FR2849039A1 - Nouvelle proteine associee aux centrosomes et ses applications - Google Patents
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Abstract
L'Invention est relative une nouvelle protéine associée aux centrosomes, au polynucléotide codant pour ladite protéine ainsi qu'aux applications de ladite protéine et dudit polynucléotide. La surexpression de la protéine selon l'Invention entraîne des perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et induit des mitoses aberrantes et abortives.
Description
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Nouvelle protéine associée aux centrosomes et ses applications.
La présente Invention est relative à une nouvelle protéine associée aux centrosomes, au polynucléotide codant pour ladite protéine ainsi qu'aux applications de ladite protéine et dudit polynucléotide.
Le processus de division cellulaire consiste en une division nucléaire (mitose) suivie d'une division cytoplasmique (cytokinèse). La mitose est dominée par la formation d'un fuseau polaire très organisé (le fuseau mitotique) constitué de deux familles de microtubules : les microtubules polaires et les microtubules kinétochoriens. Les microtubules sont des polymères composés de sous-unités d'[alpha]- et ss-tubuline. Leur croissance est initiée dans la région périphérique du centrosome par un complexe contenant majoritairement une protéine apparentée, la y-tubuline. Les microtubules polaires sont composés de rangées de microtubules et de protéines associées qui sont mises en place par les deux centres mitotiques, associés à des centrioles, situés aux pôles opposés du fuseau (asters). Chaque chromosome répliqué est constitué de deux chromatides s#urs reliées entre elles par le centromère. Les microtubules kinétochoriens sont liés aux chromosomes répliqués par des structures spécialisées appelées kinétochores qui se forment au cours de la prophase sur chacune des deux faces du centromère.
Les chromosomes se condensent pendant la prophase et forment les microtubules kinétochoriens qui commencent à interagir avec les microtubules polaires du fuseau après rupture de l'enveloppe nucléaire au cours de la prométaphase. Sous l'effet de la tension due aux forces opposées, dirigées vers les pôles qui tirent les microtubules kinétochoriens, les chromosomes s'alignent dans la zone équatoriale du fuseau pendant la métaphase. A l'anaphase, sous l'effet de forces continuellement développées au sein du fuseau mitotique, les chromatides s#urs se détachent et sont attirées vers les pôles opposés. Dans le même temps, les deux pôles cellulaires s'écartent. Au cours de la télophase, l'enveloppe nucléaire se reforme à la surface de chaque groupe de chromosomes.
La division cellulaire s'achève au moment où le contenu cytoplasmique est divisé selon le processus de cytokinèse. Le fuseau mitotique joue un rôle important dans le processus de cytokinèse, en fixant la mise en place de la segmentation cellulaire. Le sillon de division apparaît invariablement dans le plan de la plaque équatoriale, perpendiculairement à l'axe du fuseau mitotique.
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Les processus décrits ci-dessus sont finement régulés par un équilibre entre des réactions de phosphorylation et de déphosphorylation.
Lorsque la cellule entre en mitose, des changements importants dans la phosphorylation des protéines interviennent. Le centrosome et le fuseau mitotique sont particulièrement enrichis en sites phosphorylés. De nombreuses protéine-kinases, particulièrement des sérine-thréonine-kinases, ont été décrites comme intervenant dans ces processus de phosphorylation (voir à cet égard Giet R. et Prigent C., J. Cell Science, 112,3591-3601, 1999).
Parmi celles-ci on citera celles localisées au niveau des centrosomes, parmi lesquelles les kinases de type aurora, requises pour la séparation des centrosomes et l'assemblage du fuseau mitotique, les kinases de type polo, impliquées dans la maturation et la formation du fuseau bipolaire et les kinases de type NIMA qui régulent la séparation des centrosomes.
Les mammifères possèdent au moins trois protéine-kinases du type aurora. Chez l'homme, ces trois protéine-kinases sont surexprimées dans des pathologies cancéreuses du fait d'anomalies chromosomiques.
Ainsi, ces protéines semblent jouer un rôle important dans le contrôle de la ploïdie. Par exemple, une inactivation ou une surexpression de deux de ces kinases conduit à une polyploïdie. L'inhibition de l'activité de la kinase aurora A conduit à la formation de fuseaux monopolaires. L'inhibition de l'activité de la kinase aurora B conduit à la formation de cellules multinucléées par défaut de cytokinèse. Ces anomalies chromosomiques apparaissent liées à des perturbations dans la formation du fuseau mitotique.
Les partenaires et les substrats de ces protéine-kinases sont encore peu connus. Par exemple, chez le xénope, aurora A interagit avec une kinésine impliquée dans la dynamique des microtubules. Chez l'homme, elle phosphoryle la protéine HsTACC-3, également surexprimée dans de nombreuses lignées de cellules cancéreuses. Chez la drosophile, aurora A phosphoryle la protéine D-TACC et est nécessaire à sa localisation aux centrosomes afin de réguler les microtubules astraux. D-TACC interagit avec la protéine associée aux microtubules (MAP : Microtubule Associated Protein) Msp, qui fait partie de la famille des protéines XMA0215/ch-TOC/Msps, qui stimulent la croissance des microtubules in vitro et sont concentrées au niveau des centrosomes in vivo. D-TACC et Msp coopèrent pour stabiliser les centrosomes. Le terme MAP regroupe une collection de protéines variées définies sur la base de leur capacité à interagir avec les microtubules. Les
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MAP apparaissent comme des partenaires/substrats des kinases du centrosome comme aurora ou polo.
Une division cellulaire correcte nécessite une coordination entre la ségrégation des chromosomes par le fuseau mitotique et le clivage de la cellule par l'appareil de cytokinèse. Les microtubules du fuseau mitotique jouent un rôle essentiel dans le deux processus.
Cependant, malgré l'ensemble des travaux réalisés sur la division cellulaire, les facteurs intervenant dans une mise en place correcte du fuseau mitotique et/ou au contraire perturbant sa mise en place et/ou sa structure, entraînant ainsi les conséquences ci-dessus décrites ne sont toujours pas connus.
Une telle connaissance permettrait d'une part de mieux comprendre les mécanismes de la mitose et d'autre part de pouvoir développer des moyens de lutter contre les anomalies de la division cellulaire et les conséquences qu'elles entraînent.
C'est dans ce domaine que se place la présente Invention.
En effet, de manière surprenante et inattendue, les Inventeurs ont mis en évidence une nouvelle protéine humaine associée aux centrosomes. Par immunofluorescence, elle est détectée en colocalisation avec l'atubuline des microtubules du fuseau mitotique, en particulier avec l'aster.
Cette protéine a été nommée ASAP pour Aster Associated Protein (Protéine Associée à l'Aster) par les Inventeurs.
La surexpression de la protéine selon l'Invention entraîne des perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et induit des mitoses aberrantes et abortives (cellules plurinucléées, fuseaux mono- ou multipolaires). Sa surexpression bloque la division cellulaire et par conséquent la prolifération cellulaire.
Ainsi, l'Invention a pour objet une protéine isolée, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : a) une protéine répondant à la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID N 1 ; b) une protéine comportant, sur sa totalité, au moins 80% d'identité ou au moins 90% de similarité, de préférence au moins 90 % d'identité ou au moins 95% de similarité, avec la protéine SEQ ID N 1.
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Une protéine conforme à l'Invention se caractérise par les propriétés suivantes : - elle présente un poids moléculaire compris entre 60 et 100 kDa, de préférence entre 65 et 80 kDa ; - elle est associée aux centrosomes ; - elle est colocalisée par immunofluorescence avec l'a-tubuline des microtubules du fuseau mitotique ; - elle présente une faible identité (23%) avec la protéine MAP1A (Microtubule Associated Protein 1A) ; - elle présente des domaines coiled-coil essentiellement regroupés dans sa partie C-terminale entre les acides aminés 297 et 327 d'une part et 477 et 628 d'autre part, indiquant soit que la protéine s'oligomérise, soit qu'elle interagit avec d'autres protéines ; - elle présente une faible identité (20%), entre les acides aminés 300 et 600 avec un domaine de type caldesmon (Gusev, N.B., Biochemistry, 10 : 2000), référencé pfam00769 (NCBI, domains, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi?uid=pfam00769), et, entre les acides aminés 480 et 630, avec un domaine de type ERM (Ezrin/radixin/moesin ; Louvet-Vallet, S., Biol. Cell, 274 : 305-316,2000), référencé pfam02029 (NCBI, domains, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/cddsrv.cgi?uid=pfam02029). Les protéines caldesmon et ERM sont également considérées comme des MAP ; - elle présente également, entre les positions 65 et 303, un domaine BRCT, (Breast cancer carboxy-terminal domain ; Bork, P., et coll., , FASEB J., 11,68-76 (1997)), protéine impliquée dans le contrôle du cycle cellulaire, ; - elle présente une grande richesse en hélices a dans sa partie C-terminale, en particulier dans la région comprise entre les acides aminés 420-620, presque exclusivement formées d'hélices a.
Ces éléments permettent de penser que la protéine ASAP est une nouvelle MAP.
Les protéines selon l'Invention incluent toute protéine (naturelle, synthétique, semi-synthétique ou recombinante) de n'importe quel orga-
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nisme procaryote ou eucaryote, notamment d'un mammifère, comprenant ou consistant en une protéine ASAP. Préférentiellement, ladite protéine est une protéine ASAP fonctionnelle.
On entend par "fonctionnelle", une protéine possédant une activité biologique normale, c'est à dire capable d'intervenir dans l'organisation du fuseau mitotique et dans la division cellulaire. Cette protéine peut comprendre des mutations silencieuses n'induisant aucun changement substantiel dans son activité et ne produisant aucune modification phénotypique.
Sont incluses dans les protéines selon l'Invention définies en b), les protéines variantes de la séquence SEQ ID N 1, en particulier les protéines dont la séquence en acides aminés présente au moins une mutation correspondant notamment à une troncation, une délétion, une substitution et/ou une addition d'au moins un résidu d'acide aminé par rapport à la séquence SEQ ID N 1.
De manière préférée, les protéines variantes présentent une mutation entraînant un dysfonctionnement (activation ou inhibition) de la protéine, d'autres gènes ou protéines ou encore de la cellule en général.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'Invention, ladite protéine est une protéine de mammifère, préférentiellement une protéine d'origine humaine.
Au sens de la présente Invention les définitions suivantes s'appliquent.
L'identité d'une séquence par rapport à une séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les deux séquences sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles.
Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % d'identité avec une séquence de référence est définie, dans la présente Invention comme une protéine dont la séquence peut inclure jusqu'à 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence, tout en conservant les propriétés fonctionnelles de ladite protéine de référence. Au sens de la présente Invention, le terme altération inclut les délétions, les
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substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence.
La similarité d'une séquence par rapport à une séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques ou qui différent par des substitutions conservatives, lorsque les deux séquences sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Au sens de la présente Invention, on entend par substitution conservative, la substitution d'un acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité), qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles de la protéine.
Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % de similarité avec une séquence de référence est définie, dans la présente Invention comme une protéine dont la séquence peut inclure jusqu'à 100-X altérations non-conservatives pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Au sens de la présente Invention, le terme altérations nonconservatives inclut les délétions, les substitutions non-conservatives ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence.
Par "techniques ou méthodes bien connues de l'homme du métier" on entend ici se référer aux techniques ou méthodes classiquement utilisées par l'homme du métier et exposées dans de nombreux ouvrages, comme en particulier celui intitulé Molecular Cloning. A Laboratory Manual (Sambrook J, Russell DW. (2000) Cold Spring Harbor Laboratory Press).
La protéine selon l'Invention est obtenue soit à partir d'une cellule, soit par synthèse chimique, soit par recombinaison génétique.
Par synthèse chimique, la protéine peut être obtenue en utilisant l'une des nombreuses voies de synthèses peptidiques connues, par exemple les techniques mettant en #uvre des phases solides ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique. Dans ce cas, la séquence de la protéine peut être modifiée afin d'améliorer sa solubilité, en particulier dans les solvants aqueux. De telles modifications sont connues de l'homme du métier comme par exemple la délétion de domaines hydrophobes ou la substitution d'acides aminés hydrophobes par des acides aminés hydrophiles.
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La protéine selon l'Invention est constituée de l'enchaînement de 13 peptides correspondants aux produits de traduction de 13 des 14 exons que comporte le gène correspondant, le premier exon n'étant pas traduit (voir ci-après).
De manière plus précise, lesdits peptides répondent aux séquences suivantes (positions données par rapport à la numérotation de la séquence SEQ ID N 1) : - Peptide 1 : il comprend 25 acides aminés correspondants aux positions 1 à 25 (SEQ ID N 2) ; - Peptide 2 : il comprend 28 acides aminés correspondants aux positions 26 à 53 (SEQ ID N 3) ; - Peptide 3 : il comprend 107 acides aminés correspondants aux positions 54 à 160 (SEQ ID N 4) ; - Peptide 4 : il comprend 76 acides aminés correspondants aux positions 161 à 236 (SEQ ID N 5) ; - Peptide 5 : il comprend 31 acides aminés correspondants aux positions 237 à 267 (SEQ ID N 6) ; - Peptide 6 : il comprend 83 acides aminés correspondants aux positions 268 à 350 (SEQ ID N 7) ; - Peptide 7 : il comprend 24 acides aminés correspondants aux positions 351 à 374 (SEQ ID N 8) ; - Peptide 8 : il comprend 54 acides aminés correspondants aux positions 375 à 428 (SEQ ID N 9) ; - Peptide 9 : il comprend 32 acides aminés correspondants aux positions 429 à 460 (SEQ ID N 10) ; - Peptide 10 : il comprend 54 acides aminés correspondants aux positions 461 à 514 (SEQ ID N 11) ; - Peptide 11 : il comprend 49 acides aminés correspondants aux positions 515 à 563 (SEQ ID N 12) ; - Peptide 12 : il comprend 43 acides aminés correspondants aux positions 564 à 606 (SEQ ID N 13) ;
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- Peptide 13 : il comprend 41 acides aminés correspondants aux positions 607à 647 (SEQ ID N 14).
La présente Invention a aussi pour objet un peptide constitué d'un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs d'une protéine définie ci-dessus en a) ou b), particulièrement un peptide sélectionné parmi les séquences correspondant aux peptides 1 à 13 décrits ci-dessus, c'est-à-dire sélectionné parmi les séquences SEQ ID N 2 à SEQ ID N 14.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'Invention, ledit peptide est utile pour la production d'anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine telle que définie ci-dessus, préférentiellement reconnaissant la protéine ASAP de séquence SEQ ID N 1.
L'invention a ainsi également pour objet des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement une protéine selon l'Invention.
De manière préférentielle selon l'Invention, les anticorps reconnaissent, parmi les MAPs, uniquement et spécifiquement la protéine ASAP de séquence SEQ ID N 1.
Les anticorps selon l'Invention sont, par exemple, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2.
Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal délectable et/ou quantifiable.
Lesdits anticorps peuvent être obtenus directement à partir de sérum humain ou à partir de sérum d'animaux immunisés avec les protéines ou les peptides selon l'Invention. Les anticorps polyclonaux ou monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon les techniques bien connues de l'Homme du Métier.
L'Invention a également pour objet l'utilisation des anticorps selon l'Invention pour la détection et/ou la purification d'une protéine selon l'Invention.
De manière générale, les anticorps selon l'Invention peuvent être avantageusement utilisés pour détecter la présence d'une protéine selon l'Invention, normale ou mutée.
Particulièrement, les anticorps monoclonaux, peuvent être utilisés pour la détection de ces protéines dans un échantillon biologique. Ils
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constituent ainsi un moyen d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique de l'expression des protéines selon l'Invention, notamment la protéine de séquence SEQ ID N 1, sur des coupes de tissus. Généralement pour de telles analyses, les anticorps utilisés sont marqués afin d'être détectables par exemple par des composés immunofluorescents, par marquage à l'or ou sous forme d'immunoconjugués enzymatiques.
Ils peuvent permettre notamment de mettre en évidence une expression anormale de ces protéines dans les tissus ou prélèvements biologiques et ainsi permettre la détection de cellules présentant des perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et/ou une induction des mitoses aberrantes et abortives (cellules plurinucléées, fuseaux mono- ou multipolaires) liées à la surexpression de la protéine selon l'invention.
L'invention a également pour objet une méthode de détection dans un échantillon biologique de la protéine selon l'Invention, particulièrement de la protéine ASAP, comprenant une première étape de traitement convenable des cellules par tout moyen approprié permettant de rendre accessible le milieu intracellulaire, une seconde étape de mise en contact dudit milieu intracellulaire ainsi obtenu avec un anticorps selon l'Invention et une troisième étape de mise en évidence par tout moyen approprié du complexe protéine ASAP-anticorps formé.
Cette méthode peut en outre permettre de mesurer le taux d'expression de la protéine selon l'invention dans des cellules, particulièrement dans des cellules cancéreuses. L'étude de l'expression de la protéine ASAP (sur- ou sous-expression) est un élément d'évaluation de la capacité de prolifération ou d'agressivité (capacité à évoluer vers des cancers de mauvais pronostic) de cellules cancéreuses.
L'invention a donc également pour objet une méthode d'évaluation in vitro de la capacité de prolifération ou d'agressivité des cellules cancéreuses contenues dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend une première étape de traitement convenable des cellules par tout moyen approprié permettant de rendre accessible le milieu intracellulaire, une seconde étape de mise en contact dudit milieu intracellulaire ainsi obtenu avec un anticorps selon l'Invention, une troisième étape de mise en évidence et/ou de mesure par tout moyen approprié du complexe protéine ASAP-anticorps formé et une quatrième étape d'évaluation du taux de
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transcription du gène par comparaison du taux de complexes protéine ASAP-anticorps formés à celui d'un échantillon biologique témoin préalablement choisi. Ledit témoin peut être constitué par exemple par un échantillon biologique contenant des cellules présentant un taux de protéines normal ou altéré, auquel ladite méthode est appliquée dans les mêmes conditions.
L'invention a également pour objet une trousse permettant de mettre en oeuvre l'une quelconque des méthodes ci-dessus décrites comprenant : a) au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'Invention ; b) les réactifs permettant la détection du complexe protéine ASAP-anticorps produit lors de la réaction immunologique.
Selon un mode de réalisation particulier de l'Invention, la trousse peut éventuellement comprendre des réactifs nécessaires pour rendre accessible le milieu intracellulaire.
Par moyen pour rendre accessible le milieu intracellulaire, on entend tout moyen connu de l'Homme du Métier comme par exemple la lyse cellulaire par voie enzymatique, chimique ou encore la sonication, la perméation membranaire, les chocs thermiques.
La présente Invention a également pour objet un polynucléotide isolé (ADNc ou fragment d'ADN génomique), caractérisé en ce qu'il comprend ou répond à une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : - les polynucléotides codant pour une protéine ou un peptide tels que définis ci-dessus, et - les polynucléotides complémentaires des précédents, sens ou anti-sens.
L'Invention englobe, les allèles du gène asap issus de n'importe quel mammifère, ainsi que les polynucléotides des mutants naturels ou artificiels du gène asap codant pour une protéine ASAP, particulièrement pour une protéine ASAP fonctionnelle telle que définie ci-dessus.
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Selon un mode de réalisation avantageux de l'Invention, ledit polynucléotide codant pour une protéine ASAP comprend ou répond à une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : - la séquence SEQ ID N 15, correspondant à l'ADN complémentaire de 2575 nucléotides de l'ARNm codant pour la protéine hASAP ; - le fragment d'ADN génomique de 29750 nucléotides répondant à la séquence représentée dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID N 16, correspondant au gène asap humain comprenant 14 exons dont 13 seulement sont traduits, le premier exon n'étant pas traduit, contenue dans le contig AC097467 (longueur 178204 paires de bases) entre les bases 115117 et 143828 (version v.7.29a3 NCBI/Ensembl du 12 juillet 2002, http://www.ensembl.org), par ailleurs localisée sur le chromosome 4q32. 1 entre les marqueurs anonymes D4S1053 et D4S571 (région 161,25 Mégabases (Mb) à 161,28 Mb).
La séquence SEQ ID N 16 est contenue dans le clone BAC RP11-27G13 (Osoegawa, K., et col., (2001) A Bacterial Artificial Chromosome Library for Sequencing the Complete Human Genome, Genome Research, Vol. 11, n 3, 483-496, mars 2001). Les séquences contenues dans le contig AC097467 et dans le clone BAC RP11-27G13 ont été obtenues dans le cadre du programme de séquençage du génome humain et n'ont jusqu'à présent fait l'objet d'aucune reconnaissance ni caractérisation précises permettant de leur attribuer une quelconque fonction. Deux acides nucléiques correspondants à des fragments du polynucléotide isolé par les Inventeurs sont répertoriés dans la base de données GenBank sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812, ainsi que les EST répertoriés sous les numéros d'accès BU198882, BM693711, AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, AI885274, A1671785, AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726, AI433877, AV751613, BQ372751, A1827535, A1866257, AA843565, R96130, BU684090, BF958121, BQ351941, AW194906, BG203580, BF078132, AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494, BB025236, BF214179, AI283076, BE694273, A1266380, BM670854, AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934, AW061311, BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152, BB185248, BB557128, BB698742, BB186736, AV345769, BB274293, BB632007, BB617958, AI391312, W18534, BB186581, BB311289, BB312835, AW347411, AA972439,
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BB263570, AU035125, BB277226, BB274224, BB268445, AW024037, AA025609, BB274174, R96089, BB272238, BB269037, BB385718, BE007324, BB325992, AJ275277, AI414381, BB125476, BB430961, BE232162, BQ121419, BQ121418, BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559, B1759567, AL601021, AL598780, AU222540, BG567619, AU166296, BF889835, AU164011, AV656025, BF343454, AW262441, AW237952. Ces séquences, obtenues dans le cadre d'un programme de séquençage en masse de banques d'ADN complémentaires humains, sont incomplètes et n'ont jamais été ni reconnues ni caractérisées. En fait, le polynucléotide isolé par les Inventeurs présente de longs enchaînements de désoxyadénosines (poly-dA), ce qui explique les difficultés rencontrées par les Inventeurs pour obtenir l'ADNc complet par utilisation d'amorces oligo-désoxythymidines (oligo-dT) classiques, celles-ci s'hybridant de manière aléatoire avec les enchaînements poly-dA. C'est par l'utilisation répétée de la technique de l'amplification rapide des extrémités 3' d'ADNc (3' Rapid Amplification cDNA end ou 3'RACE) que les Inventeurs sont parvenus à isoler le polynucléotide correspondant à l'ARNm complet.
L'ARNm, correspondant au polynucléotide de séquence SEQ ID N 15, est spécifiquement exprimé dans le testicule sous la forme d'un polynucléotide d'une longueur d'environ 2,9 kilobases et dans le cerveau sous la forme d'un polynucléotide d'une longueur d'environ 9 kilobases pouvant correspondre soit à un prémessager soit à une isoforme de haut poids moléculaire.
De manière plus précise, lesdits exons sont répartis comme suit sur ladite séquence génomique (par rapport à la numérotation de la séquence SEQ ID N 16) : - exon 1 : il comprend 200 paires de bases correspondant aux positions 101 à 300 (SEQ ID N 17) ; - exon 2 : il comprend 139 paires de bases correspondant aux positions 1157 à 1295 (SEQ ID N 18) ; - exon 3 : il comprend 85 paires de bases correspondant aux positions 2050 à 2134 (SEQ ID N 19) ; - exon 4 : il comprend 321 paires de bases correspondant aux positions 3615 à 3935 (SEQ ID N 20) ;
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- exon 5 : il comprend 227 paires de bases correspondant aux positions 8259 à 8485 (SEQ ID N 21) ; - exon 6 : il comprend 94 paires de bases correspondant aux positions 14930 à 15023 (SEQ ID N 22) ; - exon 7 : il comprend 248 paires de bases correspondant aux positions 16715 à 16962 (SEQ ID N 23) ; - exon 8 : il comprend 71 paires de bases correspondant aux positions 19552 à 19622 (SEQ ID N 24) ; - exon 9 : il comprend 169 paires de bases correspondant aux positions 21187 à 21355 (SEQ ID N 25 ; - exon 10 : il comprend 90 paires de bases correspondant aux positions 21911 à 22000 (SEQ ID N 26) ; - exon 11 : il comprend 162 paires de bases correspondant aux positions 23731 à 23892 (SEQ ID N 27) ; - exon 12 : il comprend 146 paires de bases correspondant aux positions 24014 à 24159 (SEQ ID N 28) ; - exon 13 : il comprend 133 paires de bases correspondant aux positions 24343 à 24475 (SEQ ID N 29) ; - exon 14 : il comprend 485 paires de bases correspondant aux positions 29166 à 29650 (SEQ ID N 30) ;
L'Invention a aussi pour objet : - un fragment de l'un quelconque des polynucléotides selon l'Invention, d'au moins 15 à 1500 nucléotides consécutifs à l'exclusion des séquences répertoriées sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812 et des EST répertoriés sous les numéros d'accès BU198882, BM693711, AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, AI885274, A1671785, AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726, AI433877, AV751613, BQ372751, AI827535, AI866257, AA843565, R96130, BU684090, BF958121, BQ351941, AW194906, BG203580, BF078132, AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494, BB025236, BF214179, AI283076, BE694273, A1266380, BM670854, AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934, AW061311, BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152,
L'Invention a aussi pour objet : - un fragment de l'un quelconque des polynucléotides selon l'Invention, d'au moins 15 à 1500 nucléotides consécutifs à l'exclusion des séquences répertoriées sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812 et des EST répertoriés sous les numéros d'accès BU198882, BM693711, AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, AI885274, A1671785, AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726, AI433877, AV751613, BQ372751, AI827535, AI866257, AA843565, R96130, BU684090, BF958121, BQ351941, AW194906, BG203580, BF078132, AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494, BB025236, BF214179, AI283076, BE694273, A1266380, BM670854, AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934, AW061311, BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152,
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BB185248, BB557128, BB698742, BB186736, AV345769, BB274293, BB632007, BB617958, A1391312, W18534, BB186581, BB311289, BB312835, AW347411, AA972439, BB263570, AU035125, BB277226, BB274224, BB268445, AW024037, AA025609, BB274174, R96089, BB272238, BB269037, BB385718, BE007324, BB325992, AJ275277, A1414381, BB125476, BB430961, BE232162, BQ121419, BQ121418, BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559, B1759567, AL601021, AL598780, AU222540, BG567619, AU166296, BF889835, AU164011, AV656025, BF343454, AW262441, AW237952 dans la base de données GenBank, particulièrement un fragment sélectionné parmi les séquences correspondants aux exons c'est-à-dire sélectionné parmi les séquences SEQ ID N 16 à SEQ ID N 30 ; - un acide nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, avec l'un des polynucléotides selon l'Invention.
La définition de l'identité d'une séquence donnée précédemment pour les protéines, s'applique par analogie aux molécules d'acide nucléique.
Sont inclus dans un polynucléotide présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, selon l'Invention, les polynucléotides variants de la séquence SEQ ID N 15, c'est-à-dire l'ensemble des polynucléotides correspondants à des variants alléliques, c'est-à-dire à des variations individuelles de la séquence SEQ ID N 15. Ces séquences variantes naturelles correspondent à des polymorphismes présents chez les mammifères, en particulier chez l'être humain et, notamment à des polymorphismes pouvant conduire à la survenue d'une pathologie.
On entend également désigner par polynucléotide variant, tout ARN ou ADNc résultant d'une mutation et/ou d'une variation d'un site d'épissage de la séquence génomique dont l'ARNm a comme ADN complémentaire le polynucléotide de séquence SEQ ID N 15.
De préférence, la présente Invention concerne les polynucléotides ou les fragments variants de la séquence SEQ ID N 15, particulièrement ceux dans lesquelles les mutations conduisent à une modification de la séquence en acides aminés de la protéine codée par la séquence SEQ ID N 1.
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Les polynucléotides selon l'Invention peuvent être isolés à partir de cellules, particulièrement des cellules de testicule ou de cerveau ou à partir de banques d'ADN cellulaire. Ils peuvent également être obtenus par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) effectuée sur l'ADN total des cellules ou encore par RT-PCR effectuée sur les ARN totaux des cellules ou par synthèse chimique.
Les polynucléotides selon l'Invention, particulièrement les fragments de l'un quelconque des polynucléotides selon l'Invention, et les séquences répertoriées sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812 et les EST répertoriés sous les numéros d'accès BU198882, BM693711, AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, A1885274, AI671785, AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726, AI433877, AV751613, BQ372751, AI827535, A1866257, AA843565, R96130, BU684090, BF958121, BQ351941, AW194906, BG203580, BF078132, AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494, BB025236, BF214179, AI283076, BE694273, AI266380, BM670854, AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934, AW061311, BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152, BB185248, BB557128, BB698742, BB186736, AV345769, BB274293, BB632007, BB617958, AI391312, W18534, BB186581, BB311289, BB312835, AW347411, AA972439, BB263570, AU035125, BB277226, BB274224, BB268445, AW024037, AA025609, BB274174, R96089, BB272238, BB269037, BB385718, BE007324, BB325992, AJ275277, A1414381, BB125476, BB430961, BE232162, BQ121419, BQ121418, BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559, B1759567, AL601021, AL598780, AU222540, BG567619, AU166296, BF889835, AU164011, AV656025, BF343454, AW262441, AW237952 dans la base de données GenBank ou leurs fragments, peuvent notamment être utilisés comme sondes ou comme amorces pour détecter/amplifier des polynucléotides (ARN ou ADN génomique) correspondants au polynucléotide selon l'Invention, particulièrement dans d'autres organismes.
Les transcrits du gène asap sont par exemple de préférence mis en évidence à l'aide de sondes sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 15, SEQ ID N 17 à SEQ ID N 44 ou à l'aide d'un EST tel que défini ci-dessus ou amplifiés par RT-PCR à l'aide d'amorces sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 31 à 43.
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Le polynucléotide selon l'Invention peut permettre de diagnostiquer un état pathologique ou une maladie génétique impliquant un dysfonctionnement du gène asap et de cribler des substances capables de moduler (activer ou inhiber) la transcription dudit gène.
L'invention a aussi pour objet les polynucléotides susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide des amorces selon l'Invention.
Les sondes et amorces selon l'Invention peuvent être marquées directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal délectable et/ou quantifiable.
Le marquage des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 35S, le 3H ou l'125I. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels que la biotine, l'avidine, la streptavidine, la digoxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.
Les polynucléotides selon l'Invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en #uvre notamment la technique de PCR (amplification en chaîne par polymérase) (U. S. N 4,683,202). D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR II existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin, la technique TAS (Transcription-based Amplification System), la technique 3SR (Self-Sustained Sequence Replication), la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction), la technique de RCR (Repair Chain Reaction), la technique CPR (Cycling Probe Reaction), la technique d'amplification à la Q-bêta-réplicase. On peut encore citer la PCR-SSCP qui permet de détecter des mutations ponctuelles.
Ces techniques sont bien entendu parfaitement connues de l'homme du métier.
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Comme sondes ou comme amorces, les différents polynucléotides selon l'Invention peuvent permettent, soit de déterminer le profil de transcription du gène asap correspondant ou une éventuelle altération de ce profil dans un échantillon biologique, soit de mettre en évidence le gène correspondant dans d'autres espèces, des variants alléliques de ce gène ou une éventuelle altération fonctionnelle de ce gène (changement substantiel dans l'activité de la protéine codée par ledit gène) résultant d'une mutation (insertion, délétion ou substitution) d'un ou plusieurs nucléotides au niveau d'au moins un exon dudit gène. De telles mutations incluent en particulier les délétions, les insertions ou les substitutions non-conservatives au niveau de codons correspondant à des résidus d'acides aminés situés dans un domaine essentiel pour l'activité biologique de la protéine.
Ainsi l'Invention a pour objet une méthode de détermination du profil de transcription du gène correspondant au polynucléotide selon l'Invention ou d'une altération dudit profil, dans un échantillon biologique, comprenant une première étape d'obtention par tout moyen approprié des ARN totaux à partir de l'échantillon biologique, une deuxième étape de mise en contact desdits ARN avec une sonde selon l'Invention, préalablement marquée, dans des conditions classiques d'hybridation entre les ARN et la sonde et une troisième étape de révélation par tout moyen approprié des hybrides formés.
Par conditions classiques d'hybridation, on entend celles décrites dans Sambrook J, Russell DW. (2000) Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Selon un mode de mise en #uvre de ladite méthode, la deuxième étape peut être une étape de transcription inverse et d'amplification des transcrits, réalisée à l'aide d'une paire d'amorces telles que décrites précédemment et la troisième étape, une étape de révélation par tout moyen approprié des acides nucléiques amplifiés formés.
Ladite méthode de détermination du profil de transcription du gène peut en outre comporter une étape d'évaluation du taux de transcription du gène par comparaison avec un échantillon témoin préalablement choisi.
Ledit témoin peut être constitué par exemple par un échantillon biologique présentant une transcription normale ou altérée du gène correspondant au
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polynucléotide selon l'Invention auquel ladite méthode de détermination du profil de transcription du gène est appliquée dans les mêmes conditions.
L'invention a aussi pour objet une méthode de mise en évidence dans d'autres espèces du gène correspondant au polynucléotide selon l'Invention ou des variants alléliques dudit gène ou d'une altération fonctionnelle de ce gène, dans un échantillon biologique, comprenant une première étape d'obtention par tout moyen approprié de l'ADN à partir des cellules d'un échantillon biologique, une deuxième étape de mise en contact desdits ADN avec une sonde selon l'Invention, préalablement marquée, dans des conditions classiques d'hybridation entre les ADN et la sonde et une troisième étape de révélation par tout moyen approprié des hybrides formés.
Selon un mode de mise en #uvre de ladite méthode, la deuxième étape peut être une étape d'amplification réalisée à l'aide d'une paire d'amorces telles que décrites précédemment et la troisième étape, une étape de révélation par tout moyen approprié des acides nucléiques amplifiés formés. La méthode peut éventuellement comporter une quatrième étape d'isolement et de séquençage des acides nucléiques mis en évidence.
L'Invention a également pour objet une trousse de réactifs pour la mise en oeuvre des méthodes précédemment décrites comprenant : a) au moins une sonde ou une paire d'amorces selon l'Invention ; b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction classique d'hybridation entre ladite sonde ou lesdites amorces et l'acide nucléique de l'échantillon biologique ; c) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification ; d) les réactifs nécessaires à la détection et/ou au dosage de l'hybride formé entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon biologique ou des acides nucléiques amplifiés formés.
Une telle trousse peut également contenir des contrôles positifs ou négatifs afin d'assurer la qualité des résultats obtenus. Elle peut également contenir les réactifs nécessaires à la purification des acides nucléiques à partir de l'échantillon biologique.
Le polynucléotide de l'Invention ou un de ses fragment, ainsi que les EST
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décrits précédemment ou leur fragments peuvent servir à la mise au point de modèles cellulaires ou animaux n'exprimant pas la protéine ASAP, en invalidant le gène ASAP par la méthode de Si RNA (ou RNAi pour RNA inter- férence ; M. McManus and P. Sharp, Nature Reviews Genetics, 3,737-747, 2002; V. Brondani, F. Kolb, E. Billy, M/S, 6-7,665-667, 2002) à l'aide d'oligonucléotides dérivés de leurs séquences.
L'Invention a également pour objet un vecteur de clonage et/ou d'expression dans lequel est inséré le polynucléotide selon l'Invention.
Un tel vecteur peut contenir les éléments nécessaires à l'expression et éventuellement à la sécrétion de la protéine dans une cellule hôte.
Lesdits vecteurs comportent de préférence : un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Ils doivent pouvoir être maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent éventuellement comprendre des séquences codant pour des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite tels que par exemple un promoteur fort de nature ubiquitaire ou un promoteur sélectif d'un type de cellule et/ou de tissu particulier. Ces différentes séquences de contrôle sont choisies en fonction de l'hôte cellulaire utilisé.
Le polynucléotide selon l'Invention peut être inséré dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilise de préférence en fonction de la cellule hôte, des systèmes de type plasmidique ou viral. Les vecteurs viraux peuvent notamment être des adénovirus, des rétrovirus, des lentivirus, des poxvirus ou des virus herpétiques. L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes.
Lorsque l'on souhaite l'intégration de la séquence dans les chromosomes de la cellule hôte, on peut utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou viral ; de tels virus sont, par exemple, les rétrovirus ou les virus associés aux adénovirus (Adeno-associated virus ou AAV).
Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN ou l'ARN nu, les chromosomes artificiels de bactérie (BAC,
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bacterial artificiel chromosome), les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificiel chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préférée les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines.
De tels vecteurs sont préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les vecteurs recombinants en résultant peuvent être introduits dans l'hôte approprié par des méthodes standards, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, la transformation après perméabilisation chimique de la membrane, la fusion cellulaire.
L'Invention a aussi pour objet les cellules hôtes transformées, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, dans lesquelles au moins un polynucléotide ou un fragment selon l'Invention ou au moins un vecteur selon l'Invention a été introduit.
Parmi les cellules utilisables aux sens de la présente Invention, on peut citer les cellules bactériennes, les cellules de levure, les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères ou encore les cellules végétales. On peut citer également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant par exemple en oeuvre des baculovirus.
L'Invention a également pour objet les organismes transgéniques tels que les animaux ou les végétaux transgéniques, dont tout ou partie des cellules contient le polynucléotide selon l'Invention ou le vecteur selon l'Invention, sous une forme libre ou intégrée.
De préférence selon l'Invention, les organismes transgéniques sont ceux porteurs de cellules contenant un polynucléotide selon l'Invention, non fonctionnel ou porteur d'une mutation.
Selon l'Invention les animaux transgéniques sont de préférence des mammifères, excepté l'homme, plus préférentiellement les rongeurs, en particulier les souris ou les rats.
Les animaux transgéniques peuvent être obtenus par toute méthode classique connue de l'homme du métier, comme par exemple par
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recombinaison homologue sur cellules souches embryonnaires, transfert de ces cellules souches à des embryons, sélection des chimères affectées au niveau des lignées reproductrices, et croissance desdites chimères.
Les cellules hôtes transformées, les animaux ou les végétaux transgéniques selon l'Invention peuvent ainsi exprimer ou surexprimer le gène codant pour la protéine selon l'Invention ou leur gène homologue ou exprimer ledit gène dans lequel est introduite une mutation.
Les cellules de testicule ou de cerveau, les cellules hôtes transformées ou les organismes transgéniques selon l'Invention peuvent être utilisés pour la préparation de la protéine selon l'Invention.
La protéine selon l'Invention, particulièrement la protéine ASAP native, peut être purifiée selon les techniques connues de l'homme du métier. Ainsi, la protéine peut être purifiée à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, particulièrement de chromatographie d'affinité, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques, etc...
L'invention a également pour objet une méthode de préparation de la protéine ASAP, se caractérisant en ce que l'on cultive des cellules exprimant la protéine ou des cellules transformées selon la présente Invention, notamment les cellules de mammifères ou les cellules d'organismes transgéniques selon l'Invention, dans des conditions permettant l'expression de ladite protéine, et que l'on purifie ladite protéine.
Comme technique de purification, on peut citer par exemple la chromatographie d'affinité sur glutathione-sépharose (ou agarose) telle que décrite dans Sambrook J & Russell DW. (2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
L'invention a également pour objet une protéine, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par l'une quelconque des méthodes de préparation ci-dessus décrites.
L'Invention a encore pour objet une méthode de criblage d'une substance capable d'interagir in vitro, directement ou indirectement, avec le polynucléotide ou la protéine selon l'Invention caractérisée en ce que :
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dans une première étape on met en contact la substance à tester et le polynucléotide ou la protéine selon l'Invention et - dans une deuxième étape on détecte par tout moyen approprié le complexe formé entre ladite substance et le polynucléotide ou la protéine selon l'Invention.
La présente invention a également pour objet une méthode de criblage d'une substance capable de moduler (activer ou inhiber) l'activité de la protéine ASAP, caractérisée en ce que : - dans une première étape on met en contact des cellules d'un échantillon biologique exprimant la protéine ASAP avec une substance à tester, - dans une deuxième étape on mesure par tout moyen approprié l'effet de ladite substance sur l'activité de ladite protéine ASAP, et - dans une troisième étape on sélectionne des substances capables de moduler ladite activité.
Au sens de la présente invention, on entend par activité de la protéine ASAP, aussi bien l'expression de la protéine ASAP ou des transcrits (ARNm) correspondants, que l'activité biologique de ladite protéine ASAP, comme par exemple son effet sur l'organisation du fuseau mitotique ou l'induction de mitoses aberrantes et abortives.
La détection du complexe formé entre ladite substance et le polynucléotide ou la protéine ou la mesure de l'effet de ladite substance sur l'activité de ladite protéine ASAP peuvent être réalisées par les techniques classiques d'analyse d'ARNm ou de protéines qui sont connues en elles-mêmes ; à titre d'exemple non-limitatif, on peut citer les techniques suivantes : RT-PCR, Northern-blot, Western-blot, RIA, ELISA, immunoprécipitation, techniques d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique.
Avantageusement, ladite mesure est réalisée à l'aide des sondes, des amorces ou des anticorps, tels que définis ci-dessus.
De telles substances peuvent être des macromolécules biologiques comme par exemple un acide nucléique, un lipide, un sucre, une protéine, un peptide, un composé hybride protéine-lipide, protéine-sucre,
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peptide-lipide ou peptide-sucre, une protéine ou un peptide sur lequel on a ajouté des ramifications chimiques ou encore des molécules chimiques.
L'Invention a également pour objet le polynucléotide, la protéine, les anticorps, les vecteurs ou les cellules transformées selon l'Invention, utilisés comme médicaments.
Comme indiqué précédemment, la surexpression de la protéine selon l'Invention bloque la division cellulaire et par conséquent la prolifération cellulaire. Cela en fait un excellent candidat pour une utilisation comme agent anti-mitotique, utilisable par exemple dans le traitement des pathologies cancéreuses.
Ainsi, l'Invention a également pour objet l'utilisation du polynucléotide, d'un vecteur ou de la protéine selon l'Invention, dans la préparation d'un médicament anti-mitotique.
De même comme il est également indiqué précédemment, la surexpression de la protéine selon l'Invention entraîne des perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et induit des mitoses aberrantes et abortives (cellules plurinucléées, fuseaux mono- ou multipolaires).
Ainsi, l'Invention a aussi pour objet l'utilisation d'un polynucléotide anti-sens ou d'un fragment anti-sens, d'un anticorps, d'un vecteur contenant un oligonucléotide anti-sens selon l'Invention, capables d'inhiber l'expression du polynucléotide ou de la protéine selon l'Invention, dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées aux perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et/ou à une induction des mitoses aberrantes et abortives (cellules plurinucléées, fuseaux mono- ou multipolaires) liées à la surexpression de la protéine selon l'Invention.
Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre de l'Invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
La Figure 1 représente la localisation chromosomique et la structure du gène asap humain.
La Figure 1 représente la localisation chromosomique et la structure du gène asap humain.
La Figure 2 représente les signaux obtenus par Northern blots sur différents tissus humains après hybridation avec une sonde hASAP.
La Figure 3 représente les résultats obtenus :
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(A) par électrophorèse sur gel d'agarose des produits de RT-PCR obtenus avec des amorces correspondant au polynucléotide de souris, orthologue du polynucléotide SEQ ID N 15, à partir de différents tissus de souris.
(B) Après transfert du gel après électrophorèse sur une membrane et hybridation avec une sonde mASAP interne.
La Figure 4 représente la localisation cellulaire de la protéine hASAP couplée à la Green Fluorescent Protein (GFP) en 3' ou la Yellow Fluorescent Protein (YFP) en 5' ou à un tag MYC du côté N-terminal (colonne fusion).
Les noyaux sont colorés à l'iodure de propidium ou au Hoechst 33286. (4A : objectif 63x ; 4B, 4C, 4D : objectif IOOX).
La Figure 5 montre la co-localisation de la protéine ASAP humaine avec l'alpha-tubuline. Figure 5 A : localisation cellulaire de l'alpha- tubuline, Figure 5 B : de la protéine ASAP, Figure 5 C : tion des 2 images montrant la colocalisation des 2 protéines.
Les exemples suivants sont illustratifs de l'Invention et ne la limitent aucunement.
Exemple 1 : Construction de la séquence codante ASAP complète :
On amplifie la séquence complète de l'ADNc de la protéine ASAP à partir de 2 fragments chevauchants : - un fragment A amplifié par PCR à partir du clone AI885274 avec les amorces : constFIS-1 F (5'-ATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (SEQ IDN 31)et constFIS-2R (5'-AGGCCTCAAATGATGCTAATGC-3') (SEQ ID N 32) ; - un fragment B amplifié à partir du clone A1671785 avec les amorces : constFIS-2F (5'-ATCATTTGAGGCCTGGAAGGC-3') (SEQ ID N 33) et
On amplifie la séquence complète de l'ADNc de la protéine ASAP à partir de 2 fragments chevauchants : - un fragment A amplifié par PCR à partir du clone AI885274 avec les amorces : constFIS-1 F (5'-ATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (SEQ IDN 31)et constFIS-2R (5'-AGGCCTCAAATGATGCTAATGC-3') (SEQ ID N 32) ; - un fragment B amplifié à partir du clone A1671785 avec les amorces : constFIS-2F (5'-ATCATTTGAGGCCTGGAAGGC-3') (SEQ ID N 33) et
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et constFIS-1 R (5'-AAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3') (SEQ ID N 34).
Puis, pour obtenir un produit PCR unique correspondant à la séquence complète de l'ADNc de la protéine ASAP, utilisable pour les expériences de fonction, 0,5 l des produits de chacune des 2 réactions PCR (fragment A et B) sont hybridés ensemble à 25 C puis amplifiés avec les amorces constFIS-1 F et constFIS-2F. Ce produit PCR est sous-cloné dans le vecteur PCR4 suivant les recommandations du fabricant (Invitrogen) et vérifié par séquençage.
Les difficultés majeures rencontrées se sont situées dans la détermination in silico de la séquence codante complète ASAP et de sa reconstruction in vitro. En particulier, le choix des amorces et des différentes PCR de la région 3' ont été délicats en raison de la richesse de la séquence en polydA.
Exemple 2 : Analyse bio-informatique
La Figure 1 représente la localisation chromosomique et la structure du gène asap humain.
La Figure 1 représente la localisation chromosomique et la structure du gène asap humain.
L'organisation complète du gène asap et sa localisation chromosomique ont été obtenues en comparant la séquence de l'ADNc obtenu à l'exemple 1, à la séquence du génome humain en utilisant les programmes du Wellcome Trust Sanger Institute (httl2://ww.ensembl.oriz/genome/central/ et plus précisément le programme de recherche BLAST (htip://genome.cse.ucsc.edu/).
Le gène humain asap est constitué de 29750 nucléotides comprenant 14 exons dont 13 seulement sont traduits, le premier exon n'étant pas traduit. La taille des exons s'échelonne de 71 à 321 paires de bases. La séquence du gène est contenue dans le contig AC097467 (longueur 178204 paires de bases) entre les bases 115117 et 143828 (version v.7.29a3 NCBI/Ensembl du 12 juillet 2002, http ://www.ensembl.org), et est par ailleurs localisée sur le chromosome 4q32. 1 entre les marqueurs anonymes D4S1053 et D4S571 (région 161,25 Mégabases (Mb) à 161,28 Mb). La séquence du gène est physiquement contenue dans le clone BAC RP11-27G13.
Deux acides nucléiques correspondants à des fragments du polynucléotide isolé par les Inventeurs sont répertoriés dans la base de
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données GenBank sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812, ainsi que les EST répertoriés sous les numéros d'accès BU198882, BM693711, AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, A1885274, A1671785, AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726, A1433877, AV751613, BQ372751, AI827535, AI866257, AA843565, R96130, BU684090, BF958121, BQ351941, AW194906, BG203580, BF078132, AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494, BB025236, BF214179, A1283076, BE694273, A1266380, BM670854, AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934, AW061311, BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152, BB185248, BB557128, BB698742, BB186736, AV345769, BB274293, BB632007, BB617958, A1391312, W18534, BB186581, BB311289, BB312835, AW347411, AA972439, BB263570, AU035125, BB277226, BB274224, BB268445, AW024037, AA025609, BB274174, R96089, BB272238, BB269037, BB385718, BE007324, BB325992, AJ275277, A1414381, BB125476, BB430961, BE232162, BQ121419, BQ121418, BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559, B1759567, AL601021, AL598780, AU222540, BG567619, AU166296, BF889835, AU164011, AV656025, BF343454, AW262441, AW237952. Ces séquences, obtenues dans le cadre d'un programme de séquençage en masse de banques d'ADN complémentaires humains, sont incomplètes et n'ont jamais été ni reconnues ni caractérisées.
La séquence protéique a été comparée aux séquences des banques de données en utilisant les programmes PSI-BLAST et PHI-BLAST du NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sitemap/). Des motifs protéiques consensus ont été recherchés en utilisant les programmes DART du NCBI et SMART d'ExPASy-Tools (http://www.expasy.ch/tools/#similariw), dont les paramètres permettent de détecter des motifs de faible homologie. La protéine ASAP présente une identité de séquence de 23% sur le tiers C-terminal avec une protéine associée aux microtubules (MAP 1A pour Microtubule-AssociatedProtein 1A). Par ailleurs la recherche de motifs conservés (DART on SMART) révèle des domaines de type caldesmon (Gusev, N. B., Biochemistry, 10 1112- 1121,2000) et ERM (Ezrin/radixin/moesin) (Louvet-Vallet, S., Biol. Cell, 274 : 305-316,2000), qui sont des protéines également considérées comme des MAPs, avec des identités d'environ 20%. Elle présente également un domaine BRCT (Breast cancer carboxy-terminal domain ; Bork, P., et coll., FASEB J.,
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11,68-76 (1997)) entre les positions 65 et 303.
La protéine ASAP présente des domaines coiled-coil essentiellement regroupés dans sa partie C-terminale entre les acides aminés 297 et 327 d'une part et 477 et 628 d'autre part, indiquant soit que la protéine s'oligomérise, soit qu'elle interagit avec d'autres protéines.
L'analyse informatique de la protéine à l'aide des programmes accessibles dans le site internet (http://npsa-bil.ibcp.fr/cgibin/npsa~automat.pl?page=/NPSA/npsa~secons.html), révèle l'absence de feuillet p et une très grande richesse en hélices a, en particulier pour la région comprise entre les acides aminés 420-620, presque exclusivement formées d'hélices a.
Ces éléments permettent de penser que la protéine ASAP est une nouvelle MAP.
Exemple 3 : Expression tissulaire a) Analyse par Northern blot :
Préparation des sondes radioactives :
Les ADN à radiomarquer sont isolés sur gel à bas point de fusion (LMP) selon la technique décrite dans Rouquier, S. et al., (Genomics, 17,330-340, (1993)). Environ 100 ng d'ADN ainsi isolé, sont marqués par amorçage aléatoire (fragment de Klenow, Proméga) en présence de [a32P dCTP] (Amersham) selon la technique décrite dans Feinberg, A. P. & Vogelstein, B., (Anal. Biochem., 132,6-13, (1983)). Ces sondes sont purifiées sur des colonnes de Sephadex G-50 selon la technique décrite dans Sambrook J & Russell DW. (2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Les hybridations s'effectuent durant la nuit en présence de 2.106 Cpm/ml de sonde radioactive dénaturée. a.1) Hybridation :
Deux membranes Northern Blot de la société Clontech, (Human MTN Blot at Human MTN Blot II, Réf. 7760-1 et 7759-1) comportant des ARNm humains de différents tissus ont été hybridées avec l'ADNc hASAP complet marqué comme décrit ci-dessus. La membrane est hybridée en présence de formamide à 42 C, en suivant le protocole Clontech. Un contrôle d'hybridation de la membrane est réalisé avec une sonde actine. La membrane est rincée 2 fois à haute stringence en 0,1 X SSC/0,1% SDS à la
Préparation des sondes radioactives :
Les ADN à radiomarquer sont isolés sur gel à bas point de fusion (LMP) selon la technique décrite dans Rouquier, S. et al., (Genomics, 17,330-340, (1993)). Environ 100 ng d'ADN ainsi isolé, sont marqués par amorçage aléatoire (fragment de Klenow, Proméga) en présence de [a32P dCTP] (Amersham) selon la technique décrite dans Feinberg, A. P. & Vogelstein, B., (Anal. Biochem., 132,6-13, (1983)). Ces sondes sont purifiées sur des colonnes de Sephadex G-50 selon la technique décrite dans Sambrook J & Russell DW. (2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Les hybridations s'effectuent durant la nuit en présence de 2.106 Cpm/ml de sonde radioactive dénaturée. a.1) Hybridation :
Deux membranes Northern Blot de la société Clontech, (Human MTN Blot at Human MTN Blot II, Réf. 7760-1 et 7759-1) comportant des ARNm humains de différents tissus ont été hybridées avec l'ADNc hASAP complet marqué comme décrit ci-dessus. La membrane est hybridée en présence de formamide à 42 C, en suivant le protocole Clontech. Un contrôle d'hybridation de la membrane est réalisé avec une sonde actine. La membrane est rincée 2 fois à haute stringence en 0,1 X SSC/0,1% SDS à la
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température de 42 C, pendant 15 minutes. Les membranes sont alors analysées par autoradiographie ou au Phosphorlmager.
Les tissus testés sont : la rate, le thymus, la prostate, le testicule, l'ovaire, l'intestin grêle, le colon, les leucocytes sanguins, le c#ur, le cerveau, le placenta, le poumon, le foie, le muscle squelettique, le rein et le pancréas. a. 2) Résultats :
La Figure 2 représente ces résultats.
La Figure 2 représente ces résultats.
Deux signaux sont détectés : - un signal dans le testicule à environ 2,6 kb, ce qui correspond à la taille de l'ARNm ; - un signal dans le cerveau mais à un haut poids moléculaire (9 kb) qui correspond soit à un prémessager, soit à une isoforme de haut poids moléculaire b) Analyse par RT-PCR :
Cette analyse a été effectuée sur des ARNs totaux de différents tissus de souris, à savoir le cerveau, le c#ur, le colon, le foie, l'intestin grêle, le muscle squelettique, le pancréas, le poumon, le rein, la rate et le testicule. b.1) Obtention de l'ADNc orthologue de souris :
Les ARNs totaux de cellules de différents tissus de souris sont extraits avec le "mammalian total RNA kit" de la société Sigma. Les ARN sont rétro-transcrits avec le kit Superscript Il de la société Invitrogen selon les conditions prescrites par le fournisseur et en utilisant des amorces oligodT.
Cette analyse a été effectuée sur des ARNs totaux de différents tissus de souris, à savoir le cerveau, le c#ur, le colon, le foie, l'intestin grêle, le muscle squelettique, le pancréas, le poumon, le rein, la rate et le testicule. b.1) Obtention de l'ADNc orthologue de souris :
Les ARNs totaux de cellules de différents tissus de souris sont extraits avec le "mammalian total RNA kit" de la société Sigma. Les ARN sont rétro-transcrits avec le kit Superscript Il de la société Invitrogen selon les conditions prescrites par le fournisseur et en utilisant des amorces oligodT.
Les produits obtenus sont vérifiés par électrophorèse sur gel d'agarose à I%.
1 l de chaque échantillon ainsi obtenu est à son tour amplifié par PCR (25 l de milieu de réaction, 30 cycles (94 C pendant 15 secondes, 55 C pendant 30 secondes, 72 C pendant 30 secondes)) avec des amorces spécifiques du gènes asap de souris (mFIS-1 F, 5'-ACA ACG AAT AAC AGA GTG TCC-3' (SEQ ID N : 35) et mFIS-2R, 5'-ACT CCT GAT AAA CAG CTG CC-3' (SEQ ID N : 36).
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Les produits amplifiés obtenus sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1%, colorés au bromure d'éthydium et leur taille comparée à un marqueur de taille déposé sur le gel en parallèle.
Après électrophorèse, les produits amplifiés obtenus sont transférés par capillarité sur membrane de nylon chargée, dans le tampon NaCI 1,5M/NaOH 0,5M, selon la technique de Southern (transfert alcalin). La membrane est ensuite hybridée avec une sonde radiomarquée mASAP, (SEQ ID N 44), générée par amplification de la séquence contenue dans le clone de souris AW06131 sélectionné après comparaison de la séquence ASAP humaine dans les banques de données (GenBank) (http://expression.gnf.org/promoter/tissue/images/41739~s~at.png).
L'amplification a été réalisée par PCR (conditions telles que décrites ci-dessus dans lesquelles le volume de réaction est de 50 l et le dCTP froid est à la concentration de 10 M supplémenté avec 50 Ci d'a-P32- dCTPà 3000Ci/mmole), en utilisant les amorces mFIS-1 F (SEQ ID N : 35) et mFis-2R (SEQ ID N : 36). Les hybridations sont réalisées à 65 C (dans du tampon 6X SSC/0,5% SDS/5X Denhardt). La membrane est rincée à forte stringence (O,IX SSC/0.1% SDS), puis analysée par autoradiographie ou au Phosphorlmager. b. 2) Résultats :
La Figure 3 représente ces résultats.
La Figure 3 représente ces résultats.
On constate qu'on obtient un signal majoritaire dans le testicule et le cerveau nettement visible sur gel (Figure 3A).
Après transfert du gel et hybridation avec une sonde interne, on constate que l'on détecte un signal très faible dans les autres tissus (Figure 3B).
Par conséquent l'ARNm codant pour la protéine mASAP est majoritairement exprimé dans le testicule et le cerveau.
Exemple 4 : Localisation cellulaire a) Sous-clonage de l'ADNc hASAP dans un vecteur d'expression eucaryote :
L'ADNc hASAP obtenu à l'exemple 1 est inséré dans trois vecteurs d'expression :
L'ADNc hASAP obtenu à l'exemple 1 est inséré dans trois vecteurs d'expression :
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1- dans pEAK10-EGFP en phase avec la Green Fluorescent Protein (GFP) fusionnée en C-terminal (vecteur 1) (pEAK10, vecteur de Edge Biosystems (distribué par Q.BIOgene, Illkirch en France) dans lequel a été introduit la protéine EGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) suivant la référence Gaillard, I., et al., Eur. J. Neurosci., 15, 409-418, 2002) ;
2- dans pEYFP-C1 en phase avec la Yellow Fluorescent Protein (YFP) fusionnée du côté N-terminal (vecteur 2) (distribué par BD Biosciences Clontech)) ;
3- dans GLOMYC3-1 comportant un tag MYC du côté N-terminal (vecteur 3), vecteur dérivé du vecteur pcDNA3.1 (Invitrogen), dans lequel ont été insérées une région 5'non-traduite (5' UTR) et un tag MYC aux sites Hindlll-BamHI, et la région 3'UTR de la globine (fragment Spel-Xbal dans le site Xbal).
2- dans pEYFP-C1 en phase avec la Yellow Fluorescent Protein (YFP) fusionnée du côté N-terminal (vecteur 2) (distribué par BD Biosciences Clontech)) ;
3- dans GLOMYC3-1 comportant un tag MYC du côté N-terminal (vecteur 3), vecteur dérivé du vecteur pcDNA3.1 (Invitrogen), dans lequel ont été insérées une région 5'non-traduite (5' UTR) et un tag MYC aux sites Hindlll-BamHI, et la région 3'UTR de la globine (fragment Spel-Xbal dans le site Xbal).
L'ADNc hASAP est amplifié à partir de son vecteur de clonage initial (pCR4-TOPO) par PCR en utilisant la polymérase haute-fidélité pfu Turbo, à l'aide d'amorces amplifiant l'ADNc entre la méthionine de départ et le dernier acide aminé. Les produits amplifiés obtenus sont sous-clonés dans les 3 vecteurs.
- Clonage dans PEAK-GFP. Préparation de l'insert d'ADN par PCR [94 C 2 min ; (94 C 15 sec.; 58 C 30 sec.; 72 C 1 min 30 sec.) 30 cycles ; 72 C 3 min. ], à l'aide des amorces hFIS-Exp1 F (5'-GCCACCATGTCTGATGAAGTTTTTAGCAC-3) (SEQ ID N : 37) et hFIS-Exp1 R (5'-GAAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3') (SEQ ID N : 38).
Le vecteur est coupé par EcoRV et déphosphorylé : 10 ng de vecteur sont utilisés pour la ligation avec l'insert d'ADN. Le produit PCR est phosphorylé puis purifié sur high PURE PCR kit (Roche) : 100 ng d'insert sont utilisés pour la ligation [12h à 16 C dans 10 l final (ligase Biolabs), suivant les conditions standards (Sambrook and Russell)].
- Clonage dans Glomyc : Préparation de l'insert d'ADN par PCR [94 C 2 min ; (94 C 15 sec.; 60 C 30 sec.; 72 C 1 min 30 sec.) 30
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cycles ; 72 C 3 min.], à l'aide des amorces : Glomyc-FIS1 F : (5'-TAATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (SEQ ID N : 39) et Glomyc-FIS1 R : (5'-TCAAAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3') (SEQ ID N : 40).
Conditions de clonage identiques à celles décrites pour le clonage dans PEAK-GFP.
- Clonage dans YFP : de l'insert d'ADN : mêmes conditions que pour Glomyc, à l'aide des amorces : YFP-FIS1F (5'-AATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (SEQ ID N : 41) et Glomyc-FIS1R (SEQ ID N : 40) (cf ci-dessus).
Conditions de clonage identiques à celles décrites pour le clonage dans PEAK-GFP, le vecteur ayant préalablement été coupé par Sma1.
Les recombinants sont analysés par PCR en utilisant une amorce du vecteur et une amorce interne.
PEAK-GFP : annealing à 58 C, extension 45 sec. à 72 C. et conditions standards pour le reste. Amorces : constFIS-2F (SEQ ID N : 33) et GFP-1 R (5'-TCAGCTTGCCGTAGGTGGC-3') (SEQ ID N : 42).
YFP : annealing 55 C pendant 1 min. ; Amorces : YFP-2F (5'ATGGTCCTGCTGGAGTTCG-3') (SEQ ID N :43) et hFIS-Exp1 R (SEQ ID N : 38) .
Glomyc : annealing 44 C, extension 45 sec. à 72 C. Amorces : constFIS-2F (SEQ ID N : 33) et SP6. Les recombinants sont séquences par séquençage automatique à façon à partir des produits PCR (Genome Express, Meylan). b) Transfection, immunofluorescence et microscopie :
Les vecteurs obtenus sont transfectés selon la technique au phosphate de calcium ou de façon plus routinière en utilisant le procédé jetPEl (GDSP10101, Qbiogene) suivant les recommandations du fabricant,
Les vecteurs obtenus sont transfectés selon la technique au phosphate de calcium ou de façon plus routinière en utilisant le procédé jetPEl (GDSP10101, Qbiogene) suivant les recommandations du fabricant,
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dans les lignées cellulaires PEAK (ref. 37937, Edge Biosystems (distribué par Q.BIOgene, Illkirch en France)) ou HEK-293 (ATCC (American Tissue Culture Collection) référence CRL-1573).
Pour les vecteurs 1) et 2), les localisations se font directement par détection de la fluorescence de la GFP ou de l'YFP à 24h, 48h et 72h après fixation des cellules au paraformaldéhyde et coloration des noyaux soit au propioiodure de propidium, soit au Hoechst 33286.
Pour le vecteur 3) la détection du tag MYC est réalisée à l'aide d'un anticorps primaire anti-MYC distribué par TEBU (9 E10, cat.#SC- 40, Santa Cruz Biotechnology, CA) et d'un anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de souris marqué au fluorochrome Alexa-594 (Molecular Probes, ref.
A-11032, distribué en France par Interchim, Montluçon), après la fixation des cellules et leur perméabilisation au Triton X100 0,1%. Les lames sont analysées, et les images collectées sur un microscope Zeiss Axiophot. b) Résultats : Localisation cellulaire
La Figure 4 représente ces résultats (IP = Iodure de propidium).
La Figure 4 représente ces résultats (IP = Iodure de propidium).
L'observation au microscope à fluorescence des lames correspondant aux différentes transfections par les vecteurs 1), 2) et 3) montrent les mêmes types de profil : la localisation de la protéine hASAP est cytoplasmique et son profil fibreux rappelle celui des filaments de tubuline.
Par ailleurs, il semble que les cellules transfectées présentent des défauts de division car les noyaux sont toujours plus gros que dans les cellules non transfectées (Figure 4A et 4B). De plus, certaines des cellules transfectées semblent plurinucléées (Figure 4B). Ceci suggère une division des cellules transfectées anormale.
Enfin, la mitose des cellules transfectées semble anormale, tant au niveau de l'organisation des chromosomes, que du profil de localisation de la protéine hASAP au niveau du fuseau mitotique. Le profil de localisation de la protéine hASAP en étoile, est caractéristique de la nucléation des microtubules en aster autour du centrosome (Figures 4C et 4D).
La Figure 5 montre la co-localisation de la protéine ASAP
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humaine avec l'alpha-tubuline.
La Figure 5 A montre la localisation cellulaire de l'alphatubuline détectée par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps anti-tubuline (Alexa-594, Molecular Probe).
La Figure 5 B montre la localisation de la protéine ASAP marquée à la YFP (yellow fluorescent protein).
La Figure 5 C montre la superposition des 2 images montrant la colocalisation des 2 protéines.
Claims (38)
1) Protéine isolée, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : a) une protéine répondant à la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID N 1 ; b) une protéine comportant, sur sa totalité, au moins 80% d'identité ou au moins 90% de similarité, de préférence au moins 90 % d'identité ou moins 95% de similarité, avec la protéine de séquence SEQ ID N 1.
2) Peptide, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs d'une protéine selon la revendication 1.
3) Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les séquences représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID N 2 à SEQ ID N 14.
4) Protéine variante de la séquence SEQ ID N 1, caractérisée en ce qu'elle présente une mutation entraînant un dysfonctionnement de la protéine.
5) Protéine ou peptide selon l'une quelconque des revendications 1 ou 4, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une protéine ou d'un peptide d'origine humaine.
6) Polynucléotide isolé, comprenant ou répondant à une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : - les polynucléotides codant pour une protéine ou pour un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ; - un polynucléotide répondant à la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID N 15 ; - le fragment d'ADN génomique de 29800 nucléotides répondant à la séquence représentée dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID N 16, correspondant au gène asap humain ; - un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs de l'un quelconque des polynucléotides précédents, à l'exclusion des séquences répertoriées sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812 et des EST
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répertoriés sous numéros d'accès BU198882, BM693711, AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, AI885274, AI671785, AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726, A1433877, AV751613, BQ372751, AI827535, AI866257, AA843565, R96130, BU684090, BF958121, BQ351941, AW 194906, BG203580, BF078132, AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494, BB025236, BF214179, AI283076, BE694273, A1266380, BM670854, AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934, AW061311, BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152, BB185248, BB557128, BB698742, BB186736, AV345769, BB274293, BB632007, BB617958, A1391312, W18534, BB186581, BB311289, BB312835, AW347411, AA972439, BB263570, AU035125, BB277226, BB274224, BB268445, AW024037, AA025609, BB274174, R96089, BB272238, BB269037, BB385718, BE007324, BB325992, AJ275277, A1414381, BB125476, BB430961, BE232162, BQ121419, BQ121418, BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559, B1759567, AL601021, AL598780, AU222540, BG567619, AU166296, BF889835, AU164011, AV656025, BF343454, AW262441, AW237952 dans la base de données GenBank ; - un fragment de l'un quelconque des polynucléotides précédents, sélectionné parmi les séquences représentées dans la liste des séquences en annexe sous les numéros SEQ ID N 16 à SEQ ID N 30 ; - un polynucléotide présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, après alignement optimal avec l'un des polynucléotides ou l'un des fragments précédents ; - les polynucléotides complémentaires des précédents, sens ou anti-sens.
7) Polynucléotide ou fragment selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide variant de la séquence SEQ ID N 15.
8) Polynucléotide ou fragment selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polynucléotide porteur d'au moins une
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mutation conduisant à une modification de la séquence en acides aminés de la protéine correspondant à la séquence SEQ ID N 1.
9) Utilisation d'un polynucléotide ou d'un fragment selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou de l'une des séquences répertoriées sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812 et d'un des EST répertoriés sous les numéros d'accès BU198882, BM693711, AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, AI885274, AI671785, AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726, A1433877, AV751613, BQ372751, AI827535, AI866257, AA843565, R96130, BU684090, BF958121, BQ351941, AW194906, BG203580, BF078132, AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494, BB025236, BF214179, A1283076, BE694273, AI266380, BM670854, AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934, AW061311, BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152, BB185248, BB557128, BB698742, BB186736, AV345769, BB274293, BB632007, BB617958, A1391312, W18534, BB186581, BB311289, BB312835, AW347411, AA972439, BB263570, AU035125, BB277226, BB274224, BB268445, AW024037, AA025609, BB274174, R96089, BB272238, BB269037, BB385718, BE007324, BB325992, AJ275277, AI414381, BB125476, BB430961, BE232162, BQ121419, BQ121418, BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559, BI759567, AL601021, AL598780, AU222540, BG567619, AU166296, BF889835, AU164011, AV656025, BF343454, AW262441, AW237952 dans la base de données GenBank ou de leurs fragments, comme sonde pour détecter, identifier ou doser des polynucléotides correspondants au polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, particulièrement dans d'autres organismes.
10) Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que la sonde est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 15 ou SEQ ID N 17 à SEQ ID N 44.
11) Amorce pour l'amplification des polynucléotides (ARN ou ADN génomique) correspondants au polynucléotide selon l'une quelconque
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des revendications 6 à 8, particulièrement dans d'autres organismes caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 31 à 43.
12) Polynucléotide susceptible d'être obtenu par amplification à l'aide des amorces selon la revendication 11.
13) Méthode de détermination du profil de transcription du gène correspondant au polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou 12, ou d'une altération dudit profil, dans un échantillon biologique, comprenant une première étape d'obtention par tout moyen approprié des ARN totaux à partir de l'échantillon biologique, une deuxième étape de mise en contact desdits ARN avec une sonde telle que définie aux revendications 9 ou 10, préalablement marquée, dans des conditions classiques d'hybridation entre les ARN et la sonde et une troisième étape de révélation par tout moyen approprié des hybrides formés.
14) Méthode selon la revendication 13, dans laquelle la deuxième étape est une étape de transcription inverse et/ou d'amplification des transcrits, réalisée à l'aide d'une paire d'amorces selon la revendication 11 et la troisième étape est une étape de révélation par tout moyen approprié des acides nucléiques amplifiés.
15) Méthode selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre une étape d'évaluation du taux de transcription du gène par comparaison à un témoin préalablement choisi.
16) Méthode de mise en évidence dans d'autres espèces du gène correspondant au polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou 12, ou de mise en évidence des variants alléliques dudit gène ou de mise en évidence d'une altération fonctionnelle de ce gène, dans un échantillon biologique, comprenant une première étape d'obtention par tout moyen approprié de l'ADN à partir de l'échantillon biologique, une deuxième étape de mise en contact desdits ADN avec une sonde telle que définie aux revendications 9 ou 10, préalablement marquée, dans des
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conditions classiques d'hybridation entre les ADN et la sonde et une troisième étape de révélation par tout moyen approprié des hybrides formés.
17) Méthode selon la revendication 16, dans laquelle la deuxième étape est une étape d'amplification réalisée à l'aide d'une paire d'amorces selon la revendication 11 et la troisième étape une étape de révélation par tout moyen approprié des acides nucléiques amplifiés formés.
18) Méthode selon l'une quelconque des revendications 16 ou 17, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre une étape d'isolement et de séquençage des acides nucléiques mis en évidence.
19) Trousse de réactifs pour la mise en oeuvre des méthodes selon l'une quelconque des revendications 13 à 18 comprenant : - au moins une sonde telle que définie aux revendications 9 ou 10 et/ou une paire d'amorces selon la revendication 11 ; - les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction classique d'hybridation entre ladite sonde et/ou lesdites amorces et l'acide nucléique de l'échantillon biologique ; - les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification ; - les réactifs nécessaires à la détection et/ou le dosage de l'hybride formé entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon biologique ou des acides nucléiques amplifiés formés.
20) Vecteur de clonage et/ou d'expression dans lequel est inséré un polynucléotide ou un fragment selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou 12.
21) Cellules hôtes transformées, dans lesquelles au moins un polynucléotide ou un fragment selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou 12 ou au moins un vecteur selon la revendication 20 a été introduit.
22) Organismes transgéniques non-humains, dont tout ou partie des cellules contient au moins un polynucléotide ou un fragment selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou 12 ou au moins un vecteur selon la revendication 20, sous une forme libre ou intégrée.
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23) Organismes transgéniques non-humains selon la revendication 22, caractérisés en ce qu'ils sont porteurs de cellules contenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou 12 non fonctionnel ou porteurs d'une mutation.
24) Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication 21 ou d'un organisme transgénique non-humain selon l'une quelconque des revendications 22 ou 23, pour la production d'une protéine ou d'un peptide décrits dans l'une quelconque des revendications 1 à 5.
25) Méthode de préparation d'une protéine ou d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'on cultive des cellules exprimant la protéine ou des cellules transformées selon la revendication 21 ou un organisme transgénique non-humain selon l'une quelconque des revendications 22 ou 23, dans des conditions permettant l'expression de ladite protéine, et que l'on purifie ladite protéine.
26) Protéine, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par la méthode de préparation selon la revendication 25.
27) Anticorps mono- ou polyclonal caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître spécifiquement une protéine ou un peptide selon l'une quelconque des revendications 1à 5 ou 26.
28) Anticorps selon la revendication 27, caractérisé en ce qu'il reconnaît, parmi les MAPs, uniquement et spécifiquement la protéine ASAP de séquence SEQ ID N 1.
29) Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 27 ou 28 pour la détection et/ou la purification d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 26.
30) Méthode de détection d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 26, dans les cellules d'un échantillon biologique, comprenant - une première étape de traitement convenable des cellules par tout moyen approprié permettant de rendre accessible le milieu intracellulaire,
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une seconde étape de mise en contact dudit milieu intracellulaire ainsi obtenu avec un anticorps selon l'une quelconque des revendications 27 ou 28 et - une troisième étape de mise en évidence par tout moyen approprié du complexe protéine ASAP-anticorps formé.
31) Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 27 ou 28 pour la détection et/ou la sélection de cellules présentant des perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et/ou une induction des mitoses aberrantes et abortives (cellules plurinucléées, fuseaux mono- ou multipolaires) liées à la surexpression de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 26.
32) Méthode d'évaluation in vitro de la capacité de prolifération ou d'agressivité de cellules cancéreuses comprenant - une première étape de traitement convenable des cellules par tout moyen approprié permettant de rendre accessible le milieu intracellulaire, - une seconde étape de mise en contact dudit milieu intracellulaire ainsi obtenu avec un anticorps selon l'une quelconque des revendications 27 ou 28, - une troisième étape de mise en évidence et de mesure par tout moyen approprié du complexe protéine ASAP-anticorps formé et - une quatrième étape d'évaluation du taux de transcription du gène par comparaison du taux de complexes protéine ASAP-anticorps formés à celui d'un échantillon biologique témoin préalablement choisi.
33) Trousse permettant de mettre en oeuvre la méthode selon l'une quelconque des revendications 30 ou 32 comprenant : - au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'une quelconque des revendications 27 ou 28 ; - les réactifs permettant la détection du complexe protéine ASAP-anticorps produit lors de la réaction immunologique.
34) Méthode de criblage d'une substance capable d'interagir in vitro, directement ou indirectement, avec le polynucléotide selon l'une
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quelconque des revendications 6 à 8 ou 12 ou la protéine ou un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 26, caractérisée en ce que : - dans une première étape on met en contact la substance à tester et le polynucléotide ou la protéine et - dans une deuxième étape on détecte par tout moyen approprié le complexe formé entre ladite substance et le polynucléotide ou la protéine.
35) Méthode de criblage d'une substance capable de moduler (activer ou inhiber) l'activité de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 26, caractérisée en ce que : - dans une première étape on met en contact des cellules d'un échantillon biologique exprimant la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 26, avec une substance à tester, - dans une deuxième étape on mesure par tout moyen approprié de l'effet de ladite substance sur l'activité de ladite protéine, et - dans une troisième étape on sélectionne des substances capables de moduler ladite activité.
36) Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 26 ou polynucléotide ou fragment selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou 12 ou anticorps selon l'une quelconque des revendications 27 ou 28 ou vecteur selon la revendication 20 ou cellule transformée selon la revendication 21, utilisé comme médicaments.
37) Utilisation d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 26 ou d'un polynucléotide ou d'un fragment selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou 12 ou d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 27 ou 28 ou d'un vecteur selon la revendication 20 ou d'une cellule transformée selon la revendication 21, dans la préparation d'un médicament anti-mitotique.
38) Utilisation d'un polynucléotide ou d'un fragment anti-sens selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou 12 ou d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 27 ou 28 ou d'un vecteur contenant un oligonucléotide anti-sens selon la revendication 20 et capable
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d'inhiber l'expression du polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1,4 ou 5, dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées aux perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et/ou à une induction des mitoses aberrantes et abortives (cellules plurinucléées, fuseaux mono- ou multipolaires) liées à la surexpression de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 26.
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20120831 |