CN113827716A - 犬瘟热病毒弱毒株、及其制备的疫苗组合物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含免疫量的犬瘟热病毒LT90株抗原和冻干保护剂；该犬瘟热病毒LT90株抗原为犬瘟热病毒LT90株或其培养物的活的全病毒抗原，该犬瘟热病毒LT90株保藏号为CCTCC NO.V202030。本发明的疫苗组合物能对现有流行的犬瘟热进行预防和治疗，且能对感染或反复感染犬瘟热的犬只进行治疗，对不同地域的犬瘟热均能防控。还提供了犬瘟热病毒LT90株、该疫苗组合物的制备方法及应用。

Description

犬瘟热病毒弱毒株、及其制备的疫苗组合物和应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及犬瘟热病毒弱毒株、及其制备的疫苗组合物和应用。
背景技术
犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染引起的犬瘟热(Caninedistemper,CD)是世界范围内存在的一种高发病率、高死亡率、病毒性疾病，以发热呈双相热型、结膜炎、上呼吸道与肺及胃肠道卡他性炎症、皮炎、神经症状和足垫硬化为特征，极易继发其他细菌、病毒等混合感染和二次感染。严重影响犬及其它易感染动物的健康，造成大批犬死亡，并可引起患病动物的严重后遗症，对宠物犬、养犬业造成了严重的经济损失。
犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)于1978年首次被发现，目前流行于世界各地。犬细小病毒是引起犬急性出血性肠炎和幼犬心肌炎的病原，主要危害犬，尤其是2～6月龄幼犬。该病发病急、病程短、死亡率高、传染性强，对犬等具有很大的危害。
目前商品化的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗中，犬瘟热病毒疫苗株(Onderstepoort株、Snyder Hill株)为北美-1型，而国内主要流行亚洲-1型，同样的，犬细小病毒疫苗株(NL-35-D株、154株)均为早期出现的CPV-2型，而目前国内主要流行new CPV-2a型。国内流行毒株与商品化疫苗株在核苷酸、氨基酸水平上存在差异，不能对宿主动物进行有效保护。
特别是这些商品化进口疫苗自引入国内起，犬瘟热病毒、犬细小病毒单独或混合感染的临床病例均未得到显著抑制或减少，仍然给宠物犬、养犬业和毛皮经济动物等养殖行业造成极大危害和严重的损失。
此外。犬瘟热是一种高度接触性传染病，传染性强，死亡率可高达80％以上，在犬所患的各种疾病中无论是传染强度，病情的严重程度，还是死亡率上都可列榜首，一旦感染或反复感染后治愈困难。因此，亟需提供一种针对现有流行犬瘟热病毒的疫苗，其能预防及治疗流行性犬瘟热，特别是针对反复感染的犬只具有好的治疗效果，同时在临床应用上，针对不同地域的感染犬均能具有预防和治疗效果才具现实意义。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种抗犬瘟热疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的犬瘟热病毒LT90株抗原和冻干保护剂；所述犬瘟热病毒LT90株抗原为犬瘟热病毒LT90株或其培养物的活的全病毒抗原，所述犬瘟热病毒LT90株保藏号为CCTCCNO.V202030。
本发明的犬瘟热弱毒株具有稳定的生物学特性，且具有良好的免疫原性，安全可靠，制备的弱毒活疫苗能够产生较高水平的抗体，能够对流行株犬瘟热强毒攻击具有良好的保护效果。
本发明的疫苗组合物能对现有流行株进行保护，不仅具有预防效果，还能治疗感染的犬只，更可阻断犬瘟热病毒的持续感染。
本发明的疫苗组合物免疫不同地区发病犬后，均可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％保护，说明本发明的犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗在临床能治疗感染了犬瘟热病毒的犬，具有很好的保护力，针对不同地域犬瘟热病毒感染显示出很好的免疫保护和安全性。
本发明的疫苗组合物免疫发病犬后，对犬只经反复感染仍能阻断病毒感染(出现临床症状)，因此具有现实的临床治疗意义。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是免疫有效量。所述免疫有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒LT90株抗原含量为≥102.5FAID50/头份。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒LT90株抗原含量为102.5～105.5FAID50/头份。
犬瘟热病毒LT90株抗原含量可以选自102.5FAID50/头份、102.6FAID50/头份、102.7FAID50/头份、102.8FAID50/头份、102.9FAID50/头份、103.0FAID50/头份、103.1FAID50/头份、103.2FAID50/头份、103.3FAID50/头份、103.4FAID50/头份、103.5FAID50/头份、103.6FAID50/头份、103.7FAID50/头份、103.8FAID50/头份、103.9FAID50/头份、104.0FAID50/头份、104.1FAID50/头份、104.2FAID50/头份、104.3FAID50/头份、104.4FAID50/头份、104.5FAID50/头份、104.6FAID50/头份、104.7FAID50/头份、104.8FAID50/头份、104.9FAID50/头份、105.0FAID50/头份、105.1FAID50/头份、105.2FAID50/头份、105.3FAID50/头份、105.4FAID50/头份、105.5FAID50/头份。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒LT90株抗原含量为103.5～104.5FAID50/头份。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒LT90株培养物为1～100代次的培养物。
犬瘟热病毒LT90株培养物可以选自1代次、2代次、3代次、4代次、5代次、6代次、7代次、8代次、9代次、10代次、11代次、12代次、13代次、14代次、15代次、16代次、17代次、18代次、19代次、20代次、21代次、22代次、23代次、24代次、25代次、26代次、27代次、28代次、29代次、30代次、35代次、40代次、45代次、50代次、55代次、60代次、65代次、70代次、75代次、80代次、85代次、90代次、95代次、100代次的培养物。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述冻干保护剂包括SPGA、糖类、蛋白质、含有蛋白质的物质或/和缓冲液；优选地，糖类选自山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖，蛋白质选自白蛋白或者酪蛋白，所述含有蛋白质的物质为牛血清或者脱脂乳，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；更优选地，所述冻干保护剂为40w/v％蔗糖和8w/v％明胶的水溶液，所述冻干保护剂与抗原的比例为体积比1:1。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包括免疫量的犬细小病毒JM35株抗原，所述犬细小病毒JM35株抗原为所述犬细小病毒JM35株或其培养物的活的全病毒抗原，所述犬细小病毒JM35株保藏号为CCTCC NO.V201965。
犬细小病毒JM35株(Canine Parvovirus,Strain JM35)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201965，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2019年10月22日。
本发明的疫苗组合物中，犬细小病毒JM35株为new CPV-2a型，能对国内主要流行野毒株进行完全保护，保护率100％(5/5)。
本发明的二联疫苗组合物能对犬瘟热病毒国内主要流行野毒株、犬细小病毒国内主要流行野毒株进行完全保护，且针对现有流行株显示出比现有商品化疫苗更好的免疫保护和安全性。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬细小病毒JM35株抗原含量为≥104.0FAID50/头份。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬细小病毒JM35株抗原含量为104.0～106.5FAID50/头份。
犬细小病毒JM35株抗原含量为104.0FAID50/头份、104.1FAID50/头份、104.2FAID50/头份、104.3FAID50/头份、104.4FAID50/头份、104.5FAID50/头份、104.6FAID50/头份、104.7FAID50/头份、104.8FAID50/头份、104.9FAID50/头份、105.0FAID50/头份、105.1FAID50/头份、105.2FAID50/头份、105.3FAID50/头份、105.4FAID50/头份、105.5FAID50/头份、105.6FAID50/头份、105.7FAID50/头份、105.8FAID50/头份、105.9FAID50/头份、106.0FAID50/头份、106.1FAID50/头份、106.2FAID50/头份、106.3FAID50/头份、106.4FAID50/头份、106.5FAID50/头份。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬细小病毒JM35株抗原含量为105.0～106.0FAID50/头份。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述犬细小病毒JM35株培养物为1～100代次的培养物。
犬细小病毒JM35株培养物可选自1代次、2代次、3代次、4代次、5代次、6代次、7代次、8代次、9代次、10代次、11代次、12代次、13代次、14代次、15代次、16代次、17代次、18代次、19代次、20代次、21代次、22代次、23代次、24代次、25代次、26代次、27代次、28代次、29代次、30代次、35代次、40代次、45代次、50代次、55代次、60代次、65代次、70代次、75代次、80代次、85代次、90代次、95代次、100代次的培养物。
本发明还提供了一种制备所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)扩增所述犬瘟热病毒LT90株或其培养物；以及步骤(2)在所述步骤(1)扩增的犬瘟热病毒LT90株或其培养物中添加冻干保护剂，混匀。
本发明还提供了一种制备所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)分别扩增所述犬瘟热病毒LT90株或其培养物、所述犬细小病毒JM35株或其培养物；以及步骤(2)将所述步骤(1)所述扩增的犬瘟热病毒LT90株或其培养物、所述扩增的细小病毒JM35株或其培养物中添加冻干保护剂，混匀。
本发明还提供了所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬瘟热的药物中的应用。
本发明还提供了犬瘟热病毒弱毒株LT90株，所述犬瘟热病毒LT90株保藏号为CCTCC NO.V202030。
本发明的目的在于提供一种亚洲-1型犬瘟热病毒弱毒株，所述犬瘟热病毒弱毒株具有安全性高和良好的免疫原性的特点，其制备的疫苗能够抵抗现有流行株感染。
为此，本发明提供犬瘟热病毒LT90株弱毒株，保藏号为CCTCC NO.V202030。
犬瘟热病毒LT90株(Canine Distemper Virus,Strain LT90)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V202030，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2020年5月13日。
致病性试验表明，犬瘟热病毒LT90株培养1代至100代之间，高剂量接种对犬致病力显著降低，犬在接种后观察14天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。因此，该病毒与亲本强毒犬瘟热病毒LT株相比，致病力显著降低，是人工致弱的病毒株。
免疫原性试验表明，犬瘟热病毒LT90株培养至第100代，仍具有良好的免疫原性。犬在接种后21天，可抵御强毒犬瘟热病毒LT株的攻击。同时，未接种LT90株培养物的犬，则不能抵御犬瘟热病毒LT株的攻击，全部发病。
毒力返强试验表明，培养1代至100代之间的病毒，接种后在犬体内连续继代多次，不发生返强。因此，病毒接种犬群后，不会重新演变为强毒而发病，安全性有保证。
与其犬瘟热病毒亲本强毒株相比，犬瘟热病毒LT90株第1代至第100代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现导致M蛋白V140F、A231V和D290E氨基酸变异，H蛋白H477L和R519I氨基酸变异，F蛋白N209S和L390F氨基酸变异。
犬瘟热病毒LT90株不同代次培养物病毒基因编码的氨基酸出现的共性的特征性变化很有可能是其亲本强毒株毒力降低的原因，同时这些变化并未导致其免疫原性的变化。
本发明的犬瘟热病毒弱毒株其M蛋白、H蛋白和F蛋白氨基酸序列发生的点突变，较亲本强毒株毒性降低，且具有遗传稳定性。
还可以包含可用于本发明的可药用载体或者稀释剂的其他实例包括稳定剂，如SPGA、糖类(例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白质，如白蛋白或者酪蛋白、含有蛋白质的物质，如牛血清或者脱脂乳和缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。
特别当将这种稳定剂加入疫苗时，疫苗非常适于冷冻干燥。因此，在该实施方案的更优选的形式中，活的减毒疫苗是冷冻干燥的形式。
任选地，可以向疫苗中加入具有佐剂活性的一种或多种化合物。根据本发明的活的减毒的犬瘟热病毒不一定需要这种佐剂来实现功效，但是特别对应包含根据本发明的活的减毒的犬瘟热病毒和来自另一致病病毒或微生物的抗原性物质的组合疫苗，将值得加入佐剂。佐剂是免疫系统的非特异性刺激剂，它们增强宿主对疫苗的免疫应答。本领域中已知的佐剂的实例是弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs(免疫刺激复合体，参考例如欧洲专利EP109942)、皂苷、矿物油、植物油，和Carbopol。
因此，在该实施方案的优选形式中，根据本发明的活的减毒疫苗包含佐剂。
本文所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制犬瘟热病毒和/或犬细小病毒感染或推迟疾病发作，减少感染后排毒的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使犬瘟热病毒和/或犬细小病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1犬瘟热病毒LT90株的获得
1.取生长良好的Vero细胞，用胰酶消化，接种于细胞瓶内，以含有90％～97％体积比的DMEM培养液和3％～10％体积比的新生牛血清的细胞生长液(pH调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下继续培养，形成良好单层，用于接种病毒。
2.将犬瘟热病毒LT株接种生长良好的上述传代细胞单层，用含有95％～99％体积比的DMEM培养液和1％～5％体积比的新生牛血清的细胞生长液(pH调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下继续培养，于72h～96h后，当细胞80％以上发生病变时，收获细胞培养病毒液。
3.重复上述步骤连续传代培养获得犬瘟热病毒弱毒株，将获得的犬瘟热病毒弱毒株进行测序，结果显示M蛋白V140F、A231V和D290E氨基酸稳定变异，H蛋白H477L和R519I氨基酸稳定变异，F蛋白N209S和L390F氨基酸稳定变异。将该犬瘟热病毒弱毒株命名为犬瘟热病毒LT90株。
实施例2犬瘟热病毒LT90株生物学特性研究
1.致病性试验
2～3月龄的健康易感抗原抗体阴性犬15只随机分成3组，每组5只，分组和攻毒情况见表1。
表1致病性试验动物分组
组别 接种用毒株 接种剂量
1 LT90株 滴鼻2ml、腹腔4ml(10<sup>5.5</sup>FAID<sub>50</sub>/ml)
2 LT株 滴鼻2ml、腹腔4ml(10<sup>5.5</sup>FAID<sub>50</sub>/ml)
3 DMEM培养基 滴鼻2ml、腹腔4ml
病毒接种后观察21日，每日早晚对对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表2。
表2 LT90株对犬的致病性
Figure BDA0002552976270000081
Figure BDA0002552976270000091
结果显示，犬瘟热病毒LT株可以导致犬100％发病(5/5)，而犬瘟热病毒LT90株体温正常，无临床症状，剖检组织器官无变化。
致病性试验表明，犬瘟热病毒LT90株与亲本强毒株LT株相比，致病力显著降低，是致弱的病毒株。
同时，为验证犬瘟热病毒LT90株不同代次致病力的稳定性，用第1代、20代、40代、60代、80代、100代的犬瘟热病毒LT90株培养物，各接种一组犬瘟热抗原抗体阴性犬(5头)，滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/头，5头犬作为对照组。每日观察、记录犬的临床变化，直至接种21天。
结果显示，第1代、20代、40代、60代、80代、100代的犬瘟热病毒LT90株培养物，接种后观察21天，体温正常，无临床症状，剖检组织器官无变化。
不同代次致病性试验表明，犬瘟热病毒LT90株不同代次培养物致病力显著降低，是致弱的病毒株。
2.免疫原性试验
在免疫后第21天，对犬瘟热病毒LT90株接种的犬5头，以及对照组5头，均用犬瘟热病毒LT株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表3。
表3 LT90株对犬的免疫原性
Figure BDA0002552976270000101
结果显示，犬瘟热病毒LT90株接种过的犬全部保护，而对照组犬全部发病。
免疫原性试验表明，犬瘟热病毒LT90株具有良好的免疫原性，能对犬瘟热病毒LT株攻击产生良好的保护作用。
同时，为验证犬瘟热病毒LT90株不同代次免疫原性的稳定性，对分别免疫第1代、20代、40代、60代、80代、100代的犬瘟热病毒LT90株培养物后第21天，各免疫组连同对照组均用犬瘟热病毒LT株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录。
结果显示，第1代、20代、40代、60代、80代、100代的犬瘟热病毒LT90株培养物接种过的犬全部保护，对照组犬全部发病。
不同代次免疫原性试验表明，犬瘟热病毒LT90株不同代次培养物均具有良好的免疫原性，能对犬瘟热病毒LT株攻击产生良好的保护作用。
3.病毒返强安全性试验
将犬瘟热病毒LT90株第1代病毒液(107.4FAID50/ml)通过滴鼻2ml、腹腔注射4ml接种3只健康易感犬。接种后每日早晚测温和观察临床表现，接种后第8日剖杀，观察病变，并对肺脏采样进行组织病学HE染色和免疫组化检测，对肺脏研磨液进行犬瘟热病毒核酸测定，挑选病毒含量高的犬肺脏适当处理后作为下一代毒力返强用接种物，如此在犬体内传至第4代。
取第4代毒力返强试验获得肺脏研磨液过滤后再经滴鼻2ml、腹腔注射4ml接种3只健康易感犬。接种后每日早晚测温和观察临床表现，接种后第21日剖杀，观察病变，并对肺脏、肠、肠系膜淋巴结和脑采样进行HE和免疫组化检测，对肺脏研磨液进行病毒核酸测定。
如在第1～4代毒力返强继代试验中，如果出现某代试验中，肺脏组织检测不到犬瘟热病毒核酸，则应适当加大接种量，同样方式接种6只犬，以提高病毒核酸检出率，如果进一步试验确证继代后不能重新在肺脏检测到犬瘟热核酸，表明该毒力返强试验结果可判成立，该毒株没有毒力返强可能。
结果显示，第1代病毒液接种犬后体温和临床表现均未见异常，接种后第8日剖检，组织器官未见异常，HE染色未见异常，肺脏免疫组化检测可见少量CDV抗原阳性,肺脏可分离到CDV病毒；取第1代后的肺脏研磨液再接种35～40日龄健康易感犬进行第2代毒力返强试验，依次传至第4代所有接种犬体温和临床表现均未见异常，剖杀后各脏器未见明显病变，HE染色均未见异常，免疫组化检测结果均为阴性；传至第4代，犬肺脏已检测不到病毒载量。将第3代毒力返强肺脏研磨液浓缩加倍接种6只35～40日龄健康易感犬,进行第4代毒力返强重复试验,接种后临床表现均未见异常,接种8日后剖检,各组织脏器均未见异常,肺脏病毒载量检测仍为阴性。毒力返强试验时同居饲养的试验犬，临床观察也未见异常，同居饲养21日后血清CDV抗体也未见转阳，可见犬瘟热病毒LT90株即没有毒力返强能力，也不水平传播，是一株安全性良好的弱毒株。
分别将犬瘟热病毒LT90株第20代、40代、60代、80代、100代病毒液参照上述病毒返强试验步骤进行验证，结果显示接种犬体温和临床表现均未见异常，组织器官未见异常，HE染色未见异常，肺脏免疫组化检测可见少量CDV抗原阳性,肺脏可分离到CDV病毒；依次传至第4代所有接种犬体温和临床表现均未见异常，剖杀后各脏器未见明显病变，HE染色均未见异常，免疫组化检测结果均为阴性；荧光定量PCR检测结果也显示传代过程中病毒载量逐渐下降，传至第4代，已检测不到病毒载量；剂量加倍试验及同居试验也未见异常。
因此，犬瘟热病毒LT90株不会重新演变为强毒而引起发病，安全性有保证。
4.基因序列分析
将犬瘟热病毒LT90株第1代至第100代的培养物，用RT-PCR方法，进行基因组扩增(不同代次培养物分别扩增)。将获得的基因扩增产物回收、纯化，连接到测序质粒载体中，测定病毒基因的核苷酸序列，并用计算机软件转化成病毒的氨基酸序列。用序列分析软件，将获得氨基酸序列与亲本强毒株LT株氨基酸序列进行比较，描述病毒氨基酸序列特征。
结果显示，犬瘟热病毒LT90株第1代至第100代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现导致M蛋白V140F、A231V和D290E氨基酸变异，H蛋白H477L和R519I氨基酸变异，F蛋白N209S和L390F氨基酸变异。
表明，犬瘟热病毒LT90株不同代次培养物病毒基因编码的氨基酸出现的共性的特征性变化很有可能是其亲本强毒株毒力降低的原因。
实施例3犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗的制备
1.病毒的增殖
将实施例1制备的犬瘟热病毒LT90株毒种同步接种Vero细胞悬液，加入含2％新生牛血清的DMEM培养液，置37℃、5％CO2培养。待80％细胞病变后，收获病毒，测定病毒滴度，置低温保存。
2.保护剂的配制
每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置高压蒸气灭菌(121℃30min)。
3.疫苗的制备
将上述制备并保存的病毒液与保护剂按1:1(体积比)混合，冻干。疫苗含量具体配比见表4。
表4犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗含量配比
组分 疫苗1 疫苗2 疫苗3
LT90株抗原(FAID<sub>50</sub>)/头份 10<sup>2.5</sup> 10<sup>3.5</sup> 10<sup>5.5</sup>
保护剂(V/V) 50％ 50％ 50％
实施例4犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗的免疫原性试验
28日龄以上的犬瘟热抗原抗体阴性犬20只随机分成4组，每组5只，免疫实施例3制备的犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗。第4组免疫疫苗1，第5组免疫疫苗2，第6组免疫疫苗3，第7组为对照组。免疫21日后攻毒，均用犬瘟热病毒LT株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表5。
表5犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗的免疫原性试验结果
Figure BDA0002552976270000131
结果显示，采用实施例3制备的犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗免疫犬后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护，而对照组犬攻毒后全部发病。
证明了三个试验组犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性。
实施例5犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗的免疫原性对比试验
将45日龄犬瘟热病毒抗原抗体阴性犬15只随机分成3组，5只/组。第8组免疫实施例3制备的犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗疫苗1；第9组免疫商品化犬瘟热、细小病毒二联活疫苗(Onderstepoort株，北美-1型)；第10组为对照组。免疫21日后攻毒，均用犬瘟热病毒LT株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表6。
表6犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗的免疫原性对比试验结果
Figure BDA0002552976270000141
结果显示，采用实施例3制备的犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗免疫犬后，可阻断病毒感染(不出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护；对照组犬攻毒后全部发病；而现有商品化的疫苗不能对犬完全保护。
证明了犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗具有很好的保护力，针对现有流行株显示出比现有商品化疫苗更好的免疫保护和安全性。
实施例6犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗的临床试验
分别挑选河北、河南、陕西、湖北四地发生犬瘟热的犬场，对未出现临床症状的犬进行隔离，采集眼鼻肛拭子进行PCR检测，并免疫实施例3制备疫苗1，每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表7。
表7犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗的临床试验免疫结果
Figure BDA0002552976270000151
结果显示，采用实施例3制备的犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗免疫不同地区发病犬后，均可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％保护，说明本发明的犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗在临床能治疗感染了犬瘟热病毒的犬。
证明了本发明犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗具有很好的保护力，针对不同地域犬瘟热病毒感染显示出很好的免疫保护和安全性。
进一步将免疫前感染犬瘟热病毒的犬在逐步恢复正常后每组(11～14组)随机选取5只，另再选取犬瘟热病毒抗原抗体阴性犬5只作为对照，均用犬瘟热病毒LT株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表8。
表8犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗的临床试验攻毒结果
Figure BDA0002552976270000161
结果显示，各免疫过实施例3制备的犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗的犬，在攻毒后均未出现临床症状，能为犬提供100％(5/5)保护；对照组犬攻毒后全部发病。这说明本发明的犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗免疫后能对反复感染的犬只具有延长保护作用，保护率为100％。
进一步证明了本发明犬瘟热病毒LT90株弱毒活疫苗具有很好的保护力，可阻断犬瘟热病毒的连续感染。
实施例7犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗的制备
1.病毒的增殖
将犬细小病毒JM35株毒种同步接入F81细胞悬液，加入含有90％～98％体积比的RPMI 1640培养液和2％～10％体积比的新生牛血清的细胞生长液(pH调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下培养。待细胞病变达到80％左右时冻融收毒，并进行病毒含量测定，置低温保存。
2.保护剂的配制
每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置高压蒸气灭菌(121℃，30min)。
3.疫苗的制备
将上述制备并保存的犬细小病毒JM35株病毒液和实施例3制备并保存的犬瘟热病毒LT90株病毒液按比例混合，并与保护剂按1:1(体积比)混合，冻干。疫苗含量具体配比见表9。
表9犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗含量配比
组分 疫苗4 疫苗5
LT90株抗原(FAID<sub>50</sub>)/头份 10<sup>3.5</sup> 10<sup>5.5</sup>
JM35株抗原(FAID<sub>50</sub>)/头份 10<sup>5.0</sup> 10<sup>6.0</sup>
保护剂(V/V) 50％ 50％
实施例8犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗的免疫原性试验
28日龄以上的犬瘟热、犬细小病毒抗原抗体阴性犬30只随机分成6组，每组5只，免疫实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗。第16组、第17组免疫疫苗4，第18组、第19组免疫疫苗5，第20组、第21组为对照组。
第16组、第28组和第20组免疫21日后攻毒，均用犬瘟热病毒LT株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表10。
表10犬二联活疫苗犬瘟热部分免疫原性试验结果
Figure BDA0002552976270000171
结果显示，采用实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗免疫犬后，可阻断犬瘟热病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，而对照组犬攻毒后全部发病。
第17组、第19组和第21组免疫14日后攻毒，均用犬细小病毒JM株以皮下注射4ml(106.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录。具体结果见表11。
表11犬二联活疫苗犬细小部分免疫原性试验结果
Figure BDA0002552976270000181
结果显示，采用实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗免疫犬后，可阻断犬细小病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，而对照组犬攻毒后全部发病。
证明了本发明提供的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性，有效预防犬瘟热、犬细小病毒病的发生。
实施例9犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗免疫原性对比试验
将45日龄犬瘟热、犬细小病毒抗原抗体阴性犬30只随机分成6组，5只/组。第22组、第23组免疫实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗疫苗4；第24组、第25组免疫商品化犬瘟热、细小病毒二联活疫苗(Onderstepoort株)；第26组、第27组为对照组。
第22组、第24组和第26组免疫21日后攻毒，均用犬瘟热病毒LT株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表12。
表12犬二联活疫苗犬瘟热部分免疫原性对比试验结果
Figure BDA0002552976270000191
结果显示，采用实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗免疫犬后，可阻断犬瘟热病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)；对照组犬攻毒后全部发病；而现有商品化的疫苗不能对犬完全保护。
第23组、第25组和第27组免疫14日后攻毒，均用犬细小病毒JM株以皮下注射4ml(106.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录。具体结果见表13。
表13犬二联活疫苗犬细小部分免疫原性对比试验结果
Figure BDA0002552976270000192
结果显示，采用实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗免疫犬后，可阻断犬细小病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，对照组犬攻毒后全部发病；而现有商品化的疫苗不能对犬完全保护。
证明了犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗具有很好的保护力，针对现有流行株显示出比现有商品化疫苗更好的免疫保护和安全性。
实施例10犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗的临床试验
10.1本发明犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗针对流行野毒株的治疗作用
挑选河南发生犬瘟热的犬场，对未出现临床症状的犬进行隔离，采集眼鼻肛拭子进行PCR检测，并进行基因鉴定为国内流行株亚洲-1型感染，经背景调查犬场正常免疫过商品化犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗。免疫实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗疫苗4，每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表14。
表14犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗的临床试验免疫结果
Figure BDA0002552976270000201
结果显示，采用实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗免疫犬瘟热发病犬后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％保护，说明本发明的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗在临床能治疗感染了犬瘟热病毒的犬。
证明了本发明犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗具有很好的保护力，针对商品化犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗免疫后犬瘟热病毒重新感染显示出很好的免疫保护和安全性。而是商品苗为北美-1型毒株制备，这不仅说明现有的商品苗不能针对现有的流行毒株进行预防，还说明了本发明的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗疫苗4能对犬瘟热流行野毒株具有临床治疗作用。
10.2本发明犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗免疫后针对反复感染的延长保护
进一步将10.1中免疫本发明疫苗4前感染犬瘟热病毒的犬在逐步恢复，完全正常后随机选取5只(28-1组)，另再选取犬瘟热病毒抗原抗体阴性犬5只作为对照(29组)，均用犬瘟热病毒LT株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/头剂量攻毒，攻毒后每日早晚对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录；同时，再将免疫前感染犬瘟热病毒的犬在逐步恢复完全正常后随机选取5只(28-2组)，另再选取犬细小病毒抗原抗体阴性犬5只作为对照(30组)，均用犬细小病毒JM株以皮下注射4ml(106.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录；具体结果见表15。
表15犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗的临床试验攻毒结果
Figure BDA0002552976270000211
结果显示，免疫过实施例7制备的犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗疫苗4的犬，免疫组在攻毒后均未出现临床症状，能为犬提供100％(5/5)保护；两个对照组犬攻毒后全部发病。
也进一步证明了本发明犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗具有很好的保护力，有效预防犬瘟热、犬细小病毒病的发生，免疫后针对反复感染具有延长保护，可阻断犬瘟热病毒的连续感染。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的犬瘟热病毒LT90株抗原和冻干保护剂；所述犬瘟热病毒LT90株抗原为犬瘟热病毒LT90株或其培养物的活的全病毒抗原，所述犬瘟热病毒LT90株保藏号为CCTCC NO.V202030。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述犬瘟热病毒LT90株抗原含量为≥102.5FAID50/头份；优选地，所述犬瘟热病毒LT90株抗原含量为102.5～105.5FAID50/头份；更优选地，所述犬瘟热病毒LT90株抗原含量为103.5～104.5FAID50/头份；所述犬瘟热病毒LT90株培养物为1～100代次的培养物。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述冻干保护剂包括SPGA、糖类、蛋白质、含有蛋白质的物质或/和缓冲液；优选地，糖类选自山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖，蛋白质选自白蛋白或者酪蛋白，所述含有蛋白质的物质为牛血清或者脱脂乳，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；更优选地，所述冻干保护剂为40w/v％蔗糖和8w/v％明胶的水溶液，所述冻干保护剂与抗原的比例为体积比1:1。
4.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括免疫量的犬细小病毒JM35株抗原，所述犬细小病毒JM35株抗原为所述犬细小病毒JM35株或其培养物的活的全病毒抗原，所述犬细小病毒JM35株保藏号为CCTCC NO.V201965。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述犬细小病毒JM35株抗原含量为≥104.0FAID50/头份；优选地，所述犬细小病毒JM35株抗原含量为104.0～106.5FAID50/头份；更优选地，所述犬细小病毒JM35株抗原含量为105.0～106.0FAID50/头份。
6.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述犬细小病毒JM35株培养物为1～100代次的培养物。
7.一种制备权利要求1所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：
步骤(1)扩增所述犬瘟热病毒LT90株或其培养物；
步骤(2)在所述步骤(1)扩增的犬瘟热病毒LT90株或其培养物中添加冻干保护剂，混匀。
8.一种制备权利要求4所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：
步骤(1)分别扩增所述犬瘟热病毒LT90株或其培养物、所述犬细小病毒JM35株或其培养物；
步骤(2)将所述步骤(1)所述扩增的犬瘟热病毒LT90株或其培养物、所述扩增的细小病毒JM35株或其培养物中添加冻干保护剂，混匀。
9.根据权利要求1～6任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬瘟热的药物中的应用。
10.犬瘟热病毒弱毒株LT90株，所述犬瘟热病毒LT90株保藏号为CCTCC NO.V202030。
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