CN103398960A - 一种检测那曲肝素钙制品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及紫外-可见分光光度法检测技术领域，尤其涉及一种快速检测那曲肝素钙制品的方法，通过分光光度法检测混合液在200-800nm范围内的吸光度来检测溶液中那曲肝素钙的浓度，混合液为含荧光素、那曲肝素钙和缓冲液的溶液；优选地，混合液由荧光素的乙醇溶液、那曲肝素钙溶液、硫酸钠溶液和缓冲液混合而成。本发明应用的仪器简单，操作简便，可快速测定那曲肝素钙溶液的浓度。本发明的检测方法的抗干扰能力强，选择性强，且可监控那曲肝素钙溶液中的亚硝酸根离子和钙离子的含量是否严重超标。本发明检测方法的线性范围为3.0×10-3-4.5×10-2mol/L,检出限为1.0×10-3mol/L，完全适用于那曲肝素钙中间产品和最终产品的检测，可以有效地对那曲肝素钙的药品生产工艺进行监控。
Description
技术领域
本发明涉及紫外-可见分光光度法检测技术领域，尤其涉及一种快速检测那曲肝素钙制品的方法。
背景技术
肝素类药物是高度硫酸化的粘多糖硫酸酯，被广泛应用于治疗心脑血管疾病以及血液透析，其中在血液透析重症治疗方面，是目前唯一可用的特效药物。目前，在肝素类药物市场中占主导地位的是低分子肝素（LowMolecularWeightHeparin,LMWH），即平均分子量分布为3500-6500Da的肝素衍生物。因为相比于普通肝素（UnfractionatedHeparin,UFH），LMWH具有很多明显的临床应用优点，包括药理作用更加清晰、副作用大幅度减少、抗血栓活性持续时间长和生物利用度较高等。常见的LMWH制剂主要有5种，分别是那曲肝素钙（NadroparinCalcium，NC）、依诺肝素钠（EnoxaparinSodium，ES）、达肝素钠（DalteparinSodium，DS）、帕肝素钠（ParnaparinSodium，PS）和汀肝素钠（TinzaparinSodium，TS）。其中，NC是收录于《欧洲药典》（2010版）的LMWH药物之一，可以通过对来源自猪小肠粘膜的UFH进行亚硝酸法裂解制备得到，其化学结构式如图1所示。NC的主要质量标准特征包括：1）平均分子量分布为3600-5000Da；2）化学结构的还原末端为6-O-硫酸-2,5-脱水-D-甘露醇，非还原末端为2-O-硫酸-α-L-艾杜糖醛酸；3）钙含量按干燥品计算，一般应为9.5%-11.5%；4）游离硫酸根含量不大于0.5%，硫酸根离子与羧酸根离子的摩尔比范围一般为1.8-4.0；5）水溶液的pH值范围为5.0-8.0，一般接近pH6.0。
肝素的临床应用历史悠久，给无数的患者提供了确切的疗效。同时，在治疗过程中，对患者血液中的肝素水平进行监测是非常重要的，可以避免出现一些不良反应，如肝素过量引起的出血和血小板减少。此外，2008年2月，在美国发生了患者服用肝素钠药物后死亡的“百特事件”，其直接原因是相关的肝素钠药物中存在一种“类肝素物质”，即多硫酸软骨素。这次严重的不良反应事件说明了，在肝素类药物的生产工艺过程中，也需要建立一些有效的工艺监控技术，防止所得的药物制剂中混入有毒杂质或者溶液浓度异常，从根本上确保肝素类药物的质量安全。不过，对肝素类药物进行定量检测是比较困难的，因为其具有天然的多分散性和化学不均一性，所得紫外吸收光谱或者荧光光谱缺乏显著特征。许多常规测试方法，例如活化凝血时间测试法、离子色谱法、高效液相色谱法等，在应用于肝素样品的检测时，往往缺乏足够的灵敏度、可重复性和时效性。对此，一些先进的替用检测方法，最近也被越来越多地开发，以对肝素样品进行定性检测和定量检测，包括电化学方法、光散射方法、核磁共振方法，以及采用荧光探针试剂的荧光光度法等。这些检测技术虽然有助于改善检测的灵敏度和选择性，但是仍然存在较多的限制，例如辅助检测试剂的制备程序复杂、检测成本高、适用范围窄等。特别地，这些最终建立的检测方法难以按照《药品生产质量管理规范》（GMP）的要求和规定进行标准化和推广使用，因而无法应用于肝素类药品的实际生产工艺过程中。所以，我们迫切需要建立一种简单、快速、检测成本低和易于标准化操作的肝素类药品的分析检测技术，并将其进行实际应用。基于这些检测要求，紫外-可见分光光度法具有很显著的优点，包括操作流程简单、仪器价格便宜、测试成本低、检测过程耗时短、测试结果可重复性高等，尤其是可以依据GMP的要求对所得检测方法进行工艺验证和标准化，并能够最终归纳到药品的生产工艺规程中，作为一种有效的生产工艺监控技术。
发明内容
本发明的目的在于为克服现有技术的缺陷，而提供一种简单易行，抗干扰能力强，可监控亚硝酸根离子含量和钙离子含量是否超标，且对低分子肝素类药物具有选择性的快速检测那曲肝素钙制品的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种检测那曲肝素钙制品的方法，通过分光光度法检测混合液在200-800nm范围内的吸光度来检测溶液中那曲肝素钙的浓度，所述混合液为含荧光素、那曲肝素钙制品和缓冲液的溶液。
所述混合液为含荧光素、那曲肝素钙制品、SO4 2-和缓冲液的溶液。
所述混合液由荧光素的乙醇溶液、那曲肝素钙制品溶液、硫酸钠溶液和缓冲液混合而成。
所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、盐酸-三羟甲基氨基甲烷缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液和柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液中的任一种。
所述缓冲液为pH=3.0-7.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或pH=3.0-7.0的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液。
所述缓冲液为pH=6.2-7.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或pH=6.0-7.0的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液。
所述缓冲液为pH=6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
将所述混合液放置5-180min再测定其吸光度。
所述混合液中荧光素的浓度为1.5×10-5-4.5×10-5mol/L，硫酸钠的浓度为1.0×10-4-8.0×10-3mol/L。
所述测定那曲肝素钙浓度的方法的线性范围为3.0×10-3-4.5×10-2mol/L,检出限为1.0×10-3mol/L。
所述检测方法可用于监控那曲肝素钙制品中亚硝酸根离子的含量。
所述检测方法可用于监控那曲肝素钙制品中钙离子的含量。
由于那曲肝素钙制品的溶液近中性，且含有大量的钙离子和硫酸根离子，为了保证检测结果的准确性和可重复性，建立的紫外-可见分光光度法检测体系采用近中性的缓冲体系，并且为了避免硫酸根离子的干扰，向检测体系中预先引入硫酸根离子。此外，在那曲肝素钙的实际生产工艺过程中，在完成裂解、还原、转钙、超滤等工序以后，需要对所得中间产品溶液进行醇沉处理，以取得符合分子量分布标准的最终产品，所以在进行检测时需考虑到乙醇的影响，因此混合液的优选方式为水和乙醇的混合溶液以避免那曲肝素钙中少量乙醇对检测结果的干扰。在柠檬酸盐缓冲液中，荧光素在可见光区的最大吸收峰位于490±1nm处，在紫外光区的最大吸收峰位于235±1nm处。而那曲肝素钙可以明显地降低荧光素在490±1nm处的吸光度，且吸光度的下降值与那曲肝素钙溶液的浓度成线性关系；同时，那曲肝素钙可以明显地提高荧光素在235±1nm处的吸光度，且吸光度的上升值与那曲肝素钙溶液的浓度成线性关系。由此，建立了一种快速准确的检测那曲肝素钙制品方法。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明应用的仪器简单，操作简便，在预先测定标准工作曲线的情况下，可快速检测那曲肝素钙制品中那曲肝素钙的浓度。本发明的检测方法的抗干扰能力强，可以避免亚硝酸根离子、钙离子、钠离子、硫酸根离子的干扰，适用于那曲肝素钙的实际生产工艺过程中，且可监控那曲肝素钙制品中亚硝酸根离子含量和钙离子含量是否超标。本发明的检测方法需要有钙离子的参与，而常见的五种低分子肝素制剂中只有那曲肝素钙是本发明检测方法的检测对象，因此本发明检测方法对低分子肝素类药物具有很好的选择性。本发明检测方法的线性范围为3.0×10-3-4.5×10-2mol/L,检出限为1.0×10-3mol/L，完全适用于那曲肝素钙中间产品和最终产品的检测，可以有效地对生产工艺进行监控。
显色时间试验的结果表明，本发明的荧光素检测体系在混合5分钟后取得稳定的吸光度值，并在180分钟内没有明显改变，因此本发明的荧光素检测体系具有良好的稳定性。氯化钙干扰试验、普通肝素钠检测试验和依诺肝素钠检测试验结果表明，那曲肝素钙对荧光素在490±1nm处的吸光度的影响，需要有钙离子的参与，因此对那曲肝素钙的检测具有较高的专一性。亚硝酸钠干扰试验的结果表明，外加的大量的亚硝酸钠对本发明荧光素检测体系在490±1nm处的吸光度没有明显影响，而且吸收光谱在354±1nm处出现了一个新的吸收峰，其吸光度与荧光素检测体系中的亚硝酸钠浓度成正比线性关系，因此本发明的检测方法可用于对那曲肝素钙溶液中亚硝酸钠残留量的检测。
附图说明
图1为那曲肝素钙的化学结构式；
图2为荧光素检测体系在pH6.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的吸收光谱；
图3为荧光素检测体系在不同pH值（pH3.0-6.0）的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的吸收光谱；
图4为荧光素检测体系在不同pH值（pH6.0-7.0）的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的吸收光谱；
图5为荧光素检测体系在pH6.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的吸收光谱；
图6为荧光素检测体系在不同pH值的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液中的吸收光谱；
图7不同荧光素乙醇溶液浓度的检测体系的吸收光谱（200-800nm）；
图8不同荧光素乙醇溶液浓度的检测体系的吸收光谱（400-600nm）；
图9不同硫酸钠溶液浓度对荧光素测试体系的影响；
图10为荧光素检测体系在不同显色时间的吸光度；
图11为外加亚硝酸钠溶液的荧光素检测体系的吸收光谱；
图12为外加氯化钙溶液的荧光素检测体系的吸收光谱；
图13为荧光素检测体系检测普通肝素钠的吸收光谱；
图14为荧光素检测体系检测依诺肝素钠的吸收光谱；
图15为荧光素检测体系检测那曲肝素钙的标准工作曲线吸收光谱（200-800nm）；
图16为荧光素检测体系检测那曲肝素钙的标准工作曲线吸收光谱（350-700nm）。
具体实施方式
为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进一步介绍和说明。
本发明中所使用的主要化学试剂包括：荧光素（C20H12O5，分析纯，CAS号：2321-07-5，英文名称为：Fluorescein，简称为：FL）；柠檬酸（C6H8O7·2H2O，分析纯，CAS号：77-92-9）；柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O，分析纯，CAS号：68-04-2）；硫酸钠（Na2SO4，分析纯，CAS号：7757-82-6）；氯化钙（CaCl2，药用级，CAS号：10043-52-4）；亚硝酸钠（NaNO2，药用级，CAS号：7632-00-0）。
实验一：不同盐类的缓冲体系的选择
取3支10mL比色管，分别作为空白对照体系（不加荧光素和那曲肝素钙）、荧光素显色体系（不加那曲肝素钙）、荧光素-那曲肝素钙检测体系。首先，往所有比色管中，分别加入5.0mL0.1mol/LpH6.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和1.0mL2.0×10-2mol/L的硫酸钠溶液。然后，往荧光素显色体系中，加入0.5mL1.0×10-3mol/L的荧光素乙醇溶液；往荧光素-那曲肝素钙检测体系中，加入0.5mL1.0×10-3mol/L的荧光素乙醇溶液和1.0mL1.0×10-2mol/L的那曲肝素钙溶液。最后，用注射用水将所得溶液稀释至刻度，摇匀，充分混合。静置10分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在200－800nm范围内，分别扫描荧光素显色体系和荧光素-那曲肝素钙检测体系的吸收光谱。
测试完成后，将pH6.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液分别换成其它4种不同的缓冲液，包括pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液、pH7.1的盐酸-三羟甲基氨基甲烷缓冲液、pH7.5的硼酸-硼砂缓冲液和pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓溶液，重复以上试验。所得测试结果列于表1，同时pH6.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的吸收光谱如图2所示。
表1不同盐类的缓冲体系的选择试验测试结果
注：在磷酸盐缓冲体系中，加入那曲肝素钙样品后，混合溶液产生淡黄色粉末状沉淀。
从表1和图2可以发现，采用pH6.2柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的荧光素-那曲肝素钙检测体系对那曲肝素钙具有良好的灵敏度，在可见光区内的吸光度变化值相对最大。因此，选用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行后续实验。
实验二：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值选择
取3支10mL比色管，分别作为空白对照体系（不加荧光素和那曲肝素钙）、荧光素显色体系（不加那曲肝素钙）、荧光素-那曲肝素钙检测体系。首先，往所有比色管中，分别加入5.0mL0.1mol/LpH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和1.0mL2.0×10-2mol/L的硫酸钠溶液。然后，往荧光素显色体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液；往荧光素-那曲肝素钙检测体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液和1.0mL1.0×10-2mol/L的那曲肝素钙溶液。最后，用注射用水将所得溶液稀释至刻度，摇匀，充分混合。静置10分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在200－800nm范围内，分别扫描荧光素显色体系和荧光素-那曲肝素钙检测体系的吸收光谱。
测试完成后，将pH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液分别换成其它8种不同pH值的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，包括pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH6.2、pH6.4、pH6.6、pH6.8和pH7.0，重复以上试验。所得测试结果列于表2；相应的吸收光谱（400-600nm）按照pH值范围，分别如图3（pH3.0-pH6.0）和图4（pH6.0-pH7.0）所示。
表2柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系的pH值选择试验测试结果
综合表2、图3和图4的结果，可以发现在pH3.0-pH6.2范围内，随着柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值逐渐增大，荧光素检测体系在可见光区内的最大吸收峰逐渐发生红移，从436nm红移至490nm，其在紫外光区内的吸收峰波长变化幅度则相对较小。而在pH6.2-pH7.0范围内，随着柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值逐渐增大，荧光素检测体系在可见光区的最大吸收峰都位于490±1nm处，保持不变。同时，在最大吸收峰的吸光度变化值方面，当柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值为pH6.6时，变化值最大，且荧光素检测体系的吸光度接近1.0。因此，可以将pH6.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为荧光素检测体系的较优选择。
实验三：采用pH6.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的荧光素检测体系
取3支10mL比色管，分别作为空白对照体系（不加荧光素和那曲肝素钙）、荧光素显色体系（不加那曲肝素钙）、荧光素-那曲肝素钙检测体系。首先，往所有比色管中，分别加入5.0mL0.1mol/LpH6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和1.0mL2.0×10-2mol/L的硫酸钠溶液。然后，往荧光素显色体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液；往荧光素-那曲肝素钙检测体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液和1.0mL2.0×10-2mol/L的那曲肝素钙溶液。最后，用注射用水将所得溶液稀释至刻度，摇匀，充分混合。静置10分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在200－800nm范围内，分别扫描荧光素显色体系和荧光素-那曲肝素钙检测体系的吸收光谱，所得结果如图5所示。
从图5可以发现，当那曲肝素钙样品溶液的浓度由1.0×10-2mol/L增大为2.0×10-2mol/L时，所得吸收光谱在可见光区内的最大吸收峰仍然是490±1nm，相应的吸光度值呈现下降趋势；同时，在紫外光区内的最大吸收峰保持在235±1nm处，相应的吸光度值出现上升趋势。这说明所得荧光素检测体系对不同浓度的那曲肝素钙样品溶液的检测有良好的适用性。
实验四：柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液的pH值选择
取3支10mL比色管，分别作为空白对照体系（不加荧光素和那曲肝素钙）、荧光素显色体系（不加那曲肝素钙）、荧光素-那曲肝素钙检测体系。首先，往所有比色管中，分别加入5.0mL0.1mol/LpH3.0的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液和1.0mL2.0×10-2mol/L的硫酸钠溶液。然后，往荧光素显色体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液；往荧光素-那曲肝素钙检测体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液和1.0mL1.0×10-2mol/L的那曲肝素钙溶液。最后，用注射用水将所得溶液稀释至刻度，摇匀，充分混合。静置10分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在200－800nm范围内，分别扫描荧光素显色体系和荧光素-那曲肝素钙检测体系的吸收光谱。
测试完成后，将pH3.0的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液分别换成其它8种不同pH值的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，包括pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5和pH7.0，重复以上试验。所得测试结果列于表3，相应的吸收光谱（400-600nm）如图6所示。
表3柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲体系的pH值选择试验测试结果
综合表3和图6的结果可以发现，采用柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液的荧光素检测体系，与采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的荧光素检测体系，在pH3.0-pH7.0范围内，具有相似的最大吸收峰红移现象，并都在pH6.0-pH7.0范围内取得最优的检测灵敏度，所得吸光度变化值相对较大。不过，考虑到缓冲液的缓冲容量和长期稳定性，以及缓冲液配制的简便性，选用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行后续试验。
实验五：荧光素乙醇溶液浓度的选择
取3支10mL比色管，分别作为空白对照体系（不加荧光素和那曲肝素钙）、荧光素显色体系（不加那曲肝素钙）、荧光素-那曲肝素钙检测体系。首先，往所有比色管中，分别加入5.0mL0.1mol/LpH6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和1.0mL2.0×10-2mol/L的硫酸钠溶液。然后，往荧光素显色体系中，加入0.5mL5.0×10-5mol/L的荧光素乙醇溶液；往荧光素-那曲肝素钙检测体系中，加入0.5mL5.0×10-5mol/L的荧光素乙醇溶液和1.0mL1.6×10-2mol/L的那曲肝素钙溶液。最后，用注射用水将所得溶液稀释至刻度，摇匀，充分混合。静置10分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在200－800nm范围内，分别扫描荧光素显色体系和荧光素-那曲肝素钙检测体系的吸收光谱。
测试完成后，将5.0×10-5mol/L的荧光素乙醇溶液分别换成其它7种不同浓度的荧光素乙醇溶液，包括1.0×10-4mol/L、3.0×10-4mol/L、5.0×10-4mol/L、6.0×10-4mol/L、9.0×10-4mol/L、1.2×10-3mol/L和1.5×10-3mol/L，重复以上试验。所得测试结果列于表4，相应的吸收光谱如图7和图8所示。
表4荧光素乙醇溶液浓度的选择试验测试结果
综合表4、图7和图8的结果可以发现，荧光素乙醇溶液的浓度对检测体系在可见光区内的吸光度变化值有较大的影响，并在3.0×10-4-9.0×10-4mol/L的范围内取得良好的检测结果。同时，荧光素乙醇溶液的浓度对检测体系在紫外光区内的吸光度变化值的影响很小，在5.0×10-5-1.2×10-3mol/L范围内，相应的吸光度变化值都十分接近于0.34。因为选择适合的吸光度范围（通常是0.15-1.00），可以更好地减少检测结果的误差，所以将荧光素乙醇溶液的浓度选择为3.0×10-4mol/L。不过，当需要提高所得荧光素检测体系对那曲肝素钙的检测灵敏度，以实现对很低浓度的那曲肝素钙溶液样品进行检测时，可以选用更高浓度的荧光素乙醇溶液，例如6.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液。
实验六：硫酸钠溶液浓度的选择
取3支10mL比色管，分别作为空白对照体系（不加荧光素和那曲肝素钙）、荧光素显色体系（不加那曲肝素钙）、荧光素-那曲肝素钙检测体系。首先，往所有比色管中，分别加入5.0mL0.1mol/LpH6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和1.0mL1.0×10-3mol/L的硫酸钠溶液。然后，往荧光素显色体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液；往荧光素-那曲肝素钙检测体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液和1.0mL1.6×10-2mol/L的那曲肝素钙溶液。最后，用注射用水将所得溶液稀释至刻度，摇匀，充分混合。静置10分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在200－800nm范围内，分别扫描荧光素显色体系和荧光素-那曲肝素钙检测体系的吸收光谱。
测试完成后，将1.0×10-3mol/L的硫酸钠溶液分别换成其它6种不同浓度的硫酸钠溶液，包括2.0×10-3mol/L、5.0×10-3mol/L、8.0×10-3mol/L、1.0×10-2mol/L、2.0×10-2mol/L、5.0×10-2mol/L和8.0×10-2mol/L，重复以上试验。所得测试结果如图9所示。
依据《中国药典》和《欧洲药典》的要求，那曲肝素钙最终产品的游离硫酸根离子的含量不大于0.5%；也就是说，当那曲肝素钙样品的浓度为0.02mol/L时，其对应的硫酸根离子的浓度最高可达到0.083mol/L，即检测体系中的硫酸根离子含量为8.3×10-5mol。在荧光素检测体系中加入硫酸钠溶液，就是为了避免那曲肝素钙样品中的硫酸根离子对荧光素检测体系造成冲击性干扰。实验六的测试结果证明了这一点。从图9可以发现，在1.0×10-3-8.0×10-2mol/L范围内，硫酸钠溶液浓度的变化，对荧光素检测体系的在490nm和236nm吸收峰的吸光度变化值的影响很小。特别地，当硫酸钠溶液的浓度达到1.0×10-2mol/L以上时，荧光素检测体系的检测结果十分稳定。因此，将硫酸钠溶液的浓度选择为2.0×10-2mol/L。
实验七：硫酸盐种类的选择
取3支10mL比色管，分别作为空白对照体系（不加荧光素和那曲肝素钙）、荧光素显色体系（不加那曲肝素钙）、荧光素-那曲肝素钙检测体系。首先，往所有比色管中，分别加入5.0mL0.1mol/LpH6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和1.0mL2.0×10-2mol/L的硫酸钠溶液。然后，往荧光素显色体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液；往荧光素-那曲肝素钙检测体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液和1.0mL1.6×10-2mol/L的那曲肝素钙溶液。最后，用注射用水将所得溶液稀释至刻度，摇匀，充分混合。静置10分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在200－800nm范围内，分别扫描荧光素显色体系和荧光素-那曲肝素钙检测体系的吸收光谱。
测试完成后，将2.0×10-2mol/L硫酸钠溶液换成其它2种不同种类的硫酸盐溶液，包括2.0×10-2mol/L的硫酸钾溶液和2.0×10-3mol/L的硫酸铵溶液，重复以上试验。结果列于表5。
表5硫酸盐的种类的选择试验测试结果
从表5可以发现，不同的硫酸盐（Na2SO4、K2SO4和(NH4)2SO4），对荧光素检测体系的检测结果没有明显的影响。
实验八：荧光素检测体系的显色时间选择
取2支10mL比色管，分别作为空白对照体系（不加荧光素和那曲肝素钙）和荧光素-那曲肝素钙检测体系。首先，往2支比色管中，分别加入5.0mL0.1mol/LpH6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和1.0mL2.0×10-2mol/L的硫酸钠溶液。然后，往荧光素-那曲肝素钙检测体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液和1.0mL1.5×10-2mol/L的那曲肝素钙溶液。最后，用注射用水将所得溶液稀释至刻度，摇匀，充分混合。采用不同的显色时间，包括5、10、15、20、25、30、40、50、60、90、120、150和180分钟，然后以空白对照体系作为空白对照溶液，在200－600nm范围内，扫描荧光素-那曲肝素钙检测体系的吸收光谱，记录490nm和235nm处的吸光度，测试结果如图10所示。
由图10可以发现，荧光素-那曲肝素钙检测体系的吸光度在显色5分钟后即达到稳定值，并在180分钟内保持稳定（变化值小于稳定值的3%）。这表明所得荧光素-那曲肝素钙检测体系具有良好的稳定性。同时考虑到实际样品检测过程中的可操作性，因此将检测体系的显色时间选择为10分钟。
实验九：荧光素检测体系的亚硝酸钠干扰试验
取7支10mL比色管，其中1支作为空白对照体系（不加荧光素和那曲肝素钙），另外6支为荧光素-那曲肝素钙检测体系。首先，往所有比色管中，分别加入5.0mL0.1mol/LpH6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和1.0mL2.0×10-2mol/L的硫酸钠溶液。然后，往所有荧光素-那曲肝素钙检测体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液和1.0mL2.0×10-2mol/L的那曲肝素钙溶液。接着，往其中5份荧光素-那曲肝素钙检测体系中，分别加入0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mL2.0mol/LNaNO2溶液。最后，用注射用水将所得溶液稀释至刻度，摇匀，充分混合。静置10分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在200－800nm范围内，扫描荧光素-那曲肝素钙检测体系的吸收光谱，测试结果如图11所示。
由图11可以发现，当外加亚硝酸钠的量超过实际允许含量500倍以上时，荧光素-那曲肝素钙检测体系在490nm处的吸光度没有明显的变化。这充分证明了，所得荧光素-那曲肝素钙检测体系在可见光区内，对亚硝酸钠有很强的抗干扰能力。此外，随着亚硝酸钠的加入，荧光素-那曲肝素钙检测体系的吸收光谱在355nm处出现了一个新的吸收峰，并且其吸光度的大小与外加亚硝酸钠的量成正比关系，因此可以应用于对亚硝酸钠的定量检测。进一步的研究结果表明，应用该荧光素-那曲肝素钙体系对亚硝酸钠进行检测，其标准工作曲线方程为：A=21.28CNO2-+0.0464，R2=0.9999，线性范围为：5.0×10-3mol/L-8.0×10-2mol/L，检出限为：2.0×10-3mol/L。这表明，所得荧光素-那曲肝素钙检测体系完全可以验证那曲肝素钙产品溶液中的亚硝酸钠含量是否严重超标，监控其药品质量。
实验十：荧光素检测体系的氯化钙干扰试验
取7支10mL比色管，其中1支作为空白对照体系（不加荧光素和那曲肝素钙），另外6支为荧光素-那曲肝素钙检测体系。首先，往所有比色管中，分别加入5.0mL0.1mol/LpH6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和1.0mL2.0×10-2mol/L的硫酸钠溶液。然后，往所有荧光素-那曲肝素钙检测体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液和1.0mL2.0×10-2mol/L的那曲肝素钙溶液。接着，往其中5份荧光素-那曲肝素钙检测体系中，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL5.0mol/LCaCl2溶液。最后，用注射用水将所得溶液稀释至刻度，摇匀，充分混合。静置10分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在200－800nm范围内，扫描荧光素-那曲肝素钙检测体系的吸收光谱，测试结果如图12所示。
由图12可以发现，外加氯化钙溶液会对荧光素检测体系在490nm处的吸收峰产生显著的影响。这说明了那曲肝素钙样品溶液中的钙离子参与了整个显色体系的形成，外加大量钙离子会改变显色体系的结构，进而导致吸光度大幅度下降。进一步的研究结果表明，当那曲肝素钙样品溶液的浓度为0.02mol/L（以其干燥品的钙含量最高允许值11.5%计算，则对应的钙离子浓度为0.23mol/L，即荧光素检测体系中钙离子浓度为0.023mol/L），即荧光素检测体系中的钙离子含量为0.23mM，并要求荧光素检测体系的测试结果没有发生明显变化时，外加钙离子的允许量可以达到0.50mM，大于实际可能含量的3倍以上。因此，当那曲肝素钙样品符合相应的质量标准，即其钙含量按干燥品计算应为9.5%-11.5%时，所得荧光素检测体系的测试结果不会因钙离子含量的变化而产生误差。同时，当检测的那曲肝素钙样品的钙含量严重超标，比如达到30%以上时，所得的吸收光谱也可以反映出这种情况，从而对其药品质量进行监控。
实验十一：荧光素检测体系的普通肝素钠检测试验
取3支10mL比色管，分别作为空白对照体系（不加荧光素和普通肝素钠）、荧光素显色体系（不加普通肝素钠）、荧光素-普通肝素钠检测体系。首先，往所有比色管中，分别加入5.0mL0.1mol/LpH6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和1.0mL2.0×10-2mol/L的硫酸钠溶液。然后，往荧光素显色体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液；往荧光素-普通肝素钠检测体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液和1.0mL2.0×10-2mol/L的普通肝素钠溶液。最后，用注射用水将所得溶液稀释至刻度，摇匀，充分混合。静置10分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在200－800nm范围内，分别扫描荧光素显色体系和荧光素-普通肝素钠检测体系的吸收光谱，所得结果如图13所示。
由图13可以发现，普通肝素钠对荧光素检测体系在可见光区内的吸收光谱没有明显的影响；在加入普通肝素钠样品前后，490nm处的吸光度没有发生改变。同时，普通肝素钠对荧光素检测体系在紫外光区内的吸收光谱有显著的影响，其最大吸收峰由235nm蓝移至229nm，相应的吸光度则由0.544大幅度上升至1.693。所得结果进一步证明，那曲肝素钙与荧光素之间的相互作用，需要有钙离子的参与，不只是肝素母链单独与荧光素发生结合。
实验十二：荧光素检测体系的依诺肝素钠检测试验
取3支10mL比色管，分别作为空白对照体系（不加荧光素和依诺肝素钠）、荧光素显色体系（不加依诺肝素钠）、荧光素-依诺肝素钠检测体系。首先，往所有比色管中，分别加入5.0mL0.1mol/LpH6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和1.0mL2.0×10-2mol/L的硫酸钠溶液。然后，往荧光素显色体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液；往荧光素-依诺肝素钠检测体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液和1.0mL2.0×10-2mol/L的依诺肝素钠溶液。最后，用注射用水将所得溶液稀释至刻度，摇匀，充分混合。静置10分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在200－800nm范围内，分别扫描荧光素显色体系和荧光素-依诺肝素钠检测体系的吸收光谱，所得结果如图14所示。
由图14可以发现，依诺肝素钠的检测结果与普通肝素钠的检测结果十分相似。依诺肝素钠对荧光素检测体系在可见光区内的吸收光谱也是没有明显的影响；在加入依诺肝素钠样品前后，490nm处的吸光度没有发生改变。同时，依诺肝素钠对荧光素检测体系在紫外光区内的吸收光谱有显著的影响，其最大吸收峰由235nm红移至242nm，相应的吸光度则由0.564大幅度上升至3.712。这表明荧光素检测体系不能对依诺肝素钠进行定量检测，所得荧光素检测体系对那曲肝素钙的检测具有较好的选择性。
实验十三：荧光素体系检测那曲肝素钙的线性范围和检出限
取3支10mL比色管，分别作为空白对照体系（不加荧光素和那曲肝素钙）、荧光素显色体系（不加那曲肝素钙）、荧光素-那曲肝素钙检测体系。首先，往所有比色管中，分别加入5.0mL0.1mol/LpH6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和1.0mL2.0×10-2mol/L的硫酸钠溶液。然后，往荧光素显色体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液；往那曲肝素钙检测体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液和1.0mL1.0×10-2mol/L的那曲肝素钙溶液。最后，用注射用水将所得溶液稀释至刻度，摇匀，充分混合。静置10分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在200－800nm范围内，分别扫描荧光素显色体系和那曲肝素钙检测体系的吸收光谱。
测试完成后，将1.0mL1.0×10-2mol/L的那曲肝素钙溶液分别换成其它20种不同浓度的那曲肝素钙溶液，包括4.0×10-4mol/L、8.0×10-4mol/L、1.0×10-3mol/L、2.0×10-3mol/L、3.0×10-3mol/L、4.0×10-3mol/L、5.0×10-3mol/L、6.0×10-3mol/L、7.0×10-3mol/L、8.0×10-3mol/L、9.0×10-3mol/L、1.0×10-2mol/L、1.5×10-2mol/L、2.0×10-2mol/L、2.5×10-2mol/L、3.0×10-2mol/L、3.5×10-2mol/L、4.0×10-2mol/L、4.5×10-2mol/L和5.0×10-2mol/L，重复以上试验。
取得所有测试结果以后，按照常规的计算方法，以那曲肝素钙溶液的浓度为横坐标、以荧光素体系在490nm吸收峰的吸光度相对下降值或者荧光素体系在235nm吸收峰的吸光度相对上升值为纵坐标，进行线性拟合分析。
结果表明，所得荧光素体系对那曲肝素钙检测的线性范围为：3.0×10-3-4.5×10-2mol/L，有效检出限为：1.0×10-3mol/L。
实施例一
（1）荧光素检测体系检测那曲肝素钙的标准工作曲线
取9支10mL比色管，其中1支作为空白对照体系（不加荧光素和那曲肝素钙）、1支作为荧光素显色体系（不加那曲肝素钙）、7支作为荧光素-那曲肝素钙检测体系。首先，往所有比色管中，分别加入5.0mL0.1mol/LpH6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和1.0mL2.0×10-2mol/L的硫酸钠溶液。然后，往荧光素显色体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液；往7支荧光素-那曲肝素钙检测体系中，加入0.5mL3.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液和1.0mL不同浓度（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0×10-2mol/L）的那曲肝素钙溶液。最后，用注射用水将所得溶液稀释至刻度，摇匀，充分混合。静置10分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在200－800nm范围内，分别扫描荧光素显色体系和荧光素-那曲肝素钙检测体系的吸收光谱，并记录490nm和235nm处的吸光度。所得测试结果列于表6，吸收光谱如图15和图16所示。
表6荧光素检测体系检测那曲肝素钙的标准工作曲线试验结果
注：吸光度的相对下降值以及相对上升值，是指荧光素-那曲肝素钙检测体系的吸光度与荧光素显色体系的吸光度之间的差值的绝对值。
由表6、图15和图16可以发现，当那曲肝素钙样品的浓度在1.0×10-2-4.0×10-2mol/L范围内时，荧光素检测体系在490nm吸收峰处的吸光度相对下降值，以及235nm吸收峰处的吸光度相对上升值，都与那曲肝素钙样品的浓度呈现良好的线性关系。进一步计算得到，在490nm吸收峰处的标准工作曲线方程为：ΔA490=7.479CNC–0.0485，R2=0.9969；在235nm吸收峰处的标准工作曲线方程为：ΔA235=21.421CNC–0.035，R2=0.9987。由于在实际的药品生产工艺过程中，那曲肝素钙溶液的浓度范围为1.5×10-2-4.0×10-2mol/L，处于上述试验所得的线性范围之内，因此该检测方法适用于那曲肝素钙实际样品的检测。此外，由于荧光素检测体系在可见光区内的稳定性比其在紫外光区内的稳定性相对较好，所得测试结果更加准确，因此在实际应用中，采用490nm吸收峰处的吸光度进行定量检测。
（2）荧光素检测体系对那曲肝素钙生产工艺的中间产品溶液检测
另取6支10mL比色管，作为实际样品测试体系，每个样品重复测试三次，取平均值。那曲肝素钙的生产工艺流程与中国专利《邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱法测定那曲肝素钙的溶液浓度》（专利公开号：CN103149170A）所公开的工艺一致，包括溶解、裂解、还原、转钙、超滤、醇沉、离心、干燥等工序。在那曲肝素钙的实际生产过程中，取样两次，分别是转钙工序之后的中间产品溶液与超滤工序之后的中间产品溶液。所得样品溶液不需要进行处理，直接按照实施例一的试验方法，配制得到那曲肝素钙实际样品检测体系溶液，并进行紫外-可见分光光度法检测。最后，将所得的490nm吸收峰的吸光度相对下降值代入以上得到的490nm吸收峰的标准工作曲线方程，计算溶液浓度。所得测试结果列于表7。
表7荧光素检测体系对那曲肝素钙实际样品的检测结果
表7的测试结果在那曲肝素钙的药品生产工艺过程中具有指导作用。经转钙工序处理后的那曲肝素钙中间产品溶液，再经超滤工序处理以后，其浓度由2.34×10-2mol/L明显地提高至3.75×10-2mol/L，这充分证明了超滤工序已经达到了预期的效果。此外，结合多次检测累积得到的平均数据，表7的测试结果还可以为下一步醇沉工序的工艺参数设计提供有力的参考。
实施例二：荧光素检测体系对那曲肝素钙制剂产品的检测
在实施例一检测那曲肝素钙的标准工作曲线的实验基础上，另取3支10mL比色管，作为实际样品测试体系，每个样品重复测试三次，取平均值。取同一批次的3支那曲肝素钙制剂产品（规格为5000IU/0.5mL）作样品，首先加入0.5mL注射用水将其稀释至1.0mL，然后直接按照实施例一的试验方法，配制得到那曲肝素钙制剂样品检测体系溶液，并进行紫外-可见分光光度法检测。最后，将所得的490nm吸收峰的吸光度相对下降值代入实施例一中得到的490nm吸收峰的标准工作曲线方程，计算溶液浓度。所得测试结果列于表8。
表8荧光素检测体系对那曲肝素钙制剂样品的检测结果
表8的测试结果，可以与那曲肝素钙药品的效价试验结果进行对照。由表8所得的制剂样品浓度为2.65×10-2mol/L，同时该批那曲肝素钙药品的平均分子量为3850Da，因此每支那曲肝素钙制剂产品（溶液体积为0.5mL）的那曲肝素钙含量为51.01mg。根据每支那曲肝素钙制剂产品的总效价为5000IU，进一步计算得到，该批那曲肝素钙药品的效价为98IU/mg，符合相应的那曲肝素钙干品效价标准（抗Xa因子效价范围为95-130IU/mg）。而该批那曲肝素钙药品由效价测定试验所得到的结果为106IU/mg，与该结果的相对误差为8%。因此，由荧光素检测体系分光光度法测定的那曲肝素钙效价结果具有较好的参考价值。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。
Claims (10)
1.一种检测那曲肝素钙制品的方法，其特征在于，通过分光光度法检测混合液在200-800nm范围内的吸光度来检测溶液中那曲肝素钙的浓度，所述混合液为含荧光素、那曲肝素钙制品和缓冲液的溶液。
2.根据权利要求1所述一种检测那曲肝素钙制品的方法，其特征在于，所述混合液为含荧光素、那曲肝素钙制品、SO4 2-和缓冲液的溶液。
3.根据权利要求2所述一种检测那曲肝素钙制品的方法，其特征在于，所述混合液由荧光素的乙醇溶液、那曲肝素钙制品溶液、硫酸钠溶液和缓冲液混合而成。
4.根据权利要求1-3所述任一一种检测那曲肝素钙制品的方法，其特征在于，所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、盐酸-三羟甲基氨基甲烷缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液和柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液中的任一种。
5.根据权利要求4所述一种检测那曲肝素钙制品的方法，其特征在于，所述缓冲液为pH=3.0-7.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或pH=3.0-7.0的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液。
6.根据权利要求5所述一种检测那曲肝素钙制品的方法，其特征在于，所述缓冲液为pH=6.2-7.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或pH=6.0-7.0的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液。
7.根据权利要求6所述一种检测那曲肝素钙制品的方法，其特征在于，所述缓冲液为pH=6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
8.根据权利要求2或3所述一种检测那曲肝素钙制品的方法，其特征在于，所述混合液中荧光素的浓度为1.5×10-5-4.5×10-5mol/L，硫酸钠的浓度为1.0×10-4-8.0×10-3mol/L。
9.根据权利要求7所述一种检测那曲肝素钙制品的方法，其特征在于，所述测定方法可用于监控那曲肝素钙制品中钙离子的含量。
10.根据权利要求7所述一种检测那曲肝素钙制品的方法，其特征在于，所述测定方法可用于监控那曲肝素钙制品中亚硝酸根离子的含量。
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