BR122018075948B1 - Métodos de produzir uma planta de soja com teor de ácidos graxos de semente alterados - Google Patents

Métodos de produzir uma planta de soja com teor de ácidos graxos de semente alterados Download PDF

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Greg E. Keithly
Toni Voelker
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Abstract

MÉTODOS DE PRODUZIR UMA PLANTA DE SOJA COM TEOR DE ÁCIDOS GRAXOS DE SEMENTE ALTERA-DOS, ALIMENTO, REFEIÇÃO, PROTEÍNA, OU PREPARAÇÃO DE ÓLEO A PARTIR DE SEMENTE DA MESMA. A presente invenção refere-se a métodos para obter plantas de soja que produzem semente com baixos níveis de ácido linolênico e níveis oleicos moderadamente aumentados. A invenção também refe-re-se a métodos para produzir semente com baixos níveis de ácido linolênico, níveis oleicos moderadamente aumentados e baixos níveis de ácido graxo saturado. Estes métodos vinculam a combinação de transgenes que fornecem níveis moderados de ácido oleico com idio-plasma de soja que contém mutações em genes de soja que conferem baixos fenótipos de ácido linolênico. Estes métodos também vinculam a combinação de transgenes que fornecem tanto moderados níveis de ácido oleico quanto baixos níveis de gordura saturada com idioplasma de soja que contém mutações em genes de soja que conferem baixos fenótipos de ácido linolênico. A invenção também refere-se a plantas de soja e sementes produzidas por estes métodos são também descri-tas.

Description

[001] Dividido do PI0708748-9, depositado em 09.03.2007.
Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados
[002] Este pedido reivindica prioridade para a data de depósito de 10 de março, de 2006 do Pedido de Patente Provisório U.S. Número 60/781.519 que está aqui incorporado por referência em sua totalidade.
Incorporação da Listagem de sequências
[003] Uma Listagem de sequências está aqui incorporada. Esta Listagem de sequências consiste em SEQ ID NOs:1-63.
Antecedentes Da Invenção 1. Campo da Invenção
[004] Esta invenção geralmente se refere aos métodos para fabricação de plantas de soja que produzem semente de soja com composições de óleo alteradas e, mais particularmente, aos métodos onde a semente de soja com uma semente de soja ou fenótipo pouco linolênico, meio oleico com um fenótipo pouco linolênico, pouco saturado, meio oleico, é produzido.
2. Técnica relacionada
[005] Os óleos de planta são usados em uma variedade de apli cações. Novas composições de óleo vegetal e abordagens melhoradas são necessárias para obter composições de óleo, de fontes de planta naturais ou biossintéticas. Dependendo do uso de óleo pretendido, várias composições de ácido graxo diferentes são desejadas. As plantas, especialmente espécies que sintetizam quantidades grandes de óleos em sementes, são uma fonte importante de óleos tanto para uso comestível quanto industrial. Os óleos de semente são quase completamente compostos de triacilgliceróis nos quais os ácidos gra- xos são esterificados para os três grupos hidroxila de gli- cerol.
[006] O óleo de soja contém tipicamente cerca de 16-20% de ácidos graxos saturados: 13-16% de palmitato e 3-4% de estearato. Vide de forma geral Gunstone e outros, The Lipid Handbook, Chapman & Hall, London (1994). Os óleos de soja foram modificados através de vários métodos de reprodução para criar benefícios para os mercados específicos. Entretanto, um óleo de soja que é amplamente benéfico a maioria dos usuários de óleo de soja, tal como consumidores de óleo de salada, óleo de cozinha e óleo de fritura, e mercados industriais, tal como biodiesel e mercados de biolubrificantes, não está disponível. Os óleos de soja anteriores foram ou muito caros ou ne-cessitaram de uma propriedade de qualidade de comida importante tal como estabilidade oxidativa, bom sabor de comida frita ou conteúdo de gordura saturada, ou uma propriedade de biodiesel importante tal como emissões de óxido nítrico apropriadas ou tolerância ao frio ou fluxo frio.
[007] As plantas superiores sintetizam ácidos graxos por uma série de reações metabólica comum - a série de reação de ácido graxo sintetase (FAS), que fica localizada nos plastídeos. As β-cetoacil-ACP sintases são enzimas de limitação de taxa importantes na FAS de células de planta e existem em várias versões. β-cetoacil-ACP sintase I catalisa alongamento de cadeia para palmitoil-ACP (C16:0), considerando que β-cetoacil-ACP sintase II catalisa alongamento de cadeia para estearoil-ACP (C18:0). β-cetoacil-ACP sintase IV é uma variante de β-cetoacil-ACP sintase II, e também pode catalisar alongamento de cadeia para 18:0-ACP. Em soja, os produtos principais de FAS são 16:0-ACP e 18:0-ACP. A dessaturação de 18:0-ACP para formar 18:1- ACP é catalisada por uma delta-9 dessaturase solúvel localizada em V plastídeo (também chamada "estearoil-ACP dessaturase"). Veja Voelker e outros, 52 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol 335-61 (2001).
[008] Os produtos da FAS plastidial e delta-9 dessaturase, 16:0- ACP, 18.0-ACP, e 18:1-ACP, são hidrolisados através de tioesterases específicas (FAT). As tioesterases de planta podem ser classificadas em duas famílias de gene com base em homologia de sequência e preferência de substrato. A primeira família, FATA, inclui acil-ACP tioesterases de cadeia longa que tem atividade principalmente em 18:1- ACP. As enzimas da segunda família, FATB, geralmente utilizam 16:0- ACP (palmitoil-ACP), 18:0-ACP (estearoil-ACP), e 18:1-ACP (oleoil- ACP). Tais tioesterases têm um papel importante na determinação do comprimento de cadeia durante biossíntese de ácido graxo de novo em plantas, e deste modo estas enzimas são úteis na provisão de várias modificações de composições de acila graxa, particularmente com respeito às proporções relativas de vários grupos acila graxa que estão presentes em óleos de armazenamento de semente.
[009] Os produtos das reações de FATA e FATB, os ácidos gra- xos livres, deixam os plastídeos e são convertidos para seus respectivos ésteres de acil-CoA. Acil-CoAs são substratos para a série de reações de biossíntese de lipídio (Série de Reação de Kennedy), que fica situada no retículo endoplásmico (ER). Esta série de reação é responsável pela formação de lipídio de membrana como também pela biossíntese de triacilgliceróis que constitui o óleo de semente. No ER há dessaturases adicionais ligadas à membrana, que podem também dessaturar 18:1 para ácidos graxos poliinsaturado. Uma delta-12 dessaturase (FAD2) catalisa a inserção de uma ligação dupla em 18:1 (ácido oleico), formando ácido linoleico (18:2). Uma delta-15 dessaturase (FAD3) catalisa a inserção de uma ligação dupla em 18:2, formando ácido linolênico (18:3).
[0010] A inibição do gene FAD2 endógeno por uso de transgenes que inibem a expressão de FAD2 foi mostrada para conferir um fenóti- po de ácido meio oleico desejável (18:1) (isto é, a semente de soja que compreende 50% e 75% de ácido oleico em peso). Os transgenes e as plantas transgênicas que fornecem inibição da expressão de gene FAD2 endógena e um fenótipo meio oleico, são descritos na Patente U.S. 7.067.722. Em contraste, as plantas de soja tipo silvestre que necessitam de transgenes de inibição de FAD2 tipicamente produzem semente com composições de ácido oleico de menos do que 20%.
[0011] O óleo de soja contém tipicamente cerca de 8% de ácido linolênico (18:3) que resulta em estabilidade e sabor reduzidos. Os níveis de ácido linolênico (18:3) em óleo de soja podem ser reduzidos através de hidrogenação para melhorar tanto a estabilidade quanto o sabor (Dutton e outros, 1951; Lui e White, 1992). Infelizmente, a hidrogenação resulta na produção de ácidos graxos trans, que aumentam o risco para doença cardíaca coronária quando consumiu (Hu e outros, 1997).
[0012] A reprodução convencional também foi usada para gerar linhagens de soja com os níveis linolênicos que variam de 1%-6% (Ross e outros, Crop Science, 40:383; 2000; Wilson e outros J. Oleo Sei., 50:5, 87, 2001; Wilson Lipid technology Sept. 1999). As variedades de soja de ácido pouco linolênico foram produzidas por mutação, peneiragem e reprodução (Fehr e outros, 1992; Rahman e Takagi, 1997; Ross e outros, 2000; Byrum e outros, 1997; Stoisin e outros, 1998). Certas variedades de soja com um conteúdo de ácido linolênico de cerca de 1% ou mais baixo, foram obtidas ( Patentes U.S. n~ 5.534.425 e 5.714.670). Mais recentemente, os métodos para obter plantas de soja com ambos os níveis baixos de níveis de ácido linolênico como também as características de produção e crescimento de variedades de soja agronomicamente elite foram descritos (Pedido de Patente U.S. 2006/0107348).
[0013] O ácido oleico tem uma ligação dupla, porém ainda é relativamente estável em temperaturas elevadas, e os óleos com níveis elevados de ácido oleico são adequados para cozimento e outros processos onde o aquecimento seja requerido. Recentemente, o consumo aumentado de óleos oleicos elevados foi recomendado, porque o ácido oleico parece reduzir os níveis de sangue de lipoproteínas de densidade baixa ("LDLs") sem afetar os níveis de lipoproteínas de densidade elevada ("HDLs"). Entretanto, alguma limitação de níveis de ácido oleico é desejável, porque quando ácido oleico é degradado em temperaturas elevadas, ele cria compostos de sabor negativo e diminui os sabores positivos criados pela oxidação de ácido linoleico. Neff e outros, JAOCS, 77 :1303-1313 (2000); Warner e outros, J. Agric. Food Chem. 49:899-905 (2001). É deste modo preferível usar óleos com níveis de ácido oleico que sejam 65-85% ou menos em peso, para limitar os sabores de má qualidade em aplicações de comida tal como óleo de fritura e comida frita. Outros óleos preferidos têm níveis de ácido oleico que são maiores do que 55% em peso para melhorar a estabilidade oxidativa.
[0014] Para muitas aplicações de óleo, os níveis de ácido graxo saturado de menos do que 8% em peso ou até mesmo menos do que cerca de 2-3% em peso são desejáveis. Os ácidos graxos saturados têm pontos de fusão elevados que são indesejáveis em muitas aplicações. Quando usados como uma carga de alimentação ou combustível, os ácidos graxos saturados causam turvação em baixas temperaturas, e conferem propriedades de fluxo frio pobres como pontos de derramamento e pontos de ligação de filtro frio, ao combustível. Os produtos de óleo que contêm níveis baixos de ácido graxo saturado podem ser preferidos pelos consumidores e pela indústria de comida porque eles são percebidos como mais saudáveis e/ou podem ser ro- tulados como "sem gordura saturada" de acordo com diretrizes de FDA. Além disso, os óleos pouco saturados reduzem ou eliminam a necessidade de trabalhar sob temperaturas hibernais o óleo para apli-cações de comida tal como óleos de salada. Em aplicações de biodiesel e lubrificante os óleos com baixos níveis de ácido graxo saturado conferem propriedades melhoradas de fluxo frio e não turvam em baixas temperaturas.
[0015] As linhagens de soja que produzem semente com conteúdo de ácido meio oleico, pouco linoleico, seriam muito desejáveis. Infeliz- mente, as tentativas de combinar as características medianamente oleicas e pouco linolênicas por abordagens de engenharia genética, foram problemáticas. As linhagens transgênicas onde ambos os genes de delta-12 dessaturase (FAD2) e delta-15 dessaturase (FAD3) foram suprimidos têm sementes com níveis linolênicos baixos, porém os níveis de ácido oleico são tipicamente acima da faixa definida para meio oleico. Entretanto, os métodos descritos aqui permitem a produção de sementes de soja pouco linolênicas que também têm níveis de ácido oleico na faixa de meio oleico de 55-80%. Além disso, estes métodos não requerem processos de hidrogenação e deste modo evitam a produção de gorduras trans indesejáveis.
[0016] As linhagens de soja que produzem semente com conteúdo de ácido meio oleico, pouco saturado, pouco linoleico também seriam muito desejáveis. Os métodos descritos aqui permitem a produção de sementes de soja pouco linolênicas que também têm níveis de ácido oleico na faixa oleica moderada de 55-80% e níveis de ácido graxo saturado de menos do que 8%.
Sumário da Invenção
[0017] Devido aos problemas anteriores que a presente invenção foi desenvolvida. A primeira invenção se refere a um método para produzir uma planta de soja que compreende um conteúdo de ácido lino- 7/105 lênico de menos do que cerca de 6% de ácidos graxos de semente totais em peso e um conteúdo de ácido oleico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso. Este método da invenção é praticado por uma primeira etapa para a preparação de uma ou mais plantas de soja que compreendem um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 endógeno de soja e pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja, uma segunda etapa para obter pelo menos uma semente da referida planta de soja obtida da primeira etapa, uma terceira etapa para determinar uma porcentagem do conteúdo de ácido graxo de semente total em peso de ácido linolênico e ácido oleico para a semente da segunda etapa, e então identificando uma planta de soja que pro-duz semente que tem uma composição de ácido graxo de semente que compreende um conteúdo de ácido linolênico de menos do que cerca de 6% de ácidos graxos de semente totais em peso e um conteúdo de ácido oleico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso.
[0018] Em outras modalidades deste método, as plantas de soja que são feitas na primeira etapa compreendem pelo menos duas mutações de perda de função em pelo menos dois genes de FAD3 endógeno de soja. Esta perda de mutações de função pode ser localizada nos genes de FAD3-1B e FAD3-1C endógenos de soja. Nesta modalidade do método, as plantas de soja identificadas na terceira etapa do método compreendem um conteúdo de ácido linolênico de menos do que cerca de 3% de ácidos graxos de semente totais em peso e um conteúdo de ácido oleico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso.
[0019] Em certas modalidades deste método, o transgene pode também compreender um transgene que confere tolerância ao herbicida. O transgene de tolerância ao herbicida pode conferir tolerância ao glifosato. Em modalidades específicas da invenção, o transgene compreende sequências localizadas entre as sequências fronteiras de T- DNA de pMON68504, pCGN5469, pCGN5471, ou pCGN5485 que são integradas em um cromossomo da referida planta.
[0020] Na terceira etapa do método, a porcentagem do conteúdo de ácido graxo de semente total em peso de ácido linolênico e ácido oleico é determinada por uma técnica de análise de lipídio. Esta técnica de análise de lipídio compreende uma ou mais técnicas selecionadas do grupo que consiste em cromatografia de gás/detecção de ionização por chama, cromatografia de gás/espectroscopia de massa, cromatografia de camada fina/detecção de ionização por chama, cro-matografia líquida/espectrometria de massa, cromatografia líqui- da/espectrometria de massa de ionização por eletrovaporização e cromatografia líquida/espectroscopia de massa tandem de ionização por eletrovaporização.
[0021] A planta de soja que compreende um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 endógeno de soja e pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja pode ser feita cruzando uma primeira linhagem de soja parental compreendendo o transgene com uma segunda linhagem de soja parental compreendendo pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja para obter uma planta de soja F1 que seja heterozigota para o transgene e heterozigota para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 e então autofertilizando as plantas progénies F1 do cruzamento para obter uma planta de soja F2 que seja homozigota para o referido transgene e homozigota para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3. Em certas modalidades deste método, a segunda linhagem de soja parental compreende pelo menos duas mutações de perda de função em pelo menos dois genes FAD3 de soja endógenos. Os dois genes FAD3 de soja endógenos podem ser FAD3-1B e FAD3- 1C. Neste método, a planta de soja F1 que é heterozigota para o transgene e para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 é obtida na etapa (i) submetendo-se uma pluralidade de plantas F1 a pelo menos uma técnica de análise de DNA que permite a identificação de uma planta F1 que é heterozigota para o referido transgene e para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3. Semelhantemente, a planta de soja F2 que é homozigota para o transgene e homozigota para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 é obtida na etapa (ii) submetendo-se uma pluralidade de plantas F2 a pelo menos uma técnica de análise de DNA que permite identificação de uma planta F2 que é homozigota para o referido transgene e homozigota para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3. A técnica de análise de DNA compreende uma ou mais técnicas selecionadas do grupo que consiste em análise de PCR, análise de PCR quantitativa, análise de SNP, análise de AFLP, análise de RFLP e análise de RAPD. Em certas modalidades desta invenção, a técnica de análise de DNA compreende a detecção de pelo menos um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na sequência de gene FAD3-1C que corresponde ao nucleotídeo 687, 1129, 1203, 2316, 3292, 3360 ou 3743 de SEQ ID NO:62, detecção de uma deleção no gene FAD3-1C de SEQ ID NO:62, ou detecção de pelo menos um polimorfismo de nucleotídeo único em uma sequência promotora FAD3-1C de soja que corresponde a uma guanina no nucleotídeo 334, uma citosina no nucleotídeo 364, uma timina no nucleotídeo 385, uma adenina no nucleotídeo 387, uma citosina no nucleotídeo 393, uma guanina no nucleotídeo 729 e uma citosina no nucleotídeo 747 de SEQ ID NO:63. Em outras modalidades desta invenção, a técnica de análise de DNA compreende a detecção de um polimorfismo de nucleotídeo único em um gene FAD3- 1B de soja que compreende uma substituição de um resíduo de timina para um resíduo de citosina em uma posição na sequência de gene FAD3-1b que corresponde ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61. Neste método, o transgene pode também compreender um transgene que confere tolerância ao herbicida e a planta de soja F1 que é hete- rozigota para o referido transgene é obtida na etapa (i) submetendo-se uma pluralidade de plantas F1 à seleção de herbicida para o referido transgene. Semelhantemente, quando o transgene também compreende um transgene que confere tolerância ao herbicida, uma pluralidade de plantas F2 enriquecidas para plantas de soja F2 que são ho- mozigotas para o referido transgene é obtida na etapa (ii) submetendo- se a referida pluralidade de plantas F2 à seleção de herbicida para o referido transgene. Este método também pode ainda compreender a etapa iii) de autofertilização da planta progénie F2 que é homozigota para o transgene e homozigota para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 da etapa (ii) para obter uma planta de soja F3.
[0022] Um método alternativo de fazer plantas de soja que compreendem um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 endógeno de soja e pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja envolve a transformação direta de plantas ou células de soja que compreendem a mutação com o transgene. Deste modo esta planta de soja é feita na primeira etapa da invenção transformando-se uma planta de soja ou célula de planta que compreende pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja com um transgene que diminui a expressão de gene FAD2-1 endógeno de soja para obter uma planta de soja R0 com menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 que é heterozigota para o referido transgene, por autofertilização da planta progénie R0 da etapa anterior para obter uma planta de soja R1 que é homozigota para o transgene e homozigota para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3, desse modo obtendo uma planta de soja que compreende um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 endógeno de soja e pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja. Em certas modalidades deste método, o transgene também compreende sequências que conferem uma característica de tolerância ao herbicida. Em outras modalidades da invenção, o transgene também compreende sequências que conferem tolerância ao glifosato.
[0023] Esta invenção também abrange plantas de soja produzidas pelos métodos acima mencionados da invenção como também partes de planta de plantas de soja produzidas pelos métodos da invenção. A parte de planta de soja produzida pode ser pólen, um óvulo, um meris- tema, uma folha, um talo, uma raiz, ou uma célula. As plantas de soja progénies das plantas de soja produzidas por estes métodos também são contempladas por esta invenção. A invenção também abrange semente da planta de soja produzida pelos métodos da invenção onde esta semente tem uma composição de ácido graxo que compreende um conteúdo de ácido linolênico de menos do que cerca de 6% de ácidos graxos de semente totais em peso e um conteúdo de ácido oleico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso. A invenção também abrange semente da planta de soja produzida por métodos em que as plantas de soja compreendendo pelo menos duas perdas de mutação de função em pelo menos dois genes FAD3 endógenos de sojas, são usadas, a referida semente tendo uma composição de ácido graxo que compreende um conteúdo de ácido linolênico de menos do que cerca de 3% de ácidos graxos de semente totais em peso e um conteúdo de ácido oleico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso.
[0024] Esta invenção também fornece um método para obter uma planta de soja com uma composição de ácido graxo de óleo de semente alterada que compreende as etapas de: a) cruzar uma primeira linhagem de soja parental tendo uma composição de ácido graxo de óleo de semente que compreende um conteúdo de ácido linolênico de menos do cerca de 3% de ácidos graxos totais em peso com uma segunda linhagem de soja parental tendo uma composição de ácido graxo de óleo de semente em que o conteúdo de pelo menos um ácido graxo diferente de ácido linoleico é alterado em pelo menos 50% quando comparado ao conteúdo de ácido graxo correspondente de um óleo de soja de produto de consumo, a referida segunda linhagem de soja parental que compreende um transgene que altera o conteúdo de pelo menos um ácido graxo diferente de ácido linoleico; e b) obter uma planta progénie que exibe uma composição de ácido graxo de óleo de semente que compreende um conteúdo de ácido linolênico de menos do que 3% de ácidos graxos totais em peso e um conteúdo de pelo menos um ácido graxo diferente de ácido linoleico que é alterado em pelo menos 50% quando comparado ao conteúdo de ácido graxo correspondente de um óleo de soja de produto de consumo, desse modo obtendo uma planta de soja com uma composição de ácido graxo de óleo de semente alterada. Neste método, o ácido graxo diferente de ácido linolênico é selecionado do grupo que consiste em ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido estearidônico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido y-linoleico, ácido eicosapentanóico e ácido docosaexanóico.
[0025] A invenção também se refere a um método para produzir uma planta de soja que compreende um conteúdo de ácido linolênico de menos do que cerca de 6% de ácidos graxos de semente totais em peso, um conteúdo de ácido graxo saturado de menos do que cerca de 8% em peso e um conteúdo de ácido oleico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso. Este método da invenção é praticado por uma primeira etapa de preparação de uma ou mais plantas de soja que compreendem um transgene que diminui a expressão de ambos um gene FAD2-1 endógeno de soja e um gene de FATB endógeno, e pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja, uma segunda etapa para obter pelo menos uma semente da referida planta de soja obtida da primeira etapa, uma terceira etapa de determinar uma porcentagem do conteúdo de ácido graxo de semente total em peso de ácido linolênico, ácidos graxos saturados e ácido oleico para a semente da segunda etapa, e então identificar uma planta de soja que produz semente que tem uma composição de ácido graxo de semente que compreende um conteúdo de ácido linolênico de menos do que cerca de 6% de ácidos graxos de semente totais em peso, um conteúdo de ácido graxo saturado de menos do que cerca de 8% em peso e um conteúdo de ácido oleico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso.
[0026] Em outras modalidades deste método, as plantas de soja que são feitas na primeira etapa compreendem pelo menos duas mutações de perda de função em pelo menos dois genes FAD3 endógeno de soja. Esta perda de mutações de função pode ser localizada nos genes FAD3-1B e FAD3-1C endógenos de soja. Nesta modalidade do método, as plantas de soja identificadas na terceira etapa do método podem compreender um conteúdo de ácido linolênico de menos do que cerca de 3% de ácidos graxos de semente totais em peso, um conteúdo de ácido graxo saturado de menos do que cerca de 8% em peso e um conteúdo de ácido oleico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso.
[0027] Em certas modalidades deste método, o transgene pode também compreender um transgene que confere tolerância ao herbicida. O transgene pode conferir tolerância ao glifosato. O transgene que confere resistência ao glifosato pode codificar um gene de EPSPS de CP4.
[0028] Na terceira etapa do método, a porcentagem do conteúdo de ácido graxo de semente total em peso de ácido linolênico, ácidos graxos saturados e ácido oleico é determinada por uma técnica de análise de lipídio. Esta técnica de análise de lipídio compreende uma ou mais técnicas selecionadas do grupo que consiste em cromatografia de gás/detecção de ionização por chama, espectroscopia de mas- sa/cromatografia de gás, cromatografia de camada fina/detecção de ionização por chama, cromatografia liquida/espectrometria de massa, cromatografia liquida/espectrometria de massa de ionização por eletrovaporização e cromatografia líquida/espectroscopia de massa tandem de ionização por eletrovaporização.
[0029] A planta de soja que compreende pelo menos um transgene que diminui a expressão de ambos um gene FAD2-1 endógenos de soja e um gene FATB endógeno e pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógenos de soja pode ser feita cruzando uma primeira linhagem de soja parental compreendendo o transgene com uma segunda linhagem de soja parental compreendendo pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógenos de soja para obter uma planta de soja F1 que é heterozigota para o transgene(s) e heterozigota para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 e então autofertilizan- do as plantas progénies F1 do cruzamento para obter uma planta de soja F2 que é homozigota para o referido transgene e homozigota para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3. Em certas modalidades deste método, a segunda linhagem de soja parental compreende pelo menos duas mutações de perda de função em pelo menos dois genes FAD3 endógenos de soja. Os dois genes FAD3 endógenos de soja podem ser FAD3-1B e FAD3-1C. Neste mé- todo, a planta de soja F1 que é heterozigota para o transgene e para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 é obtida na etapa (i) submetendo uma pluralidade de plantas F1 a pelo menos uma técnica de análise de DNA que permite a identificação de uma planta F1 que é heterozigota para o referido transgene e para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3. Semelhantemente, a planta de soja F2 que é homozigota para o transgene e homozigota para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 é obtida na etapa (ii) submetendo-se uma pluralidade de plantas F2 a pelo menos uma técnica de análise de DNA que permite a identificação de uma planta F2 que é homozigota para o referido transgene e homozigota para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3. A técnica de análise de DNA compreende uma ou mais técnicas selecionadas do grupo que consiste em análise de PCR, análise de PCR quantitativa, análise de SNP, análise de AFLP, análise de RFLP e análise de RAPD. Em certas modalidades desta invenção, a técnica de análise de DNA compreende a detecção de pelo menos um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na sequência de gene FAD3-1C que corresponde ao nucleotídeo 687, 1129, 1203, 2316, 3292, 3360 ou 3743 da SEQ ID NO:62, ou detecção de uma deleção no gene FAD3-1C de SEQ ID NO:62, ou detecção de pelo menos um polimorfismo de nucleotídeo único em uma sequência promotora de soja FAD3-1C que corresponde a uma guanina em nucleotídeo 334, uma citosina em nucleotídeo 364, uma timina em nucleotídeo 385, uma adenina em nucleotídeo 387, uma citosina em nucleotídeo 393, uma guanina em nucleotídeo 729 e uma citosina dm nucleo-tídeo 747 de SEQ ID NO:63. Em outras modalidades desta invenção, a técnica de análise de DNA compreende a detecção de polimorfismo de nucleotídeo único em um gene FAD3-1B de soja que compreende uma substituição de um resíduo de timina por um resíduo de citosina em uma posição na sequência de gene Fad3-1b que corresponde ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61. Neste método, o transgene também pode compreender um transgene que confere tolerância ao herbicida e a planta de soja F1 que é heterozigota para o referido transgene é obtida na etapa (i) submetendo-se uma pluralidade de plantas F1 à seleção de herbicida para o referido transgene. Semelhantemente, quando o transgene também compreende um transgene que confere tolerância ao herbicida, uma pluralidade de plantas F2 enriquecida para plantas de soja F2 que são homozigotas para o referido transgene é obtida na etapa (ii) submetendo-se a referida pluralidade de plantas F2 à seleção de herbicida para o referido transgene. Este método também pode ainda compreender a etapa iii) de autofertilização da planta progénie F2 que é homozigota para o transgene e homozigota para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 da etapa (ii) para obter uma planta de soja F3.
[0030] Um método alternativo de fabricar plantas de soja que compreendem pelo menos um transgene que diminui a expressão de ambos um gene FAD2-1 endógeno de soja e um gene FATB endógeno de soja e um gene FATB endógeno e pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja, envolve a transformação direta de plantas ou células de soja que compreendem a mutação com o transgene(s). Deste modo esta planta de soja é feita na primeira etapa da invenção transformando-se uma planta ou célula de planta de soja que compreende pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja com um ou mais transgene(s) que diminui a expressão de ambos um gene FAD2-1 endógeno de soja e um gene FATB endógeno de soja para obter uma planta de soja R0 com pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 que é heterozigota para o referido transgene, auto- fertilizando a planta progénie R0 da etapa anterior para obter uma planta de soja R1 que é homozigota para o transgene e homozigota para pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3, desse modo obtendo uma planta de soja que compreende um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 endógeno de soja e pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja. Em certas modalidades deste método, o transgene também compreende sequências que conferem uma característica de tolerância ao herbicida. Em outras modalidades da invenção, o transgene também compreende sequências que conferem tolerância ao glifosato.
[0031] Esta invenção também abrange plantas de soja produzidas pelos métodos acima mencionados da invenção como também partes de planta de plantas de soja produzidas pelos métodos da invenção. A parte de planta de soja produzida pode ser pólen, um óvulo, um meris- tema, uma folha, um talo, uma raiz, ou uma célula. As plantas de soja progénies das plantas de soja produzidas por estes métodos também são contempladas por esta invenção. A invenção também abrange semente da planta de soja produzida pelos métodos da invenção onde esta semente tem uma composição de ácido graxo que compreende um conteúdo de ácido linolênico de menos do que cerca de 6% de ácidos graxos de semente totais em peso, um conteúdo de ácido graxo saturado de menos que 8% em peso e um conteúdo de ácido oleico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso. A invenção também abrange semente da planta de soja produzida por métodos em que as plantas de soja compreendendo pelo menos duas mutações de perda de função em pelo menos dois genes FAD3 endógenos de soja são usadas, a referida semente tendo uma composição de ácido graxo que compreende um conteúdo de ácido linolênico de menos do que cerca de 3% de ácidos graxos de semente totais em peso, um conteúdo de ácido graxo saturado de menos do que 8% em peso e um conteúdo de ácido oleico de cerca de 55% a cerca de 80% de ácidos graxos de semente totais em peso.
[0032] As características e vantagens adicionais da presente invenção, como também a estrutura e operação de várias modalidades da presente invenção, são descritas em detalhes abaixo com referência para aos desenhos acompanhantes.
Breve Descrição dos Desenhos
[0033] Os desenhos acompanhantes, que estão incorporados em e formam uma parte do relatório descritivo, ilustram as modalidades da presente invenção e juntos com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção. Nos desenhos:
[0034] Figura 1 ilustra pCGN5469, um vetor de planta para diminuir a expressão do gene FAD2-1 de soja;
[0035] Figura 2 ilustra pCGN5471, um vetor de planta para diminuir a expressão do gene FAD2-1 de soja;
[0036] Figura 3 ilustra pCGN5485, um vetor de planta para diminuir a expressão do gene FAD2-1 de soja; e
[0037] Figura 4 ilustra configurações de vetor de planta exemplares para diminuir a expressão de um ou mais genes usando os elementos da sequência de DNA dos genes de soja listados na Tabela 1.
[0038] Figura 5 ilustra as configurações de vetor de planta exemplares para diminuir a expressão de um ou mais genes usando os elementos da sequência de DNA dos genes FAD2-1 de soja e/ou FATB de soja listados na Tabela 2.
[0039] Figura 6 ilustra vetores de planta exemplares para diminuir a expressão de ambos os genes FAD2-1 e FATB endógenos de soja.
Descrição Detalhada da Invenção
[0040] A descrição das sequências de ácido nucléico
[0041] SEQ ID NO: 1 é uma sequência de ácido nucléico de um íntron 1 de FAD2-1A.
[0042] SEQ ID NO: 2 é uma sequência de ácido nucléico de um intron 1 de FAD2-1A.
[0043] SEQ ID NO: 3 é uma sequência de ácido nucléico de um promotor de FAD2-1B.
[0044] SEQ ID NO: 4 é uma sequência de ácido nucléico de um clone genômico de FAD2-1A.
[0045] SEQ ID NOs: 5 & 6 são sequências de ácido nucléico de um 3 ' UTR e 5'UTR de FAD2-1A, respectivamente.
[0046] SEQ ID NOs: 7-13 são sequências de ácido nucléico de introns 1,2, 3A, 4, 5, 3B, e 3C de FAD3-1A, respectivamente.
[0047] SEQ ID NO: 14 é uma sequência de ácido nucléico de um intron 4 de FAD3-1C.
[0048] SEQ ID NO: 15 é uma sequência de ácido nucléico de um clone genômico parcial de FAD3-1A.
[0049] SEQ ID NOs: 16 & 17 são sequências de ácido nucléico de um 3'UTR e 5'UTR FAD3-1 A, respectivamente.
[0050] SEQ ID NO: 18 é uma sequência de ácido nucléico de um clone genômico parcial de FAD3-1B.
[0051] SEQ ID NOs: 19-25 são sequências de ácido nucléico de introns 1,2, 3A, 3B, 3C, 4, e 5 de FAD3-1B, respectivamente.
[0052] SEQ ID NOs: 26 & 27 são sequências de ácido nucléico de um 3'UTR e 5’UTR de FAD3-1B, respectivamente.
[0053] SEQ ID NO: 28 é uma sequência de ácido nucléico de um clone genômico de FATB-1.
[0054] SEQ ID NOS: 29-35 são sequências de ácido nucléico de introns I, II, III, IV, V, VI, e VII de FATB-1, respectivamente.
[0055] SEQ ID NOs: 36 & 37 são sequências de ácido nucléico de um 3'UTR e 5'UTR FATB-1, respectivamente.
[0056] SEQ ID NO: 38 é uma sequência de ácido nucléico de um gene de Cuphea pulcherrima KAS I.
[0057] SEQ ID NO: 39 é uma sequência de ácido nucléico de um gene de Cuphea pulcherrima KAS IV.
[0058] SEQ ID NOs: 40 & 41 são sequências de ácido nucléico de genes de delta-9 dessaturase de Ricinus communis e Simmondsia chinensis, respectivamente.
[0059] SEQ ID NO: 42 é uma sequência de ácido nucléico de um cDNA de FATB-2.
[0060] SEQ ID NO: 43 é uma sequência de ácido nucléico de um clone genômico de FATB-2.
[0061] SEQ ID NOs: 44-47 são sequências de ácido nucléico de introns I, II, III, e IV de FATB-2 respectivamente.
[0062] SEQ ID NOs: 48-60 são sequências de ácido nucléico de iniciadores de PCR.
[0063] SEQ ID NO:61 é uma sequência de gene FAD3-1B que corresponde à SEQ ID NO:1 do Pedido de Patente U.S. No. 10/176.149.
[0064] SEQ ID NO: 62 é uma sequência de gene FAD3-1C que corresponde á SEQ ID NO:2 do Pedido de Patente U.S. No. 10/176.149.
[0065] SEQ ID NO:63 é uma sequência promotora de FAD3-1C que corresponde à SEQ ID NO:3 do Pedido de Patente U.S. No. 10/176.149..
Definições
[0066] "ACP" se refere a uma porção de proteína veículo de acila. "Composição de óleo de semente alterada" se refere a uma composição de óleo de semente de uma planta transgênica ou transformada da invenção que alterou ou modificou os níveis dos ácidos graxos nesta, relativo a um óleo de semente de uma planta que tem uma base genética semelhante porém que não foi transformada. "Supressão de anti-sentido" se refere ao silenciamento específico de gene que é induzido pela introdução de uma molécula de RNA anti-sentido.
[0067] "Agronomicamente elite", como usado aqui, significa um genótipo que tem uma culminação de muitas características distinguíveis tal como emersão, vigor, vigor vegetativo, resistência à doença, conjunto de semente, padronização e debulhabilidade que permitem um produtor colher um produto de significância comercial.
[0068] "Alelo" como usado aqui, se refere a qualquer de uma ou mais formas alternativas de um local de gene, todos dos quais alelos se referem a um traço ou característica. Em uma célula ou organismo diplóide, os dois alelos de um determinado gene ocupam lugares cor-respondentes em um par de cromossomos homólogos.
[0069] "Cruzamento reversível" como usado aqui, se refere a um processo no qual um criador cruza repetidamente a progénie híbrida, por exemplo, uma primeira geração híbrida (F1), de novo para um dos pares da progénie híbrida. O cruzamento reversível pode ser usado para introduzir uma ou mais conversões de local único de uma base genética em outra.
[0070] "Coexpressão de mais do que um agente tal como um mRNA ou proteína" se refere à expressão simultânea de um agente em estruturas de tempo de sobreposição e na mesma célula ou tecido como outro agente. "Expressão coordenada de mais de um agente" se refere à coexpressão de mais do que um agente quando a produção de transcrições e proteínas de tais agentes é realizada utilizando um promotor compartilhado ou o idêntico.
[0071] "Complemento" de uma sequência de ácido nucléico se refere ao complemento da sequência ao longo de seu comprimento completo.
[0072] "Co-supressão" é a redução em níveis de expressão, normalmente no nível de RNA, de um gene endógeno particular ou família de gene pela expressão de um construto de sentido homólogo que é capaz de transcrever mRNA da mesma fita como a cópia do gene en- dógeno. Napoli e outros, Plant Cell 2:279-289 (1990); van der Krol e outros, Plant Cell 2:291-299 (1990).
[0073] Um gene de "CP4 EPSPS" ou "CP4 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase" codifica uma enzima (CP4 EPSPS) capaz de conferir um grau significativo de resistência ao glifo- sato na célula de planta e plantas geradas desta. A sequência de EPSPS CP4 pode ser uma sequência de EPSPS CP4 derivada de Agrobacterium tumefaciens sp. CP4 ou uma forma variante ou sintética deste, como descrito na Patente U.S. No. 5.633.435. As sequências de EPSPS CP4 representativas incluem, sem limitação, aquelas apresentadas nas Patentes U.S. Nos. 5.627.061 e 5.633.435.
[0074] "Cruzamento", como usado aqui, se refere ao acasalamento de duas plantas origem.
[0075] "Polinização cruzada", como usado aqui, se refere à fertilização pela união de dois gametas de plantas diferentes.
[0076] "F1" ou "F1", como usado aqui, se refere à primeira progé nie de geração do cruzamento das duas plantas.
[0077] "F1 Híbrido" ou F1 Híbrido", como usado aqui, se refere a primeira progénie de geração do cruzamento de duas plantas não- isogênicas.
[0078] "F2" ou "F2", como usado aqui, se refere à segunda progé nie de geração do cruzamento das duas plantas.
[0079] "F3" ou "F3", como usado aqui, se refere à segunda progé nie de geração do cruzamento de duas plantas.
[0080] "Óleo de soja bruto" se refere ao óleo de soja que foi extraído de sementes de soja, porém não foi refinado, processado, ou misturado, embora possa ser desengomado.
[0081] "CTP" se refere a um peptídeo de trânsito cloroplástico, codificado pela "sequência de codificação de peptídeo de trânsito cloroplástico". 23/105
[0082] Ao se referir às proteínas e ácidos nucléicos aqui, "derivado" se refere ou diretamente (por exemplo, olhando na sequência de uma proteína ou ácido nucléico conhecido e preparando uma proteína ou ácido nucléico que tenha uma sequência similar, pelo menos em parte, à sequência da proteína ou ácido nucléico conhecido) ou indiretamente (por exemplo, obtendo uma proteína ou ácido nucléico de um organismo que está relacionado com uma proteína ou ácido nucléico conhecido) obtendo uma proteína ou ácido nucléico de uma proteína ou ácido nucléico conhecido. Outros métodos "derivando" de uma proteína ou ácido nucléico de uma proteína ou ácido nucléico conhecido são conhecidos por alguém de experiência na técnica.
[0083] RNA de filamento duplo ("dsRNA"), interferência de RNA de filamento duplo ("dsRNAi") e interferência de RNA ("RNAi") todos se referem ao silenciamento específico de gene que é induzido pela in-trodução de um constructo capaz de transcrever uma molécula de RNA pelo menos parcialmente de filamento duplo. Uma "molécula de dsRNA" e uma "molécula de RNAi" se referem a uma região de uma molécula de RNA que contém segmentos com sequências de nucleo- tídeo complementares e portanto podem hibridizar entre si e formar o RNA de filamento duplo. Tais moléculas de RNA de filamento duplo são capazes, quando introduzidas em uma célula ou organismo, de pelo menos parcialmente reduzir o nível de uma espécie de mRNA presente em uma célula ou uma célula de um organismo. Além disso, o dsRNA pode ser criado após montagem in vivo de fragmentos de DNA apropriados por recombinação ilegítima e recombinação específica de sítio como descrito no Pedido Internacional No. PCT/US2005/004681, depositado em 11 de fevereiro de 2005, que está desse modo incorporado pela referência em sua totalidade.
[0084] "Exon" se refere ao sentido normal do termo quando significando um segmento de moléculas de ácido nucléico, normalmente DNA, que codifica parte ou tudo de uma proteína expressa.
[0085] "FAD2" se refere a um gene ou proteína codificada capaz de catalisar a inserção de uma ligação dupla em uma porção de acila graxa na décima segunda posição contada do terminal de carboxila. As proteínas FAD2 também são referidas como "Δ12 dessaturase" ou "omega-6 dessaturase". O termo "FAD2-1" é usado para se referir a uma proteína ou gene FAD2 que seja expresso naturalmente de uma maneira específica em tecido de semente, e o termo "FAD2-2" é usado para se referir a uma proteína ou gene FAD2 que seja (a) um gene diferente de uma proteína ou gene FAD2-1 e (b) seja expresso naturalmente em tecidos múltiplos, incluindo a semente. As sequências FAD2 representativas incluem, sem limitação, aquelas apresentadas no Pedido de Patente U.S. No. 10/176.149, depositado no dia 21 de junho de 2002, e em SEQ ID NOs: 1-6.
[0086] Um gene "FAD3", "Δ15 dessaturase" ou "omega-3 dessaturase" codifica uma enzima (FAD3) capaz de catalisar a inserção de uma ligação dupla em uma porção de acila graxa na décima quinta posição contada do terminal de carboxila. Os termos "FAD3-1, FAD3- A, FAD3-B e FAD3-C" são usados para se referir aos membros da família de gene FAD3 que são expressos naturalmente em tecidos múltiplos, incluindo a semente. As sequências FAD3 representativas incluem, sem limitação, aquelas apresentadas no Pedido de Patente U.S. No. 10/176.149 depositado no dia 21 de junho de 2002, e em SEQ ID NOs: 7-27.
[0087] Um "FATB" ou "palmitoil-ACP tioesterase" se refere a um gene que codifica uma enzima (FATB) capaz de catalisar a divagem hidrolítica da ligação de tioéster de enxofre ao carbono no grupo profético de pantoteno de palmitoil-ACP como sua reação preferida. A hidrólise de outros tioésteres de ACP de ácido graxo também pode ser catalisada por esta enzima. As sequências FATB-1 representativas incluem, sem limitação, aquelas apresentadas no Pedido Provisório U.S. No. 60/390.185, depositado no dia 21 de junho de 2002; as Patentes U.S. N— 5.955.329; 5.723.761; 5.955.650; e 6.331.664; e SEQ ID NOs: 28-37. As sequências FATB-2 representativas incluem, sem limitação, aquelas apresentadas nas SEQ ID NOs: 42-47.
[0088] "Ácido graxo" se refere aos ácidos graxos livres e grupos de acila graxa.
[0089] "Gene" se refere a uma sequência de ácido nucléico que abrange uma região promotora 5 ' associada com a expressão do produto de gene, quaisquer regiões de intron e éxon e regiões não transladadas 3’ ou 5' associadas com a expressão do produto de gene.
[0090] "Silenciamento de gene" se refere à supressão de expressão de gene ou sub-regulação de expressão de gene.
[0091] Uma "família de gene" é dois ou mais genes em um organismo que codifica as proteínas que exibem atributos funcionais similares, e um "membro de família de gene" é qualquer gene da família de gene encontrado dentro do material genético da planta, por exemplo, um "membro da família de gene FAD2" é qualquer gene FAD2 encontrado dentro do material genético da planta. Um exemplo de dois membros de uma família de gene é FAD2-1 e FAD2-2. Uma família de gene pode ser adicionalmente classificada pela semelhança das sequências de ácido nucléico. Um gene, FAD2, por exemplo, inclui alelos naquele local. Preferivelmente, um membro da família de gene exibe pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferi-velmente pelo menos 80% de identidade de sequência de ácido nucléico na porção de sequência de codificação do gene.
[0092] "Genótipo", como usado aqui, se refere à constituição genética de uma célula ou organismo.
[0093] Como usado aqui, "Heterólogo" significa de ocorrência não natural junto.
[0094] Uma molécula de ácido nucléico é dita ser "introduzida" se for inserida em uma célula ou organismo como resultado de manipulação humana, de qualquer forma indireta. Os exemplos de moléculas de ácido nucléico introduzidas incluem, porém não estão limitados aos ácidos nucléicos que foram introduzidos em células por transformação, transfecção, injeção, e projeção, e aqueles que foram introduzidos em um organismo por métodos incluindo, porém não limitado a, conjugação, endocitose, e fagocitose.
[0095] "íntron" se refere ao sentido normal do termo como significando um segmento de moléculas de ácido nucléico, normalmente DNA, que não codifica parte ou tudo de uma proteína expressa, e que, em condições endógenas, é transcrito em moléculas de RNA, porém que é removido do RNA endógeno antes do RNA ser transladado em uma proteína. Uma "molécula de dsRNA de íntron" e uma "molécula de RNAi íntron" ambos se referem a uma molécula de RNA de filamento duplo capaz, quando introduzido em uma célula ou organismo, de pelo menos parcialmente reduzir o nível de uma espécie de mRNA presente em uma célula ou uma célula de um organismo onde a molé-cula de RNA de filamento duplo exibe identidade suficiente para um íntron de um gene presente na célula ou organismo para reduzir o nível de um mRNA que contém aquela sequência de íntron.
[0096] Uma composição de óleo de semente de soja "pouco saturada" contém entre 3,6 e 8 por cento de ácidos graxos saturados em peso.
[0097] Uma composição de óleo "pouco linolênico" contém menos do que cerca de 3% de ácido linolênico em peso dos ácidos graxos totais em peso.
[0098] Uma "semente de soja medianamente oleica" é uma se mente que tem entre 55% e 85% de ácido oleico presente na composição de óleo da semente em peso. 27/105
[0099] O termo "não-codificação" se refere às sequências de moléculas de ácido nucléico que não codificam parte ou tudo de uma proteína expressa. As sequências de não-codificação incluem, porém não estão limitadas a introns, regiões promotoras, regiões não transladadas 3 ' (3'UTRs), e regiões não transladadas 5' (5'UTRs).
[00100] O termo "composição de óleo" se refere aos níveis de áci dos graxos.
[00101] "Fenótipo", como usado aqui, se refere às características detectáveis de uma célula ou organismo, cujas características são a manifestação de expressão de gene.
[00102] Um promotor que é "operativamente ligado" a uma ou mais sequências de ácido nucléico é capaz de direcionar a expressão de uma ou mais sequências de ácido nucléico, incluindo sequências de ácido nucléico de codificação e não-codificação múltiplas dispostas em uma configuração policistrônica.
[00103] Sequências de ácido nucléico "fisicamente ligadas" são sequências de ácido nucléico que são encontradas em uma única molécula de ácido nucléico. Uma "planta" inclui referência a plantas inteiras, órgãos de planta (por exemplo, folhas, talos, raízes, etc.), sementes, e células de planta e progénie do mesmo. O termo "célula de planta" inclui, sem limitação, culturas de suspensão de semente, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófi- tos, esporófitos, pólen, e microesporos. "Promotores de planta", incluem, sem limitação, promotores virais de planta, os promotores derivados de plantas, e os promotores sintéticos capazes de funcionar em uma célula de planta para promover a expressão de um mRNA.
[00104] Um "gene policistrônico" ou "mRNA policistrônico" é qualquer gene ou mRNA que contém sequências de ácido nucléico transcritas que correspondem às sequências de ácido nucléico de mais do que um gene alvejado para supressão. É entendido que tais genes po- licistrônicos ou mRNAs podem conter sequências que correspondem aos introns, 5'UTRs, 3'UTRs, sequências de codificação de peptídeo de trânsito, éxon, ou combinações destes, e que um gene policistrôni- co recombinante ou mRNA pode, por exemplo sem limitação, conter sequências que correspondem a um ou mais UTRs de um gene e um ou mais introns de um segundo gene.
[00105] Como usado aqui, o termo "RO", "R0", "geração de RO" ou "geração de RO" se refere a uma planta transformada obtida por regeneração de uma célula de planta transformada.
[00106] Como usado aqui, o termo "R1", "R1", "geração de R1" ou "geração de R1" se refere às sementes obtidas de uma planta R0 transgênica autofertilizada. As plantas de R1, são crescidas das sementes de R1.
[00107] Um "promotor específico de semente" se refere a um promotor que é preferencialmente ou exclusivamente ativo em uma semente. "Atividade preferencial" se refere à atividade promotora que é substancialmente maior na semente do que em outros tecidos, órgãos ou organelas da planta. "Específico de semente" inclui sem limitação atividade na camada de aleurona, endosperma, embrião e/ou da semente.
[00108] "Supressão de intron de sentido" se refere ao silenciamento de gene que é induzido pela introdução de um intron de sentido ou fragmento deste. Supressão de íntron de sentido é descrita, por exemplo, por Fillatti em PCT WO 01/14538 A2.
[00109] "Expressão simultânea" de mais do que um agente tal como um mRNA ou proteína se refere à expressão de um agente ao mesmo tempo que outro agente. Tal expressão pode somente se sobrepor em parte e também pode ocorrer em tecido diferente ou em níveis diferentes.
[00110] "Nível de óleo total" se refere à quantidade de agregado total de ácido graxo sem levar em conta o tipo de ácido graxo. Como usado aqui, o nível de óleo total não inclui a cadeia principal de glice- rol.
[00111] "Transgene" se refere a uma sequência de ácido nucléico associada com a expressão de um gene introduzida em um organismo. Um transgene inclui, porém não está limitado a, um gene endógeno ou um gene de ocorrência não natural no organismo.
[00112] Uma "planta transgênica" é qualquer planta que estavel- mente incorpora um transgene de uma maneira que facilita a transmissão daquele transgene de uma planta por qualquer método sexual ou assexual.
[00113] Uma composição de óleo de semente de soja "zero saturada" contém menos do que 3,6 por cento de ácidos graxos saturados em peso.
[00114] Uma "mutação de perda de função" é uma mutação na sequência de codificação de um gene, que faz com que a função do produto de gene, normalmente uma proteína, ou seja reduzida ou completamente ausente. Por exemplo, uma mutação de perda de função pode ser causada pela truncação do produto de gene por causa de uma mutação de deslocamento ou sem sentido. Um fenótipo associado com um alelo com uma mutação de perda de função pode ser recessivo ou dominante.
[00115] Uma célula ou organismo pode ter uma família de mais do que um gene que codifica uma enzima particular, e a letra maiúscula que segue a terminologia de gene (A, B, C) é usada para designar o membro da família, isto é, FAD2-1A é um membro da família de gene diferente de FAD2-1B. Semelhantemente, FAD3-1A, FAD3-1B, e FAD3-1C representam os membros distintos da família de gene FAD3- 1. A perda de alelos de função de vários genes é representada em minúscula seguida por um sinal de menos (isto é, fad3-1b - e fad3-1c - representa perda de alelos de função dos genes FAD3-1B e FAD3-1C, respectivamente).
[00116] Como usado aqui, qualquer faixa apresentada é inclusiva dos pontos finais da faixa a menos que de outro modo declarado.
A. Transgene que diminui a expressão do gene FAD2-1 endógeno de soja
[00117] Vários transgenes que diminuem a expressão do gene FAD2-1 endógeno de soja podem ser usados para praticar os métodos da invenção. Ao suprimir, pelo menos parcialmente reduzir, reduzir, substancialmente reduzir, ou eliminar a expressão do gene de FAD2 endógeno efetivamente, a quantidade de proteína FAD2 disponível em uma célula de planta é diminuída, isto é, os níveis de estado constante da proteína FAD2 são reduzidos. Deste modo, uma diminuição na expressão de proteína FAD2 na célula de soja pode resultar em uma proporção aumentada de ácidos graxos mono-insaturados tal como oleato (C18:1). As plantas de soja que contêm transgenes que diminuem a expressão da soja endógena FAD2-1 e produzem semente com ácido oleico aumentado são descritas na Patente U.S. N° 7.067.722.
[00118] Vários transgenes que diminuem a expressão tanto de um FAD2-1 endógeno de soja quanto um gene FATB endógeno de soja podem ser usados para praticar os métodos da invenção para produção de plantas de soja com um fenótipo de ácido pouco linolênico, pouco saturado, meio oleico. Ao suprimir, pelo menos parcialmente reduzir, reduzir, substancialmente reduzir, ou efetivamente eliminar a expressão do gene FATB endógeno, a quantidade de proteína FATB disponível em uma célula de planta é diminuída, isto é os níveis de estado constante da proteína FATB são reduzidos. Quando a quantidade de FATB é diminuída em uma célula de planta, uma quantidade diminuída de ácidos graxos saturados tal como palmitato e estearato, pode ser fornecida. Deste modo, uma diminuição de FATB pode resultar em uma proporção aumentada de ácidos graxos não saturados tal como oleato (18:1).
[00119] Vários métodos para diminuir a expressão de qualquer um: 1) o gene(s) FAD2-1 de soja endógeno ou 2) ambos os genes de FAD2-1 e FATB endógenos de soja em plantas de soja e semente são contemplados por esta invenção, incluindo, porém não limitado a, supressão de anti-sentido, co-supressão, ribozimas, combinações de sentido e anti-sentido (RNAi de filamento duplo), silenciamento de promotor, e uso de proteínas de ligação de DNA tal como proteínas de ligador de zinco. A prática geral destes métodos com respeito aos vários genes de planta endógenos é descrita em WO 98/53083, WO 01/14538, e Patente U.S. 5.759.829. A supressão de expressão de gene em plantas, também conhecida como silenciamento de gene, ocorre tanto no nível transcricional quanto no nível pós-transcricional. Certo destes mecanismos de silenciamento de gene, são associados com homologia de ácido nucléico no nível de DNA ou RNA. Tal homo- logia se refere à semelhança em sequências de DNA ou proteína dentro das mesmas espécies ou entre espécies diferentes. O silenciamento de gene ocorre se a sequência de DNA introduzida em uma célula hospedeira for suficientemente homóloga a um gene endógeno cuja transcrição da sequência de DNA introduzida induzirá ao silenciamento de gene transcricional ou pós-transcricional do gene endógeno. Para praticar esta invenção, as sequências de DNA com pelo menos 50%, cerca de 60%, ou cerca de 70% idênticas no comprimento total de uma sequência de DNA de uma região de codificação ou região de não-codificação de FAD2-1 ou FATB de soja, ou para uma sequência de ácido nucléico que é complementar a uma região de codificação ou não-odificação FAD2-1 ou FATB de soja, têm homologia suficiente para supressão de níveis de expressão de estado constante de FAD2-1 ou FATB quando introduzidos em plantas de soja como transgenes. Os transgenes da invenção compreendem sequências de DNA que são, em seu comprimento total, mais preferivelmente pelo menos 80% idênticas; pelo menos 85% idênticas; pelo menos 90% idênticas; pelo menos 95% idênticas; pelo menos 97% idênticas; pelo menos 98% idênticas; pelo menos 99% idênticas; ou 100% idênticas a uma região de codificação ou região de não-codificação do gene FAD2-1 ou FATB de soja, ou a uma sequência de ácido nucléico que é complementar a uma região de codificação ou não-codificação de gene de FAD2-1 ou FATB de soja. As sequências de DNA com os níveis indicados acima de identidade para o gene(s) FAD2-1 ou FAT de soja podem ser sequências de codificação, sequências de íntron, sequências 3’UTR, se-quências 5'UTR, sequências promotoras, outras sequências de não- codificação, ou qualquer combinação dos anteriores. O íntron pode ser localizado entre os éxon, ou localizado em um UTR 5 ' ou 3 ' de um gene de planta. A sequência de codificação é preferivelmente uma fração de uma estrutura de codificação de proteína que não codifica uma proteína com atividade enzimática de FAD2. Entretanto, é reconhecido que em certos casos, tal como em co-supressão, as sequências de DNA que codificam uma proteína de FATB ou FAD2 enzimaticamente ativa podem ser usadas para diminuir a expressão do gene(s) FAD2-1 ou de FATB endógenos de soja.
[00120] Também é entendido que as sequências de DNA com os níveis indicados acima de identidade para o gene FAD2-1 de soja que são úteis nos métodos desta invenção podem ser derivadas de qualquer gene FAD2 de soja, o gene FAD2-1A de soja (SEQ ID NO:4), o íntron FAD2-1A de soja (SEQ ID NO:1), introns FAD2-1B de soja (SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3), o gene FAD2-2 de soja, alelos do gene FAD2-1 de soja, alelos do gene FAD2-2 de soja, e de genes FAD2 derivados de outras plantas leguminosas tal como Medicago sp., Pisum sp., Vicia sp., Phaseolus sp., e Pisum sp. Está deste modo claro que a sequência de DNA com os níveis indicados de identidade para a sequência de FAD2-1 de soja pode ser derivada de múltiplas fontes. As sequências de DNA com os níveis indicados de identidade de sequência também podem ser obtidas sinteticamente.
[00121] Semelhantemente, também é entendido que as sequências de DNA com os níveis indicados acima de identidade para o gene FATB de soja que são úteis nos métodos desta invenção podem ser derivadas de qualquer gene FATB de soja, um gene FATB-1 de soja (SEQ ID NO:28), introns FATB-1 de soja (SEQ ID NOS:29-35), FATB- 1 5'UTR de soja (SEQ ID NO:36), FATB-1 3'UTR de soja (SEQ ID NO:37), o gene FATB-2 de soja (SEQ ID NO:43), alelos do FATB-1 soja, alelos do gene FATB-2 de soja, e de genes FATB derivados de outras plantas leguminosas tal como Medicago sp., Pisum sp., Vicias sp., Phaseolus sp., e Pisum sp. Está deste modo claro que a sequên-cia de DNA com os níveis indicados de identidade para a sequência FAD2-1 de soja pode ser derivada de fontes múltiplas. As sequências de DNA com os níveis indicados de identidade de sequência também podem ser obtidas sinteticamente.
[00122] Nos métodos desta invenção, os transgenes especificamente designados para produzir as moléculas de RNA de filamento duplo (dsRNA) com homologia para o gene FAD2-1 também podem levar ao silenciamento específico de sequência FAD2-1 e podem ser usados para diminuir a expressão do gene FAD2-1 endógeno de soja. As sequências de filamento de sentido do dsRNA podem ser separadas das sequências de anti-sentido por uma sequência espaçadora, preferivelmente uma que promova a formação de uma molécula de dsRNA. Os exemplos de tais sequências espaçadoras incluem aqueles apresentados em Wesley e outros, Plant J., 27(6):581 -90 (2001), e Hamilton e outros, Plant J., 15:737-746 (1988). Em um aspecto preferido, a sequência espaçadora é capaz de formar uma estrutura de grampo como ilustrado em Wesley e outros, supra. As sequências es- paçadoras particularmente preferidas neste contexto são introns de planta ou partes destes. Um intron de planta particularmente preferido é um intron ligável. Os introns ligáveis incluem, porém não estão limitados a, um intron selecionado do grupo que consiste em intron PDK, intron No. 5 FAD3-1Aou FAD3-1B, intron No. 1FAD3, intron No. 3A de FAD3, intron No. 3B de FAD3, intron No. 3C de FAD3, intron No. 4 de FAD3, intron No. 5 de FAD3, intron No. 1 de FAD2, e intron de FAD2- 2. As moléculas de sentido orientado de não-codificação podem ser, opcionalmente separadas das moléculas anti-sentido orientadas correspondentes por um segmento espaçador de DNA. O segmento es- paçador pode ser um fragmento de gene ou o DNA artificial. O segmento espaçador pode ser curto para facilitar a formação do dsRNA de grampo de cabelo ou longo para facilitar dsRNA sem uma estrutura de grampo de cabelo. O espaçador pode ser fornecido estendendo-se o comprimento de uma das moléculas de sentido ou anti-sentido como descrito na US 2005/0176670 A1. Alternativamente, uma sequência borda direita - borda direita ("RB-RB") pode ser criada após a inserção no genoma de planta como descrito no Pedido de Patente U.S. 2005/0183170.
[00123] Os transgenes da invenção tipicamente incluirão um promotor funcional em uma célula de planta, ou um promotor de planta que é operativamente unido a uma sequência de DNA acima mencionada que diminui a expressão de um gene FAD2-1 ou FATB endógenos de soja. O projeto de um tal vetor geralmente está dentro da capacidade da técnica (Veja, por exemplo, Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark (ed.), Springer, Nova Iorque (1997)). Entretanto, é reconhecido que os constructos ou vetores também podem conter um gene sem promoto que pode utilizar um promotor endógeno em inserção. Vários promotores que são ativos em células de planta foram descritos 35/105 na literatura tal como os promotores de CaMV 35S e FMV. As versões realçadas ou duplicadas dos promotores CaMV 35S e FMV 35S também podem ser usadas para expressar uma sequência de DNA acima mencionada que diminui a expressão de um gene FAD2-1 endógeno (Odell e outros, Nature 313: 810-812 (1985); Patente U.S. No. 5.378.619). Os promotores adicionais que podem ser utilizados são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.378.619; 5.391.725; 5.428.147; 5.447.858; 5.608.144; 5.608.144; 5.614.399; 5.633.441; 5.633.435; e 4.633.436. Além disso, um realçador específico de tecido pode ser usado com um promotor de planta basal. Os promotores basais compreendem tipicamente uma caixa "TATA" e um sítio de estrutura de mRNA porém necessita de elementos realçadores requeridos para níveis elevados de expressão.
[00124] Os promotores particularmente preferidos para uso nos transgenes da presente invenção são promotores que expressam uma sequência de DNA que diminui a expressão de um gene FAD2-1 ou FATB endógenos de soja em sementes ou frutas. Realmente, em uma modalidade preferida, o promotor usado é um promotor específico de semente. Os exemplos de tais promotores específicos de semente incluem as regiões reguladoras 5' de tais genes como napin (Kridl e outros, Seed Sei. Res. 1:209-219 (1991)), faseolina, estearoil-ACP des- saturase, 7Sα, 7Sα' (Chen e outros, Proc. Natl. Acad. Sei., 83:8560- 8564 (1986)), USP, arcelin e oleosina. Os promotores preferidos para expressão na semente são promotores de 7Sα, 7α', napin, e FAD2-1A.
[00125] Os constructos ou vetores também incluirão tipicamente um terminador transcricional 3’ ou sinal de poliadenilação 3' que é operativamente ligado a uma sequência de DNA acima mencionada que diminui expressão de um gene FAD2-1 ou FATB endógenos de soja. O sinal de terminação transcricional pode ser qualquer sinal de terminação transcricional funcional em uma planta, ou qualquer sinal de termi- nação transcricional de planta. Os sinais de terminação transcricionais preferidos incluem, porém não estão limitados a, uma sequência de ervilha Rubisco E9 3', uma sequência de Brassica napin 3', uma sequência de tml 3 e uma sequência de gene 3' de nopalina sintase (NOS) de plasmídeo de indução de tumor (Ti) de Agrobacterium. É entendido que este grupo de regiões de poliadenilação exemplares seja não limitante e alguém versado na técnica poderia empregar outras regiões de poliadenilação que não são citadas aqui explicitamente na prática desta invenção.
[00126] Finalmente, também é reconhecido que podem ser inseridos transgenes da invenção em vetores de transformação de planta que também compreendem genes que codificam marcadores selecionáveis ou de classificáveis. O gene marcador selecionável pode ser um gene que codifica uma proteína de neomicina fosfotransferase, uma proteína de fosfinotricina acetiltransferase, uma proteína de 5- enol-piruvilchiquimato-3-fosfato sintase resistente ao glifosato (EPSPS), uma proteína de higromicina fosfotransferase, uma proteína de diidropteroato sintase, uma proteína de acetolactato sintase insensível à sulfoniluréia, uma proteína Q insensível à atrazina, uma proteína de nitrilase capaz de degradar bromoxinila, uma proteína de dealo- genase capaz de degradar dalapon, uma proteína de 2,4- diclorofenoxiacetato monoxigenase, uma proteína de diidrofolato reductase insensível a metotrexato, e uma proteína de octopina sintase insensível a aminoetilcisteína. Os agentes seletivos correspondentes usados junto com cada gene podem ser: neomicina (para seleção de proteína neomicina fosfotransferase), fosfinotricina (para seleção de proteína fosfinotricina acetiltransferase), glifosato (para seleção de proteína 5-enol-piruvilchiquimato-3-fosfato sintase resistente ao glifosato (EPSPS)), higromicina (para seleção de proteína higromicina fosfotransferase), sulfadiazina (para uma seleção de proteína diidropteroato sintase), clorsulfurona (para uma seleção de proteína acetolactato sin- tase insensível à sulfoniluréia), atrazina (para uma seleção de proteína Q insensível à atrazina), bromoxinila (para uma seleção de proteína nitrilase), dalapon (para uma seleção de proteína dealogenase), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (para uma seleção de proteína 2,4- diclorofenoxiacetato monoxigenase), metotrexato (para uma seleção de proteína diidrofolato reductase insensível a metotrexato), ou amino- etilcisteína (para uma seleção de proteína octopina sintase insensível à aminoetilcisteína). Um gene marcador selecionável preferido é um gene de EPSPS de CP4 que confere resistência ao glifosato herbicida. O gene de marcador classificável pode ser um gene que codifica uma proteína beta-glicuronidase, uma proteína verde fluorescente, uma proteína amarela fluorescente, uma proteína beta-galactosidase, uma proteína luciferase derivada de um gene luc, uma proteína de luciferase derivada de um gene lux, uma proteína sialidase, proteína de es- treptomicina fosfotransferase, uma proteína de nopalina sintase, uma proteína de octopina sintase ou uma proteína cloranfenicol acetil transferase.
[00127] As moléculas de ácido nucléico descritas acima são modalidades que alcançam os objetivos, características e vantagens da presente invenção. Não é pretendido que a presente invenção fique limitada às modalidades ilustradas. A disposição das sequências nos primeiro e segundo grupo D de sequências de DNA na molécula de ácido nucléico não é limitada às disposições ilustradas e descritas, e pode ser alterada de qualquer maneira adequada para alcançar os objetivos, características e vantagens da presente invenção como descrito aqui e ilustrado nos desenhos acompanhantes.
B. Organismos Transqênicos, e Métodos para Produzir o Mesmo
[00128] Quaisquer das moléculas de ácido nucléico e constructos da invenção podem ser introduzidas em uma planta de soja ou célula de planta de uma maneira permanente ou transiória. Os métodos e tecnologia para introdução de DNA em células de planta de soja são bem conhecidas por aqueles de experiência na técnica, e virtualmente qualquer método pelo qual moléculas de ácido nucléico podem ser introduzidas em uma célula é adequado para uso na presente invenção. Os exemplos não limitantes de métodos adequados incluem: métodos químicos; métodos físicos tal como microinjection, eletroporação, a pistola de gene, bombardeio de microprojétil, e infiltração a vácuo; vetores virais; e mecanismos mediados por receptor. Outros métodos de transformação de célula também podem ser usados e podem ser incluídos porém não estão limitados a introdução de DNA em plantas através de transferência de DNA direta em pólen, por injeção direta de DNA em órgãos reprodutivos de uma planta, ou por injeção direta de DNA nas células de embriões imaturos seguido pela reidratação de embriões dessecados.
[00129] A transferência mediada por Agrobacterium é um sistema extensamente aplicável para introduzir genes em células de planta. Veja, por exemplo, Fraley e outros, Bio/Technology 3:629-635 (1985); Rogers e outros, Methods Enzymol. 153:253-277 (1987). A região de DNA a ser transferida é definida pelas sequências fronteiras e o DNA interveniente é normalmente inserido no genoma de planta. Spielmann e outros, Mol. Gen. Genet. 205:34 (1986). Os novos vetores de trans-formação de Agrobacterium são capazes de réplica em E. coli como também Agrobacterium, permitindo manipulações convenientes. Klee e outros, Em: Plant DNA Infectious Agents, Hohn e Schell (eds.), Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 179-203 (1985). A transformação mediada por Agrobacterium de soja especificamente é descrita na Patente U.S. No. 7.002.058.
[00130] As plantas transgênicas são obtidas tipicamente ligando-se o gene de interesse (isto é, neste caso um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 endógeno de soja ou que diminui a expressão tanto de um gene FAD2-1 quanto gene FATB) a um gene marcador selecionável, introduzindo os transgenes ligados em uma célula de planta, um tecido de planta ou uma planta antes de qualquer um dos métodos descritos acima, e regenerando ou de outro modo recuperando a planta transgênica sob condições que requerem ex-pressão do referido gene marcador selecionável para crescimento de planta. Os genes marcadores selecionávéis exemplares e os agentes seletivos correspondentes foram descritos em seções anteriores desta descrição da invenção.
[00131] As plantas transgênicas também podem ser obtidas ligando-se um gene de interesse (isto é, neste caso um transgene que diminui expressão de um gene FAD2-1 endógeno de soja ou que diminui a expressão de ambos um gene FAD2-1 ou gene FATB) a um gene marcador classificável, introduzindo os transgenes ligados em uma célula de planta antes de qualquer um dos métodos descritos acima, e regenerando as plantas transgênicas de células de planta transformadas que testam positivo para expressão do gene marcador classificável. Os genes marcadores classificáveis exemplares foram descritos em seções anteriores desta descrição da invenção.
[00132] A regeneração, desenvolvimento e cultivo de plantas de transformantes de protoplast© de planta única ou de vários explantes transformados, são bem-conhecidos na técnica. Geralmente veja, Ma- liga e outros, Methods in Plant Biologia Molecular, Cold Spring Harbor Press (1995); Weissbach and Weissbach, In: Methods for Plant Biology Molecular, Academic Press, San Diego, CA (1988). As plantas da presente invenção podem ser parte de ou podem ser geradas de um programa de reprodução, e podem ser reproduzidas também usando apomixia. Os métodos para a produção de plantas apomíticas são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. 5.811.636.
[00133] Um método particular de obter plantas de soja pouco linolê- nicas/medianamente oleicas contemplado aqui requer a transformação direta de variedades de soja que compreendem pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja com um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 endógeno de soja. Os exemplos de variedades de soja que compreendem pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja incluem A5, C1640, 6P248, N98-44, T27111, T27190, T26767, T26830, e soja de Soyola® (veja Pedido de Patente U.S. 20060107348 e Burton e outros, Crop Sei. 44:687-688, 2004). Também é contemplado que outras linhagens de soja que compreendem pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja e que possuem crescimento agronomicamente elite e/ou produzem características produzidas pelos métodos de reprodução ajudados pelo marcador descritos em, veja Pedido de Patente U.S. 20060107348 poderiam ser transformadas diretamente com um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 endógeno de soja. Alternativamente, também é contemplado que as linhagens de soja que compreendem pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja e que são sensíveis à transformação podem ser produzidas pelos métodos de reprodução ajudados pelo marcador descritos em, veja Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676. As plantas de soja compreendendo pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja e que são sensíveis à transformação também podem ser transformadas diretamente com um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 endógeno de soja. Três outras sojas pouco linolênicas que poderiam ser transformadas diretamente pelos métodos da invenção incluem BARC12 que é uma linhagem No. 3 de grupo de maturidade determinante, linhagens de soja Vistive® (Monsanto, St.Louis, MO., G- tS> USA), ou 0137648/01AHKW-38, que é uma linhagem hilum amarelo L2 NUL,
[00134] Também é contemplado que as plantas de soja pouco lino- lênicas que são transformadas diretamente com o transgene nos métodos da invenção podem ser derivadas de germoplasma de soja que compreende regiões genômicas de planta de soja que contêm fad3-1b fad3-1c-, ou ambos os alelos fad3-1b- e fad3-1c - que conferem conteúdo de ácido linolênico diminuído. Tais polimorfismos de nucleotídeo único associados com o fenótipo de soja pouco linolênico são descritos no Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676. Em certas modalidades, uma região genômica de soja que confere o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico é caracterizada por um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na sequência de gene FAD3-1B que corresponde ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61. Em outra modalidade, a região genômica de soja que confere o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico, é caracterizada por um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na sequência de gene FAD3-1C que corresponde ao nucleotídeo 687, 1129, 1203, 2316, 3292, 3360 ou 3743 de SEQ ID NO:62. Em outra modalidade, a região genômica de soja que confere o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico é caracterizada por um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição no promotor de FAD3-1C que corresponde ao nucleotídeo 334, 364, 385, 387, 393, 729 ou 747 de SEQ ID NO:63. Em outra modalidade, a região genômica de soja que confere o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico é caracterizada por uma deleção no gene FAD3-1C. As regiões genômicas de soja que conferem o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico também podem ser caracterizadas por ambos um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na sequência de gene FAD3-1B que corresponde ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61 e uma deleção na sequência de gene FAD3-1c. As regiões genômicas de soja que confe- rem o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico também podem ser caracterizadas por ambos um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na sequência de gene FAD3-1B que corresponde ao nucleotídeo 2021 da SEQ ID NO:61 e um polimorfismo no promotor de FAD3-1C, tal como um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição que corresponde ao nucleotídeo 334, 364, 385, 387, 393, 729 ou 747 de SEQ ID NO:63. Germplasma de soja que compreende uma de- leção no gene de soja de FAD3-1C é útil na prática destes métodos e pode ser obtido de linhagens de soja que incluem porém não são limitadas às linhagens de soja 6P248, T27111, T27190, T26767, T26830 e A5, descritas no Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676.
[00135] A detecção dos polimorfismos de nucleotídeo único pode ser realizada por qualquer método, incluindo PCR, análise de polimorfismo conformacional de filamento único, eletroforese de gel de gradiente de desnaturação, análise de polimorfismo de fragmento de comprimento de clivagem e/ou sequenciamento de DNA como descrito no Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676. Alternativamente, o polimorfismo de nucleotídeo único pode ser detectado por qualquer ensaio que seja selecionado do grupo que consiste em extensão de base única (SBE), sequenciamento de extensão de iniciador específico de alelo (ASPE), sequenciamento, PCR universal, extensão específica de alelo, hibridização, espectrometria de massa, ligação, ligação por extensão, e ensaios mediados por Flap Endonuclease. Os iniciadores e métodos para detecção dos polimorfismos genéticos FAD3-1B e FAD3- 1C acima mencionados são descritos no Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676. As deleções tal como aquelas no gene FAD3-1C podem ser detectadas por métodos que incluem porém não estão limitados à PCR, hibridização, análise de polimorfismo de fragmento de comprimento de clivagem e/ou os métodos com base em sequenciamento de DNA.
[00136] Os métodos de transformação diretas como descrito acima também podem ser usados para obter plantas de soja pouco linolêni- cas/pouco saturadas/medianamente oleicas. Nestes métodos, as plantas de soja pouco linolênicas acima mencionadas são transformadas diretamente com transgenes que diminuem a expressão tanto de um gene FAD2-1 endógeno de soja quanto um gene FATB endógeno de soja para produção de plantas de soja com um fenótipo de ácido pouco linolênico, pouco saturado, meio oleico.
[00137] Os transgenes que podem ser usados na transformação ou transfecção de planta podem ser quaisquer dos transgenes que diminuem a expressão de qualquer um: 1) o gene(s) FAD2- 1 endógeno de soja ou 2) ambos gene(s) FAD2-1 e FATB endógenos de soja. É contemplado também que vetores que compreendem transgenes que diminuem a expressão de qualquer um: 1) o gene(s) FAD2-1 endógeno de soja ou 2) ambos os genes FAD2-1 e FATB endógenos de soja também podem compreender ou ser geneticamente combinados com transgenes adicionais. Por exemplo, os transgenes adicionais que expressam outros genes que afetam a composição de óleo, resistência de patógeno, produção, morfologia, composição de proteína, composição de aminoácido, composição de amido, e nível de fitato são descritos no Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676 e podem ser combinados com os transgenes e mutantes poucos linolênicos descritos aqui.
[00138] Não é pretendido que a presente invenção seja limitada às modalidades ilustradas. As moléculas de ácido nucléico exemplares foram descritas na parte A da Descrição Detalhada, e moléculas de ácido nucléico exemplares não-limitantes também são descritas e ilustradas abaixo nas Figuras 1-4, e nos Exemplos.
C. Cruzamentos de Plantas de Soja que Contêm Transgenes
[00139] Em outro aspecto, uma planta da invenção pode ser cruzada com outra planta que seja transgênica ou não-transgênica. Uma planta pode ser cruzada com outra planta que tenha uma composição de óleo que contém níveis modificados de ácidos graxos, por exemplo sem limitação, uma variedade com uma composição de óleo que tem um nível de ácido linolênico mais baixo. Em uma modalidade preferida, uma planta da presente invenção é cruzada com uma variedade com menos do que 3% em peso de ácido linolênico. Em outra modalidade da invenção, uma planta da presente invenção é cruzada com outra planta que tem mais do que 20% em peso do ácido esteárico. Tal planta, tendo níveis modificados de ácidos graxos, é conhecida e descrita na técnica, por exemplo, em Hawkins e Kridl (1998) Plant Journal 13(6):743-752 e Patente U.S. No. 6.365.802.
[00140] Em particular, os cruzamentos de plantas de soja que compreendem um transgene qualquer que diminua a expressão de um gene FAD2-1 endógeno de soja ou diminua a expressão de ambos os genes FAD2-1 e FATB endógenos de soja com variedades de soja que compreendem pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja, são contemplados pelos métodos desta invenção. Os exemplos de variedades de soja que compreendem pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja incluem A5, C1640, 6P248, N98-44, T27111, T27190, T26767, T26830, e soja de Soyola® (veja Pedido de Patente U.S. 20060107348 e Burton e outros, Crop Sei. 44:687-688, 2004). Também é contemplado que outras linhagens de soja que compreendem pelo menos uma mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja e que possuem crescimento agronomicamente elite e/ou produzem características produzidas pelos métodos de reprodução ajudados pelo marcador descritos em, veja Pedido de Patente U.S. 20060107348 poderiam ser cruzadas com plantas de soja que compreendem um transgene que diminui a expressão de um gene FAD2-1 endógeno de soja. Três outros pares de cruzamento pouco 45/105 linolênico que poderiam ser usados nos métodos da invenção incluem BARC12 que é uma linhagem No. 3 de grupo de maturidade determinante, linhagem de soja Vistive®, ou 0137648/01AHKW-38, que é uma linhagem hilum amarelo L2 NUL.
[00141] Também é contemplado que as plantas de soja pouco lino- lênica usadas no cruzamento com o transgene(s) podem ser derivadas de germoplasma de soja que compreende regiões genômicas de planta de soja que contêm fad3-1b fad3-1c-, ou ambos alelos fad3-1b- e fad3-1c- que conferem teor de ácido linolênico diminuído. Tais polimorfismos de nucleotídeo único, associados com o fenótipo de soja pouco linolênico são descritos no Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676. Em certas modalidades, uma região genômica de soja que confere o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico é caracterizada por um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na sequência de gene FAD3-1B que corresponde ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61. Em outra modalidade, a região genômica de soja que confere o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico é caracterizada por um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na sequência de gene FAD3-1C que corresponde ao nucleotídeo 687, 1129, 1203, 2316, 3292, 3360 ou 3743 de SEQ ID NO:62. Em outra modalidade, a região genômica de soja que confere o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico é caracterizada por um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição no promotor de FAD3-1C que corresponde ao nucleotídeo 334, 364, 385, 387, 393, 729 ou 747 de SEQ ID NO:63. Em outra modalidade, a regi-ão genômica de soja que confere o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico é caracterizada por uma deleção no gene FAD3-1C. As regiões genômicas de soja que conferem o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico também podem ser caracterizadas por ambos um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na sequência de gene FAD3 -1B que corresponde ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61 e 46/105 uma deleção na sequência de gene FAD3-1C. As regiões genômicas de soja que conferem o fenótipo de baixo teor de ácido linolênico também podem ser caracterizadas por ambos um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na sequência de gene FAD3-1B que corresponde ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61 e um polimorfismo no promotor de FAD3-1C, como um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição que corresponde ao nucleotídeo 334, 364, 385, 387, 393, 729 ou 747 de SEQ ID NO:63. Germplasma de soja que compreende uma deleção no gene FAD3-1C de soja é útil na prática destes métodos e pode ser obtido de linhagens de soja que incluem porém não estão limitadas à linhagem de soja 6P248, T27111, T27190, T26767, T26830 e A5, descrita no Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676. As Tabelas 3 e 4 dos Exemplos descrevem a associação de polimorfismos específicos com germoplasma de soja específico ou linhagens de soja que exibem fenótipos de ácido pouco linolênico.
[00142] Sem estar limitado por teoria, é também notado que certos polimorfismos e deleções em certos genes FAD3-1C são potencialmente em parte responsáveis pelos fenótipos de ácidos pouco linolê- nicos exibidos por plantas de soja que carregam estes polimorfismos ou deleções. O SNP na 2021 posição em SEQ ID NO:61 é uma mutação de sentido que muda um resíduo de aminoácido de Histidina para Tirosina. O resíduo de histidina foi constatado ser crítico em vários genes envolvidos com a dessaturação. Constatou-se que este SNP particular causou uma mutação no motivo His-Val-lle-His-His a His-Val-lle- His-Tyr nas linhagens pouco linolênicas. O motif foi associado com um fenótipo pouco linolênico e é uma causa provável para o fenótipo de ácido linolênico reduzido observado em sojas com este polimorfismo.
[00143] A detecção do polimorfismo de nucleotídeo único pode ser realizada por qualquer método, incluindo PCR, análise de polimorfismo conformacional de filamento único, eletroforese de gel de gradiente de usw, desnaturação, análise de polimorfismo de fragmento de comprimento de clivagem e/ou sequenciamento de DNA como descrito no Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676, Alternativamente, o polimorfismo de nucleotídeo único pode ser detectado por qualquer ensaio que seja selecionado do grupo que consiste em extensão de base única (SBE), sequenciamento de extensão de iniciador específico de alelo (ASPE), sequenciamento, PCR universal, extensão específica de alelo, hibridi- zação, espectrometria de massa, ligação, ligação por extensão, e ensaios mediados por Flap Endonuclease. Iniciadores e métodos para detecção dos polimorfismos genéticos de FAD3-1B e FAD3-1C acima mencionados são descritos no Pedido de Patente U.S. No. 11/239.676. As deleções tal como aquelas no gene FAD3-1C podem ser detectadas por métodos que incluem porém não podem ser limitados à PCR, hibridização, análise de polimorfismo de fragmento de comprimento de clivagem e/ou métodos com base em sequenciamento de DNA.
[00144] Os métodos de cruzamento como descrito acima também podem ser usados para obter planta de soja pouco linolênicas/pouco saturadas/medianamente oleicas. Nestes métodos, as plantas de soja pouco linolênicas, acima mencionadas são cruzadas com plantas de soja que compreendem transgenes que diminuem a expressão de ambos um gene FAD2-1 endógeno de soja e um gene FATB endógeno de soja para produção de plantas de soja com um fenótipo de ácido pouco linolênico, pouco saturado, meio oleico.
[00145] É contemplado também que os cruzamentos do transge- ne(s) com as linhagens de soja pouco linolênicas, podem ser facilitados por acoplamento de um marcador selecionável que confere resistência a um herbicida. Por exemplo, em cruzamentos de plantas de soja que são heterozigotas para o transgene com plantas que são ho- mozigotas ou heterozigotas para o alelo(s) conferindo a característica de pouco linolênico, progénie de F1 que é heterozigota para o transgene pode ser selecionada através de tratamento de herbicida. Também, as plantas F2 derivadas de plantas F1 que são heterozigotas para o transgene podem ser enriquecidas para planta de soja F2 que são homozigotas para referido transgene submetendo-se a referida pluralidade de plantas F2 à seleção de herbicida para o transgene. Os mar-cadores moleculares que podem distinguir plantas de soja que são heterozigotas ou homozigotas para o transgene também podem ser usados para identificar plantas de soja que são homozigotas para a inserção de transgene.
[00146] As plantas de soja (Glycine max L.) podem ser cruzadas através de qualquer técnica natural ou mecânica. A polinização natural ocorre em sojas ou por polinização propriamente dita ou polinização cruzada natural, que tipicamente é ajudada pela polinização dos organismos. Em cruzamentos naturais ou artificiais, florescência e tempo de florescência são uma consideração importante. A soja é uma planta de dia curto, porém há variação genética considerável quanto à sensi-bilidade ao fotoperíodo. A duração de dia crítico para florescer varia de cerca de 13 h para genótipos adaptados a latitudes tropicais a 24 h para genótipos insensíveis a fotoperíodo crescidos em latitudes mais altas. As sojas parecem ser insensíveis à duração do dia por 9 dias após a emersão. Os fotoperíodos mais curtos que o comprimento de dia crítico são requeridos durante 7 a 26 dias para completar a indução de flor.
[00147] As flores da soja tipicamente são autopolinizadas no dia que a corola abre. O estigma é receptivo ao pólen cerca de 1 dia antes da antese e permanece receptivo durante 2 dias após antese, se as pétalas de flor não forem removidas. Os filamentos de nove estames são fundidos, e o mais próximo do padrão é livre. Os estames formam um anel abaixo do estigma até cerca de 1 dia antes da antese, então 49/105 os seus filamentos começam a se prolongar rapidamente e elevar as anteras ao redor do estigma. As anteras descem no dia da antese, os grãos de pólen caem no estigma, e dentro de 10 h os tubos de pólen alcançam o ovário e a fertilização é completada. A autopolinização ocorre naturalmente em soja sem manipulação das flores. Para o cruzamento de duas plantas de soja, é tipicamente preferível, embora não exigido, utilizar hibridização artificial. Na hibridização artificial, a flor usada como uma fémea em um cruzamento é manualmente polinizada cruzada antes da maturação de pólen da flor, desse modo prevenindo a auto-fertilização, ou alternativamente, as partes masculinas da flor são castradas usando uma técnica conhecida na técnica. As técnicas para castrar as partes masculinas de uma flor de soja incluem, por exemplo, remoção física das partes masculinas, uso de um fator genético que confere esterilidade masculina, e aplicação de uma gametoci- da química às partes masculinas.
[00148] Ou com ou sem emasculação da flor feminina, a polinização manual pode ser realizada removendo os estames e pistilo com um fórceps de uma flor origem masculino e escovando as anteras suavemente contra o estigma da flor feminina. O acesso para os estames pode ser alcançado removendo a sépala dianteira e pétalas de quilha, ou perfurando a quilha com fórceps fechado e os permitindo-a abrir para empurrar as pétalas. A escovação das anteras no estigma faz com que ele rompe, e a porcentagem mais alta de cruzamentos prósperos é obtida quando pólen é claramente visível no estigma. O pólen caído pode ser verificado batendo as anteras antes de escovar o estigma. Várias flores masculinas podem ter que ser usadas para obter pólen adequado caído quando as condições são desfavoráveis, ou o mesmo macho pode ser usado para polinizar várias flores com bom pólen caído.
[00149] A esterilidade masculina genética está disponível em sojas e pode ser útil para facilitar a hibridização no contexto da invenção atual, particularmente para programas de seleção periódica. A distância requerida para isolamento completo de um bloco de cruzamento não está clara; porém, a herança de material genético é menor do que 0,5% quando plantas macho-estéreis forem 12 m ou mais de uma fonte de pólen estrangeira (Boerma e Moradshahi, Crop Sei., 15:858-861, 1975). As plantas nos limites de um bloco de cruzamento provavelmente sustentam a maior parte da herança de material genético com pólen estrangeiro e podem ser eliminadas na colheita para minimizar contaminação.
[00150] Uma vez colhidas, as vagens são tipicamente secadas a ar em não mais do que 38°C até que as sementes contenham 13% de umidade ou menos, então as sementes são removidas manualmente. A semente pode ser armazenada adequadamente em cerca de 25°C durante até um ano se a umidade relativa for 50% ou menos. Em climas úmidos, a porcentagem de germinação declina rapidamente, a menos que a semente seja secada a 7% de umidade e armazenada em um recipiente hermético em temperatura ambiente. O armazenamento em longo prazo em qualquer clima é melhor realizado secando a semente a 7% de umidade e armazenando em 10°C ou menos em um ambiente mantido a 50% de umidade relativa ou em um recipiente hermético.
F. Produtos da Presente invenção
[00151] As plantas da presente invenção podem ser usadas em todo ou em parte. As partes de planta preferidas incluem partes reprodutoras ou de armazenamento. O termo "partes de planta" como usado aqui inclui, sem limitação, semente, endosperma, óvulo, pólen, raízes, tubérculos, talos, folhas, talos, fruta, bagas, nozes, cascas, vagens, sementes e flores. Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção a parte de planta é uma semente. 4
[00152] Quaisquer das plantas ou partes desta da presente invenção pode ser processada para produzir um alimento, refeição, proteína, ou preparação de óleo. Uma parte de planta particularmente preferida para este propósito é uma semente. Em uma modalidade preferida o alimento, refeição, proteína ou preparação de óleo é designada para animais de gado, peixes ou humanos, ou qualquer combinação. Métodos para produzir alimento, refeição, proteína e preparações de óleo são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patentes U.S. 4.957.748. 5.100.679. 5.219.596. 5.936.069. 6.005.076. 6.146.669. e 6.156.227. Em uma modalidade preferida, a preparação de proteína é uma preparação de alto teor de proteína. Uma tal preparação de alto teor de proteína tem um conteúdo de proteína preferivelmente maior do que 5% em peso/volume, mais preferivelmente 10% em pe- so/volume, e até mesmo mais preferivelmente 15% em peso/volume.
[00153] Em uma preparação de óleo preferida, a preparação de óleo é uma preparação com alto teor de óleo com um conteúdo de óleo derivado de uma planta ou parte desta da presente invenção maior do que 5% em peso/volume, mais preferivelmente 10% em peso/volume, e até mesmo mais preferivelmente 15% em peso/volume. Em uma modalidade preferida a preparação de óleo é um líquido e de um volume maior que 1, 5, 10 ou 50 litros. A presente invenção fornece óleo produzido de plantas da presente invenção ou gerado por um método da presente invenção. Tal óleo pode exibir estabilidade oxida- tiva aumentada. Também, tal óleo pode ser um componente secundário ou principal de qualquer produto resultante.
[00154] Além disso, tal óleo pode ser misturado com outros óleos. Em uma modalidade preferida, o óleo produzido de plantas da presente invenção ou gerado por um método da presente invenção constitui mais do que 0,5%, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou 90% em volume ou peso do componente de óleo de qualquer produto. Em outra moda- 52/105 lidade, a preparação de óleo pode ser misturada e pode constituir mais do que 10%, 25%, 35%, 50% ou 75% da mistura em volume. O óleo produzido de uma planta da presente invenção pode ser misturado com um ou mais solventes orgânicos ou destilados de petróleo.
[00155] As sementes das plantas podem ser colocadas em um recipiente. Como usado aqui, um recipiente é qualquer objeto capaz de guardar tal semente. Um recipiente contém mais do que cerca de 500, 1,000, 5,000, ou 25,000 sementes preferivelmente onde pelo menos cerca de 10%, 25%, 50%, 75% ou 100% das sementes são derivados de uma planta da presente invenção. A presente invenção também fornece um recipiente de mais do que cerca de 10.000, mais preferivelmente cerca de 20.000, e até mesmo mais preferivelmente cerca de 40.000 sementes onde mais do que cerca de 10%, mais preferivelmente cerca de 25%, mais preferivelmente 50% e até mesmo mais preferivelmente cerca de 75% ou 90% das sementes são sementes derivadas de uma planta da presente invenção. A presente invenção também fornece um recipiente de mais do que cerca de 10 kg, mais preferivelmente cerca de 25 kg, e até mesmo mais preferivelmente cerca de 50 kg de sementes onde mais do que cerca de 10%, mais preferivelmente cerca de 25%, mais preferivelmente cerca de 50% e até mesmo mais preferivelmente cerca de 75% ou 90% das sementes são sementes derivadas de uma planta da presente invenção.
[00156] As sementes de soja produzidas pelos métodos da invenção podem compreender várias composições de óleo. Um óleo produzido por sementes de soja produzidas pelos métodos da invenção é referido abaixo como um "óleo da presente invenção".
[00157] Um óleo preferido da presente invenção tem uma composição de óleo pouco saturada, ou uma composição de óleo zero saturada. Em outras modalidades preferidas, os óleos da presente invenção aumentaram os níveis de ácido oleico, reduziram os níveis de ácido í graxo saturado, e reduziram os níveis de ácido graxo poliinsaturado. Em modalidades preferidas adicionais, os óleos da presente invenção aumentaram os níveis de ácido oleico e reduziram os níveis de ácido graxo saturado. Em uma modalidade preferida, o óleo é um óleo de soja. As porcentagens de conteúdo de ácido graxo, ou níveis de ácido graxo, usados aqui se referem às porcentagens em peso.
[00158] Em uma primeira modalidade, um óleo da presente invenção tem uma composição de óleo que é 55 a 80% de ácido oleico, cerca de 12 a 43% de poliinsaturados, preferivelmente e 2 a 8% de ácidos graxos saturados; mais preferivelmente tem uma composição de óleo que é 55 a 80% de ácido oleico, cerca de 14 a 42% de poliinsaturados, e 3 a 6% de ácidos graxos saturados; e até mesmo mais preferivelmente tem uma composição de óleo que é 55 a 80% de ácido oleico, cerca de 16,5 a 43% de poliinsaturados, e 2 a 3,6% de ácidos graxos saturados.
[00159] Em uma segunda modalidade, um óleo da presente invenção tem uma composição de óleo que é 65 a 80% de ácido oleico, cerca de 12 a 33% de poliinsaturados, preferivelmente e 2 a 8% de ácidos graxos saturados; mais preferivelmente tem uma composição de óleo que é 65 a 80% de ácido oleico, cerca de 14 a 32% de poliinsaturados, e 3 a 6% de ácidos graxos saturados; e até mesmo mais preferivelmente tem uma composição de óleo que é 65 a 80% de ácido oleico, cerca de 16,5 a 33% de poliinsaturados, e 2 a 3,6% de ácidos graxos saturados.
[00160] Em uma terceira modalidade, um óleo da presente invenção preferivelmente tem uma composição de óleo que é cerca de 42 a cerca de 85% de ácido oleico e cerca de 8% a cerca de 1,5% de ácidos graxos saturados.
[00161] Em uma quarta modalidade, um óleo da presente invenção tem uma composição de óleo que é cerca de 42 a cerca de 85% de ácido oleico, cerca de 8% a cerca de 1,5% de ácidos graxos saturados, cerca de 6% a cerca de 15% em peso de ácido linolênico; mais preferivelmente tem uma composição de óleo que é cerca de 42 a cerca de 85% de ácido oleico, cerca de 8% a cerca de 1,5% de ácidos graxos saturados, menos do que 35% em peso de ácido linolênico; e até mesmo mais preferivelmente tem uma composição de óleo que é cerca de 42 a cerca de 85% de ácido oleico, cerca de 8% a cerca de 1,5% de ácidos graxos saturados, cerca de 9% em peso de ácido linolênico.
[00162] Em uma quinta modalidade, um óleo da presente invenção tem uma composição de óleo que é cerca de 50% a cerca de 85% de ácido oleico e cerca de 8% a cerca de 1,5% de ácidos graxos saturados; mais preferivelmente cerca de 50% a cerca de 85% de ácido oleico, cerca de 8% a cerca de 1,5% de ácidos graxos saturados, cerca de 4% a cerca de 14% em peso de ácido linolênico; mais preferivelmente tem uma composição de óleo que é cerca de 50% a cerca de 85% de ácido oleico, cerca de 8% a cerca de 1,5% de ácidos graxos saturados, menos do que 35% em peso de ácido linolênico; e até mesmo mais preferivelmente tem uma composição de óleo que é cerca de 42 a cerca de 85% de ácido oleico, cerca de 8% a cerca de 1,5% de ácidos graxos saturados, cerca de 2% a cerca de 45% em peso de ácido linolênico.
[00163] Em outra modalidade, um óleo da presente invenção tem uma composição de óleo que é cerca de 65-80% de ácido oleico, cerca de 3-8% de saturados, e cerca de 12-32% de poliinsaturados. Em outra modalidade, um óleo da presente invenção tem uma composição de óleo que é cerca de 65-80% de ácido oleico, cerca de 2-3,5% de saturados, e cerca de 16,5-33% de poliinsaturados.
[00164] Em uma modalidade particularmente preferida, um óleo da presente invenção tem uma composição de óleo que é cerca de 47- 55/105 83% de ácido oleico e cerca de 5% de saturados; cerca de 60-80% de ácido oleico e cerca de 5% de saturados; cerca de 50-85% de ácido oleico e cerca de 2-7% de saturados; cerca de 55-85% de ácido oleico e cerca de 2,5-7% de saturados; cerca de 47-88% de ácido oleico e cerca de 3-7% de saturados; cerca de 43-85% de ácido oleico e cerca de 5-7% de saturados; cerca de 81-85% de ácido oleico e cerca de 5% de saturados; cerca de 74-83% de ácido oleico e cerca de 6% de saturados; cerca de 65-87% de ácido oleico e cerca de 6% de saturados; cerca de 66-80% de ácido oleico e cerca de 6% de saturados; cerca de 42-77% de ácido oleico e cerca de 5-8% de saturados; cerca de 60- 77% de ácido oleico e cerca de 6% de saturados; cerca de 70-81% de ácido oleico e cerca de 5-7% de saturados; cerca de 52-71% de ácido oleico e cerca de 5-7% de saturados; cerca de 44-71% de ácido oleico e cerca de 6% de saturados; cerca de 61-71% de ácido oleico e cerca de 8% de saturados; cerca de 57-71% de ácido oleico e cerca de 7% de saturados; cerca de 23-58% de ácido oleico e cerca de 8-14% de saturados; cerca de 20-70% de ácido oleico e cerca de 6% de saturados; cerca de 21-35% de ácido oleico e cerca de 5-6% de saturados; ou cerca de 19-28% de ácido oleico e cerca de 5% de saturados.
[00165] Em outras modalidades, a porcentagem de ácido oleico é 50% ou maior; 55% ou maior; 60% ou maior; 65% ou maior; 70% ou maior; 75% ou maior; ou 80% ou maior; ou é uma faixa de 50 a 80%; 55 a 80%; 55 a 75%; 55 a 65%; 60 a 85%; 60 a 80%; 60 a 75%; 60 a 70%; 65 a 85%; 65 a 80%; 65 a 75%; 65 a 70%; ou 69 a 73%. As faixas de porcentagem adequadas para o conteúdo de ácido oleico em óleos da presente invenção também incluem faixas nas quais o limite mais baixo é selecionado das seguintes porcentagens: 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, ou 80 por cento; e o limite superior é selecionado das seguintes porcentagens: 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ou 90 por cento.
[00166] Em outras modalidades, a porcentagem de ácido linolênico em um óleo da presente invenção é 10% ou menos; 9% ou menos; 8% ou menos; 7% ou menos; 6% ou menos; 5% ou menos; 4.5% ou menos; 4% ou menos; 3,5% ou menos; 3% ou menos; 3,0% ou menos; 2,5% ou menos; ou 2% ou menos; ou é uma faixa de 0,5 a 2%; 0,5 a 3%; 0,5 a 4,5%; 0,5% a 6%; 3 a 5%; 3 a 6%; 3 a 8%; 1 a 2%; 1 a 3%; ou 1 a 4%.
[00167] Nestas outras modalidades, a porcentagem de ácidos graxos saturados em uma composição de óleo da presente invenção é 15% ou menos; 14% ou menos; 13% ou menos; 12% ou menos, 11% ou menos; 10% ou menos; 9% ou menos; 8% ou menos; 7% ou menos; 6% ou menos; 5% ou menos; 4% ou menos; ou 3,6% ou menos; ou é uma faixa de 2 a 3%; 2 a 3.6%; 2 a 4%; 2 a 8%; 3 a 15%; 3 a 10%; 3 a 8%; 3 a 6%; 3,6 a 7%; 5 a 8%; 7 a 10%; ou 10 a 15%.
[00168] Em outras modalidades, os ácidos graxos saturados em um óleo da presente invenção incluem a combinação dos ácidos graxos esteáricos e palmíticos. Em uma modalidade, a porcentagem de ácidos graxos saturados varia de cerca de 10% ou menos; cerca de 9% ou menos; cerca de 8% ou menos; cerca de 7% ou menos; cerca de 6% ou menos; cerca de 5% ou menos; cerca de 4,5% ou menos; cerca de 4% ou menos; cerca de 3,5% ou menos; cerca de 3% ou menos; cerca de 3,0% ou menos; cerca de 2,5% ou menos; ou cerca de 2% ou menos; ou é uma faixa de 0,5 a 2%; 0,5 a 3%; 0,5 a 4,5%; 0,5 a 6%; 0,5 a 7%; 0,5 a 8%; 0,5 a 9%; 1 a 4%; 1 a 5%; 1 a 6%; 1 a 7%; 1 a 8%; 1 a 9%; 1,5 a 5%; 1,5 a 6%; 1,5 a 7%; 1,5 a 8%; 1,5 a 9%; 2 a 5%; 2 a 6%; 2 a 7%; 2 a 8%; 2 a 9%; 3 a 5%; 3 a 6%; 3 a 7%; 3 a 8%; 3 a 9%; 4 a 7%; 4 a 8%; 4 a 9%; 5 a 7%; 5 a 8%; e 5 a 9%. Nestas modalidades, as faixas de porcentagem adequadas para conteúdo de ácido graxo saturado em óleos da presente invenção também incluem faixas nas quais o limite mais baixo é selecionado das seguintes porcentagens: 0,5, 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, ou 6,5 por cento; e o limite superior é selecionado das seguintes porcentagens: 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, ou 0,5 por cento.
G. Modulação de Supressão
[00169] Outra modalidade da invenção é voltada a um método para modular níveis de supressão de gene. A modulação de supressão de gene pode resultar em mais ou menos supressão de gene. A supressão de um produto de gene pode ser o resultado de inserção de um constructo da presente invenção em um genoma de planta. Semelhantemente, a modulação de supressão de gene pode ser o resultado de inserção de um constructo da presente invenção em um genoma de planta. Outros exemplos de métodos para modular supressão de gene incluem, sem limitação, técnicas de anti-sentido, co-supressão, interferência de RNA (dsRNAi), animais transgênicos, híbridos, e ribozimas que usam uma construção da presente invenção. Os seguintes exemplos são fornecidos como forma de ilustração, e não é pretendido serem limitantes da presente invenção.
[00170] A supressão de um gene pode ser modulada alterando-se o comprimento do DNA que pode ser transcrito usado para supressão, cuja sequência é derivada do gene alvo para supressão. Muitos métodos podem ser usados para suprimir um gene que usa mecanismos de silenciamento de gene pós-transcricional. Sem estar limitado à teoria, acredita-se que estes métodos tenham em comum a expressão de uma molécula de RNA que hibridiza para outra molécula de RNA. Sur-preendentemente, pode ser vantajoso usar uma molécula de RNA de comprimentos particulares para modular ou moderar a supressão dos níveis de expressão de estado constante de um gene endógeno alvo.
[00171] Supressão de gene de FAD2-1 leva a níveis elevados de ácido oleico e redução de níveis de ácido linoleico. Quando FAD2-1 é suprimido pesadamente, os níveis de ácido oleico podem ser maiores do que 65%, que causa uma redução em níveis de ácido palmítico e ácido linolênico. Por exemplo, quando FAD2-1 é suprimido, os níveis de ácido oleico podem alcançar 85% e os níveis de ácido palmítico e esteárico combinados são reduzidos em cerca de 10%. Semelhantemente, a sub-regulação de FATB resulta em níveis diminuídos de ácidos graxos saturados, principalmente palmitato. Quando FAD2 e FATB são suprimidos, então aqueles níveis oleicos são de cerca de 85%, os níveis de saturados são de cerca de 10%. Quando FAD2 e FATB são suprimidos, então aqueles níveis de oleico são cerca de 85%, os níveis de saturados podem cair para abaixo de 10%.
[00172] Levando em conta a presente invenção, os níveis de saturados podem ser reduzidos para menos do que 10% sem aumentar os ácidos oleicos acima de 85%. Em uma modalidade, a supressão de FAD2 é modulada reduzindo o comprimento de íntron de FAD2-1 introduzido na planta. Menos supressão de FAD2 resulta em níveis moderados de ácido oleico, aproximadamente 40-85% de ácido oleico. A supressão de FAD2 é reduzida quando o comprimento do fragmento de íntron de FAD2-1 introduzido é reduzido. Por exemplo, um íntron de FAD2-1 reduzido em comprimento em pelo menos 100 nucleotídeos contíguos pode reduzir a supressão de FAD2 e o aumento correspondente em ácido oleico e diminuir em níveis de ácido linoleico.
[00173] A relação entre a diminuição em supressão de gene endógeno e a diminuição em comprimento de DNA homólogo pode ser determinada empiricamente introduzindo comprimentos diferentes de DNA. Por exemplo, a quantidade de redução em supressão obtenível por redução do comprimento de DNA introduzido homólogo pode ser determinada deletando-se as porções crescentes do DNA homólogo sendo introduzido e ensaiando para expressão do gene alvo. I í c2 í *%-, । c
[00174] Incluído na presente invenção é um método para moderar a supressão de FAD2 ao mesmo tempo em que ainda tendo uma redução forte de níveis saturados em uma planta. Em tal planta, os níveis de ácido oleico podem variar de 40-85%. Semelhantemente, menos do que a supressão completa de FATB ocorre quando as regiões não transladadas combinadas 3 ' e 5 ' são introduzidas quando comparadas quando o gene FATB de tamanho natural é introduzido em uma célula hospedeira. Da mesma maneira, os níveis de supressão de FATB são reduzidos quando a parte 5 ' da estrutura de leitura aberta, que principalmente codifica o peptídeo de trânsito de cloroplasto, é introduzida em uma célula hospedeira. Em células com FAD2 e FATB suprimiu usando métodos de acordo com a presente invenção, níveis de ácido oleico podem ser 40-85% ao mesmo tempo em que os níveis saturados podem estar entre 1 a 9 por cento.
[00175] Em uma modalidade, a presente invenção está voltada a um método de modular a supressão de gene para reduzir a supressão relativa à supressão de um elemento de gene inteiro, onde um elemento de gene inteiro pode ser um gene inteiro, um éxon inteiro, um íntron inteiro, uma sequência de sinal inteira, ou um UTR inteiro, em seguida construindo uma molécula de ácido nucléico recombinante que compreende um fragmento da sequência endógena do elemento de gene; iniciando a expressão da molécula de ácido nucléico recombinante em uma célula hospedeira; e suprimindo o gene endógeno com a molécula de ácido nucléico recombinante. O gene que é suprimido pode ser qualquer gene, incluindo FAD2 e FATB. Em uma modalidade, a presente invenção está voltada a um método para modular supressão de FAD2 ou FATB que compreende: expressar uma sequência de elemento de gene FAD2 ou FATB parcial em uma célula hospedeira onde um elemento de gene FAD2 ou FATB é de um gene FAD2 ou FATB endógeno na célula hospedeira e uma sequência de elemento de gene FAD2 ou FATB pode ser um gene FAD2 ou FATB, um éxon de FAD2 ou FATB, um intron de FAD2 ou FATB, uma região de codificação de peptídeo de trânsito FAD2 ou FATB, ou um UTR de FAD2 ou FATB; e a sequência de elemento de gene FAD2 ou FATB parcial é menor do que a sequência de elemento de gene FAD2 ou FATB inteira; e suprimindo um FAD2 ou FATB endógeno com a sequência de elemento de gene FAD2 ou FATB parcial onde os níveis de supressão do gene FAD2 ou FATB endógeno na célula hospedeira são menores do que os níveis de supressão do gene FAD2 ou FATB endógeno em uma célula hospedeira com uma base genética similar e uma segunda sequência de ácido nucléico de FAD2 ou FATB que compreendem a sequência de elemento de gene FAD2 ou FATB inteira do elemento de gene FAD2 ou FATB.
[00176] Em outra modalidade, a presente invenção está voltada a um método para alterar a composição de óleo de uma célula de planta transformando-se uma célula de planta com uma molécula de ácido nucléico recombinante que compreende uma sequência de DNA que suprime expressão endógena de FAD2, FATB, ou FAD2 e FATB onde a sequência de DNA compreende uma sequência de ácido nucléico de FAD2, FATB, ou FAD2 e FATB que é mais curta do que a sequência inteira de um elemento genético inteiro selecionado de um gene, um éxon, um íntron, uma região de codificação de peptídeo de trânsito, um 3'-UTR, um 5'-UTR, e uma estrutura de leitura aberta; e cultivando a célula de planta sob condições onde a referida transcrição de sequência de DNA é iniciada, por meio da qual a composição de óleo é alterada relativa a uma célula de planta com uma base genética semelhante porém necessitando da molécula de ácido nucléico recombinante. Um elemento de gene FAD2 ou FATB pode ser encurtado em comprimento por 50, 75, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 800, 1000, 2000, 3000, ou 4000 nucleotídeos. Um comprimento de um elemento de gene FAD2 ou FATB pode ser 50, 75, 100, 150, 175, 200, 220, 250, 300, 320, 350, 400, 420, 450, 500, 550, 600, 800, ou 1000 nucleotídeos.
[00177] Em outra modalidade, a presente invenção está voltada a um método para aumentar o conteúdo de ácido oleico e reduzir o conteúdo de ácido graxo saturado em uma semente de planta: i) encurtando-se o comprimento de uma sequência de DNA de FAD2 exógena em uma célula hospedeira até que a quantidade de supressão de expressão de FAD2 de uma planta transformada seja reduzida pelo menos parcialmente relativa à supressão de expressão de FAD2 em uma célula hospedeira com uma base genética similar e uma sequência de DNA de gene FAD2 exógeno inteiro; e ii) cultivando-se uma planta com uma molécula de ácido nucléico que compreende a sequência de DNA de FAD2 encurtada onde a sequência de DNA de FAD2 encurtada pelo menos parcialmente suprime a expressão endógena de FAD2; e iii) cultivando-se uma planta que produz semente com um conteúdo de ácido graxo saturado reduzido relativo a semente de uma planta tendo uma base genética similar porém necessitando de sequência de DNA de FAD2 encurtada. A quantidade que a sequência de DNA de FAD2 exógena é encurtada para pelo menos parcialmente reduzir a supressão do FAD2 endógeno pode ser determinada empiricamente introduzindo-se comprimentos diferentes de DNA. Por exemplo, a quantidade de redução em supressão obtenível reduzindo-se o comprimento de DNA introduzido homólogo, pode ser determinada dele- tando-se as porções crescentes do DNA homólogo sendo introduzido e ensaiando quanto à expressão do gene alvo. A quantidade de supressão de expressão de FAD2 pode ser obtida como uma média de três ou mais, seis ou mais, dez ou mais, quinze ou mais, ou vinte ou mais sementes de uma planta.
[00178] Em outra modalidade, a presente invenção está voltada a um método para produzir uma planta transformada que tem semente com um conteúdo de ácido graxo saturado reduzido transformando-se uma célula de planta com uma molécula de ácido nucléico recombi- nante que compreende uma sequência de DNA que suprime a expressão endógena de FAD2 e FATB onde a sequência de DNA compreende uma sequência de ácido nucléico de FAD2 que é mais curta do que a sequência inteira de um elemento genético inteiro selecionado de um gene, um éxon, um íntron, uma região de codificação de peptídeo de trânsito, e um UTR; e cultivando a planta transformada onde a planta transformada produz semente com um teor de ácido graxo saturado reduzido relativo à semente de uma planta tendo uma base genética similar porém necessitando da referida molécula de ácido nucléico re- combinante.
[00179] Em outra modalidade, a presente invenção está voltada a um método de modular a composição de ácido graxo de óleo de uma semente de uma colheita de semente de óleo temperada isolando-se um elemento genético de pelo menos 40 nucleotídeos em comprimento que é capaz de suprimir a expressão de um gene endógeno na série de reação de síntese de ácido graxo; gerando-se mais do que um fragmento encurtado do elemento genético; introduzindo-se cada do mais que um fragmento encurtado em uma célula de planta da colheita de semente de óleo temperada para produzir planta transgênica; e selecionando-se uma planta transgênica que compreende um fragmento encurtado de determinado comprimento e sequência que efetuam uma mudança desejável na composição de ácido graxo de óleo de semente. Em uma modalidade preferida, o método acima também inclui construir uma construção de DNA recombinante tendo pelo menos dois fragmentos encurtados de dois genes endógenos diferentes que efetuam mudanças desejáveis diferentes em composição de ácido graxo de óleo de semente; introduzir o constructo de DNA recombinan- te em uma célula de planta da colheita de semente de óleo temperada para produzir plantas transgênicas; e selecionar uma planta transgêni- ca que compreende o pelo menos dois fragmentos encurtados e uma composição de ácido graxo de óleo de uma semente que tem mais do que uma mudança desejável efetuada pelo, pelo menos dois fragmentos encurtados.
[00180] Em outra modalidade, a presente invenção está voltada a uma semente de soja que exibe uma composição de óleo que tem um conteúdo de ácido graxo saturado fortemente reduzido e um conteúdo de ácido oleico moderadamente aumentado que tem uma sequência de DNA que suprime a expressão endógena de FAD2 em uma célula hospedeira onde a sequência de DNA tem uma sequência de ácido nucléico de FAD2 que é mais curta do que a sequência inteira de um elemento genético inteiro selecionado de um gene, um éxon, um intron, uma região de codificação de peptídeo de trânsito, e um UTR.
Exemplos
[00181] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Deveria ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam técnicas descritas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção, e deste modo podem ser consideradas constituírem modos preferidos para sua prática. Entretanto, aqueles de experiência na técnica deveriam, levando em conta a presente descrição, apreciar que podem ser feitas muitas mudanças nas modalidades específicas que são descritas e ainda obtêm um resultado igual ou similar sem afastar-se do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que são ambos quimicamente e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui ao mesmo tempo em que os mesmos resultados ou resultados similares seriam obtidos. Todos tais substitutos e modificações similares evidentes para aqueles versados na técnica são julgados estar dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações apensas.
Exemplo 1. Isolamento de sequências de FATB-2
[00182] Tecido de folha é obtido de variedade de soja Asgrow A3244, moído em nitrogênio líquido e é armazenado em 80°C até uso. Seis ml de tampão de extração de SDS (650 ml de ddH20 estéril, 100 ml de 1M de Tris-CI pH 8, 100 ml de 0,25M de EDTA, 50 ml de SDS a 20%, 100 ml de 5M de NaCI, 4μl de beta-mercaptoetanol) são adicionados a 2 ml de tecido de folha congelada/moída, e a mistura é incubada a 65°C durante 45 minutos. A amostra é agitada a cada 15 minutos. 2 ml de 5M de acetato de potássio gelado são adicionados à amostra, a amostra é agitada, e então é incubada em gelo durante 20 minutos. 3 ml de CHCI3 são adicionados à amostra e a amostra é agitada durante 10 minutos.
[00183] A amostra é centrifugada em 10.000 rpm durante 20 minutos e o sobrenadante é coletado. 2 ml de isopropanol são adicionados ao sobrenadante e misturados. A amostra é então centrifugada a 10.000 rpm durante 20 minutos e o sobrenadante é escoado. O pélete é novamente suspenso em 200 μl de RNase e incubado a 65°C durante 20 minutos. 300 μl de acetato de amônio/isopropanol (1:7) são adicionados e misturados. A amostra é então centrifugada em 10.000 rpm durante 15 minutos e o sobrenadante é descartado. O pélete é enxaguado com 500 μl de etanol a 80% e permitido secar a ar. O pélete de DNA genômico é então novamente suspenso em 200 μl de T10E1 (10 mM de Tris:1mM de EDTA).
[00184] Uma sequência contígua de cDNA de FATB-2 de soja (SEQ ID NO: 42) é usada para designar treze oligonucleotídeos que ampliam o gene: F1 (SEQ ID NO: 48), F2 (SEQ ID NO: 49), F3 (SEQ ID NO: 50), F4 (SEQ ID NO: 51), F5 (SEQ ID NO: 52), F6 (SEQ ID NO: 53), F7 (SEQ ID NO: 54), R1 (SEQ ID NO: 55), R2 (SEQ ID NO: 56), R3 (SEQ ID NO: 57), R4 (SEQ ID NO: 58), R5 (SEQ ID NO: 59), e R6 (SEQ ID NO: 60). Os oligonucleotideos são usados em pares para amplificação de PCR do DNA genômico de soja isolada: par 1 (F1 + R1), par 2 (F2 + R1), par (F3 + R2), par 4 (F4 + R3), par 5 (F5 + R4), par 6 (F6 + R5), e par 7 (F7 + R6). A amplificação de PCR para par 5 é realizada como segue: 1 ciclo, 95°C durante 10 minutos; 30 ciclos, 95°C durante 15 segundos, 43°C durante 30 segundos, 72°C durante 45 segundos; 1 ciclo, 72°C durante 7 minutos. Para todos os outros pares de oligo, as amplificações de PCR são realizadas como segue: 1 ciclo, 95°C durante 10 minutos; 30 ciclos, 95°C durante 15 segundos, 48°C durante 30 segundos, 72°C durante 45 segundos; 1 ciclo, 72°C durante 7 minutos, fragmentos positivos São obtidos de pares de inici-ador 1, 2, 4, 5, 6 e 7. Cada fragmento é clonado no vetor pCR2.1 (Invi- trogen). Os fragmentos 2, 4, 5 e 6 são confirmados e sequenciados. Estas quatro sequências são alinhadas para formar uma sequência genômica para o gene de FATB-2 (SEQ ID NO: 43).
[00185] Quatro introns são identificados no gene FATB-2 de soja por comparação da sequência genômica com a sequência de cDNA: intron I (SEQ ID NO: 44) amplia base 119 a base 1333 da sequência genômica (SEQ ID NO: 43) e é 1215 pares de base em comprimento; intron II (SEQ ID NO: 45) amplia base 2231 a base 2568 da sequência genômica (SEQ ID NO: 43) e é 338 pares de base em comprimento; intron III (SEQ ID NO: 46) amplia a base 2702 a base 3342 da sequência genômica (SEQ ID NO: 43) e é 641 pares de base em comprimento; e intron IV (SEQ ID NO: 47) amplia a base 3457 a base 3823 da sequência genômica (SEQ ID NO: 43) e é 367 pares de base em comprimento.
Exemplo 2. Constructos de Supressão 2A. Constructos de FAD2-1
[00186] O intron de FAD2-1A No. 1(SEQ ID NO: 1) é clonado no cassete de expressão, pCGN3892, em orientações de sentido e anti- sentido. O vetor pCGN3892 contém o promotor 7S de soja e uma ervilha rbcS 3'. Ambas as fusões de gene são então separadamente ligadas em pCGN9372, um vetor que contém o gene de EPSPS de CP4 regulado pelo promotor de FMV. Os constructos de expressão resultantes (sentido de pCGN5469 e anti-sentido de pCGN5471, descritos nas figuras 1 e 2, respectivamente) são usadas para transformação de soja.
[00187] O intron de FAD2-1B (SEQ ID NO: 2) é fundido no terminal de 3' do intron de FAD2-1A No.1 em plasmídeo pCGN5468 (contém o promotor 7S de soja fundido ao intron de FAD2-1A (sentido) e uma ervilha rbcS 3 ') ou pCGN5470 (contém o promotor 7S de soja fundido ao intron de FAD2-1A (anti-sentido) e uma ervilha rbcS 3') em orientação de sentido e anti-sentido, respectivamente. As fusões de combina-ção de intron resultantes são então separadamente ligadas em pCGN9372, um vetor que contém o gene de EPSPS de CP4 regulado pelo promotor de FMV. As construções de expressão resultantes (sentido de intron de pCGN5485, FAD2-1A & FAD2-1B e pCGN5486, FAD2-1A & anti-sentido de intron de FAD2-1B) são usados para transformação de soja.
2B. Constructos de FAD3-1
[00188] Introns de FAD3-1A No. 1, No. 2, No. 4 e No. 5 (SEQ ID NOs: 7, 8, 10 e 11, respectivamente), introns de FAD3-1B No. 3C (SEQ ID NO: 23) e No. 4 (SEQ ID NO: 24), são todos separadamente ligados em pCGN3892, em orientação de sentido ou anti-sentido. pCGN3892 contém o promotor 7S de soja e uma ervilha rbcS 3'. Estas fusões são ligadas em pCGN9372, um vetor que contém o gene de EPSPS de CP4 regulado pelo promotor de FMV para transformação em soja. Os constructos de expressão resultantes (pCGN5455, sentido de intron de FAD3-1A No. 4; pCGN5459, anti-sentido de intron de FAD3-1A No. 4; pCGN5456, sentido de íntron de FAD3 No. 5; pCGN5460, anti-sentido de intron de FAD3-1A No. 5; pCGN5466, anti- sentido de intron de FAD3-1A No. 2; pCGN5473, anti-sentido de intron de FAD3-1A No. 1) são usados para transformação de soja.
2C. Constructos de FatB
[00189] A sequência de intron II de FATB-1 de soja (SEQ ID NO: 30) é ampliada por PCR que usa um clone genômico parcial de FATB- 1 como um modelo. A amplificação de PCR é realizada como segue: 1 ciclo, 95°C durante 10 min; 25 ciclos, 95oC durante 30 segundos, 62°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos; 1 ciclo, 72°C para 7 min. A amplificação de PCR resulta em um produto que é 854 pares de base longo, incluindo sítios de restrição reconstruídos em ambos os terminais. O produto de PCR é clonado diretamente no pCGN3892 de cassete de expressão em orientação de sentido, por via de sítios de Xhol construídos sobre os terminais 5' dos iniciadores de PCR, para formar pMON70674. PCGN3892 de vetor contém o promotor 7S de soja e uma ervilha rbcS 3'. pMON70674 é então cortado com Notl e ligado em pMON41164, um vetor que contém o gene de EPSPS de CP4 regulado pelo promotor de FMV. O constructo de expressão de gene resultante, pMON70678, é usado para transformação de soja que usa métodos de Agrobacterium.
2D Constructos de Combinação
[00190] Os constructos de expressão são feitos contendo várias permutações de: 1) umas sequências de FAD2-1 sozinhas (para métodos de produção de soja pouco linolênica, medianamente oleica) e 2) combinações sequências de DNA de FAD2-1 e FATB. As sequências de DNA são quaisquer daquelas descritas, ou ilustradas na Tabela 2, ou qualquer outro grupo de sequências de DNA que contém várias combinações de regiões de não-codificação ou codificação de FAD2 e/ou FATB de sentido, anti-sentido, ou sentido e anti-sentido de forma que eles sejam capazes de formar os constructos de dsRNA, constructos de co-supressão de sentido, constructo de anti-sentido, ou várias combinações do anterior.
[00191] Figura 4 descreve sequências de DNA que são capazes de expressar a co-supressão de constructos de sentido ou anti-sentido de acordo com a presente invenção, as sequências de não-codificação que são descritas nas Tabelas 1 e 2 abaixo. As sequências de não- codificação podem ser sequências únicas, combinações de sequências (por exemplo, o 5'UTR ligado ao 3'UTR), ou qualquer combinação dos anteriores. Para expressar uma construção de co-supressão de sentido, todas as sequências de não-codificação são sequências de sentido, e para expressar um constructo de anti-sentido, todas as sequências de não-codificação são sequências de anti-sentido. Para expressar constructos de sentido e anti-sentido, são fornecidas sequências de não-codificação de sentido e anti-sentido.
[00192] Figura 5 descreve vários primeiros grupos de sequências de DNA que são capazes de expressar constructo de dsRNA de acordo com a presente invenção, as sequências de não-codificação das quais são descritas nas Tabelas 1 e 2 abaixo. O primeiro grupo de sequências de DNA descrito na figura 5 compreende pares de sequências de sentido e anti-sentido relacionadas, organizadas tal que, por exemplo, o RNA expresso pela primeira sequência de sentido seja capaz de formar um RNA de filamento duplo com o RNA de anti-sentido expresso pela primeira sequência de anti-sentido. Por exemplo, se referindo ao vetor mais alto da figura 5 e combinação ilustrativa N° 1 (da Tabela 1), o primeiro grupo de sequências de DNA compreende uma sequência de FAD2-1 de sentido, uma sequência de FAD3-1 de sentido, uma sequência de FAD2-1 de anti-sentido e uma sequência de FAD3-1 de anti-sentido. Ambas as sequências de anti-sentido corres- pondem às sequências de sentido de forma que os produtos de expressão do primeiro grupo de sequências de DNA sejam capazes de formar urn RNA de filamento duplo com cada outro. As sequências de sentido podem ser separadas das sequências de anti-sentido por uma sequência espaçadora, preferivelmente uma que promova a formação de uma molécula de dsRNA. Os exemplos de tais sequências espaça- doras incluem aqueles apresentados em Wesley e outros, supra, e Hamilton e outros, Plant J., 15:737-746 (1988). O promotor é qualquer promotor funcional em uma planta, ou qualquer promotor de planta. Os exemplos não limitantes de promotores adequados são descritos na Parte A da Descrição Detalhada.
[00193] O primeiro grupo de sequências de DNA é inserido em um constructo de expressão na orientação de sentido ou anti-sentido usando uma variedade de técnicas de manipulação de DNA. Se for conveniente os sítios de restrição estarem presentes nas sequências de DNA, eles serão inseridos no constructo de expressão digerindo-se com as endonucleases de restrição e ligação no constructo que foi di-gerido em um ou mais dos sítios de clonagem disponíveis. Se sítios de restrição convenientes não estão disponíveis nas sequências de DNA, o DNA ou do constructo ou das sequências de DNA é modificado em uma variedade de modos para facilitar a clonagem das sequências de DNA no constructo. Os exemplos de métodos para modificar o DNA incluem por PCR, ligador sintético ou ligação de adaptador, mutagêne- se de sítio direcionado in vitro, carregamento em ou redução de terminais de 5' ou 3' de projeção, e similares. Estes e outros métodos de manipulação de DNA são bem-conhecidos por aqueles de experiência ordinária na técnica.
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Exemplo 3 3A. Constructos de Anti-sentido
[00194] Se referindo agora à figura 7, as sequências de não- codificação de FATB-2 de soja (SEQ ID NOs: 44-47), sequências de não-codificação de FATB-1 (SEQ ID NOs: 29-37), e sequências de não-codificação de FAD2-1 (SEQ ID NOs: 1 e 5-6) são ampliadas por PCR para resultar em produtos de PCR que incluem sítios de restrição re-construídos em ambos os terminais. Os produtos de PCR são clo- nados diretamente em orientação de sentido e anti-sentido em um vetor que contém o promotor 7Sa' de soja de uma sequência de terminação tml 3'. O vetor é então cortado com uma endonuclease de restrição apropriada e ligado em pMON80612 um vetor que contém o gene de EPSPS de CP4 regulado pelo promotor de FMV e uma sequência de terminação de ervilha Rubisco E9 3'. O constructo de expressão de gene resultante é descrita na maioria da constructo de base da figura 7 e é usado para transformação usando métodos como descrito aqui.
3B. Montagem In Vivo
[00195] Um aspecto da presente invenção inclui um constructo de DNA que monta em uma unidade de transcrição recombinante em um cromossomo de planta em planta que é capaz de formar o RNA de filamento duplo. A montagem de tais constructos e os métodos para montagem in vivo de uma unidade de transcrição recombinante para supressão de gene são descritos no Pedido Internacional No. PCT/US2005/00681, desse modo incorporado por referência em sua totalidade.
[00196] pMON95829 é um constructo usado para montagem in vivo que tem dois segmentos de T-DNA, cada flanqueado por elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium, isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). O primeiro T-DNA contém um promotor 7Sa de soja operativamente ligando-se a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), que é reduzido em 100 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado aos 42 nucleotídeos contíguos de um 5' UTR de FATB-1 a, seguido pela região de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto de FATB-1A ("CTP"), e um gene de EPSPS de CP4 operativamente ligado a um promotor de FMV aumentado e uma se-quência de terminação de ervilha Rubisco E9 3' tudo flanqueado por elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium, isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). No mesmo vetor no segundo segmento de T-DNA, flanqueado por outro RB e LB, está uma sequência de terminação H6 3' operativamente ligada a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), que é reduzido em 100 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado aos 42 nucleotídeos contíguos de um 5 ' UTR de FATB-1 a, seguiu pela região de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto ("CTP") de FATB-1 A. Os constructos de expres-são de gene resultantes são usados para transformação usando métodos como descrito aqui.
[00197] pMON97595 é um constructo usado para montagem in vivo que tem dois segmentos de T-DNA, cada flanqueado por Elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). O primeiro segmento de T-DNA contém um promotor de 7Sa' de soja operativamente ligado a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido através de 320 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado aos 42 nucleotídeos contíguos de um 5 ' UTR de FATB-1 a seguido pela região de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto ("CTP") de FATB-1A, e um Gene de EPSPS de CP4 operativamente ligado a um promotor de FMV aumentado e uma sequência de terminação 3' de ervilha rubisco E9 3', tudo flanqueado por Elementos de borda de T-DNA de Agrobac- terium , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). No segundo segmento de T-DNA, flanqueado por outro RB e LB, é uma sequência de terminação 3' H6 operativamente ligada a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1), que é reduzido em 320 nucleotídeos contíguos do terminal 3 ' e ligado aos 42 nucleotídeos contíguos de um 5 ' UTR de FATB-1 a seguido pela região de codificação de CTP de FATB-1A. O constructo de expressão de gene resultante é usado para transformação que usa métodos como descrito aqui.
[00198] pMON97581 é um constructo usado para montagem in vivo que tem dois segmentos de T-DNA, cada flanqueado por elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). O primeiro segmento de T-DNA contém um promotor de 7Sa' de soja operativamente ligado a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 320 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado à região de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto ("CTP") de FATB-1A, e um gene de EPSPS de CP4 operativamente ligado a um promotor de FMV aumentado e uma sequência de terminação 3' de ervilha Rubisco E9, tudo flanqueado por elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). No mesmo constructo, no segundo segmento de T-DNA, flanqueado por outro RB e LB, está uma sequência de terminação 3' H6 operativamente ligada a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 320 nucleotídeos contíguos do terminal 3 ' e ligado a região de codificação de CTP de FATB-1 a. O constructo de expressão de gene resultante é usado para transformação que usa métodos como descrito aqui.
[00199] pMON97596 é um constructo usado para montagem in vivo tendo dois segmentos de T-DNA, cada flanqueado por elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). O primeiro segmento de T-DNA contém um promotor de 7Sa de soja operativamente ligado a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 320 nucleotídeos contíguos do terminal 3 ' e ligado a 5 ' 180 pares de base da região de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto ("CTP") de FATB- 1A, e um gene de EPSPS de CP4 operativamente ligado a um promotor de FMV aumentado e uma sequência de terminação 3' de ervilha Rubisco E9, tudo flanqueado por elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium, isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). No mesmo constructo, no segundo segmento de T-DNA, flanqueado por outro RB e LB, está uma sequência de terminação 3' H6 operativamente ligada a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 320 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado ao 5 ’ 180 pares de base da região de codificação de CTP de FATB-1 a. O constructo de expressão de gene resultante é usado para transformação que usa métodos como descrito aqui.
[00200] pMON97597 é um constructo usado para montagem in vivo que tem dois segmentos de T-DNA, cada flanqueado por elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). O primeiro segmento de T-DNA contém um promotor de 7Sa' de soja operativamente ligado a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 320 nucleotídeos contíguos do terminal 3’ e ligado ao 5 ’ 120bp da região de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto ("CTP") de FATB-1, e um gene de EPSPS de CP4 operativamente ligado a um promotor de FMV au-mentado e uma sequência de terminação 3' de ervilha Rubisco E9, tudo flanqueado por elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). No mesmo constructo, no segundo segmento de T-DNA, flanqueado por outro RB e LB, está uma sequência de terminação 3' H6 operativamente ligada a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 320 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado ao 5 ' 120 pares de base da região de codificação de CTP de FATB-1 a. O constructo de expressão de gene resultante é usado para transformação que usa métodos como descrito aqui.
[00201] pMON97598 é um constructo usado para montagem in vivo que tem dois segmentos de T-DNA, cada flanqueado por elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). O primeiro segmento de T-DNA contém um promotor de 7Sa' de soja operativamente ligado a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 340 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado à região de codificação de peptídeo de trânsito de cloroplasto ("CTP") de FATB-1A, e um gene de EPSPS de CP4 operativamente ligado a um promotor de FMV aumentado e uma sequência de terminação 3’ de ervilha Rubisco E9, tudo flanqueado por elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). No mesmo constructo, no segundo segmento de T-DNA, flanqueado por outro RB e LB, está uma sequência de terminação 3' H6 operativamente ligada a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 340 nucleotídeos contíguos do terminal 3’ e ligado à região de codifi-cação de CTP de FATB-1 a. O constructo de expressão de gene resultante é usada para transformação que usa métodos como descrito aqui.
[00202] Quando os dois segmentos de T-DNA de qualquer uma das constructos acima (isto é, pMON95829, pMON97595, pMON97581, pMON97597, pMON97598) são inseridos em um único lugar do cromossomo de um organismo hospedeiro em uma orientação de RB para RB, a unidade de transcrição montada tem um promotor de 7Sa’ de soja operativamente ligando o íntron 1 de FAD2-1A de soja orientado em sentido e anti-sentido e fragmentos de DNA de FATB-1 a. Quando transcritas, as sequências de RNA operativamente ligadas orientadas em sentido e anti-sentido são capazes de formar o RNA de filamento duplo efetivo para supressão de FAD2-1A e FATB.
Exemplo 4. Transformação e Análise de Planta
[00203] Os constructos dos Exemplos 2 e 3 são estavelmente introduzidos em soja (por exemplo, variedade Asgrow A4922 ou variedade Asgrow A3244 ou variedade Asgrow A3525) pelos métodos descritos anteriormente, incluindo os métodos de McCabe e outros, Bio/Technology, 6:923-926 (1988), ou transformação mediada por Agrobacterium. As plantas de soja transformadas são identificadas através de seleção em meios que contêm agente selecionável ou herbicidas. O herbicida pode ser glifosato quando um transgene que confere resistência ao glifosato for usado. Composições de ácido graxo são analisadas de linhagens de semente de soja transformadas com o constructo usando cromatografia de gás.
[00204] Para algumas aplicações, são descritas composições de ácido graxo modificadas em sementes em desenvolvimento, considerando que em outros exemplos, tal como para análise de perfil de óleo, a detecção de modificações de ácido graxo que ocorre depois na série de reação de FAS, ou para detecção de modificações secundárias para a composição de ácido graxo, a análise de ácido graxo ou óleo de sementes maduras é realizada. Além disso, análise de conteúdo de óleo e/ou ácido graxo de sementes individuais pode ser desejável, es-pecialmente na detecção da modificação de óleo na segregação de populações de semente R1. Como usado aqui, a geração de RO indica a planta que surge de protocolos de transformação / regeneração descritos aqui, a geração de R1 indica sementes crescidas na planta RO transgênica autofertilizada. As plantas R1 são crescidas das sementes R1.
[00205] As composições de ácido graxo são determinadas para a semente de linhagens de soja transformadas com o constructo do Exemplo 3. Uma a dez sementes de cada das linhagens de soja de controle e transgênicas são moídas usando um homogenizador de tecido individualmente (Pro Scientific) para extração de óleo. O óleo de semente de soja moída é extraído durante a noite em 1,5 ml de hepta- no que contêm trieptadecanoína (0,50 mg/ml). As alíquotas de 200 μl do óleo extraído são derivadas para ésteres de metila com a adição de 500 μl de metóxido de sódio em metanol absoluto. A reação de deriva- tização é permitida progredir durante 20 minutos em 50°C. A reação é parada pela adição simultânea de 500 μl de 10% (peso/volume) de cloreto de sódio e 400 μl de heptano. Os ésteres de metila de ácido graxo resultantes extraídos em hexano são resolvidos através de cromatografia de gás (GC) em um modelo 6890 GC Hewlett-Packard (Paio Al- to, CA). A GC foi ajustada com uma coluna Supelcowax 250 (30 m, 0,25 mm de id, 0,25 microns de espessura de película) (Supelco, Bellefonte, PA). A temperatura de coluna é 175°C em injeção e a temperatura programada de 175°C a 245°C a 175°C em 40°C/min. As temperaturas do Injetor e detector são 250°C e 270°C, respectivamente.
Exemplo 5.
[00206] Este exemplo ilustra transformação de planta para produzir plantas de soja com genes suprimidos.
[00207] Um pMON68537 de vetor de transformação é usado para introduzir um constructo de formação de RNA de filamento duplo de íntron/3'UTR em soja para suprimir os genes de Δ12 dessaturase, Δ15 dessaturase, e FATB. O vetor PMON68537 também contém os genes de delta-9 dessaturase (FAB2) e os genes de CP4. O vetor pMON68537 é designado para transformação de planta para suprimir os genes de FAD2, FAD3, e FATB e super-expressar delta-9 dessaturase em soja. Em particular, o constructo compreende um promotor 7S alfa operativamente ligado ao íntron orientado em sentido de soja e 3'UTRs, isto é, um íntron No. 1 de FAD2-1A, um 3'UTR de FAD3-1A, um 3'UTR de FATB-1, um íntron ligável de formação de alça de grampo, e uma série complementar de íntron orientado em anti-sentido de soja e 3'UTR, isto é, um 3'UTR de FATB-1, um 3'UTR de FAD3-1A e um íntron No. 1 de FAD2-1A e o promotor de FAD2 de soja que direciona a delta-9 dessaturase. O vetor é estavelmente introduzido na soja (variedade Asgrow A4922) por ABI de cepa de Agrobacterium tumefa- ciens (Martinell, Patente U.S. No. 6.384.301). O marcador selecionável de CP4 permite as plantas de soja transformadas serem identificadas através de seleção em meios que contêm herbicida de glifosato.
[00208] As composições de ácido graxo são analisadas de semente de linhagens de soja transformadas com os constructos de expressão de dsRNAi de íntron/3'UTR usando cromatografia de gás. As composições de óleo de semente R1 agrupada e semente R1 única demonstram que as composições de ácido graxo mono- e poliinsaturadas são alteradas no óleo de sementes de linhagens de soja transgênica quando comparadas com aquelas da semente de soja não transformada, (Veja Tabela 3). Por exemplo, a supressão de FAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster de ácido oleico; supressão de FAD3 fornece plantas com compostos de éster de ácido linolênico diminuído; e supressão de FATB fornece plantas de compostos de éster graxo saturado reduzido, por exemplo, palmitatos e estearatos. As seleções podem ser feitas de tais linhagens dependendo da composição de ácido graxo relativa desejada. As composições de ácido graxo são analisadas de semente de linhagens de soja transformadas com constructos usando cromatografia de gás.
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Exemplo 6. Constructo de dsRNAi de FAD2-1/FATB em soja transqê- nica
[00209] O constructo de pMON95829 como descrito no Exemplo 3D é usado para introduzir um íntron de FAD2-1, FATB, constructo de formação de RNA de filamento duplo em soja para suprimir o gene FAD2 e gene FATB. O vetor é estavelmente introduzido em soja (variedade de Asgrow A4922) por ABI de cepa de Agrobacterium tumefadens (Martinell, Patente U.S. No. 6.384.301). O marcador selecionável CP4 permite que as plantas de soja transformadas sejam identificadas através de seleção em meios contendo herbicida de glifosato. Subsequentemente, os genomas de plantas transformadas são avaliados para inserção tandem simultânea do primeiro T-DNA e do segundo T- DNA, isto é na montagem da "borda direita para borda direita". A avali-ação é feita com métodos de mapeamento de hibridização do Sul. As plantas de soja transformadas contendo a configuração preferida no seu genoma são transferidas para uma estufa para produção de semente.
[00210] Por exemplo, tecido de folha foi tomado das plantas RO transformadas com constructo pMON95829 e análise do Sul é realizada. As sondas e digestões de enzima de restrição são escolhidas para identificar eventos que contêm uma montagem de borda-direita-borda- direita ("RB-RB") de ambos os T-DNAs. Tipicamente, cerca de 25% de todos os transformantes tem T-DNAs de RB-RB apropriadamente montados.
[00211] As composições de ácido graxo são analisadas de semente de linhagens de soja transformadas com uma constructo de pMON95829 usando cromatografia de gás como descrito no Exemplo 4 para identificar ésteres de metila de compostos de ácido graxo extraídos de sementes. Primeiro, seis sementes R1 tomadas de plantas de soja transformadas com constructo de pMON95829 são colhidas, e a composição de ácido graxo de cada semente única é determinada. Por conseguinte as plantas R1 de cada evento estão segregando para os transgenes e, portanto, produzem sementes com composição de soja convencional, como também versões modificadas. As sementes positivas são agrupadas e pesadas para cada evento. As médias positivas agrupadas demonstram que as composições de ácido graxo mono- e poliinsaturadas são alteradas no óleo de sementes de linhagens de soja transgênica quando comparadas com aquelas da semente de soja não transformada (Veja Tabela 4). Por exemplo, a supressão de FAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster de ácido oleico e supressão de FATB fornece plantas com compostos de éster graxo saturado reduzido, por exemplo, palmitatos e estearatos.
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Exemplo 7
[00212] pMON93505 é um constructo usado para montagem in vivo e tem dois segmentos de T-DNA, cada flanqueado por elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium , isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). O primeiro segmento de T-DNA contém um promotor 7Sα' de soja operativamente ligado a um intron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 100 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado ao 3'UTR de FATB-1 a seguidos por um 5 ' UTR de FATB-1a, um gene de KAS IV C. pulcherrima (SEQ ID NO: 39) operativamente ligando-se a um promotor de Brassica napin e uma sequência terminação 3 ' de Brassica napin, um gene de delta 9 dessaturase Ricinus communis (Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2003/00229918 A1) operativamente ligando-se a um promotor 7Sα de soja e uma sequência de terminação 3' nos, e um gene de EPSPS de CP4 que operativamente se liga a um promotor eFMV e uma sequência de terminação 3' de ervilha Rubisco E9 tudo flanqueado por elementos de borda de T-DNA de Agrobacterium, isto é DNA de borda direita (RB) e DNA de borda esquerda (LB). No mesmo constructo, no segundo segmento de T-DNA, flanqueado por outro RB e LB, está uma sequência de terminação 31 H6 operativamente ligando-se a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 100 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e ligado ao 3 ' UTR de FATB-1A seguido por um 5 ' UTR de FATB-1 a.
[00213] O constructo de pMON93505 é estavelmente introduzido em soja (variedade de Asgrow A4922) por ABI de cepa de Agrobacte- rium tumefaciens (Martinell, Patente U.S. No. 6.384.301). O marcador selecionável de CP4 permite que a planta de soja transformada seja identificada através de seleção em meios que contêm herbicida de gli-fosato. Subsequentemente, os genomas de plantas transformadas são avaliados quanto à inserção tandem simultânea do primeiro T-DNA e do segundo T-DNA, isto é na montagem de "borda direita para borda direita". A avaliação é feita com métodos de mapeamento de hibridização do sul. As plantas de soja transformadas contendo a configuração preferida no seu genoma são transferidas para uma estufa para produção de semente.
[00214] Por exemplo, o tecido de folha foi tomado das plantas R0 transformadas com constructo de pMON93505 e a análise do Sul é realizada. As sondas e digestões de enzima de restrição são escolhidas para identificar eventos que contêm uma montagem de borda- direita- borda-direita ("RB-RB") de ambos os T-DNAs. Tipicamente, aproximadamente 25% de todo o transformante tem T-DNAs de RB- RB apropriadamente montados.
[00215] As composições de ácido graxo são analisadas de semente de linhagens de soja transformadas com um constructo de pMON93505 usando cromatografia de gás como descrito no Exemplo 4 para identificar ésteres de metila de compostos de ácido graxo de sementes. Primeiro, seis sementes R1 tomadas de plantas de soja transformadas com constructo de pMON93505 são colhidas, e a composição de ácido graxo de cada semente única é determinada. Por conseguinte, as plantas R1 de cada evento estão segregando para os transgenes e, portanto, produzem as sementes com composição de soja convencional, como também versões modificadas. As sementes positivas são agrupadas e pesadas para cada evento. As médias positivas agrupadas demonstram que as composições de ácido graxo de mono- e poliinsaturado são alteradas no óleo de sementes de linhagens de soja transgênica quando comparadas com aquelas da semente de soja não transformada (Veja Tabela 10). Por exemplo, a supressão de FAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster de ácido oleico. Por exemplo, a supressão de FAD2 fornece plantas com quantidade aumentada de compostos de éster de ácido oleico, supressão de FAD3 fornece plantas com compostos de éster de ácido linolênico reduzido, e supressão de FATB fornece plantas de compostos de éster graxo saturado reduzido, por exemplo palmitates e estearatos.
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Exemplo 8. Sojas Transqênicas com Composições de Ácido Graxo Alteradas
[00216] pMON97563 contém um promotor de 7Sa' de soja operati vamente ligado a um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 100 nucleotídeos contíguos do terminal 31 e ligado a um 5'UTR de FAD3-1A, seguido por um 3'UTR de FAD3-1A, ligado a um 5'UTR de FAD3-1B, seguido por um 3'UTR de FAD3-1B, ligado a um 5'UTR de FAD3-1C, seguiu por um 3'UTR de FAD3-1C, seguido por uma região de codificação de CTP de FATB-1 a, seguido por uma região de codificação de CTP de FATB-2a operativamente ligando-se a 70 nucleotídeos de íntron 4 de FAD3-1A, operativamente ligando-se a uma região de codificação de CTP de FATB-2a na orientação de anti- sentido seguido por uma região de codificação de CTP de FATB-1 a na orientação de anti-sentido, ligado a um 3’UTR de FAD3-1C em anti- sentido, seguido por um 5'UTR de FAD3-1C em anti-sentido, ligado a um 3'UTR de FAD3-1B em anti-sentido, seguido por um 5'UTR de FAD3-1B em anti-sentido, ligado a um 3'UTR de FAD3-1A em anti- sentido, seguido por um 5'UTR de FAD3-1A em anti-sentido, seguido por um íntron 1 de FAD2-1A de soja (SEQ ID NO: 1) que é reduzido em 400 nucleotídeos contíguos do terminal 3' e na orientação de anti- sentido, operativamente ligado a um segmento de poliadenilação 3' H6 que com um gene de EPSPS de CP4 operativamente ligando-se a um promotor de eFMV e uma sequência de terminação 3' de ervilha Ru- bisco E9 tudo flanqueado por RB e LB na mesma molécula de DNA. O constructo de expressão de gene resultante é usada para transformação de planta que usa métodos como descrito aqui. As composições de ácido graxo são determinadas de semente de linhagens de soja transformadas com este constructo usando cromatografia de gás como descrito no Exemplo 4. A Tabela 26 determina as composições de sementes representativas. O nível de 18:3 é reduzido para aproximadamente 1 %.
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Exemplo 9, Cruzamentos de soja transgênica medianamente oleica com soja pouco linolênica
[00217] Uma planta de soja de uma linhagem com sementes que têm níveis moderados de ácido oleico é cruzada com uma planta de uma linhagem com níveis normais de ácido oleico porém cerca de 2,8% de ácido linolênico (18:3). Este cruzamento resulta em uma linhagem de soja que produz óleo com as propriedades combinadas, ácido meio oleico e ácido pouco linolênico.
[00218] Resumidamente, a reprodução de planta foi realizada como descrito abaixo. Uma linhagem origem, uma linha de soja transgênica, evento GM_A22234 rotulado, contém o pMON68504 de plasmídeo em um cromossomo. pMON68504 é um constructo de 2T-DNA tendo um promotor 7S operativamente ligado a um íntron No. 1 de FAD2-1A (SEQ ID NO: 2; Publicação PCT WO 2001014538) em orientação de sentido para parcialmente suprimir o gene FAD2 endógeno e um gene marcador selecionável de CP4. O óleo extraído das sementes desta linhagem contém aproximadamente 65% de ácido oleico, acima dos 20% de óleo de soja convencional (veja, Tabela 25). Outra linhagem origem é uma variedade não transgênica 6p248-5 (linhagem C1640) que tem um conteúdo de ácido linolênico de cerca de 3% em peso de ácidos graxos totais em suas sementes, quando comparado ao 8-9% de ácido linolênico convencional encontrado em óleo de soja normal (veja, Tabela 25). A redução em ácido linolênico é causada por um mutante duplo fad3-1b-/fad3-1c-. (Veja Wilcox, J.R. e J.F. Cavins, Inheritance of low linolenic acid content of the seed of a mutant of Glycine max., Theoretical and Applied Genetics 71: 74-78, 1985).
[00219] As plantas da linhagem transgênica GM_A22234 (usadas como fêmea) e a linhagem mutante 6p248-5 (usada como o macho) foram cruzadas. Trinta sementes F1 foram produzidas e plantadas para produzir 1 kg (2,3 Ibs) de sementes F2 autofertilizadas. As sementes homozigotas triplas putativas foram identificadas de 200 sementes F2 por análise de metil-éster de ácido graxo de semente única (FAME) de lascas de semente. Vinte e sete sementes com cerca de 60% de 18:1, cerca de 20% de 18:2, e cerca de 2-3% de 18:3 foram identificadas e plantadas para produzir sementes F3 autofertilizadas.
[00220] Para análise do marcador, as amostras de tecido de folha F2 foram coletadas e marcadores moleculares estabelecidos para os alelos mutantes de FAD3 foram usados para identificar as plantas positivas duplas (plantas que têm ambas as mutações de FAD3-1B e FAD3-1C). Três genótipos foram direcionados para recuperação desta experiência: 1) mutantes homozigotas fad3-1b - / fad3-1c-duplos; 2) plantas homozigotas únicas para o fad3-1c-alelo sozinho; e 3) homozigotas único para fad3-1b-alelo sozinho.
[00221] As plantas F2 foram plantas únicas colhidas, e as 10 suba- mostras de semente F3 foram analisadas. De 27 sementes com cerca de 60% de 18:1 (ácido oleico), cerca de 20% de 18:2 (ácido linoleico), e cerca de 2-3% de 18:3 (ácido linolênico), 5 plantas foram identificadas como mutante de FAD3 duplo putativo e foram aumentadas juntas para crescimento adicional. A Tabela 25 resume os dados da composição de semente F3 de 120 plantas F2.
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[00222] A linhagem de ácido meio oleico tripla fad3-1b-, fad3-1c-, (GM_AA22234) tem 1,9% de 18:3 linolênico e 74,3% de ácido oleico. A combinação de mutantes fad3-1b- e fad3-1c- com o local transgêni- co meio oleico (GM_AA22234) leva à outra redução de linolênico e aumento de oleico relativo às linhagens origens respectivas.
[00223] Para avaliar a eficácia de campo da linhagem medianamente oleica tripla fad3-1b-, fad3-1c- (GM_AA22234), as entradas de pilha de reprodução foram plantadas em um projeto de bloco de grupo com as pilhas e controles origens agrupados e aleatorizados no bloco de teste, e as amostras de semente foram analisadas. Um perfil de ácido graxo para a pilha medianamente oleica tripla fad3-1b-, fad3-1c- (GM_AA22234) foi gerado com semente crescida no campo F4 que usa FAME de semente única. O perfil de ácido graxo F4 demonstrou aproximadamente 68% de 18:1, 13% de saturados totais, 16% de 18:2 e 2,3% de 18:3. Os níveis de proteína e óleo foram similares às linhagens origem.
Exemplo 10, Cruzamentos de soja transgênica pouco saturada, medi-anamente oleica com soja pouco linolênica
[00224] Uma planta de soja de uma linhagem com sementes que tem nível pouco saturado e ácido meio oleico em seu óleo é cruzada com uma planta de uma linhagem com níveis saturados e oleicos nor- mais porém cerca de 2,8% de ácido linolênico (18:3). Este cruzamento resulta em uma linhagem de soja que produz óleo com as propriedades combinadas, níveis de ácido graxo meio oleico, pouco saturado e pouco linolênico.
[00225] Resumidamente, a reprodução de planta foi realizada como descrito abaixo. Uma linhagem origem é uma linhagem de soja trans- gênica que abriga DNA recombinante para supressão parcial dos genes FAD2-1 e FATB endógenos como também um gene de marcador selecionável de CP4 que torna a planta tolerante ao glifosato. O óleo extraído das sementes desta linhagem contém aproximadamente 55- 85% de ácido oleico, acima dos 20% de óleo de soja convencional. Também contém menos do que 8% de ácidos graxos saturados (16:0 mais 18:0), reduzido dos 14-16% convencionais de óleo de soja normal. Outra linhagem origem é uma variedade não transgênica 6p248-5 (linhagem C1640) que tem cerca de 3% de níveis de ácido linolênico em suas sementes, quando comparado aos 8-9% de ácido linolênico convencional encontrado em óleo de soja normal. A redução em ácido linolênico é causada por um mutante Íad3-1b-/fad3-1c-duplo. (Veja Wilcox, J.R. e J.F. Cavins, Inheritance of low linolenic acid content of the seed of a mutant of Glycine max., Theoretical and Applied Genetics 71: 74-78, 1985.)
[00226] As plantas da linhagem transgênica meio - muito olei- ca/pouco saturada são cruzadas com plantas da linhagem de mutante 6p248-5. As sementes F1 são produzidas e plantadas para produzir semente F2 autofertilizada. As sementes homozigotas triplas putativas são identificadas de sementes F2 por análise de metil-éster de ácido graxo de semente única (FAME) de lascas de semente. As sementes com características de óleo combinadas são identificadas e plantadas para produzir sementes F3 autofertilizadas. Para análise de marcador, as amostras de tecido de folha F2 são coletadas e os marcadores mo- leculares estabelecidos para os alelos mutantes FAD3 são usados para identificar plantas positivas duplas (plantas que têm ambas dele- ções de FAD3). Os lotes de semente F3 que indicam homozigosidade para o local de transgene como também as duas mutações de FAD3 são selecionados e usados para estabelecimento de linhagem.
[00227] Para avaliar a eficácia de campo das linhagens fad3-1b-, fad3-1c-, medianamente oleicas/pouco saturadas, as entradas de pilha de reprodução são plantadas em um projeto de bloco de grupo com as pilhas e controles origens agrupados e aleatorizados no bloco de teste, e as amostras de semente são analisadas. Um perfil de ácido graxo para a pilha tripla fad3-1b-, fad3-1c-, medianamente oleica/pouco saturada é determinado com semente crescida em campo F4 usando FAME de semente única. O perfil de ácido graxo F4 mostra 55-85% de 18:1, menos do que 8% de saturados, e 2-3% de 18:3. Os níveis de óleo e proteína são similares às linhagens origens.
Exemplo 11. Uso de Polimorfismos em FAD3-1 b
[00228] Para praticar os métodos da invenção, os polimorfismos associados com o gene FAD3-1B de soja podem ser usados para identificar a presença de regiões genômicas de soja associadas com certos fenótipos de ácido pouco linolênico. Um polimorfismo de nucleo-tídeo único em uma posição que corresponde à posição 2021 de SEQ ID NO:61 é detectado entre todas as linhagens em um comprimento de sequência inteiro de 2683 pares de base (Tabela 3) e é associado com um fenótipo de ácido pouco linolênico. A linhagem pouco linolêni- ca 6P248, T27111, T27190, T26767 e T26830 carrega um alelo "C" nesta posição ao mesmo tempo em que todas as outras linhagens carregam um "T". Consequentemente, a presença de um alelo "C" pode ser usada para identificar a presença das regiões genômicas de soja pouco linolênicas em cruzamentos onde o germoplasma pouco linolênico derivado de 6P248, T27111, T27190, T26767 e T26830 é usado. Outras linhagens pouco linolênicas tal como A5, Soyola, e N98-4445 carregam um alelo tipo silvestre neste lugar, indicando que um ou mais outros lugares contribuem com o fenótipo pouco linolênico nas linhagens de A5, Soyola, e N98-4445.
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Exemplo 12. Identificação de Polimorfismos no gene FAD3-1C
[00229] Para praticar os métodos da invenção, são usados polimorfismos associados com o gene FAD3-1C de soja para identificar a presença de regiões genômicas de soja associadas com certos fenótipos de ácido pouco linolênico. Quatro SNPs e um indel (inserção/deleção) são identificados em FAD3-1C que é associado com certos fenótipos de ácido pouco linolênico (Tabela 4). Os SNPs que correspondem às posições 687, 2316, 3743, como também o indel em 1129 de SEQ ID NO:62 são associados com o fenótipo pouco linolênico. As linhagens pouco linolênicas, Soyola e N98-4445 carregam um alelo diferente nas posições 687 e 1129 de todas as outras linhagens.
[00230] As linhagens de mutante 6P248, T27111, T27190, T26767, T26830 e A5 deixarão de amplificar com certos iniciadores específicos de lugar de FAD3-1C uma vez que há uma deleção grande no lugar de FAD3-1C nestas linhagens. A falha destas regiões a serem amplificadas, acopladas com reações de controle positivas apropriadas (isto é, usando DNA genômico de soja que contém um gene FAD3-1C intacto com iniciadores de FAD3-1C da região deletada como também uso de iniciadores para outros genes de não FAD3-1C com o DNA genômico de soja da deleção de FAD3-1C), é diagnóstico para deleções de FAD3-1C.
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Exemplo 13. Identificação de Polimorfismos de Promotor de FAD3-1C de Soja
[00231] Para praticar os métodos da invenção, polimorfismos associados com o promotor de FAD3-1C de soja são usados para identificar a presença de regiões genômicas de soja associadas com certos fenótipos de ácido pouco linolênico. Como notado na Tabela 5, as linhagens pouco linolênicas Soyola e N98-4445 carregaram um alelo diferente em todas as sete posições das outras linhagens tipo silvestre. A presença destes polimorfismos poderia ser usada para identificar a presença de Soyola ou germoplasma N98-4445 em cruzamentos para germoplasma tipo silvestre.
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[00232] Todos os métodos e/ou composições descritos e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida levando em conta a presente descrição. Ao mesmo tempo as composições e métodos desta invenção foram descritos em termos de modalidades preferidas, será evidente para aqueles de experiência na técnica que variações podem ser aplicadas aos métodos e/ou composições e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito aqui sem afastar-se do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que são tanto quimicamente quanto fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui ao mesmo tempo em que os mesmos ou resultados similares seriam obtidos. Todos tais substitutos similares e modificações evidentes para aqueles versados na técnica são julgados estarem dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações anexas.
[00233] Todas as publicações e pedidos de patente citados neste relatório descritivo estão aqui incorporados por referência como se cada publicação ou pedido de patente individual especificamente e indi-vidualmente fosse indicado serem incorporados por referência.

Claims (17)

1. Método de produzir uma planta de soja compreendendo um teor de ácido linolênico menor do que 6% de ácidos graxos de semente totais em peso, um teor de ácido graxo saturado menor do que 8% em peso e um teor de ácido oleico de 55% a 80% de ácidos gra- xos de semente totais em peso, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) criar uma ou mais plantas de soja compreendendo um ou mais transgenes compreendendo um promotor 7Sα’ de soja operacio-nalmente ligado a um íntron de FAD2-1A de soja de SEQ ID NO: 1 que é reduzido em 100 nucleotídeos contínuos a partir da extremidade 3' e em 42 nucleotídeos contínuos de 5' UTR de FATB-1a seguido pela região codificante do peptídeo de trânsito de cloroplasto ("CTP") do gene FATB-1A de SEQ ID NO: 28 que diminuem a expressão tanto de um gene FAD2-1 de soja endógeno, quanto um FATB endógeno, e mutações de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja de SEQ ID NO: 61 e uma mutação de perda de função está em um gene FAD3-1C endógeno de soja de SEQ ID NO: 62; b) obter uma ou mais sementes da referida planta de soja obtida na etapa (a); c) determinar uma percentagem do teor de ácido graxo de semente total em peso de ácido linolênico, ácidos graxos saturados e ácido oleico para a referida semente de etapa (b); e, d) identificar uma planta de soja que produz semente tendo uma composição de ácido graxo de semente compreendendo um teor de ácido linolênico menor do que 6% de ácidos graxos de semente totais em peso, um teor de ácido graxo saturado menor do que 8% em peso, e um teor de ácido oleico de 55% a 78% de ácidos graxos de semente totais em peso.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas plantas de soja que são criadas na etapa (a) compreendem ainda uma mutação de perda de função em um gene FAD3-1C endógeno de soja de SEQ ID NO: 62.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida planta de soja identificada na etapa 3 compreende um teor de ácido linolênico menor do que 3% de ácidos gra- xos de semente totais em peso, um teor de ácido graxo saturado menor do que 8% em peso e um teor de ácido oleico de 55% a 78% de ácidos graxos de semente totais em peso.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida planta de soja é criada na etapa (a) por : i) cruzamento de uma primeira linhagem de soja parental compreendendo o referido transgene, com uma segunda linhagem de soja parental compreendendo a mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja para obter uma planta de soja F1 que seja heterozigota para o referido transgene e heterozigota para a mutação de perda de função em um gene de FAD3; e ii) autofertilização de plantas de progênie F1 de (i) para obter uma planta de soja F2 que é homozigota para o referido transgene e homozigota para a mutação de perda de função em um gene de FAD3, desse modo obtendo uma planta de soja compreendendo o transgene que diminui a expressão tanto de um gene FAD2-1 endógeno de soja, quanto um FATB endógeno e a mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida planta de soja F1 que seja heterozigota para o referido transgene e para a mutação de perda de função em um gene de FAD3 é obtida na etapa (i) submetendo uma pluralidade de plantas F1 a uma ou mais técnicas de análise de DNA permitindo identificação de uma planta F1 que seja heterozigota para o referido trans gene e para uma ou mais mutações de perda de função em um gene de FAD3.
6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida planta de soja F2 que é homozigota para o referido transgene e homozigota para a mutação de perda de função em um gene de FAD3 é obtida na etapa (ii) submetendo uma pluralidade de plantas F2 a uma ou mais técnicas de análise de DNA permitindo identificação de uma planta F2 que é homozigota para o referido transgene e homozigota para a mutação de perda de função em um gene de FAD3.
7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida técnica de análise de DNA compreende a detecção de um ou mais polimorfismos de nucleotídeo único em uma posição na sequência de gene de FAD3-1 C correspondendo ao nu- cleotídeo 687, 1129, 1203, 2316, 3292, 3360 ou 3743 de SEQ ID NO:62, detecção de uma deleção no gene FAD3-1 C de SEQ ID NO:62, ou detecção de um ou mais polimorfismos de nucleotídeo único em uma sequência promotora de FAD3-1C de soja correspondendo a uma guanina no nucleotídeo 334, uma citosina no nucleotídeo 364, uma timina no nucleotídeo 385, uma adenina no nucleotídeo 387, uma citosina no nucleotídeo 393, uma guanina no nucleotídeo 729 e uma citosina no nucleotídeo 747 de SEQ ID NO:63.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida técnica de análise de DNA compreende a detecção de um polimorfismo de nucleotídeo único em uma posição na sequência de gene de FAD3-1 C correspondendo ao nucleotídeo 687, 1129, 1203, 2316, 3292, 3360 ou 3743 de SEQ ID NO:62, detecção de uma deleção no gene FAD3-1C de SEQ ID NO:62, ou detecção de um ou mais polimorfismos de nucleotídeo único em uma sequência promotora de FAD3-1C de soja correspondendo a uma guanina no nucle- otídeo 334, uma citosina no nucleotídeo 364, uma timina no nucleotí- deo 385, uma adenina no nucleotídeo 387, uma citosina no nucleotí- deo 393, uma guanina no nucleotídeo 729 e uma citosina no nucleotí- deo 747 de SEQ ID NO:63.
9. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida técnica de análise de DNA compreende a detecção de um polimorfismo de nucleotídeo único no referido gene de FAD3-1 B de soja compreendendo uma substituição de um resíduo de timina para um resíduo de citosina em uma posição na sequência de gene de FAD3-1 B correspondendo ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61.
10. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida técnica de análise de DNA compreende a detecção de um polimorfismo de nucleotídeo único no referido gene de FAD3-1B de soja compreendendo uma substituição de um resíduo de timina para um resíduo de citosina em uma posição na sequência de gene de FAD3-1B correspondendo ao nucleotídeo 2021 de SEQ ID NO:61.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido transgene também compreende um transgene que confere tolerância ao herbicida.
12. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido transgene também compreende um transgene que confere tolerância ao herbicida e em que a referida planta de soja F1 que é heterozigota para o referido transgene é obtida na etapa (i) submetendo uma pluralidade de plantas F1 à seleção de herbicida para o referido transgene.
13. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido transgene também compreende um transgene que confere tolerância ao herbicida e em que uma pluralidade de plantas F2 enriquecidas para plantas de soja F2 que são homozigotas para o referido transgene é obtida na etapa (ii) submetendo a referida pluralidade de plantas F2 à seleção de herbicida para o referido trans-gene.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o referido herbicida é glifosato e o referido transgene compreende um gene CP4 EPSPS.
15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida planta de soja é criada na etapa (a) por : a) transformação de uma planta de soja ou célula de planta de soja compreendendo a mutação de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja de SEQ ID NO: 61 com o transgene que diminuem a expressão de tanto de um gene FAD2-1 endógeno de soja quanto um FATB endógeno de soja para obter uma planta de soja R0 com a mutação de perda de função em um gene de FAD3 que seja heterozigota para o referido transgene; b) autofertilização da referida planta de progênie R0 de (i) para obter uma planta de soja R1 que é homozigota para o referido transgene e homozigota para a mutação de perda de função em um gene de FAD3, desse modo obtendo uma planta de soja compreendendo o referido transgene, e uma ou mais mutações de perda de função em um gene FAD3 endógeno de soja.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o referido transgene também compreende sequências que conferem uma característica de tolerância ao herbicida.
17. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de também compreender a etapa iii) de autofertilização da referida progênie F2 que é homozigota para o referido transgene e homozigota para a mutação de perda de função em um gene de FAD3 de (ii) para obter uma planta de soja F3.
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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1871353B (zh) 2003-08-21 2013-04-24 孟山都技术有限公司 来自报春的脂肪酸去饱和酶
EP1734947B1 (en) 2004-04-16 2015-04-15 Monsanto Technology, LLC Expression of fatty acid desaturases in corn
BRPI0515928B1 (pt) 2004-09-29 2018-02-06 Monsanto Technology Llc Método para obter germoplasma de soja
WO2010078505A1 (en) 2008-12-31 2010-07-08 Battelle Memorial Institute Preparation of esters and polyols by initial oxidative cleavage of fatty acids followed by esterification reactions
WO2010078498A1 (en) 2008-12-31 2010-07-08 Battelle Memorial Institute Use of fatty acids as feed material in polyol process
US8247582B2 (en) 2006-02-07 2012-08-21 Battelle Memorial Institute Esters of 5-hydroxymethylfurfural and methods for their preparation
CA2988226C (en) 2006-03-10 2022-04-26 Monsanto Technology Llc Soybean seed and oil compositions and methods of making same
US8435790B2 (en) * 2008-07-25 2013-05-07 The Regents Of The University Of California Methods of modulating lipid concentrations in eukaryotic cells
MX356687B (es) 2008-09-29 2018-06-07 Monsanto Technology Llc Evento transgénico de frijol de soya mon87705 y métodos para detección del mismo.
TWI604053B (zh) * 2008-09-29 2017-11-01 孟山都科技有限責任公司 大豆基因轉殖品系ｍｏｎ８７７０５及其檢測方法
MX2011007002A (es) 2008-12-31 2012-09-28 Battelle Memorial Institute Pre-esterificacion de polioles primarios para mejorar la solubilidad en solventes usados en el proceso de poliol.
CA2748618C (en) 2008-12-31 2016-06-07 Battelle Memorial Institute Solvent-less preparation of polyols by ozonolysis
EP2406357B1 (en) 2009-03-13 2016-04-27 Battelle Memorial Institute Process for producing modified vegetable oil lubricants
CN103002727B (zh) 2009-07-08 2016-04-27 密苏里大学管委会 利用传统大豆育种技术培育高油酸大豆的方法
US9480271B2 (en) 2009-09-15 2016-11-01 Monsanto Technology Llc Soybean seed and oil compositions and methods of making same
EP2491119B1 (en) 2009-10-20 2016-06-08 Bayer CropScience NV Methods and means to alter lipid biosynthesis by targeting multiple enzymes to suborganelle domains
EP2513319A4 (en) * 2009-12-17 2013-05-08 Univ Missouri PLANT GENES ASSOCIATED WITH SEED OIL CONTENT AND METHODS OF USE
WO2011075716A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Cargill, Incorporated Brassica plants yielding oils with a low total saturated fatty acid content
AR085892A1 (es) * 2011-01-14 2013-11-06 Univ Missouri Metodo para desarrollar soja con un contenido elevado de acido oleico usando tecnicas de desarrollo convencionales
CN102498794A (zh) * 2011-11-08 2012-06-20 东华理工大学 一种十字花科种子活力的检测方法
US9049872B2 (en) 2012-06-03 2015-06-09 Monsanto Technology Llc Soybean variety A1026244
CA2877290A1 (en) 2012-06-19 2013-12-27 Daniel F. Voytas Gene targeting in plants using dna viruses
WO2014006159A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Bayer Cropscience Nv Soybean rod1 gene sequences and uses thereof
BR112015009967B1 (pt) 2012-11-01 2022-07-12 Medicago Inc. Método para a produção de um polipeptídeo terapêutico
ES2673864T3 (es) 2012-12-21 2018-06-26 Cellectis Patatas con endulzamiento inducido en frío reducido
US10113162B2 (en) 2013-03-15 2018-10-30 Cellectis Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the FAD2-1A/1B genes
US9192119B2 (en) 2013-06-10 2015-11-24 Monsanto Technology Llc Soybean variety A1036554
EP3080250A1 (en) * 2013-12-10 2016-10-19 The University of York Desaturase nucleic acids and polypeptides
WO2015193858A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Cellectis Potatoes with reduced granule-bound starch synthase
BR102015006156B1 (pt) * 2015-03-19 2023-12-05 Embrapa-Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuaria Método de produzir planta de soja com composição diferenciada de ácidos graxos na semente, planta de soja, semente de planta de soja e óleo de semente de soja
AU2016235264B2 (en) 2015-03-25 2019-05-23 Candle-Lite Company, Llc Candle products comprising vegetable oil that is low in polyunsaturation and gelling agent
CN105132531B (zh) * 2015-07-23 2017-11-28 中国农业科学院作物科学研究所 一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒棕榈酸含量的方法及其应用
US10837024B2 (en) 2015-09-17 2020-11-17 Cellectis Modifying messenger RNA stability in plant transformations
WO2017134601A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-10 Cellectis Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the fad3a/b/c genes
US9974266B2 (en) 2016-06-07 2018-05-22 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01059566
US9999186B2 (en) 2016-06-07 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01059533
US9968056B2 (en) 2016-06-07 2018-05-15 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01051641
UY37482A (es) 2016-11-16 2018-05-31 Cellectis Métodos para alterar el contenido de aminoácidos en plantas mediante mutaciones de desplazamiento de marco
WO2018160485A1 (en) 2017-03-03 2018-09-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Non-destructive assay for soybean seeds using near infrared analysis
WO2018198049A1 (en) 2017-04-25 2018-11-01 Cellectis Alfalfa with reduced lignin composition
US10064380B1 (en) 2017-07-06 2018-09-04 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01063585
US10194615B2 (en) 2017-07-06 2019-02-05 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01063576
US10058058B1 (en) 2017-07-06 2018-08-28 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01063616
US10058059B1 (en) 2017-07-14 2018-08-28 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01067522
US10660293B2 (en) 2018-08-27 2020-05-26 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077434
US10743493B2 (en) 2018-08-27 2020-08-18 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077438
US10602706B2 (en) 2018-08-27 2020-03-31 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077437
US10743492B2 (en) 2018-08-27 2020-08-18 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077433
US10743491B2 (en) 2018-08-27 2020-08-18 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077432
US10660294B2 (en) 2018-08-27 2020-05-26 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077435
US10512242B1 (en) 2018-08-27 2019-12-24 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077436
WO2021108248A1 (en) * 2019-11-27 2021-06-03 Calyxt, Inc. Tal-effector nucleases for gene editing
BR112022020902A2 (pt) 2020-04-24 2023-01-24 Monsanto Technology Llc Evento de milho transgênico mon95275 e métodos para a detecção e seus usos
WO2022072846A2 (en) * 2020-10-02 2022-04-07 Impossible Foods Inc. Transgenic plants with altered fatty acid profiles and upregulated heme biosynthesis
CN114192725B (zh) * 2021-12-09 2022-06-28 睿恩特智能装备(东莞)有限公司 一种自动化防错漏铆压方法及铆压设备
WO2023151004A1 (en) * 2022-02-11 2023-08-17 Northeast Agriculture University Methods and compositions for increasing protein and oil content and/or modifying oil profile in plant

Family Cites Families (126)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB715352A (en) 1952-02-06 1954-09-15 Melville Edward Dunkley Process for the treatment of oil-bearing vegetable material
US4089880A (en) * 1975-03-13 1978-05-16 Sullivan Systems Inc. Proces for refining fatty oils
DE2922146A1 (de) 1979-01-19 1980-07-24 Intercell Ag Verfahren und anlage zur verlustfreien lagerung von koernerfruechten und samen, sowie anwendung des verfahrens
JPS5846118A (ja) 1981-09-10 1983-03-17 Teijin Ltd 感湿捲縮複合繊維
MX7580E (es) 1981-10-15 1989-11-23 Cpc International Inc Procedimiento para la refinacion de aceites vegetales crudos
US5428147A (en) 1983-04-15 1995-06-27 Mycogen Plant Science, Inc. Octopine T-DNA promoters
US4633436A (en) 1983-12-16 1986-12-30 International Business Machines Corp. Real-time rub-out erase for an electronic handwriting facility
US5447858A (en) 1984-04-13 1995-09-05 Mycogen Plant Sciences, Inc. Heat shock promoter and gene
US4789554A (en) 1985-12-05 1988-12-06 The Procter & Gamble Company High temperature vacuum steam distillation process to purify and increase the frylife of edible oils
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US4944954A (en) * 1986-04-23 1990-07-31 Epe Incorporated Vegetable oil extraction process
JPS6344843A (ja) 1986-08-13 1988-02-25 Kao Corp 油中水中油型乳化油脂組成物
JPS6344843U (pt) 1986-09-10 1988-03-25
US4957748A (en) 1987-03-23 1990-09-18 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Ruminant feed, method of making and method of using
US5638637A (en) * 1987-12-31 1997-06-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of improved rapeseed exhibiting an enhanced oleic acid content
EP0566216B1 (en) 1987-12-31 1999-12-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Improved rapeseed exhibiting an enhanced oleic acid content
US4915972A (en) * 1988-01-05 1990-04-10 Prosoya Corporation Food processing in oxygen-free environment
US4948811A (en) 1988-01-26 1990-08-14 The Procter & Gamble Company Salad/cooking oil balanced for health benefits
US5534425A (en) 1988-02-03 1996-07-09 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybeans having low linolenic acid content and method of production
DE68918494T2 (de) 1988-05-17 1995-03-23 Lubrizol Genetics Inc Pflanzliches Ubiquitinpromotorsystem.
GB8813766D0 (en) 1988-06-10 1988-07-13 Efamol Holdings Essential fatty acid compositions
US5286886A (en) * 1988-06-21 1994-02-15 Van Den Bergh Foods Co., Division Of Conopco, Inc. Method of refining glyceride oils
GB8814732D0 (en) 1988-06-21 1988-07-27 Unilever Plc Method of refining clyceride oils
CH678181A5 (pt) * 1989-05-22 1991-08-15 Nestle Sa
US5633441A (en) 1989-08-04 1997-05-27 Plant Genetic Systems, N.V. Plants with genetic female sterility
EP0426641B1 (en) 1989-10-31 2000-09-13 Monsanto Company Promoter for transgenic plants
US5557037A (en) * 1989-12-05 1996-09-17 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybeans having elevated contents of saturated fatty acids
US5391725A (en) 1989-12-08 1995-02-21 New York University Medical Center Organ-specific plant promoter sequences
US5585535A (en) * 1990-01-05 1996-12-17 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybeans and soybean products having low palmitic acid content
GB2241503A (en) 1990-02-15 1991-09-04 Unilever Plc Edible fatty composition containing bleached fish oils
AU639319B2 (en) * 1990-04-04 1993-07-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of improved rapeseed exhibiting a reduced saturated fatty acid content
US6483008B1 (en) 1990-08-15 2002-11-19 Calgene Llc Methods for producing plants with elevated oleic acid content
US5219596A (en) 1990-08-24 1993-06-15 Cargill, Incorporated Composition and method thereof for increasing milk production in dairy cattle
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5100679A (en) 1990-10-03 1992-03-31 Cargill B.V. Method of making a modified proteinaceous product and composition thereof
US6022577A (en) * 1990-12-07 2000-02-08 Nabisco Technology Company High stearic acid soybean oil blends
US5208058A (en) * 1991-01-09 1993-05-04 Amano Jitsugyo Co., Ltd. Method for treating nuts
US5658767A (en) * 1991-01-24 1997-08-19 Martek Corporation Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
US5260077A (en) * 1991-02-12 1993-11-09 The Lubrizol Corporation Vegetable oil compositions
AU680809B2 (en) 1991-09-30 1997-08-14 Cargill Incorporated A canola variety producing a seed with reduced glucosinolates and linolenic acid yielding an oil with low sulfur, improved sensory characteristics and increased oxidative stability
US6270828B1 (en) * 1993-11-12 2001-08-07 Cargrill Incorporated Canola variety producing a seed with reduced glucosinolates and linolenic acid yielding an oil with low sulfur, improved sensory characteristics and increased oxidative stability
US5750827A (en) * 1991-09-30 1998-05-12 Cargill Incorporated Canola variety producing a seed with reduced glucosinolates and linolenic acid yielding an oil with low sulfur, improved sensory characteristics and increased oxidative stability
US5710365A (en) 1991-10-24 1998-01-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean products with improved carbohydrate composition and soybean plants
ES2101309T5 (es) 1992-04-03 2000-12-01 Air Liquide Metodo de mejorar el aroma y el sabor de bebidas almacenadas.
US5315020A (en) * 1992-07-29 1994-05-24 Praxair Technology, Inc. Method of recovering waste heat from edible oil deodorizer and improving product stability
US6372965B1 (en) 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
WO1994011516A1 (en) * 1992-11-17 1994-05-26 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
US6872872B1 (en) 1992-11-17 2005-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
AU672858B2 (en) 1992-12-03 1996-10-17 Unilever Plc Process for the refining of edible oils
DK0685993T3 (da) * 1993-02-25 2000-08-07 Cargill Inc Brassica med lavt glucosinolatindhold
ATE160166T1 (de) * 1993-03-17 1997-11-15 Unilever Nv Entfernung von phospholipiden aus glyceridoelen
JP3527242B2 (ja) * 1993-04-27 2004-05-17 カージル，インコーポレーテッド 食用の非水素化カノラ油
AU709039B2 (en) * 1993-06-17 1999-08-19 Cargill Incorporated Pourable canola oil for food applications
ATE186174T1 (de) 1993-08-20 1999-11-15 Nestle Sa Lipidzusammensetzung für nahrungsmittel
AU692791B2 (en) * 1993-10-12 1998-06-18 Agrigenetics, Inc. Brassica napus variety AG019
JPH09505470A (ja) 1993-11-10 1997-06-03 カルジーン，インコーポレイティド 植物アシルａｃｐチオエステラーゼ配列
US5530183A (en) 1994-01-10 1996-06-25 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybean variety 9253
US5520708A (en) * 1994-04-26 1996-05-28 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybean oil ester fuel blends
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
JPH10505237A (ja) 1994-08-31 1998-05-26 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー カノラ及びダイズのパルミトイル−ａｃｐチオエステラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列、並びにダイズ及びカノラ植物の油の脂肪酸量の調節におけるこれらの使用
US5625130A (en) * 1995-03-07 1997-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Oilseed Brassica bearing an endogenous oil wherein the levels of oleic, alpha-linolenic, and saturated fatty acids are simultaneously provided in an atypical highly beneficial distribution via genetic control
US5955329A (en) 1995-05-15 1999-09-21 Calgene, Inc. Engineering plant thioesterases for altered substrate specificity
AU5816096A (en) 1995-05-16 1996-11-29 Unilever Plc Method for refining an edible oil
EP0833882B1 (en) * 1995-06-12 2002-01-16 Unilever N.V. Mild refining of triglyceride oil
US5811636A (en) 1995-09-22 1998-09-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Apomixis for producing true-breeding plant progenies
EP0936266B1 (en) 1998-02-13 2008-12-24 Lipidia Holding S.A. Refining of edible oil retaining maximum antioxidative potency
US5936069A (en) 1995-12-06 1999-08-10 Iowa State University Research Foundation Process for producing improved soy protein concentrate from genetically-modified soybeans
US5844086A (en) 1996-01-31 1998-12-01 Stilts Corporation Oil seed protein extraction
AR006830A1 (es) 1996-04-26 1999-09-29 Du Pont Aceite de soja con alta estabilidad oxidativa
US6340485B1 (en) * 1996-06-03 2002-01-22 Croda International Plc Compositions and uses thereof
US5850026A (en) * 1996-07-03 1998-12-15 Cargill, Incorporated Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content
US5850030A (en) 1996-12-23 1998-12-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Reduced linolenic acid production in soybeans
JPH10191885A (ja) 1997-01-14 1998-07-28 Nisshin Oil Mills Ltd:The 大豆・菜種配合油
US6376754B1 (en) * 1997-03-07 2002-04-23 Asgrow Seed Company Plants having resistance to multiple herbicides and its use
WO1998050569A2 (en) 1997-05-05 1998-11-12 Dow Agrosciences Llc Nucleotide sequences of maize oleoyl-acp thioesterase and palmitoyl-acp thioesterase genes and their use in the modification of fatty acid content of oil
GB9710475D0 (en) 1997-05-21 1997-07-16 Zeneca Ltd Gene silencing
MY124156A (en) * 1997-08-29 2006-06-30 Lipogenics Inc Process for stabilization of oil from plant materials
CA2303407C (en) * 1997-09-12 2011-01-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Regulation of gene expression in plants
EP1161877B1 (en) 1998-05-11 2005-11-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fat products from high stearic soybean oil and a method for the production thereof
US6426448B1 (en) * 1998-05-11 2002-07-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Gene combinations that alter the quality and functionality of soybean oil
US6229033B1 (en) * 1998-05-11 2001-05-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fat products from high stearic soybean oil and a method for the production thereof
US6146669A (en) 1998-05-14 2000-11-14 Cargill Incorporated Method for processing oilseed material
US6459018B1 (en) 1998-06-12 2002-10-01 Monsanto Technology Llc Polyunsaturated fatty acids in plants
US6365802B2 (en) 1998-08-14 2002-04-02 Calgene Llc Methods for increasing stearate content in soybean oil
US6303849B1 (en) * 1998-11-12 2001-10-16 Saskatchewan Wheat Pool Brassica juncea lines bearing endogenous edible oils
US6172248B1 (en) * 1998-11-20 2001-01-09 Ip Holdings, L.L.C. Methods for refining vegetable oils and byproducts thereof
EP1141346A2 (en) 1999-01-14 2001-10-10 Monsanto Co. Soybean transformation method
CA2260397A1 (en) 1999-01-29 2000-07-29 Atlantis Marine Inc. Method of converting rendered triglyceride oil from marine sources into bland, stable food oil
US6313328B1 (en) * 1999-02-11 2001-11-06 Cargill, Incorporated Extraction of corn oil from flaked corn grain
US6610867B2 (en) * 2000-08-10 2003-08-26 Renessen Llc Corn oil processing and products comprising corn oil and corn meal obtained from corn
US6388110B1 (en) * 1999-02-11 2002-05-14 Cargill, Incorporated High oil corn processing
US6156227A (en) 1999-03-01 2000-12-05 Cargill, Incorporated Deicer composition which includes a plant material which is a corrosion inhibitor
US6388113B1 (en) * 1999-06-04 2002-05-14 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas ( Csic) High oleic/high stearic sunflower oils
BR0013309A (pt) * 1999-08-16 2002-05-28 Du Pont Fragmento de ácido nucléico isolado, complemento, gene quimérico, planta ou célula hospedeira transformada, planta transformada, planta ou célula hospedeira, sementes, óleo método de alteração do nìvel de ácidos graxos em uma planta ou célula hospedeira, método de produção de óleo se sementes contendo ácidos graxos, método para a produção de enzimas modificadoras de ácidos graxos, método para isolar fragmentos de ácidos nucléicos e seus subfragmentos funcionalmente equivalentes, alimentos animal e método para aprimorar a qualidade de carcaça de um animal
CA2382693C (en) * 1999-08-26 2013-10-01 Calgene Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
US7531718B2 (en) * 1999-08-26 2009-05-12 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
US6184442B1 (en) 2000-01-06 2001-02-06 Asgrow Seed Company Llc Soybean cultivar 9323265446452
US6369302B1 (en) 2000-03-08 2002-04-09 Asgrow Seed Company, Llc Soybean cultivar 958361722350
AU2001264880A1 (en) * 2000-05-24 2001-12-03 The Texas A And M University System Degumming of edible oils by ultrafiltration
WO2002010365A2 (en) * 2000-08-02 2002-02-07 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Down-regulation of single genes and simultaneous down-regulation of multiple genes by nuclear localization of rna transcripts
US6667064B2 (en) * 2000-08-30 2003-12-23 Pilot Therapeutics, Inc. Composition and method for treatment of hypertriglyceridemia
SE523094C2 (sv) * 2001-01-11 2004-03-30 Karlshamns Ab Förfarande för framställning av en fettkomposition som innehåller sterolestrar, fria steroler och glycerider, fettkomposition framställd genom förfarandet samt fettkompositionens användning
US6511690B1 (en) * 2001-02-01 2003-01-28 Carolina Soy Products, Inc. Soybean oil process
JP4995377B2 (ja) * 2001-04-26 2012-08-08 花王株式会社 油脂組成物
JP4728561B2 (ja) 2001-05-14 2011-07-20 マーテック バイオサイエンシーズ コーポレーション 植物種子および微生物由来のステアリドン酸およびγ−リノレン酸を含む極性脂質リッチ画分の精製および使用方法
EP2261312A1 (en) 2001-12-12 2010-12-15 Martek Biosciences Corporation Extraction and Winterization of Lipids from Oilseed and Microbial Sources
US7166771B2 (en) 2002-06-21 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs
US20040107460A1 (en) 2002-03-21 2004-06-03 Fillatti Joanne J. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
EP2294915A3 (en) 2002-03-21 2011-04-13 Monsanto Technology LLC Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
US7566813B2 (en) 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
US7078588B2 (en) 2002-05-03 2006-07-18 Renessen Llc Seed specific USP promoters for expressing genes in plants
KR101288258B1 (ko) 2002-06-19 2013-07-26 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 다가불포화 지방산을 함유하는 미생물 오일의 제조방법
AR039717A1 (es) 2002-06-21 2005-03-09 Monsanto Technology Llc Construcciones de arn de intrones cadena doble y usos de las mismas
AR039716A1 (es) * 2002-06-21 2005-03-09 Monsanto Technology Llc Secuencias de acidos nucleicos relacionadas con tioesterasas y metodos de uso para la produccion de plantas con composicion de acidos grasos modificada
US6791016B1 (en) * 2003-01-31 2004-09-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean variety 93M40
US20040172682A1 (en) 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
CN101437958B (zh) * 2003-08-01 2012-02-08 先锋高级育种国际公司 具有优越农业性能的大豆植物及其生产方法
US7579492B2 (en) * 2003-09-30 2009-08-25 Carolina Soy Products Llc Two-stage extraction of soybean oil
US6924381B2 (en) * 2003-12-24 2005-08-02 Carolina Soy Products, Llc Modified physical refining of soybean oil
US7855323B2 (en) 2004-02-10 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Recombinant DNA for gene suppression
EP1766032B1 (en) 2004-02-13 2012-10-10 Monsanto Technology, LLC In vivo assembly of transcription units
BRPI0515928B1 (pt) 2004-09-29 2018-02-06 Monsanto Technology Llc Método para obter germoplasma de soja
US8057835B2 (en) 2004-11-04 2011-11-15 Monsanto Technology Llc Seed oil compositions
CA2988226C (en) * 2006-03-10 2022-04-26 Monsanto Technology Llc Soybean seed and oil compositions and methods of making same
US9480271B2 (en) * 2009-09-15 2016-11-01 Monsanto Technology Llc Soybean seed and oil compositions and methods of making same

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