CN108152384B - 指纹图谱结合化学计量学区分广陈皮与陈皮的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了HPLC指纹图谱结合化学计量学区分广陈皮与陈皮的分析方法。包括：将广陈皮样品与陈皮样品分别进行前处理，通过高效液相色谱仪进行梯度洗脱获得广陈皮共有模式的指纹图谱，分析其指纹图谱信息得到以橙皮苷为参照峰的17个共有峰，并通过与标准品比对，鉴定了3个共有峰。然后对不同批次的广陈皮样品与陈皮样品的HPLC原始数据进行预处理后，进行相似度计算、聚类分析和主成分分析。本发明的分析结果以相似度数据范围、树状聚类分析图及PCA得分图的形式展示，构建的广陈皮质控模式清晰地揭示了广陈皮与陈皮规律性和差异性，能够直观判别其品种情况，无需再进行相关验证和分析，体现出品种之间的量化差异，可作为区分广陈皮与陈皮的分析方法。

Description

指纹图谱结合化学计量学区分广陈皮与陈皮的分析方法

技术领域

本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种指纹图谱结合化学计量学区分广陈皮与陈皮的分析方法。

背景技术

广陈皮是由茶枝柑的成熟果实的果皮晒干或低温干燥而成的，是陈皮的道地药材。广陈皮具有很高的药用价值，有“陈久者良”之说。从这个角度考虑，有效鉴别区分陈皮品种对于质量控制具有一定意义。药典通过性状鉴别区分广陈皮与普通陈皮，以橙皮苷含量作为质量控制的指标。虽然常规性状显微鉴别可以达到一定的效果，但是这种手段比较原始，不利于大规模检测，且检测误差也比较大。

另一方面，目前对陈皮的质量评价主要是着重于检测其中一个或几个化合物量为指标判定药材质量的结论过于局限，无法全面地评价药材质量。因此，找到一种既可以很简便地区分陈皮和广陈皮又可以客观全面量化地评价药材质量的方法具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于公开一种指纹图谱结合化学计量学区分广陈皮与陈皮的分析方法。

本发明所采取的技术方案是：一种指纹图谱结合化学计量学区分广陈皮与陈皮的分析方法，包括以下步骤：

(1)制备混合对照品溶液；

(2)制备供试品溶液；

(3)应用HPLC法构建指纹图谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到广陈皮样品与陈皮样品的HPLC指纹图谱数据进行预处理，最后应用相似度、聚类分析和主成分分析模型区分广陈皮与陈皮。

优选的，制备混合对照品溶液的方法是：称取橙皮苷、川陈皮素和桔皮素对照品，用甲醇溶解配制成储备液，吸取各对照品储备液，加甲醇稀释摇匀，配制成混合对照品溶液。

优选的，制备的混合对照品溶液中橙皮苷浓度为0.120mg/mL、川陈皮素浓度为0.017mg/mL、桔皮素浓度为0.015mg/mL。

优选的，HPLC法制作指纹图谱的条件是：色谱柱：采用十八烷基键合硅胶柱；流动相：乙腈-水，梯度洗脱；洗脱程序为：0-10min，5％-10％乙腈；10-50min，10％-30％乙腈；50-65min，30％-45％乙腈；65-85min，45％-90％乙腈；85-87min，90％-5％乙腈，保持5min；流速0.8～1.2mL/min；柱温25～35℃，进样量15～25μL，检测波长250～290nm。

进一步优选的，流速1.0mL/min；柱温30℃，进样量20μL，检测波长270nm。

优选的，主要特征峰为：与橙皮苷对应的9号峰、与川陈皮素对应的13号峰、与桔皮素对应的16号峰，其保留时间分别为35.87、65.06、69.71min；以9号峰橙皮苷为参照峰。

进一步优选的，特征峰还包括：保留时间为17.88min的1号峰、保留时间为19.04min的2号峰、保留时间为20.02min的3号峰、保留时间为26.88min的4号峰、保留时间为28.66min的5号峰、保留时间为29.56min的6号峰、保留时间为32.70min的7号峰、保留时间为33.64min的8号峰、保留时间为57.15min的10号峰、保留时间为60.97min的11号峰、保留时间为62.17min的12号峰、保留时间为65.96min的14号峰、保留时间为67.58min的15号峰、保留时间为72.18min的17号峰。

优选的，分析区分广陈皮与陈皮的方法是：将得到广陈皮与陈皮样品的HPLC数据导入指纹图谱相似度计算软件，对得到相似度进行分析，以数据大小范围形式对区分结果进行展示，当相似度小于0.4时为陈皮，当相似度大于0.9时为广陈皮。

本发明的有益效果是：该方法稳定性、精密度、重复性均符合要求，较全面反映了广陈皮、陈皮整体特征信息，能够直观的判别其品种情况，无需再进行相关验证和分析，可作为区分广陈皮与陈皮的分析方法。

附图说明

图1是本发明的广陈皮指纹图谱与混合对照品色谱图，其中A为广陈皮，B为混合标准品；9为橙皮苷峰，13为川陈皮素峰，16为桔皮素峰。

图2是本发明的广陈皮指纹图谱与陈皮色谱图，其中A为广陈皮，B为陈皮。

图3是本发明的32批广陈皮样品的HPLC指纹图谱。

图4是本发明32批广陈皮HPLC指纹图谱共有模式。

图5是32批广陈皮与10批陈皮样品的聚类分析,其中1-32为广陈皮，33-42为陈皮。

图6是32批广陈皮与10批陈皮PCA图。其中Ⅰ为陈皮，Ⅱ为广陈皮。

具体实施方式

通过下面具体实施例及其附图对本发明作进一步的详细描述，便于理解本发明的技术方案，但本发明的实施方式不限于此。

1.色谱条件:

色谱柱：依利特Hypersil ODS2C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱，洗脱程序为：0-10min，5％-10％(A)；10-50min，10％-30％(A)；50-65min，30％-45％(A)；65-85min，45％-90％(A)；85-87min，90％-5％(A)，保持5min；流速1.0mL/min；柱温30℃，进样量20μL；检测波长270nm。

2.方法与结果

2.1混合对照品溶液的制备

3种对照品分别用甲醇溶解配制成储备液，精密吸取各对照品适量，配制成浓度分别为橙皮苷0.120mg/mL、川陈皮素0.017mg/mL、桔皮素0.015mg/mL的混合对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备

精密称取广陈皮粉末0.1g，置于5mL量瓶中，加50％甲醇适量，超声处理60min，放冷，50％甲醇定容至刻度，摇匀，离心(10000转)5min，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3方法学考察

2.3.1精密度试验取同一供试品，连续进样6次，记录色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似性评价软件进行处理，相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好。

2.32重现性试验取同一批号广陈皮样品，平行制备6份供试品溶液，进行测定，记录色谱图；采用中药色谱指纹图谱相似性评价软件进行处理，相似度均大于0.99，说明方法重复性较好。

2.3.3稳定性试验取同一供试品，分别在0、3、6、12、24、48h进样，记录色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似性评价软件进行处理，相似度均大于0.99，表明供试品溶液在48h内保持稳定。

2.4指纹图谱的建立及特征峰的标定

2.4.1特征峰的确定及主要色谱峰的指认

通过比较32批广陈皮的色谱图，共标定17个共有特征色谱峰，17个共有特征色谱峰的面积占总面积大于90％。通过与对照品比对，分别指认了3个色谱峰，其中9号峰为橙皮苷、13号峰为川陈皮素、16号峰为桔皮素，保留时间分别为：35.87、65.06、69.71min(结果见图1)。在色谱图中9号峰是橙皮苷,其保留时间在36min左右，该峰为峰强度较高、分离度理想,因此以该峰作为参照峰。广陈皮32批，陈皮10批样本经HPLC分析记录85min，收集数据。广陈皮与陈皮代表性图谱见图2。

2.4.2.指纹图谱的相似度评价

采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”对32批样品数据进行分析(见图3)，采用多点校正后进行自动匹配，32批样品均数为共有模式，作为对照图谱(图4)，对32批广陈皮(编号为：1～32)及10批陈皮(编号为：33～42)进行评价。本发明专利中的广陈皮各共有峰与对照指纹图谱比对相似度均大于0.90，10批陈皮各共有峰与对照指纹图谱比对相似度均小于0.40，说明该发明建立的广陈皮指纹图谱共有模式能有效区分鉴别广陈皮与陈皮。结果见表1。

表1 32批广陈皮与10批陈皮的相似度

3.指纹图谱技术参数的确定

上述试验结果表明，以对照指纹图谱为参照计算相似度，32批广陈皮HPLC指纹图谱相似度均在0.90以上,说明该测定方法稳定可靠，指纹图谱相对稳定。因此暂定广陈皮HPLC指纹图谱标准为：供试品图谱应与对照指纹图谱一致，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。以广陈皮的共模作为10批陈皮的对照图谱，陈皮的相似度在0.305～0.379，陈皮的相似度暂定小于0.4。

综上所述，本发明建立的广陈皮HPLC指纹图谱的检测方法，以橙皮苷为参照峰，建立了一种广陈皮HPLC指纹图谱，标定了17个共有峰。采用标准品比对的方法，对广陈皮HPLC指纹图谱共有峰进行了分析研究，鉴定了9号峰(橙皮苷)、13号峰(川陈皮素)、16号峰(桔皮素)3个共有峰，进一步阐明了广陈皮的化学物质基础。

4.化学计量学分析

4.1聚类分析

将32批广陈皮与10批陈皮指纹图谱进行计算机图谱解析技术处理，获得其量化指纹特征(HPLC色谱峰峰面积数据)。采用IBM SPSS Statistics 20软件，将量化指纹特征作为变量进行系统聚类分析，以欧式距离平方为变量距离测定方法，采用最小方差法进行分析。该方法利用相似系数或欧氏距离等量值大小，将系列样品按近似程度由远及近聚集一起，本实验采用32批广陈皮与10批陈皮样品指纹图谱中以橙皮苷峰为参照峰的17个色谱峰相对峰面积，以欧氏距离为聚类统计量，获得42批样品聚类分析图，横坐标为临界值即为类间的距离，纵坐标为样品编号，临界值越小，表示谱图越相似，结果显示(图5)：当临界值为25时，分为两大类时，33～42(均为陈皮)聚为0一类，1～32(均为广陈皮)聚为一类；当临界值为13时，分为三大类，33～42(均为陈皮)聚为一类，1～19(2～7年广陈皮)聚为一类,20～32(8～30年广陈皮，除了14、15、18)聚为一类。聚类结果较为理想，可以有效地将2个品种区分。而且将储存7年及以下与7年以上广陈皮明显区分。

4.2主成分分析

PCA是将多个变量通过线性变换选出较少个数重要变量的一种多元统计分析方法，是常见的一种降维分析方法。采用SIMCA-P v11.5软件，对32批广陈皮与10批陈皮样品进行PCA分析，结果表明(图6)，广陈皮与陈皮样本群在PCA图中处于不同的空间聚落，可以较好地区分。陈皮聚落更为集中紧凑(Ⅰ类为33～42)，广陈皮聚落较分散(Ⅱ类为1～32)，离散度大于陈皮样本。

Claims (7)

1.一种指纹图谱结合化学计量学区分广陈皮与陈皮的分析方法，包括以下步骤：

（1）制备混合对照品溶液；

（2）制备供试品溶液：分别制备广陈皮供试品溶液、陈皮供试品溶液；

（3）分别对广陈皮供试品溶液、陈皮供试品溶液进行HPLC指纹图谱检测，将所得HPLC指纹图谱与混合对照品溶液的HPLC指纹图谱进行比较分析，用相似度、聚类分析和/或主成分分析模型区分广陈皮与陈皮；

HPLC法制作指纹图谱的条件是：色谱柱：采用十八烷基键合硅胶柱；流动相：乙腈-水，梯度洗脱；洗脱程序为：0-10 min，5 %-10 %乙腈；10-50 min，10%-30%乙腈；50-65 min，30%-45%乙腈；65-85 min，45 %-90 %乙腈；85-87 min，90%-5%乙腈，保持5 min；流速0.8~1.2 mL/min；柱温25~35℃，进样量15~25μL，检测波长250~290nm；

所述聚类分析为采用IBM SPSS Statistics 20软件，将量化指纹特征作为变量进行系统聚类分析，以欧式距离平方为变量距离测定方法，采用最小方差法进行分析；

所述主成分分析为采用SIMCA-P v11.5软件，对广陈皮与陈皮样品进行主成分分析。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，制备混合对照品溶液的方法是：称取橙皮苷、川陈皮素和桔皮素对照品，用甲醇溶解配制成储备液，吸取各对照品储备液，加甲醇稀释摇匀，配制成混合对照品溶液。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，混合对照品溶液中，橙皮苷浓度为0.120 mg/mL、川陈皮素浓度为0.017 mg/mL、桔皮素浓度为0.015 mg/mL。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，HPLC法制作指纹图谱的条件是，过柱流速1.0mL/min；柱温30℃，进样量20μL，检测波长270nm。

5.根据权利要求1或3所述的分析方法，其特征在于，混合对照品溶液的HPLC指纹图谱的主要特征峰为：与橙皮苷对应的9号峰、与川陈皮素对应的13号峰、与桔皮素对应的16号峰，其保留时间分别为35.87、65.06、69.71 min；以9号峰橙皮苷为参照峰。

6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，特征峰还包括：保留时间为17.88 min的1号峰、保留时间为19.04 min的2号峰、保留时间为20.02 min的3号峰、保留时间为26.88min的4号峰、保留时间为28.66 min的5号峰、保留时间为29.56 min的6号峰、保留时间为32.70 min的7号峰、保留时间为33.64 min的8号峰、保留时间为57.15 min的10号峰、保留时间为60.97 min的11号峰、保留时间为62.17 min的12号峰、保留时间为65.96 min的14号峰、保留时间为67.58 min的15号峰、保留时间为72.18 min的17号峰。

7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，分析区分广陈皮与陈皮的方法是：将得到广陈皮与陈皮样品的HPLC数据导入指纹图谱相似度计算软件，对得到相似度进行分析，以数据大小范围形式对区分结果进行展示，当相似度小于0.4时为陈皮，当相似度大于0.9时为广陈皮。

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