CN105987966B - 基于谱效关系的广东紫珠质量控制方法及其模型建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于谱效关系的广东紫珠质量控制方法，1)建立待检测广东紫珠供试品的HPLC的指纹图谱；2)然后筛选出特征峰；3)将步骤2)中所筛选的特征峰的峰面积带入谱效数学模型中进行计算，并根据计算所得的结果判断广东紫珠质量的优劣。

Description

基于谱效关系的广东紫珠质量控制方法及其模型建立方法

技术领域

本发明属于中药质量标准检测的技术领域，尤其是涉及广东紫珠的质量的控制方法及检测模型建立的方法。

背景技术

广东紫珠，是源于马鞭草科植物紫珠属(Calliscarpa kwangtungensis C.)，主要生长分布于中国的浙江、江西、福建、湖北、四川、广州、广西等地，为《中国药典》2010版一部新收载品种。临床报道显示，广东紫珠具有收敛止血、散瘀、清热解毒的功能，主要用于治疗宫颈糜烂出血、阴道炎、宫颈炎等妇科炎症。其含有以金石蚕苷、连翘酯苷B为代表的苯乙醇苷类和以槲皮素为代表的黄酮类成分，其中以苯乙醇苷类化合物含量为最高。然而，对于广东紫珠的质量控制，目前仍未缺乏一个与药效明显关联并且具体量化的标准与方法。故而对广东紫珠药材的种植与培育的优劣性，一直难以进行有效科学的质量评估。

发明内容

本发明目的在于针对目前缺乏的有效的广东紫珠质量控制方法，提供借助化学分析和统计方法，将广东紫珠的指纹图谱与止血效果进行谱效相关性研究以预期广东紫珠的止血效果来判断其质量优劣的质量检测方法。

本发明采用技术方案如下：通过建立广东紫珠HPLC指纹图谱和测定广东紫珠的止血效果，并根据HPLC指纹图谱的特征峰的峰面积和止血效果建立相应的谱效关系，然后利用所建立的谱效关系直接评价的广东紫珠的止血效果。

基于谱效关系的广东紫珠质量控制方法，步骤如下：

1.建立待检测广东紫珠供试品的HPLC的指纹图谱；

供试品溶液制备方法为：取供试品200mg，以50％乙醇-水溶解于10ml容量瓶中，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液；

色谱条件为：色谱柱采用Welch Material C18柱，流动相A为含0.5％磷酸的水，流动相B为色谱级乙腈；时间为0min→5min→20min→50min→80min→110min；流动相A％：95％→92％→88％→85％→82％→82％，流动相B：5％→8％→12％→15％→18％→18％，流速为1ml/min，取样量为40μl，取样温度为20℃，柱温为35℃，检测器为UV-MWD/DAD检测器，检测波长为210mm，总时间为110min，样品溶剂为乙醇和水以1:1比例混合。

2.根据中药色谱指纹图谱相似度筛选出特征峰；

根据步骤1)中的制得样品的HPLC指纹图谱，利用指纹图谱的相似度筛选出相应的特征峰，特征峰的保留时间为9.20min、12.88min、17.86min、18.51min、21.25min、22.57min、26.10min、34.72min、37.34min、43.26min、48.58min、79.07min、84.25min、88.47min。

3.将步骤2中所筛选的特征峰的峰面积带入谱效数学模型中，并根据预测结果判断广东紫珠质量的优劣。

其中，14个色谱峰引入到谱效数学模型中，其余色谱峰因其显著性检验P值大于0.05而剔除；X₁代表保留时间为9.20min的色谱峰峰面积，X₂代表保留时间为12.88min色谱峰峰面积，X₃代表保留时间为17.86min色谱峰峰面积，X₄代表保留时间为18.51min色谱峰峰面积，X₄代表保留时间为21.25min色谱峰峰面积，X₆代表保留时间为22.57min色谱峰峰面积，X₇代表保留时间为26.10min色谱峰峰面积，X₈代表保留时间为34.72min色谱峰峰面积，X₉代表保留时间为37.34min色谱峰峰面积，X₁₀代表保留时间为43.26min色谱峰峰面积，X₁₁代表保留时间为48.58min色谱峰峰面积，X₁₂代表保留时间为79.07min色谱峰峰面积，X₁₃代表保留时间为84.25min色谱峰峰面积，X₁₄代表保留时间为88.47min色谱峰峰面积；Y_玻片、Y_断尾代表止血效率比值；其中，止血效率比值＝测量时间值/空白组凝血时间值；

眼球取血-玻片凝血时间与特征峰峰面积之间的谱效关系数学模型：

Y_玻片＝1.05293523242994-0.00215638329795342X₅-0.000119237377074156X₁₂-0.000317348228922039X₁₁+0.000389559368988219X₆-0.000120870779326365X₉-0.000298174292983868X₁₄+0.00046065208499242X₇-0.0000333159515258528X₁₃，P＝3.81780016863706E-38<0.01，R2＝0.999945754737945；

小鼠断尾止血时间与特征峰峰面积之间的谱效关系数学模型：

Y_断尾＝0.748529703596608-0.0000743341327156706X₂-0.000148980185513651X₈+0.000763290974744721X₁₀-0.000906408936197708X₅-0.000315846631377703X₁-0.000157856047291727X₁₁-0.000164166200251442X₃+0.0000129153890779381X₄，P＝2.3203159885737E-163<0.01，R2＝0.999992332236408。

根据已建立的谱效关系的数学模型，计算出供试品相应的玻片凝血时间和断尾止血时间；Y玻片和Y断尾均小于1.0时，判定为广东紫珠的供试品质量佳。

本发明的有益效果如下：通过建立数学模型，将指纹图谱数据与止血作用 结果进行关联，说明论证了广东紫珠中，对止血作用的有效成分组成，是以苯乙醇苷为主，黄酮类为辅的药效物质基础，并且通过玻片凝血和断尾止血效果共同判断广东紫珠优劣，同时判断方法采用指纹图谱和数学模型结合的方式避免第三方因素的干扰，不必做复杂的药理实验，避免了动物个体偏差，基本能够快捷明确的确定广东紫珠药材提取物的止血效果评价。本发明具有方便简洁，客观性强，重现性强，特征峰明确等优点，使广东紫珠的质量控制更加科学完善。采用供试品广东紫珠的HPLC指纹图谱中的色谱峰保留时间和光谱特征对特征峰进行识别和筛选，保证识别特征峰的准确性和重复性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明9组供试品的HPLC指纹图谱，其中A为样品A，B为样品 A-1，C为样品B，D为样品B-1，E为样品B-2，F为样品B-3，G为样品C，H 为样品C-1，I为样品C-2；

图2为保留时间为9.20min的色谱峰；

图3为保留时间为11.68min的色谱峰；

图4为保留时间为12.88min的色谱峰；

图5为保留时间为17.86min的色谱峰；

图6为保留时间为18.51min的色谱峰；

图7为保留时间为21.25min的色谱峰；

图8为保留时间为22.57min的色谱峰；

图9为保留时间为26.10min的色谱峰；

图10为保留时间为30.83min的色谱峰；

图11为保留时间为34.72min的色谱峰；

图12为保留时间为37.34min的色谱峰；

图13为保留时间为43.26min的色谱峰；

图14为保留时间为44.29min的色谱峰；

图15为保留时间为46.03min的色谱峰；

图16为保留时间为48.58min的色谱峰；

图17为保留时间为52.07min的色谱峰；

图18为保留时间为57.44min的色谱峰；

图19为保留时间为69.05min的色谱峰；

图20为保留时间为79.07min的色谱峰；

图21为保留时间为84.25min的色谱峰；

图22为保留时间为88.47min的色谱峰；

图23为保留时间为100.56min的色谱峰；

图24为保留时间为9.20min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图25为保留时间为11.68min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图26为保留时间为12.88min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图27为保留时间为17.86min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图28为保留时间为18.51min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图29为保留时间为21.25min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图30为保留时间为22.57min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图31为保留时间为26.10min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图32为保留时间为30.83min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图33为保留时间为34.72min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图34为保留时间为37.34min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图35为保留时间为43.26min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图36为保留时间为44.29min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图37为保留时间为46.03min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图38为保留时间为48.58min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图39为保留时间为52.07min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图40为保留时间为57.44min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图41为保留时间为69.05min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图42为保留时间为79.07min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图43为保留时间为84.25min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图44为保留时间为88.47min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图45为保留时间为100.56min的色谱峰的峰面积与止血效率的线性关系图；

图46为供试品的PCA主成分分析图；

图47为主成分的ward法聚类分析验证图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、基于谱效关系对广东紫珠质量进行检的测模型的建立

1.首先采用9组不同的制备工艺制备的样品供试液，以HPLC法建立对应色谱的指纹图谱(如图1所示)，再用小鼠断尾止血法和小鼠眼球取血-玻片凝血法得到的平均止血时间评价其止血效果。

1.1HPLC法建立对应色谱的指纹图谱，色谱条件如下：

色谱柱采用Welch Material C18柱，流动相A为含0.5％磷酸的水，流动相B为色谱级乙腈；时间为0min→5min→20min→50min→80min→110min；流动相A％：95％→92％→88％→85％→82％→82％，流动相B：5％→8％→12％→15％→18％→18％，流速为1ml/min，取样量为40μl，取样温度为20℃，柱温为35℃，检测器为UV-MWD/DAD检测器，检测波长为210mm，总时间为110min，样品溶剂为乙醇和水以1:1比例混合。

1.29组不同样品供试液的制备方法如下：

广东紫珠水提物的制备：取准备好的烘干细粉2kg，10倍重量水回流提取两次，每次1h，合并滤液减压回收至干(以下称样品A)。

广东紫珠60％乙醇提取物的制备：取准备好的烘干细粉2kg，10倍量60％乙醇回流提取，两次每次1h，合并滤液减压回收至干(以下称样品B)。

广东紫珠95％乙醇提取物的制备：取准备好的烘干细粉2kg，95％乙醇回流提取两次，每次提取1h，合并滤液减压回收至干(以下称样品C)。

广东紫珠水提醇沉上清液的制备：取部分水提物干浸膏加适量水溶解，加乙醇调酒精浓度至50％，静置12h，取上清液减压回收至干(以下称样品A-1)。

广东紫珠60％乙醇提取物水洗，20％乙醇洗脱和60％乙醇洗脱物的制备：取上述的部分60％醇提物干浸膏加适量水溶解，过AB-8大孔吸附树脂柱，水洗脱至洗脱液澄清，合并洗脱液减压回收至干(以下称样品B-1)；再以20％乙醇洗脱至洗脱液澄清，合并洗脱液减压回收至干(以下称样品B-2)；再以60％乙醇洗脱至洗脱液澄清，合并洗脱液减压回收至干(以下称样品B-3)。

广东紫珠95％乙醇提正丁醇萃取物和萃取后水部位的制备：取部分95％醇提物浸膏加适量水溶解，置分液漏斗中添加饱和正丁醇萃取，摇匀静置4h，分别减压回收正丁醇萃取物(以下称样品C-1)和萃取后水部位(以下称样品C-2)至干。

1.3广东紫珠止血模型试验如下：

将132只小鼠均随机分为3批，每批11组，每组4只，雌雄各半，分别编号为空白组、样品A组、样品A-1组、样品B组、样品B-1组、样品B-2组、样品B-3组、样品C组、样品C-1组、样品C-2组、阳性对照组，实验室条件下喂养小鼠一周后，按等生药量每天分别灌胃给药于第七天末次灌胃30分钟后，用镊子摘取小鼠右侧眼珠取血一滴于玻璃板上，静置每隔30S用针轻挑血液至有血丝形成，记为玻片凝血时间；再于小鼠尾部末段5mm左右处用利剪剪去其尾，保持切口面积大小基本相等，每隔30S用滤纸轻轻擦拭血迹，直到无血迹为止，记录断尾止血时间；将测得结果与空白组对照，得到止血效率比值＝测量值/空白组凝血时间。将测得结果和空白组对照，得到止血效率比值＝测量值/空白组凝血时间，具体的测试结果如表1所示；

表1 玻片凝血时间及断尾止血时间测定结果(n＝12)

注：与空白组比较，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001

2.根据HPLC指纹图谱和止血效率比值的结果，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会推荐中药色谱指纹图谱相似度评价系统)筛选出共有峰(指几组图谱中都有，或者大部分都有的峰)并进行相关性分析和双侧检验得到峰面积与止血药效相关性明显的色谱峰(作为相关峰)，并用于谱-效相关数学模型的建立(具体如下所述)，相关峰峰面积的相关性、双侧显著性结果如表2所示；

表2 相关峰峰面积均值及其Pearson相关性、双侧显著性分析结果(n＝3)

注：**.在0.01水平(双侧)上显著相关；*.在0.05水平(双侧)上显著相关；“-”表示该处特征峰相对峰面积极小或无特征峰，可忽略；“p”代表色谱峰。

其中表2中所示的22个相关峰的保留时间依次为9.20min、11.68min、12.88min、17.86min、18.51min、21.25min、22.57min、26.10min、30.83min、34.72min、37.34min、43.26min、44.29min、46.03min、48.58min、52.07min、57.44min、69.05min、79.07min、84.25min、88.47min、100.56min。

对上述相关峰经DAD检测，其中在200～400nm区间内，在332nm附近处有最大吸收峰者，鉴定为苯乙醇苷类化合物；在250～280nm之间和在310～350nm之间，分别有最大吸收峰者，鉴定为黄酮类化合物，相关峰的DAD图谱见图2-23；相关峰中多共同含有苯乙醇苷类化合物和黄酮类化合物。

根据玻片凝血、断尾止血相关性结果和相关峰的DAD检测结果，发现广东紫珠的止血作用是其所含有的黄酮类化合物和苯乙醇苷类化合物成分协同作用的结果，各相关峰代表的化学成分与其止血作用的相关性各有差异，但都起到了一定止血凝血的作用，所以相关峰对应的组分中含有上述二类化合物。

3.运用主因子分析，即PCA分析，对9组不同提取方式得到的广东紫珠供试品的相关峰进行主成分分析，寻找出供试品相关峰对组分组件差异有较大影响且有较大累计贡献率的指标，利用主成分和理论成分的差异验证相关峰的相关性，从而使谱效关系的评价更加准确；分析后获得这些形状的特征值、贡献率(方差百分比)、累计贡献率，确定主成分各个成分对其贡献程度的差异，如表3所示，

表3 各变量的特征值及相应的百分比

主成分确定数量的方法主要基于三点：1)要保留的主成分个数累计贡献率不得低于80％；2)保留的主成分特征值必须大于1；3)经过KMO检验(越接近1越适合PCA因子分析)和Bartlett检验(显著性<0.01)；其中KOM检验和Bartlett检验(或称Bartlett’s球状检验)的检测结构如表4所示。

表4 KMO检验和Bartlett检验表

如表3和4所示，根据上述累计贡献率和主成分特征值，得到的结果包括两个主成分，主成分1和主成分2。随后对符合上述检验标准的主因子进行进一步的主成分分得到主成分的因子载荷矩阵(如表5所示)，及PCA载荷降维图(如图46所示)，其中载荷量绝对值越接近1，说明其影响主成分越大；其中，在载荷降维图(图46)中，六十醇提水洗为样品B-1，九五醇提萃取后水部位为样品C-2，水提物为样品为样品A，六十醇提二十醇(水洗)为B-2，六十醇提物为样品B，醇沉上清液为样品A-1，九五醇提为样品C，六十醇提六十水洗为样品B-3，九五醇提正丁醇为样品C-1；

表5 广东紫珠9种供试品PCA因子载荷矩阵

结合上述的主成分相关性分析的结果，根据相关度和显著性高，筛选和判断各个主要贡献主成分的贡献差异，主成分一对样品A-1、样品B、样品B-2、B-3和样品C、C-1的效果的贡献度较大，而主成分二对样品B-1的效果贡献度较大。

随后利用SPSS软件中的ward法聚类分析法对主成分分析进行验证，结果如图47所示，其中纵坐标表示提取方法A-C₂，其中S460醇提60洗代表B-3样品，S760醇提代表B样品，S560醇提20洗代表B-2样品，S995萃取正丁醇部位代表C-1样品，S1095醇提代表样品C，S2醇沉上清液代表样品A-1，S3水提物代表样品A，S895萃取水部位代表样品C-2，S660醇提水洗代表样品B-1；横坐标为Ward法聚类分析距离；

如图47所示，样品B-3、B和B-2等相对距离较近，主成分组分相近，样品B-1与其他样品距离较远，主成分组分与其他相差较远，这也与上述的主成分1和主成分2的对样品贡献度的差异相符合；结合PCA结果和各组供试品的特征峰的类别及其峰面积(大小)进行分析，并参照HPLC和DAD的检测图谱数据中成分的分布，得到的主成分一为苯乙醇苷类物质，主成分二为黄酮类化合物；同时得到结论，相关峰与药效的具有良好的相关性。

4.将上述具有显著相关性的相关峰(22个峰)的峰面积与玻片凝血、小鼠断尾止血效果的关系建立散点图，如图24-45所示，相关峰的峰面积与玻片凝血、断尾止血效果关系的变化呈负相关，与相关分析统计结果相一致，从而确定相关峰的峰面积与玻片凝血、断尾止血关系有一定的线性趋势关系。

利用线性回归分析对数据(数据包括相关性筛选后得到的相关峰峰面积和药理数据--即止血效率比值)进行逐步引入多元线性模型拟合，利用SPSS20.0软件进行拟合，其中拟合时会剔除显著性检验P值大于0.05的色谱峰；上述的22个相关峰中有14个相关峰被引入方程式拟合中，引入的相关峰分别为p14，p20，p28，p29，p31，p32，p37，p41，p42，p48，p51，p64，p66，p68(可参照表2所示)，保留时间依次为9.20min、12.88min、17.86min、18.51min、21.25min、22.57min、26.10min、34.72min、37.34min、43.26min、48.58min、79.07min、84.25min、88.47min，并依次定义为X₁，X₂，X₃，X₄，X₅...X₁₄，分别拟合玻片凝血和断尾止血的方程组，Y值代表止血效率比值；其中，模型建立时的部分数据(R方、P值和非标准比系数等)如表6和表7所示，表6为因变量为玻片凝血效果，表7为因变量为断尾止血效果；

表6 玻片凝血效果的模型建立的部分数据

表7 断尾止血效果模型建立的部分数据

根据模型建立时数据结果，尤其是R值、P值的结果，得出最优的方程组，拟合时，剔除与玻片凝血或断尾止血效果相关较大的色谱峰(根据显著性检验P值)，如下：

眼球取血-玻片凝血的效率比值与特征峰峰面积之间的谱效关系数学模型：

Y_玻片＝1.05293523242994-0.00215638329795342X₅-0.000119237377074156X₁₂-0.000317348228922039X₁₁+0.000389559368988219X₆-0.000120870779326365X₉-0.000298174292983868X₁₄+0.00046065208499242X₇-0.0000333159515258528X₁₃，P＝3.81780016863706E-38<0.01，R²＝0.999945754737945；

小鼠断尾止血的效率比值与特征峰峰面积之间的谱效关系数学模型：

Y_断尾＝0.748529703596608-0.0000743341327156706X₂-0.000148980185513651X₈+0.000763290974744721X₁₀-0.000906408936197708X₅-0.000315846631377703X₁-0.000157856047291727X₁₁-0.000164166200251442X₃+0.0000129153890779381X₄，P＝2.3203159885737E-163<0.01，R²＝0.999992332236408。

其中，上述最优方程组的P值小于其他模型P值，同时R方值均大于其他模型的R方值。

二、利于基于谱效关系的数学模型进行广东紫珠质量检测的方法

实施例1

(1)仪器与试药：

色谱仪：Agilent1260高效液相色谱(HPLC)仪；对照标准品连翘酯苷B、金石蚕苷皆为由中国食品药品检定研究院提供的对照标准品(上同)。试验数据使用SPSS20.0软件进行统计分析。

采集江西GMP药材基地提供广东紫珠药材样品3批，经上海医药工业研究院吴彤研究员鉴定为马鞭草科紫珠属广东紫珠Callicarpa kwangtungensis Chun的干燥地上部分，将上述药材粉碎为细粉，过4号筛，烘干，密封，冰柜(-4℃)储藏。阳性对照药：抗宫炎胶囊批号：Z20040083，生产厂家：江西心正药业股份有限公司；ICR小鼠132只雌雄各半，体重16-18g(SFP级)上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号码SCXK(沪)2008-0016，合格证编号：2008001624145。

(2)供试品溶液：精密称定供试品200mg，以50％乙醇-水溶解于10ml容量瓶中，摇匀，用0.22ul微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。此处供试品溶液的制备方法不局限于此，也可采用其他制备方法(更换溶剂，离心沉淀等方法)，以达到以同样浓度(200mg/ml)完成HPLC检测目的为准。

(3)色谱条件：

色谱柱：色谱柱Welch Material C18柱(4.6mmX250mm，5μm)；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

流动相A：含0.5％磷酸的水；流动相B：色谱级乙腈。时间(min)：0min→5min→20min→50min→80min→110min，流动相A％：95％→92％→88％→85％→82％→82％，流动相B：5％→8％→12％→15％→18％→18％；流速：1ml/min；取样量：20℃，40μL；柱温：35℃；检测器：UV-MWD/DAD检测器；检测波长：210mm；总时间：110min；样品溶剂：乙醇：水(1:1)。

(4)首先进行金石蚕苷标准品的HPLC图谱检测，随后对供试品溶液的HPLC图谱检测；以金石蚕苷的色谱峰为对照峰，校对供试品含有金石蚕苷的色谱峰的保留时间；随后，根据中药色谱指纹图谱相似度评价系统筛选出特征峰，筛选出保留时间与提取特征峰保留时间相差0.05min之内的色谱峰，提取保留时间分别为9.20min、12.88min、17.86min、18.51min、21.25min、22.57min、26.10min、34.72min、37.34min、43.26min、48.58min、79.07min、84.25min、88.47min特征 峰，并且依次被定义为X₁,X₂,X₃,X₄,X₅,X₆,X₇,X₈,X₉,X₁₀,X₁₁,X₁₂,X₁₃,X₁₄。各峰面积如表8所示；

表8 特征峰峰面积积分结果

X1	X2	X3	X4	X5	X6	X7	X8	X9	X10	X11	X12	X13	X14
														140.7	260.7	445.0	356.1	119.5	271.3	147.2	1352.4	1219.8	505.7	295.6	368.9	343.2	29.0

(5)将步骤4)中筛选出的特征峰的峰面积带入上述已经建立的谱效方程中，计算出凝血效果；

Y_玻片＝1.05293523242994-0.00215638329795342X₅-0.000119237377074156X₁₂-0.000317348228922039X₁₁+0.000389559368988219X₆-0.000120870779326365X₉-0.000298174292983868X₁₄+0.00046065208499242X₇-0.0000333159515258528X₁₃，P＝3.81780016863706E-38<0.01，R²＝0.999945754737945；

Y_断尾＝0.748529703596608-0.0000743341327156706X₂-0.000148980185513651X₈+0.000763290974744721X₁₀-0.000906408936197708X₅-0.000315846631377703X₁-0.000157856047291727X₁₁-0.000164166200251442X₃+0.0000129153890779381X₄，P＝2.3203159885737E-163<0.01，R²＝0.999992332236408。

计算得到玻片凝血效率比值为0.6633，断尾止血效率比值为0.6457。根据计算结果的Y值判断其止血效果优劣方法，本实施中的广东紫珠的止血效率比值Y_玻片、Y_断尾均小于1.0，表明该广东紫珠的药品质量较好。

为验证上述模型的实用性，采用断尾止血和玻片凝血模型进行止血药理试验：将16只小鼠均随机分为2组，每组8只，雌雄各半，分别编号为空白组、样品组，实验室条件下喂养小鼠一周后，按等生药量每天分别灌胃给药于第七天末次灌胃30分钟后，用镊子摘取小鼠右侧眼珠取血一滴于玻璃板上，静置每隔30S用针轻挑血液至有血丝形成，记为玻片凝血时间；再于小鼠尾部末段5mm左右处用利剪剪去其尾，保持切口面积大小基本相等，每隔30S用滤纸轻轻擦拭血迹，直到无血迹为止，记录断尾止血时间；将测得结果与空白组对照，得到止血效率比值＝测量值/空白组凝血时间；数学模型验证和实验值之间进行样品残差和偏差的检测，具体结果如表9所示；

表9 数学模型验证样品残差及偏差率

由于动物模型的不稳定性，导致实测个体值偏差率较大，但在建立的数学模型被带入峰面积计算得到的验证样品的止血效率比值与实测值的均值基本一致，总体判断结果较为准确，故上述模型具有较好的药效评估结果。

实施例2

重新选取待检测的广东紫珠中药，检测方法参照实施例1的内容；本次待检测广东紫珠的特征峰峰面积如表10所示，

表10 特征峰峰面积积分结果

X1	X2	X3	X4	X5	X6	X7	X8	X9	X10	X11	X12	X13	X14
														80.9	83.3	199.0	68.9	189.8	460.1	291.4	1994.9	378.5	371.6	586.9	159.9	654.1	296.2

利用上述的方程组进行计算本样品的断尾止血效果和玻片凝血效果值，断尾止血效率比值为0.5958，玻片凝血效率比值为0.4067；然后，进行本样品的实验检测，并且对数学模型验证和实验值之间进行样品残差和偏差的检测，结果如表11所示；

表11 数学模型验证样品残差及偏差率

利用上述建立的数学模型被带入峰面积计算得到的验证样品的止血效率比值与实测值的均值基本一致，总体判断结果较为准确。

实施例3

重新选取待检测的广东紫珠中药，检测方法参照实施例1的内容；本次待检测广东紫珠的特征峰峰面积如表12所示；

表12 特征峰峰面积积分结果

X1	X2	X3	X4	X5	X6	X7	X8	X9	X10	X11	X12	X13	X14
														18.6	24.8	33.1	46.1	0.0	160.1	91.4	94.0	38.4	511.3	61.1	129.6	44.3	28.5

利用上述的方程组进行计算本样品的断尾止血效果和玻片凝血效果值，断尾止血效率比值为1.1079，玻片凝血效率比值为1.1026；然后，进行本样品的实验检测，并且对数学模型验证和实验值之间进行样品残差和偏差的检测，结果如表13所示；

表13 数学模型验证样品残差及偏差率

利用上述建立的数学模型被带入峰面积计算得到的验证样品的止血效率比值与实测值的均值基本一致，总体判断结果较为准确。

根据实施例1‐3中待检测广东紫珠的数学模型预测实验数据和实验实测值，实施例1‐2中的广东紫珠止血效果比值均小于1，表明本两个实施例的广东紫珠质量较佳，实施例3中的广东紫珠止血效果的大于1，表明该实施例的广东紫珠的质量相对较差。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.基于谱效关系的广东紫珠质量控制方法，其特征是，具有如下步骤：

1)建立待检测广东紫珠供试品的HPLC的指纹图谱；2)然后筛选出特征峰；3)将步骤2)中所筛选的特征峰的峰面积带入谱效数学模型中进行计算，并根据计算所得的结果判断广东紫珠质量的优劣；

供试品溶液制备方法为：取供试品200mg，以50％乙醇-水溶解于10ml容量瓶中，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液；

色谱条件为：色谱柱采用Welch Material C18柱，流动相A为含0.5％磷酸的水，流动相B为色谱级乙腈；时间为0min→5min→20min→50min→80min→110min；流动相A％：95％→92％→88％→85％→82％→82％，流动相B：5％→8％→12％→15％→18％→18％，流速为1ml/min，取样量为40μl，取样温度为20℃，柱温为35℃，检测器为UV-MWD/DAD检测器，检测波长为210mm，总时间为110min，样品溶剂为乙醇和水以1:1比例混合；

指纹图谱中特征峰的色谱保留时间分别为：9.20min、12.88min、17.86min、18.51min、21.25min、22.57min、26.10min、34.72min、37.34min、43.26min、48.58min、79.07min、84.25min、88.47min

其中所述的谱效数学模型如下：X₁代表保留时间为9.20min的色谱峰峰面积，X₂代表保留时间为12.88min色谱峰峰面积，X₃代表保留时间为17.86min色谱峰峰面积，X₄代表保留时间为18.51min色谱峰峰面积，X₅代表保留时间为21.25min色谱峰峰面积，X₆代表保留时间为22.57min色谱峰峰面积，X₇代表保留时间为26.10min色谱峰峰面积，X₈代表保留时间为34.72min色谱峰峰面积，X₉代表保留时间为37.34min色谱峰峰面积，X₁₀代表保留时间为43.26min色谱峰峰面积，X₁₁代表保留时间为48.58min色谱峰峰面积，X₁₂代表保留时间为79.07min色谱峰峰面积，X₁₃代表保留时间为84.25min色谱峰峰面积，X₁₄代表保留时间为88.47min色谱峰峰面积；Y_玻片、Y_断尾代表止血效率比值；

Y_玻片＝1.05293523242994-0.00215638329795342X₅-0.000119237377074156X₁₂-0.000317348228922039X₁₁+0.000389559368988219X₆-0.000120870779326365X₉-0.000298174292983868X₁₄+0.00046065208499242X₇-0.0000333159515258528X₁₃，P＝3.81780016863706E-38<0.01，R²＝0.999945754737945；

Y_断尾＝0.748529703596608-0.0000743341327156706X₂-0.000148980185513651X₈+0.000763290974744721X₁₀-0.000906408936197708X₅-0.000315846631377703X₁-0.000157856047291727X₁₁-0.000164166200251442X₃+0.0000129153890779381X₄，

P＝2.3203159885737E-163<0.01，R²＝0.999992332236408；

步骤3)中判断的广东紫珠质量优劣的方法为：当供试品的Y_玻片和Y_断尾均小于1.0时，此广东紫珠质量为佳。

2.如权利要求1所述的基于谱效关系的广东紫珠质量控制方法，其特征是，步骤2)中，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统来完成对特征峰的筛选。