CN103776908A - 一种复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，包括以下步骤：制备标准溶液、对照品溶液和供试品溶液再将其通过高效液相色谱仪检测；然后计算酚酸类化合物相对于丹参素钠的相对校正因子；再通过下述式Ⅳ所示获得复方丹参片中酚酸类化合物的含量。本发明提供的检测方法，通过对一个化合物（丹参素钠）进行检测，达到对多个化合物（丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B）的同时测定，方法简便，快速，准确，普适性好，节省人力、物力、财力，能更全面地反映复方丹参片的质量。
Description
技术领域
本发明涉及药物化合物检测领域。具体涉及一种药物的检测方法，尤其涉及一种复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法。
背景技术
复方丹参片为临床常用的心脑血管药物，是由丹参、三七、冰片为原料加辅料制成的中药制剂，能活血化瘀、理气止痛，主要用于治疗冠心病心绞痛。复方丹参片收载于2010年版《中华人民共和国药典》一部，分为三种规格，其中规格一为薄膜衣小片，每片重0.32g，相当于饮片0.6g；规格二为薄膜衣大片，每片重0.8g，相当于饮片1.8g；规格三为糖衣片，相当于饮片0.6g。
复方丹参片的药效物质基础明确，包括丹参酮、酚酸、皂苷三大类活性成分，其中酚酸类化合物含量较高的有丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B。2010年版《中华人民共和国药典》一部复方丹参片中酚酸类化合物的含量测定只控制了丹酚酸B一个化合物，监测指标少，不足以全面反映复方丹参片的质量。
目前对复方丹参片中酚酸类化合物的多指标含量测定方法文献报道较多，但存在诸如检测指标选择不合理、对照品难得或价格昂贵、所建立的方法普适性不强等不足，无法全面、有效、准确地对复方丹参片中酚酸类化合物各物质的含量进行检测，并且方法繁琐，费时费力。
发明内容
因此，本发明的目的是针对目前无法全面、有效、准确地对复方丹参片中酚酸类化合物各物质的含量进行检测的不足，提供一种复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，该方法简单，易于操作，能够全面、有效、准确地对复方丹参片中酚酸类化合物各物质的含量进行检测。
针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明提供一种复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，包括以下步骤：
步骤1：取酚酸类化合物对照品、丹参素钠对照品和复方丹参片分别将其制成标准溶液、对照品溶液和供试品溶液；
步骤2：将步骤1制得的标准溶液、对照品溶液和供试品溶液通过高效液相色谱仪检测；
步骤3：通过下述式Ⅲ所示计算所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对校正因子：
式Ⅲ
其中，fs/k为所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对校正因子，As为所述标准溶液中所述丹参素钠的峰面积，Ws为所述标准溶液中所述丹参素钠的质量或浓度，Ak为所述标准溶液中所述酚酸类化合物的峰面积，Wk为所述标准溶液中所述酚酸类化合物的质量或浓度；
步骤4：通过下述式Ⅳ所示获得所述复方丹参片中所述酚酸类化合物的含量：
式Ⅳ
其中，Wk′为所述复方丹参片中所述酚酸类化合物的含量，Ws′为用外标法测得的所述复方丹参片中所述丹参素钠的含量，其通过所述对照品溶液对所述复方丹参片中的所述丹参素钠进行定性和定量得到，AS′为所述供试品溶液中所述丹参素钠的峰面积，AK′为所述供试品溶液中所述酚酸类化合物的峰面积，fs/k为所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对校正因子。
在对中药进行多指标质量评价时，可以以样品中某一典型组分（有对照品供应者，且性质稳定）为内标，建立该组分与其它组分之间的相对校正因子（fs/k），可以通过相对校正因子计算其它组分的含量。本发明提供的方法适用于对照品难得或制备成本高或不稳定的情况下多成分的同时测定。
在高效液相色谱法以紫外检测器测定时，在一定的范围内（线性范围内）某一组分的量（质量或浓度，W）与检测器响应（峰面积，A）成正比，即：W＝f·A。在多指标质量评价时，以样品中某一典型组分（有对照品供应者，且性质稳定）为标准，建立该组分与其它组分之间的相对校正因子（fs/k）。于是测得的相对校正因子可作为某一色谱条件下某一组分的通用参数。通过使用一个对照品（标准物）和相对校正因子计算其它组分的含量。
为了节省人力物力，在测定复方丹参片中酚酸类化合物的含量之前，可以先对酚酸类化合物定性。相对保留值（rk/s）和保留时间差（ΔtR(k/s)）是常用的待测成分色谱峰的定性方法。相对保留值（rk/s）为某待测成分的保留时间（tR(k)）与内标的保留时间（tR(s)）的比值（rk/s=tR(k)/tR(s)），保留时间差（ΔtR(k/s)）为某待测成分保留时间（tR(k)）与内标保留时间（tR(s)）的差值（ΔtR(k/s)=tR(k)-tR(s)）。
分别考察相对保留值和保留时间差两种参数在不同仪器和不同色谱柱上的重现性，选取RSD较小的一种参数作为色谱峰定性依据。RSD<5%时符合要求，RSD>5%时，通过相对保留值或保留时间差不能准确定性，可通过其它方式对待测成分色谱峰定性。
具体如下：
优选地，在步骤2和步骤3间还包括对所述酚酸类化合物进行定性检测的步骤。
优选地，所述对酚酸类化合物进行定性检测的步骤是通过包括以下步骤的方法进行的：
1）通过下述式Ⅰ所示计算所述标准溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的标准相对保留值：
rk/s=tR(k)/tR(s)
式Ⅰ
其中，rk/s为所述标准溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的标准相对保留值，tR(k)为所述标准溶液中所述酚酸类化合物的保留时间，tR(s)为所述标准溶液中所述丹参素钠的保留时间；
2）再根据下述式Ⅱ所示获得所述供试品溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对保留值：
r′k/s=t′R(k)/t′R(s)
式Ⅱ
其中，r′k/s为所述供试品溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对保留值，t′R(k)为所述供试品溶液中所述酚酸类化合物的保留时间，t′R(s)为所述供试品溶液中所述丹参素钠的保留时间；
3）比较所述标准溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的标准相对保留值和所述供试品溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对保留值。
优选地，所述酚酸类化合物选自丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B中的任意一种或多种及丹参素钠。
优选地，所述丹参素的相对校正因子为1.11；或所述原儿茶醛的相对校正因子为4.55~4.96，所述原儿茶醛的相对校正因子优选为4.76；或所述迷迭香酸的相对校正因子为1.59~1.78，所述迷迭香酸的相对校正因子优选为1.69；或所述紫草酸的相对校正因子为1.32~1.44，所述紫草酸的相对校正因子优选为1.38；或所述丹酚酸B的相对校正因子为1.44~1.57，所述丹酚酸B的相对校正因子优选为1.51。
优选地，所述丹参素的标准相对保留值为1.00；或所述原儿茶醛的标准相对保留值为1.41~1.49，所述原儿茶醛的标准相对保留值优选为1.44；或所述迷迭香酸的标准相对保留值为2.75~2.97，所述迷迭香酸的标准相对保留值优选为2.85；或所述紫草酸的标准相对保留值为2.90~3.16，所述紫草酸的标准相对保留值优选为3.00；或所述丹酚酸B的标准相对保留值为3.37~3.79，所述丹酚酸B的标准相对保留值优选为3.50。
优选地，在步骤1中，取所述酚酸类化合物对照品、所述丹参素钠对照品和所述复方丹参片分别通过加入甲醇溶液中溶解，制成所述标准溶液、所述对照品溶液和所述供试品溶液。
优选地，以μg/mL计，所述酚酸类化合物与甲醇溶液的质量体积比为10～5000:1，此浓度范围内所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对校正因子（fs/k）为一常数（平均值，RSD<3%），通过式Ⅳ计算得到的所述复方丹参片中所述酚酸类化合物的含量与常规外标法的结果无显著性差异（P＞0.05）。
优选地，以μg/mL计，所述丹参素钠对照品与甲醇溶液的质量体积比为10～5000:1，此浓度范围内通过式Ⅳ计算得到的所述复方丹参片中所述酚酸类化合物的含量与常规外标法的结果无显著性差异（P＞0.05）。
优选地，以g/mL计，所述复方丹参片与甲醇溶液的质量体积比为1：20～100，此浓度范围内通过式Ⅳ计算得到的所述复方丹参片中所述酚酸类化合物的含量与常规外标法的结果无显著性差异（P＞0.05）。
更优选地，所述甲醇溶液的体积比浓度为60%，还优选地，所述复方丹参片加入甲醇后还经过超声处理，最优选地，所述超声处理具体为：在功率250W、频率33kHz的条件下，超声处理15～60min。
优选地，在步骤2中，所述高效液相色谱法包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，0.3%磷酸水为流动相B，按下述条件进行梯度洗脱：
0至5分钟：流动相A与流动相B的体积比为5：95；
5至25分钟：流动相A与流动相B的体积比由5：95匀速变化至23：77；
25至60分钟：流动相A与流动相B的体积比为23：77。
此洗脱条件下，所述复方丹参片中所述酚酸类化合物均能得到良好分离。
优选地，所述高效液相色谱法采用紫外检测器，检测波长为225～235nm。
优选地，在步骤2中，理论板数按丹参素钠峰计算应不低于6000。
优选地，在步骤4中，所述外标法包括以下步骤：
a.取所述酚酸类化合物对照品和所述复方丹参片分别制成对照品溶液和供试品溶液；
b.将步骤a制得的对照品溶液和供试品溶液通过高效液相色谱仪进行测定；
c.通过比较峰面积得出所述复方丹参片中所述酚酸类化合物的含量。
本发明提供的复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，通过对一个化合物（丹参素钠）进行检测，达到对多个化合物（丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B）的同时测定。具体的，以复方丹参片样品中有对照品供应且性质稳定的丹参素的钠盐（丹参素钠）为标准，建立丹参素钠与丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B之间的相对校正因子（fs/k）。于是测得的相对校正因子可作为某一色谱条件下某一酚酸类化合物的通用参数，获得此酚酸类化合物与丹参素钠的关系的数学模型，通过使用一个对照品（丹参素钠）和相对校正因子计算丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量。该方法简便，快速，准确，普适性好，节省人力、物力、财力，能更全面地反映复方丹参片的质量。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1测得的标准溶液的高效液相色谱图，其中，峰1为丹参素钠，峰2为原儿茶醛，峰3为迷迭香酸，峰4为紫草酸，峰5为丹酚酸B；
图2为实施例2测得的丹参素钠对照品的高效液相色谱图，其中，峰1为丹参素钠；
图3为实施例2测得的复方丹参片的高效液相色谱图，其中，峰1为丹参素钠，峰2为原儿茶醛，峰3为迷迭香酸，峰4为紫草酸，峰5为丹酚酸B；
图4为实施例3测得的丹参素钠对照品的高效液相色谱图，其中，峰1为丹参素钠；
图5为实施例3测得的复方丹参片的高效液相色谱图，其中，峰1为丹参素钠，峰2为原儿茶醛，峰3为迷迭香酸，峰4为紫草酸，峰5为丹酚酸B；
图6为实施例4测得的丹参素钠对照品的高效液相色谱图，其中，峰1为丹参素钠；
图7为实施例4测得的复方丹参片的高效液相色谱图，其中，峰1为丹参素钠，峰2为原儿茶醛，峰3为迷迭香酸，峰4为紫草酸，峰5为丹酚酸B。
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用的丹参素钠对照品购自中国药品生物制品检定所，酚酸类化合物对照品购自中国药品生物制品检定所；
除非特别指明，以下实施例中所用的乙腈、磷酸均为色谱纯试剂，甲醇为分析纯级试剂，水为纯净水，且可从正规渠道商购买获得。
实施例1 酚酸类化合物相对于丹参素钠的相对校正因子和标准相对
保留值的确定
按照高效液相色谱法（《中国人民共和国药典》2010年版一部附录ⅥD）测定。
色谱条件与系统适用性试验：Waters 2695高效液相色谱仪、DionexUltiMate 3000高效液相色谱仪、Agilent 1260高效液相色谱仪；MerckPurospher STAR RP-18e（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱、Diamonsil C18（2）（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱、phenomenex luna C18（2）（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱、Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱、Waters SunFire C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱、AgilentTC-C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱、Ecosil C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，0.3体积%磷酸水为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长为230nm。理论板数按丹参素钠峰计算应不低于6000。
表1 梯度洗脱程序
标准溶液的制备：取丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品适量，精密称定，加60体积%甲醇制成每1ml各含0.605mg、0.104mg、0.309mg、0.402mg、5.040mg的溶液，作为储备液。取储备液，稀释为7个不同浓度（丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的浓度分别为：6.05μg/ml、1.04μg/ml、3.09μg/ml、4.02μg/ml、50.40μg/ml；30.25μg/ml、5.2μg/ml、15.45μg/ml、20.1μg/ml、252.0μg/ml；60.5μg/ml、10.4μg/ml、30.9μg/ml、40.2μg/ml、504.0μg/ml；90.75μg/ml、15.6μg/ml、46.35μg/ml、60.3μg/ml、756μg/ml；121μg/ml、20.8μg/ml、61.8μg/ml、80.4μg/ml、1008μg/ml；151.25μg/ml、26μg/ml、77.25μg/ml、100.5μg/ml、1260μg/ml；181.5μg/ml、31.2μg/ml、92.7μg/ml、120.6μg/ml、1512μg/ml），即得。
测定法：精密吸取上述7个不同浓度的标准溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
相对校正因子的计算：通过下述式Ⅲ所示计算所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对校正因子：
式Ⅲ
其中，fs/k为所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对校正因子，As为所述标准溶液中所述丹参素钠的峰面积，Ws为所述标准溶液中所述丹参素钠的质量或浓度，Ak为所述标准溶液中所述酚酸类化合物的峰面积，Wk为所述标准溶液中所述酚酸类化合物的质量或浓度。
标准相对保留值的计算：通过下述式Ⅰ所示计算所述标准溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的标准相对保留值：
rk/s=tR(k)/tR(s)
式Ⅰ
其中，rk/s为所述标准溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的标准相对保留值，tR(k)为所述标准溶液中所述酚酸类化合物的保留时间，tR(s)为所述标准溶液中所述丹参素钠的保留时间。
保留时间差的计算：通过下述式Ⅴ所示计算所述标准溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的保留时间差：
ΔtR(k/s)=tR(k)-tR(s)
式V
其中，ΔtR(k/s)为所述标准溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的保留时间差，tR(k)为所述标准溶液中所述酚酸类化合物的保留时间，tR(s)为所述标准溶液中所述丹参素钠的保留时间。
本实施例考察了Waters 2695、Dionex UltiMate 3000、Agilent 1260三种高效液相色谱系统和Merck Purospher STAR RP-18e、Diamonsil C18（2）、phenomenex luna C18（2）、Waters Symmetry C18、Waters SunFire C18、Agilent TC-C18、Ecosil C18七根不同品牌型号的色谱柱对酚酸类化合物相对校正因子的影响。在上述仪器和上述色谱柱上测得的酚酸类化合物的相对校正因子较稳定，差异不显著（P>0.05），见表2。
本实施例获得的酚酸类化合物的相对校正因子将直接用于实施例2、实施例3、实施例4的酚酸类化合物的含量测定。
表2 酚酸类化合物在不同仪器和不同色谱柱上的相对校正因子
本实施例分别考察了标准相对保留值（rk/s）和保留时间差（ΔtR(k/s)）两种参数在不同仪器和不同色谱柱上的重现性，结果显示保留时间差的RSD较大，故选取RSD较小的标准相对保留值作为色谱峰定性依据。酚酸类化合物的标准相对保留值见表3，保留时间差见表4。
本实施例获得的酚酸类化合物的标准相对保留值将直接用于实施例2、实施例3、实施例4的酚酸类化合物的定性检测。
表3 酚酸类化合物在不同仪器和不同色谱柱上的标准相对保留值
表4 酚酸类化合物在不同仪器和不同色谱柱上的的保留时间差
本实施例还提供测定方法的方法学考察：
线性关系考察：
方法：取上述7个不同浓度的标准溶液，按表1通过高效液相色谱仪检测。以酚酸类化合物的浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，得到酚酸类化合物的线性回归方程和线性范围。
结果：见表5。
表5 线性关系考察结果
精密度考察：
方法：日内精密度：每3小时一次，以标准溶液（丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的浓度分别为60.5μg/ml、10.4μg/ml、30.9μg/ml、40.2μg/ml、504.0μg/ml）连续进样5次，计算峰面积的相对标准偏差。日间精密度考察：每天一次，以标准溶液（丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的浓度分别为60.5μg/ml、10.4μg/ml、30.9μg/ml、40.2μg/ml、504.0μg/ml）连续进样5天，计算峰面积的相对标准偏差。
重复性考察：
方法：取同一批次样品60片，除去薄膜衣，精密称定，研细，称取6份，每份约1g，精密称定，置具塞棕色瓶中，精密加入60体积%甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用60体积%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，置棕色瓶中，得供试品溶液，按表1进样测定，计算含量及相对标准偏差。
稳定性考察：
方法：取重复性下同一供试品，0、3、12、18、24、36、48、72小时连续进样8次，记录72小时内峰面积，计算相对标准偏差。
结果：日内及日间精密度、重复性实验、稳定性实验的结果见表6。丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B在室温或低温、避光的条件下在对照品溶液中至少5天内保持稳定，在样品溶液中至少72小时内保持稳定。
表6 精密度、重复性及稳定性实验结果
an=5;bn=5;cn=6;dn=8。
加样回收率考察：
方法：取已知含量的同一批次样品0.5g，精密称定，精密加入高、中、低三个剂量的丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品，共9份，分别制备供试品溶液，按表1进样测定。
结果：高、中、低剂量下，酚酸类化合物的加样回收率均在95%-105%之间，符合要求，见表7。
表7 加样回收率实验结果
abc数据为三次测定结果的平均值；d回收率（%）=[（测得量-固有含量）/加入量]×100%。
实施例2 复方丹参片中酚酸类化合物含量的测定
按照《中华人民共和国药典》2010年版一部复方丹参片的规格要求，取18批复方丹参片样品进行测定。
按照高效液相色谱法（《中国人民共和国药典》2010年版一部附录ⅥD）测定。
色谱条件与系统适用性试验：Waters 2695高效液相色谱仪；WatersSymmetry C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，0.3体积%磷酸水为流动相B，按表8进行梯度洗脱；检测波长为230nm。理论板数按丹参素钠峰计算应不低于6000。
表8 梯度洗脱程序
对照品溶液的制备：取丹参素钠对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加60体积%甲醇制成每1ml含10μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取复方丹参片10片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞棕色瓶中，精密加入60体积%甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用60体积%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，置棕色瓶中，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
1.通过比较实施例1中获得的标准溶液中酚酸类化合物相对于丹参素钠的标准相对保留值和本实施例中计算得到的供试品溶液中酚酸类化合物相对于丹参素钠的相对保留值，对供试品溶液中酚酸类化合物定性。
酚酸类化合物相对于丹参素钠的标准相对保留值如表9所示：
表9 酚酸类化合物相对于丹参素钠的标准相对保留值
供试品溶液中酚酸类化合物与丹参素钠之间的相对保留值根据式Ⅱ计算：
r′k/s=t′R(k)/t′R(s)
式Ⅱ
其中，r′k/s为供试品溶液中酚酸类化合物与丹参素钠之间的相对保留值，t′R(k)为供试品溶液中酚酸类化合物的保留时间，t′R(s)为供试品溶液中丹参素钠的保留时间。
酚酸类化合物的峰位，其在供试品溶液中的相对保留值应在标准溶液中的标准相对保留值的±5%范围之内。
2.以丹参素钠对照品的峰面积为对照，通过实施例1获得的相对校正因子分别计算丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量。
酚酸类化合物相对于丹参素钠的相对校正因子如表10所示：
表10 酚酸类化合物相对于丹参素钠的相对校正因子
酚酸类化合物的含量按式Ⅳ计算：
式Ⅳ
其中，
为复方丹参片中酚酸类化合物的含量（单位：mg/g），
为用外标法测得的复方丹参片中丹参素钠的含量（单位：mg/g），
为供试品溶液中丹参素钠的峰面积，
为供试品溶液中酚酸类化合物的峰面积，fs/k为酚酸类化合物与丹参素钠之间的相对校正因子。
本实施例中，18批复方丹参片（为薄膜衣小片，每片重0.32g，相当于饮片0.6g，由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供）样品含量测定结果见表11。
表11 含量测定结果
比较例：
按照《中华人民共和国药典》2010年版一部复方丹参片的规格要求，取18批复方丹参片样品进行含量测定。
采用常规外标法，按照高效液相色谱法（《中国人民共和国药典》2010年版一部附录Ⅵ D）测定。
色谱条件与系统适用性试验：Waters 2695高效液相色谱仪；WatersSymmetry C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，0.3体积%磷酸水为流动相B，按表12进行梯度洗脱；检测波长为230nm。理论板数按丹参素钠峰计算应不低于6000。
表12 梯度洗脱程序
对照品溶液的制备：取丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加60体积%甲醇制成每1ml各含10μg、10μg、30μg、40μg、50μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取复方丹参片10片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞棕色瓶中，精密加入60体积%甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用60体积%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，置棕色瓶中，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
本比较例中，18批复方丹参片（为薄膜衣小片，每片重0.32g，相当于饮片0.6g，由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供）样品含量测定结果见表13。
表13 含量测定结果（常规外标法）
由表11、表13测定结果可知，本发明提供的测定方法与常规外标法的结果无显著性差异（P＞0.05），证明本发明提供的测定方法对复方丹参片中酚酸类成分进行测定具有可信度和可行性。
实施例3 复方丹参片中酚酸类化合物含量的测定
按照《中华人民共和国药典》2010年版一部复方丹参片的规格要求，取3批复方丹参片样品进行测定。
按照高效液相色谱法（《中国人民共和国药典》2010年版一部附录Ⅵ D）测定。
色谱条件与系统适用性试验：Dionex U3000高效液相色谱仪；MerckPurospher STAR RP-18e（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，0.3体积%磷酸水为流动相B，按表14进行梯度洗脱；检测波长为225nm。理论板数按丹参素钠峰计算应不低于6000。
表14 梯度洗脱程序
对照品溶液的制备：取丹参素钠对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加60体积%甲醇制成每1ml含1000μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取复方丹参片10片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞棕色瓶中，精密加入60体积%甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33kHz）15分钟，放冷，再称定重量，用60体积%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，置棕色瓶中，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
1.通过比较实施例1获得的标准溶液中酚酸类化合物相对于丹参素钠的标准相对保留值和本实施例中计算得到的供试品溶液中酚酸类化合物相对于丹参素钠的相对保留值，对供试品溶液中酚酸类化合物定性。
酚酸类化合物相对于丹参素钠的标准相对保留值如表15所示：
表15 酚酸类化合物相对于丹参素钠的标准相对保留值
供试品溶液中酚酸类化合物与丹参素钠之间的相对保留值根据式Ⅱ计算：
r′k/s=t′R(k)/t′R(s)
式Ⅱ
其中，r′k/s为供试品溶液中酚酸类化合物与丹参素钠之间的相对保留值，t′R(k)为供试品溶液中酚酸类化合物的保留时间，t′R(s)为供试品溶液中丹参素钠的保留时间。
酚酸类化合物的峰位，其在供试品溶液中的相对保留值应在标准溶液中的标准相对保留值的±5%范围之内。
2.以丹参素钠对照品的峰面积为对照，通过实施例1获得的相对校正因子分别计算丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量。
酚酸类化合物相对于丹参素钠的相对校正因子如表16所示：
表16 酚酸类化合物相对于丹参素钠的相对校正因子
酚酸类化合物的含量按式Ⅳ计算：
式Ⅳ
其中，
为复方丹参片中酚酸类化合物的含量（单位：mg/g），
为用外标法测得的复方丹参片中丹参素钠的含量（单位：mg/g），
为供试品溶液中丹参素钠的峰面积，
为供试品溶液中酚酸类化合物的峰面积，fs/k为酚酸类化合物与丹参素钠之间的相对校正因子。
本实施例中，3批复方丹参片（为薄膜衣大片，每片重0.8g，相当于饮片1.8g，分别购于各地药店）样品含量测定结果见表17。
表17 含量测定结果
比较例：
按照《中华人民共和国药典》2010年版一部复方丹参片的规格要求，取3批复方丹参片样品进行含量测定。
采用常规外标法，按照高效液相色谱法（《中国人民共和国药典》2010年版一部附录Ⅵ D）测定。
色谱条件与系统适用性试验：Dionex U3000高效液相色谱仪；MerckPurospher STAR RP-18e（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，0.3体积%磷酸水为流动相B，按表18进行梯度洗脱；检测波长为225nm。理论板数按丹参素钠峰计算应不低于6000。
表18 梯度洗脱程序
对照品溶液的制备：取丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加60体积%甲醇制成每1ml各含1000μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取复方丹参片10片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞棕色瓶中，精密加入60体积%甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33kHz）15分钟，放冷，再称定重量，用60体积%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，置棕色瓶中，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
本比较例中，3批复方丹参片（为薄膜衣大片，每片重0.8g，相当于饮片1.8g，分别购于各地药店）样品含量测定结果见表19。
表19 含量测定结果（常规外标法）
由表17、表19测定结果可知，本发明提供的测定方法与常规外标法的结果无显著性差异（P＞0.05），证明本发明提供的测定方法对复方丹参片中酚酸类成分进行测定具有可信度和可行性。
实施例4 复方丹参片中酚酸类化合物含量的测定
按照《中华人民共和国药典》2010年版一部复方丹参片的规格要求，取5批复方丹参片样品进行测定。
按照高效液相色谱法（《中国人民共和国药典》2010年版一部附录Ⅵ D）测定。
色谱条件与系统适用性试验：Agilent 1260高效液相色谱仪；AgilentTC-C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，0.3体积%磷酸水为流动相B，按表20进行梯度洗脱；检测波长为235nm。理论板数按丹参素钠峰计算应不低于6000。
表20 梯度洗脱程序
对照品溶液的制备：取丹参素钠对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加60体积%甲醇制成每1ml含5000μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取复方丹参片10片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞棕色瓶中，精密加入60体积%甲醇100ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33kHz）60分钟，放冷，再称定重量，用60体积%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，置棕色瓶中，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
1.通过比较标准溶液中酚酸类化合物相对于丹参素钠的标准相对保留值和本实施例中计算得到的供试品溶液中酚酸类化合物相对于丹参素钠的相对保留值，对供试品溶液中酚酸类化合物定性。
酚酸类化合物相对于丹参素钠的标准相对保留值如表21所示：
表21 酚酸类化合物相对于丹参素钠的标准相对保留值
供试品溶液中酚酸类化合物与丹参素钠之间的相对保留值根据式Ⅱ计算：
r′k/s=t′R(k)/t′R(s)
式Ⅱ
其中，r′k/s为供试品溶液中酚酸类化合物与丹参素钠之间的相对保留值，t′R(k)为供试品溶液中酚酸类化合物的保留时间，t′R(s)为供试品溶液中丹参素钠的保留时间。
酚酸类化合物的峰位，其在供试品溶液中的相对保留值应在标准溶液中的标准相对保留值的±5%范围之内。
2.通过实施例1测得的相对校正因子分别计算丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量。
酚酸类化合物相对于丹参素钠的相对校正因子如表22所示：
表22 酚酸类化合物相对于丹参素钠的相对校正因子
酚酸类化合物的含量按式Ⅳ计算：
式Ⅳ
其中，为复方丹参片中酚酸类化合物的含量（单位：mg/g），
为用外标法测得的复方丹参片中丹参素钠的含量（单位：mg/g），
为供试品溶液中丹参素钠的峰面积，
为供试品溶液中酚酸类化合物的峰面积，fs/k为酚酸类化合物与丹参素钠之间的相对校正因子。
本实施例中，4批复方丹参片（为糖衣片，相当于饮片0.6g，购于各地药店）含量测定结果见表23。
表23 含量测定结果
比较例：
按照《中华人民共和国药典》2010年版一部复方丹参片的规格要求，取5批复方丹参片样品进行含量测定。
采用常规外标法，按照高效液相色谱法（《中国人民共和国药典》2010年版一部附录Ⅵ D）测定。
色谱条件与系统适用性试验：Agilent 1260高效液相色谱仪；AgilentTC-C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，0.3体积%磷酸水为流动相B，按表24进行梯度洗脱；检测波长为235nm。理论板数按丹参素钠峰计算应不低于6000。
表24 梯度洗脱程序
对照品溶液的制备：取丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加60体积%甲醇制成每1ml各含5000μg、500μg、500μg、500μg和500μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取复方丹参片10片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞棕色瓶中，精密加入60体积%甲醇100ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33kHz）60分钟，放冷，再称定重量，用60体积%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，置棕色瓶中，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
本比较例中，4批复方丹参片（为糖衣片，相当于饮片0.6g，购于各地药店）样品含量测定结果见表25。
表25 含量测定结果（常规外标法）
由表23、表25测定结果可知，本发明提供的测定方法与常规外标法的结果无显著性差异（P＞0.05），证明本发明提供的测定方法对复方丹参片中酚酸类成分进行测定具有可信度和可行性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (11)
1.一种复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，包括以下步骤：
步骤1：取酚酸类化合物对照品、丹参素钠对照品和复方丹参片分别将其制成标准溶液、对照品溶液和供试品溶液；
步骤2：将步骤1制得的标准溶液、对照品溶液和供试品溶液通过高效液相色谱仪检测；
步骤3：通过下述式Ⅲ所示计算所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对校正因子：
式Ⅲ
其中，fs/k为所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对校正因子，As为所述标准溶液中所述丹参素钠的峰面积，Ws为所述标准溶液中所述丹参素钠的质量或浓度，Ak为所述标准溶液中所述酚酸类化合物的峰面积，Wk为所述标准溶液中所述酚酸类化合物的质量或浓度；
步骤4：通过下述式Ⅳ所示获得所述复方丹参片中所述酚酸类化合物的含量：
式Ⅳ
其中，Wk′为所述复方丹参片中所述酚酸类化合物的含量，Ws′为用外标法测得的所述复方丹参片中所述丹参素钠的含量，AS′为所述供试品溶液中所述丹参素钠的峰面积，AK′为所述供试品溶液中所述酚酸类化合物的峰面积，fs/k为所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对校正因子。
2.根据权利要求1所述的复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，其特征在于，在步骤2和步骤3间还包括对所述酚酸类化合物进行定性检测的步骤。
3.根据权利要求2所述的复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，其特征在于，所述对酚酸类化合物进行定性检测的步骤是通过包括以下步骤的方法进行的：
1）通过下述式Ⅰ所示计算所述标准溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的标准相对保留值；
rk/s=tR(k)/tR(s)
式Ⅰ
其中，rk/s为所述标准溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的标准相对保留值，tR(k)为所述标准溶液中所述酚酸类化合物的保留时间，tR(s)为所述标准溶液中所述丹参素钠的保留时间；
2）再根据下述式Ⅱ所示获得所述供试品溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对保留值；
r′k/s=t′R(k)/t′R(s)
式Ⅱ
其中，r′k/s为所述供试品溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对保留值，t′R(k)为所述供试品溶液中所述酚酸类化合物的保留时间，t′R(s)为所述供试品溶液中所述丹参素钠的保留时间；
3）比较所述标准溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的标准相对保留值和所述供试品溶液中所述酚酸类化合物相对于所述丹参素钠的相对保留值。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，其特征在于，所述酚酸类化合物选自丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B中的任意一种或多种及丹参素钠。
5.根据权利要求4所述的复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，其特征在于，所述丹参素的相对校正因子为1.11；或所述原儿茶醛的相对校正因子为4.55~4.96，所述原儿茶醛的相对校正因子优选为4.76；或所述迷迭香酸的相对校正因子为1.59~1.78，所述迷迭香酸的相对校正因子优选为1.69；或所述紫草酸的相对校正因子为1.32~1.44，所述紫草酸的相对校正因子优选为1.38；或所述丹酚酸B的相对校正因子为1.44~1.57，所述丹酚酸B的相对校正因子优选为1.51。
6.根据权利要求4或5所述的复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，其特征在于，所述丹参素的标准相对保留值为1.00；或所述原儿茶醛的标准相对保留值为1.41~1.49，所述原儿茶醛的标准相对保留值优选为1.44；或所述迷迭香酸的标准相对保留值为2.75~2.97，所述迷迭香酸的标准相对保留值优选为2.85；或所述紫草酸的标准相对保留值为2.90~3.16，所述紫草酸的标准相对保留值优选为3.00；或所述丹酚酸B的标准相对保留值为3.37~3.79，所述丹酚酸B的标准相对保留值优选为3.50。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，其特征在于，在步骤1中，取所述酚酸类化合物对照品、所述丹参素钠对照品和所述复方丹参片分别通过加入甲醇溶液中溶解，制成标准溶液、对照品溶液和供试品溶液，优选地，以μg/mL计，所述酚酸类化合物对照品与甲醇溶液的质量体积比为10～5000:1，优选为10～1000:1；
或优选地，以μg/mL计，所述丹参素钠对照品与甲醇溶液的质量体积比为10～5000:1，优选为10～1000:1；
或优选地，以g/mL计，所述复方丹参片与甲醇溶液的质量体积比为1：20～100；
更优选地，所述甲醇溶液的体积比浓度为60%，还优选地，所述复方丹参片加入甲醇后还经过超声处理；
最优选地，所述超声处理具体为：在功率250W、频率33kHz的条件下，超声处理15～60min。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，其特征在于，在步骤2中，所述高效液相色谱法包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，为以乙腈为流动相A，0.3%磷酸水为流动相B，按下述条件进行梯度洗脱：
0至5分钟：流动相A与流动相B的体积比为5：95；
5至25分钟：流动相A与流动相B的体积比由5：95匀速变化至23：77；
25至60分钟：流动相A与流动相B的体积比为23：77。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用紫外检测器，检测波长为225～235nm。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，其特征在于，在步骤2中，理论板数按丹参素钠峰计算应不低于6000。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的复方丹参片中酚酸类化合物的检测方法，其特征在于，在步骤4中，所述外标法包括以下步骤：
a.取所述酚酸类化合物对照品和所述复方丹参片分别将其制成对照品溶液和供试品溶液；
b.将步骤a制得的对照品溶液和供试品溶液通过高效液相色谱仪进行测定；
c.通过比较峰面积得出所述复方丹参片中所述酚酸类化合物的含量。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140507 |