KR20130129325A - 영양요구성 마커를 가지는 재조합용 산업 효모, 이를 이용하여 제조된 오탄당 및육탄당 발효가 가능한 재조합 효모, 및 이를 이용한 오탄당 및 육탄당으로부터 에탄올의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ura3 유전자의 활성이 불활성화되어 우라실에 대해 영양요구성 선별 마커를 가지는 유전자 재조합용 효모 및 이를 이용하여 유전자 재조합 균주를 제조하는 방법, 그리고 상기 균주에 오탄당 발효 관련 유전자가 도입되어 오탄당 및 육탄당 발효가 가능한 산업용 재조합 효모 및 이를 이용하여 오탄당 및 육탄당 포함 배지에서 에탄올을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

영양요구성 마커를 가지는 재조합용 산업 효모, 이를 이용하여 제조된 오탄당 및육탄당 발효가 가능한 재조합 효모, 및 이를 이용한 오탄당 및 육탄당으로부터 에탄올의 제조 방법 {A recombinant industrial yeast having auxotrophic marker, a recombinant yeast producing ethanol from pentose and hexose prepared by using the yeast, and a method for producing ethanol from pentose and hexose using the same}

본 발명은 유전자 재조합이 용이하도록 유전자 결손에 의한 영양요구성 마커를 가진 유전자 재조합용 산업 효모 균주 및 이를 이용한 유전자 재조합 균주의 제조 방법, 그리고 상기 균주를 이용하여 제조한 오탄당 및 육탄당 발효가 가능한 신규한 재조합 효모 균주 및 이를 이용한 에탄올 제조 방법에 관한 것이다.

최근 환경문제와 에너지자원 확보의 문제로 인해 대체 에너지인 바이오 에탄올에 관한 관심이 증폭되고 있다. 전세계적으로 바이오 에탄올의 생산량 또한 매년 증가하며 수송용 연료에서 대체 에너지로서의 위치를 확고히 하고 있다. 국내에서도 바이오 에탄올의 적용에 관한 실증사업이 진행되었고 RFS(의무혼합제도)의 시행에 관한 간담회와 정책들이 준비되고 있는 실정이다.

바이오 에탄올은 미생물 발효에 의해 생산되는 바이오 연료를 말하며 주로 효모가 많이 사용되고 있다. 그 이유는 가장 오랜 기간 에탄올 발효에 손쉽게 사용되어 왔고, 여러 저해에 대한 내성과 안정성이 뛰어나 산업적으로 용이하기 때문이다. 이와 같은 이유로 각 산업분야에 적합한 효모 균주의 선별과 개량 등이 많이 보고되었고, 최근에는 유전자 재조합 기술의 발달에 따라 효모를 이용한 재조합 단백질의 생산 및 바이오 케미컬 생산 등에 관한 많은 연구가 진행 중이다. 그럼에도 불구하고 지금까지 보고된 대부분의 재조합 효모들은 실험실 연구 수준에 불과하여 산업용 효모 수준의 안정성과 생산성을 나타내지 못하고, 한편으로 기존에 사용되고 있는 산업용 효모들은 핵수체가 이배체, 삼배체, 또는 그 이상의 다배체 효모인 것으로 알려져 있어 다른 특성을 부여하기 위한 유전자 재조합이 어려운 것으로 보고되고 있다.

재조합 효모를 이용한 바이오 에탄올 생산에서 고려해야 할 중요한 요소 중 하나는 적절한 선별 마커의 도입이다.

미생물의 유전자 재조합시 가장 통상적으로 사용되는 선별 마커는 항생제 내성 유전자이다. 항생제 내성 유전자를 가지는 숙주 세포는 해당 항생제 내성 유전자 생성물에 의해 분해될 수 있는 항생제가 보충된 배지 중에서 성장할 수 있으나, 항생제 내성 유전자를 가지지 않는 세포는 항생제에 의해 사멸되므로 미생물의 선별이 가능하다. 그러나, 미생물에서 항생제 내성 유전자의 존재는 환경, 조절 및 상업적 문제들을 야기하며 생물학적 안전성에 대해 잠재적인 위험이 되는 것으로 확인되었다. 또한 효모의 경우에는 널리 사용되는 항생제 마커가 제한되어 있고, 그 선택 감도가 각 균주에 따라 차이가 많이 나므로 항생제 마커의 사용에 제한이 많다.

이에, 영양요구성 선별 마커가 항생제 선별에 대한 대안으로서 개발되었다. 특히 효모는 널리 사용되는 항생제 마커가 제한되어 있고, 그 선택 감도가 각 균주에 따라 차이가 많이 나므로, 주로 대학 실험실 및 연구소에서는 단수체 효모의 단백질 생합성 유전자 결손을 이용하여 영양요구성 마커를 유전자 재조합에 사용한다. 그러나 산업용 효모의 재조합의 경우 다배체의 특성으로 유전자 조작이 어려워 우수한 산업용 균주 개발에 제한이 있으며, 여전히 항생제 내성에 대한 선별 마커를 사용하므로 항생제 내성이 우수한 wild type 효모에 대하여 선별이 어려운 문제가 있다. 따라서 산업용 효모에도 재조합 선별 마커의 삽입과 같은 일차적인 재조합 효모 기반 기술의 필요성이 부각되고 있다.

재조합 효모를 이용한 바이오 에탄올 생산에서 고려해야 할 또 다른 중요한 요소 중 하나는 발효 기질의 이용가능성을 확대하는 것이다.

재조합 효모를 이용한 바이오 에탄올 생산에 관한 연구는 최근 섬유질계 바이오매스를 이용한 2세대 바이오 에탄올 생산과 관련하여 에탄올 발효 수율을 향상시킬 수 있는 오탄당 발효에 그 초점이 맞추어져 있다. 전처리된 섬유질계 바이오매스는 대부분 글루코스(glucose)로 전환되지만 자일로스(xylose) 또한 10% 이상 차지하므로, 자일로스를 이용할 경우 총 에탄올 생산량 및 발효 수율을 향상시킬수 있다.

그러나 에탄올 발효에 많이 사용되는 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주는 글루코스와 같은 육탄당 대사 효율이 우수한 반면 자일로스와 같은 오탄당의 발효는 불가능하다. 이에, 자일로스의 에탄올 전환을 위해 오탄당 발효가 가능한 효모인 피치아 속(Pichia spp.) 또는 캔디다 속(Candida spp.) 균주를 이용한 발효가 시도되고 있으나, 사카로마이세스 세레비지애와 같은 고수율, 고생산성의 균주를 찾기가 어렵다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애에 자일로스 대사 관련 유전자를 삽입하여 자일로스 발효가 가능하도록 하는 방법들은 발효 수율 및 생산성이 산업용 효모에 미치지 못하여 산업적 이용이 불가능한 실정이다.

따라서 당 에탄올 발효 산업에서는 유전자 재조합이 용이하도록 선별 마커가 도입된 산업용 효모의 개발과 에탄올 발효의 수율 향상을 위해 오탄당 및 육탄당 발효가 가능한 산업용 재조합 효모의 개발이 절실하게 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 이전의 연구에서 제공했던 사카로마이세스 세레비지애 CHY1011 균주 (국내특허등록 10-0955945)에 상동교차(homologous recombination)를 이용한 유전자 결손 방법을 통해 우라실 생합성에 관여하는 ura3 유전자를 불활성화시켜 우라실에 대한 영양요구성 선별 마커를 가진 유전자 재조합용 효모 CHY1001 를 제조하였으며, 나아가 상기 CHY1001 균주에 자일로스 대사에 관련된 자일로스 이소머라제 (Xylose isomerase, XI) 및 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase, XK)를 코딩하는 유전자를 코돈 최적화하여 도입함으로써 오탄당의 에탄올 발효능이 추가된 산업용 에탄올 발효 효모 CHY1002x를 제조하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 산업적으로 다양한 유전자 재조합이 가능하도록 영양요구성 선별 마커를 가진 산업용 효모 균주를 제공하고, 나아가 이를 이용하여 자일로스의 에탄올 발효가 가능한 고수율의 재조합 효모를 제공하는데 있다. 또한, 자일로스가 함유된 발효 배지에서 자일로스의 에탄올 발효를 통해 고수율로 에탄올을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 ura3 유전자가 불활성화되어 우라실에 대한 영양요구성 선별 마커를 가지는, 유전자 재조합용 산업 효모인 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주 (수탁번호 KCTC 12179BP)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 균주에 ura3 유전자 및 외래 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 유전자 재조합 균주의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주 (수탁번호 KCTC 12179BP)에 ura3 유전자, 자일로스 이소머라제(xylose isomerase)를 코딩하는 유전자 및 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase)를 코딩하는 유전자가 도입된, 오탄당 및 육탄당 발효가 가능한 사카로마이세스 세레비지애 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 사카로마이세스 세레비지애 CHY1002x 균주의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 사카로마이세스 세레비지애 CHY1002x 균주를 포함하는 에탄올 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 균주를 오탄당, 또는 오탄당 및 육탄당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 에탄올의 제조 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 ura3 유전자가 불활성화되어 우라실에 대한 영양요구성 선별 마커를 가지는, 유전자 재조합용 산업 효모인 사카로마이세스 세레비지애 KCTC 12179BP 균주에 관한 것이다.

본 발명에서 "영양요구성(auxotrophy)"이란, 성장 및 대사에 요구되는 특정 물질을 제조하는 능력이 제거되거나 감소되도록 변형된 세포를 지칭한다. 이와 대비하여, "원영양성(prototrophy)"이란, 성장 및 대사에 필요한 특정 물질을 제조할 수 있는 세포를 지칭한다.

본 발명에서 "ura3 유전자"란, 피리미딘 생합성계의 5-포스페이트 디카르복실레이즈 (5-phosphate decarboxylase)를 코딩하는 구조 유전자로서, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 가진다.

본 발명에서 "불활성" 이란, 유전자의 일부 또는 전체에 결실, 삽입, 치환, 역위 또는 중복 등의 변이가 일어나 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 활성이 없어지거나 감소된 상태를 의미한다. 본 발명의 목적상, ura3 유전자의 불활성화는 ura3 유전자의 일부 또는 전체에 변이가 일어나 우라실에 대한 영양요구성을 획득한 상태를 의미한다.

효모 균주를 이용한 벡터 시스템에서는 박테리아의 유전자 재조합에서 통상적으로 사용되는 항생제 내성 유전자를 이용한 선별 마커보다는 필수 아미노산의 생합성에 관련한 유전자를 이용한 영양요구성 마커가 바람직하다. 본 발명에서는 ura3 유전자를 타켓으로 산업용 효모에 선별 마커를 도입하고자 하였다.

ura3 유전자에 변이가 일어나면 우라실에 대한 영양요구성을 나타냄과 동시에 5-플루오로-오로틱산 (5-fluoro-orotic acid, 5-FOA) 내성 변이주로서의 성질을 나타내게 된다. 이에 따라, ura3 유전자 변이를 가진 균주는 우라실이 제거된 배지에서는 생장할 수 없으나, 우라실이 존재하는 배지에서는 5-FOA 가 첨가되더라도 생장이 가능하다. 반대로, ura3 가 활성을 가지는 균주는 우라실이 제거된 배지에서 생장이 가능하나, 우라실이 존재하는 배지에 5-FOA 가 첨가되는 경우에는 ura3 활성에 의하여 5-FOA 가 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 과 같은 독성 물질로 전환되기 때문에 균주의 생장이 불가능하다.

따라서, 본 발명에서 ura3 유전자가 불활성화된 균주는 5-FOA 및 우라실을 이용한 선별이 용이해지므로 유전자 재조합을 위한 숙주 균주로 적합한 특징이 있다.

바람직하게, 본 발명의 ura3 영양요구성 균주는, 고생산성 에탄올 발효 산업용 효모인 사카로마이세스 세레비지애 CHY1011 균주 (국내특허등록 10-0955945)에 ura3 유전자 결손 카셋트를 도입함으로써, 상동교차를 이용한 유전자 결손 방법을 통해 ura3 유전자를 불활성화시켜 제조된 것이다.

숙주 균주인 사카로마이세스 세레비지애 CHY1011 균주는 국내특허등록 10-0955945 에 의하여 본 발명자들이 제공한 균주로, 수탁번호 KCTC 11250BP 로 나타내어지며, 에탄올 생산 공장의 토양으로부터 분리되고 고온의 조건에서도 에탄올 생산성이 우수한 균주이다. 상기 CHY1011 균주는 타원형이고, 통성 혐기성이며,생육 온도가 10 내지 45℃ 이고, 생육 pH 가 pH 2.5 내지 7이며, 발효 최적 온도가 30 내지 40℃로 상기 온도 범위에서 발효비율이 80% 내지 95%이다. CHY1011 균주에 관한 국내특허등록 10-0955945 는 전체가 본 발명에 참고로 포함된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, ura3 유전자를 포함하는 셔틀 벡터인 pYX12 (전북대학교)의 ura3 유전자 부위에 1.3kbp의 유전자 단편을 삽입하여 pYE-UKO 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머와 Pfu 폴리머레이즈를 사용하여 PCR 증폭하고 PCR 산물을 정제 및 회수한 후, 양 말단 부위에 ura3 유전자와 상동교차(homologous recombination)가 가능하도록 약 100bp 이상의 상동 염기서열을 추가하여 ura3 유전자 결손 카셋트(서열번호 2)를 제조하였다. 이어서, 상기 ura3 유전자 결손 카셋트를 CHY1011 균주에 형질전환하고, 상동교차에 의한 유전자 결손을 유도하여, ura3 유전자가 불활성화된 변이 균주를 수득하였다.

본 발명자들은 상기 균주에 ura3 유전자 결손 카셋트가 성공적으로 형질전환 및 상동교차되어 ura3 유전자 결손이 유도되었음을 PCR 을 통해 확인하고 (도 2), 상기 변이 균주가 우라실에 대한 영양요구성 및 5-FOA 내성을 나타냄을 확인하였으며 (도 3), 나아가 상기 변이 균주에 ura3 유전자가 포함된 벡터를 삽입할 경우 ura3 유전자 보상에 의하여 최소배지에서 정상적인 성장이 가능함을 확인하였다 (도 4).

이에, 본 발명자들은 상기 ura3 유전자가 불활성화된 변이 균주를 CHY1001 로 명명하고, 이를 대전광역시 유성구 과학로 125번지에 위치한 한국생명공학연구원에 2012년 4월 4일자로 기탁하여, 수탁번호 KCTC 12179BP 를 부여받았다.

상기와 같이 우라실 영양요구성 선별 마커를 가진 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주는 유전자 재조합을 통한 재조합 단백질의 생산 및 특정 대사 조작이 산업적으로 유용하므로, 예컨대 유전자 재조합을 위한 발현 숙주로 활용될 수 있다.

따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 CHY1001 균주에 ura3 유전자 및 외래 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 유전자 재조합 균주의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 상기와 같이 우라실 영양요구성 선별 마커를 가진 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주를 이용하여 다양한 유전자 재조합 균주를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 "외래 유전자" 또는 "목적 유전자"란, 숙주 균주가 속한 종이 아닌 외래종 또는 숙주 균주가 아닌 다른 균주로부터 기원되는 유전자, 또는 본래의 형태로부터 실질적으로 변형된 형태의 유전자를 의미하며, 외래 유전자는 전사될 특정 목적 핵산으로 폴리펩타이드를 코딩한다. 외래 유전자는 당업자가 원하는 모든 유전자가 가능하나, 본 발명의 목적상, 바람직하게 상기 외래 유전자는 CHY1001 균주의 에탄올의 생산능을 보다 향상시킬 수 있도록 에탄올 발효 및 생산과 관련된 유용한 유전자들일 수 있으며, 그 예로는 에탄올 발효 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 들 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 자일로스 이소머라제(xylose isomerase) 및 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase)를 코딩하는 유전자를 도입하였으나, 이 외에도 다양한 외래 유전자들을 도입할 수 있다.

본 발명에서 ura3 유전자의 도입은 CHY1001 균주에서 ura3 유전자 보상에 의하여 상기 균주의 원영양성을 복구하기 위한 것이다. 바람직하게, ura3 유전자 및 외래 유전자의 도입 전에는 ura3 유전자가 결손된 상기 CHY1001 균주를 우라실 첨가 배지와 같이 영양요구성을 보완해주는 배지에 배양하여 유지하다가, ura3 유전자 및 외래 유전자의 도입 후에는 상기 균주을 우라실가 제거된 배지에 배양할 수 있다. 이 때 ura3 유전자 및 외래 유전자가 성공적으로 도입되지 않은 숙주 균주들은 여전히 ura3 유전자가 결손된 상태에 있게 되어 우라실이 제거된 배지에서 생장할 수 없기 때문에, 이러한 방식으로 유전자 재조합 균주를 용이하게 선별해낼 수 있다.

상기 ura3 유전자 및 외래 유전자는 벡터에 삽입된 채로 CHY1001 균주에 도입될 수 있으며, 상기 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. 재조합 벡터는 숙주 세포 내에서 ura3 유전자 및 외래 유전자가 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하며, 예를 들어 프로모터, 개시코돈, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자, 종결코돈 및 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA, 인핸서 서열, 목적하는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 비해독영역, 선별 마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수 있다.

ura3 유전자 및 외래 유전자의 도입 방법으로는 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 리튬아세테이트법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리 방법, 유전자총(gene gun) 등 당 업계에서 널리 사용되는 방법들을 적용할 수 있다.

바람직한 양태로, 본 발명은 상기와 같이 우라실 영양요구성 선별 마커를 가진 CHY1001 균주에 ura3 유전자와 함께 자일로스 대사에 관련된 자일로스 이소머라제 및 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 유전자를 도입함으로써 오탄당의 에탄올 발효능이 추가된 산업용 에탄올 발효 효모 CHY1002x를 제공한다.

따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주에 ura3 유전자, 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자 및 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 유전자가 도입된, 오탄당 및 육탄당 발효가 가능한 사카로마이세스 세레비지애 균주에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 균주는 수탁번호 KCTC 12180BP 의 사카로마이세스 세레비지애 CHY1002x 균주이다.

또한, 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주에 ura3 유전자, 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자 및 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 형질전환하는 단계를 포함하는, 오탄당 및 육탄당 발효가 가능한 사카로마이세스 세레비지애 균주를 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 균주는 수탁번호 KCTC 12180BP 의 사카로마이세스 세레비지애 CHY1002x 균주이다.

본 발명에서 "에탄올 발효"란, 당분이 효모에 의하여 이산화탄소와 에탄올로 분해하여 이루어지는 발효를 의미한다. 에탄올 발효에 많이 사용되는 효모인 사카로마이세스 세레비지애 균주는 글루코스와 같은 육탄당 대사 효율이 우수한 반면 자일로스와 같은 오탄당의 발효는 불가능하다. 이에, 본 발명에서는 육탄당 뿐만 아니라 자일로스와 같은 오탄당을 기질로 하여 고수율로 에탄올 발효가 가능한 산업용 재조합 효모를 제공하기 위하여, CHY1001 균주에 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자 및 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 유전자를 도입하였다.

본 발명에서 "자일로스"란, 식물 세포벽을 구성하며 바이오매스의 10~40%를 구성하고 있는 비셀룰로스계 다당류인 헤미셀룰로스의 주요 구성성분으로 목재나 농업 부산물로부터 얻어지는 바이오매스로 글루코스 다음으로 풍부하게 존재하는 당질이다. 원핵생물과 진핵생물의 D-자일로스 대사경로는 초기단계에서 서로 다른 대사경로를 거쳐 D-자일룰로스가 된 다음 D-자일룰로스-5-포스페이트로 전환된다.

본 발명에서 "자일로스 이소머라제"란, 자일로스와 자일룰로스 사이의 이성질화 반응을 촉매하는 효소이다. 박테리아 유래의 자일로스 이소머라제는 자일리톨(xylitol)을 중간대사산물로 축적하지 않고 바로 자일로스를 자일룰로스(xylulose)로 전환할 수 있어 효율적인 대사 과정으로 알려져 있으나, 효모에서 발현시에는 코돈의 상이함으로 인하여 발현 및 단백질 활성에 제한이 많다. 따라서, 본 발명에서는 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자는 코돈 최적화(codon optimization)에 의해 S. cerevisiae에서 자주 사용되는 코돈으로 변경하여 사용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 사용할 수 있다.

본 발명에서 "자일룰로스 키나아제"란, D-자일룰로스와 D-자일룰로스-5-포스페이트 간의 전환 반응을 촉매하는 효소로, 이에 의하여 D-자일룰로스가 인산화된 다음 오탄당 인산경로와 EMP 경로를 거쳐 에탄올 생산이 이루어진다. 본 발명에서는 CHY1001 균주에 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 유전자를 도입하기 위하여, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애에서 유래한 서열번호 4의 염기서열을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, ura3 유전자를 포함하는 셔틀 벡터인 pYX12 (전북대학교) 벡터에 코돈 최적화된 자일로스 이소머라제 유전자(서열번호 3) 및 S. cerevisiae 유래의 자일룰로스 키나아제 유전자(서열번호 4)를 각각 접합하여, ura3 유전자, 자일로스 이소머라제 유전자 및 자일룰로스 키나아제 유전자를 모두 포함하는 재조합 벡터 pYXIXKopt 를 제조하고 (도 5), 이를 앞에서 얻어진 ura3 결손 효모 CHY1001 에 도입하였다.

본 발명자들은 상기 pYXIXKopt 가 도입된 재조합 효모가 육탄당인 글루코스 뿐만 아니라 오탄당인 자일로스를 소모하면서 에탄올을 생산하는 것을 확인하였고, 특히 모균주인 CHY1011 에 비해 13.1 g/L의 에탄올을 추가로 생산하였음을 확인하였다 (도 6).

이에, 본 발명자들은 상기 오탄당 발효능을 획득한 균주를 CHY1002x 로 명명하고, 이를 대전광역시 유성구 과학로 125번지에 위치한 한국생명공학연구원에 2012년 4월 4일자로 기탁하여, 수탁번호 KCTC 12180BP 를 부여받았다. 상기 균주는 산업적으로 육탄당 뿐 아니라 오탄당인 자일로스의 대사가 가능하고, 에탄올 생산량을 증대시킴으로 인해 에탄올의 산업적 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주에 ura3 유전자, 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자 및 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 유전자가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 균주를 오탄당, 또는 오탄당 및 육탄당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 에탄올의 제조 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 사카로마이세스 세레비지애 균주를 포함하는 에탄올 생산용 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 균주는 수탁번호 KCTC 12180BP 의 사카로마이세스 세레비지애 CHY1002x 균주이다.

본 발명은 상기 재조합 효모 CHY1002x를 이용하여 자일로스가 함유된 에탄올 발효 배지에서 육탄당인 글루코스 뿐 아니라, 오탄당인 자일로스의 에탄올 발효가 추가적으로 가능한 것을 특징으로 하는 고수율의 에탄올 제조방법을 제공한다.

상기 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(cintinuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되며, 바람직하게는 반연속식 또는 연속식 제조 공정에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예로, 상기 반연속식 또는 연속식 공정은 섬유질계 바이오매스의 전처리 공정, 당화공정, 발효공정 및 정제공정을 포함하는 에탄올 제조 방법일 수 있다.

상기 섬유질계 바이오매스의 전처리 공정에서는 수산화나트륨, 암모니아, 묽은 염산, 황산 등의 전처리액을 이용하여 적정 온도와 시간을 조절하여 실시할 수 있으며, 상기 당화공정은 전처리된 바이오매스를 당화탱크에서 온도와 시간을 조절하여 효소적 가수분해에 의해 진행될 수 있다.

상기 발효공정은 상기 사카로마이세스 세레비시애를 이용하여 에탄올 발효를 수행하는 것일 수 있다. 상기 발효공정에서는 당화된 섬유질이 발효되며, 당화되지 못한 섬유질의 경우, 당화가 지속된다. 상기 효모의 성질을 이용하여 상기 당화단계와 발효단계는 동시에 수행할 수 있다. 또한, 상기 발효 공정의 경우 실질적으로 발효뿐 아니라 당화도 진행되기 때문에 당화공정이 생략 가능하다.

또한, 상기 제조방법의 구체적인 예로는 에탄올 발효조 내에 전분, 설탕, 섬유질 및 포도당으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상을 포함하는 기질을 반연속 또는 연속적으로 공급하고, 상기 기질 및 사카로마이세스 세레비지애 CHY1002x 를 이용하여 에탄올 발효를 수행하여 에탄올을 생산하고, 상기 에탄올을 포함하는 발효액을 반연속 또는 연속적으로 배출하는 단계를 포함하는 반연속 또는 연속식 공정으로 수행하고 사카로마이세스 세레비지애 CHY1002x 를 이용하는 것일 수 있다.

에탄올을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법으로 세포 또는 배양 배지로부터 에탄올을 분리해낼 수 있다. 에탄올 회수 방법의 예로서, 증류, 여과, 크로마토그래피 및 HPLC 등의 방법이 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 ura3 유전자를 유전자 재조합의 선별 마커로 사용할 수 있는 산업용 효모 숙주를 제공하여, 재조합 단백질의 생산 및 특정 대사 조작이 산업적으로 유용하다. 또한 이 숙주를 이용하여 자일로스의 에탄올 발효 관련 유전자를 삽입한 재조합 효모를 제공하여 산업적으로 육탄당 뿐 아니라 오탄당인 자일로스의 대사가 가능하고, 에탄올 생산량을 증대시킴으로 인해 에탄올의 산업적 생산에 유용하다.

도 1 의 (A)는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 ura3 유전자에 대한 PCR 산물을 확인한 결과를 나타낸다. 도 1 의 (B) 는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 ura3 결손 카셋트에 대한 PCR 산물을 확인한 결과를 나타낸다. lane 1 은 S. cerevisiae CHY1011의 cDNA를 주형으로 하는 PCR 산물, lane 2 는 대조군으로서 ura3 유전자를 가진 pYX12 벡터를 주형으로 하는 PCR 산물, lane 3 은 ura3 결손 카셋트에 대한 PCR 산물을 나타내고, lane M 은 1kb ladder marker 를 나타낸다.
도 2 의 (A)는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 ura3 유전자의 상동교차를 PCR 산물을 통해 확인한 결과를 나타낸다. 도 2 의 (B)는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 ura3 유전자의 상동교차를 PCR 산물을 통해 확인한 결과를 나타낸다. lane M 은 1kb ladder marker, lane 1 은 유전자 결손 균주 CHY1011/ura-의 cDNA를 주형으로 하는 PCR 산물을, lane 2 및 3 은 대조군 균주 CHY1011의 cDNA를 주형으로 하는 PCR 산물을 나타낸다.
도 3은 최종 선별된 결손 효모(CHY1011/ura-) 의 우라실에 대한 영양요구성 을 확인한 결과를 나타낸다. (A) 는 최소배지MM+5-FOA(우라실 첨가) 배지 및 (B)는 MM(우라실 미첨가) 배지에서의 결과를 나타낸다.
도 4 는 최종 선별된 결손 효모(CHY1011/ura-) 의 ura3 유전자 보상에 의한 플라스미드의 형질전환 적용을 확인한 결과를 나타낸다. (A) 는 형질전환에 대한 대조군으로 CHY1011/ura- 균주를 최소배지(MM)에 도말한 결과를, (B) 는 CHY1011/ura- 균주에 ura3 유전자를 선별 마커로 사용하는 플라스미드를 형질전환하여 MM배지에 도말한 결과를 나타낸다.
도 5 는 자일로스 대사 관련 유전자 재조합 벡터 pYXIXKopt 의 제작과정 모식도를 나타낸다.
도 6 은 본 발명의 재조합 효모 CHY1002x를 대조 균주 CHY1011과 비교하여 글루코스 및 자일로스의 대사와 그에 따른 에탄올 생산을 확인한 그래프를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. ura 3 유전자 결손 카셋트 제작

본 발명에 사용된 산업용 고생산성 에탄올 발효 효모 CHY1011 (수탁번호 KCTC 11250BP)은 게놈 시퀀싱이 되어 있지 않아 ura3 유전자에 대한 정보는 없으나 선행연구 결과 사카로마이세스 세레비지애로 동정되었으므로 (국내특허등록 10-0955945), NCBI database 상의 사카로마이세스 세레비지애 염기서열을 이용하여 ura3 유전자 염기서열을 참고하였다. 효모 CHY1011에 ura3 유전자가 동일하게 존재하는지 확인하기 위해 ura 3 유전자 클로닝 프라이머(서열번호 5 및 6)를 제작하여 PCR을 통해 해당 유전자가 당 산업용 효모에도 존재함을 확인하였다 (도 1A).

서열번호 5 : 5'- GAATTCTTGTGAGTTTAGTATACA -3'

서열번호 6 : 5'- GAATTCCGGTAATCTCCGAACAGA -3'

이후 ura3 유전자 결손 카셋트를 포함한 벡터 pYE-UKO를 제작하기 위해 pYX12 (전북대학교)의 ura3 유전자를 사용하여 ura3 유전자 내부의 Apa I site를 이용하여 ura3 유전자를 불활성화하기 위한 약 1.3kb 정도의 유전자 단편을 삽입하였다. 유전자 단편은 클로닝할 때 양말단에 Apa I 제한효소 site를 추가하여 PCR을 통해 그 단편을 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편들은 정제 및 회수한 후, Apa I 제한효소로 처리한 후, 동일 효소로 처리된 pYX12 벡터와 접합함으로써 pYE-UKO 벡터를 제작하였다. ura3 유전자 결손 카셋트는 pYE-UKO 벡터를 주형으로 하여 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머와 Pfu 폴리머레이즈를 사용하여 PCR을 수행한 후, 정제 및 회수하여 완성하였다 (도 1B). 또한 상기 ura3 유전자 결손 카셋트는 양 말단 부위에 ura3 유전자와 상동교차가 일어나도록 약 100bp의 상동염기서열을 갖도록 제작하였고, 상기 카셋트의 염기 서열을 서열번호 2에 나타내었다.

서열번호 7 : 5'- CAGTACCCTTAGTATATT -3'

서열번호 8 : 5'- TCTGTCTTCGAAGAGTA -3'

실시예 2. ura3 유전자 결손 재조합 효모의 제작

CHY1011 균주(국내특허등록 10-0955945)는 우수한 에탄올 발효 산업용 효모이나 재조합에 사용가능한 선별 마커가 없어 유전자 재조합이 불가하였다. 이에, CHY1011의 산업적으로 다양한 활용을 위하여 유전자 재조합에 사용될 수 있는 우라실에 대한 영양요구성 마커를 도입하고자 실시예 1의 유전자 결손 카셋트를 이용하여 Ura3 유전자 결손 재조합 효모 균주를 제작하였다.

먼저, 실시예 1 에서 제조한 ura3 유전자 결손 카셋트를 이용하여 화학적 형질전환 방법인 LiAc (lithium acetate) 형질전환 방법으로 형질전환 및 상동교차에 의한 유전자 결손이 유도되도록 하였다. 형질전환이 유도된 효모 혼합물들은 32℃ 에서 1시간 가량 배양 후 선별배지인 YPD-5-FOA 한천배지(yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%, 5-FOA 0.1%, agar 2%)에 도말하였다. 선별배지에서 2~3일간 배양한 후 확인된 콜로니들은 멸균팁을 이용하여 다른 YPD-5-FOA 배지에 5회 이상 계대배양하여 재조합 균주의 유전자 결손이 안정적으로 유지되도록 하였다. 최종적으로 얻어진 결손 균주는 실시예 1에 기재한 서열번호 5 및 6, 그리고 서열번호 7 및 8을 이용하여 각각 PCR을 통해 증폭하고, 증폭된 각 단편들을 다음 그림과 같이 CHY1011의 것과 비교하여 ura3 유전자 내부에 삽입된 DNA 단편(약1.3kb)의 길이만큼 증가된 것을 최종 확인하였다 (도 2A 및 2B).

실시예 3. ura3 유전자 결손 효모의 영양요구성 확인

실시예 2에서 얻어진 ura3 결손 균주가 유전자 재조합에 사용될 수 있기 위해서는 ura3 유전자의 불활성화로 인해 필수 아미노산인 우라실에 대한 영양요구성을 가져야 하므로, 배지 내의 우라실에 대한 영양요구도를 확인하였다. 이를 위하여, 선별된 ura3 결손 균주를 최소배지(casamino acid without amino acid (w/o a.a.) 0.067%, glucose 2%, agar 2%)에 우라실 (0.005%) 및 5-FOA(0.1%) 를 첨가한 배지와 우라실이 첨가되지 않은 최소배지에 각각 대조 균주들과 함께 도말(streaking)한 후 생육 여부를 확인하였다. 대조군으로 사용한 모균주 CHY1011은 FOA 첨가 배지에서는 ura3 유전자의 활성으로 생육이 불가하였고, 우라실이 제거된 최소배지에서는 ura3 유전자의 활성으로 인해 글루코스로부터 필수아미노산을 자체 대사하여 생육이 가능하였다. 반면 실험실용 균주로 널리 사용되는 S2805(ura-) 균주(기보유중인 ura3 유전자 결손 효모, 산업용 효모가 아닌 실험실용 균주)와 선별 결손 균주(CHY1011/ura-)는 우라실이 첨가된 최소배지에서는 FOA의 첨가에도 ura3 유전자의 불활성화로 생육이 가능하였으나, 우라실이 제거된 최소배지에서는 생육이 불가하였다. 따라서 선별균주 CHY1011/ura3- 의 우라실 영양요구성을 확인할 수 있었다 (도 3A 및 3B).

또한, ura3 유전자가 포함된 벡터를 삽입할 경우, ura3 유전자가 보상되어 최소배지에서 정상적인 생장이 가능해야 최종적인 재조합 선별 마커로서 사용이 가능하므로, 다음과 같이 벡터 형질전환에 의한 ura3 유전자 보상에 관한 실험을 실시하였다. CHY1011/ura-는 ura3 유전자가 포함된 pYES2 벡터를 이용하여 LiAc 형질전환법에 의한 형질전환을 시도하여 선별 배지인 우라실이 결핍된 최소배지에 도말하였다. 대조군으로는 CHY1011/ura- 를 벡터 없이 동일한 형질전환 방법으로 수행하여 동일 최소배지에 도말하였다. 그 결과, 대조군 CHY1011/ura-는 최소배지에서 생육이 불가한 반면 pYES2 벡터가 형질전환된 CHY1011/pYES2 균주들은 그림과 같이 선별되었음을 확인하였다 (도 4A 및 4B).

이로부터 최종 선별 후보 CHY1011/ura- 는 산업용 효모로서 유전자 재조합이 가능함을 확인하여 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001이라 명명하고 한국생명공학연구원에 균주를 특허기탁하였다 (수탁번호 KCTC 12179BP).

실시예 4. 자일로스 대사 관련 유전자 재조합 벡터 및 재조합 효모 제작

사카로마이세스 세레비지애로부터 자일로스를 이용하여 에탄올 생산을 유도하기 위해서 박테리아 유래의 자일로스 이소머라제(XI)를 이용하였다. 박테리아 유래의 자일로스 이소머라제는 XYL A, XYL B 에 의한 대사과정에 비해 redox balance에 덜 영향을 미칠 뿐 아니라 자일리톨(xylitol)을 중간대사산물로 축적하지 않고 바로 자일로스를 자일룰로스(xylulose)로 전환할 수 있어 효율적인 대사 과정으로 알려져 있다. 그러나 이 대사과정은 박테리아 유래의 유전자를 사용함으로 인해서 효모에서의 발현과 단백질 활성에 제한이 많은 것으로 보고되고 있다. 그러므로 박테리아 유래의 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자는 코돈 최적화(codon optimization)에 의해 S. cerevisiae에서 자주 사용되는 코돈으로 변경하여 본 발명에 사용하였다. XI의 코돈 최적화는 ㈜Genotech의 코돈 최적화 시스템을 사용하여 염기서열을 디자인하였다.

자일로스 대사 관련 유전자 재조합 벡터 pYXIXKopt는 효모-대장균 셔틀벡터인 pYX12 벡터에 코돈 최적화된 XI 유전자(서열번호 3)와 S. cerevisiae 유래의 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase, XK-sc) (서열번호 4) 유전자가 접합된 벡터이다. 바이오니아로부터 유전자합성서비스를 이용하여 코돈 최적화가 이루어진 XI-opt 유전자와 XK-sc 유전자를 합성하였고, 합성된 pGEM-XI-opt, pGEM-XK-sc로부터 BamH I, Xho I 제한효소로 처리한 후 BamH I 제한효소로 처리한 셔틀벡터와 함께 라이게이즈로 접합하여 재조합 벡터 pYXIXKopt를 완성하였다 (도 5).

완성된 재조합 벡터 pYXIXKopt는 앞에서 얻어진 ura3 결손 효모 CHY1001에 LiAc 형질전환 방법을 이용하여 도입하였고, 앞에서 테스트한 우라실 결핍 최소배지에 도말하여 32?에서 2~3일 배양한 후 단일 콜로니를 형성하는 형질전환체를 선별하였다. 선별된 형질전환체들은 글루코스 대신 자일로스를 2% 첨가한 MMX 한천배지(casamino acid w/o a.a. 0.067%, xylose 2%, agar 2%)에서 5회 이상 계대 배양한 후, 생육이 우수한 재조합 효모를 최종 선별하였다. 최종 선별된 재조합 효모는 모균주 CHY1001과 달리 자일로스를 함유한 배지에서 자일로스를 소모하여 에탄올로 전환하는 발효 경향을 확인하였으므로 이 재조합 효모를 S. cerevisiae CHY1002x 라고 명칭하고 한국생명공학연구원에 특허균주 기탁을 하였다 (수탁번호 KCTC 12180BP).

실시예 5. 오탄당 발효 재조합 효모를 이용한 에탄올 발효

실시예 4 에서 얻어진 오탄당 자일로스 발효 재조합 효모를 이용하여 다음과 같이 자일로스가 함유된 배지를 이용하여 에탄올 발효를 확인하였다. 재조합 효모 CHY1002x 와 대조 균주 CHY1011 를 15mL YPGX(yeast extract 0.5%, peptone 0.5%, glucose 2.5%, xylose 2.5%)를 함유한 50mL falcon tube 에 접종하여 32?에서 14시간 배양한 후, 150mL 의 동일 YPGX를 함유한 500mL 플라스크에 계대배양하여 5시간 더 배양한 액을 오육탄당 발효의 접종액으로 사용하였다. 메인 오육탄당 발효는 2L 발효조를 이용하여 1.5L의 YPGX(yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%, xylose 5%) 배지에 위의 접종액을 접종하여 32?에서 발효하였다. 발효조의 교반속도는 200rpm으로 고정하였고, 공기는 주입하지 않았다. 그 결과, 다음 그림에서 보이는 것처럼 20 g/L의 글루코스는 두 균주 모두 10시간 이내에 소모하였고, 이후 대조 균주 CHY1011은 추가적인 자일로스의 소모나 에탄올 생산이 없었던 반면, 재조합 효모 CHY1002x는 이후로도 자일로스를 소모하면서 에탄올을 생산하는 것을 확인하였다. 20 g/L의 글루코스와 50 g/L의 자일로스가 함유된 배지에서 대조 균주 CHY1011는 당이용성의 제한으로 인해 20 g/L 글루코스만을 대사하여 9.3 g/L의 에탄올을 생산하였고, 재조합 효모 CHY1002x는 20 g/L 글루코스 뿐만 아니라 추가적으로 자일로스도 소모하여 총 22.4 g/L의 에탄올을 생산하였다. 즉, CHY1011에 비해 13.1 g/L의 에탄올을 추가로 생산하였음을 확인하였다 (도 6). 이 같은 결과는 산업적으로도 자일로스가 일부 포함된 전분질계 발효나 오육탄당의 혼합당의 배지 형태를 가지는 섬유질계 바이오매스 유래의 에탄올 발효에서 추가적인 에탄올 생산에 매우 유용할 것으로 판단된다.

한국생명공학연구원 KCTC12179BP 20120404 한국생명공학연구원 KCTC12180BP 20120404

<110> CHANGHAE ETHANOL CO., LTD. <120> A recombinant industrial yeast having auxotrophic marker, a recombinant yeast producing ethanol from pentose and hexose prepared by using the yeast, and a method for producing ethanol from pentose and hexose using the same <130> DPP20121423KR <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1107 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> gene <222> (1)..(1107) <223> ura3 gene <400> 1 gggtaataac tgatataatt aaattgaagc tctaatttgt gagtttagta tacatgcatt 60 tacttataat acagtttttt agttttgctg gccgcatctt ctcaaatatg cttcccagcc 120 tgcttttctg taacgttcac cctctacctt agcatccctt ccctttgcaa atagtcctct 180 tccaacaata ataatgtcag atcctgtaga gaccacatca tccacggttc tatactgttg 240 acccaatgcg tctcccttgt catctaaacc cacaccgggt gtcataatca accaatcgta 300 accttcatct cttccaccca tgtctctttg agcaataaag ccgataacaa aatctttgtc 360 gctcttcgca atgtcaacag tacccttagt atattctcca gtagataggg agcccttgca 420 tgacaattct gctaacatca aaaggcctct aggttccttt gttacttctt ctgccgcctg 480 cttcaaaccg 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Claims (12)

1. ura3 유전자가 불활성화되어 우라실에 대한 영양요구성 선별 마커를 가지는, 유전자 재조합용 산업 효모, 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주 (수탁번호 KCTC 12179BP).
   
2. 제1항에 있어서, 상기 ura3 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것인 균주.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 ura3 유전자 결손 카세트를 도입하여 제조된 것인 균주.
   
4. 제1항 내지 제3항의 균주에 ura3 유전자 및 외래 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 유전자 재조합 균주의 제조 방법.
   
5. 사카로마이세스 세레비지애 CHY1001 균주 (수탁번호 KCTC 12179BP)에 ura 유전자, 자일로스 이소머라제(xylose isomerase)를 코딩하는 유전자 및 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase)를 코딩하는 유전자가 도입된, 오탄당 및 육탄당 발효가 가능한 사카로마이세스 세레비지애 균주.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 오탄당이 자일로스인 균주.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것인 균주.
   
8. 제5항에 있어서, 상기 자일룰로스 키나아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것인 균주.
   
9. 제5항에 있어서, 상기 균주는 수탁번호 KCTC 12180BP 인 균주.
   
10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 균주를 포함하는 에탄올 생산용 조성물.
    
11. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 균주를 육탄당, 오탄당, 또는 오탄당 및 육탄당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 에탄올의 제조 방법.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 오탄당이 자일로스인, 에탄올의 제조 방법.

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