CN102643792B - Rna断裂试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高通量测序技术，具体提供了一种RNA断裂试剂及其应用。本发明提供的RNA断裂试剂，包括维持pH值在7至9之间的生物缓冲液，一价金属离子和二价金属离子；其中所述生物缓冲液、一价金属离子和二价金属离子均处于有效浓度。本发明还提供了上述试剂在RNA测序文库构建中的应用。利用该试剂的建库方法简化了操作步骤，在节约时间、降低成本的同时，利于自动化批量样品建库，利于自动化仪器的应用。
Description
技术领域
本发明涉及第二代高通量测序，特别是RNA测序领域，更具体地本发明涉及一种RNA断裂试剂及应用。
背景技术
随着新一代高通量DNA测序技术的快速发展，RNA测序(RNA-seq)已成为基因表达和转录组分析的重要新手段，转录组是特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。目前RNA-Seq的主要的流程包括，首先，用Poly(T)寡聚核苷酸从总RNA中抽取全部带Poly(A)尾的RNA，其中主要是编码基因所转录的mRNA，将所得RNA随机打断成片段，乙醇沉淀回收RNA片段，再用随机引物和逆转录酶从RNA片段合成cDNA片段，然后，对cDNA片段进行末端修复并连接测序接头(adapter)，得到将用于测序的cDNA。在这一过程中，之所以选择先将RNA打断，而不是在cDNA合成后打断cDNA，是因为RNA打断操作相对简单、快捷，并且打断的随机性和均一性良好。
目前，对于片段化RNA，Illumina/Solexa测序平台提供的试剂是Applied Biosystem(ABI)公司的RNA断裂试剂(RNA FragmentationReagents，AM8740)，具体打断的操作过程如下：在9μl含有RNA的体系中，加入1μl 10X断裂缓冲液(10X Fragmentation Buffer)，混匀，将反应管置于70℃15分钟，然后加入1μl终止反应液(Stop Solution)终止反应，立即将反应管置于冰上，此反应条件能将≤10μg的RNA随机打断成60-200nt大小的片段。该断裂试剂为含Zn2+的缓冲液，终止反应液为200mM EDTA pH8.0溶液。该断裂缓冲液打断RNA的效果不错，但是较为繁琐的步骤影响了实验效率，比如得加入金属螯合剂来终止片段化反应，打断后需要用乙醇沉淀回收样品才能进行后续的逆转录反应，这些步骤不仅减慢了实验速度，增加了操作的复杂性，而且也不适合批量样品建库操作，不利于整个方法流程的自动化。
发明内容
为克服上述市售的RNA断裂试剂的缺陷，我们利用高温下二价阳离子溶液能将RNA打断的性质，结合考虑逆转录过程的必要条件，提供了一种RNA断裂试剂及利用该试剂构建RNA-seq文库的方法。
本发明一方面提供了一种RNA断裂试剂，包括维持pH值在7至9之间的生物缓冲液，一价金属离子和二价金属离子；其中所述生物缓冲液、一价金属离子和二价金属离子均处于有效浓度。本发明的一价金属离子为cDNA一链合成所必需。本发明的二价金属离子为打断RNA所必需。本发明所指有效浓度是指能够达到本发明效果的浓度范围，本发明效果主要指不需要加反应终止剂，也不需要任何纯化步骤便能直接进行后续的反应，例如逆转录反应，以便于自动化。
在本发明的一个优选实施例中，所述生物缓冲液为Tris缓冲液，其浓度为100-350mM，优选150-300mM，更优选200-250mM；维持pH值在7至9之间。
在本发明的一个优选实施例中，所述一价金属离子为K+和/或Na+，优选K+；一价金属离子浓度为80-400mM，优选地90-300mM，更优选100-250mM。
在本发明的一个优选实施例中，所述二价金属阳离子为Mg2+和/或Zn2+，优选地Mg2+和Zn2+；Mg2+离子的浓度为8-100mM，优选10-80mM，更优选15-60mM；Zn2+离子的浓度为8-100mM，优选10-80mM，更优选15-60mM。
在本发明的RNA断裂试剂，其中所述RNA来源于原核或真核生物。可以来源于单个细胞，多个细胞，单种细胞，多种细胞，单个组织，多个组织，单种组织，多种组织，一个生物，多个生物，一种生物或多种生物。
本发明另一方面提供了上述RNA断裂试剂的应用，包括使用上述RNA断裂试剂断裂RNA的步骤。具体地，该应用可以是一种构建RNA测序文库的方法，其包括使用上述RNA断裂试剂断裂RNA的步骤。
在本发明的一个优选实施例中，提供了一种构建RNA测序文库的方法，包括以下步骤：
(a)使用所述的RNA断裂试剂断裂RNA得到RNA片段；
(b)在步骤(a)后的反应体系中直接加入逆转录酶和随机引物，进行逆转录合成cDNA第一链；
(c)在步骤(b)后的反应体系中加入聚合酶和cDNA二链合成缓冲液，合成cDNA第二链；
(d)纯化步骤(c)所得双链cDNA；
(e)对双链cDNA进行末端修复，加“A”和连接测序接头，得到连接产物；
(f)PCR扩增(e)所得连接产物以产生文库。
在本发明的一个优选实施例中，其中所述RNA断裂试剂打断RNA的作用温度是70-100℃，优选85-95℃，更优选94℃；作用时间是3-12min，优选6-10min，更优选10min。
在本发明的一个优选实施例中，其中所述步骤(a)断裂RNA产生的RNA片段含有60-1500nt，优选150-700nt，更优选150-500nt。
本发明另一方面提供了一种RNA测序文库，其由上述方法制得。
本发明另一方面还提供了一种测序方法，其包括构建权利要求10所述RNA测序文库，并对该测序文库进行测序的步骤。
在本发明中，对依照所述构建RNA测序文库的方法获得RNA测序文库进行测序的方法，所述测序可通过任何测序方法进行，包括但不限于双脱氧链终止法；优选高通量的测序方法，包括但不限于第二代测序平台或者是单分子测序平台。所述第二代测序平台(Metzker ML.Sequencingtechnologies-the next generation.Nat Rev Genet.11(1)：31-46，2010)包括但不限于Illumina/Solexa(GATM，HiSeq2000TM等)、ABI Solid和Roche454(焦磷酸测序)测序平台；单分子测序平台(技术)包括但不限于Helicos公司的真实单分子测序技术(True Single Molecule DNA sequencing)，Pacific Biosciences公司单分子实时测序(single molecule real-time(SMRTTM))，以及Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔测序技术等(Rusk，Nicole.Cheap Third-Generation Sequencing.Nature Methods.6(4)：244-244，2009)。
本发明的有益效果
该RNA断裂试剂和ABI公司提供的RNA Fragmentation Reagents(AM8740)打断效果相当，并且调整打断温度和打断时间，能满足对不同片段大小的需求。将该试剂应用于RNA测序文库构建表现出的另外一个优势在于断裂RNA后，不需要加反应终止剂，也不需要任何纯化步骤便能直接进行后续的逆转录反应，即在特定的逆转录反应体系中，该断裂试剂能替代一链合成缓冲液，不必另外加入一链合成缓冲液，且获得的数据与根据Illumina mRNA-Seq文库制备标准流程(mRNA SequencingSample Preparation Guide，part#1004898)所得到的数据一致。说明使用该RNA断裂试剂构建RNA测序文库的方法简化了操作步骤，节约时间，降低成本，在不影响结果的基础上，为自动化操作创造了非常有利的条件，使自动化批量样品建库成为可能。
附图说明
图1为本发明对照例中Illumina mRNA-Seq文库制备流程示意图；
图2为本发明实施例1中mRNA-Seq文库制备流程示意图；
图3为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-Agilent，用本发明对照例中Illumina测序平台提供的5×RNA断裂试剂在94℃断裂5min所得；
图4为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-Agilent，用本发明实施例1中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂3min所得；
图5为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-Agilent，用本发明实施例1中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂6min所得；
图6为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-Agilent，用本发明实施例1中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂12min所得；
图7为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-AB，用本发明实施例11中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂10min所得；
图8为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-AB平行样，用本发明实施例11中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂10min所得；
图9为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-Agilent，用本发明实施例11中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂10min所得；
图10为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-Agilent平行样，用本发明实施例11中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂10min所得；
图11为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自玉米RNA，用本发明实施例11中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂10min所得；
图12为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自玉米RNA平行样，用本发明实施例11中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂10min所得；
图13为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自水稻RNA，用本发明实施例11中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂10min所得；
图14为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自水稻RNA平行样，用本发明实施例11中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂10min所得；
图15为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自真菌RNA，用本发明实施例11中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂10min所得；
图16为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自真菌RNA平行样，用本发明实施例11中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂10min所得；
图17为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自小鼠RNA，用本发明实施例11中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂10min所得；
图18为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图，其中RNA片段来自小鼠RNA平行样，用本发明实施例11中的3×RNA断裂试剂在94℃断裂10min所得。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
为了从实验数据和图表上直观显示出本发明的有益效果，我们将此发明用于mRNA-Seq建库过程中。mRNA-Seq样品制备参考Illumina公司提供的mRNA-seq建库标准流程(mRNA Sequencing Sample PreparationGuide，part#1004898)进行，图1为对照例中Illumina mRNA-Seq文库制备流程示意图；图2为实施例1中mRNA-seq(mRNA测序)文库制备流程示意图。
实施例1
为确定较优的RNA打断条件，采用同一RNA断裂试剂对相同的样本进行试验，设置5个断裂温度梯度为70℃、80℃、90℃、94℃和100℃，6个断裂时间梯度为1.5min、3min、6min、8min、10min和12min，共30种方案。
1.1样品试剂
MAQC-Agilent(Universal Human Reference RNA，UHRR，Stratagen)；MAQC-AB(Human Brain Reference RNA，Ambion)；3X RNA断裂试剂：200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl，15mM MgCl2，15mMZnCl2(断裂试剂的各组分均购自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它各试剂缓冲液，除另有标明，均来自Illumina公司提供的mRNA-Seq样品制备试剂盒。
1.2实验步骤
1.2.1纯化mRNA
1)取1-10μg总RNA(MAQC-Agilent或MAQC-AB)至一个无RNA酶的EP管(Axygen)中，用DEPC水(Ambion)稀释至50μl。混匀，65℃变性5分钟以打开二级结构，然后立即将样品置于冰上。
2)吸取15μl Sera-Mag oligo(dT)磁珠(Invitrogen)于1.5ml的non-stick-EP管中，用100μl结合缓冲液洗磁珠两次，将磁珠重悬于50μl结合缓冲液，将第一步中制得的总RNA加入管中，室温放置5min。
3)将non-stick-EP管置于磁分离器(MPC，Invitrogen)上2min，去除上清，再用200μl洗脱缓冲液清洗磁珠两次。取一新的不粘的EP管，加入50μl的结合缓冲液。
4)向含磁珠的EP管中加入50μl 10mM Tris-HCl，80℃加热2min将mRNA从磁珠上洗脱下来，迅速将EP管转至MPC上，转移mRNA至上步加有50μl结合缓冲液的EP管，将混合溶液在65℃变性5min，打开二级结构，然后立即将样品置于冰上。另外，立即将200μl洗脱缓冲液加入到含有磁珠管中，洗两次磁珠。
5)将100μl mRNA样品加入洗过两次的磁珠中，室温放置5min，将EP管置于MPC上2min，小心吸除上清，再用200μl洗脱缓冲液清洗磁珠两次。
6)向含磁珠的EP管中加入17μl 10mM Tris-HCl，80℃加热2min，从而将mRNA从磁珠上洗脱下来。迅速地将EP管转至MPC上，转移mRNA洗脱液至一新的200μl PCR管中，大约能回收16μl mRNA。
1.2.2断裂mRNA及合成cDNA第一链
往回收到的16μl mRNA溶液加入5.1μl 3X RNA断裂试剂，94℃10min(或70℃1.5min或70℃3min或70℃6min或70℃8min或70℃10min或70℃12min，其它温度80℃、90℃、94℃和100℃设置作用时间同70℃)，立即置于冰上，加入随机引物1μl，65℃5min打开单链二级结构，置于冰上。配置反应混合物，包括2μl 100mM DTT、0.4μl 25mMdNTP混合底物、0.5μl RNA抑制剂，将混合物加入含RNA的管中，混匀后室温放置2min，然后加入1μl 200U/μl Superscript II逆转录酶混匀，总体系25μl。在PCR仪上按照以下程序进行反应：
Step 125℃ 10min
Step 242℃ 50min
Step 370℃ 15min
Step 44℃ Hold
1.2.3合成cDNA第二链
向一链反应体系中补水至82.8μl，依次加入10μl GEX二链合成缓冲液、1.2μl 25mM dNTP混合物，混匀，冰上放置5min，再加入1μlRNaseH、5μl DNA聚合酶，混匀，将反应管置于16℃反应2.5小时。
反应完成后，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化双链cDNA产物，溶于50μl洗脱液。
1.2.4末端修复
上述步骤得到50μl DNA溶液，向反应体系中依次加入27.4μl水、10μl 10X末端修复缓冲液、1.6μl 25mM dNTP混合物、5μl T4DNA聚合酶、1μl Klenow DNA聚合酶、5μl T4PNK，总反应体系为100μl，将反应管置于20℃反应30min。
反应完成后，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化末端修复产物，溶于32μl洗脱液。
1.2.5加A，加接头
上述步骤得到32μl DNA溶液，向反应体系中依次加入5μl A-Tailing反应液、10μl 1mM dATP、3μl Klenow exo(3′to 5′外切酶)，总反应体系为50μl，将反应管置于37℃反应30min。
反应完成后，用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化加A产物，溶于23μl洗脱液。
上述步骤得到23μl加A产物，向反应体系中依次加入25μl 2X T4DNA快速连接缓冲液、1μl PE接头混合物、1μl T4DNA连接酶，总反应体系为50μl，将反应管置于室温反应15min。
反应完成后，用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化连接产物，溶于10μl洗脱液。
1.2.6连接产物胶纯化
配制2％的琼脂糖凝胶，选择100bp DNA Ladder，120v电泳60min，切胶回收，根据接头以及所需目的片段大小决定，切胶范围为200-400bp。切下的胶块用QIAquick胶回收试剂盒(Qiagen)回收，最后溶于30μl洗脱液。
1.2.7PCR扩增及纯化
上述步骤得到30μl连接产物，向反应体系中依次加入10μl 5XPhusion缓冲液、1μl PCR Primer PE 1.0、1μl PCR Primer PE 2.0、0.5μl 25mM dNTP混合物、0.5μl Phusion DNA聚合酶、7μl水，总反应体系50μl。在PCR仪上按照以下程序进行反应：
a.30seconds at 98℃
b.15cycles of：
10seconds at 98℃
30seconds at 65℃
30seconds at 72℃
c.5minutes at 72℃
d.Hold at 4℃
反应完成后，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，溶于32μl洗脱液，用Agilent Bioanalyzer 2100对各个文库进行检测，对3×RNA断裂试剂94℃处理10min的制得的MAQC-AB和MAQC-AgilentRNA-Seq文库模板进行Illumina Hiseq2000测序。
Agilent Bioanalyzer 2100对RNA片段大小的检测结果图表明对于样本MAQC-Agilent或MAQC-AB，在各个作用温度下，断裂1.5min不能将RNA打断成相对较集中的片段，作用3min、6min或8min存在不同程度的大片段，而断裂12min目的片段相对较小，图4-6分别是以MAQC-Agilent RNA为样本，3×RNA断裂试剂94℃下断裂RNA 3min、6min及12min的AgilentBioanalyzer 2100检测图，从图上看，RNA被打断成相对集中的片段，但从片段大小的覆盖度来看，图4显示断裂3min仍然存在大量未被打断或者没有完全打断的RNA，图5所示断裂6min效果有所改善，仍有700bp左右的片段，图6所示打断12min，形成的主峰比较集中，但是由于打断时间片长，目的片段相对稍小。从峰图的覆盖度和文库的信息分析要求来看，利用该试剂断裂不同样本RNA的时间可在3-12min范围调整。同样的MAQC-Agilent样本，在固定的断裂时间如10min，断裂温度70℃，80℃，90℃或100℃效果不如或近似于94℃(图谱未显示)。所以，对于MAQC-Agilent或MAQC-AB，结合考虑断裂温度和时间对RNA片段的大小范围集中程度的影响，选择较优的作用条件为94℃10min，图7和图8中的RNA片段来自MAQC-AB平行样，3×RNA断裂试剂94℃处理10min；图9和图10的RNA片段其中RNA片段来自MAQC-Agilent平行样，3×RNA断裂试剂94℃处理10min。
Illumina Hiseq2000对3×RNA断裂试剂94℃处理10min制得的RNA-Seq文库模板(MAQC-AB和MAQC-Agilent)进行测序，数据统计见表1。将此Illumina HiSeq2000测序数据，与依照Illumina mRNA-Seq建库标准流程制备得的文库的测序数据(“对照例”结果)作比较，各自测序所得数据及分析结果见表1-3，后面做专门讨论。
以下实施例2～10是以同样的RNA样品(MAQC-AB或MAQC-Agilent)在固定打断时间为10min、打断温度为94℃的情况下，检测所述RNA断裂试剂组分和浓度的调整对RNA断裂效果影响的实例。
实施例2
2.1样品试剂
3X RNA断裂试剂：100mM Tris-HCl(pH 8.0)，400mM KCl，8mMMgCl2，100mM ZnCl2(断裂试剂的各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例一。
2.2实验步骤
试验步骤同1.2.1～1.2.7。
实施例3
3.1样品试剂
3X RNA断裂试剂：350mM Tris-HCl(pH 8.0)，80mM NaCl，100mMMgCl2，8mM ZnCl2(断裂试剂的各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例1。
3.2实验步骤
试验步骤同1.2.1～1.2.7。
实施例4
4.1样品试剂
3X RNA断裂试剂：150mM Tris-HCl(pH 8.0)，300mM KCl，90mMNaCl，80mM MgCl2(断裂试剂的各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例1。
4.2实验步骤
试验步骤同1.2.1～1.2.7。
实施例5
5.1样品试剂
3X RNA断裂试剂：300mM Tris-HCl(pH 8.0)，250mM KCl，100mMNaCl，10mM ZnCl2(断裂试剂的各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例1。
5.2实验步骤
试验步骤同1.2.1～1.2.7。
实施例6
6.1样品试剂
3X RNA断裂试剂：250mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl，100mMNaCl，60mM MgCl2，15mM ZnCl2(断裂试剂各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例1。
6.2实验步骤
试验步骤同1.2.1～1.2.7。
实施例7
7.1样品试剂
3X RNA断裂试剂：200mM Tris-HCl(pH 8.0)，90mM NaCl，100mMMgCl2(断裂试剂的各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例1。
7.2实验步骤
试验步骤同1.2.1～1.2.7。
实施例8
8.1样品试剂
3X RNA断裂试剂：100mM Tris-HCl(pH8.0)，250mM NaCl，8mMZnCl2(断裂试剂的各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例1。
8.2实验步骤
试验步骤同1.2.1～1.2.7。
实施例9
9.1样品试剂
3X RNA断裂试剂：200mM Tris-HCl(pH 8.0)，300mM KCl，80mMMgCl2(断裂试剂各组分来自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例1。
9.2实验步骤
试验步骤同1.2.1～1.2.7。
实施例10
10.1样品试剂
3X RNA断裂试剂：200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl，15mMZnCl2(断裂试剂的各组分均来自Sigma，试剂不含RNA酶)；其它样品和试剂缓冲液的来源同实施例1。
10.2实验步骤
试验步骤同1.2.1～1.2.7。
对实施例2～10所得的RNA-Seq文库(MAQC-AB或MAQC-Agilent)进行Agilent Bioanalyzer 2100检测。检测图(未列出)显示对同样的样本，在同样的断裂条件94℃10min下，这9个调整3X RNA断裂试剂的组分组成及浓度的方案对RNA的打断效果不如或与实施例1的3X RNA断裂试剂(200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl，15mM MgCl2，15mM ZnCl2)的效果相近。
本领域的技术人员可以了解，只要将维持pH值在7至9之间的生物缓冲液，用于一链合成的一价金属离子和用于断裂RNA的二价金属离子这三种组分混合在一起，并调配这三种组分在有效浓度，就能够达到本发明的基本目的。为达到更好的效果，本发明也相应给出了这三种组分的优选组合和浓度。所述生物缓冲液优选为Tris缓冲液，其浓度为100-350mM，优选150-300mM，更优选200-250mM；维持pH值在7至9之间。所述一价金属离子优选为K+和/或Na+，优选K+；一价金属离子的浓度为80-400mM，优选地100-300mM，更优选200-250mM。所述二价金属阳离子优选为Mg2+和/或Zn2+，更优选Mg2+和Zn2+；Mg2+离子的浓度为8-100mM，优选10-80mM，更优选15-60mM；Zn2+离子的浓度为8-100mM，优选10-80mM，更优选15-60mM。使用这些参数或者在这些参数的附近，本领域的技术人员将很容易的达到本发明的目的，即简化操作步骤，节约时间，降低成本和实现自动化。
实施例11
为了验证本发明的稳定性和可重复性，在一样的断裂试剂及作用条件下(3X RNA断裂试剂：200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl，15mMMgCl2，15mM ZnCl2，94℃10min)，选取不同物种平行建库，所选样品除了MAQC-Agilent和MAQC-AB，还有利用TRIzol(Invitrogen)提取的小鼠、水稻、玉米或真菌的RNA。
11.1样品试剂
TRIzol(Invitrogen)提取的小鼠、水稻、玉米或真菌的RNA；各试剂缓冲液，同实施例1。
11.2实验步骤
操作步骤同1.2.1～1.2.7。
对不同物种平行建库，使用Agilent Bioanalyzer 2100检测片段大小，结果见图7-18，图7-18为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer 2100检测图。图7和图8中的RNA片段来自MAQC-AB平行样；图9和图10的RNA片段其中RNA片段来自MAQC-Agilent平行样；图11和图12的RNA片段来自玉米RNA平行样；图13和图14的RNA片段来自水稻RNA平行样；图15和图16的RNA片段来自真菌RNA平行样；图17和图18的RNA片段来自小鼠RNA平行样。从每组样品的两个重复看，本发明的打断缓冲液及其打断条件对同一样品的重复性非常好，打断片段与集中度都很相似，如图9和图10显示，打断片段非常接近，峰图也非常相似。由此，我们认为本发明对同一样品的重复性良好；在不同样品之间，由于样品的特殊性，打断的片段大小有些许差别，但峰形都很正常，片段集中度都较高，覆盖度也很接近，因此，本发明方法适用于所测试的样品，打断效果良好，具有良好的可重复性与稳定性。
对照例
样品试剂：5X RNA断裂缓冲液(Applied Biosystem)；其他材料、试剂或缓冲液来源同实施例1中的1.1
操作步骤：
1)纯化mRNA，操作步骤同1.2.1；
2)断裂mRNA
加入4μl 5X RNA断裂缓冲液，94℃5min，立即加入2μl终止反应液，随后加入3M NaAC(pH 5.2)、糖元、100％乙醇，混匀后置于-80℃30min，沉淀出RNA。
3)合成cDNA第一链
将RNA沉淀溶于DEPC水中进行一链合成反应。一链合成体系如下：11.1μl RNA，随机引物1μl，65℃5min打开单链二级结构，置于冰上。配置反应混合物，包括4μl 5X一链缓冲液、2μl 100mM DTT、0.4μl25mM dNTP Mix、0.5μl RNA酶抑制剂将混合物加入含RNA的管中，混匀后室温放置2min，然后加入1μl Superscript II逆转录酶(200U/μl)混匀，总体系20μl。在PCR仪上按照以下程序进行反应：
Step 125℃ 10min
Step 242℃ 50min
Step 370℃ 15min
Step 44℃ Hold
后续操作步骤同实施例1中的1.2.3～1.2.7。
反应完成后，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，溶于32μl洗脱液，用Agilent Bioanalyzer 2100和Illumina Hiseq2000对纯化产物进行检测和测序。图3为RNA片段大小的Agilent Bioanalyzer2100检测图，其中RNA片段来自MAQC-Agilent，利用Illumina测序平台提供的5×RNA断裂试剂在94℃断裂5min所得。测序所得数据及分析见表1-3，与实施例1所得的数据作比较。
对两种微阵列质量控制标准品(MAQC标准品)MAQC-AB和MAQC-Agilent分别用对照例IHumina测序平台提供的方法a和本发明方法b(实施例1的方法)同时构建文库，各做三个重复(1、2和3)，采用样本MAQC-AB和MAQC-Agilent构建的RNA-Seq文库分析本发明方法对测序数据的影响，利用Illumina HiSeq2000测序仪测序，分别做了以下三方面的分析：测序原始数据统计、与QPCR的绝对定量的基因表达相关性分析、相同数据量检测基因数的比较分析。表1为a、b两种方法构建的MAQC标准品文库的原始测序数据统计，从表中看出对同一样品，a、b两种的建库方法得到的reads比对到基因上的比率相当，正负偏差小于5％，可以认为两种方法并无显著差别；表2为a、b两种建库方法得到的基因表达量与QPCR检测结果的相关性分析结果，两种不同建库方法得到的基因表达量与QPCR检测同样样品得到的基因表达量进行Spearman相关性分析，相关系数从0-1，数字越大，说明两者之间越接近，即相关性越好。从表中数据看，a、b两种方法的相关系数都达到0.85以上(大于0.8，符合标准)，说明本发明方法b的RNA-Seq与QPCR的相关性高，定量准确；两种方法得到的绝对定量的基因表达的相关系数非常接近，表明和Illumina提供的方法的数据相比，本发明数据可靠、可信；表3为a、b两种建库法测序相同数据量中检测到的基因数的比较，同样的数据量，基因数越接近，表明两种方法结果越相似，数据显示，对同一样品，两种不同的建库方法在相同数据量检测到的基因数相差无几，由此证实本发明的建库方法b与Illumina提供的方法a得到的数据一致，从而证明本发明RNA断裂试剂及其打断条件适用于mRNA-seq建库，得到的数据真实、可信，且对信息分析没有影响。
表1a、b两种方法构建的MAQC标准品文库的原始测序数据统计
表2a、b方法构建的MAQC标准品文库的基因表达量与QPCR检测结果的相关性分析
表3比较对a、b方法构建的MAQC标准品文库测序相同数据量后检测到的基因数
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解：根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (11)
1.一种构建RNA测序文库的方法，包括以下步骤：
(a)使用RNA断裂方法断裂RNA得到RNA片段，所述RNA断裂试剂由维持pH值在7至9之间的生物缓冲液，一价金属离子和二价金属离子组成，所述生物缓冲液、一价金属离子和二价金属离子均处于有效浓度；所述二价金属阳离子为Mg2+和Zn2+，所述Mg2+的有效浓度为8-100mM，所述Zn2+的有效浓度为8-100mM；所述断裂RNA的作用温度是94℃，作用时间是10min；所述生物缓冲液为Tris缓冲液，浓度为100-350mM；所述一价金属离子为K+和/或Na+；所述一价金属离子的浓度为80-400mM；
(b)在步骤(a)后的反应体系中直接加入逆转录酶和随机引物，进行逆转录合成cDNA第一链；
(c)在步骤(b)后的反应体系中加入聚合酶和cDNA二链合成缓冲液，合成cDNA第二链；
(d)纯化步骤(c)所得双链cDNA；
(e)对双链cDNA进行末端修复，加“A”和连接测序接头，得到连
接产物；
(f)PCR扩增(e)所得连接产物以产生文库。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Tris缓冲液浓度为150-300mM。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Tris缓冲液浓度为200-250mM。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一价金属离子的浓度为90-300mM。
5.权利要求4所述的方法，其特征在于，所述一价金属离子的浓度为100-250mM。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Mg2+的浓度为10-80mM，所述Zn2+的浓度为10-80mM。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述Mg2+的浓度为15-60mM，所述Zn2+的浓度为15-60mM。
8.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA来源于原核或真核生物。
9.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)断裂RNA产生的RNA片段含有60-1500nt。
10.权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)断裂RNA获得的RNA片段的大小为150-700nt。
11.权利要求10所述的方法，所述步骤(a)断裂RNA获得的RNA片段的大小为150-500nt。
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