CN103705916B

CN103705916B - 一种禽脑脊髓炎疫苗

Info

Publication number: CN103705916B
Application number: CN201410001529.5A
Authority: CN
Inventors: 王红; 范根成; 杜元钊; 郭伟伟; 宋新宇; 胡潇
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2014-01-02
Filing date: 2014-01-02
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2034-01-02
Also published as: CN103705916A

Abstract

本发明提供一种禽脑脊髓炎活疫苗，由抗原和保护剂组成的，其中抗原包含有保藏编号为CGMCC No.8505的禽脑脊髓炎弱病毒株。本发明制备的疫苗可有效预防禽脑脊髓炎，而且，作为抗原的禽脑脊髓炎病毒为弱毒株，通过水平传播感染在鸡体连续传代，均未见毒力返强现象，遗传性稳定，符合禽脑脊髓炎弱毒疫苗株无毒力返强的标准，制成的疫苗能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

Description

一种禽脑脊髓炎疫苗

技术领域

本发明属于家禽疫苗制备技术领域，具体涉及一种禽脑脊髓炎疫苗。

背景技术

禽脑脊髓炎（AE）是由禽脑脊髓炎病毒（AEV）引起的一种主要危害4周龄以下雏鸡，以侵害中枢神经系统引起非化脓性脑炎为主要病理特征的病毒性传染病，表现为运动失调、头颈震颤和后趾麻痹等神经症状，特别是头和颈部的震颤。因此，过去常称为“流行性震颤”。4周龄以下雏鸡感染AEV后，发病率一般为20%～60%，死亡率平均为25%，也可超过50%；成年鸡感染不表现神经症状，但可引起一过性产蛋下降，下降幅度为16%～43%，有的高达60%以上，但不出现神经症状，约两周后产蛋可恢复正常。但此时期所产的种蛋高度带毒，在孵化时呈现两种趋势：一部分鸡胚在孵化后期死亡；另一部分虽可孵化出壳，但在出壳时或出壳后数天内即能表现症状，这些雏鸡的粪便中带有大量病毒，能造成其他雏鸡的感染。禽脑脊髓炎在全世界均有发生，易感鸡群在一年四季均可发病，冬春发生较多。几乎所有鸡群最终都会被病毒感染，但临床发病率较低。

1930年，Jones首先在2周龄商品代洛岛红鸡发现AE，表现为震颤。1931年观察到两次暴发，发生在不同鸡场的1周龄和4周龄鸡群，这两个群源于同一种鸡群。在以后的两年间，在新英格兰地区多个州均发现了AE的暴发，因此又称为“新英格兰病”。1934年，Jones取自然发病鸡的脑组织滤液经脑内接种易感鸡复制出了本病。1938年，Van Roekel等指出：并不是总能观察到震颤，当出现震颤时随后会出现共济失调，因为此病有传染性和主要侵害中枢神经系统，所以提出称为“传染性禽脑脊髓炎”，后来缩为“禽脑脊髓炎”并于1939年被美国兽医协会委员会采用。1958年，Schaaf第一次报道通过免疫成功控制了本病。1960年Calnek等阐明了AE的流行病学，随后开发出了口服疫苗，成为当今世界商品鸡群控制AE的基础。该病现已遍布世界各地，很多国家和地区都有该病发生的报道。

我国许多省市，均有发生本病的报道，已给养禽业造成多方面的损失。1980年张泽纪首先在广东的雏鸡群中发现疑似AE。1982年李心平通过病理组织学确诊该病。1983年毕英佐通过流行病学、病理组织学确诊此病。姚大明、秦爱建、赵振华、姚永秀等相继进行了AEV的分离和鉴定工作及疫苗的研制与应用试验。近年来辽宁、江苏、黑龙江、河北、山东、内蒙古、福建、上海、河南、江西、陕西等地陆续出现AE的报道。黄骏明等用鸡脑敏感试验检测了哈尔滨市17个蛋鸡群，发现这些蛋鸡群对AE的污染率为95.1%。由此可见，该病在我国是广泛存在的。

对急性暴发AE的雏鸡没有有效的治疗方法。在育成期接种疫苗，能控制种鸡群在性成熟后不再发生感染，同时也能防止病毒经蛋途径扩散。此外，母源抗体能保护雏鸡在最易感的头2～3周抵抗AEV感染。商品产蛋鸡群也可以进行免疫接种，以防止由AE引起的一过行产蛋下降。世界上许多国家已经将活疫苗用于免疫接种多数鸡群，国内已研制成功灭活疫苗，可用于开产鸡或者限制使用活疫苗的地区，目前国内还没有活疫苗产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种禽脑脊髓炎活疫苗，即由筛选出的禽脑脊髓炎弱毒疫苗株作为抗原制备的疫苗，本发明的疫苗对目前流行的中国禽脑脊髓炎病毒的攻击能够提供良好的免疫保护效力。

本发明的禽脑脊髓炎活疫苗，由抗原和保护剂组成的，其中抗原包含有保藏编号为CGMCC No.8505的禽脑脊髓炎弱病毒株。

所使用的禽脑脊髓炎病毒YBF02株（禽脑脊髓炎病毒AvianEncephalomyelitis virus），该病毒株于2013年11月08日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8505。

其中的保护剂可以为目前使用的任一种病毒疫苗用保护剂，例如蔗糖和明胶，其在疫苗中的质量百分比终浓度分别为5%和1%；

为了提高疫苗保护剂的抗热性，在保护剂中还添加有酪蛋白酸钠，添加的质量百分比浓度为0.5%，使疫苗在冷冻条件长期保存后，效力仍能达到标准。

上述的疫苗中加入了抗生素，青霉素、链霉素终浓度为200单位/ml；

上述的疫苗的制备方法，是将禽脑脊髓炎病毒接种鸡胚，收获胚液和鸡胚脑、胃、肠、胰腺，混合研磨、冻融、离心后取上清获得病毒液；加入保护剂制成的。

本发明制备的疫苗可有效预防禽脑脊髓炎，而且，作为抗原的禽脑脊髓炎病毒为弱毒株，通过水平传播感染在鸡体连续传代，均未见毒力返强现象，遗传性稳定，符合禽脑脊髓炎弱毒疫苗株无毒力返强的标准，制成的疫苗能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本领域的普通技术人员在本发明技术方案的基础上，可以选用本领域常用的方法步骤，而不仅限于本发明说明书实施例的具体记载。

实施例1：禽脑脊髓炎病毒株的选育

取患有禽脑脊髓炎雏鸡的脑、胰腺和十二指肠，在无菌条件下研磨，用灭菌生理盐水作1:5稀释、反复冻融3次、4000rpm离心30分钟，取上清液滤器过滤后，脑内接种1日龄SPF雏鸡10只，0.1ml/只，待出现运动失调、头颈震颤等症状后采血致死，无菌取病雏鸡的脑、胰腺和十二指肠，在无菌条件下研磨，用灭菌生理盐水作1:5稀释，反复冻融3次、4000rpm离心30分钟，取上清液作为第1代分离毒（F1）保存备用。取F1代同上方法脑内接种1日龄SPF雏鸡传代，制备第2代分离毒（F2）。如此连传4代。鸡胚致病性试验表明分离毒为一株非鸡胚适应性的禽脑脊髓炎病毒弱毒。取1日龄SPF雏鸡传代的F4代种毒，10倍稀释后，卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，继续在37～38℃孵育至16日龄收毒：吸取胚液，观察胚体活动和发育情况，称胚体重和脑重，检查胚体，胚脑病变（出血，积水，萎缩等）；并取胚脑，胃，肠，胰腺，用胚液作1:5稀释，加双抗，研磨，反复冻融3次，4000rpm离心30分钟，制成悬液备用。这样连续传至第18代。选取作为疫苗研制的候选毒株AEV YBF02株，并于2013年11月08日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8505。

AEV YBF02株毒种安全性试验：分别将基础种子的第5、7、10代毒种稀释，取1～10周龄SPF鸡各10只，每只刺种或口服10⁴EID₅₀的YBF02株病毒，观察28日，并记录结果。结果表明：AEV YBF02株基础种子第5、7、10代毒种对1～10周龄SPF鸡是安全的，无任何禽脑脊髓炎特异性症状，不影响生长发育。

表1：AEV YBF02株安全性试验结果

毒力返强试验：将YBF02株F5代基础毒种通过3～8周龄的SPF鸡同居感染途径连传5代，取各代次病毒分别脑内接种1日龄SPF雏鸡、刺种接种28日龄SPF雏鸡和高峰产蛋鸡，观察传代后的各代次毒对1、28日龄SPF鸡及产蛋鸡的致病性。结果表明：各代次的毒力基本相同，毒力没有返强，仍为非鸡胚适应的弱毒。符合禽脑脊髓炎弱毒疫苗株无毒力返强的标准，可以作为疫苗毒株进行商品化开发。

上述毒种安全性试验结果和毒力返强试验结果说明本发明筛选的禽脑脊髓炎病毒弱毒疫苗株YBF02株是安全的，可以用来制备疫苗。

AEV YBF02株的免疫效力检测

分别将AEV YBF02株的第1、7、10、14、18代毒种稀释，取1～10龄SPF鸡各10只，每只刺种10^3.0EID₅₀的病毒，28日后，与10只同日龄、同条件下饲养的SPF对照鸡，脑内接种VR株禽脑脊髓炎强毒，10^3.0EID₅₀/只，观察28日。结果表明：AEV YBF02株第1、7、10、14、18代毒种的免疫效力差异不显著，具有良好的免疫保护性，10只免疫鸡均保护至少9只，而10只对照鸡9只发病。说明AEV YBF02株毒种在18代以内其免疫原性基本一致，具有良好免疫保护性。

表2：AEV YBF02株免疫效力检测试验结果

用YBF02株制成的活疫苗的实际免疫效果表明，用YBF02株接种后14日检测到ELISA抗体，28日抗体100%阳性，80%以上抗体阳性可维持到53周。同时在免后14日、21日、28日用禽脑脊髓炎病毒强毒VR株进行脑内攻毒，结果保护率达到100%，证明YBF02株能有效的对雏鸡进行免疫，具有制备疫苗的应用前景。而且，当用分离YBF02株制备的活疫苗同英特威、意大利、以色列等生产的活疫苗进行免疫效果对比试验，用爱德士ELISA试剂盒检测血清抗体，阳性率分别为100%、90%、80%、80%，用YBF02株制备的活疫苗效果最好。分子生物学分析表明筛选的禽脑脊髓炎病毒与已知的禽脑脊髓炎病毒存在序列上的差异，为一新型的病毒株。

实施例2禽脑脊髓活疫苗的制备及应用

1 材料

1.1 毒种制造疫苗用禽脑脊髓炎病毒选用分离的保藏编号为：CGMCCNo.8505的弱毒YBF02株。

1.2 检验用毒检验用禽脑脊髓炎病毒强毒VR株，由中国兽医药品监察所鉴定、保存、供应。

1.3 种蛋及试验鸡

1.3.1 SPF种蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.3.2 7～14日龄SPF鸡 SPF种蛋购北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，购回后自行孵化，出雏后负压隔离器饲养。

1.4 制苗用其它仪器、试剂均由青岛易邦生物工程有限公司提供。

2 方法

2.1 制苗材料选择选择发育良好的6日龄SPF鸡胚作为制苗材料。

2.2 制苗用毒液的制备禽脑脊髓炎病毒液的制备取毒种，用无菌生理盐水或PBS作100倍稀释，卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育至16日龄收毒。收毒前将鸡胚置2～8℃冻死，检查鸡胚病变，收取鸡胚胚液、脑、胃肠、胰腺，称重后用胚液1:5稀释，匀浆冻融3次，4000r/min离心30分钟，取上清混合分装于无菌容器中，置2～8℃保存，不超过20日。同时取样进行半成品检验。

2.3 半成品检验

2.3.1 无菌检验按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。

2.3.2 病毒含量测定将禽脑脊髓炎病毒液用无菌生理盐水或PBS作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74个稀释度，各卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，另取10枚同批次SPF鸡胚不接种作为对照。37℃继续孵育至正常出雏日的3日后，统计其未出壳胚数、特异性死亡雏数及有禽脑脊髓炎特异性临床症状的雏鸡数，按照Reed-Muench法计算EID₅₀。病毒含量应≥10^5.5EID₅₀/0.2ml，对照鸡胚应至少8枚按时出雏，且出雏鸡均无禽脑脊髓炎的特异性临床症状。

2.4 配苗及分装将检验合格的病毒液按规定羽份加入5%蔗糖明胶作稳定剂，最终蔗糖含量为5%，明胶含量为1%，同时加入适宜的抗生素（青霉素、链霉素终浓度均为200单位/ml），充分摇匀，定量分装。每羽份病毒含量：禽脑脊髓炎病毒YBF02株≥10^3.5EID₅₀。

为了提高疫苗保护剂的抗热性，在保护剂中还添加有0.5%酪蛋白酸钠。

2.5 冻干分装后迅速进行冷冻真空干燥。

2.6 成品检验

2.6.1 性状观察疫苗的外观颜色、性状、与瓶壁脱离情况及加稀释液后溶解情况。

2.6.2 无菌检验按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。

2.6.3 支原体检验按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。

2.6.4 外源病毒检验按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。

2.6.6 安全检验用7～14日龄SPF鸡10只，各口服0.2ml(含10羽份)或刺种10羽份疫苗，观察21日，应全部健活，无任何局部或全身不良反应。

2.6.7 效力检验下列方法任择其一。

2.6.7.1 用鸡胚检验按瓶签注明的羽份，将疫苗用灭菌生理盐水或PBS稀释至l羽份/0.2ml，再作10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-54个稀释度，分别卵黄囊内接种6日龄鸡胚10枚，每胚0.2m1，另取10枚同批次SPF鸡胚作为对照。37℃孵育（48h内死亡者弃去，不入记录）至正常出雏日的3日后，统计其未出壳胚数、特异性死亡雏数及有禽脑脊髓炎特异性临床症状雏鸡数，按Reed-Muench法计算EID₅₀，每羽份应≥10^3.0EID₅₀。对照鸡胚应至少8枚按时出雏，且出雏鸡均无禽脑脊髓炎的特异性临床症状。

2.6.7.2 用鸡检验取1～10周龄SPF鸡10只，每只口服或刺种疫苗1羽份。21日后，连同10只对照鸡，脑内接种VR株禽脑脊髓炎强毒，10³EID₅₀/只，观察28日。对照鸡应至少8只死亡或出现禽脑脊髓炎特异性症状，免疫鸡应至少8只保护。

2.6.8 剩余水分测定按2010年版《中国兽药典》附录方法进行。

2.6.9 真空度测定按2010年版《中国兽药典》附录方法进行。

3 结果

3.1 半成品检验结果

3.1.1 无菌检验按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，均无菌生长。

3.1.2 病毒含量测定禽脑脊髓炎毒液病毒含量为10^5.5EID₅₀/0.2ml。

3.2 成品检验结果

3.2.1 性状微黄色海绵状疏松团块，上下摇晃时，样品很容易与瓶壁脱离。加入稀释液后均迅速溶解。

3.2.2 无菌检验疫苗随机取样10瓶，分别用无菌生理盐水或PBS恢复原量，每瓶分别按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。均无细菌、霉菌生长。

3.2.3 支原体检验疫苗随机取样5瓶，分别用无菌生理盐水或PBS恢复原量并混合，按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。疫苗均无支原体生长。

3.2.4 外源病毒检验

3.2.4.1 鸡胚检查法疫苗取样3瓶，用无菌生理盐水或PBS恢复原量后作适当稀释后混合，与等量抗禽脑脊髓炎病毒特异性血清混合，37℃中和l小时。接种鸡胚进行检验。结果显示，检验鸡胚每组均10/10存活，胎儿均发育正常，绒毛尿囊膜均无病变，鸡胚液对1%鸡红细胞凝集试验均为阴性。

3.2.4.2 细胞检查法

3.2.4.2.1 取处理过的样品各接种2瓶已长成良好单层的鸡胚成纤维细胞各0.2ml，观察7日。检验均无细胞病变，且无红细胞吸附现象。

3.2.4.2.2 禽白血病病毒检验取处理过的样品各接种2瓶已长成良好单层的鸡胚成纤维细胞各2ml，同时设阴性对照（正常细胞）和阳性病毒作对照,同样品连传3代，取3代细胞培养物（包括样品和所有对照组）冻融3次，并作上标记，用禽白血病病毒试剂盒进行ELISA检测。样品检验结果均为阴性。

3.2.4.3 鸡检查法样品用无菌生理盐水或PBS作适当稀释，接种14日龄的SPF鸡各20只，每只同时点眼、滴鼻接种10羽份，肌肉注射100羽份，免后21日，按上述方法和剂量重复接种1次，第1次接种后42日采血，进行有关病原的血清抗体检测。结果显示，检验疫苗接种鸡后42日内，鸡只均健康，无因疫苗引起的局部或全身症状和不良反应或死亡。进行血清抗体检测时，除本疫苗所产生的特异性抗体外，无其他病原的抗体存在。结果见表3。

表3：本发明制备的疫苗的外源病毒的检测结果

综上所述，鸡胚检查法、细胞检查法及鸡检查法结果均说明疫苗外源病毒检验合格。

3.2.5 安全检验疫苗取样3瓶，分别用无菌生理盐水或PBS恢复原量后作适当稀释，各口服0.2ml(含10羽份)或刺种10羽份疫苗，观察21日。结果显示，接种鸡只均无任何不良反应，且10/10健活。

3.2.6 效力检验

3.2.6.1 用鸡胚检验按瓶签注明的羽份，将疫苗用灭菌生理盐水或PBS稀释至l羽份/0.2ml，再作10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-54个稀释度，分别卵黄囊内接种6日龄鸡胚10枚，每胚0.2m1，另取10枚同批次SPF鸡胚作为对照。37℃孵育（48h内死亡者弃去，不入记录）至正常出雏日的3日后，统计其未出壳胚数、特异性死亡雏数及有禽脑脊髓炎特异性临床症状雏鸡数，按Reed-Muench法计算EID₅₀，结果：每羽份为10^3.1EID₅₀。对照鸡胚8枚按时出雏，且出雏鸡均无禽脑脊髓炎的特异性临床症状。

3.2.6.2 用鸡检验取1～10周龄SPF鸡10只，每只口服或刺种疫苗1羽份。21日后，连同10只对照鸡，脑内接种VR株禽脑脊髓炎强毒，10³EID₅₀/只，观察28日。结果：对照鸡8只死亡或出现禽脑脊髓炎特异性症状，免疫鸡10只保护。

3.2.8 剩余水分测定疫苗取样4瓶用真空干燥法进行检验。结果检验样品剩余水分含量在2.0%～2.7%，均≤4%。说明疫苗剩余水分测定检验均合格。

3.2.9 真空度测定疫苗分别用真空检漏仪进行检验。结果检验样品均呈紫色辉光。说明疫苗真空度测定检验均合格。

为了提供疫苗的保存时间，本申请对疫苗的保护剂进行优化，最终制成的疫苗中包含有质量百分比浓度为5%的蔗糖、1%明胶和0.5%的酪蛋白酸钠（将1ml疫苗视为1g）。通过添加上述的组分，可以使疫苗在长期保存后，还能保持活力。在2～8℃条件下放置180日，其抗体效价基本不变，放置360日，其抗体阻断率下降2-3个百分点，仍高于规定的标准；而用普通保护剂冻干的产品，在2～8℃条件下放置180日，其抗体效价基本上能达到规定的标准，但放置360日和720日后抗体效价下降很快，尤其720日后不可再使用，只能按报废品处理。

Claims

1.一种禽脑脊髓炎活疫苗，其特征在于，所述的禽脑脊髓炎活疫苗由抗原和保护剂组成，其中抗原为保藏编号为CGMCC No.8505的禽脑脊髓炎弱病毒株，保护剂包括蔗糖、明胶、酪蛋白酸钠和抗生素；所述的蔗糖和明胶在疫苗中的质量百分比终浓度分别为5％和1％，酪蛋白酸钠在疫苗中的质量百分比浓度为0.5％；所述的抗生素为青霉素、链霉素，青霉素、链霉素的终浓度分别为200单位/ml。

2.权利要求1所述的禽脑脊髓炎活疫苗的制备方法，是将禽脑脊髓炎病毒接种鸡胚，收获胚液和鸡胚脑、胃、肠、胰腺，混合研磨、冻融、离心后取上清获得病毒液；加入保护剂制成的。