KR20100047100A - 베타-프룩토퓨라노시다제가 도입된 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 베타-프룩토퓨라노시다제가 도입된 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 베타-프룩토퓨라노시다제를 코딩하는 유전자, 그 유전자를 포함하는 재조합벡터 및 베타-프룩토퓨라노시다제가 도입된 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 수크로오스 대사관련 유전자군 전체를 도입하지 않고, 베타-프룩토퓨라노시다제 유전자의 도입으로도, 고가의 포도당 대신 저가의 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다.

만헤미아, 베타-프룩토퓨라노시다제, 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈

Description

베타-프룩토퓨라노시다제가 도입된 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물 {Recombinant Microorganism Having an Ability of Using Sucrose as a Carbon Source by Introducing β-fructofuranosidase}

본 발명은 베타-프룩토퓨라노시다제가 도입된 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

각국의 지속가능한 발전에 대한 관심과 정책적인 전략은 이른바 친환경 녹색기술(Green Technology, GT)이라는 새로운 분야를 태동시켰다. 재생가능한 생물자원으로부터 바이오기반 유용한 물질들을 생산하기 위한 산업생명공학도 친환경 녹색기술의 각광받는 분야중의 하나이다. 재생가능한 생물자원으로부터 미생물 등을 활용하여 유용한 물질들을 개발하는 기술은 크게 재생가능한 생물자원을 미생물이 활용할 수 있도록 처리하는 전처리공정과 미생물이 이를 활용하여 유용한 대사산물을 생산하도록 하는 과정으로 나눌 수 있다. 지구상에 재생가능한 원료가 얼마나 많이 존재하는지, 얼마나 낮은 가격에 원료를 확보할 수 있는지, 얼마나 쉽게 전처리가 가능한지 등의 전처리 공정적인 측면에서의 고려사항에 비해, 실제 생산공정에서는 오히려 비교적 단순한 문제로 귀결된다. 즉, 재생가능한 원료로부터 전처리 된 탄소원들을 과연 유용한 바이오 생산품을 생산하도록 디자인된 미생물이 쉽게 대사할 수 있는가 하는 점이다.

현재까지의 미생물 발효를 통한 바이오 생산품의 생산은 그 기본 원료물질로 포도당을 기반으로 한 생산 시스템이 대부분을 차지하고 있다. 하지만, 포도당의 경우 대부분 곡물의 녹말성분을 분해하여 얻게 되는데, 그 단가가 높은 편이어서, 포도당을 이용하여 다양한 바이오 생산품을 생산하기에는 상용화에 어려움이 있다. 따라서, 가격이 저렴하면서도 풍부하게 존재하며, 식량자원으로서 그 활용도가 낮은 탄소원 발굴을 위한 연구가 꾸준히 진행되고 있다. 목재나 펄프산업의 웨이스트(waste)를 활용한 목질계 가수생성물, 바이오디젤을 생산하면서 부산물로 나오는 글리세롤, 낙농업의 부산물인 유청, 그리고 옥수수가공의 부산물로서 corn steep liquor 등의 탄소원으로 하여 유용한 바이오 생산품을 생산하기 위한 연구가 다양한 연구진에 의해 진행되었다 (Samuelov et al ., Appl . Environ . Microbiol ., 65:2260, 1999; Lee et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 54:23, 2000; Lee et al ., Biotechnol . Bioeng ., 72:41, 2001; Lee et al ., Biotechnol . Lett ., 25:111, 2003; Lee et al ., Bioproc . Biosystems Eng ., 26:63, 2003). 특히 옥수수 전분으로부터 주로 생산되고 있는 포도당의 경우에는 식량자원으로 활용된다는 특성상 지속적인 옥수수 가격의 상승, 그리고 옥수수로부터의 추출, 전처리, 효소반응, 정제 등의 일련의 복잡한 생산 공정들을 거쳐야 하기 때문에 생산단가를 수크로오스 수준으로 낮추는 것은 매우 힘들다고 알려져 있다.

현재까지 고농도 세포배양을 통한 생분해성 고분자, 구연산, 이타코산, 아세 톤, 부탄올, 에탄올, 이소프로판올, 및 잔탄검 등 다양한 바이오 생산품의 생산에 수크로오스를 활용할 수 있다는 예가 보고되어 있다. 하지만, 실질적으로 수크로오스를 탄소원으로 사용하여 미생물 발효를 통한 목적화학물질 생산을 성공하여 실질적으로 상업화한 예는 많지가 않다.

따라서, 친환경 녹색성장의 핵심기술로서 미생물 발효를 통한 다양한 화학물질 생산이 산업화에 성공하려면, 수크로오스 같은 값싸고 풍부한 탄소원을 이용하여, 이를 효과적으로 섭취하고 이를 분해할 수 있는 미생물의 개발이 필요하다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 있게 하는 신규 수크로오스 대사관련 유전자들 (sacC, cscA, sacA) 및 이에 의해 코딩되는 베타-프룩토퓨라노시다제를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 수크로오스 대사관련 유전자가 도입되어 있는 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 β-D-프룩토퓨라노시드 결합을 가수분해하여 프락토오스를 유리하는 활성을 가지는 베타-프룩토퓨라노시다제 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자가 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 도입되어 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 배양하는 것을 특징으로 하는 대사산물, 생분해성 고분자 또는 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 베타-프룩토퓨라노시다제를 코딩하는 유전자의 도입으로, 고가의 포도당 대신 저가의 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 있는 재조합 미생 물을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에서는 가격이 저렴하고 자연계에 풍부하게 존재하는 수크로오스를 탄소원으로 효율적으로 사용 가능하게 할 수 있는 새로운 효소를 동정하고 개발함으로서 향후 미생물 발효를 통한 다양한 바이오 생산품의 생산, 즉 유용한 화학물질들의 제조, 의료용 재조합 단백질 생산, 다양한 생분해성 고분자 생산에 있어, 수크로오스를 그 탄소원으로 보다 효율적이고 경제적으로 생산하는데 이용될 것이다. 특히, 수크로오스는 그 자체로서 세포내의 단백질들을 변성을 막고 안정화시키거나, 외부환경의 변화로부터 세포의 용해를 최대한 억제시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에, 고농도의 기초 화학물질 생산이나 고농도 세포 배양 시에 더 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

본 발명자는 저렴하고 풍부한 탄소원의 하나로서 설탕으로 널리 알려진 수크로오스를 활용한 바이오 생산품의 생산, 정확히는 수크로오스를 탄소원으로 활용할 수 있는 미생물 또는, 활용할 수 없는 미생물의 경우에서라도 이를 활용할 수 있게 하는 효소를 발굴하고, 이를 활용하여 다양한 바이오 생산품의 생산에 응용하고자 한다.

수크로오스는 글루코오스와 프락토오스로 이루어진 이당류로서 지구상에 풍부하게 존재하는 탄소원 중의 하나이다. 광합성 능력을 보유한 대부분의 식물로부터 생산되며 특히, 열대 및 아열대성 작물인 사탕수수와 사탕무는 과량의 수크로오스를 함유하고 있다. 수크로오스는 사탕수수의 기계적인 압착으로 얻어진 추출액의 단순한 증발/농축 공정을 통하여 산업적으로 생산이 가능하고, 현재 전 세계 수크로오스의 60% 이상이 사탕수수로부터 매우 저렴하게 생산되고 있다. 포도당 함유량을 기준으로 미생물을 발효의 원료로 사용가능한 다양한 원료물질들의 가격을 계산한 쿠티나스 (Koutinas) 등의 2004년도 논문에 따르면, 포도당 함유량 1 킬로그램을 기준으로 수크로오스의 가격은 26.1 센트로서 포도당 가격의 1/4 수준이고, 이는 소맥, 당밀의 가격과 비교해도1/2 ~ 2/3의 가격에 해당하는 수준이다 (Koutinas et al ., Ind. Crops and Products, 20:75, 2004). 게다가, 최근 15년간 International Sugar Organizatioin에 공시된 수크로오스 가격의 추이를 살펴보면, 1995년의 13.28 cents/lb를 정점으로, 1999년 6.27 cents/lb 까지 폭락했다가, 다시 2008년 3월경 14.20 cents/lb를 거쳐 2008년 5월 7일 가격이 12.44 cents/lb 수준으로 유지되고 있으며, 공급과잉으로 인하여 하향 안정세를 유지할 것으로 전망하고 있다. 이러한 가격적인 이점 이외에도 수크로오스는 곡물로부터 얻어지는 것이 아니기 때문에, 최근의 곡물파동과 같은 식량위기 상황에서도 비교적 안정적으로 공급가능하다는 장점이 있다.

현재까지 고농도 세포배양을 통한 생분해성 고분자, 구연산, 이타코산, 아세톤, 부탄올, 에탄올, 이소프로판올, 및 잔탄검 (Lee et al ., Biotechnol . Lett ., 15:971, 1993; Lee et al ., Biotechnol . Techniques, 1:59, 1997; Forster et al ., App . Microbiol . Biotechnol ., 75:1409, 2007; George et al ., Appl . Environ. Microbiol ., 45:1160, 1983; Durre, Appl . Microbiol . Biotechnol ., 49:639, 1998; Kautola et al ., Biotechnol . Lett ., 11:313, 1989; Letisse et al ., Appl . Microbiol. Biotechnol ., 55:417, 2001) 등 다양한 바이오 생산품의 생산에 수크로오스를 활용할 수 있다는 예가 보고되었으며, 이는 수크로오스 활용능력의 향상이 곧 효과적인 바이오 생산품의 생산에 직접적인 영향을 줄 수 있을 것으로 예상된다.

하지만, 원료로서의 장점과 수크로오스 자체가 가지는 단백질 변성에 대한 보호기능, 외부환경에 대한 세포의 보호기능 등 여러 가지 이점에도 불구하고 (Kilimann et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1764, 2006), 실질적으로 수크로오스를 탄소원으로 사용하여 미생물 발효를 통한 목적화학물질 생산을 성공하여 실질적으로 상업화한 예는 많지가 않다. 이는 다수의 미생물들이 수크로오스 대사할 수 있는 메커니즘을 가지고 있지 않거나 가지고 있는 경우에도 대사속도가 느려 목적한 바이오 생산품을 효과적으로 생산할 수 없는 것이 그 원인 중에 하나이다. 따라서, 친환경 녹색성장의 핵심기술로서 미생물 발효를 통한 다양한 화학물질 생산이 산업화에 성공하려면, 수크로오스와 같은 값싸고 풍부한 탄소원을 이용하여, 이를 효과적으로 섭취하고 이를 분해할 수 있는 미생물의 개발이 필요하다. 이를 위해서는 수크로오스를 빠른 속도로 분해하고 대사할 수 있는 효소의 동정 및 이의 활용이 수반되어야 한다.

현재까지 몇몇의 연구자들에 의하여, 수크로오스를 활용가능하게 하는 효소군의 개발이 이루어져 왔다. 대표적인 것이 대장균 유래의 PTS (phosphoenol pyruvate-dependent phosphotransferase system) 및 non-PTS의 수크로오스 운송 시스템(sucrose transport system)을 도입하여 아미노산 생산에 활용한 Ajinomoto Co.의 기술들을 들 수 있고, 이는 PTS 또는 non-PTS 연관 전체 유전자군을 도입함으로서 발명을 완성하였다는 특징을 가지고 있다. 하지만 본 발명에서는 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) 유래의 베타-프룩토퓨라노시다제 (β-fructofuranosidase)인 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈(SacC, MS0909)를 비롯하여, 다른 베타-프룩토퓨라노시다제 (β-fructofuranosidase)를 코딩하는 신규 유전자들 (cscA , sacA)의 도입으로도, 수크로오스를 대사할 수 없는 미생물을 수크로오스를 대사 가능하게 함을 보이고, 본 균주를 활용한 다양한 대사산물의 생산하는 예를 보임으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서는 만헤미아 숙시니프로듀슨스 (Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)), E. coli W 및 Bacillus subtilis의 유전정보를 바탕으로 수크로오스를 분해하여 해당과정으로 연결시키는데 관여하는 효소 베타-프룩토퓨라노시다제 (β-fructofuranosidase)를 코딩하는 신규 유전자들 (sacC , cscA , sacA) 찾아내고, 이의 서열과 기능을 규명하였다.

IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 국제 생화학 및 분자생물학 연합, http://www.iubmb.org/)의 기능에 따른 효소분류법에 의해 부여된 EC number (Enzyme Comission number)는 효소를 구분하기 위해 가장 널리 활용되는 번호이다.

수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈의 정식 명칭은 베타-프룩토퓨라노시다제 (β-fructofuranosidase, (EC 3.2.1.26)) 이고, β-D-fructofuranoside fructohydrolase, invertase, saccharase, glucosucrase, β-h-fructosidase, β- fructosidase, invertin, sucrase, maxinvert L 1000, fructosylinvertase, alkaline invertase, acid invertase 등의 다른 명칭들이 존재한다 (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/26.html). 즉, 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 및 수크레이즈 등은 모두 EC 3.2.1.26에 해당하는 베타-프룩토퓨라노시다제(β-fructofuranosidase)라는 정식 명칭을 가지고 있다.

이러한 베타-프룩토퓨라노시다제는 β-D-fructofuranoside에서 터미널(terminal) 비환원 β-D-fructofuranoside 잔기들을 가수분해하는 반응에 관여하며, 관여하는 반응의 기질에 따라서, 수크로오스를 가수분해하면 수크레이즈 또는 인버타제, 수크로오스-6-포스페이트를 기질로 하면 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈라는 관용명으로 쓰인다.

이에 본 실시예에서는, 맨하이미아 유래의 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 (EC 3.2.1.26, SacC), 즉, 베타-프룩토퓨라노시다제(β-fructofuranosidase)의 도입에 의한 수크로오스 대사능을 증명하는 것에 더하여, 일반적인 베타-프룩토퓨라노시다제(β-fructofuranosidase)의 도입이 수크로오스 대사능을 가지게 한다는 것을 보이고자 노력한 결과, 예시로서 E. coli W 균주 유래의 인버타제 (EC 3.2.1.26, CscA)와 Bacillus subtilis 유래의 베타-프룩토퓨라노시다제 (EC 3.2.1.26, SacA) 각각을 도입함으로서, 수크로오스를 대사할 수 없는 미생물이 베타-프룩토퓨라노시다제 (EC 3.2.1.26)를 도입함으로서 수크로오스를 대사하여 성장하는 것을 보이고자 한다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 수크로오스를 가수분해하여 글루코오스와 프룩토오스로 전환하는 활성 및 수크로오스-6-포스페이트를 가수분해하여 글루코오스-6-포스페이트 및 프락토오스로 전환하는 활성 등을 포함하는, β-D-프룩토퓨라노시드 결합을 가수분해하여 프락토오스를 유리하는 활성을 가지는 베타-프룩토퓨라노시다제에 관한 것이다. 또한, 상기 베타-프룩토퓨라노시아다제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다.

구체적으로, 본 발명은, 수크로오스를 분해하여 해당과정으로 연결시키는데 관여하는 효소인 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-프룩토퓨라노시다제에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 베타-프룩토퓨라노시다제를 코딩하는 유전자 (sacC)에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 베타-프룩토퓨라노시다제를 코딩하는 유전자 (SacC)는 수크로오스-6-포스페이트를 글루코오스-6-포스페이트 및 프락토오스로 전환시키는 활성 또는 수크로오스를 글루코오스 및 프락토오스로 전환시키는 활성을 가진다. 본 발명에 있어서, 상기 sacC는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 일 관점에서, 수크로오스를 분해하여 해당과정으로 연결시키는데 관여하는 효소인 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 베타-프룩토퓨라노시다제에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 베타-프룩토퓨라노시다제를 코딩하는 유전자 (cscA, invertase, sucrase, sucrose hydrolase)에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 베타-프룩토퓨라노시다제를 코딩하는 유전자 (cscA) 는 수크로오스-6-포스페이트를 글루코오스-6-포스페이트 및 프락토오스로 전환시키는 활성 또는 수크로오스를 글루코오스 및 프락토오스로 전환시키는 활성을 가진다. 본 발명에 있어서, 상기 cscA는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 일 관점에서, 수크로오스를 분해하여 해당과정으로 연결시키는데 관여하는 효소인 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 베타-프룩토퓨라노시다제에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 베타-프룩토퓨라노시다제를 코딩하는 유전자 (sacA, BSU38040, sucrose-6-phosphate hydrolase)에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 베타-프룩토퓨라노시다제를 코딩하는 유전자 (sacA)는 수크로오스-6-포스페이트를 글루코오스-6-포스페이트 및 프락토오스로 전환시키는 활성 또는 수크로오스를 글루코오스 및 프락토오스로 전환시키는 활성을 가진다. 본 발명에 있어서, 상기 sacA는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 맨하이미아 유래의 sacC에 의해 코딩되는 베타-프룩토퓨라노시다제와 protein BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 검색을 통한 효소의 아미노산 시퀀스 간의 상동성 비교를 실시해 보면, E. coli W 균주 유래의 cscA에 의해 코딩되는 인버타제의 경우는 28%의 상동성을 가지고, Bacillus subtilis 유래의 sacA에 의해 코딩되는 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 (베타-프룩토퓨라노시다제)의 경우는 35%의 상동성을 지닌다. 그리고, 두 균주 유래의 베타-프룩토퓨라노시다제는 모두 “SacC”로 지칭되는 베타-프룩토시다제 (COG1621)라는 보존 된 구간(conserved domain)을 가진다. 이는 상동성에 있어서 비록 어느정도 차이가 있더라도, "SacC”로 지칭되는 베타-프룩토시다제 (COG1621)라는 보존된 구간이 존재하면, 하기에 보인 대로 이를 미생물 내에 도입하였을 때, 수크로오스를 대사하여 성장할 수 있음을 보여준다. 그러므로, 상기 베타-프룩토퓨라노시다제에 관해 본 명세서에서는 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 예시로 제시하였으나, 이에 제한되지 아니하고, β-D-프룩토퓨라노시드 결합을 가수분해하여 프락토오스를 유리하는 활성을 가진 베타-프룩토퓨라노시다제라면 모두 본 발명에 포함될 수 있다. 예시적으로, 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열과 서열동일성이 적어도 70%, 80%, 90% 이상인 아미노산 서열 또한 본 발명에 포함될 수 있다.

마찬가지로, 상기 베타-프룩토퓨라노시다제를 코딩하는 유전자는 일 예로, 서열번호 4, 5 또는 6의 염기서열을 가질 수 있으며, 이 서열 중 어느 하나의 염기 서열이 치환, 결실, 삽입 및 부가되어 돌연변이가 일어남으로써 상기 본 발명에 따른 염기서열과 적어도 70%, 80%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%의 서열 동일성을 가지는 DNA 또한 본 발명에 포함될 수 있을 것이다.

상기 "서열 동일성"이란, 2개의 폴리뉴클레오티드간 또는 아미노산간 잔기의 서열 유사성을 말한다. 상기 "서열 동일성"은 비교대상의 염기서열 또는 아미노산 서열의 영역에 걸쳐, 최적한 상태로 얼라인먼트된 2개의 염기서열 또는 아미노산 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다. 여기에서, 비교대상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은, 2개의 서열의 최적한 얼라인먼트를 위한 참고서열 (예컨대 컨센서스 서열 등)과 비교하여, 부가 또는 결실 (예컨대, 갭, 오버행 등)을 갖고 있 어도 된다. 서열 동일성의 수치는 양방의 서열에 존재하는 동일한 핵산염기 또는 아미노산을 결정하여, 적합부위의 수를 결정하고, 이어서, 비교대상의 서열영역 내의 염기 또는 아미노산의 총수로, 상기 적합부위의 수를 나누어, 얻어진 수치에 100을 곱함으로써, 산출될 수 있다. 핵산 또는 아미노산 사이의 서열 동일성은, 예컨대, 서열 해석 소프트, 구체적으로는 BLASTN, FASTA 등을 사용하여 측정된다. 상기 BLAST은,http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/에서 일반적으로 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 수크로오스(sucrose)는 앞서 설명한 바와 같이, D-글루코오스와 D-프락토오스로 이루어지는 이당류로, 그 자체로서 세포내의 단백질들을 변성을 막고 안정화시키거나, 외부환경의 변화로부터 세포의 용해를 최대한 억제시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있어, 고농도의 기초 화학물질 생산이나 고농도 세포 배양시에 더 유용하게 활용가능하다.

도 1에 나타난 바와 같이, M. succiniciproducens MBEL55E 유래의 신규 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈를 수크로오스를 대사할 수 없는 미생물에 도입했을 때, 상기 도입된 효소가 4가지 가능한 경로를 통해서 대사되는 것으로 예상된다.

첫 번째 가능한 경로 (Reaction I)는 도입한 상기 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈가 세포 외부 (Extracellular space)에서 수크로오스를 글루코오스와 프락토오스로 분해한 후, 각각의 특정한 포스포트랜스퍼라제 등의 수송에 관여하는 효소들을 통하여 세포 내부로 도입되는 경우이다.

두 번째 가능한 경로 (Reaction II)는 도입된 수크로오스-6-포스페이트 하이 드롤레이즈가 주변세포질(periplasm)내에서 수크로오스를 글루코오스와 프락토오스로 분해한 후, 각각의 특정한 포스포트랜스퍼라제 등의 수송에 관여하는 효소들을 통하여 세포 내부로 도입되는 경우이다.

세 번째 가능한 경로 (Reaction III)는 수크로오스가 포스포트랜스퍼라제 계열이 아닌 퍼미아제(permease) 효소에 의해 수크로오스 형태 그대로 세포 내로 들어와서, 상기 도입된 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈에 의해 글루코오스와 프락토오스로 분해되어 이용되는 경우이다.

네 번째 가능한 경로 (Reaction IV)는 수크로오스가 포스포트랜스퍼라제에 의해 세포 내부로 들어오면서 수크로오스-6-포스페이트로 전환되고, 도입된 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈에 의해 프락토오스와 글루코오스-6-포스페이트로 전환되어 이용되는 경우이다.

또한, 상기의 sacC 유전자는 M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)유래로, 상기 균주는 Actinobacillus succinogenes 130Z (ATCC 55618)와 함께 Pasteurellaceae 과(family)에 속한다. 특히 상기 M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)와 A. succinogenes 130Z (ATCC 55618)의 게놈 서열 및 세포 생리(cell physiology)가 매우 유사하다. 상기 두 균주의 게놈 서열은 지금까지 해독된 모든 게놈 서열 가운데 가장 유사한 것으로 알려져 있다 (McKinlay et al ., Appl . Microbiol. Biotechnol ., 76:727, 2007). 또한, 상기 sacC 유전자에 대해서 A. succinogenes 130Z 유래인 것이 M. succiniciproducens MBEL55E유래의 것과 매우 높은 상동성을 가지며, 가장 유사한 효소로 알려져 있으므로, M. succiniciproducens MBEL55E 유래의 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 (SacC, MS0909) 효소 및 이를 코딩하는 유전자와 A. succinogenes 130Z의 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 (Asuc_1829) 효소 및 이를 코딩하는 유전자도 마찬가지로 적용되는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명하다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 sacC 유전자를 비롯한 베타-프룩토퓨라노시다제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제작한 다음, 이를 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 없는 대장균에 도입함으로써, 상기 재조합 벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물, 상기 제작된 재조합 미생물을 단일 탄소원으로 수크로오스를 함유하는 배지에서 배양한 결과, 수크로오스 대사능을 갖는다는 것을 확인하고, 이를 이용한 대사산물, 생분해성 고분자, 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 적당한 숙주세포에서 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 단백질의 발현을 조절할 수 있는 조절 서열(control sequences)에 작동가능하도록 연결된 DNA 서열 및 기타 유전자 조작을 용이하게 하거나 단백질의 발현을 최적화하거나 또는 벡터의 복제에 필요한 서열들을 함유하는 DNA 작제물(DNA construct)을 말한다. 상기 조절 서열에는 전사를 조절하기 위한 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위해 선택적으로 부가된 오퍼레이터(operator), 적절한 mRNA 리보좀 결합부위 및 전사/번역의 종료를 조절하는 서열들이 포함될 수 있다. 일 예로, 상기 재조합 벡터는 도 2의 개열지도를 가지는 재조합 벡터일 수 있으나, 도 2에 나타난 pTac15K 벡터이외에 다른 공지의 벡터들도 적용가능하며, pTrc99A, pTac99A, pMAL series 와 같은 발현벡터 뿐만 아니라, pACYC, pBluescript SK-, pBR322, pGEM series, pMB1 등의 클로닝 벡터들에도 sacC 유전자를 비롯한 베타-프룩토퓨라노시다제를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현카세트를 삽입함으로서 적용가능하고, 그 외에도 본 발명이 속한 기술분야의 공지의 재조합 벡터(Sambrook J, Russell D, Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Lab (CSHL) Press, New York, 2001)를 이용하는 것이 가능하다. 또한, 카나마이신 저항 유전자 이외에도 공지된 다른 여러 저항 유전자를 포함하는 것 또한 본 발명에 적용가능하다.

본 발명의 하기 실시예에서, 상기 sacC, cscA, sacA를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 없는 미생물을 형질전환시켜 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물을 제작하였으나, 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 없는 미생물의 염색체에 상기 유전자를 공지의 방법으로 삽입시켜 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물을 제작할 수 있다. 아울러, 본 발명의 실시예에서는 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 없는 숙주 미생물로 특정 대장균만을 예시하였지만, 기타 다른 대장균뿐만 아니라, 박테리아, 효모 및 곰팡이 등 수크로오스를 탄소원으로 사용할 수 없는 숙주 미생물에 도입하더라도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 상기 베타-프룩토퓨라노시다제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물 및 상 기 재조합 미생물을 수크로오스를 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 대사산물, 생분해성 고분자 또는 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 여기서, 대사산물이란, 대사 과정을 통해 생성되는 중간 산물, 생성물을 총칭하는 것으로, 일차 대사산물과 이차 대사산물로 구분된다.

일 예로, 본 발명은 바이오 퓨얼, 일차이차 대사산물, 생분해성 고분자, 재조합 단백질 생산균주 등 재조합 또는 genome-engineered 된 수크로오스를 활용할 수 없는 미생물에 다양하게 적용 가능 할 것이다. 예를 들어, 부탄올 (Atsumi et al., Nature ., 451:7174, 2008), 에탄올 (Lindsay et al ., Appl. Microbiol . Biotechnol, 43:70, 1995), 젖산 (Zhou, Appl . Environ . Microbiol, 69:399 2003), 숙신산 및 사과산 (Jantama et al ., Biotechnol . Bioeng ., 99:1140, 2008), 아미노산(Park et al ., PNAS, 104:7797, 2006; Lee et al ., Molecular Systems Biology, 3:1, 2007), 생분해성 고분자 (Ahn et al ., Appl. Environl . Microbiol ., 66:3624, 2000; Park et al ., Biomacromolecules , 2:248, 2001; Park et al ., Biotechnol . Bioeng ., 74:81, 2001), 재조합 단백질 (Jeong et al ., Appl. Environl . Microbiol ., 65:3027, 1999; Han et al ., Appl. Environl. Microbiol ., 69:5772, 2003)등의 생산 시에 지금까지는 포도당을 주 탄소원으로서 활용하여 그 목적 바이오 생산품을 생산하였으나, 본 발명을 상기의 공지의 균주에 도입하면, 수크로오스를 탄소원으로 활용하여, 목적하는 유용 바이오 생산품을 생산가능할 것이다. 하기 실시예에서는 대사산물의 일 예로써, 트레오닌 등을 예시로 하여 대사산물을 생산하는 예를 보이고 있으나, 이외에도 생분해성 고분자, 재조합 단백질의 생산에도 본 발명을 당업자는 용이하게 적용가능 할 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 수크로오스 대사에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자의 분리

1.1: 맨하이미아 유래 수크로오스-6- 포스페이트 하이드롤레이즈 코딩하는 유전자의 분리

먼저, M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행함으로써 sacC (MS0909) 유전자의 DNA를 증폭하였다. 상기 sacC (MS0909)는 베타-프룩토퓨라노시다제(수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈)를 코딩하는 유전자(서열번호 4)이다.

서열번호 7: 5'-ACTGAGCCATGGCGAAAATCAATAAAGTAGATC-3'

서열번호 8: 5'-TGATCCGAGCTCCTATTATTCCAGTGTTCCCGCC-3'

1.2: 대장균 유래 인버타제를 코딩하는 유전자의 분리

E. coli W의 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 9 및 10의 프라이머들을 사 용하여 PCR을 수행함으로써 cscA 유전자의 DNA를 증폭하였다. 상기 cscA는 베타-프룩토퓨라노시다제(인버타제)를 코딩하는 유전자 (서열번호 5)이다.

서열번호 9: ACTCCGGAATTCATGACGCAATCTCGATTGCA

서열번호 10: ACCTGCGAGCTCCCGTTGTTCCACCTGATATTATG

1.3: 바실러스 서브틸리스 유래 수크로오스-6- 포스페이트 하이드롤레이즈 코딩하는 유전자의 분리

Bacillus subtilis의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11 및 12의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행함으로써 sacA 유전자의 DNA를 증폭하였다. 상기 sacA는 베타-프룩토퓨라노시다제(수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈)를 코딩하는 유전자 (서열번호 6)이다.

서열번호 11: GCATAGAATTCATGACAGCACATGACCAGGAGCT

서열번호 12: GCATAGAGCTCCTACATAAGTGTCCAAATTCCGACATTC

실시예 2: 재조합 벡터의 제작

2.1: pTac15K 의 준비

pKK223-3(Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)의 trc 프로모터와 trascription terminator 부분을 pACYC177 (NEB, Beverly, MA, USA)에 삽입하여 제작하였다. pTac15K는 구성적(constitutive) 발현을 위한 발현벡터로, 도 2의 개열지도에 나타난 구성을 가지고 있다.

2.2: 재조합 벡터 pTac15KsacC 의 제작

맨하이미아 유래의 베타-프룩토퓨라노시다제(수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈)를 코딩하는 유전자 sacC (MS0909)를 대장균에서 발현시키기 위하여, 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.

실시예 1.1에서 증폭된 sacC (MS0909) 유전자를 포함하는 PCR 절편을 EcoRI과 SacI으로 절단하고, 이를 같은 절단효소로 자른 pTac15K와 결합시키는 공지의 분자공학적 방법으로 pTac15KsacC를 제작하였다(도 3). 그리고 하기 서열번호 13 내지 16의 프라이머들을 이용하여 솔젠트(Solgent, Korea)에 시퀀싱을 의뢰하여 염기서열의 일치여부를 확인하였다.

서열번호 13: 5'-CCCGTTCTGGATAATGTTTT-3'

서열번호 14: 5'-AAAGTCACGGTTGTTATTCC-3'

서열번호 15: 5'-CATTTAATGCCGCTCATATT-3'

서열번호 16: 5'-ACCGCTCAATTATTGAGATT-3'

2.3: 재조합 벡터 pTac15KEWcscA 의 제작

실시예 1.2에서 얻은 DNA 단편을 EcoRI과 SacI로 처리하고, 동일한 효소로 처리한 pTac15K와 결합시키는 공지의 분자공학적 방법으로 pTac15KEWcscA를 제작하였다.

2.4 재조합 벡터 pTac15KBSsacA 의 제작

실시예 1.3에서 얻은 DNA 단편을 EcoRI과 SacI로 처리하고, 동일한 효소로 처리한 pTac15K와 결합시키는 공지의 분자공학적 방법으로 pTac15KBSsacA를 제작하였다.

실시예 3: 재조합 균주의 제작

3.1: Escherichia coli W3110 pTac15KsacC 균주의 제작

수크로오스를 대사할 수 없는 것으로 알려진 E. coli K-12 균주의 substrain인 E. coli W3110을 모델 미생물로 하기의 실험을 진행하였다. 상기 E. coli W3110을 LB 고체배지에 도말하여, 8 시간 동안 37℃에서 배양한 다음, 콜로니를 LB 액체배지 10 mL에 접종하여, 8 시간 배양하였다. 상기 배양액을 LB 액체배지 100 mL에 1 %(v/v) 접종하여 37℃ 진탕 배양기에서 배양하였다.

약 2 시간 후, OD₆₀₀가 0.30 ~ 0.35 정도가 되면, 얼음에 20 분간 방치하여 세포의 성장을 멈추게 한다. 4℃, 3,000 rpm, 15 분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득한 다음, 4℃ 상태의 RFI 용액 32 mL로 세포를 현탁하였다. 그리고 상기현탁액을 4℃, 3,000 rpm, 15 분 조건으로 원심분리하여 세포를 수득하였다. 이를 RFII 용액 8 mL로 세포를 재현탁한 후 얼음에 15분간 방치하였다. 최종적으로 상기 재현탁액을 100 ㎕ 씩 분주하여 -70℃에 보관하였다. RFI의 조성은 100 mM RbCl, 50 mM MnCl₂-4H₂O, 0.1 M CH₃COOK, 10 mM CaCl₂ 및 15 %(w/v) glycerol로 구성되며 0.2 M acetate를 첨가하여 pH를 5.8로 맞추었다. RFII는 10 mM MOPS, 10 mM RbCl, 100 mM CaCl₂, 및 15% (w/v) glycerol로 구성되며, NaOH를 첨가함으로 인해 pH를 6.8로 맞추었다.

이렇게 준비된 E. coli W3110 균주에 실시예 2.2에서 제작된 발현벡터 pTac15KsacC 또는 대조군으로 pTac15K (Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)를 혼합한 다음, 42℃에서 90초간 열충격을 가함에 따라 형질전환을 수행하였다. 열 충격 후, LB 액체배지 0.8 mL를 가하여 37℃ 진탕 배양기에서 1 시간 동안 배양하였다.

배양액을 항생제 카나마이신(최종농도 50 ㎍/L)를 함유한 LB 고체 배지에 도말하여, 37℃에서 12 시간 이상 배양하였다. 형성된 E. coli W3110 pTac15K 및 E. coli W3110 pTac15KsacC 콜로니를, LB 액체 배지에 접종을 하여, 37℃에서 8 시간 이상 배양하였다. 벡터가 잘 도입이 되었는지 확인하기 위해 상기 배양된 균주로부터, GeneAll^R Plasmid SV (GeneAll Biotechnology, Korea)를 이용하여 벡터를 분리하고, 전기영동을 통해 확인하였다.

3.2: E. coli W3110 pTac15KEWcscA 와 E. coli W3110 pTac15KBSsacA 균주의 제작

실시예 3.1에 기재된 방법과 동일한 방법으로, 수크로오스를 대사할 수 없는 것으로 알려진 E. coli K-12 균주의 substrain인 E. coli W3110을 실시예 2.3 및 2.4에서 제작된 pTac15KEWcscA 및 pTac15KBSsacA를 이용하여 형질전환시키고, 벡터 가 잘 도입되었는지 전기영동을 통해 확인하였다.

실시예 4: 재조합 대장균의 수크로오스 대사능 및 성장확인

상기 실시예 3.1에서 제작된 고체배지 상의 E. coli W3110 pTac15KsacC 균주와 E. coli W3110 pTac15K의 콜로니를 10 mL의 LB 배지에 접종하여 37℃에서 8 시간 동안 배양한 후, 이를 다시 10 g/L의 수크로오스를 포함한 100 mL의 M9 최소배지에 5 %(v/v) 접종한 후 37℃에서 배양하였다. 이때, 항생제로 최종농도 50 μg/L의 카나마이신을 첨가하였다. 상기 LB배지는 10 g/L의 tryptone, 10 g/L의 NaCl, 및 5 g/L의 yeast extract로 구성되었으며, M9 최소배지는 33.9 g/L의 Na₂HPO₄, 15 g/L의 KH₂PO₄, 2.5 g/L의 NaCl, 5 g/L의 NH₄Cl, 및 0.36 g/L의 MgSO₄로 구성되었다. 배양액 내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 OD₆₀₀의 값으로 측정하였다. 배양 중 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리한 후, 상등액의 수크로오스 및 대사산물의 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.

그 결과, 도 4, 도 5, 및 표 1에 나타낸 바와 같이, E. coli W3110 pTac15K 균주의 경우 수크로오스를 단일 탄소원으로 포함한 M9 최소배지에서 전혀 생장할 수 없으나, E. coli W3110 pTac15KsacC 균주는 수크로오스를 우수한 성능으로 대사하는 능력을 보였다. E. coli W3110 pTac15KsacC 균주는 17시간 동안 11.08 g/L의 수크로오스를 대사하여, OD₆₀₀ 기준으로 3.71의 바이오매스의 증가를 보였다. 이는 통상적인 대장균의 OD₆₀₀와 dry cell weight (DCW, g/L)의 conversion factor (1 OD₆₀₀ = 0.37 g/L DCW)를 고려할 때, 약 1.37 g/L의 바이오매스에 해당하는 양이다. 1.42 g/L의 아세트산이 생성되며, 2.01 g/L의 글루코오스 및 4.51 g/L의 프룩토오스가 남았고, 이들 두 당류는 시간에 따라 점점 소모됨을 알 수 있다.

균주	플라스미드	M9 최소 성장배지+10g/L 수크로오스에서의 성장	수크로오스 활용 표현형	수크로오스 농도 (g/L)
				0시간	17시간
E.coli W3110	pTac15K	-	scr-	11.00	11.12
E.coli W3110	pTac15KsacC	+	scr+	11.08	0.00

W3110 pTac15K 균주의 성장 그래프에서 (도 4), 접종 후 8 시간째에서 약간 OD가 증가한 것은 복합배지인 접종배지 (5 %(v/v) 접종함)에 들어있던 성분들에 의한 것으로 보이며, LC 분석결과, 수크로오스를 분해하지도, 또한 수크로오스를 단독 탄소원으로 하여 성장하지도 못하는 것을 보여준다.

또한, 상기 실시예 3.2에서 형질전환된 재조합 균주들 E. coli W3110 pTac15KEWcscA와 E. coli W3110 pTac15KBSsacA를 수크로오스를 단독 탄소원으로 하여 상기 E. coli W3110 pTac15KsacC 균주와 동일한 방법으로 배양한 결과, 도 6과 같이 우수한 성장능을 나타내었고, E. coli W3110 pTac15KEWcscA는 초기 수크로오스 7.77 g/L에서 47시간 후 1.82 g/L로 감소함을 확인하였고, E. coli W3110 pTac15KBSsacA는 초기 8.49 g/L에서 47시간 후 7.98 g/L로 감소함을 확인하여, 이들이 수크로오스를 대사하여 성장할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5 : 재조합 대장균을 이용하여 수크로오스를 탄소원으로 하는 대사산물 생산

앞서 살펴본 바와 같이, M. succiniciproducens 유래의 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈의 도입은 수크로오스를 탄소원으로 성장할 수 없는 미생물을 수크로오스 단독 탄소원으로 성장가능하게 하였다. 즉, 수크로오스를 탄소원으로 활용하지 못하는 미생물을 수크로오스를 단독 탄소원으로 최소배지상에서 배양가능 하게함으로서, 기존에 포도당 등을 탄소원으로 하는 다양한 일차이차 대사산물, 재조합 단백질, 생분해성 고분자 등의 다양한 바이오제품생산 시스템 등을 그대로 본 발명에 적용할 수 있다.

이에 본 실시예에서는 혐기조건에서 수크로오스를 활용하여, 다양한 대사산물을 생산하는 예를 보이려고 한다.

상기 실시예 3.1에서 제작된 E. coli W3110 pTac15KsacC 균주를 10 mL의 LB 배지에 접종하여 37℃에서 8 시간 동안 배양한 후, 이를 다시 200 mL의 LB 배지에 접종하여 37℃에서 8 시간 동안 배양하였고, 이를 조업부피 2.5 L의 발효조 (New Brunswick System, BioFlo 3000)에 접종하였다. 발효조의 배양배지는 20 g/L 수크로오스를 포함한 R/2 최소배지로 구성되었으며, 조업조건은 pH 6.8, 37℃, 200 rpm에 100% CO₂를 0.5 vvm의 속도로 주입하였다. 항생제로 최종농도 50 μg/L의 카나마이신을 첨가하였다. R/2배지는 6.75 g/L의 KH₂PO₄, 2 g/L의 (NH₄)₂HPO₄, 0.85 g/L의 C₆H₈O₇H₂0, 및 0.7 g/L의 MgSO₄7H₂0 과 5 ml/L의 trace metal solution (10 g/L FeSO₄7H₂0, 2 g/L CaCl₂, 2.2 g/L ZnSO₄7H₂0, 0.54 g/L MnSO₄5H₂0, 1 g/L CuSO₄5H₂0, 0.1 g/L NH₄Mo₇O₂₄7H₂0, 0.02 g/L Na₂B₄O₇10H₂0, 및 5 mL HCl) 으로 구성되었다. 배양액내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 OD₆₀₀의 값으로 측정하였으며, 주기적으로 채취된 시료는 13,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리한 후, 상등액의 수크로오스 및 대사산물의 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.

그 결과 도 7 및 표 2에 나타난 바와 같이, 아세트산, 포름산, 젖산, 숙신산, 및 에탄올 (acetic, formic, lactic, and succinic acid and ethanol)을 성공적으로 생산해 낼 수 있었다. 상기와 같은 혐기조건에서 52.5 시간동안 22.13 g/L의 수크로오스 및 이로부터 유래한 당류를 모두 소모하였으며, 그 결과 4.49 g/L의 아세트산, 3.74 g/L의 포름산, 4.19 g/L의 젖산, 5.10 g/L의 숙신산, 2.66 g/L의 에탄올을 수크로오스 기준으로 기질당 0.20, 0.17, 0.19, 0.23, 및 0.12 g/gSucrose의 수율로 생산하였으며, 이들 수율의 총합은 0.91 g/gSucrose로서 이론치에 근접한 상당히 높은 수율을 보였다. 또한, 배양시작 후 52.5 시간 의 OD₆₀₀ = 2.7 이므로, 이는 상기에 언급한 환산계수를 고려하면, gDCW = 0.999 에 해당하므로, 균체무게 당 수율인 비수율 (specific yield)은 표 2와 같다. 이는, 상기의 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈의 단독 도입을 통하여, 수크로오스를 이용하여 다양한 대사산물을 높은 수율과 높은 비수율을 보이면서 성공적으로 생산할 수 있음을 보여준다.

수크로오스 및 산물들	초기 농도	최종 농도	수율 (g/gSucrose)	비수율 (g/gDCW)
수크로오스	22.13	0	-	-
아세트산	0	4.49	0.20	4.49
포름산	0	3.74	0.17	3.74
락틱산	0	4.19	0.19	4.19
숙신산	0	5.10	0.23	5.11
에탄올	0	2.66	0.12	2.66
총	22.13	20.18	0.91	20.19

실시예 6: 트레오닌(Threonine) 생산 균주에 적용을 통한 대사공학적으로 개량된 유용 바이오 생산품 생산에 응용

대사공학적으로 개량된 genome-engineered 또는 재조합 대장균 균주에도 본 발명의 유전자를 도입함으로서, 포도당 혹은 기존에 사용되던 다른 탄소원을 대체하여 수크로오스를 활용하여 생산가능하다는 것의 예시로서 하기와 같은 트레오닌 생산 균주를 이용하여 실험을 진행하였다. 구체적으로, Escherichia coli W3110을 기반으로 대사공학적으로 개량된 genome-engineered 및 재조합 균주인 TH28C pBRThrABCR3 균주(Lee et al ., Molecular . Systems . Biology ., 3:149, 2007)를 모델로 하여 하기의 실험을 진행하였다.

실시예 3에서 설명한 방법과 같은 방법으로 상기 TH28C pBRThrABCR3 균주에 실시예 2에서 제작한 수크로오스 대사능을 가지게 하는 플라스미드pTac15KsacC로 형질전환시켜, TH28C pBRThrABCR3 pTac15KsacC를 제작하였다.

상기에서 제작된 TH28C pBRThrABCR3 pTac15KsacC 균주를 10 mL의 LB 배지에 접종하여 31℃에서 12 시간 동안 배양한 후, 이를 다시 50 mL의 LB 배지에 접종하여 31℃에서 12 시간 동안 배양하였고, 이를 조업부피 2.5 L의 발효조 (New Brunswick System, BioFlo 3000)에 접종하였다. 발효조의 배양배지는 20 g/L 수크로오스를 포함한 TPM2배지로 구성되었으며, 조업조건은 pH 6.5, 31℃, 용존산소 농도는 1 vvm의 Air의 공급과 자동적으로 rpm을 1000까지 올릴 수 있도록 조절함으로써 40 % 이상의 air가 포화된 상태가 되도록 유지하였다. 항생제로는 최종농도 30 μg/L의 클로로암페니콜, 40 μg/L의 카나마이신, 50 μg/L의 암피실린을 첨가하였다. TPM2배지는 2 g/L의 yeast extract, 2 g/L의 MgSO₄ ^.7H₂O, 2 g/L의 KH₂PO_{4 ,} 10 g/L (NH₄)₂SO₄ 및 0.2 g/L L-methionine과 0.2 g/L L-lysine과 0.05 g/L의 L-isoleucine 과 10 ml/L의 trace metal solution (10 g/L FeSO₄7H₂0, 2 g/L CaCl₂, 2.2 g/L ZnSO₄7H₂0, 0.54 g/L MnSO₄5H₂0, 1 g/L CuSO₄5H₂0, 0.1 g/L NH₄Mo₇O₂₄7H₂0, 0.02 g/L Na₂B₄O₇10H₂0, 및 5 mL HCl) 으로 구성되었다. 배양액내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 OD₆₀₀의 값으로 측정하였으며, 주기적으로 채취된 시료는 13,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리한 후, 상등액의 수크로오스 및 대사산물의 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 아미노산의 경우 5 ml의 배양액을 원심분리와 여과 과정을 거친 후에, Science Lab Center Co. (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 양이온 분리 컬럼 (cation seperation column, LCA K06/Na 1.6150mm; SykamGmbH, Eresing, Germany)을 통해 분리한 후 Sykam S433 아미노산 분석기를 활용하여 분석하였다.

그 결과 하기 표 3에 나타난 바와 같이, 수크로오스를 활용하여 4.7 g/L의 트레오닌을 성공적으로 생산해 낼 수 있었다.

수크로오스, 트레오닌, 및 세포성장	초기 수치	최종 수치 (15시간 배양 후)
OD600	0.4	18.0
수크로오스	23.7 g/L	0 g/L
트레오닌	0 g/L	4.7 g/L

상기에서 나타난 바와 같이 본 발명의 베타-프룩토퓨라노시다제 유전자를 도입하는 것만으로도, 수크로오스를 대사하는 능력을 갖춤은 물론 수크로오스를 탄소원으로 활용하여, 아세트산, 포름산, 젖산, 숙신산, 에탄올 등 여러 가지 대사산물의 생산을 가능하게 하였다. 또한, 대사공학적으로 개량된 균주에도 같은 방법으로 도입하여 목적 대사산물, 즉 본 예시에서는 트레오닌을 성공적으로 생산가능하였다. 이외에도 생분해성 고분자, 재조합 단백질의 생산에도 본 발명을 당업자는 용이하게 적용 가능할 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 수크로오스를 대사가능하게 하는 M. succiniciproducens MBEL55E 유래의 신규 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈를, 수크로오스를 대사할 수 없는 미생물에 도입했을 때, 이 효소가 수크로오스의 대사에 어떻게 관여할 수 있는지를 나타낸 4가지 가능한 경로를 나타내는 모식도이다 (굵은 화살표 (→): 도입한 M. succiniciproducens MBEL55E 유래의 신규 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈 효소가 관여할 가능성이 있는 4가지 가능한 경로들을 나타냄, 가는 화살표(→): 재조합 미생물이 원래 가지고 있는 당류 분해과정의 대사경로를 나타냄.)

도 2는 재조합 벡터 pTac15K의 개열 지도이다.

도 3은 수크로오스-6-포스페이트 하이드롤레이즈를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 pTac15KsacC의 개열 지도이다.

도 4는 재조합 E. coli W3110 pTac15K의 수크로오스 함유 M9 배지에서의 생장 그래프이다 (●를 포함한 실선: 수크로오스 농도; ◆를 포함한 실선: OD₆₀₀).

도 5는 본 발명에 따른 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 E. coli W3110 pTac15KsacC의 수크로오스 함유 M9 배지에서의 생장 그래프이다 (●를 포함한 실선: 수크로오스 농도; ◆를 포함한 실선: OD₆₀₀; ●를 포함한 점선: 글루코오스 농도; ○를 포함한 실선 : 프락토오스 농도; ▼를 포함한 점선: 아세트산 농도).

도 6은 E. coli W3110 pTac15KEWcscA 및 E. coli W3110 pTac15KBSsacA의 수크로오스 함유 M9 배지에서의 생장 그래프이다 (●를 포함한 실선: E. coli W3110 pTac15KEWcscA; ▲를 포함한 실선: E. coli W3110 pTac15KBSsacA)

도 7은 본 발명에 따른 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 E. coli W3110 pTac15KsacC를 혐기조건에서 발효한 생장 및 대사산물 생산 그래프이다 (●를 포함한 실선: 수크로오스 농도; △를 포함한 실선: OD₆₀₀; ▼를 포함한 실선: 글루코오스 농도; ■를 포함한 실선: 프락토오스 농도; ●를 포함한 점선: 숙신산 농도; ▽를 포함한 점선: 젖산 농도; ■를 포함한 점선: 포름산 농도; ◇를 포함한 점선: 아세트산 농도; ▲를 포함한 점선: 에탄올 농도)

<110> KAIST <120> Recombinant Microorganism Having an Ability of Using Sucrose as a Carbon Source by Introducing beta-fructofuranosidase <130> P08-B220 <150> KR10-2008-0106113 <151> 2008-10-28 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 502 <212> PRT <213> SacC <400> 1 Met Arg Ser Phe Leu Pro His Phe Ser Leu Phe Tyr Phe His Gln Gly 1 5 10 15 Ile Met Met Ile Ile Phe Asn Asn Gly Lys Tyr Lys Ser Ile Leu Ala 20 25 30 Ala Glu Gln Gly Glu Leu Glu Arg Ile Lys Ser Glu Val Glu Lys Asp 35 40 45 Arg Asp Phe Arg Pro Tyr Tyr His Leu Ala Pro Ser Thr Gly Leu Leu 50 55 60 Asn Asp Pro Asn Gly Leu Val Phe Asp Gly Glu Lys Phe His Leu Phe 65 70 75 80 Tyr Gln Trp Phe Pro Phe Asp Ala Ile His Gly Met Lys His Trp Lys 85 90 95 His Phe Thr Thr Glu Asp Phe His Ile Tyr Thr Glu Ala Asp Pro Leu 100 105 110 Ile Pro Cys Glu Leu Phe Glu Ser His Gly Cys Tyr Ser Gly Gly Ala 115 120 125 Leu Pro Val Gly Asp Lys Ile Ala Ala Phe Tyr Thr Gly Asn Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Ala Asp Asn Gln Arg Val Pro Phe Gln Asn Leu Ala Ile Phe 145 150 155 160 Asp Arg Thr Gly Lys Leu Leu Ser Lys Arg Pro Leu Ile Glu Asn Ala 165 170 175 Pro Lys Gly Tyr Thr Glu His Val Arg Asp Pro Lys Pro Tyr Phe Thr 180 185 190 Lys Glu Gly Lys Ile Arg Phe Ile Cys Gly Ala Gln Arg Glu Asp Leu 195 200 205 Thr Gly Thr Ala Ile Ile Phe Glu Met Asp Asn Leu Asp Asp Glu Pro 210 215 220 Arg Leu Leu Gly Glu Leu Ser Leu Pro Ala Phe Asp Asn Gln Lys Val 225 230 235 240 Phe Met Trp Glu Cys Pro Asp Leu Leu Lys Val Gly Asp Asn Asp Ile 245 250 255 Phe Ile Trp Ser Pro Gln Gly Lys Arg Arg Glu Ala Arg Arg Phe Gln 260 265 270 Asn Asn Phe His Ala Val Tyr Ala Val Gly Lys Leu Asp Asp Arg Thr 275 280 285 Phe Asn Ala Ala His Ile Ala Glu Leu Asp Gln Gly Phe Asp Phe Tyr 290 295 300 Ala Pro Gln Thr Phe Ala Gly Leu Glu Asn Gln Lys His Ala Val Met 305 310 315 320 Phe Gly Trp Cys Gly Met Pro Asp Leu Thr Tyr Pro Thr Asp Lys Tyr 325 330 335 Lys Trp His Ser Met Leu Thr Leu Pro Arg Glu Ile Thr Leu Gln Gly 340 345 350 Asn Arg Leu Val Gln Arg Pro Ile Lys Glu Ile Tyr Gln Asn Leu Thr 355 360 365 Ala Leu Ser Gln Ile Ser Leu Gln Gln Gln Ala Glu Ile Gln Asp Leu 370 375 380 Asp Arg Ala Tyr Ile Lys Phe Asp Ala Glu Asn Thr Ala Phe Asn Ile 385 390 395 400 Arg Phe Phe Ala Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Ser Leu Ser Tyr Asp 405 410 415 Gly Glu Leu Val Cys Leu Asp Arg Ser Gln Thr Glu Glu Thr Glu Trp 420 425 430 Met Lys Lys Phe Ala Ser Gln Arg Tyr Cys Glu Ile Lys Asn Leu Arg 435 440 445 Gln Val Glu Ile Phe Phe Asp Arg Ser Ile Ile Glu Ile Phe Leu Asn 450 455 460 Asp Gly Glu Lys Ala Leu Thr Ser Arg Phe Phe Ile Ala Asn Arg Gln 465 470 475 480 Asn Ser Val Lys Thr Asp Arg Thr Leu Arg Leu Asn Val Gly Tyr Pro 485 490 495 Lys Glu Ile Glu Tyr Lys 500 <210> 2 <211> 477 <212> PRT <213> CscA <400> 2 Met Thr Gln Ser Arg Leu His Ala Ala Gln Asn Ala Leu Ala Lys Leu 1 5 10 15 His Glu His Arg Gly Asn Thr Phe Tyr Pro His Phe His Leu Ala Pro 20 25 30 Pro Ala Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Ile Trp Phe Asn Asp 35 40 45 Arg Tyr His Ala Phe Tyr Gln His His Pro Met Ser Glu His Trp Gly 50 55 60 Pro Met His Trp Gly His Ala Thr Ser Asp Asp Met Ile His Trp Gln 65 70 75 80 His Glu Pro Ile Ala Leu Ala Pro Gly Asp Asp Asn Asp Lys Asp Gly 85 90 95 Cys Phe Ser Gly Ser Ala Val Asp Asp Asn Gly Val Leu Ser Leu Ile 100 105 110 Tyr Thr Gly His Val Trp Leu Asp Gly Ala Gly Asn Asp Asp Ala Ile 115 120 125 Arg Glu Val Gln Cys Leu Ala Thr Ser Arg Asp Gly Ile His Phe Glu 130 135 140 Lys Gln Gly Val Ile Leu Thr Pro Pro Glu Gly Ile Met His Phe Arg 145 150 155 160 Asp Pro Lys Val Trp Arg Glu Ala Asp Thr Trp Trp Met Val Val Gly 165 170 175 Ala Lys Asp Pro Gly Asn Thr Gly Gln Ile Leu Leu Tyr Arg Gly Ser 180 185 190 Ser Leu Arg Glu Trp Thr Phe Asp Arg Val Leu Ala His Ala Asp Ala 195 200 205 Gly Glu Ser Tyr Met Trp Glu Cys Pro Asp Phe Phe Ser Leu Gly Asp 210 215 220 Gln His Tyr Leu Met Phe Ser Pro Gln Gly Met Asn Ala Glu Gly Tyr 225 230 235 240 Ser Tyr Arg Asn Arg Phe Gln Ser Gly Val Ile Pro Gly Met Trp Ser 245 250 255 Pro Gly Arg Leu Phe Ala Gln Ser Gly His Phe Thr Glu Leu Asp Asn 260 265 270 Gly His Asp Phe Tyr Ala Pro Gln Ser Phe Leu Ala Lys Asp Gly Arg 275 280 285 Arg Ile Val Ile Gly Trp Met Asp Met Trp Glu Ser Pro Met Pro Ser 290 295 300 Lys Arg Glu Gly Trp Ala Gly Cys Met Thr Leu Ala Arg Glu Leu Ser 305 310 315 320 Glu Ser Asn Gly Lys Leu Leu Gln Arg Pro Val His Glu Ala Glu Ser 325 330 335 Leu Arg Gln Gln His Gln Ser Val Ser Pro Arg Thr Ile Ser Asn Lys 340 345 350 Tyr Val Leu Gln Glu Asn Ala Gln Ala Val Glu Ile Gln Leu Gln Trp 355 360 365 Ala Leu Lys Asn Ser Asp Ala Glu His Tyr Gly Leu Gln Leu Gly Thr 370 375 380 Gly Met Arg Leu Tyr Ile Asp Asn Gln Ser Glu Arg Leu Val Leu Trp 385 390 395 400 Arg Tyr Tyr Pro His Glu Asn Leu Asp Gly Tyr Arg Ser Ile Pro Leu 405 410 415 Pro Gln Arg Asp Thr Leu Ala Leu Arg Ile Phe Ile Asp Thr Ser Ser 420 425 430 Val Glu Val Phe Ile Asn Asp Gly Glu Ala Val Met Ser Ser Arg Ile 435 440 445 Tyr Pro Gln Pro Glu Glu Arg Glu Leu Ser Leu Tyr Ala Ser His Gly 450 455 460 Val Ala Val Leu Gln His Gly Ala Leu Trp Leu Leu Gly 465 470 475 <210> 3 <211> 480 <212> PRT <213> SacA <400> 3 Met Thr Ala His Asp Gln Glu Leu Arg Arg Arg Ala Tyr Glu Glu Val 1 5 10 15 Glu Lys Lys Glu Pro Ile Ala Asn Ser Asp Pro His Arg Gln His Phe 20 25 30 His Ile Met Pro Pro Val Gly Leu Leu Asn Asp Pro Asn Gly Val Ile 35 40 45 Tyr Trp Lys Gly Ser Tyr His Val Phe Phe Gln Trp Gln Pro Phe Gln 50 55 60 Thr Gly His Gly Ala Lys Phe Trp Gly His Tyr Thr Thr Gln Asp Val 65 70 75 80 Val Asn Trp Lys Arg Glu Glu Ile Ala Leu Ala Pro Ser Asp Trp Phe 85 90 95 Asp Lys Asn Gly Cys Tyr Ser Gly Ser Ala Val Thr Lys Asp Asp Arg 100 105 110 Leu Tyr Leu Phe Tyr Thr Gly Asn Val Arg Asp Gln Asp Gly Asn Arg 115 120 125 Glu Thr Tyr Gln Cys Leu Ala Val Ser Asp Asp Gly Leu Ser Phe Glu 130 135 140 Lys Lys Gly Val Val Ala Arg Leu Pro Glu Ala Ile Leu Thr Ala His 145 150 155 160 Phe Ser Arg Ser Glu Val Trp Glu His Glu Gly Thr Trp Tyr Met Val 165 170 175 Ile Gly Ala Gln Thr Glu Asn Leu Lys Gly Gln Ala Val Leu Phe Ala 180 185 190 Ser Asp Asn Leu Thr Glu Trp Arg Phe Leu Gly Pro Ile Thr Gly Ala 195 200 205 Gly Phe Asn Gly Leu Asp Asp Phe Gly Tyr Met Trp Glu Cys Pro Asp 210 215 220 Leu Phe Ser Leu Gln Gly Ser Asp Val Leu Ile Val Ser Pro Gln Gly 225 230 235 240 Leu Glu Ala Asp Gly Phe Arg Tyr Gln Asn Val Tyr Gln Ser Gly Tyr 245 250 255 Phe Val Gly Arg Leu Asp Tyr Asn Lys Pro Glu Leu Lys His Gly Glu 260 265 270 Phe Thr Glu Leu Asp Gln Gly Phe Asp Phe Tyr Ala Pro Gln Thr Leu 275 280 285 Glu Asp Asp Gln Gly Arg Arg Ile Leu Phe Ala Trp Met Ala Val Pro 290 295 300 Asp Gln Asp Glu Gly Ser His Pro Thr Ile Asp Cys His Trp Ile His 305 310 315 320 Cys Met Thr Leu Pro Arg Gln Leu Thr Leu Ser Gly Gln Lys Leu Ile 325 330 335 Gln Gln Pro Leu Pro Glu Leu Lys Ala Met Arg Arg Asn Glu Lys Lys 340 345 350 Ile His Ile Asn Met His Gly Ser Ser Gly Ala Leu Pro Val Glu Lys 355 360 365 Pro Glu Arg Thr Glu Ile Leu Leu Glu Asp Ile His Thr Glu Ser Gly 370 375 380 Phe Ser Ile Ser Ile Arg Gly Thr Ala Thr Phe Ser Phe His Lys Asp 385 390 395 400 Glu Gly Ile Val Thr Leu Glu Arg Lys Ser Phe Asp Gly Lys Arg Thr 405 410 415 Glu Ala Arg His Cys Arg Ile Lys Asp Leu His Thr Val His Met Phe 420 425 430 Leu Asp Ala Ser Ser Val Glu Ile Phe Ile Asn Asn Gly Glu Glu Val 435 440 445 Phe Ser Ala Arg Tyr Phe Pro Phe Pro Gly Asn His Glu Val Thr Ala 450 455 460 Ser Ala Thr Gly Lys Ser Glu Met Asn Val Gly Ile Trp Thr Leu Met 465 470 475 480 <210> 4 <211> 1509 <212> DNA <213> sacC <400> 4 gtgcggtcgt ttttaccgca cttttcttta ttttattttc accaaggtat aatgatgatt 60 atatttaata acggtaaata taaaagcatt ttggcggccg aacagggcga gcttgaacga 120 attaaaagcg aggtagaaaa agatcgggat tttcgcccct actaccatct cgcgccatct 180 acaggcttac taaacgatcc caacggtttg gtttttgacg gcgaaaaatt tcatctgttc 240 tatcaatggt tcccgtttga tgccattcac ggcatgaaac actggaagca tttcacgacc 300 gaggattttc atatctatac cgaagccgat ccgcttatcc cttgcgaact ttttgaaagt 360 cacggttgtt attccggcgg cgccttacca gtgggcgata aaatcgccgc attttatacc 420 ggtaacacaa gacgcgctgc ggataaccaa cgggttccct ttcaaaattt agcgattttt 480 gaccgcaccg gtaaacttct cagtaaacgc ccattaattg aaaatgcacc gaaaggctac 540 accgaacacg ttcgtgatcc gaaaccttac ttcacaaaag aaggaaaaat ccgttttatt 600 tgcggcgcac aacgtgaaga tttaaccggc accgccatta tttttgaaat ggataatctt 660 gatgatgagc cgcgcttatt aggcgaattg tctctccccg cttttgataa tcaaaaggtg 720 tttatgtggg aatgcccgga tttattgaaa gtcggcgata acgatatttt catctggtct 780 ccgcaaggca aacggcgcga agcccgccgg ttccaaaata attttcatgc ggtctatgcc 840 gtaggaaaat tggatgatcg gacatttaat gccgctcata ttgccgaact tgatcaaggt 900 ttcgatttct atgcgccgca aacttttgcc ggcctggaaa atcaaaagca tgccgttatg 960 ttcggttggt gcggtatgcc ggatttgacc tacccgacgg ataaatacaa atggcattca 1020 atgctgactc tcccgcggga aattacattg caaggcaata ggcttgttca gcgcccgata 1080 aaagaaattt atcaaaattt gaccgcactt tcgcaaattt ccctgcaaca gcaagcggaa 1140 attcaggatt tagatcgagc ctatattaaa tttgacgcgg aaaacacagc gtttaatatc 1200 cgcttttttg ccaacgaaca aggacaaacg ctctcgcttt cttatgacgg agaacttgtt 1260 tgtctggatc gttcgcaaac ggaagaaacg gaatggatga aaaaatttgc tagtcagcgt 1320 tattgtgaaa taaagaatct gcgacaagtg gaaattttct ttgaccgctc aattattgag 1380 attttcctga atgacggcga aaaagccctg acttcgagat tctttattgc gaaccgccaa 1440 aattccgtca aaaccgaccg cactttgcgg ttaaacgtcg gttatccgaa agaaattgaa 1500 tataaatag 1509 <210> 5 <211> 1434 <212> DNA <213> cscA <400> 5 atgacgcaat ctcgattgca tgcggcgcaa aacgccctag caaaacttca tgagcaccgg 60 ggtaacactt tctatcccca ttttcacctc gcgcctcctg ccgggtggat gaacgatcca 120 aacggcctga tctggtttaa cgatcgttat cacgcgtttt atcaacatca tccgatgagc 180 gaacactggg ggccaatgca ctggggacat gccaccagcg acgatatgat ccactggcag 240 catgagccta ttgcgctagc gccaggagac gataatgaca aagacgggtg tttttcaggt 300 agtgctgtcg atgacaatgg tgtcctctca cttatctaca ccggacacgt ctggctcgat 360 ggtgcaggta atgacgatgc aattcgcgaa gtacaatgtc tggctaccag tcgggatggt 420 attcatttcg agaaacaggg tgtgatcctc actccaccag aaggaatcat gcacttccgc 480 gatcctaaag tgtggcgtga agccgacaca tggtggatgg tagtcggggc gaaagatcca 540 ggcaacacgg ggcagatcct gctttatcgc ggcagttcgt tgcgtgaatg gaccttcgat 600 cgcgtactgg cccacgctga tgcgggtgaa agctatatgt gggaatgtcc ggactttttc 660 agccttggcg atcagcatta tctgatgttt tccccgcagg gaatgaatgc cgagggatac 720 agttaccgaa atcgctttca aagtggcgta atacccggaa tgtggtcgcc aggacgactt 780 tttgcacaat ccgggcattt tactgaactt gataacgggc atgactttta tgcaccacaa 840 agctttttag cgaaggatgg tcggcgtatt gttatcggct ggatggatat gtgggaatcg 900 ccaatgccct caaaacgtga aggatgggca ggctgcatga cgctggcgcg cgagctatca 960 gagagcaatg gcaaacttct acaacgcccg gtacacgaag ctgagtcgtt acgccagcag 1020 catcaatctg tctctccccg cacaatcagc aataaatatg ttttgcagga aaacgcgcaa 1080 gcagttgaga ttcagttgca gtgggcgctg aagaacagtg atgccgaaca ttacggatta 1140 cagctcggca ctggaatgcg gctgtatatt gataaccaat ctgagcgact tgttttgtgg 1200 cggtattacc cacacgagaa tttagacggc taccgtagta ttcccctccc gcagcgtgac 1260 acgctcgccc taaggatatt tatcgataca tcatccgtgg aagtatttat taacgacggg 1320 gaagcggtga tgagtagtcg aatctatccg cagccagaag aacgggaact gtcgctttat 1380 gcctcccacg gagtggctgt gctgcaacat ggagcactct ggctactggg ttaa 1434 <210> 6 <211> 1443 <212> DNA <213> sacA <400> 6 atgacagcac atgaccagga gcttcgtcgc cgggcttatg aagaagtgga gaaaaaagag 60 cccatcgcta acagcgatcc gcaccgccag cattttcata tcatgccgcc ggttgggctg 120 ctgaatgacc cgaatggcgt gatttattgg aagggcagct atcatgtatt ctttcagtgg 180 cagccgtttc agacggggca cggcgcaaaa ttttgggggc attatacgac acaggatgtt 240 gtgaattgga agcgggaaga gattgcgctg gctccgagtg attggtttga taaaaacggc 300 tgctactcgg gcagcgctgt cacgaaagac gatcggctct atctttttta cacaggaaat 360 gtcagggatc aggatggaaa tcgggaaacg tatcaatgcc ttgctgtttc tgacgacggg 420 ctgtcctttg agaaaaaggg tgtcgtcgcc cgccttccgg aagcgatatt aacggcgcac 480 ttttcgcgat ccgaagtatg ggagcatgaa ggcacatggt atatggtgat tggtgcgcaa 540 acagagaatt tgaaagggca ggctgtgttg tttgcttctg ataacctgac agagtggaga 600 tttcttggcc cgataaccgg cgcgggcttc aacgggctgg acgattttgg atacatgtgg 660 gaatgccctg atttgttttc ccttcaagga tcggatgtgc tgattgtttc gcctcaaggg 720 cttgaggctg acggtttccg ttatcagaac gtatatcaat caggttattt tgtcggccgc 780 ctcgattata acaagcctga actgaagcat ggtgaattta cggagcttga tcaaggtttt 840 gatttttacg cgccgcaaac acttgaagac gatcagggaa ggcggatttt atttgcatgg 900 atggcggtgc ctgatcagga tgaagggtcc catccgacca ttgactgcca ctggattcac 960 tgcatgacgc tgccgagaca gctgacgctt tcaggacaga agctgattca gcagccgctg 1020 cctgagctaa aagccatgcg cagaaatgag aaaaaaatac acatcaacat gcatggatca 1080 tctggtgcgc ttccagtgga aaaacctgaa agaactgaga ttctactgga agacattcat 1140 acggagtctg gcttttcaat cagtatccgc ggaacggcta cgttttcctt ccataaagac 1200 gaggggattg ttacgctgga acgaaagagc tttgacggaa aaagaacaga agcgagacat 1260 tgccgcatca aggatttgca taccgtacac atgtttctcg acgcgtcatc tgtggaaatc 1320 tttatcaata acggagaaga ggtctttagt gcaagatatt ttcctttccc gggaaatcat 1380 gaagtaacag ccagtgcgac cgggaaatct gaaatgaatg tcggaatttg gacacttatg 1440 tag 1443 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> primer <400> 7 actgagccat ggcgaaaatc aataaagtag atc 33 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> primer <400> 8 tgatccgagc tcctattatt ccagtgttcc cgcc 34 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> primer <400> 9 actccggaat tcatgacgca atctcgattg ca 32 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> primer <400> 10 acctgcgagc tcccgttgtt ccacctgata ttatg 35 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> primer <400> 11 gcatagaatt catgacagca catgaccagg agct 34 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> primer <400> 12 gcatagagct cctacataag tgtccaaatt ccgacattc 39 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 13 cccgttctgg ataatgtttt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 14 aaagtcacgg ttgttattcc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 15 catttaatgc cgctcatatt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 16 accgctcaat tattgagatt 20

Claims (14)

1. β-D-프룩토퓨라노시드 결합을 가수분해하여 프락토오스를 유리하는 활성에 의해 수크로오스 대사능 활성을 가지는 베타-프룩토퓨라노시다제.
2. 제1항에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 베타-프룩토퓨라노시다제.
3. 제1항의 베타-프룩토퓨라노시다제를 코딩하는 유전자.
4. 제3항에 있어서, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 군에서 선택된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
5. 제3항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
6. 제5항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 군에서 선택된 염기서열을 가지는 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
7. 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 제5항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물.
8. 제7항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 군에서 선택된 염기서열을 가지는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
9. 제7항에 있어서, 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
10. 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포의 염색체 DNA에 제3항의 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 수크로오스 대사능을 가지는 재조합 미생물.
11. 제10항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 군에서 선택된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
12. 제10항에 있어서, 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
13. 제7항의 재조합 미생물을 수크로오스를 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 대사산물, 생분해성 고분자 또는 재조합 단백질의 제조방법.
14. 제10항의 재조합 미생물을 수크로오스를 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 대사산물, 생분해성 고분자 또는 재조합 단백질의 제조방법.

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