KR20120119944A

KR20120119944A - 나노입자화된 키틴과 키토산을 이용하는 키토올리고당과 키토산올리고당의 효소적 제조 방법

Info

Publication number: KR20120119944A
Application number: KR1020110038125A
Authority: KR
Inventors: 권기식
Original assignee: 권기식
Priority date: 2011-04-24
Filing date: 2011-04-24
Publication date: 2012-11-01

Abstract

본 발명은 3 단계로 이루어진 분쇄방법에 의해 키틴 또는 키토산을 나노입자로 제조하는 방법과 상기와 같은 방법에 의해 제조된 나노입자를 반응 기질로 사용하여 키티네이즈 또는 키토사네이즈로 반응시켜 키토올리고당 또는 키토산올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 나노입자화된 키틴 또는 키토산 원료를 기질로 사용한 효소반응 과정에서 키토올리고당 또는 키토산올리고당 생성 반응속도가 현저히 증가하게 되며, 최종 올리고당류의 생성 수율이 기존의 방법에 비해 매우 높은 효과가 있다. 이러한 효과는 키토올리고당 또는 키토산올리고당의 제조원가를 낮출 수 있고, 생리활성 기능이 우수한 기능성 올리고당을 활용한 식품, 의약품, 화장품 등 다양한 제품에 적용될 경우 기존 제품에 비하여 높은 활용성을 가질 수 있게 된다.

Description

나노입자화된 키틴과 키토산을 이용하는 키토올리고당과 키토산올리고당의 효소적 제조 방법 {Enzymatic production method for chitooligosaccharide and chitosan oligosaccharide using nano-particulated chitin and chitosan}

본 발명은 나노입자화된 키틴과 키토산을 기질로 이용하는 키토올리고당과 키토산올리고당의 효소적 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 3 단계로 이루어진 분쇄방법에 의해 키틴 또는 키토산을 나노입자로 제조하는 방법 및 상기와 같은 방법에 의해 제조된 나노입자를 반응 기질로 사용하여 키티네이즈 또는 키토사네이즈로 반응시켜 키토올리고당 또는 키토산올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

키토올리고당이란 엔아세틸글루코사민 단량체가 한분자에서 열분자까지 베타-1, 4-결합된 올리고당이며, 키토산올리고당은 단량체로 디아세틸글루코사민이 중합된 구조를 갖고 있는 올리고당을 의미한다.

키토올리고당 및 키토산올리고당은 항종양, 항암, 항진균 및 면역부활 촉진효과와 같은 각종 기능성을 갖고 있다. 또한 인체에서 칼로리화되지 않고 장내 유산균에 의해 대사가 이루어짐으로써 장내 유용세균의 증식을 촉진하며, 또한 기존의 감미료인 설탕이나 맥아당과 혼합 사용할 경우 기능성 당으로도 이용될 수 있다. 따라서 최근 식품, 의약품등 여러 분야에서 점차 그 이용이 증가되고 있다.

원료인 키틴은 자연계에 섬유소 다음으로 풍부한 매년 재생되는 자원으로 갑각류나 곤충의 껍질, 연체동물의 기관, 균류의 세포벽, 식물세포의 벽등에 존재하며, 게껍질의 70%, 곤충류 껍질의 30~60%, 연체동물 표피 중량의 40% 전후를 이루고 있다. 그 구조는 엔아세틸글루코사민이 베타-1, 4-결합된 중합체이며, 무기염인 탄산칼슘, 단백질, 카로틴과 같은 색소들과 복합체로 존재한다.

또한 키토산올리고당 생성을 위한 기질로 사용되는 키토산은 키틴을 고농도 수산화나트륨으로 처리하여 엔아세틸 결합을 가수분해하여 아세틸기를 제거함으로써 얻어진다.

키토올리고당의 제조방법으로는 결정형 키틴을 강산으로 가수분해시켜 저분자의 키토올리고당을 얻는 화학적 제조방법과 키틴 분해 효소를 사용하는 효소적 제조방법이 있다.

화학적 제조방법은 농축 염산등으로 키틴을 저온에서 12시간 이상 교반시키면서 반응시켜 저분자 상태의 키토올리고당을 생성시키는 방법이다.

이와 같은 화학적 제조방법은 강산에 의하여 키틴 고분자가 무작위로 가수분해됨으로써 적절한 분자크기의 키토올리고당을 얻기 어렵고 가수분해후 당생성물을 다시 중화시켜야 하는 공정상의 결점을 지니고 있다.

효소적 제조방법을 이용할 경우, 사용 효소의 종류, 첨가량, 그리고 효소반응 조건을 변화시켜 키토올리고당의 분자 크기를 조절할 수 있어 화학적 가수분해 방법보다는 효율적인 제조방법이라고 볼 수 있다.

그러나 자연상태의 키틴 또는 키토산과 같은 전처리된 키틴은 키틴 분해 효소에 의해 쉽게 분해되지 않는 결정 구조를 이루고 있어 효소 가수분해작용이 매우 어려워 키토올리고당 생성 수율이 매우 낮은 문제점이 있다.

이러한 문제점을 해결코자 결정형 키틴을 전처리하여 구조를 변형시켜 사용하는데, 그 방법으로는 강산으로 부분 가수분해시켜 교질상태의 키틴으로 만들거나 인산으로 처리하여 팽윤상태의 키틴으로 구조를 변형시켜 원료로 사용하고 있다.

이와 같이 전처리된 키틴을 제조하는 경우 강산으로 전처리한 후 이를 다시 중화시키는 공정이 필요하며, 구조변형된 키틴 또는 키토산의 회수율이 50%정도로 원료의 손실이 많아 경제적 손실이 큰 공정상의 결점이 있다.

또한 이와 같이 전처리된 키틴을 효소반응 기질로 이용하여도 현재의 방법으로는 키토올리고당의 수율이 20~30% 정도의 수준에 머무르고 있어 이에 대한 개선이 필요하다.

나노 기술이란 나노미터 크기의 물질 (나노물질)들이 갖는 독특한 성질과 현상을 찾아내 나노물질을 정렬시키고 조합하여 매우 유용한 성질의 소재나 시스템을 생산하는 기술을 통칭한다.

현재까지 개발된 나노물질의 제조방법으로는 연소, 폭발, 쇼크 웨이브(shock wave)를 활용하는 건식 공정(dry process)과 졸-겔 프로세스(sol-gel process), 초임계유체 활용기술, 화학반응, 용매분산, 침전, 증착, 유기용매 등을 사용하는 습식공정(wet-process)으로 대별된다.

최근에는 상기와 같은 나노 기술을 식품에 적용함으로써 기존에 섭취가 어려운 식품소재를 일부가 아닌 전체로서의 섭취가 가능하도록 할 수 있으며 화학적으로나 열처리에 의해 제조되는 가공식품을 생식 그 자체로 섭취할 수 있고 특정 영양성분에 특이 성질이 부여되도록 할 수 있을 것으로 예상되고 있다. 또한, 나노입자를 캡슐화 함으로써 변질을 방지할 수 있을 뿐 만 아니라 인체 내의 작용부위와 주요 작용의 조절이 가능해질 것으로 전망되고 있다.

그러나, 현재 식품산업에서의 나노물질의 제조는 적용 검토 단계의 수준에 머무르고 있으며 선진 일부 기업을 제외하고는 대부분의 기업에서 마이크로 단위의 미세 캡슐화에 대한 연구만이 주로 수행되어 왔다.

이는 지금까지 개발된 나노물질의 제조방법을 식품에 적용하기 위해서는 안전성 여부나 유해물질의 잔류 여부 및 수율 등이 고려되어야 하기 때문이다. 한편, 제약분야에서는 초임계유체를 활용하는 방법이 진전되어 실용화를 앞두고 있다. 그러나, 이를 식품에 적용하기에는 상술한 바와 같이 안정성 등이 검증되어야 하는 문제점이 있다. 또한, 유기물로 이루어진 식품소재의 특성상 구성성분의 분포가 복잡하며 외부환경에 의한 변화가능성이 크기 때문에 식품소재를 나노화한다는 것은 큰 어려움이 있다.

이에 본 발명자들은 나노기술을 불용성 고분자 다당류의 전처리에 활용하여 효소분해 반응을 촉진하고자 연구하던 중 키틴 또는 키토산을 다단계의 방법에 의해 분쇄함으로써 나노입자를 수득하고 이를 사용하여 효소분해반응의 기질로 사용할 때 키토올리고당 또는 키토산올리고당 생성 반응 속도와 수율이 현저히 증가함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 키틴 또는 키토산 원료를 다단계 방법에 의해 분쇄하여 나노입자를 수득하고, 이를 효소반응 기질로 사용하여 키토올리고당 또는 키토산 올리고당 제조시 반응속도와 최종 수율을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위해 본 발명은 키틴 또는 키토산을 나노입자로 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 나노입자를 효소반응 기질로 사용하여 키토올리고당 또는 키토산올리고당을 효소적으로 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명에서 나노입자란 나노미터 단위의 표면적을 가지는 불균일 분산입자를 말한다. 본 발명은 키틴 또는 키토산 원료를 나노입자로 제조하는 방법은 (a) 건조된 키틴 또는 키토산 중에서 선택된 것을 함마밀에 투입하여 200?300mesh 크기의 입자로 1차 분쇄하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 분쇄물을 ACM 분쇄기에 투입하여 5,000?10,000mesh 크기의 입자로 2차 분쇄하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 분쇄물을 우레탄 코팅된 건식 또는 습식 볼밀에 투입하여 50?2,000nm 크기의 나노입자로 3차 분쇄하는 단계를 포함한다.

상기 (a) 단계에서 건조된 키틴 또는 키토산 원료는 함마밀에 투입되어 1차 분쇄되고 상기 1차 분쇄물은 2차 분쇄과정으로 연동되어 투입된다.

상기 (b) 단계에서 상기 1차 분쇄물은 공기의 와류와 진동, 원료간의 충돌에 의해 미세 분쇄되는 ACM(Air classifying mill) 분쇄기에 투입되어 보다 미세하게 2차 분쇄된다.

상기 (c) 단계에서 상기 2차 분쇄물은 내부에 우레탄 코팅이 된 볼밀로 자동 이송되어 3차 분쇄가 이루어지며 3차례의 분쇄과정을 거쳐 원료는 50?2,000nm의 나노입자로 전환된다.

이상이 건식 타입의 나노 분쇄이며 상기 (c) 단계의 분쇄과정에서 습식 볼밀을 거쳐 분쇄하면 습식타입 나노 분쇄가 된다.

상기와 같이 본 발명의 방법에 따라 키틴 또는 키토산 원료를 분쇄하는 경우에 성분의 변화 없이 나노 크기로의 분쇄가 가능하다.

나아가, 상기와 같은 방법에 의해 제조된 나노 키틴 또는 키토산 입자를 기질로 사용하여 효소반응과정을 거쳐 키토올리고당 또는 키토산올리고당을 제조할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 키틴 또는 키토산 원료는 기질로는 천연 결정형 키틴, 분리 정제된 결정형 키틴, 또는 키토산, 콜로이달키틴, 팽윤 키틴과 같은 전처리된 키틴을 사용할 수 있으며, 건조된 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명에서 사용되는 키틴 또는 키토산 원료는 수분함량이 6?15 중량%로 조절된 것을 사용할 수 있다. 건조방법으로는 양건, 음건, 열풍건조, 동결건조 및 자연건조 방법을 모두 사용할 수 있다. 바람직하게는 열풍건조 및 동결건조 방법을 사용할 수 있다.

키토올리고당 또는 키토산올리고당 제조에 사용되는 효소는 특별히 한정되지 않으며, 아스파르질러스속, 뮤코속, 페니실니움속등의 곰팡이류와 스트렙토마이세스속, 바실러스속 등의 세균류들이 생산하는 엔도형 및 엑소형 키티네이즈와 키토사네이즈, 그리고 라이소자임을 사용할 수 있다. 이들 효소는 상업적으로 판매되고 있는 것을 구입하여 사용하거나 미생물 배양액으로부터 분리하여 사용할 수 있다.

상기 나노입자화된 키틴 또는 키토산 원료를 기질로 사용하여 효소반응 과정을 거치게되면 키토올리고당 또는 키토산올리고당 생성 반응속도가 현저히 증가하게 되며, 최종 올리고당류의 생성 수율이 기존의 방법에 비해 매우 높은 효과가 있다. 이러한 효과는 키토올리고당 또는 키토산올리고당의 제조원가를 낮출 수 있고, 생리활성 기능이 우수한 기능성 올리고당을 활용한 식품, 의약품, 화장품 등 다양한 제품에 적용될 경우 기존 제품에 비하여 높은 활용성을 가질 수 있게 된다.

도 1은 본 발명에서 키토올리고당 수율의 변화를 시간이 경과함에 따라 관찰한 결과 비교도.
도 2는 본 발명에서 반응액의 키토올리고당의 조성을 고압 액체크로마토그라피로 분석한 결과 비교도 ((A) 나노입자 키틴, (B) 대조군)
시간( )은 효소반응시간임.
숫자부호 설명 : 1, 엔아세틸디글루코사민; 2, 키토바이오즈; 3, 키토트리오즈; 4, 키토테트라오즈; 5, 키토펜타오즈; 6, 키토헥사오즈
도 3은 본 발명에서 키토산올리고당 수율의 변화를 시간이 경과함에 따라 관찰한 결과 비교도

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명의 키틴 또는 키토산 원료를 나노입자로 제조하는 방법은 3단계의 건식 및 습식 분쇄 방법을 단계별로 혼합하는 것을 특징으로 하며, 건조된 키틴 또는 키토산 중에서 선택된 것을 함마밀에 투입하여 200?300mesh 크기의 입자로 1차 분쇄하는 단계; 상기 단계의 분쇄물을 ACM 분쇄기에 투입하여 5,000?10,000mesh 크기의 입자로 2차 분쇄하는 단계 및 상기 2차 분쇄 단계의 분쇄물을 우레탄 코팅된 건식 또는 습식 볼밀에 투입하여 50?2,000nm 크기의 나노입자로 3차 분쇄하는 단계를 포함한다.

본 발명의 키토올리고당 또는 키토산올리고당의 제조를 위한 효소반응 과정에서 원료인 나노입자 키틴 또는 키토산의 첨가농도는 10~250g/ℓ 정도가 적당하며, 결정형 키틴 또는 키토산 기질당 적정 키틴 또는 키토산 분해 효소의 첨가비율은 분해 효소의 종류에 따라 다르나 10~1,000 units/g 정도가 적절하다.

효소의 반응온도 범위는 최적 온도인 20~70℃ 전후이며, 반응액의 pH는 사용하는 키틴 분해 효소의 종류 및 기원에 따라 다르나 적정 pH 범위는 3.5~9.0정도이다.

본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명하면 다음과 같다.

건조된 키틴 원료를 함마밀에 투입하여 200 mesh 크기의 입자로 1차 분쇄하였다. 그 다음 상기 분쇄물을 ACM 분쇄기를 사용하여 5,000 mesh 크기의 입자로 2차 분쇄하였다. 상기 2차 분쇄물을 볼밀로 자동 이송하여 12시간 분쇄하여 700 nm크기의 나노입자를 수득할 수 있다.

실시예 1에서 제조한 나노입자화된 결정형 키틴 50g을 인산완충용액(pH7.0) 1.0ℓ에 현탁시키고, 아스파르질러스속이 분비하는 키틴 분해 효소 200 units 첨가하여 50℃에서 200rpm으로 60시간동안 교반하므로서 키토올리고당 생성반응을 수행하였다.

이때 생성된 키토올리고당의 변화를 시간이 경과함에 따라 관찰한 결과는 [도1]과 같다.

또한 비교를 목적으로 나노입자화하지 않은 키틴원료를 기질로 사용한 경우도 포함시켰다.

본 발명에 의한 경우 48시간 반응후 당생성 수율이 85%였으며 나노입자화하지 않은 경우의 15%에 비하여 크게 향상되었다.

실시예 2에서 얻어진 반응액 중 키토올리고당의 조성을 고압액체크로마토그라피로 분석한 결과는 도2와 같으며, 나노입자 키틴과 대조군의 경우와그 조성은 거의 유사하였으며, 중합도가 1에서 6인 각종 키토올리고당이 생성되었다.

강염기로 전처리하여 아세틸기를 제거한 결정형 키토산을 원료로 사용하고 그 외의 방법은 실시예 1및 실시예 2와 동일한 조건으로 나노입자화 시킨 후 효소 반응시켜 키토산올리고당을 생성반응을 수행하였다. 또한 비교를 목적으로 나노입자화 시킨지 않은 키토산 원료를 대조군으로 사용하여 비교하였다.

본 발명에 의한 경우 48시간 반응후 당생성 수율은 [도3]과 같이 95%였으며, 기존의 제조방법인 결정형 키토산을 사용한 대조군 경우의 24%에 비하여 크게 향상되었다.

Claims

건조된 키틴 또는 키토산 중에서 선택된 것을 함마밀에 투입하여 100?300mesh 크기의 입자로 1차 분쇄하는 단계와 상기 단계의 분쇄물을 ACM 분쇄기에 투입하여 5,000?10,000 mesh 크기의 입자로 2차 분쇄하는 단계, 그리고 상기 단계의 분쇄물을 우레탄 코팅된 건식 또는 습식 볼밀에 투입하여 50?2,000nm 크기의 나노입자로 3차 분쇄하는 단계를 포함하는 나노입자화된 키틴 또는 키토산을 이용하는 키토올리고당 또는 키토산올리고당 효소적 제조방법
제 1 항에 있어서, 아스파르질러스속, 뮤코속, 페니실니움속등의 곰팡이류와 스트렙토마이세스속, 바실러스속 등의 세균류들이 생산하는 엔도형 및 엑소형 키티네이즈와 키토사네이즈, 그리고 라이소자임을 사용하는 나노입자화된 키틴 또는 키토산을 이용하는 키토올리고당 또는 키토산올리고당 효소적 제조방법
제 1항에 있어서, 나노입자 키틴 또는 키토산의 첨가농도는 10~250g/ℓ, 결정형 키틴 또는 키토산 기질당 키틴 또는 키토산 분해 효소의 첨가비율은 10~1,000 units/g, 효소의 반응온도 범위는 최적 온도인 20~70℃, 반응액의 pH는 3.5~9.0인 나노입자화된 키틴 또는 키토산을 이용하는 키토올리고당 또는 키토산올리고당 효소적 제조방법