CN113321712A - 一组猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

一组猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原多肽及其应用，它涉及生物检测技术领域，本发明要解决在血清学上无法有效区分疫苗免疫和野毒感染的PRRS基因工程标记弱毒疫苗的问题，本发明的抗原肽是由序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2中的一种或者两种所示的多肽组成的组合物。它用于制备ELISA诊断试剂盒。本发明筛选可用于鉴别诊断的蛋白多肽，并建立相应的间接ELISA检测方法。为今后PRRS基因工程标记弱毒疫苗株提供候选标签蛋白，为PRRS疫苗株和野毒株的鉴别诊断提供技术支持。本发明应用于猪用疫苗及诊断领域。

Description

一组猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一组猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒的抗原多肽及其多肽ELISA诊断试剂盒。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是猪的一种传染性病毒病，给全世界养猪业造成了巨大经济损失。因为发病猪耳部多发绀成蓝紫色，也被称为“蓝耳病”(Keffaber et al.,1989)。临床上主要表现为妊娠母猪的繁殖障碍以及各年龄阶段猪的呼吸障碍。1987年美国首次出现PRRS，随后该病在美国大范围流行并传播到加拿大等地区。随后欧洲及亚洲一些国家和地区也相继报道了该病(Albina et al.,1997)。1992年，世界动物卫生组织(OIE)将该病归类为B类传染病。我国于1996年郭宝清等首次在国内发现该病(郭宝清等,1996)，随后几年里该病在我国多个主要养猪省份均有报道。2006年，一种以发病急、传播快、高发病率和高死亡率为特征的高致病性PRRS(highly pathogenic PRRS,HP-PRRS)在我国南方暴发(Tian et al.,2007)，并迅速蔓延到我国各省份，导致大量生猪死亡，直接经济损失数十亿元。随后，高致病性PRRS成为我国的主流毒株，严重危害我国养猪业的健康发展。我国农业部将高致病性PRRS划归为一类传染病，作为重点防控疾病。
疫苗接种是防控该病的有效办法。截止到目前，市场上PRRSV疫苗的主要是弱毒疫苗和灭活疫苗，其中以弱毒疫苗为主。我国获批准生产的PRRS弱毒疫苗有很多种，包括CH-1R株、JXA1-R株、HuN4-F112株、TJM株、GDr180株和R98株等。弱毒疫苗在预防PRRS方面起到了积极的作用，而现有的血清学鉴别诊断方法无法区分疫苗免疫和野毒感染，给PRRS疾病的检测防控带来了巨大困难。因此研制一种能够在血清学上区分疫苗免疫和野毒感染的PRRS基因工程标记弱毒疫苗是当前情况下防控PRRS最佳选择。
近年来，反向遗传学技术的快速发展为标记疫苗的研究提供了重要的技术保障。在不影响病毒活性的前提下，通过删除疫苗株中具有良好免疫原性的多肽作为缺失标记，再以该多肽为包被抗原，通过血清学检测方法即可完成疫苗与野毒的鉴别诊断。因此，筛选出理想的抗原多肽，是PRRS基因工程标记弱毒疫苗研制的关键。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，而提供一组猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原多肽的筛选及其应用。
本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原多肽，所述的抗原多肽是由序列表中SEQID NO：1、SEQ ID NO：2中的一种或者两种所示的多肽组成的组合物。
进一步地，所述的SEQ ID NO：1所示的多肽为猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2蛋白第562-627位的氨基酸序列。
进一步地，所述的SEQ ID NO：2所示的多肽为猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2蛋白第749-813位的氨基酸序列。
本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原多肽的应用，它用于制备ELISA诊断试剂盒。
进一步地，所述的ELISA诊断试剂盒包含猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原多肽作为抗原包被的酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、底物显色液和终止液。
进一步地，采用所制备的ELISA诊断试剂盒区分猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株与野毒株。
本发明包含以下有益效果：
本发明筛选出PRRS的一组抗原多肽，经鉴定发现该多肽具有良好的抗原性。将该多肽作为ELISA包被抗原，建立了一种间接ELISA方法。该ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。在PRRSV弱毒疫苗株的基因组中缺失该组多肽的序列，不影响疫苗株的增殖，也不影响产生疫苗株的抗体，可以起到PRRS疫苗鉴别诊断的目的。本发明涉及的鉴定抗原多肽的方法、建立多肽ELISA方法，对于PRRSV以及其他病原标记疫苗的开发具有重要的借鉴作用。
本发明首先对GenBank中907条北美洲型PRRSV的NSP2序列(截止到2020年7月GenBank中北美洲型PRRSV全长NSP2序列共计907条)进行比对后，将缺失位置设计在NSP2的562-627aa和749-813aa，分别命名为m1B、m2B(参见序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。以PRRS弱毒疫苗HuN4-F112株为模式毒株，在其感染性克隆上进行缺失，拯救出单缺失突变株rHuN4-F112-m1B、rHuN4-F112-m2B和双缺失突变株rHuN4-F112-m1B-m2B。生长动力学表明，删除m1B和m2B对病毒复制没有明显影响。因此，m1B和m2B可以作为开发诊断PRRSV疫苗的潜在分子标记，该疫苗能够区分野毒感染动物和疫苗接种的动物。
本发明筛选可用于鉴别诊断的蛋白多肽，并建立相应的间接ELISA检测方法。为今后PRRS基因工程标记弱毒疫苗株提供候选标签蛋白，为PRRS疫苗株和野毒株的鉴别诊断提供技术支持。
附图说明
图1为基于907条北美洲型PRRSV的NSP2的系统插入缺失模式图；
图2为缺失标记毒株的缺失位置图；
图3为m1B氨基酸编码蛋白的特性分析图；
图4为m2B氨基酸编码蛋白的特性分析图；
图5为m1B和m2B与PRRSV阳性血清ELISA检测结果；其中，A为HP-PRRSV，B为NADC30-like；C为unifected control；
图6为m1B和m2B的序列保守性分析图；
图7为PRRSV m1B、m2B单缺失突变体和双缺失突变体感染Marc-145细胞的间接免疫荧光图；其中，a为rHuN4-F112-m1B，b为rHuN4-F112-m2B，c为rHuN4-F112-m1B-m2B；d为rHuN4-F112；e为阴性对照；
图8为rHuN4-F112和rHuN4-F112-m1B-m2B在感染后24、48、72和96h的病毒拷贝数图；其中，A为rHuN4-F112，B为rHuN4-F112-m1B-m2B；
图9为血清确定最佳一抗作用时间图；其中，A为阳性对照，B为阴性对照，C为P/N曲线；
图10为TMB确定底物最佳显色时间图；其中，A为阳性对照，B为阴性对照，C为P/N曲线；
图11为HuN4 F112和HuN4 F112-mGP3免疫后HuN4 F5攻毒的血清检测及X+3SD值判定图；其中，左侧两图均为血清检测数据，右侧两图均为X+3SD值判定数据；其中，a为血清359，b为血清360，c为血清356，d为血清358，e为血清357，h为血清332，i为血清334，f为血清333，j为血清331，g为血清330。
具体实施方式
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
PRRSV NSP2优势抗原区的筛选
1、实验材料
1.1实验血清
PRRSV HuN4-F112阳性血清、PRRSV HuN4-F5阳性血清、PRRSV阴性血清由本实验室保存。
1.2实验试剂
多肽由吉尔生化有限公司合成；TMB显色液购自Invitrogen公司；HRP山羊抗猪IgG购自SIGMA公司；ELISA酶标板购自corning公司；PBS干粉购自北京酷来搏科技有限公司
1.3实验仪器
电热恒温培养箱购自上海一恒科技有限公司；PH计购自；振荡器购自其林贝尔仪器制造公司；洗板机购自BioTek公司；全自动酶标仪购自BioTek公司；超纯水仪购自Millipore。
1.4实验试剂配制
pH＝9.6的碳酸盐缓冲液：Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，定容至1,000mL，pH调至9.6后用400μm的滤膜过滤后4℃保存。
PBST：在1L的PBS中加入加入500μL Tween-20。
2、方法
2.1北美洲型PRRSV的NSP2的数据集和序列比对
为了确定NSP2的缺失插入位置，本研究于2020年从GenBank下载了所有的907条NSP2北美洲型PRRSV全长序列，通过DNAstarv7.1.0软件进行了氨基酸序列比对和插入/缺失(indels)分析，将缺失位置设计在NSP2的562-627aa和749-813aa，分别命名为m1B、m2B(参见序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。氨基酸比对的参考毒株的全基因组序列的GenBank登录号如下：JXA1(EF112445)、HuN4(EF635006)、GD(EU825724)、WUH4(JQ326271)、HUB1(EF075945)、YN9(GU232738)、NADC30(JN654459)、MN184A(DQ176019)、HENAN-XINX(KF611905)、WUH5(KU523366)、FJZ03(KP860909)、VR-2332(AY150564)、BJ-4(AF331831)、CC-1(EF153486)、RespPRRS MLV(EF484033)、CH-1R(EU807840)、GM2(JN662424)、QYYZ(JQ308798)。
2.2多肽m1B和m2B的生物信息学分析
利用DNAStar软件分析多肽m1B和m2B的亲疏水性、表面可及性、柔性和抗原性，最后结合这几种参数综合评估多肽m1B和m2B的抗原指数。
2.4NSP2缺失标记毒株的构建
为了验证m1B和m2B多肽作为标记疫苗缺失位点的应用潜力，本专利以实验室前期构建的PRRSV弱毒疫苗株F112感染性克隆质粒(pHuN4-F112)为模板，缺失NSP2蛋白m1B和m2B位置处的氨基酸，构建了两株单缺失突变体病毒：以pHuN4-F112质粒为模板，H-B-m1B-F/H-B-NheI-R、H-B-FseI-F/H-B-m2B-R、H-B-m2B-F/H-B-NheI-R为引物分别扩增1B、2BL和2BR片段，电泳鉴定后切胶回收1B、2BL和2BR片段。以2BL和2BR片段为模板，H-B-FseI-F/H-B-NheI-R为引物进行融合PCR，融合PCR产物命名为2B片段；电泳鉴定后切胶回收2B片段，以FseI和NheI双酶切1B片段、2B片段和pHuN4-F112质粒，将这两个酶切后的片段分别连接到pHuN4-F112质粒上，构建单缺失标记毒株rHuN4-F112-m1B和rHuN4-F112-m2B。
同时在pHuN4-F112质粒上同时缺失NSP2蛋白m1B和m2B位置处的氨基酸，构建了一株双缺失突变体病毒：以pHuN4-F112质粒为模板，通过引物H-1B-2B-F/H-1B-2B-R同时缺失562-627的氨基酸(m1B)和749-813位的氨基酸(m2B)，构建双缺失标记毒株rHuN4-F112-m1B-m2B。
挑取单克隆在含有卡那霉素抗性的LB培养液中扩大培养，通过PCR鉴定菌液，再将鉴定选出阳性菌液进行测序。测序验证正确后将菌液扩大培养，使用中提质粒试剂盒提取缺失标记质粒并调整浓度至1μg/μL。引物(表1)由吉林库美生物技术有限公司合成。
表1缺失突变株所用扩增引物
Figure BDA0003171430610000061
2.5缺失突变体的拯救和传代
待6孔板内生长状态良好的Marc-145细胞融合度达到80％～90％，参照X-tremeGene HP DNA Transfection Reagent转染试剂(Roche)说明书进行转染。在37℃含5％CO2的温箱中培养5d后，将六孔板中的细胞和上清一起冻存于-80℃，备用。将拯救获得的0代病毒在Marc-145细胞上进行传代培养。待细胞瓶内的Marc-145细胞融合度达到80％～90％，进行病毒传代。每一代次病毒均存放于-80℃冰箱备用。
2.6缺失突变体的RT-PCR鉴定
利用RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit根据其说明书步骤提取2.5中培养的第三代缺失突变体病毒RNA，反转录提取的病毒RNA即可得到病毒的cDNA，保存于-20℃备用。以反转录得到的cDNA为模板，并通过RT-PCR方法扩增NSP2基因缺失区域，通过凝胶电泳结果鉴定PCR产物条带大小是否正确，同时将PCR产物送测序，通过测序结果判断突变病毒是否拯救成功。设亲本病毒接毒细胞为阳性对照，未接毒细胞为阴性对照。
反转录体系及反应条件：dNTP 8μL、5×MLV-Buffer 4μL、Random Primer 1μL、M-MLV 1μL、RRI 0.5μL以及RNA 6μL；于室温下静置10min后42℃水浴1h。
PCR体系及反应条件：PremixTaq 12.5μL、ddH2O 6.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL以及cDNA 4μL；95℃5min、94℃30s、55℃30s、72℃1min，35个循环，72℃10min。
2.7缺失突变体间接免疫荧光鉴定
将2.5中培养的第三代的缺失突变体病毒接种到Marc-145细胞，在37℃含5％的CO2的温箱中培养5d。取下层细胞利用PRRSV M蛋白抗体3F7进行间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)检测，详细过程如下：
向Marc-145细胞中分别接种第三代的缺失突变体病毒rHuN4-F112-m1B、rHuN4-F112-m2B、rHuN4-F112-m1B-m2B及亲本病毒rHuN4-F112在含5％CO2的37℃温培养箱孵育72h后，取其下层细胞进行IFA试验。
(1)固定：PBS缓冲液洗涤细胞后加入无水乙醇固定30min，固定完成用PBS清洗细胞(操作缓慢，防止细胞从板上脱落)。
(2)一抗：1:100稀释PRRSV M蛋白单克隆抗体(3F7)，取500μL分别加入到每个孔中，37℃温箱中孵育1h后用PBS清洗3次。
(3)二抗：1:100稀释FITC标记的山羊抗小鼠IgG，37℃温箱中避光孵育1h后进行3次洗涤，每次10min。使用荧光显微镜观察IFA试验结果。
2.8缺失突变体病毒滴度TCID50的测定
将第三代的缺失突变体病毒rHuN4-F112-m1B、rHuN4-F112-m2B、rHuN4-F112-m1B-m2B及亲本病毒rHuN4-F112分别接种到铺满Marc-145细胞的96孔板中，在37℃含5％的二氧化碳的温箱中孵育5d后记录细胞病变孔数，并计算病毒TCID50值。每次实验都需要检测亲本病毒的TCID50作为对照。具体操作如下：
(1)当铺于96孔板中的Marc-145细胞铺满单层时，将10％FBS DMEM换为2％FBSDMEM。
(2)从10-1-10-8倍比稀释病毒。
(3)将稀释好的病毒依次加入到96孔板中，每个稀释度8个孔，每孔加100μL；在含5％CO2的37℃温箱里培养5d，记录细胞病变孔数。
(4)计算病毒滴度，用TCID50/mL表示(Reed-Muench计算方法)。
2.9缺失标记病毒在Marc-145细胞中的生长动力学
为了检测m1B和m2B缺失对病毒复制的影响，在Marc-145细胞在六孔板中生长至80％汇合，然后感染2.5中培养后的第三代病毒(rHuN4-pF112-m1B，rHuN4-pF112-m2B、rHuN4-F112-m1B-m2B和rHuN4-pF112)的感染复数为0.01。接种后0、24、48、72和96小时收取上清液。提取RNA并反转录，使用实时定量PCR(RT-qPCR)确定不同时间点的病毒拷贝数。所有样品均进行了3次测试，并使用GraphPad软件(GraphPad，美国)绘制了复制动力学曲线。测量值表示为平均值±标准偏差。使用t检验在p<0.05时评估显着性。
3、结果
3.1NSP2蛋白的缺失插入类型多态性分析
为了系统分析NSP2蛋白缺失插入类型的多态性，对1991年至2020年间GenBank中所有NSP2北美洲型PRRSV全长序列(n＝907)进行了比对。将VR-2332作为参考毒株，发现了NSP2蛋白中广泛的插入缺失(图1)。这些插入缺失可以分为五个主要类型：类型1：代表毒株为经典PRRSV VR-2332(无插入和删除)；类型2：代表毒株为NADC30(第322–432、482和504–522位氨基酸缺失)；类型3：代表毒株为NADC34(第335-434位氨基酸缺失)；类型4：代表毒株为HP-PRRSV(第482和533–561位氨基酸缺失)和类型5：代表毒株为SP(第814位插入36个氨基酸)。
在中国的PRRSV中，以上五个主要插入缺失类型均有检测到。在插入缺失分析中，发现HeB108株传代过程中发生的NSP2第585-586位氨基酸缺失非常独特。为了研究该缺失是否可用于设计DIVA疫苗，本研究将NSP2进行人为缺失，缺失位置为第562-627位氨基酸，涵盖了第585-586位氨基酸，缺失位置的多肽命名为m1B。采用相同的方法，在起止位置为第749-813位也进行了缺失，对应的多肽命名为m2B(图2)。
3.2多肽m1B和m2B的抗原性分析
利用DNAstar v7.1.0对多肽m1B和m2B序列进行亲水性、表面可及性和抗原性分析，发现m1B和m2B多肽具有良好的抗原性(图3，4)。
3.3多肽m1B和m2B与PRRSV阳性血清ELISA检测
为了检查m1B和m2B的抗原性，将化学合成的多肽m1B和m2B包被ELISA板。取HP-PRRSV和NADC30-like PRRSV的阳性猪血清进行1B2B-ELISA试验。结果显示，m1B和m2B都与两种血清强烈反应，P/N比大于2(图5)。
3.4多肽m1B和m2B的序列保守性分析
NSP2的序列比对显示，m1B和m2B在同谱系PRRSV之间是保守的，但在不同谱系PRRSV之间保守性不高(图6)。
3.5拯救m1B和m2B缺失突变株
以HuN4-F112感染性克隆为骨架，单独缺失NSP2蛋白m1B或m2B区域，并拯救相应的PRRSV单缺失标记毒株rHuN4-F112-m1B、rHuN4-F112-m2B；同时缺失NSP2蛋白m1B和m2B区域，拯救PRRSV双缺失标记毒株rHuN4-F112-m1B-m2B。间接免疫荧光试验显示，在感染了缺失标记毒株的Marc-145细胞中观察到了特异性的绿色荧光(图7)。拯救病毒的第三代rHuN4-F112，rHuN4-F112-m1B，rHuN4-F112-m2B和rHuN4-F112-m1B-m2B的滴度分别为107.168TCID50/mL、107.465TCID50/mL、107.447TCID50/mL和105.536TCID50/mL。
3.6通过RT-qPCR评估病毒生长曲线
在感染后24h、48h和72h，rHuN4-F112-m1B或rHuN4-F112-m2B的拷贝数显着高于rHuN4-F112(p<0.05)，但在感染后96h则无显著差异。双缺失标记毒株rHuN4-F112-m1B-m2B在感染后48、72和96小时的病毒拷贝数也显着高于rHuN4-F112(图8)。结果表明，NSP2蛋白562–627或749–813氨基酸位置的单缺失和双缺失均不会降低PRRSV在Marc-145细胞中的复制能力。
综上，对于当前的养猪业，PRRS仍然是需要高度关注的重要传染性疾病。PRRS灭活疫苗和活疫苗(MLV)已在市场上得到广泛使用，它们在预防和控制PRRS流行中发挥了积极作用。但是仍需进行一些改进，例如针对不同类型PRRSV的交叉免疫保护，难以区分疫苗免疫与野毒感染。
NSP2是PRRSV的最大蛋白，在VR-2332株(北美洲型PRRSV的原型株)中有1196个残基。经常检测到NSP2插入/缺失标记毒株，尤其是在NSP2的中间位置，例如NADC30-likePRRSV，NADC34-like PRRSV和HP-PRRSV。这表明NSP2可以耐受氨基酸缺失和外源基因插入。NSP2蛋白中含有一些良好免疫原性的B细胞表位，因此NSP2蛋白具有高抗原性，本实施例确定了两个免疫优势抗原区域m1B和m2B，通过ELISA检测结果显示这两个多肽可以被HP-PRRSV和NADC30-like PRRSV的阳性猪血清很好地识别。
本实施例在北美洲型PRRSV的NSP2蛋白中发现了具有良好抗原性且通用的负标记位置，通过相应的ELISA可以监测到针对该负标记的抗体。更重要的是，缺失这两段序列并不会显著降低病毒的复制水平，表明这两种肽可能是开发PRRSV DIVA疫苗的潜在分子标记。
实施例2
猪繁殖与呼吸综合征缺失突变株ELISA方法建立
本实施例以缺失的m1B和m2B多肽作为包被抗原，建立检测PRRSV缺失标记毒株的间接ELISA方法。通过优化，确定各个步骤的最佳反应条件，1B2B抗原最适包被浓度为1.25μg/ml，一抗血清最佳稀释度为1:40，酶标二抗最佳稀释度为1:30000，一抗二抗的最佳孵育时间为60min，底物最佳显色条件为室温15min。阴阳性临界值为0.237。用1B2B-ELISA方法对HuN4-F112免疫后的血清进行检测，结果表明，从免疫后第21天起即可检测到针对1B2B特异性抗体。1B2B-ELISA方法的建立对PRRSV双缺失突变株rHuN4-F112-m1B-m2B特异性鉴别诊断试剂盒的建立具有重要价值。
2、材料与方法
2.1实验血清与实验试剂
PRRSV HuN4-F112阳性血清、PRRS阴性血清由本实验室保存。猪瘟(CSFV)阳性血清、猪流行性腹泻(PEDV)阳性血清、猪伪狂犬(PRV)阳性血清、猪细小病毒(PPV)阳性血清、猪圆环2型病毒(PCV-2)阳性血清均为哈尔滨兽医研究所孙明霞博士提供。
多肽由吉尔生化有限公司合成；TMB显色液购自Invitrogen公司；HRP山羊抗猪IgG购自SIGMA公司；ELISA酶标板购自Corning公司；脱脂乳购自PBS干粉购自北京酷来搏科技有限公司；PRRSV抗体检测试剂盒Herd Check PRRS X3购自IDEXX公司。
2.2 1B2B-ELISA方法的试验流程
1B2B间接ELISA方法的操作步骤如下：
稀释：用蒸馏水将粉末状的1B2B合成肽抗原稀释到1mg/mL的储存浓度，保存于-80℃备用。
包被：用包被液将1B2B合成肽抗原稀释到最佳包被浓度，每孔包被100μL，4℃过夜。
封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h。
洗涤：每孔加300μL PBST，洗涤3次，每次约5min。
加样：取100μL稀释到最佳浓度的样品加到ELISA板孔中，37℃孵育1h。
洗涤：每孔加300μL PBST，洗涤3次，每次约5min。
酶标二抗：取100μL稀释到最佳浓度的HRP标记的山羊抗猪IgG加到ELISA板孔中，37℃孵育1h。
洗涤：每孔加300μL PBST，洗涤3次，每次约5min。
显色：每孔中加入100μL TMB显液，室温避光显色15min。
终止：每孔中加入100μL终止液终止反应。
读数：测定并记录各孔在450nm波长处的吸光值(OD值)。
按着1B2B-ELISA方法的试验流程对各个反应条件一一进行优化。以PRRSV阳性血清OD值与阴性血清OD值的比值(P/N值)作为判定标准。
2.3抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
将多肽m1B和m2B 10倍梯度稀释后进行包被(5μg/mL至0.125μg/mL)，同时按1:20、1:40、1:80、1:160稀释PRRSV HuN4-F112阳性血清和PRRSV阴性血清，其他反应条件保持与上述试验流程一致。通过测定并记录各孔的OD值并计算P/N值来确定最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度。
2.4最佳封闭液及封闭时间的优化
确定最佳抗原包被浓度及最佳血清稀释度后，其他条件保持固定。更换封闭液及封闭时间。具体操作如下：具体操作如下：以含有1％BSA、2％BSA、3％BSA、4％脱脂乳、5％脱脂乳和6％脱脂乳的PBST作为封闭液，封闭4组。每组的封闭时间分别为1h、1.5h、2h和2.5h，通过阳性血清和阴性血清间接ELISA的测定结果确定最佳封闭液及封闭时间。
2.5一抗血清最佳反应时间的优化
为了确定血清最佳反应时间，其他反应条件保持固定。将一抗的反应时间分别设置为30min、1h和2h，通过测定并记录各孔的OD值并计算P/N值来确定血清最佳反应时间。
2.6酶标二抗最佳稀释度及最佳作用时间的优化
为了确定酶标二抗最佳稀释度及作用时间，其他反应条件保持固定。以1:30000、1:40000比例稀释酶标二抗(HRP标记的山羊抗猪IgG)。将二抗的反应时间分别设置为30min、45min、60min和90min。通过测定并记录各孔的OD值并计算P/N值来确定酶标二抗的最佳稀释度及作用时间。
2.7底物最佳显色时间的优化
为了确定底物最佳显色时间，在避光的环境下将TMB显色液加到ELISA板的反应孔中，室温条件下分别显色5min、10min和15min。测定并记录各孔的OD值并计算P/N值来确定底物的最佳显色时间。
2.8阴阳性临界值的优化
为了确定1B2B-ELISA检测方法的阴阳性临界值。本实施例检测214份阴性血清，测定出OD值后计算其平均值(X)和3倍标准偏差(SD)，确定阴阳性临界值的条件为X+3SD。当样品的OD值大于或等于X+3SD判定为阳性，当样品的OD值小于X+3SD则判定为阴性。
2.9特异性试验
以建立的1B2B-ELISA方法检测CSFV、PEDV、PCV2、PPV和PRV的阳性血清，同时设置PRRSV阳性血清和阴性血清分别为阳性对照和阴性对照。通过ELISA试验结果分析1B2B多肽抗原是否与针对上述病毒的抗体存在交叉反应。
2.10实验血清符合性实验
用IDEXX的猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒(IDEXX Herd
Figure BDA0003171430610000122
PRRS X3)对不同时间采集的试验猪血清进行检测，比较两种检测方法的结果，计算两者之间的符合率。
3、结果
3.1抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
将合成的1B2B多肽抗原用蛋白质稳定剂稀释为1mg/ml储存浓度，通过棋盘法确定抗原最佳包被浓度与血清稀释浓度。选择阴性血清OD≤0.100，阳性血清和阴性血清OD比值P/N≥2为最佳条件。由表2可知，血清的最佳稀释度为1:40，抗原最佳包被浓℃为1.25μg/ml，P/N值为21.41。
表2棋盘法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度
Figure BDA0003171430610000121
3.2最佳封闭液及封闭时间的优化
为了确定最佳封闭液及封闭时间，其他条件固定，分别设置不同封闭液以及封闭时间，进行间接ELISA检测，以P/N值最大为判定标准。由表3可知，最佳封闭液为含5％脱脂乳的PBST，最佳封闭时间为37℃封闭2h。
表3最佳封闭液及封闭时间的确定
Figure BDA0003171430610000131
3.3最佳血清作用时间的优化
根据已确定的1B2B-ELISA反应条件，设置不同的血清孵育时间，通过测定OD值并计算P/N值，从而选择血清最佳孵育时间。如图9所示，当血清孵育时间为37℃1h时，P/N值最大。
3.4最佳酶标二抗稀释度及作用时间
为了确定最佳酶标二抗稀释度及反应条件，其他条件固定，分别设置不同酶标二抗稀释度及反应条件，进行间接ELISA检测，在阴性值低于0.1的范围内，以P/N值最大为判定标准。结果显示最佳酶标抗体稀释倍数为1：30000，最佳反应条件为37℃孵育60min(表4)。
表4酶标二抗最佳稀释度及作用时间的确定
Figure BDA0003171430610000141
3.5最佳底物反应时间
当其他条件保持不变时，阴性血清和阳性血清OD值随着底物反应时间延长而逐渐升高，比较各点的P/N值，选择15min作为最佳底物反应时间，如图10所示。
3.6阴阳性临界值
平均值+3×标准差方法确定临界值：对214份阴性血清进行检测，计算平均值为0.122，标准差为0.054，用平均值+3×标准差的方法确认的临界值为0.237。因此样品的OD值大于或等于该临界值的猪血清均判定为1B2B抗体阳性，反之则被判定为1B2B抗体阴性。
3.7特异性试验
通过1B2B-ELISA检测CSFV、TGEV、PEDV、PCV-2、PRV、PPV，测定OD值为0.227、0.159、0.132、0.090、0.124、0.095，确定1B2B合成肽抗原与以上常见的猪病病毒抗体无明显的交叉反应。
3.8动物实验血清监测符合率结果
使用1B2B-ELISA方法对HuN4 F112免疫攻毒的血清(356#-360#)和HuN4 F112基因突变株HuN4 F112-mGP3免疫后HuN4 F5攻毒的血清(330#-334#)进行检测，通过检测OD值进行X+3SD值判定，从第21-28d开始出现抗体转阳(如图11)。IDEXX试剂盒检测血清中N蛋白抗体转阳时间为7-14d，为本实施例建立的1B2B-ELISA作一个参考对照。
综上，目前疫苗接种依旧是目前防控PRRS最有效的办法。虽然商品化疫苗的使用使PRRS疾病得到了有效的防控但也使我国猪场猪群出现不同野毒和疫苗毒同时存在的复杂情况，而现有的鉴别诊断方法从血清学上的角度均无法区分是疫苗免疫还是野毒感染，从而给PRRS疾病的监测和防控带来了巨大挑战。为了解决这个难题，本发明前期以HuN4-F112感染性克隆为基础，通过缺失NSP2蛋白第562-627和749-813氨基酸，成功构建并拯救出两株单缺失突变株rHuN4-F112-m1B和rHuN4-F112-m2B以及双缺失突变株rHuN4-F112-m1B-m2B。
在不同的血清学方法中，ELISA具有灵敏性高，特异性好并且可以在短时间内检测大量血清样本等优点，因此适用于PRRSV感染的大规模筛查。近些年的研究已经开发不同检测目的的PRRSV ELISA方法。但是，市面上仍然没有能够将PRRSV疫苗抗体与野生型病毒区分开的ELISA方法。本研究为避免在蛋白纯化过程中杂蛋白影响缺失标记1B2B多肽的纯度，同时基于合理利用时间的考虑，因此试验中所使用的多肽均为合成肽。特异性试验结果显示缺失标记蛋白与其他常见的猪病无交叉反应，表明该ELISA方法可以用于标记疫苗特异性缺失标记抗体的监测。通过建立的1B2B-ELISA方法检测HuN4-F112免疫后的血清，可判定抗体转阳的时间在21d-28d，而IDEXX抗体转阳时间在7-14d。原因在于包被抗原的抗原性之间存在差异，1B2B-ELISA试验中采用的抗原1B2B是NSP2蛋白中的抗原表位，而IDEXX试剂盒检测的是针对N蛋白的抗体。PRRSV感染早期产生大量针对于N蛋白的抗体，而针对于NSP2蛋白的抗体水平则较低，因此PRRSV感染早期难以检测到1B2B的特异性抗体。
本实施例针对双缺失突变株rHuN4-F112-m1B-m2B建立1B2B-ELISA鉴别诊断方法。为了提高检测方法的敏感性以及降低非特异性，本实施例通过优化每个步骤确定最佳反应条件。1B2B-ELISA方法建立为双缺失突变株rHuN4-F112-m1B-m2B缺失蛋白抗体检测奠定了基础。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120>一组猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原多肽及其应用
<160>10
<210>1
<211>
<212> PRT
<213>m1B。
<400> 1
TTLTHQDEPLDLPASSQTEYEAFPLAPSQNMGILEAGGQEVEEVLSEISDILNDTNPAPVSSSSPL
<210>2
<211>18
<212> PRT
<213>m2B。
<400> 2
GSVATEDVPRILGKIGDTDELLDRGPSAPSKGEPVCDQPAKDPRMSPRESDESMIAPPADTGGVG
<210>3
<211>27
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> H-B-m1B-F。
<400> 3
GTGGCGGCCGCTCAAGTGTTAAGATCA 27
<210>4
<211>18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> H-B-NheI-R。
<400> 4
GCCGCTGGCGGCTAGCAG 18
<210>5
<211>18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> H-B-FseI-F。
<400> 5
GAGTGGGCCGGCCCCAGT 18
<210>6
<211>40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> H-B-m2B-R。
<400> 6
AGACGGCAAATCAGTGAATGAAATGGTGAGGTCACTCTCT 40
<210>7
<211>40
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> H-B-m2B-F。
<400> 7
AGAGAGTGACCTCACCATTTCATTCACTGATTTGCCGTCT 40
<210>8
<211>18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> H-B-NheI-R。
<400> 8
GCCGCTGGCGGCTAGCAG 18
<210>9
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> B-900-F。
<400> 9
AGTGAGCCCGTACTTATGCCC 21
<210>10
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> B-900-R。
<400>10
AAAAACCCCCATTCGCACACG 21

Claims (7)

1.猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原多肽，其特征在于，所述的抗原多肽是由序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2中的一种或者两种所示的多肽组成的组合物。
2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原多肽，其特征在于，所述的SEQ ID NO：1所示的多肽为猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2蛋白第562-627位的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原多肽，其特征在于，所述的SEQ ID NO：2所示的多肽为猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2蛋白第749-813位的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原多肽的应用，其特征在于，它用于制备ELISA诊断试剂盒。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的ELISA诊断试剂盒包含猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原多肽作为抗原包被的酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、底物显色液和终止液。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原多肽，为由序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2中的一种或者两种所示的多肽组成的。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，采用所制备的ELISA诊断试剂盒区分猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株与野毒株。
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