CN101095896A - 一种治疗胆囊疾病的中药组合物及其指纹图谱分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中医药技术领域，具体为一种治疗胆囊疾病的中药组合物及其指纹图谱分析方法。该中药组合物由大黄、虎杖、青皮、陈皮、郁金、山楂、白茅根七味药材或者七味药材的提取物组成。这种中药组合物组成成分的指纹图谱具有一定数量的特征峰，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积符合一定的比例。本发明对于发展我国传统医药，促进人类健康具有十分重大的意义。

Description

一种治疗胆囊疾病的中药组合物及其指纹图谱分析方法
技术领域
本发明属于中医药技术领域，具体涉及一种治疗胆囊疾病的中药组合物及其指纹图谱分析方法，用本指纹图谱分析方法得到的结果代表了该中药组合物特定的配比和工艺。
背景技术
胆结石是一种常见病，在我国，胆石症患者占人群的5％-10％左右，并呈逐年上升的趋势。目前的治疗方法主要分为手术和非手术两大类。手术治疗能够有效去除大部分成形的结石，但是不能真正改变患者体内的成石趋势，术后复发存在一定比例。而非手术治疗胆结石，以中医药为主的综合治疗体系目前已经基本形成，并且积累了丰富的经验。中医认为肝胆互为表里，肝胆疾病往往互相影响，肝病及胆，胆病及肝，经常同时出现，互为因果。因此，胆病从肝论治是中医中药治疗胆道疾病的基本治疗原则。而本中药组合物正是根据这一理论，结合现代药理和临床研究，开发成功的一个中药新药品种。
本中药组合物由大黄、虎杖、山楂、郁金、陈皮、青皮、白茅根七味药材制成，具有疏肝利胆、清热通下作用的中药片剂，适宜于治疗肝郁气滞型的慢性胆道感染、胆石病，包括无明显感染的肝胆管结石、胆囊结石、慢性胆囊炎与慢性胆管炎；能够明显降低肝脏胆汁中β-葡萄糖醛酸酶活力，降低胆汁中游离胆红素与钙离子的含量，逆转成石趋势，有明显的防石作用，并且能够作用于肝细胞水平，具有显著的抗脂变能力；能够使肝细胞的超微结构恢复正常，胆囊慢性炎症得到消退，促进胆汁分泌，同时对胆固醇类结石同样有效，能抑制成核因子，具有预防和溶解胆固醇结石的双重功效。
指纹图谱技术是国际上得到公认的一种中药分析方法。指纹图谱技术从整体上表征中药的化学成分和质量特征。对于组成和工艺一定的中药，其指纹图谱中特征指纹峰的保留时间和峰面积也是一定的；因此，指纹图谱上的指纹峰，及其保留时间和峰面积的相对值也反应了该中药组成和工艺的变化情况。
本发明提出了一种治疗胆囊疾病的中药组合物及其指纹图谱分析方法，并用指纹图谱分析结果对该中药组合物进行了描述。本发明对于发展我国传统医药，促进人类健康具有十分重大的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗胆囊疾病的药物及其指纹图谱分析方法。
本发明所涉及的治疗胆囊疾病的中药组合物由大黄、虎杖、山楂、郁金、陈皮、青皮、白茅根共七种中药混合制成，其中各药材可以直接使用，可以使用药材的提取物。本发明所涉及的治疗胆囊疾病的药物，其中包含黄酮类和蒽醌类等共8种主要化学成分，药物提取后，使用高效液相色谱法，对其指纹图谱进行分析。其中高效液相色谱分析使用蒸发光散射检测器、质谱检测器、电雾式检测器、紫外检测器中的一种或多种。
本发明针对中药中主要成分用高效液相色谱法获取指纹图谱，其分析方法如下：
药物除去包衣，研成细粉，用甲醇和水的混合溶剂提取，提取方法用加热回流或超声提取方法，提取物经离心、滤过后用高效液相色谱法分析。所使用色谱柱型号为反相C18色谱柱；流动相由水相A和有机相B组成，梯度洗脱，检测器使用紫外检测器(UV)、蒸发光散射检测器(ELSD)或者质谱检测器(MS)。
进一步的分析方法如下：
药物除去包衣，研成细粉，用甲醇和水的混合溶剂提取，提取方法用加热回流或超声提取方法，提取物经离心、过滤后用高效液相色谱分析。所使用色谱柱型号为Dimonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)或ZORBAX SB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相由水相和有机相组成，水相为含0.05％甲酸的水溶液(用三乙胺调至pH为5)，有机相为乙腈；洗脱梯度为：有机相比例在40分钟内从15％线性增加至35％，从第40分钟至50分钟，有机相所占比例由35％线性增加至50％，再从第50分钟至60分钟，有机相所占比例由50％线性增加至100％，并保持100％比例至70分钟；检测器使用紫外检测器。
本发明所涉及的治疗胆囊疾病的中药组合物，用上述指纹图谱方法进行分析，各得到20个共有峰，这些共有峰的峰面积和保留时间的相对值代表了该中药组合物特定的配比和工艺。
在用液相色谱法所得指纹图谱20个共有峰中，9、11、12、18、19、20号峰为大黄药材特征峰，6、7、14、16、17号峰为陈皮药材特征峰，3、10、11、13、15、18、20号峰为虎杖药材特征峰，2号峰为白茅根药材特征峰，16号峰为郁金药材特征峰，6、7、14、15、17号峰为青皮药材特征峰，1、4、5号峰为山楂药材特征峰。其中5号峰为金丝桃苷(hyperin)、7号峰为橙皮苷(hesperidin)、10号峰为白藜芦醇(resveratrol)、15号峰为川陈皮素(nobiletin)、16号峰为姜黄素(curcumine)、18号峰为大黄素(emodin)、19号峰为大黄酚(chrysophanol)、20号峰为大黄素6-甲醚(physcion)的吸收峰。这些化合物的结构式见图1所示，这些化合物结构成了中药组合物的主要成分。
选取大黄素成分所对应的色谱峰为参照，计算所得指纹图谱中20个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。共有峰的相对保留时间与相对峰面积满足以下2种特征之一种：
第一种：
指纹图谱中存在着20个共有峰，以其中的大黄素所对应色谱峰为参照峰，以该峰的保留时间和峰面积值为基准，其它共有峰的相对保留时间和相对峰面积为：
    峰号   相对保留时间     相对峰面积
  123456789101112131415161718(大黄素)1920   0.05～0.180.06～0.240.08～0.260.15～0.380.20～0.400.24～0.450.28～0.500.30～0.520.32～0.600.36～0.720.40～0.760.48～0.800.50～0.940.65～0.960.78～0.970.82～0.980.90～0.991.001.01～1.151.02～1.22     0.01～0.200.01～0.300.01～0.400.01～0.450.12～4.120.01～0.800.02～2.250.01～1.200.01～1.100.01～1.200.01～2.450.06～0.250.01～0.800.01～0.800.02～1.200.01～1.200.02～1.201.000.01～0.800.02～1.00
第二种：
指纹图谱中存在着20个共有峰，以其中的大黄素所对应色谱峰为参照峰，以该峰的保留时间和峰面积值为基准，其它共有峰的相对保留时间和相对峰面积为：
    峰号     相对保留时间     相对峰面积
    123456789101112131415     0.09～0.140.10～0.200.12～0.220.23～0.320.26～0.340.30～0.380.34～0.430.37～0.440.40～0.500.47～0.620.54～0.660.68～0.770.85～0.900.85～0.930.91～0.95     0.01～0.080.03～0.090.02～0.100.03～0.120.78～3.300.05～0.430.10～1.250.03～0.390.03～0.220.03～0.410.27～1.450.06～0.250.04～0.100.02～0.070.08～0.49
 161718(大黄素)1920     0.95～0.970.98～0.991.001.02～1.071.06～1.09     0.06～0.160.01～0.211.000.02～0.090.09～0.16
 21(大黄素)2223     1.00～0.001.05～0.061.07～0.06     1.00～0.000.04～0.030.13～0.08
附图说明
图1为药物组合物中各化合物的结构式。
图2为药物组合物的指数图谱(采用LC-2010AHT液相色谱仪)。
图3为药物组合物的指数图谱(采用安捷伦1100高效液相色谱仪)。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明。
实施例1：中药组合物中主要成分提取方法
取该中药组合物片剂，除去包衣，在70℃下干燥，研成细粉，准确称取约100mg，置10ml容量瓶中，加入70％甲醇约8ml，超声提取40分钟，放冷至室温后用70％甲醇定容，混匀后过0.45μm微孔滤膜，取续滤液20μl，注入高效液相色谱仪中测定。
实施例2：中药组合物中主要成分提取方法
取该中药组合物片剂，除去包衣，在70℃下干燥，研成细粉，准确称取约250mg，置具塞锥形瓶中，准确加入70％甲醇25ml，称重，回流提取1小时，放冷至室温后用70％甲醇补足重量，混匀后以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液20μl，注入高效液相色谱仪中测定。
实施例3：中药组合物指纹图谱分析方法
采用LC-2010AHT液相色谱仪，色谱柱型号为Dimonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相由水相和有机相组成，水相为含0.05％甲酸的水溶液(用三乙胺调至pH为5)，有机相为乙腈；洗脱梯度为：有机相比例在40分钟内从15％线性增加至35％，从第40分钟至50分钟，有机相所占比例由35％线性增加至50％，再从第50分钟至60分钟，有机相所占比例由50％线性增加至100％，并保持100％比例至70分钟；检测器使用紫外检测器，检测波长346nm；流速每分钟0.8ml；柱温25℃。所得指纹图谱如附图2所示，图中包含20个特征峰。
实施例4：中药组合物指纹图谱分析方法
采用安捷伦1100高效液相色谱仪，色谱柱型号为安捷伦Z0RBAX SB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相由水相和有机相组成，水相为含0.05％甲酸的水溶液(用三乙胺调至pH为5)，有机相为乙腈；洗脱梯度为：有机相比例在内40分钟从15％线性增加至35％，从第40分钟至50分钟，有机相所占比例由35％线性增加至50％，再从第50分钟至60分钟，有机相所占比例由50％线性增加至100％，并保持100％比例至70分钟；检测器使用紫外检测器，检测波长346nm；流速每分钟0.8ml；柱温25℃。所得指纹图谱如附图3所示，图中包含20个特征峰。
实施例5：不同批次中药组合物指纹图谱的特征峰分析
取本发明所涉及的8个批次中药组合物，按下表所示提取方法和指纹图谱分析方法得到指纹图谱：
批次编号     提取方法     指纹图谱方法
    1     实施例1     实施例3
    2     实施例1     实施例3
    3     实施例2     实施例3
    4     实施例2     实施例3
    5     实施例1     实施例4
    6     实施例1     实施例4
    7     实施例2     实施例4
    8     实施例2     实施例4
指纹图谱(附图1)中确定了20个共有峰。以大黄素所对应色谱峰(18号峰)为参照，计算得到各指纹图谱特征峰相对值如附表1。
附表1    8批中药组合物指纹图谱的特征峰分析
Figure A20071004001400091

Claims (4)

1.一种治疗胆囊疾病的中药组合物的指纹图谱分析方法，其特征在于：针对中药组合物中的主要成分，采用高效液相色谱法获取指纹图谱，具体步骤如下：
药物除去包衣后研成细粉，用有机溶剂、水或者两者的混合溶剂提取，提取方法用加热回流或超声提取方法，提取物经离心、滤过后用高效液相色谱法分析。所使用色谱柱型号为反相C18色谱柱；流动相由水相A和有机相B组成，水相为含0.05％～0.5％甲酸的水溶液，有机相为乙腈或甲醇；梯度洗脱，有机相所占比例逐步升高；检测器使用紫外检测器、蒸发光散射检测器或者质谱检测器。
2.根据权利要求1所述的中药组合物的指纹图谱分析方法，其特征在于：针对中药中的8种主要成分，采用高效液相色谱法获取主要成分的指纹图谱，具体步骤如下：
药物除去包衣后研细，用甲醇和水的混合溶剂提取，提取方法用加热回流或超声方法，提取物经离心、过滤后用高效液相色谱分析；所使用色谱柱型号为Dimonsil C18色谱柱或ZORBAX SB-C18色谱柱；流动相由水相和有机相组成，水相为含0.1％甲酸的水溶液，用三乙胺调至pH为5，有机相为乙腈；洗脱梯度程序为：有机相比例在40分钟从15％线性增加至35％，从第40分钟至50分钟，有机相所占比例由35％线性增加至50％，再从第50分钟至60分钟，有机相所占比例由50％线性增加至100％，并保持100％比例至70分钟；检测器使用紫外检测器；
针对中药中的主要成分所得的高效液相色谱指纹图谱，其中含有8种主要化合物，分别为金丝桃甙，橙皮苷，白藜芦醇，川陈皮素，姜黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。
3.一种治疗胆囊疾病的中药组合物，其特征在于：用权利要求1或2所述的指纹图谱分析方法和对该中药组合物进行分析，组合物的主要成分在得到的指纹图谱中存在20个共有峰，其中，9、11、12、18、19、20号峰为大黄药材特征峰，6、7、14、16、17号峰为陈皮药材特征峰，3、10、11、13、15、18、20号峰为虎杖药材特征峰，2号峰为白茅根药材特征峰，16号峰为郁金药材特征峰，6、7、14、15、17号峰为青皮药材特征峰，1、4、5号峰为山楂药材特征峰；其中5号峰为金丝桃苷、7号峰为橙皮苷、10号峰为白藜芦醇、15号峰为川陈皮素、16号峰为姜黄素、18号峰为大黄素、19号峰为大黄酚、20号峰为大黄素6-甲醚的吸收峰。
4.根据权利要求3所述的治疗胆囊疾病的中药组合物，其特征在于：主要成分在指纹图谱中存在着20个共有峰，以其中的大黄素所对应色谱峰为参照峰，以该峰的保留时间和峰面积值为基准，其它共有峰的相对保留时间和相对峰面积具有如下两种情形之一种：
第一种：
    峰号     相对保留时间     相对峰面积     1234567891011121314151617181920     0.05～0.180.06～0.240.08～0.260.15.～0.380.20～0.400.24～0.450.28～0.500.30～0.520.32～0.600.36～0.720.40～0.760.48～0.800.50～0.940.65～0.960.78～0.970.82～0.980.90～0.991.001.01～1.151.02～1.22     0.01～0.200.01～0.300.01～0.400.01～0.450.12～4.120.01～0.800.02～2.250.01～1.200.01～1.100.01～1.200.01～2.450.06～0.250.01～0.800.01～0.800.02～1.200.01～1.200.02～1.201.000.01～0.800.02～1.00
第二种：
    峰号     相对保留时间     相对峰面积     1234567891011121314151617181920     0.09～0.140.10～0.200.12～0.220.23～0.320.26～0.340.30～0.380.34～0.430.37～0.440.40～0.500.47～0.620.54～0.660.68～0.770.85～0.900.85～0.930.91～0.950.95～0.970.98～0.991.001.02～1.071.06～1.09     0.01～0.080.03～0.090.02～0.100.03～0.120.78～3.300.05～0.430.10～1.250.03～0.390.03～0.220.03～0.410.27～1.450.06～0.250.04～0.100.02～0.070.08～0.490.06～0.160.01～0.211.000.02～0.090.09～0.16
这些共有峰的峰面积和保留时间相对值代表了该中药组合物特定的配比和工艺。
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