CN104749280A - 一种丹参注射液的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种丹参注射液的质量控制方法。该方法采用HPLC测定丹参注射液中原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸、咖啡酸、异阿魏酸，或还包括原儿茶酸和丹参素钠的含量，具有简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，尤其是一种丹参注射液的质量控制方法。
背景技术
中药丹参为双子叶植物唇形科(Labiatae)鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhizaBge.)的干燥根及根茎，具有活血通经、除烦清心、凉血消肿等功效。现代医学与临床实验表明，丹参在心血管方面有扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量、减慢心率、改善心肌缺氧、改善急性症状和心电图提示的缺血性改变、抑制血小板凝集、抑制血小板的释放反应、降低血粘度、降低血脂、对抗红细胞聚集、减轻动脉粥样硬化、可抑制纤维蛋白原转变成纤维蛋白、改善微循环、中枢镇静及抗菌消炎等作用，可用于治疗冠心病之心绞痛、胸闷、心悸、心肌梗塞、心肌炎等症，用于抗血栓形成和抗凝。
丹参的主要的活性成分为脂溶性丹参酮(二萜醌)和水溶性丹参酚酸类化合物。迄今为止，从丹参里分离得到了七十余个丹参酮类化合物和三十多个丹参酚酸类化合物，包括丹参酮IIA(Tanshinone IIA)、丹参酮I(Tanshinone I)，隐丹参酮(cryptotanshinone)、二氢丹参酮I(15,16-dihydrotanshinone I)、丹参素、原儿茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B(Salvianolic acid B)、丹酚酸C、迷迭香酸等。
丹参注射液是丹参经加工制成的灭菌水溶液。收载于中药部颁标准第20卷，书页号：Z20-34，标准编号：WS3-B-3766-98。标准规定制法为：取丹参1500g，加水煎煮三次，第一次2小时，第二、三次各1.5小时,合并煎液,滤过，滤液减压浓缩至750ml。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量为75％，第二次使含醇量为85％，每次均冷藏放置后滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至约250ml，加注射用水至400ml,混匀,冷藏放置，滤过，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，煮沸半小时，滤过，加注射用水至1000ml,灌封，灭菌，即得。该产品为棕色至棕红色的澄明液体。pH值在5.0～7.0之间。每1ml含原儿茶醛(C7H6O3)不得少于0.2mg。主要功能活血化瘀，通脉养心。用于冠心病胸闷，心绞痛。肌内注射和静脉注射均可。丹参注射液在制备的过程中，经过了加热、灭菌酸碱处理等一系列过程，其化学组成和含量不可避免地发生了变化，并且不同批次和不同生产厂家的丹参注射液中所含化学成分的种类和含量也可能存在很大差别。因此，对丹参水溶性成分的成分进行系统地研究，最大限度地鉴定其结构，并研究这些化合物在产品中所占的含量比例，对丹参注射液的质量控制和作用机理研究具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种丹参注射液的质量控制方法，是对其中原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸、咖啡酸、异阿魏酸，或还包括原儿茶酸和丹参素钠的含量进行测定。
当测定原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸、咖啡酸、异阿魏酸的含量时，本发明的方法包括下列步骤：
(1)对照品溶液的制备
原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B对照品贮备液：分别精密称取3mg原儿茶醛对照品和2mg迷迭香酸对照品，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液；分别精密称取2.9mg丹酚酸B对照品，置于5ml容量瓶中，精密量取1ml原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液置于此容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得含0.58mg/ml丹酚酸B、0.30mg/ml原儿茶醛和0.20mg/ml迷迭香酸的对照品贮备液；
原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；
咖啡酸和异阿魏酸对照品贮备液：分别精密称取2.8mg咖啡酸对照品和1.2mg异阿魏酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀；精密量取250μl所配溶液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含28μg/ml咖啡酸、12μg/ml异阿魏酸的对照品贮备液；
咖啡酸和异阿魏酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；
紫草酸对照品贮备液：精密称取精密称取1.4mg紫草酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得紫草酸对照品母液；精密量取1.25ml紫草酸对照品母液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含70μg/ml紫草酸的对照品贮备液；
紫草酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
取丹参注射液加水稀释5倍，或用PVDF亲水滤膜过滤或离心后加水稀释5倍，备用；
(3)含量测定
吸取上述供试品溶液注入液相色谱仪，使用HPLC法进行测定，色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为乙腈-磷酸水溶液，检测波长为280～290nm，流速为1.0mL/min，柱温为15～40℃，进样量为10μL，梯度洗脱程序如下，
系统适应性条件：分离度大于1.5，色谱峰理论塔板数不小于30000，对称因子在0.9～1.1之间；
按外标法以峰面积计算。
在本发明的一些实施方案中，所述检测波长为282nm、284nm、286nm、288nm或290nm，优选286nm。检测波长的变动对所有成分的峰面积测定都有不同程度的影响，尤其对丹参素钠和原儿茶酸的影响最为明显，且在286nm波长下，基线平稳，主要成分响应值高，谱图信息全面。
在本发明的一些实施方案中，当所述酚酸类化合物还包括原儿茶酸和丹参素钠时，本发明所述的检测波长为286nm，所述的对照品溶液的制备包括下列步骤：
丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B对照品贮备液：分别精密称取3mg原儿茶醛对照品和2mg迷迭香酸对照品，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液；分别精密称取7.2mg丹参素钠对照品和2.9mg丹酚酸B对照品，置于5ml容量瓶中，精密量取1ml原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液置于此容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得含1.44mg/ml丹参素钠、0.58mg/ml丹酚酸B、0.30mg/ml原儿茶醛和0.20mg/ml迷迭香酸的对照品贮备液；
丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；
咖啡酸和异阿魏酸对照品贮备液：分别精密称取2.8mg咖啡酸对照品和1.2mg异阿魏酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀；精密量取250μl所配溶液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含28μg/ml咖啡酸、12μg/ml异阿魏酸的对照品贮备液；
咖啡酸和异阿魏酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；
原儿茶酸和紫草酸对照品贮备液：精密称取1.2mg原儿茶酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得原儿茶酸对照品母液；精密称取1.4mg紫草酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得紫草酸对照品母液；精密量取0.25ml原儿茶酸对照品母液和1.25ml紫草酸对照品母液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含12μg/ml原儿茶酸、70μg/ml紫草酸的对照品贮备液；
原儿茶酸和紫草酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液。
在本发明的一些实施方案中，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱选自Shiseido Capcellpak MG C18柱、Agilent Zorbax SB C18柱、Waters Xbridge C18柱或Phenomenex Luna C18，优选Shiseido Capcell pak MG C18柱或Phenomenex Luna C18，更优选Shiseido Capcell pak MGC18，其中所述十八烷基硅烷键合硅胶柱进一步用Shiseido MG C18柱保护。对于丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B三个主要成分以及咖啡酸，不同色谱柱均能做到基线分离，峰面积RSD<3％。而迷迭香酸、原儿茶酸、紫草酸和异阿魏酸四种成分，仅能在两到三种色谱柱上达到基线分离，其中迷迭香酸、异阿魏酸与其邻近的杂质峰较难分开，如果选用不同色谱柱，可通过改变流动相条件来改善分离度。当上述四种成分色谱峰分离度>1.2时，记录峰面积并计算RSD或RAD(相对平均偏差)。数据显示迷迭香酸、原儿茶酸和紫草酸峰面积RSD<4％，异阿魏酸峰面积RAD<3％，说明不同色谱柱对峰面积影响较小。
在本发明的一些实施方案中，所述流动相为乙腈-磷酸水溶液，其中磷酸的体积百分比为0.01～0.10％，优选0.03％、0.05％或0.075％，更优选0.03％。流动相动相酸度对分离度有一定影响，且不同物质变化趋势不同，但在磷酸的体积百分比为0.03％、0.05％或0.075％的条件下几乎所有成分都能达到基线分离。丹参素钠、原儿茶醛等主要成分的峰面积受酸度影响较小，RSD<2％。紫草酸和异阿魏酸由于含量低，峰面积小，相对偏差较大，实际峰面积的偏差仍在可接受的系统波动范围内。
在本发明的一些实施方案中，所述柱温为20～35℃，优选30±0.8℃。柱温对9种酚酸类化合物的分离度影响较小，均能达到或接近基线分离，分离度均>1.4。随着温度上升，各成分保留时间减少，而大部分物质的理论塔板数也随之有一定幅度的降低。丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B四个主要成分峰面积RSD<2％，不同柱温对其影响不大。而由于原儿茶酸、紫草酸、咖啡酸和异阿魏酸含量较低，峰面积较小，其RSD达到了5％～8％，说明在测定含量较低的酚酸类成分时，有必要注意控温。
本发明的质量控制方法具有如下优点：
(1)以丹参注射液主要活性成分酚酸类为指标建立起来的质量控制方法，代表了丹参注射液大部分药理活性成分，能有效地表征丹参注射液的质量，从而对丹参注射液各组分最大程度的进行检测，有利于对其质量的全面控制；
(2)本发明的质量控制方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。
具体实施方案
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而不对本发明进行限制，任何形式的等同替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1丹参注射液中酚酸类成分的含量测定方法
1、仪器与试剂
高效液相色谱系统：Agilent 1100美国安捷伦科技公司(配置真空脱气机，自动进样器，四元泵，VWD G1314A，DAD G1315B；Agilent ChemStation A 10.02色谱工作站)。
丹参素钠对照品、原儿茶酸对照品、原儿茶醛对照品均购自中国药品生物制品检定所，迷迭香酸对照品、紫草酸对照品、丹酚酸B对照品、咖啡酸对照品、异阿魏酸对照品均购自上海友思生物技术有限公司；磷酸(85％)、甲酸(96％)、乙酸均购自Tedia(USA)，甲醇、乙腈均购自Burdick&Jackson(Honeywell，USA)，水由Mili-Q超纯水仪制备。
2、色谱条件与系统适应性试验
(1)色谱条件
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Shiseido Capcell pak MG C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱及Shiseido MG C18(4.6×12.5mm，5μm)保护柱；流动相：乙腈-0.03％磷酸水溶液；检测波长：286nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；梯度洗脱程序：见表1；色谱积分参数：见表2。
表1梯度洗脱程序
表2色谱积分参数
(3)系统适应性试验
在选定的色谱条件下，九个主要酚酸类成分丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异阿魏酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B均达到基线分离，分离度大于1.5，色谱峰理论塔板数不小于30000，对称因子在0.9-1.1之间。
3、对照品溶液的制备
由于样品中几个主要酚酸类成分含量及溶解度差异较大，将含量及溶解性相近的成分配成混标贮备液，量取不同体积后定容得到浓度适宜的标准曲线对照品溶液。具体操作方法如下。
丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B对照品贮备液：分别精密称取3mg原儿茶醛对照品和2mg迷迭香酸对照品，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液。分别精密称取7.2mg丹参素钠对照品和2.9mg丹酚酸B对照品，置于5ml容量瓶中，精密量取1ml原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液置于此容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得含1.44mg/ml丹参素钠、0.58mg/ml丹酚酸B、0.30mg/ml原儿茶醛和
0.20mg/ml迷迭香酸的对照品贮备液。
丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液。
咖啡酸和异阿魏酸对照品贮备液：分别精密称取2.8mg咖啡酸对照品和1.2mg异阿魏酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取250μl所配溶液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含28μg/ml咖啡酸、12μg/ml异阿魏酸的对照品贮备液。
咖啡酸和异阿魏酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液。
原儿茶酸和紫草酸对照品贮备液：精密称取1.2mg原儿茶酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得原儿茶酸对照品母液。精密称取1.4mg紫草酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得紫草酸对照品母液。精密量取0.25ml原儿茶酸对照品母液和1.25ml紫草酸对照品母液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含12μg/ml原儿茶酸、70μg/ml紫草酸的对照品贮备液。
原儿茶酸和紫草酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液。
上述操作重复3次，用于建立标准曲线。
4、供试品溶液的制备
取丹参注射液样品加水稀释5倍，即得。丹酚酸类成分极易溶于水，尼龙6微孔滤膜对酚酸类物质有一定吸附作用，且注射液产品中几乎不含固体颗粒杂质，因此供试品可直接进样，或经其他种类滤膜(如PVDF亲水滤膜)或离心后取上清进样以维护色谱柱。
5、线性及范围
采用外标标准曲线法，按3对照品溶液的制备项中步骤制备7个不同浓度的标准曲线对照品溶液，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以样品浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线。每个浓度的对照品溶液重复配置测定3次，将3次结果平均得到最终的标准曲线，见表3-表11。结果表明，8个被测定的化合物在标准曲线的线性范围内均呈良好的线性(R2>0.999)。
表3丹参素钠的标准曲线
表4原儿茶醛的标准曲线
表5迷迭香酸的标准曲线
表6丹酚酸B的标准曲线
表7原儿茶酸的标准曲线
表8紫草酸酸的标准曲线
表9咖啡酸的标准曲线
表10异阿魏酸的标准曲线
表118种酚酸类化合物的标准曲线
检测限(LOD)是信噪比(S/N)为3时的被测物浓度；定量限(LOQ)是信噪比(S/N)为10时的被测物浓度，通过重复测量2次求得平均值，得被测成分的检测限和定量限见表3-表11。
6、准确度
准确度验证采用向已知浓度的供试品溶液中加入已知量的对照品，计算回收的百分率。每个对照品设计3个不同浓度，每个浓度平行制备3份供试品溶液进行测定，用9个测定结果评价准确度。
丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B对照品贮备液：分别精密称取3.1mg原儿茶醛对照品和2mg迷迭香酸对照品，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液。分别精密称取7.4mg丹参素钠对照品和2.9mg丹酚酸B对照品，置于5ml容量瓶中，精密量取1ml原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液置于此容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得含1.48mg/ml丹参素钠、0.58mg/ml丹酚酸B、0.31mg/ml原儿茶醛和0.20mg/ml迷迭香酸的对照品贮备液。
丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B加标回收率供试品溶液：精密量取0.3，0.4，0.6ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得低、中、高三个浓度的混合对照品溶液。将丹参注射液加水稀释5倍，与对照品溶液等体积混合，每一浓度平行制备3份，得丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B加标回收率供试品溶液。
原儿茶酸和紫草酸对照品贮备液：精密称取1.2mg原儿茶酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得原儿茶酸对照品母液。精密称取1.45mg紫草酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得紫草酸对照品母液。精密量取0.5ml原儿茶酸对照品母液和2.5ml紫草酸对照品母液置于10ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含12μg/ml原儿茶酸、72.5μg/ml紫草酸的对照品贮备液。
原儿茶酸和紫草酸加标回收率供试品溶液：精密量取0.3，0.4，0.6ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得低、中、高三个浓度的混合对照品溶液。将丹参注射液加水稀释5倍，与对照品溶液等体积混合，每一浓度平行制备3份，得原儿茶酸、紫草酸加标回收率供试品溶液。
咖啡酸和异阿魏酸对照品贮备液：分别精密称取2.85mg咖啡酸对照品和1.35mg异阿魏酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取250μl所配溶液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含28.5μg/ml咖啡酸、13.5μg/ml异阿魏酸的对照品贮备液。
咖啡酸和异阿魏酸加标回收率供试品溶液：精密量取0.3，0.4，0.6ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得低、中、高三个浓度的混合对照品溶液。将丹参注射液加水稀释5倍，与对照品溶液等体积混合，每一浓度平行制备3份，得咖啡酸、异阿魏酸加标回收率供试品液。
将加标回收率供试品溶液用2色谱条件与系统适应性试验项的HPLC方法进行分析，通过计算测定的理论值和真实加入量的比值来计算回收率，结果见表12。结果表明，供试品平均回收率大于98％，小于102％，RSD小于3％，本方法具有良好的准确度。
表12准确度考察结果
7、精密度
(1)重复性考察
取同一瓶丹参注射液样品，平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，计算含量，结果见表13。结果显示，RSD小于2％，表明方法重复性良好。
表13重复性考察结果
(2)中间精密度试验
不同日期：取同一瓶丹参注射液样品，每天制备三份供试品溶液，分别精密吸取10μl注入液相色谱仪，测定峰面积，计算含量，连续分析三天，结果见表14。结果表明，RSD小于2％，方法精密度良好。
表14中间精密度试验——不同日期
不同人员：取同一瓶丹参注射液样品，由三名不同操作人员每人平行制备三份供试品溶液，分别精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，计算含量，结果见表15。结果表明，RSD小于2％，方法精密度良好。
表15中间精密度试验——不同人员
8、供试品稳定性考察
取同一份供试品溶液，分别在0，3，6，9，12，15，18，21，24小时进样，记录峰面积，计算含量，结果见表16。结果表明，RSD小于2％，供试品溶液在24小时内稳定。
表16稳定性考察
实施例2丹参注射液中酚酸类成分的含量测定方法
按照实施例1相同的含量测定方法对同一份丹参注射液供试品溶液进行检测，并将Shiseido Capcell pak MG C18(4.6×250mm，5μm)替换为Agilent Zorbax SB C18(4.6×250mm，5μm)、Waters Xbridge C18(4.6×250mm，5μm)或Phenomenex Luna C18(4.6×250mm，5μm)。比较四种色谱柱的图谱分离度及峰面积，结果见表17。结果表明：对于丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B三个主要成分以及咖啡酸，不同色谱柱均能做到基线分离，峰面积RSD<3％；对于迷迭香酸、原儿茶酸、紫草酸和异阿魏酸四种成分，可通过改变流动相条件以进一步改善分离度。当上述四种成分色谱峰分离度>1.2时，记录峰面积并计算RSD或RAD(相对平均偏差)。数据显示迷迭香酸、原儿茶酸和紫草酸峰面积RSD<4％，异阿魏酸峰面积RAD<3％，说明不同色谱柱对峰面积影响较小。
表17
注：-表示主峰与杂质峰未分开，因而无法统计分离度、理论塔板数和峰面积。
实施例3丹参注射液中酚酸类成分的含量测定方法
按照实施例1相同的含量测定方法对同一份丹参注射液供试品溶液进行检测，并将柱温由30℃替换为20℃、25℃或35℃，比较不同图谱的理论塔板数和分离度，结果见表18。结果表明：柱温对分离度影响较小，丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、原儿茶酸、紫草酸、咖啡酸、异阿魏酸各成分在四个温度下都能达到或接近基线分离，分离度均>1.4。随着温度上升，各成分保留时间减少，而大部分物质的理论塔板数也随之有一定幅度的降低。丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B四个主要成分峰面积RSD<2％，不同柱温对其影响不大。
表18
实施例3丹参注射液中酸类成分的含量测定方法
按照实施例1相同的含量测定方法对同一份丹参注射液供试品溶液进行检测，并将流动相由乙腈-0.03％磷酸水溶液替换为乙腈-0.05％磷酸水或乙腈-0.075％磷酸水溶液，比较不同图谱的理论塔板数和分离度，结果见表19。结果表明：流动相酸度对分离度有一定影响，且不同物质变化趋势不同，但几乎所有成分在三个酸度下都能达到基线分离。
表19
注：-表示主峰与杂质峰未分开，因而无法统计分离度、理论塔板数和峰面积。
实施例4丹参注射液中酚酸类成分的含量测定方法
按照实施例1相同的含量测定方法对同一份丹参注射液供试品溶液进行检测，并将检测波长由286nm替换为282nm、284nm、288nm或290nm，比较不同图谱的理论塔板数和分离度，结果见表20。结果表明：检测波长的变动对所有成分的峰面积测定都有不同程度的影响，尤其对丹参素钠和原儿茶酸的影响最为明显。
表20
实施例5丹参注射液样品的含量测定
按照实施例1的含量测定方法对10个批次的丹参注射液样品(神威药业集团有限公司提供)含量测定(见表21)，为平均含量(mg/瓶)，d为相对标准偏差(％)。8种成分的总含量平均值为26.17mg/瓶(加和平均值)。
表21丹参注射液中丹酚酸类化合物含量
Claims (9)
1.一种丹参注射液的质量控制方法，包括酚酸类化合物原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸、咖啡酸、异阿魏酸的含量测定，其特征在于包括下列步骤，
(1)对照品溶液的制备
原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B对照品贮备液：分别精密称取3mg原儿茶醛对照品和2mg迷迭香酸对照品，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液；分别精密称取2.9mg丹酚酸B对照品，置于5ml容量瓶中，精密量取1ml原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液置于此容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得含0.58mg/ml丹酚酸B、0.30mg/ml原儿茶醛和0.20mg/ml迷迭香酸的对照品贮备液；
原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；
咖啡酸和异阿魏酸对照品贮备液：分别精密称取2.8mg咖啡酸对照品和1.2mg异阿魏酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀；精密量取250μl所配溶液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含28μg/ml咖啡酸、12μg/ml异阿魏酸的对照品贮备液；
咖啡酸和异阿魏酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；
紫草酸对照品贮备液：精密称取精密称取1.4mg紫草酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得紫草酸对照品母液；精密量取1.25ml紫草酸对照品母液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含70μg/ml紫草酸的对照品贮备液；
紫草酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
取丹参注射液加水稀释5倍，或用PVDF亲水滤膜过滤或离心后加水稀释5倍，备用；
(3)含量测定
吸取上述供试品溶液注入液相色谱仪，使用HPLC法进行测定，色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为乙腈-磷酸水溶液，检测波长为280～290nm，流速为1.0mL/min，柱温为15～40℃，进样量为10μL，梯度洗脱程序如下，
系统适应性条件：分离度大于1.5，色谱峰理论塔板数不小于30000，对称因子在0.9～1.1之间；
按外标法以峰面积计算。
2.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，所述检测波长为282nm、284nm、286nm、288nm或290nm。
3.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，所述检测波长为286nm。
4.根据权利要求3所述的质量控制方法，其中所述酚酸类化合物还包括原儿茶酸和丹参素钠，所述对照品溶液的制备包括下列步骤：
丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B对照品贮备液：分别精密称取3mg原儿茶醛对照品和2mg迷迭香酸对照品，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液；分别精密称取7.2mg丹参素钠对照品和2.90mg丹酚酸B对照品，置于5ml容量瓶中，精密量取1ml原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液置于此容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得含1.44mg/ml丹参素钠、0.58mg/ml丹酚酸B、0.30mg/ml原儿茶醛和0.20mg/ml迷迭香酸的对照品贮备液；
丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；
咖啡酸和异阿魏酸对照品贮备液：分别精密称取2.8mg咖啡酸对照品和1.2mg异阿魏酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取250μl所配溶液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含28μg/ml咖啡酸、12μg/ml异阿魏酸的对照品贮备液；
咖啡酸和异阿魏酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；
原儿茶酸和紫草酸对照品贮备液：精密称取1.2mg原儿茶酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得原儿茶酸对照品母液。精密称取1.4mg紫草酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得紫草酸对照品母液；精密量取0.25ml原儿茶酸对照品母液和1.25ml紫草酸对照品母液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含12μg/ml原儿茶酸、70μg/ml紫草酸的对照品贮备液；
原儿茶酸和紫草酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的质量控制方法，其特征在于，其中所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱选自Shiseido Capcell pak MG C18柱、Agilent Zorbax SB C18柱、WatersXbridge C18柱或Phenomenex Luna C18，优选Shiseido Capcell pak MG C18柱或PhenomenexLuna C18，更优选Shiseido Capcell pak MG C18。
6.根据权利要求5所述的质量控制方法，其特征在于所述十八烷基硅烷键合硅胶柱进一步用Shiseido MG C18柱保护。
7.根据权利要求1-4中任意一项所述的质量控制方法，其特征在于，其中所述流动相为乙腈-磷酸水溶液，其中磷酸的体积百分比为0.01～0.10％。
8.根据权利，其特征在于，所述磷酸水溶液的体积百分比为0.03％、0.05％或0.075％，优选0.03％。
9.根据权利要求1-4中任意一项所述的质量控制方法，其特征在于，其中所述柱温为20～35℃，优选30±0.8℃。
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