EP1578792A2 - Nouvelle proteine associee aux centrosomes et ses applications - Google Patents
Nouvelle proteine associee aux centrosomes et ses applicationsInfo
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- EP1578792A2 EP1578792A2 EP03813937A EP03813937A EP1578792A2 EP 1578792 A2 EP1578792 A2 EP 1578792A2 EP 03813937 A EP03813937 A EP 03813937A EP 03813937 A EP03813937 A EP 03813937A EP 1578792 A2 EP1578792 A2 EP 1578792A2
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- C12Q2600/158—Expression markers
Definitions
- the protein according to the invention consists of the chain of 13 peptides corresponding to the translation products of 13 of the 14 exons that contains the corresponding gene, the first exon not being translated (see below).
- - Peptide 7 it comprises 24 amino acids corresponding to positions 351 to 374 (SEQ ID NO: 8); - Peptide 8: it comprises 54 amino acids corresponding to positions 375 to 428 (SEQ ID NO: 9);
- sequences SEQ ID NO: 47 to 53 corresponding to mutants of the hASAP protein deleted from the N-terminal part containing the BRCT domain (NdeM: residues 304 -647 (SEQ ID NO: 48); Ndel2: residues 411-647 (SEQ ID NO: 49); Ndel3: residues 478-647 (SEQ ID NO: 50)) or of the C-terminal part containing the MAP domain (CdeM: residues 1 to 477 (SEQ ID NO: 51); Cdel2: residues 1 to 418 (SEQ ID NO: 52); Cdel3: residues 1 to 303 (SEQ ID NO: 53); residues 1 to 421 (SEQ ID NO: 47)).
- said peptide is useful for the production of antibodies specifically recognizing a protein as defined above, preferably recognizing the ASAP protein of sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 46 .
- the subject of the invention is also a kit of reagents for the implementation of the methods described above comprising: a) at least one probe or a pair of primers according to the invention; b) the reagents necessary for carrying out a conventional hybridization reaction between said probe or said primers and the nucleic acid of the biological sample; c) the reagents necessary for carrying out an amplification reaction; d) the reagents necessary for the detection and / or the assay of the hybrid formed between said probe and the nucleic acid of the biological sample or of the amplified nucleic acids formed.
- Such substances can be biological macromolecules such as for example a nucleic acid, a lipid, a sugar, a protein, a peptide, a hybrid protein-lipid compound, protein-sugar, peptide-iipid or peptide-sugar, a protein or a peptide to which chemical ramifications have been added or chemical molecules.
- the invention also relates to the polynucleotide, the protein, the antibodies, the vectors or the cells transformed according to the invention, used as medicaments.
- Hoechst 33286 (4A: 63x objective; 4B, 4C, 4D: I00X objective).
- YFP-FIS1 F (5'-AATGTCTGATGAAG I I I I IAGCACC-3 ') (SEQ ID NO: 41)
- the vectors obtained are transfected according to the calcium phosphate technique or more routinely using the jetPE1 process (GDSP10101, Qbiogene) according to the manufacturer's recommendations, in the following cell lines:
- FIG. 5 illustrates the co-location of the human ASAP protein with alpha-tubulin; similarly the murine ASAP protein co-locates with alpha-tubulin.
- RNAi interfering RNA
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Abstract
L'invention est relative une nouvelle protéine associée aux centrosomes, au polynucléotide codant pour ladite protéine ainsi qu'aux applications de ladite protéine et dudit polynucléotide. La surexpression de la protéine selon l'invention entraîne des perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et induit des mitoses aberrantes et abortives.
Description
NOUVELLE PROTEINE ASSOCIEE AUX CENTROSOMES ET SES
APPLICATIONS.
La présente Invention est relative à une nouvelle protéine associée aux centrosomes, au polynucléotide codant pour ladite protéine ainsi qu'aux applications de ladite protéine et dudit polynucléotide.
Le processus de division cellulaire consiste en une division nucléaire (mitose) suivie d'une division cytoplasmique (cytokinèse). La mitose est dominée par la formation d'un fuseau polaire très organisé (le fuseau mitotique) constitué de deux familles de microtubules : les microtubules polaires et les microtubules kinétochoriens. Les microtubules sont des polymères composés de sous-unités d'α- et β-tubuline. Leur croissance est initiée dans la région périphérique du centrosome par un complexe contenant majoritairement une protéine apparentée, la γ-tubuline. Les microtubules polaires sont composés de rangées de microtubules et de protéines associées qui sont mises en place par les deux centres mitotiques, associés à des centrioles, situés aux pôles opposés du fuseau (asters). Chaque chromosome répliqué est constitué de deux chromatides sœurs reliées entre elles par le centromère. Les microtubules kinétochoriens sont liés aux chromosomes répliqués par des structures spécialisées appelées kinétochores qui se forment au cours de la prophase sur chacune des deux faces du centromère. Les chromosomes se condensent pendant la prophase et forment les microtubules kinétochoriens qui commencent à interagir avec les microtubules polaires du fuseau après rupture de l'enveloppe nucléaire au cours de la prométaphase. Sous l'effet de la tension due aux forces opposées, dirigées vers les pôles qui tirent les microtubules kinétochoriens, les chromosomes s'alignent dans la zone équatoriale du fuseau pendant la métaphase. A l'ana- phase, sous l'effet de forces continuellement développées au sein du fuseau mitotique, les chromatides sœurs se détachent et sont attirées vers les pôles opposés. Dans le même temps, les deux pôles cellulaires s'écartent. Au cours de la télophase, l'enveloppe nucléaire se reforme à la surface de chaque groupe de chromosomes.
La division cellulaire s'achève au moment où le contenu cyto- plasmique est divisé selon le processus de cytokinèse. Le fuseau mitotique joue un rôle important dans le processus de cytokinèse, en fixant la mise en place de la segmentation cellulaire. Le sillon de division apparaît invariable- ment dans le plan de la plaque équatoriale, perpendiculairement à l'axe du fuseau mitotique.
Les processus décrits ci-dessus sont finement régulés par un équilibre entre des réactions de phosphorylation et de déphosphorylation. Lorsque la cellule entre en mitose, des changements importants dans la phosphorylation des protéines interviennent. Le centrosome et le fuseau mitotique sont particulièrement enrichis en sites phosphorylés. De nombreuses protéine-kinases, particulièrement des sérine-thréonine-kinases, ont été décrites comme intervenant dans ces processus de phosphorylation (voir à cet égard Giet R. et Prigent C, J. Cell Science, 112, 3591-3601 , 1999). Parmi celles-ci on citera celles localisées au niveau des centrosomes, parmi lesquelles les kinases de type aurora, requises pour la séparation des centrosomes et l'assemblage du fuseau mitotique, les kinases de type polo, impliquées dans la maturation et la formation du fuseau bipolaire et les kinases de type NIMA qui régulent la séparation des centrosomes. Les mammifères possèdent au moins trois protéine-kinases du type aurora. Chez l'homme, ces trois protéine-kinases sont surexprimées dans des pathologies cancéreuses du fait d'anomalies chromosomiques. Ainsi, ces protéines semblent jouer un rôle important dans le contrôle de la ploïdie. Par exemple, une inactivation ou une surexpression de deux de ces kinases conduit à une polyploïdie. L'inhibition de l'activité de la kinase aurora A conduit à la formation de fuseaux monopolaires. L'inhibition de l'activité de la kinase aurora B conduit à la formation de cellules multinucléées par défaut de cytokinèse. Ces anomalies chromosomiques apparaissent liées à des perturbations dans la formation du fuseau mitotique. Les partenaires et les substrats de ces protéine-kinases sont encore peu connus. Par exemple, chez le xénope, aurora A interagit avec une kinésine impliquée dans la dynamique des microtubules. Chez l'homme, elle
phosphoryle la protéine HsTACC-3, également surexprimée dans de nombreuses lignées de cellules cancéreuses. Chez la drosophile, aurora A phosphoryle la protéine D-TACC et est nécessaire à sa localisation aux centrosomes afin de réguler les microtubules astraux. D-TACC interagit avec la protéine associée aux microtubules (MAP : Microtubule Associated Protein) Msp, qui fait partie de la famille des protéines XMAO215/ch-TOC/Msps, qui stimulent la croissance des microtubules in vitro et sont concentrées au niveau des centrosomes in vivo. D-TACC et Msp coopèrent pour stabiliser les centrosomes. Le terme MAP regroupe une collection de protéines variées définies sur la base de leur capacité à interagir avec les microtubules. Les MAP apparaissent comme des partenaires/substrats des kinases du centrosome comme aurora ou polo.
Une division cellulaire correcte nécessite une coordination entre la ségrégation des chromosomes par le fuseau mitotique et le clivage de la cellule par l'appareil de cytokinèse. Les microtubules du fuseau mitotique jouent un rôle essentiel dans les deux processus.
Cependant, malgré l'ensemble des travaux réalisés sur la division cellulaire, les facteurs intervenant dans une mise en place correcte du fuseau mitotique et/ou au contraire perturbant sa mise en place et/ou sa structure, entraînant ainsi les conséquences ci-dessus décrites ne sont toujours pas connus.
Une telle connaissance permettrait d'une part de mieux comprendre les mécanismes de la mitose et d'autre part de pouvoir développer des moyens de lutter contre les anomalies de la division cellulaire et les conséquences qu'elles entraînent.
C'est dans ce domaine que se place la présente Invention. En effet, de manière surprenante et inattendue, les Inventeurs ont mis en évidence une nouvelle protéine humaine associée aux centrosomes. Par immunofluorescence, elle est détectée en colocalisation avec l'α- tubuline des microtubules du fuseau mitotique, en particulier avec l'aster. Cette protéine a été nommée ASAP pour Aster Associated Protein (Protéine Associée à l'Aster) par les Inventeurs.
La surexpression de la protéine selon l'Invention entraîne des perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et induit des mitoses aberrantes et abortives (cellules plurinucléées, fuseaux mono- ou multipolaires). Sa surexpression bloque la division cellulaire et par conséquent la prolifération cellulaire.
Ainsi, l'Invention a pour objet une protéine isolée, dénommée ASAP, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : a) une protéine répondant à la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1 ; b) une protéine présentant, sur la totalité de sa séquence, au moins 80% d'identité ou au moins 90% de similarité, de préférence au moins 90 % d'identité ou au moins 95% de similarité, avec la protéine de SEQ ID NO: 1. Une protéine conforme à l'Invention se caractérise par les propriétés suivantes : elle présente un poids moléculaire compris entre 60 et 100 kDa, de préférence entre 65 et 80 kDa ; elle est associée aux centrosomes ; - elle est colocalisée par immunofluorescence avec l'α-tubuline des microtubules du fuseau mitotique ; elle présente une faible identité (23%) avec la protéine MAP1A (Microtubule Associated Protein 1A) ; elle présente des domaines coiled-coil essentiellement regroupés dans sa partie C-terminale entre les acides aminés 297 et 327 d'une part et 477 et 628 d'autre part, indiquant soit que la protéine s'oligo- mérise, soit qu'elle interagit avec d'autres protéines ; elle présente une faible identité (20%), entre les acides aminés 300 et 600 avec un domaine de type caldesmon (Gusev, N.B., Biochemistry, 10 : 1112-1121 , 2000), référencé pfam00769 (NCBI, domains, http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi?uid=pfam00769), et, entre les acides aminés 480 et 630, avec un domaine de type ERM
(Ezrin/radixin/moesin ; Louvet-Vallet, S., Biol. Cell, 274 : 305-316, 2000), référencé pfam02029 (NCBI, domains, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/cddsnt.cgi?uid=pfam02029). Les protéines caldesmon et ERM sont également considérées comme des MAP ; - elle présente également, entre les positions 65 et 303, un domaine BRCT, (Breast cancer carboxy-terminal domain ; Bork, P., et coll., FASEB J., 11 , 68-76 (1997)), indiquant que la protéine est impliquée dans le contrôle du cycle cellulaire' ; elle présente une grande richesse en hélices α dans sa partie C-terminale, en particulier dans la région comprise entre les acides aminés 420-620, presque exclusivement formée d'hélices α.
Ces éléments permettent de penser que la protéine ASAP est une nouvelle MAP.
Les protéines selon l'Invention incluent toute protéine (natu- relie, synthétique, semi-synthétique ou recombinante) de n'importe quel organisme procaryote ou eucaryote, notamment d'un mammifère, comprenant ou consistant en une protéine ASAP. Préférentiellement, ladite protéine est une protéine ASAP fonctionnelle.
On entend par "fonctionnelle", une protéine possédant une activité biologique normale, c'est à dire capable d'intervenir dans l'organisation du fuseau mitotique et dans la division cellulaire. Cette protéine peut comprendre des mutations silencieuses n'induisant aucun changement substantiel dans son activité et ne produisant aucune modification phéno- typique. Des protéines conformes à l'invention sont notamment représentées par les protéines ASAP humaine (SEQ ID NO : 1) et murine (SEQ ID NO : 46).
Sont incluses dans les protéines selon l'Invention définies en b), les protéines variantes des séquences SEQ ID NO: 1 et 46, en particulier les protéines dont la séquence en acides aminés présente au moins une mutation correspondant notamment à une troncation, une délétion, une substitution et/ou une addition d'au moins un résidu d'acide aminé par rapport
aux séquences SEQ ID NO: 1 et 46.
De manière préférée, les protéines variantes présentent une mutation entraînant un dysfonctionnement (activation ou inhibition) de la protéine, d'autres gènes ou protéines ou encore de la cellule en général. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'Invention, ladite protéine est une protéine de mammifère, préférentiellement une protéine d'origine humaine.
Au sens de la présente Invention les définitions suivantes s'appliquent. L'identité d'une séquence par rapport à la séquence de SEQ
ID NO :1 comme séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les deux séquences sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Le pourcentage d'identité peut être calculé par l'Homme du métier en utilisant un programme informatique de comparaison de séquences tel que, par exemple celui de la suite BLAST (Altschul et al., NAR, 1997, 25, 3389-3402).
Les programmes BLAST sont mis en œuvre sur la fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la SEQ ID NO :1 , indiquée comme séquence de référence.
Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % d'identité avec une séquence de référence est définie, dans la présente Invention comme une protéine dont la séquence peut inclure jusqu'à 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence, tout en conservant les propriétés fonctionnelles de ladite protéine de référence. Au sens de la présente Invention, le terme altération inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. La similarité d'une séquence par rapport à une séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques ou qui différent par des substitutions conservatives,
lorsque les deux séquences sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Au sens de la présente Invention, on entend par substitution conservative, la substitution d'un acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité), qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles de la protéine.
Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % de similarité avec une séquence de référence est définie, dans la présente Invention comme une protéine dont la séquence peut inclure jusqu'à 100-X altérations non-conservatives pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Au sens de la présente Invention, le terme altérations non- conservatives inclut les délétions, les substitutions non-conservatives ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. Par "techniques ou méthodes bien connues de l'homme du métier" on entend ici se référer aux techniques ou méthodes classiquement utilisées par l'homme du métier et exposées dans de nombreux ouvrages, comme en particulier celui intitulé Molecular Cloning. A Laboratory Manual (Sambrook J, Russell DW. (2000) Cold Spring Harbor Laboratory Press). La protéine selon l'Invention est obtenue soit à partir d'une cellule, soit par synthèse chimique, soit par recombinaison génétique.
Par synthèse chimique, la protéine peut être obtenue en utilisant l'une des nombreuses voies de synthèses peptidiques connues, par exemple les techniques mettant en œuvre des phases solides ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique. Dans ce cas, la séquence de la protéine peut être modifiée afin d'améliorer sa solubilité, en particulier dans les solvants aqueux. De telles modifications sont connues de l'homme du métier comme par exemple la délétion de domaines hydrophobes ou la substitution d'acides aminés hydrophobes par des acides aminés hydrophiles.
La protéine selon l'Invention est constituée de l'enchaînement de 13 peptides correspondants aux produits de traduction de 13 des 14 exons
que comporte le gène correspondant, le premier exon n'étant pas traduit (voir ci-après).
De manière plus précise, lesdits peptides répondent aux séquences suivantes (positions données par rapport à la numérotation de la séquence SEQ ID NO: 1) :
- Peptide 1 : il comprend 25 acides aminés correspondants aux positions 1 à 25 (SEQ ID NO: 2) ;
- Peptide 2 : il comprend 28 acides aminés correspondants aux positions 26 à 53 (SEQ ID NO: 3) ; - Peptide 3 : il comprend 107 acides aminés correspondants aux positions 54 à 160 (SEQ ID NO: 4) ;
- Peptide 4 : il comprend 76 acides aminés correspondants aux positions 161 à 236 (SEQ ID NO: 5) ;
- Peptide 5 : il comprend 31 acides aminés correspondants aux positions 237 à 267 (SEQ ID NO: 6) ;
- Peptide 6 : il comprend 83 acides aminés correspondants aux positions 268 à 350 (SEQ ID NO: 7) ;
- Peptide 7 : il comprend 24 acides aminés correspondants aux positions 351 à 374 (SEQ ID NO: 8) ; - Peptide 8 : il comprend 54 acides aminés correspondants aux positions 375 à 428 (SEQ ID NO: 9) ;
- Peptide 9 : il comprend 32 acides aminés correspondants aux positions 429 à 460 (SEQ ID NO: 10) ;
- Peptide 10 : il comprend 54 acides aminés correspondants aux positions 461 à 514 (SEQ ID NO: 11) ;
- Peptide 11 : il comprend 49 acides aminés correspondants aux positions 515 à 563 (SEQ ID NO: 12) ;
- Peptide 12 : il comprend 43 acides aminés correspondants aux positions 564 à 606 (SEQ ID NO: 13) ; - Peptide 13 : il comprend 41 acides aminés correspondants aux positions 607à 647 (SEQ ID NO: 14).
La présente Invention a aussi pour objet un peptide constitué d'un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs d'une protéine définie ci-dessus en a) ou b), particulièrement un peptide sélectionné parmi :
- les séquences correspondant aux peptides 1 à 13 décrits ci- dessus, c'est-à-dire sélectionné parmi les séquences SEQ ID NO: 2 à SEQ ID NO: 14, et
- les séquences SEQ ID NO : 47 à 53 correspondant à des mutants de la protéine hASAP délétés de la partie N-terminale contenant le domaine BRCT (NdeM : résidus 304 -647 (SEQ ID NO: 48) ; Ndel2 : résidus 411-647 (SEQ ID NO : 49) ; Ndel3 : résidus 478-647 (SEQ ID NO : 50)) ou de la partie C-terminale contenant le domaine MAP (CdeM : résidus 1 à 477 (SEQ ID NO: 51) ; Cdel2 : résidus 1 à 418 (SEQ ID NO: 52) ; Cdel3 : résidus 1 à 303 (SEQ ID NO: 53) ; résidus 1 à 421 (SEQ ID NO: 47)).
Selon un mode de réalisation avantageux de l'Invention, ledit peptide est utile pour la production d'anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine telle que définie ci-dessus, préférentiellement reconnaissant la protéine ASAP de séquence SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 46.
L'Invention a ainsi également pour objet des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement une protéine selon l'Invention.
De manière préférentielle selon l'Invention, les anticorps reconnaissent, parmi les MAPs, uniquement et spécifiquement la protéine ASAP de séquence SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 46.
Les anticorps selon l'Invention sont, par exemple, des anti- corps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal délectable et ou quantifiable.
Lesdits anticorps peuvent être obtenus directement à partir de sérum humain ou à partir de sérum d'animaux immunisés avec les protéines ou les peptides selon l'Invention. Les anticorps polyclonaux ou monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon les techniques bien connues de l'Homme du Métier.
L'Invention a également pour objet l'utilisation des anticorps selon l'Invention pour la détection et/ou la purification d'une protéine selon l'Invention.
De manière générale, les anticorps selon l'Invention peuvent être avantageusement utilisés pour détecter la présence d'une protéine selon l'Invention, normale ou mutée.
Particulièrement, les anticorps monoclonaux, peuvent être utilisés pour la détection de ces protéines dans un échantillon biologique. Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immunocytochimique ou immuno- histochimique de l'expression des protéines selon l'Invention, notamment la protéine de séquence SEQ ID NO: 1, sur des coupes de tissus. Généralement pour de telles analyses, les anticorps utilisés sont marqués afin d'être détectables par exemple par des composés immunofluorescents, par marquage à l'or ou sous forme d'immunoconjugués enzymatiques. Ils peuvent permettre notamment de mettre en évidence une expression anormale de ces protéines dans les tissus ou prélèvements biologiques et ainsi permettre la détection de cellules présentant des perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et/ou une induction des mitoses aberrantes et abortives (cellules plurinucléées, fuseaux mono- ou multipolaires) liées à la surexpression de la protéine selon l'Invention.
L'Invention a également pour objet une méthode de détection dans un échantillon biologique de la protéine selon l'Invention, particulièrement de la protéine ASAP, comprenant une première étape de traitement convenable des cellules par tout moyen approprié permettant de rendre accessible le milieu intracellulaire, une seconde étape de mise en contact dudit milieu intracellulaire ainsi obtenu avec un anticorps selon l'Invention et une troisième étape de mise en évidence par tout moyen approprié du complexe protéine ASAP-anticorps formé.
Cette méthode peut en outre permettre de mesurer le taux d'expression de la protéine selon l'Invention dans des cellules, particulièrement dans des cellules cancéreuses. L'étude de l'expression de la protéine ASAP (sur- ou sous-expression) est un élément d'évaluation de la capacité de
prolifération ou d'agressivité (capacité à évoluer vers des cancers de mauvais pronostic) de cellules cancéreuses.
L'Invention a donc également pour objet une méthode d'évaluation in vitro de la capacité de prolifération ou d'agressivité des cellules cancéreuses contenues dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend une première étape de traitement convenable des cellules par tout moyen approprié permettant de rendre accessible le milieu intracellulaire, une seconde étape de mise en contact dudit milieu intracellulaire ainsi obtenu avec un anticorps selon l'Invention, une troisième étape de mise en évidence et/ou de mesure par tout moyen approprié du complexe protéine ASAP-anticorps formé et une quatrième étape d'évaluation du taux de transcription du gène par comparaison du taux de complexes protéine ASAP-anticorps formés à celui d'un échantillon biologique témoin préalablement choisi. Ledit témoin peut être constitué par exemple par un échantillon biologique contenant des cellules présentant un taux de protéines normal ou altéré, auquel ladite méthode est appliquée dans les mêmes conditions.
L'Invention a également pour objet une trousse permettant de mettre en œuvre l'une quelconque des méthodes ci-dessus décrites comprenant : a) au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'Invention ; b) les réactifs permettant la détection du complexe protéine ASAP-anticorps produit lors de la réaction immunologique.
Selon un mode de réalisation particulier de l'Invention, la trousse peut éventuellement comprendre des réactifs nécessaires pour rendre accessible le milieu intracellulaire.
Par moyen pour rendre accessible le milieu intracellulaire, on entend tout moyen connu de l'Homme du Métier comme par exemple la lyse cellulaire par voie enzymatique, chimique ou encore la sonication, la perméa- tion membranaire, les chocs thermiques.
La présente Invention a également pour objet un polynucléotide isolé (ADNc ou fragment d'ADN génomique), caractérisé en ce que sa séquence est sélectionnée dans le groupe constitué par : les séquences codant pour une protéine ou un peptide tels que définis ci-dessus, et les séquences complémentaires des précédentes, sens ou anti-sens.
L'Invention englobe, les allèles du gène asap issus de n'importe quel mammifère, ainsi que les polynucléotides des mutants naturels ou artificiels du gène asap codant pour une protéine ASAP, particulièrement pour une protéine ASAP fonctionnelle telle que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'Invention, ledit polynucléotide codant pour une protéine ASAP répond à une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : - la séquence SEQ ID NO: 15, correspondant à l'ADN complémentaire de 2575 nucléotides de l'ARNm codant pour la protéine ASAP humaine (hASAP) ; la séquence SEQ ID NO: 45, correspondant à l'ADN complémentaire de 2767 nucléotides de l'ARNm codant pour la protéine ASAP murine (mASAP) le fragment d'ADN génomique de 29750 nucléotides répondant à la séquence représentée dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 16, correspondant au gène asap humain comprenant 14 exons dont 13 seulement sont traduits, le premier exon n'étant pas traduit, contenue dans le contig AC097467 (longueur 178204 paires de bases) entre les bases 115117 et 143828 (version v.7.29a3 NCBI/Ensembl du 12 juillet 2002, http://www.ensembl.org), par ailleurs localisée sur le chromosome 4q32.1 entre les marqueurs anonymes D4S1053 et D4S571 (région 161 ,25 Mégabases (Mb) à 161,28 Mb). La séquence SEQ ID NO: 16 est contenue dans le clone BAC
RP11-27G13 (Osoegawa, K., et col., (2001) A Bacterial Artificial Chromosome Library for Sequencing the Complète Human Génome, Génome Research,
Vol. 11 , n°3, 483-496, mars 2001). Les séquences contenues dans le contig AC097467 et dans le clone BAC RP11-27G13 ont été obtenues dans le cadre du programme de séquençage du génome humain et n'ont jusqu'à présent fait l'objet d'aucune reconnaissance ni caractérisation précises permettant de leur attribuer une quelconque fonction. Deux acides nucléiques correspondants à des fragments du polynucléotide isolé par les Inventeurs sont répertoriés dans la base de données GenBank sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812, ainsi que les EST répertoriés sous les numéros d'accès BU198882, BM693711 , AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, AI885274, AI671785, AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726, AI433877, AV751613, BQ372751 , AI827535, AI866257, AA843565, R96130, BU684090, BF958121 , BQ351941 , AW194906, BG203580, BF078132, AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494, BB025236, BF214179, AI283076, BE694273, AI266380, BM670854, AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934, AW061311 , BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152, BB185248, BB557128, BB698742, BB186736, AV345769, BB274293, BB632007, BB617958, AI391312, W18534, BB186581 , BB311289, BB312835, AW347411 , AA972439, BB263570, AU035125, BB277226, BB274224, BB268445, AW024037, AA025609, BB274174, R96089, BB272238, BB269037, BB385718, BE007324, BB325992, AJ275277, AI414381 , BB125476, BB430961 , BE232162, BQ121419, BQ121418, BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559, BI759567, AL601021 , AL598780, AU222540, BG567619, AU 166296, BF889835, AU164011 , AV656025, BF343454, AW262441 , AW237952. Ces séquences, obtenues dans le cadre d'un programme de séquençage en masse de banques d'ADN complémentaires humains, sont incomplètes et n'ont jamais été ni reconnues ni caractérisées. En fait, le polynucléotide isolé par les Inventeurs présente de longs enchaînements de desoxyadénosines (poly-dA), ce qui explique les difficultés rencontrées par les Inventeurs pour obtenir l'ADNc complet par utilisation d'amorces oligo-désoxythymidines (oligo-dT) classiques, celles-ci s'hybridant
de manière aléatoire avec les enchaînements poly-dA. C'est par l'utilisation répétée de la technique de l'amplification rapide des extrémités 3' d'ADNc (3' Rapid Amplification cDNA end ou 3'RACE) que les Inventeurs sont parvenus à isoler le polynucléotide correspondant à l'ARNm complet. L'ARNm, correspondant au polynucléotide de séquence SEQ
ID NO: 15, est spécifiquement exprimé dans le testicule sous la forme d'un polynucléotide d'une longueur d'environ 2,9 kilobases et dans le cerveau sous la forme d'un polynucléotide d'une longueur d'environ 9 kilobases pouvant correspondre soit à un prémessager soit à une isoforme de haut poids molé- culaire.
De manière plus précise, lesdits exons sont répartis comme suit sur ladite séquence génomique (par rapport à la numérotation de la séquence SEQ ID NO: 16) :
- exon 1 : il comprend 200 paires de bases correspondant aux positions 101 à 300 (SEQ ID NO: 17) ;
- exon 2 : il comprend 139 paires de bases correspondant aux positions 1157 à 1295 (SEQ ID NO: 18) ;
- exon 3 : il comprend 85 paires de bases correspondant aux positions 2050 à 2134 (SEQ ID NO: 19) ; - exon 4 : il comprend 321 paires de bases correspondant aux positions 3615 à 3935 (SEQ ID NO: 20) ;
- exon 5 : il comprend 227 paires de bases correspondant aux positions 8259 à 8485 (SEQ ID NO: 21) ;
- exon 6 : il comprend 94 paires de bases correspondant aux posi- tions 14930 à 15023 (SEQ ID NO: 22) ;
- exon 7 : il comprend 248 paires de bases correspondant aux positions 16715 à 16962 (SEQ ID NO: 23) ;
- exon 8 : il comprend 71 paires de bases correspondant aux positions 19552 à 19622 (SEQ ID NO: 24) ; - exon 9 : il comprend 169 paires de bases correspondant aux positions 21187 à 21355 (SEQ ID NO: 25) ;
- exon 10 : il comprend 90 paires de bases correspondant aux positions 21911 à 22000 (SEQ ID NO: 26) ;
- exon 11 : il comprend 162 paires de bases correspondant aux positions 23731 à 23892 (SEQ ID NO: 27) ; - exon 12 : il comprend 146 paires de bases correspondant aux positions 24014 à 24159 (SEQ ID NO: 28) ;
- exon 13 : il comprend 133 paires de bases correspondant aux positions 24343 à 24475 (SEQ ID NO: 29) ;
- exon 14 : il comprend 485 paires de bases correspondant aux positions 29166 à 29650 (SEQ ID NO: 30).
L'Invention a aussi pour objet : un fragment de l'un quelconque des polynucléotides selon l'Invention, d'au moins 15 à 1500 nucléotides consécutifs à l'exclusion des séquences répertoriées sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812 et des EST répertoriés sous les numéros d'accès BU198882, BM693711 , AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, AI885274, AI671785, AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726, AI433877, AV751613, BQ372751, AI827535, AI866257, AA843565, R96130, BU684090, BF958121 , BQ351941 , AW194906, BG203580, BF078132, AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494, BB025236, BF214179, AI283076, BE694273, AI266380, BM670854, AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934, AW061311 , BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152, BB185248, BB557128, BB698742, BB186736, AV345769, BB274293, BB632007, BB617958, AI391312, W18534, BB186581 , BB311289, BB312835, AW347411 , AA972439, BB263570, AU035125, BB277226, BB274224, BB268445, AW024037, AA025609, BB274174, R96089, BB272238, BB269037, BB385718, BE007324, BB325992, AJ275277, AI414381, BB125476, BB430961 , BE232162, BQ121419, BQ121418, BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559, BI759567, AL601021 , AL598780, AU222540, BG567619, AU166296, BF889835, AU164011 , AV656025, BF343454, AW262441 , AW237952 dans
la base de données GenBank, particulièrement un fragment sélectionné parmi les séquences correspondants aux exons c'est-à-dire sélectionné parmi les séquences SEQ ID NO: 16 à SEQ ID NO: 30 ; un acide nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, avec l'un des poly- nucléotides selon l'Invention.
La définition de l'identité d'une séquence donnée précédemment pour les protéines, s'applique par analogie aux molécules d'acide nucléique. Sont inclus dans un polynucléotide présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, selon l'Invention, les polynucléotides variants des séquences SEQ ID NO: 15 et 45, c'est-à-dire l'ensemble des polynucléotides correspondants à des variants alléliques, c'est-à-dire à des variations individuelles des séquences SEQ ID NO: 15 et 45. Ces séquences variantes naturelles correspondent à des polymorphismes présents chez les mammifères, en particulier chez l'être humain et, notamment à des polymorphismes pouvant conduire à la survenue d'une pathologie. On entend également désigner par polynucléotide variant, tout ARN ou ADNc résultant d'une mutation et/ou d'une variation d'un site d'épissage de la séquence génomique dont l'ARNm a comme ADN complémentaire le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO : 45.
De préférence, la présente Invention concerne les polynucléotides ou les fragments variants des séquences SEQ ID NO: 15 et 45, particulièrement ceux dans lesquelles les mutations conduisent à une modifi- cation de la séquence en acides aminés des protéines de séquence SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO : 46.
Les polynucléotides selon l'Invention peuvent être isolés à partir de cellules, particulièrement des cellules de testicule ou de cerveau ou à partir de banques d'ADN cellulaire. Ils peuvent également être obtenus par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) effectuée sur l'ADN total des cellules ou encore par RT-PCR effectuée sur les ARN totaux des cellules ou par synthèse chimique.
Les polynucléotides selon l'Invention, particulièrement les fragments de l'un quelconque des polynucléotides selon l'Invention, et les séquences répertoriées sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812 et les EST répertoriés sous les numéros d'accès BU198882, BM693711, AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, AI885274, AI671785, AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726, AI433877, AV751613, BQ372751 , AI827535, AI866257, AA843565, R96130, BU684090, BF958121 , BQ351941 , AW194906, BG203580, BF078132, AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494, BB025236, BF214179, AI283076, BE694273, AI266380, BM670854, AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934, AW061311 , BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152, BB185248, BB557128, BB698742, BB186736, AV345769, BB274293, BB632007, BB617958, AI391312, W18534, BB186581 , BB311289, BB312835, AW347411 , AA972439, BB263570, AU035125, BB277226, BB274224, BB268445, AW024037, AA025609, BB274174, R96089, BB272238, BB269037, BB385718, BE007324, BB325992, AJ275277, AI414381 , BB125476, BB430961 , BE232162, BQ121419, BQ121418, BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559, BI759567, AL601021 , AL598780, AU222540, BG567619, AU166296, BF889835, AU164011 , AV656025, BF343454, AW262441 , AW237952 dans la base de données GenBank ou leurs fragments, peuvent notamment être utilisés comme sondes ou comme amorces pour détecter/amplifier des polynucléotides (ARN ou ADN génomique) correspondants au polynucléotide selon l'Invention, particulièrement dans d'autres organismes.
Les transcrits du gène asap sont par exemple de préférence mis en évidence à l'aide de sondes sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO: 17 à SEQ ID NO: 44 ou à l'aide d'un EST tel que défini ci-dessus ou amplifiés par RT- PCR à l'aide d'amorces sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 31 à 43.
Le polynucléotide selon l'Invention peut permettre de diagnostiquer un état pathologique ou une maladie génétique impliquant un dysfonctionnement du gène asap et de cribler des substances capables de moduler (activer ou inhiber) la transcription dudit gène. L'Invention a aussi pour objet les polynucléotides susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide des amorces selon l'Invention.
Les sondes et amorces selon l'Invention peuvent être marquées directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal délectable et/ou quantifiable.
Le marquage des sondes selon l'Invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 35S, le 3H ou l'125l. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels que la biotine, l'avidine, la streptavidine, la digoxygenine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémo- luminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.
Les polynucléotides selon l'Invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en œuvre notamment la technique de PCR (amplification en chaîne par polymerase) (U.S. N° 4,683,202). D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplifica- tion) ou technique d'amplification à déplacement de brin, la technique TAS (Transcription-based Amplification System), la technique 3SR (Self-Sustained Séquence Replication), la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification), la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction), la technique de RCR (Repair Chain Reaction), la technique CPR (Cycling Probe Reaction), la technique d'amplification à la Q-bêta-réplicase. On peut encore citer la PCR-SSCP qui permet de détecter des mutations ponctuelles.
Ces techniques sont bien entendu parfaitement connues de l'homme du métier.
Comme sondes ou comme amorces, les différents polynucléotides selon l'Invention peuvent permettent, soit de déterminer le profil de transcription du gène asap correspondant ou une éventuelle altération de ce profil dans un échantillon biologique, soit de mettre en évidence le gène correspondant dans d'autres espèces, des variants alléliques de ce gène ou une éventuelle altération fonctionnelle de ce gène (changement substantiel dans l'activité de la protéine codée par ledit gène) résultant d'une mutation (insertion, délétion ou substitution) d'un ou plusieurs nucléotides au niveau d'au moins un exon dudit gène. De telles mutations incluent en particulier les délétions, les insertions ou les substitutions non-conservatives au niveau de codons correspondant à des résidus d'acides aminés situés dans un domaine essentiel pour l'activité biologique de la protéine. Ainsi l'Invention a pour objet une méthode de détermination du profil de transcription du gène correspondant au polynucléotide selon l'Invention ou d'une altération dudit profil, dans un échantillon biologique, comprenant une première étape d'obtention par tout moyen approprié des ARN totaux à partir de l'échantillon biologique, une deuxième étape de mise en contact desdits ARN. avec une sonde selon l'Invention, préalablement marquée, dans des conditions classiques d'hybridation entre les ARN et la sonde et une troisième étape de révélation par tout moyen approprié des hybrides formés.
Par conditions classiques d'hybridation, on entend celles décrites dans Sambrook J, Russell DW. (2000) Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Selon un mode de mise en œuvre de ladite méthode, la deuxième étape peut être une étape de transcription inverse et d'amplification des transcrits, réalisée à l'aide d'une paire d'amorces telles que décrites précédemment et la troisième étape, une étape de révélation par tout moyen approprié des acides nucléiques amplifiés formés.
Ladite méthode de détermination du profil de transcription du gène peut en outre comporter une étape d'évaluation du taux de transcription du gène par comparaison avec un échantillon témoin préalablement choisi. Ledit témoin peut être constitué par exemple par un échantillon biologique présentant une transcription normale ou altérée du gène correspondant au polynucléotide selon l'Invention auquel ladite méthode de détermination du profil de transcription du gène est appliquée dans les mêmes conditions.
L'Invention a aussi pour objet une méthode de mise en évidence dans d'autres espèces du gène correspondant au polynucléotide selon l'Invention ou des variants alléliques dudit gène ou d'une altération fonctionnelle de ce gène, dans un échantillon biologique, comprenant une première étape d'obtention par tout moyen approprié de l'ADN à partir des cellules d'un échantillon biologique, une deuxième étape de mise en contact desdits ADN avec une sonde selon l'Invention, préalablement marquée, dans des conditions classiques d'hybridation entre les ADN et la sonde et une troisième étape de révélation par tout moyen approprié des hybrides formés.
Selon un mode de mise en œuvre de ladite méthode, la deuxième étape peut être une étape d'amplification réalisée à l'aide d'une paire d'amorces telles que décrites précédemment et la troisième étape, une étape de révélation par tout moyen approprié des acides nucléiques amplifiés formés. La méthode peut éventuellement comporter une quatrième étape d'isolement et de séquençage des acides nucléiques mis en évidence.
L'Invention a également pour objet une trousse de réactifs pour la mise en œuvre des méthodes précédemment décrites comprenant : a) au moins une sonde ou une paire d'amorces selon l'Invention ; b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction classique d'hybridation entre ladite sonde ou lesdites amorces et l'acide nucléique de l'échantillon biologique ; c) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification ;
d) les réactifs nécessaires à la détection et/ou au dosage de l'hybride formé entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon biologique ou des acides nucléiques amplifiés formés.
Une telle trousse peut également contenir des contrôles posi- tifs ou négatifs afin d'assurer la qualité des résultats obtenus. Elle peut également contenir les réactifs nécessaires à la purification des acides nucléiques à partir de l'échantillon biologique.
Le polynucléotide de l'Invention ou un de ses fragment, ainsi que les EST décrits précédemment ou leur fragments peuvent servir à la mise au point de modèles cellulaires ou animaux n'exprimant pas la protéine ASAP, en invalidant le gène ASAP par la méthode de Si RNA (ou RNAi pour RNA interférence ; M. McManus and P. Sharp, Nature Reviews Genetics, 3, 737-747, 2002 ; V. Brondani, F. Kolb, E. Billy, M/S, 6-7, 665-667, 2002) à l'aide d'oligonucléotides dérivés de leurs séquences. L'Invention a également pour objet un vecteur de clonage et/ou d'expression dans lequel est inséré le polynucléotide selon l'Invention.
Un tel vecteur peut contenir les éléments nécessaires à l'expression et éventuellement à la sécrétion de la protéine dans une cellule hôte. Lesdits vecteurs comportent de préférence : un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Ils doivent pouvoir être maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent éventuellement comprendre des séquences codant pour des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite tels que par exemple un promoteur fort de nature ubiquitaire ou un promoteur sélectif d'un type de cellule et/ou de tissu particulier. Ces différentes séquences de contrôle sont choisies en fonction de l'hôte cellulaire utilisé.
Le polynucléotide selon l'Invention peut être inséré dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi ou des vecteurs inté- gratifs de l'hôte choisi.
Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilise de préférence en fonction de la cellule hôte, des systèmes de type plasmidique ou viral. Les vecteurs viraux peuvent notamment être des adénovirus, des rétrovirus, des lentivirus, des poxvirus ou des virus herpétiques. L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes.
Lorsque l'on souhaite l'intégration de la séquence dans les chromosomes de la cellule hôte, on peut utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou viral ; de tels virus sont, par exemple, les rétrovirus ou les virus associés aux adénovirus (Adeno-associated virus ou AAV). Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN ou l'ARN nu, les chromosomes artificiels de bactérie (BAC, bacterial artificiel chromosome), les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificiel chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expres- sion dans les cellules murines et de manière préférée les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines.
De tels vecteurs sont préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les vecteurs recombinants en résul- tant peuvent être introduits dans l'hôte approprié par des méthodes standards, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, la transformation après perméabilisation chimique de la membrane, la fusion cellulaire.
L'Invention a aussi pour objet les cellules hôtes transformées, notamment les cellules eucaπ/otes et procaryotes, dans lesquelles au moins un polynucléotide ou un fragment selon l'Invention ou au moins un vecteur selon l'Invention a été introduit.
Parmi les cellules utilisables aux sens de la présente Invention, on peut citer les cellules bactériennes, les cellules de levure, les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères ou encore les cellules végétales. On peut citer également les cellules d'insectes dans
lesquelles on peut utiliser des procédés mettant par exemple en oeuvre des baculovirus.
L'Invention a également pour objet les organismes transgéniques non-humains tels que les animaux ou les végétaux transgéniques, dont tout ou partie des cellules contient le polynucléotide selon l'Invention ou le vecteur selon l'Invention, sous une forme libre ou intégrée.
De préférence selon l'Invention, les organismes transgéniques non-humains sont ceux porteurs de cellules contenant un polynucléotide selon l'Invention, non fonctionnel ou porteur d'une mutation. Selon l'Invention les animaux transgéniques sont de préférence des mammifères, excepté l'homme, plus préférentiellement les rongeurs, en particulier les souris ou les rats.
Les animaux transgéniques peuvent être obtenus par toute méthode classique connue de l'homme du métier, comme par exemple par recombinaison homologue sur cellules souches embryonnaires, transfert de ces cellules souches, à des embryons, sélection des chimères affectées au niveau des lignées reproductrices, et croissance desdites chimères.
Les cellules hôtes transformées, les animaux ou les végétaux transgéniques selon l'Invention peuvent ainsi exprimer ou surexprimer le gène codant pour la protéine selon l'Invention ou leur gène homologue ou exprimer ledit gène dans lequel est introduite une mutation.
Les cellules de testicule ou de cerveau, les cellules hôtes transformées ou les organismes transgéniques selon l'Invention peuvent être utilisés pour la préparation de la protéine selon l'Invention. La protéine selon l'Invention, particulièrement la protéine
ASAP native, peut être purifiée selon les techniques connues de l'homme du métier. Ainsi, la protéine peut être purifiée à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, particulièrement de chromatographie d'affinité, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques, etc..
L'Invention a également pour objet une méthode de préparation de la protéine ASAP, se caractérisant en ce que l'on cultive des cellules exprimant la protéine ou des cellules transformées selon la présente Invention, notamment les cellules de mammifères ou les cellules d'organismes transgéniques selon l'Invention, dans des conditions permettant l'expression de ladite protéine, et que l'on purifie ladite protéine.
Comme technique de purification, on peut citer par exemple la chromatographie d'affinité sur glutathione-sépharose (ou agarose) telle que décrite dans Sambrook J & Russell DW. (2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
L'Invention a également pour objet une protéine, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par l'une quelconque des méthodes de préparation ci-dessus décrites.
L'Invention a encore pour objet une méthode de criblage d'une substance capable d'interagir in vitro, directement ou indirectement, avec le polynucléotide ou la protéine selon l'Invention caractérisée en ce que : dans une première étape on met en contact la substance à tester et le polynucléotide ou la protéine selon l'Invention et dans une deuxième étape on détecte par tout moyen approprié le complexe formé entre ladite substance et le polynucléotide ou la protéine selon l'Invention.
La présente invention a également pour objet une méthode de criblage d'une substance capable de moduler (activer ou inhiber) l'activité de la protéine ASAP, caractérisée en ce que : - dans une première étape on met en contact des cellules d'un échantillon biologique exprimant la protéine ASAP avec une substance à tester,
- dans une deuxième étape on mesure par tout moyen approprié l'effet de ladite substance sur l'activité de ladite protéine ASAP, et - dans une troisième étape on sélectionne des substances capables de moduler ladite activité.
Au sens de la présente invention, on entend par activité de la protéine ASAP, aussi bien l'expression de la protéine ASAP ou des transcrits
(ARNm) correspondants, que l'activité biologique de ladite protéine ASAP, comme par exemple son effet sur l'organisation du fuseau mitotique ou l'induction de mitoses aberrantes et abortives.
La détection du complexe formé entre ladite substance et le polynucléotide ou la protéine ou la mesure de l'effet de ladite substance sur l'activité de ladite protéine ASAP peuvent être réalisées par les techniques classiques d'analyse d'ARNm ou de protéines qui sont connues en elles-mêmes ; à titre d'exemple non-limitatif, on peut citer les techniques suivantes : RT-PCR, Northern-blot, Westem-blot, RIA, ELISA, immunopréci- pitation, techniques d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique. Avantageusement, ladite mesure est réalisée à l'aide des sondes, des amorces ou des anticorps, tels que définis ci-dessus. De telles substances peuvent être des macromolécules biologiques comme par exemple un acide nucléique, un lipide, un sucre, une protéine, un peptide, un composé hybride protéine-lipide, protéine-sucre, peptide-iipide ou peptide-sucre, une protéine ou un peptide sur lequel on a ajouté des ramifications chimiques ou encore des molécules chimiques. L'Invention a également pour objet le polynucléotide, la protéine, les anticorps, les vecteurs ou les cellules transformées selon l'Invention, utilisés comme médicaments.
Comme indiqué précédemment, la surexpression de la protéine selon l'Invention bloque la division cellulaire et par conséquent la prolifération cellulaire. Cela en fait un excellent candidat pour une utilisation comme agent anti-mitotique, utilisable par exemple dans le traitement des pathologies cancéreuses.
Ainsi, l'Invention a également pour objet l'utilisation du polynucléotide, d'un vecteur ou de la protéine selon l'Invention, dans la prépara- tion d'un médicament anti-mitotique.
De même comme il est également indiqué précédemment, la surexpression de la protéine selon l'Invention entraîne des perturbations dans
l'organisation du fuseau mitotique et induit des mitoses aberrantes et abor- tives (cellules plurinucléées, fuseaux mono- ou multipolaires).
Ainsi, l'Invention a aussi pour objet l'utilisation d'un polynucléotide anti-sens ou d'un fragment anti-sens, d'un anticorps, d'un vecteur contenant un oligonucléotide anti-sens selon l'Invention, capables d'inhiber l'expression du polynucléotide ou de la protéine selon l'Invention, dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées aux perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et/ou à une induction des mitoses aberrantes et abortives (cellules plurinucléées, fuseaux mono- ou multipolaires) liées à la surexpression de la protéine selon l'Invention.
Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l'Invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - La Figure 1 représente la localisation chromosomique et la structure du gène asap humain.
- La Figure 2 représente les signaux obtenus par Northern blots sur différents tissus humains après hybridation avec une sonde hASAP.
- La Figure 3 représente les résultats obtenus : (A) par électrophorèse sur gel d'agarose des produits de
RT-PCR obtenus avec des amorces correspondant au polynucléotide de souris, orthologue du polynucléotide SEQ ID NO: 15, à partir de différents tissus de souris.
(B) Après transfert du gel après électrophorèse sur une membrane et hybridation avec une sonde mASAP interne.
- La Figure 4 représente la localisation cellulaire de la protéine hASAP couplée à la Green Fluorescent Protein (GFP) en 3' ou la Yellow Fluorescent Protein (YFP) en 5' ou à un tag MYC du côté N-terminal (colonne fusion). Les noyaux sont colorés à l'iodure de propidium ou au
Hoechst 33286. (4A : objectif 63x ; 4B, 4C, 4D : objectif I00X).
- La Figure 5 montre la co-localisation de la protéine ASAP
humaine avec l'alpha-tubuline. Figure 5 A : localisation cellulaire de l'alpha- tubuline, Figure 5 B : localisation de la protéine ASAP, Figure 5 C : superposition des 2 images montrant la colocalisation des 2 protéines.
Les exemples suivants sont illustratifs de l'Invention et ne la limitent aucunement.
EXEMPLE 1 : Construction de la séquence codante ASAP complète :
On amplifie la séquence complète de l'ADNc de la protéine ASAP à partir de 2 fragments chevauchants :
- un fragment A amplifié par PCR à partir du clone AI885274 avec les amorces : constFIS-1F (5'-ATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (SEQ ID NO: 31) et constFIS-2R (5'-AGGCCTCAAATGATGCTAATGC-3') (SEQ ID NO: 32) ; - un fragment B amplifié à partir du clone AI671785 avec les amorces : constFIS-2F (5'-ATCATTTGAGGCCTGGAAGGC-3') (SEQ ID
NO: 33) et et constFIS-1 R (5'-AAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3') (SEQ ID NO: 34).
Puis, pour obtenir un produit PCR unique correspondant à la séquence complète de l'ADNc de la protéine ASAP, utilisable pour les expériences de fonction, 0,5 μl des produits de chacune des 2 réactions PCR (fragment A et B) sont hybrides ensemble à 25°C puis amplifiés avec les amorces constFIS-1 F et constFIS-2F. Ce produit PCR est sous-cloné dans le vecteur PCR4 suivant les recommandations du fabricant (Invitrogen) et vérifié par séquençage.
Les difficultés majeures rencontrées se sont situées dans la détermination in silico de la séquence codante complète ASAP et de sa reconstruction in vitro. En particulier, le choix des amorces et des différentes
PCR de la région 3' ont été délicats en raison de la richesse de la séquence en polyA.
EXEMPLE 2 : Analyse bio-informatique
La Figure 1 représente la localisation chromosomique et la structure du gène asap humain.
L'organisation complète du gène asap et sa localisation chromosomique ont été obtenues en comparant la séquence de l'ADNc obtenu à l'exemple 1 , à la séquence du génome humain en utilisant les programmes du Wellcome Trust Sanger Institute
(httl2://www.ensembl.oriz/genome/central/ et plus précisément le programme de recherche BLAST (htip://genome.cse.ucsc.edu/). Le gène humain asap est constitué de 29750 nucléotides comprenant 14 exons dont 13 seulement sont traduits, le premier exon n'étant pas traduit. La taille des exons s'échelonne de 71 à 321 paires de bases. La séquence du gène est contenue dans le contig AC097467 (longueur 178204 paires de bases) entre les bases 115117 et 143828 (version v.7.29a3 NCBI/EnsembI du 12 juillet 2002, http ://www.ensembl.org), et est par ailleurs localisée sur le chromosome 4q32.1 entre les marqueurs anonymes D4S1053 et D4S571 (région 161 ,25 Mégabases (Mb) à 161,28 Mb). La séquence du gène est physiquement contenue dans le clone BAC RP11-27G13.
Deux acides nucléiques correspondants à des fragments du polynucléotide isolé par les Inventeurs sont répertoriés dans la base de données GenBank sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812, ainsi que les EST répertoriés sous les numéros d'accès BU198882, BM693711 , AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, AI885274, AI671785, AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726, AI433877, AV751613, BQ372751 , AI827535, AI866257, AA843565, R96130, BU684090, BF958121 , BQ351941 , AW194906, BG203580, BF078132, AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494, BB025236, BF214179, AI283076, BE694273, AI266380, BM670854, AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934, AW061311 , BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152, BB185248, BB557128, BB698742, BB186736, AV345769, BB274293, BB632007, BB617958, AI391312, W18534, BB186581 , BB311289,
BB312835, AW347411 , AA972439, BB263570, AU035125, BB277226, BB274224, BB268445, AW024037, AA025609, BB274174, R96089, BB272238, BB269037, BB385718, BE007324, BB325992, AJ275277, AI414381, BB125476, BB430961 , BE232162, BQ121419, BQ121418, BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559, BI759567, AL601021 , AL598780, AU222540, BG567619, AU166296, BF889835, AU164011 , AV656025, BF343454, AW262441, AW237952. Ces séquences, obtenues dans le cadre d'un programme de séquençage en masse de banques d'ADN complémentaires humains, sont incomplètes et n'ont jamais été ni reconnues ni caractérisées.
La séquence protéique a été comparée aux séquences des banques de données en utilisant les programmes PSI-BLAST et PHI-BLAST du NCBI (http://www.ncbi.nIm.nih.gov/Sitemap/). Des motifs protéiques consensus ont été recherchés en utilisant les programmes DART du NCBI et SMART d'ExPASy-Tools (http://www.expasy.ch/tools/#similariw), dont les paramètres permettent de détecter des motifs de faible homologie. La protéine ASAP présente une identité de séquence de 23% sur le tiers C-terminal avec une protéine associée aux microtubules (MAP 1A pour Microtubule-Associated-Protein 1A). Par ailleurs la recherche de motifs conservés (DART on SMART) révèle des domaines de type caldesmon (Gusev, N.B., Biochemistry, 10 1112-1121 , 2000) et ERM (Ezrin/radixin/moesin) (Louvet-Vallet, S., Biol. Cell, 274 : 305-316, 2000), qui sont des protéines également considérées comme des MAPs, avec des identités d'environ 20%. Elle présente également un domaine BRCT (Breast cancer carboxy-terminal domain ; Bork, P., et coll., FASEB J., 11 , 68-76 (1997)) entre les positions 65 et 303.
La protéine ASAP présente des domaines coiled-coil essentiellement regroupés dans sa partie C-terminale entre les acides aminés 297 et 327 d'une part et 477 et 628 d'autre part, indiquant soit que la protéine s'oligomérise, soit qu'elle interagit avec d'autres protéines.
L'analyse informatique de la protéine à l'aide des programmes accessibles dans le site internet (http://npsa-bil.ibcp.fr/cgi-
bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA npsa_secons.html), révèle l'absence de feuillet β et une très grande richesse en hélices α, en particulier pour la région comprise entre les acides aminés 420-620, presque exclusivement formées d'hélices α. Ces éléments permettent de penser que la protéine ASAP est une nouvelle MAP. EXEMPLE 3 : Expression tissulaire a) Analyse par Northern blot
Préparation des sondes radioactives : Les ADN à radiomarquer sont isolés sur gel à bas point de fusion (LMP) selon la technique décrite dans Rouquier, S. et al., (Genomics, 17, 330-340, (1993)). Environ 100 ng d'ADN ainsi isolé, sont marqués par amorçage aléatoire (fragment de Klenow, Proméga) en présence de [α32P dCTP] (Amersham) selon la technique décrite dans Feinberg, A.P. & Vogelstein, B., (Anal. Biochem., 132, 6-13, (1983)). Ces sondes sont purifiées sur des colonnes de Sephadex G-50 selon la technique décrite dans Sambrook J & Russell DW. (2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Les hybridations s'effectuent durant la nuit en présence de 2.106 Cpm/ml de sonde radioactive dénaturée. a.1) Hvbrjdatj n
Deux membranes Northern Blot de la société Clontech, (Human MTN Blot at Human MTN Blot II, Réf. 7760-1 et 7759-1) comportant des ARNm humains de différents tissus ont été hybridées avec l'ADNc hASAP complet marqué comme décrit ci-dessus. La membrane est hybridée en présence de formamide à 42°C, en suivant le protocole Clontech. Un contrôle d'hybridation de la membrane est réalisé avec une sonde actine. La membrane est rincée 2 fois à haute stringence en 0,1X SSC/0,1% SDS à la température de 42°C, pendant 15 minutes. Les membranes sont alors analysées par autoradiographie ou au Phosphorimager. Les tissus testés sont : la rate, le thymus, la prostate, le testicule, l'ovaire, l'intestin grêle, le colon, les leucocytes sanguins, le cœur, le
cerveau, le placenta, le poumon, le foie, le muscle squelettique, le rein et le pancréas. a.2) Résultats
La Figure 2 illustre ces résultats. Deux signaux sont détectés :
- un signal dans le testicule à environ 2,6 kb, ce qui correspond à la taille de l'ARNm ;
- un signal dans le cerveau mais à un haut poids moléculaire (9 kb) qui correspond soit à un prémessager, soit à une isoforme de haut poids moléculaire b) Analyse par RT-PCR
Cette analyse a été effectuée sur des ARNs totaux de différents tissus de souris, à savoir le cerveau, le cœur, le colon, le foie, l'intestin grêle, le muscle squelettique, le pancréas, le poumon, le rein, la rate et le testicule. b.1 ) Obtention de l'AD Ne .Qrth jpgue.de sgurjs
Les ARNs totaux de cellules de différents tissus de souris sont extraits avec le "mammalian total RNA kit" de la société Sigma. Les ARN sont rétro-transcrits avec le kit Superscript II de la société Invitrogen selon les conditions prescrites par le fournisseur et en utilisant des amorces oligodT. Les produits obtenus sont vérifiés par électrophorèse sur gel d'agarose à l%. 1 μl de chaque échantillon ainsi obtenu est à son tour amplifié par PCR (25 μl de milieu de réaction, 30 cycles (94°C pendant 15 secondes, 55°C pendant 30 secondes, 72°C pendant 30 secondes)) avec des amorces spécifiques du gènes asap de souris (mFIS-1F, 5'-ACA ACG AAT AAC AGA GTG TCC-3' (SEQ ID NO: 35) et mFIS-2R, 5'-ACT CCT GAT AAA CAG CTG CC-3' (SEQ ID NO: 36).
Les produits amplifiés obtenus sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1%, colorés au bromure d'éthydium et leur taille comparée à un marqueur de taille déposé sur le gel en parallèle.
Après électrophorèse, les produits amplifiés obtenus sont transférés par capillarité sur membrane de nylon chargée, dans le tampon
NaCI 1,5M/NaOH 0,5M, selon la technique de Southern (transfert alcalin). La membrane est ensuite hybridée avec une sonde radiomarquée mASAP, (SEQ ID NO: 44), générée par amplification de la séquence contenue dans le clone de souris AW06131 sélectionné après comparaison de la séquence ASAP humaine dans les banques de données (GenBank) (http://expression.gnf.org/promoter/tissue/images/41739_s_at.png).
L'amplification a été réalisée par PCR (conditions telles que décrites ci-dessus dans lesquelles le volume de réaction est de 50 μl et le dCTP froid est à la concentration de 10 μM supplémenté avec 50 μCi d'α-P32- dCTPà 3000Ci/mmole), en utilisant les amorces mFIS-1F (SEQ ID NO: 35) et mFis-2R (SEQ ID NO: 36). Les hybridations sont réalisées à 65°C (dans du tampon 6X SSC/0,5% SDS/5X Denhardt). La membrane est rincée à forte stringence (0,IX SSC/0.1% SDS), puis analysée par autoradiographie ou au Phosphorlmager. b.2) .Résultats
La Figure 3 illustre ces résultats.
On constate qu'on obtient un signal majoritaire dans le testicule et le cerveau, nettement visible sur gel (Figure 3A).
Après transfert du gel et hybridation avec une sonde interne, on constate que l'on détecte un signal très faible dans les autres tissus (Figure 3B).
Par conséquent l'ARNm codant pour la protéine mASAP est majoritairement exprimé dans le testicule et le cerveau. L'ADNc complet de souris, amplifié par RT-PCR à partir de l'ARN de testicule de souris, correspond à la séquence SEQ ID NO : 45 et la protéine correspondante (mASAP) à la séquence SEQ ID NO : 46. EXEMPLE 4 : Localisation cellulaire a) Sous-clonage de l'ADNc hASAP dans un vecteur d'expression eucaryote
L'ADNc hASAP obtenu à l'exemple 1 est inséré dans trois vecteurs d'expression :
1- dans pEAK10-EGFP en phase avec la Green Fluorescent Protein (GFP) fusionnée en C-terminal (vecteur 1) (pEAK10, vecteur de Edge
Biosystems (distribué par Q.BIOgene, lllkirch en France) dans lequel a été introduit la protéine EGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) suivant la référence Gaillard, I., et al., Eur. J. Neurosci., 15, 409-418, 2002) ;
2- dans pEYFP-C1 en phase avec la Yellow Fluorescent Protein (YFP) fusionnée du côté N-terminal (vecteur 2) (distribué par BD
Biosciences Clontech)) ;
3- dans GLOMYC3-1 comportant un tag MYC du côté N-terminal (vecteur 3) , vecteur dérivé du vecteur pcDNA3.1 (Invitrogen), dans lequel ont été insérées une région 5' non-traduite (5' UTR) et un tag MYC aux sites Hindlll-BamHI, et la région 3'UTR de la globine (fragment Spel-Xbal dans le site Xbal).
L'ADNc hASAP est amplifié à partir de son vecteur de clonage initial (pCR4-TOPO) par PCR en utilisant la polymerase haute-fidélité pfu
Turbo, à l'aide d'amorces amplifiant l'ADNc entre la méthionine de départ et le dernier acide aminé. Les produits amplifiés obtenus sont sous-clonés dans les
3 vecteurs.
- Clonage dans PEAK-GFP. Préparation de l'insert d'ADN par PCR [94°C 2 min ; (94°C 15 sec; 58°C 30 sec; 72°C 1min 30 sec.) 30 cycles ; 72°C 3 min.], à l'aide des amorces hFIS-Exp1F (5'-GCCACCATGTCTGATGAAGTTTTTAGCAC-3) (SEQ ID NO:
37) et hFIS-Exp1 R (5'-GAAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3') (SEQ ID NO: 38).
Le vecteur est coupé par EcoRV et déphosphorylé : 10 ng de vecteur sont utilisés pour la ligation avec l'insert d'ADN. Le produit PCR est phosphoryle puis purifié sur high PURE PCR kit (Roche) : 100 ng d'insert sont utilisés pour la ligation [12h à 16°C dans 10 μl final (ligase Biolabs), suivant les conditions standards (Sambrook and Russell)].
Clonage dans Glomyc : Préparation de l'insert d'ADN par
PCR [94°C 2 min ; (94°C 15 sec; 60°C 30 sec; 72°C 1min 30 sec.) 30 cycles ; 72°C 3 min.], à l'aide des amorces :
Glomyc-FIS1 F : (5'-TAATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (SEQ ID NO:
39) et
Glomyc-FIS1R : (5'-TCAAAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3') (SEQ ID NO:
40).
Conditions de clonage identiques à celles décrites pour le clonage dans PEAK-GFP. - Clonage dans YFP : Préparation de l'insert d'ADN : mêmes conditions que pour Glomyc, à l'aide des amorces :
YFP-FIS1 F (5'-AATGTCTGATGAAG I I I I IAGCACC-3') (SEQ ID NO: 41) et
Glomyc-FIS1R (SEQ ID NO: 40) (cf ci-dessus).
Conditions de clonage identiques à celles décrites pour le clonage dans PEAK-GFP, le vecteur ayant préalablement été coupé par
Sma1.
Les recombinants sont analysés par PCR en utilisant une amorce du vecteur et une amorce interne.
PEAK-GFP : annealing à 58°C, extension 45 sec. à 72°C. et conditions standards pour le reste. Amorces : constFIS-2F (SEQ ID NO: 33) et GFP-1 R
(5'-TCAGCTTGCCGTAGGTGGC-3') (SEQ ID NO: 42).
YFP : annealing 55°C pendant 1 min. ; Amorces : YFP-2F (5'-
ATGGTCCTGCTGGAGTTCG-3') (SEQ ID NO: 43) et hFIS-Exp1R (SEQ ID
NO: 38) . Glomyc : annealing 44°C, extension 45 sec. à 72°C. Amorces : constFIS-2F
(SEQ ID NO: 33) et SP6. Les recombinants sont séquences par séquençage automatique à façon à partir des produits PCR (Génome Express, Meylan). b) Sous-clonage de l'ADNc hASAP dans un vecteur d'expression procarvote
En utilisant une stratégie similaire à celle utilisée au para- graphe a) ci-dessus, l'ADNc hASAP a été clone dans le vecteur pGEX-4T2 (AMERSHAM), de façon à produire une protéine de fusion avec la GST, purifiable selon les protocoles standards. c) Sous-clonage de l'ADNc mASAP dans un vecteur d'expression procarvote ou eucaryote En utilisant une stratégie similaire à celle utilisée au paragraphe a) ci-dessus, l'ADNc mASAP a été clone dans les vecteurs suivants :
- pGEX-4T2, (AMERSHAM), de façon à produire une protéine de fusion avec la GST, purifiable selon les protocoles standards.
- pEYFP-C1 de façon à produire une protéine de fusion (fusion N-terminale) avec la Yellow Fluorescent Protein (YFP) détectable par immunofluorescence directe. d) Transfection, immunofluorescence et microscopie d • 1 ) matériels et.rnéthpdes
Les vecteurs obtenus sont transfectés selon la technique au phosphate de calcium ou de façon plus routinière en utilisant le procédé jetPEl (GDSP10101 , Qbiogene) suivant les recommandations du fabricant, dans les lignées cellulaires suivantes :
- PEAK (réf. 37937, Edge Biosystems (distribué par Q.BIOgene, lllkirch en France), uniquement pour les constructions ASAP humaines, - HEK-293 (ATCC (American Tissue Culture Collection) référence CRL-1573 ; p53 -/- non synchronisable), pour les constructions ASAP humaines et murines,
- NIH3T3 non-transformées (constructions ASAP murines), et
- U-2 OS (ATCC HTB-96 ; p53 +/-, synchronisable) Pour les vecteurs 1) et 2) (constructions ASAP humaines et murines), les localisations se font directement par détection de la fluorescence de la GFP ou de l'YFP à 24h, 48h et 72h après fixation des cellules au para- formaldéhyde et coloration des noyaux soit au propioiodure de propidium, soit au Hoechst 33286. Pour le vecteur 3) la détection du tag MYC est réalisée à l'aide d'un anticorps primaire anti-MYC distribué par TEBU (9 E10, cat.#SC- 40, Santa Cruz Biotechnology, CA) et d'un anticorps secondaire de chèvre anti-lgG de souris marqué au fluorochrome Alexa-594 (Molecular Probes, réf. A-11032, distribué en France par Interchim, Montluçon), après la fixation des cellules et leur permeabilisation au Triton X100 0,1%. Les lames sont analysées, et les images collectées sur un microscope Zeiss Axiophot.
d.2) R.é .uJtats..:..Loçalisatjpn ayecj.'alβha-t.u.bujjne
- localisation cellulaire
La Figure 4 illustre la localisation cellulaire de la protéine hASAP surexprimée dans la lignée HEK-293 (IP = lodure de propidium).
L'observation au microscope à fluorescence des lames correspondant aux différentes transfections par les vecteurs 1), 2) et 3) montrent les mêmes types de profil : la localisation des protéines hASAP et mASAP est cytoplasmique et son profil fibreux rappelle celui des filaments de tubuline.
Par ailleurs, il semble que les cellules transfectées présentent des défauts de division car les noyaux sont toujours plus gros que dans les cellules non transfectées (Figure 4A et 4B). De plus, certaines des cellules transfectées semblent plurinucléées (Figure 4B). Ceci suggère une division anormale des cellules transfectées.
Enfin, la mitose des cellules transfectées semble anormale, tant au niveau de l'organisation des chromosomes, que du profil de localisation des protéines hASAP et mASAP au niveau du fuseau mitotique. Le profil de localisation des protéines hASAP et mASAP, en étoile, est caractéristique de la nucléation des microtubules en aster autour du centrosome (Figures 4C et 4D).
Un profil similaire de localisation de la protéine ASAP est détecté dans la lignée U-2 OS (p53 +/-) surexprimant hASAP et dans la lignée NI H 3T3 non-transformée surexprimant mASAP ; une accumulation de cellules monopolaires en mitose est observée.
En outre, en synchronisant les cellules U-2 OS et en récupérant les extraits cellulaires à différents moments du cycle, il a été vérifié que la protéine ASAP était bien présente dans toutes les phases du cycle cellulaire (interphase, S, G2/M). - colocalisation de la protéine ASAP avec l'alpha-tubuline
La Figure 5 illustre la co-localisation de la protéine ASAP humaine avec l'alpha-tubuline ; de même la protéine ASAP murine co-localise
avec l'alpha-tubuline.
La Figure 5 A illustre la localisation cellulaire de l'alpha- tubuline détectée par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps anti-tubuline (Alexa-594, Molecular Probe). La Figure 5 B illustre la localisation de la protéine ASAP marquée à la YFP (yellow fluorescent protein).
La Figure 5 C représente la superposition des 2 images démontrant la colocalisation des 2 protéines.
EXEMPLE 5 : Production d'anticorps polyclonaux anti-hASAP et mASAP a) Production d'anticorps
Les constructions suivantes de la protéine ASAP ont été clonées dans le vecteur d'expression procarvote pGEX 4T-2 (AMERSHAM) comme décrit à l'exemple 4 :
- protéine ASAP humaine entière (SEQ ID NO : 1) - protéine humaine délétée de sa partie C-terminale contenant le domaine MAP potentiel (résidus 1 à 421 , SEQ ID NO : 47)
- protéine murine entière (SEQ ID NO : 46).
Les protéines ont été exprimées dans E. coli et purifiées selon les protocoles standards. Des lapins ont ensuite été immunisés avec les protéines ASAP purifiées selon un protocole standard, et les sérums immuns ont été récoltés. b) Analyse de la réactivité des sérums polyclonaux vis-à-vis de la protéine ASAP endogène.
Les sérums polyclonaux monospécifiques dirigés contre la protéine hASAP entière ou délétée de sa partie C-terminale contenant le domaine MAP potentiel, ont été testées en Western-blot et en immunofluorescence, sur des cellules HEK-293 et U-2 OS, selon des protocoles standards.
En Western-blot, le sérum polyclonal monospécifique dirigé contre la protéine hASAP entière détecte une protéine d'un poids moléculaire apparent d'environ 110 kDa correspondant à la protéine ASAP endogène, aussi bien dans les cellules HEK-293 que les cellules U-2 OS. Dans ces conditions, un anticorps anti-FLAG, détecte une protéine de poids moléculaire
équivalent, dans des cellules contrôle HEK-293 ou U-2 OS, transfectées par un vecteur d'expression de la protéine hASAP fusionnée avec une étiquette
FLAG.
En immunofluorescence, le sérum polyclonal monospécifique dirigé contre la protéine hASAP entière marque les microtubules des cellules
HEK-293 en interphase, les asters des cellules en mitose et les microtubules du corps résiduel en fin de télophase.
Le sérum polyclonal monospécifique dirigé contre la protéine hASAP délétée de sa partie C-terminale contenant le domaine MAP potentiel présente le même profil en immunofluorescence et détecte une protéine d'environ 110 kDa, en Western blot.
Le sérum polyclonal monospécifique dirigé contre la protéine mASAP est utilisé pour détecter quels sont les types cellulaires exprimant
ASAP et à quel(s) stade(s) du cycle cellulaire elle est exprimée, par immuno- fluorescence sur des coupes testiculaires de souris.
EXEMPLE 6 : Analyse fonctionnelle de la protéine hASAP à l'aide de mutants délétés de la partie N-terminale contenant le domaine BRCT ou de la région C-terminale contenant le domaine MAP potentiel.
Des fragments d'ADNc codant pour une protéine hASAP délétée de la partie N-terminale contenant le domaine BRCT (NdeH : résidus
304 -647 (SEQ ID NO : 48) ; Ndel2 : résidus 411-647 (SEQ ID NO : 49) ;
Ndel3 : résidus 478-647 (SEQ ID NO : 50)) ou de la partie C-terminale contenant le domaine MAP (CdeM : résidus 1 à 477 (SEQ ID NO : 51) ;
Cdel2 : résidus 1 à 418 (SEQ ID NO : 52) ; Cdel3 : résidus 1 à 303 (SEQ ID NO : 53)) ont été amplifiés par PCR à l'aide d'amorces appropriées puis clones dans les vecteurs d'expression pEAK10-EGFP (fusion C-terminale avec la GFP) et pEYFP-C1 (fusion N-terminale avec la YFP) selon un protocole similaire à celui décrit à l'exemple 4.
Les différentes constructions ont été transfectées dans les lignées HEK-293 et U-2 OS puis la localisation cellulaire des différents mutants de la protéine hASAP a été analysée comme décrit à l'exemple 4.
On constate que pour les mêmes délétions, un profil similaire est obtenu avec la construction comportant la YFP en N-terminal ou la GFP en C-terminal.
Par comparaison avec la protéine hASAP entière, les 3 constructions délétées de la partie C-terminale ne colocalisent plus en interphase avec la tubuline et ne présentent plus un aspect fibreux ; ces résultats indiquent que la délétion intéresse un domaine MAP. En outre, aucune cellule monopolaire bloquée en mitose n'est observée dans les cellules surexprimant les mutants délétés de la partie C-terminale contenant le domaine MAP. Par comparaison avec la protéine hASAP entière, les 3 constructions délétées de la partie N-terminale contenant le domaine BRCT, présentent une localisation nucléaire sous forme de foyers mais il reste dans le cytoplasme quelques fibres co-localisant avec la tubuline.
L'analyse fonctionnelle de la protéine hASAP est complétée par des expériences d'inactivation de l'expression du gène par des ARN interférents (ARNi).
Claims
REVENDICATIONS
1°) Protéine isolée, dénommée ASAP, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : a) une protéine répondant à la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1, correspondant à la protéine ASAP humaine, et b) une protéine présentant, sur la totalité de sa séquence, au moins 80% d'identité ou au moins 90% de similarité, de préférence au moins 90 % d'identité ou moins 95% de similarité, avec la protéine de séquence SEQ ID NO: 1.
2°) Protéine selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID NO: 46 correspondant à la protéine ASAP murine.
3°) Peptide, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs d'une protéine selon la revendication 1 ou la revendication 2.
4°) Peptide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les séquences représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 2 à SEQ ID NO: 14 et SEQ ID NO: 47 à 53.
5°) Protéine variante de la séquence SEQ ID NO: 1 ou de la séquence SEQ ID NO: 46, caractérisée en ce qu'elle présente une mutation entraînant un dysfonctionnement de la protéine.
6°) Protéine ou peptide selon l'une quelconque des revendica- tions 1, 3, 4 ou 5, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une protéine ou d'un peptide d'origine humaine.
7°) Polynucléotide isolé, répondant à une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par :
- les séquences codant pour une protéine ou pour un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ;
les séquences représentées sous les numéros SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 45 dans la liste de séquences en annexe, correspondant respectivement aux ADNc ASAP humain et murin, le fragment d'ADN génomique de 29800 nucléotides répondant à la séquence représentée dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 16, correspondant au gène asap humain ; un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs de l'une quelconque des séquences précédentes, à l'exclusion des séquences répertoriées sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812 et des EST répertoriés sous numéros d'accès BU 198882, BM693711 , AW372449,
BM021380, BU928828, AL707573, AI885274, AI671785, AA805679,
BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726, AI433877,
AV751613, BQ372751 , AI827535, AI866257, AA843565, R96130, BU684090,
• BF958121 , BQ351941 , AW194906, BG203580, BF078132, AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494, BB025236, BF214179, AI283076, BE694273, AI266380, BM670854, AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934, AW061311 , BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152, BB185248, BB557128, BB698742, BB186736, AV345769, BB274293, BB632007, BB617958, AI391312, W18534, BB186581 , BB311289, BB312835, AW347411, AA972439, BB263570, AU035125, BB277226, BB274224, BB268445, AW024037, AA025609, BB274174, R96089, BB272238, BB269037, BB385718, BE007324, BB325992, AJ275277, AI414381, BB125476, BB430961 , BE232162, BQ121419, BQ121418, BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559, BI759567, AL601021 , AL598780, AU222540, BG567619, AU166296, BF889835, AU164011 , AV656025, BF343454, AW262441 , AW237952 dans la base de données GenBank ; un fragment de l'un quelconque des séquences précé- dentés, sélectionné parmi les séquences représentées dans la liste des séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 16 à SEQ ID NO: 30 ;
une séquence présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, après alignement optimal avec l'une des séquences ou l'un des fragments précédents ;
- les séquences complémentaires des précédentes, sens ou anti-sens.
8°) Polynucléotide ou fragment selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide variant de la séquence SEQ ID NO: 15 ou 45.
9°) Polynucléotide ou fragment selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide porteur d'au moins une mutation conduisant à une modification de la séquence en acides aminés de la protéine correspondant à la séquence SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID N : 46.
10°) Utilisation d'un polynucléotide ou d'un fragment selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou de l'une des séquences réperto- riées sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812 et d'un des EST répertoriés sous les numéros d'accès BU198882, BM693711 , AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, AI885274, AI671785, AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726, AI433877, AV751613, BQ372751 , AI827535, AI866257, AA843565, R96130, BU684090, BF958121 , BQ351941 , AW194906, BG203580, BF078132, AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494, BB025236, BF214179, AI283076, BE694273, AI266380, BM670854, AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934, AW061311 , BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152, BB185248, BB557128, BB698742, BB186736, AV345769, BB274293, BB632007, BB617958, AI391312, W18534, BB186581 , BB311289, BB312835, AW347411 , AA972439, BB263570, AU035125, BB277226, BB274224, BB268445, AW024037, AA025609, BB274174, R96089, BB272238, BB269037, BB385718, BE007324, BB325992, AJ275277, AI414381 , BB125476, BB430961 , BE232162, BQ121419, BQ121418, BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559, BI759567, AL601021 , AL598780, AU222540, BG567619, AU166296, BF889835,
AU164011 , AV656025, BF343454, AW262441, AW237952 dans la base de données GenBank ou de leurs fragments, comme sonde pour détecter, identifier ou doser des polynucléotides correspondants au polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, particulièrement dans d'autres organismes.
11°) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que la sonde est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 15, 45 ou SEQ ID NO: 17 à SEQ ID NO: 44.
12°) Amorce pour l'amplification des polynucléotides (ARN ou ADN génomique) correspondants au polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, particulièrement dans d'autres organismes caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 31 à 43.
13°) Polynucléotide susceptible d'être obtenu par amplification à l'aide des amorces selon la revendication 12.
14°) Méthode de détermination du profil de transcription du gène correspondant au polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou 13, ou d'une altération dudit profil, dans un échantillon biologique, comprenant une première étape d'obtention par tout moyen approprié des ARN totaux à partir de l'échantillon biologique, une deuxième étape de mise en contact desdits ARN avec une sonde telle que définie aux revendications 10 ou 11 préalablement marquée dans des conditions classiques d'hybridation entre les ARN et la sonde et une troisième étape de révélation par tout moyen approprié des hybrides formés. 15°) Méthode selon la revendication 14, dans laquelle la deuxième étape est une étape de transcription inverse et/ou d'amplification des transcrits, réalisée à l'aide d'une paire d'amorces selon la revendication 12 et la troisième étape est une étape de révélation par tout moyen approprié des acides nucléiques amplifiés. 16°) Méthode selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre une étape d'évaluation du
taux de transcription du gène par comparaison à un témoin préalablement choisi.
17°) Méthode de mise en évidence dans d'autres espèces du gène correspondant au polynucléotide selon l'une quelconque des revendica- tions 7 à 9 ou 13, ou de mise en évidence des variants alléliques dudit gène ou de mise en évidence d'une altération fonctionnelle de ce gène, dans un échantillon biologique, comprenant une première étape d'obtention par tout moyen approprié de l'ADN à partir de l'échantillon biologique, une deuxième étape de mise en contact desdits ADN avec une sonde telle que définie aux revendications 10 ou 11 , préalablement marquée, dans des conditions classiques d'hybridation entre les ADN et la sonde et une troisième étape de révélation par tout moyen approprié des hybrides formés.
18°) Méthode selon la revendication 17, dans laquelle la deuxième étape est une étape d'amplification réalisée à l'aide d'amorces selon la revendications 12 et la troisième étape une étape de révélation par tout moyen approprié des acides nucléiques amplifiés formés.
19°) Méthode selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre une étape d'isolement et de séquençage des acides nucléiques mis en évidence. 20°) Trousse de réactifs pour la mise en œuvre des méthodes selon l'une quelconque des revendications 14 à 19 comprenant :
- au moins une sonde telle que définie aux revendications 10 ou 11 et/ou des amorces selon la revendication 12 ;
- les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction classique d'hybridation entre ladite sonde et/ou lesdites amorces et l'acide nucléique de l'échantillon biologique ;
- les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification ;
- les réactifs nécessaires à la détection et/ou le dosage de l'hybride formé entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon biologique ou des acides nucléiques amplifiés formés.
21°) Vecteur de clonage et/ou d'expression dans lequel est inséré un polynucléotide ou un fragment selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou 13.
22°) Cellules hôtes transformées, dans lesquelles au moins un polynucléotide ou un fragment selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou 13 ou au moins un vecteur selon la revendication 21 a été introduit.
23°) Organismes transgéniques non-humains, dont tout ou partie des cellules contient au moins un polynucléotide ou d'un fragment selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou 123 ou au moins un vecteur * selon la revendication 20, sous une forme libre ou intégrée.
24°) Organismes transgéniques non-humains selon la revendication 23 caractérisés en ce qu'ils sont porteurs de cellules contenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou 13 non fonctionnel ou porteur d'une mutation. 25°) Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication
22 ou d'un organisme transgénique non-humain selon l'une quelconque des revendications 23 ou 24, pour la production d'une protéine ou d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
26°) Méthode de préparation d'une protéine ou d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'on cultive des cellules exprimant la protéine ou des cellules transformées selon la revendication 22 ou un organisme transgénique selon l'une quelconque des revendications 23 ou 24, dans des conditions permettant l'expression de ladite protéine, et que l'on purifie ladite protéine. 27°) Protéine, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par la méthode de préparation selon la revendication 26.
28°) Anticorps mono- ou polyclonal caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître spécifiquement une protéine ou un peptide selon l'une quelconque des revendications 1à 6 ou 27. 29°) Anticorps selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il reconnaît, parmi les MAPs, uniquement et spécifiquement la protéine ASAP de séquence SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 46.
30°) Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 28 ou 29 pour la détection et/ou la purification d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 27.
31°) Méthode de détection d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 27, dans les cellules d'un échantillon biologique, comprenant une première étape de traitement convenable des cellules par tout moyen approprié permettant de rendre accessible le milieu intracellulaire, - une seconde étape de mise en contact dudit milieu intracellulaire ainsi obtenu avec un anticorps selon l'une quelconque des revendications 28 ou 29 et une troisième étape de mise en évidence par tout moyen approprié du complexe protéine ASAP-anticorps formé. 32°) Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 28 ou 29 pour la détection et/ou la sélection de cellules présentant des perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et/ou une induction des mitoses aberrantes et abortives liées à la surexpression de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 27. 33°) Méthode d'évaluation in vitro de la capacité de prolifération ou d'agressivité de cellules cancéreuses comprenant une première étape de traitement convenable des cellules par tout moyen approprié permettant de rendre accessible le milieu intracellulaire, - une seconde étape de mise en contact dudit milieu intracellulaire ainsi obtenu avec un anticorps selon l'une quelconque des revendications 28 ou 29, une troisième étape de mise en évidence et de mesure par tout moyen approprié du complexe protéine ASAP-anticorps formé et - une quatrième étape d'évaluation du taux de transcription du gène par comparaison du taux de complexes protéine ASAP-anticorps formés à celui d'un échantillon biologique témoin préalablement choisi.
34°) Trousse permettant de mettre en oeuvre la méthode selon l'une quelconque des revendications 31 ou 33 comprenant : au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'une quelconque des revendications 28 ou 29 ; - les réactifs permettant la détection du complexe protéine
ASAP-anticorps produit lors de la réaction immunologique.
35°) Méthode de criblage d'une substance capable d'interagir in vitro, directement ou indirectement, avec le polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou 13 ou la protéine ou un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 27, caractérisée en ce que : dans une première étape on met en contact la substance à tester et le polynucléotide ou la protéine et dans une deuxième étape on détecte par tout moyen approprié le complexe formé entre ladite substance et le polynucléotide ou la protéine.
36°) Méthode de criblage d'une substance capable de moduler l'activité de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 27, caractérisée en ce que :
- dans une première étape on met en contact des cellules d'un échantillon biologique exprimant la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 27, avec une substance à tester,
- dans une deuxième étape on mesure par tout moyen approprié de l'effet de ladite substance sur l'activité de ladite protéine, et
- dans une troisième étape on sélectionne des substances capables de moduler ladite activité.
37°) Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 27 ou polynucléotide ou fragment selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou 13 ou anticorps selon l'une quelconque des revendications 28 ou 29 ou vecteur selon la revendication 21 ou cellule transformée selon la revendication 22, utilisé comme médicaments.
38°) Utilisation d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 27 ou d'un polynucléotide ou d'un fragment selon
l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou 13 ou d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 28 ou 29 ou d'un vecteur selon la revendication 21 ou d'une cellule transformée selon la revendication 22, dans la préparation d'un médicament anti-mitotique. 39°) Utilisation d'un polynucléotide ou d'un fragment anti-sens selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou 13 ou d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 28 ou 29 ou d'un vecteur contenant un oligonucléotide anti-sens selon la revendication 21 et capable d'inhiber l'expression du polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 , 2 ,5, 6 dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées aux perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et/ou à une induction des mitoses aberrantes et abortives, liées à la surexpression de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 27.
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