JP4660200B2 - 中心体結合タンパク質およびその適用 - Google Patents
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
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-
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- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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Description
本発明は、この分野にある。
a) 添付の配列表において配列番号1の番号で表される配列に対応するタンパク質;
b) 配列番号1のタンパク質と、その全配列にわたって、少なくとも80%の同一性(identity)または少なくとも90%の類似性(similarity)、好ましくは少なくとも90%の同一性または少なくとも95%の類似性を示すタンパク質
からなる群より選択されることを特徴とする、ASAPとよばれる単離タンパク質である。
- 60〜100 kDaの間、好ましくは65〜80 kDaの間の分子量を有する;
- 中心体に結合する;
- 免疫蛍光により、有糸分裂紡錘体の微小管のα-チューブリンと共局在化する;
- MAP1Aタンパク質(微小管結合タンパク質(Microtubule Associated Protein) 1A)と弱い同一性を示す(23%);
- そのC-末端部分に実質的に含まれる高次コイルドメインを、まずアミノ酸297〜327の間、次にアミノ酸477〜628の間に有し、このことはタンパク質がオリゴマー化するか、または他のタンパク質と相互作用することを示す;
- そのC-末端部分、特にアミノ酸420〜620の間の領域においてα-ヘリックスに非常に富み、ここはほとんどα-ヘリックスのみでつくられている。
これらの要素は、ASAPタンパク質を新規なMAPであるとみなすことを可能にする。
「機能的」なる用語は、通常の生物活性を有する、すなわち有糸分裂紡錘体機構および細胞分裂に関係し得るタンパク質を意味することを意図する。このタンパク質は、その活性にいずれの本質的な変化も誘導せず、いずれの表現型の変更も生み出さないサイレント突然変異を含み得る。
好ましくは、異型タンパク質は、該タンパク質、他の遺伝子もしくはタンパク質、または一般に細胞の機能不全(活性化または阻害)をもたらす突然変異を有する。
参照配列としての配列番号1の配列に対する配列の同一性は、2つの配列を、これらの間で最大限の一致が得られるように整列させたときに、同一であるアミノ酸残基のパーセンテージにより評価する。
パーセンテージ同一性は、当業者により、例えばBLASTシリーズ(Altschulら、NAR、1997、25、3389〜3402)のもののような配列比較のためのコンピュータプログラムを用いて算出できる。
BLASTプログラムは、参照配列として示される配列番号1全体からなる比較のウィンドウ(window of comparison)にわたって実行される。
参照配列と少なくともX%の類似性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、本発明において、参照配列の100個のアミノ酸当たり100-X個までの非保存的変化(non-conservative alterations)を含み得る配列のタンパク質として規定される。本発明の目的のために、「非保存的変化」の用語は、参照配列における連続もしくは分散したアミノ酸の非保存的置換または挿入を含む。
化学合成により、タンパク質は、多くの既知のペプチド合成経路の一つ、例えば固相を用いる技術または部分固相(partial solid phase)を用いる技術によるか、断片の縮合によるか、あるいは通常の溶液での合成により得ることができる。この場合、タンパク質の配列は、特に水性溶媒でのその溶解性を向上するために修飾することができる。このような修飾は、当業者に公知であり、例えば疎水性ドメインの欠失または疎水性アミノ酸の親水性アミノ酸での置換である。
より明確には、該ペプチドは、次の配列に対応する(与えられた位置は、配列番号1の配列の番号付けに関する):
- ペプチド1:位置1〜25に相当する25アミノ酸を含む(配列番号2);
- ペプチド2:位置26〜53に相当する28アミノ酸を含む(配列番号3);
- ペプチド3:位置54〜160に相当する107アミノ酸を含む(配列番号4);
- ペプチド4:位置161〜236に相当する76アミノ酸を含む(配列番号5);
- ペプチド5:位置237〜267に相当する31アミノ酸を含む(配列番号6);
- ペプチド6:位置268〜350に相当する83アミノ酸を含む(配列番号7);
- ペプチド7:位置351〜374に相当する24アミノ酸を含む(配列番号8);
- ペプチド9:位置429〜460に相当する32アミノ酸を含む(配列番号10);
- ペプチド10:位置461〜514に相当する54アミノ酸を含む(配列番号11);
- ペプチド11:位置515〜563に相当する49アミノ酸を含む(配列番号12);
- ペプチド12:位置564〜606に相当する43アミノ酸を含む(配列番号13);
- ペプチド13:位置607〜647に相当する41アミノ酸を含む(配列番号14)。
- 上記のペプチド1〜13に相当する、すなわち配列番号2〜配列番号14の配列から選択される配列、および
- BRCT ドメインを含むN-末端部分(Ndel1:残基304〜647 (配列番号48);Ndel2:残基411〜647 (配列番号49);Ndel3:残基478〜647 (配列番号50))、またはMAPドメインを含むC-末端部分(Cdel1:残基1〜477 (配列番号51);Cdel2:残基1〜418 (配列番号52);Cdel3:残基1〜303 (配列番号53);残基1〜421 (配列番号47))の欠失があるhASAPタンパク質の突然変異体に対応する配列番号47〜53の配列
から選択されるペプチドでもある。
本発明によると、好ましくは、該抗体は、MAPのうちで、配列番号1または配列番号46の配列のASAPタンパク質を単一かつ特異的に認識する。
該抗体は、ヒト血清から、または本発明によるタンパク質もしくはペプチドで免疫された動物の血清から直接得ることができる。
特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、当業者に公知の技術により得ることができる。
一般に、本発明による抗体は、本発明による通常または変異タンパク質の存在を検出するために有利に用いることができる。
特に、モノクローナル抗体は、生体試料中のこれらのタンパク質を検出するために用い得る。よってこれらは本発明によるタンパク質、特に配列番号1の配列のタンパク質の、組織切片上での発現の免疫化学的または免疫組織学的分析の手段を構成する。このような分析について一般には、用いられる抗体は、検出可能とするために、例えば免疫蛍光化合物により、金標識により、または酵素イムノコンジュゲートの形において標識される。
この方法は、本発明によるタンパク質の細胞内、特に癌細胞内での発現レベルの測定も可能にする。ASAPタンパク質の発現(過剰発現または過少発現)の研究は、癌細胞の増殖能または攻撃性(予後が乏しい癌に対して進行する能力)を評価するための要素である。
a) 少なくとも1つの本発明によるモノクローナルまたはポリクローナル抗体;
b) 免疫反応の間に産生されたASAPタンパク質-抗体複合体を検出するための試薬
を含むキットでもある。
「細胞内の媒体を接触可能にするための手段」の表現は、当業者に公知のいずれの手段、例えば酵素学的もしくは化学的プロセス、または超音波処理、膜透過、熱ショックによる細胞溶解を意味することを意図する。
- 上記で規定されるタンパク質またはペプチドをエンコードする配列、および
- 該配列に相補的な、センスまたはアンチセンスであり得る配列
からなる群より選択されることを特徴とする単離ポリヌクレオチド(cDNAまたはゲノムDNA断片)でもある。
本発明は、いずれの哺乳動物に由来するasap遺伝子の対立遺伝子、およびASAP タンパク質、特に上記で規定されるような機能的ASAPタンパク質をエンコードするasap遺伝子の天然または人工の突然変異体のポリヌクレオチドを包含する。
- ヒトASAPタンパク質(hASAP)をエンコードするmRNAの2575ヌクレオチドの相補的DNAに対応する配列番号15の配列;
- マウスASAPタンパク質(mASAP)をエンコードするmRNAの2767ヌクレオチドの相補的DNAに対応する配列番号45の配列;
- 14個のエキソン(そのうちの13個だけが翻訳され、最初のエキソンは翻訳されない)を含むヒトasap遺伝子に対応する、添付の配列表において配列番号16の番号の下で表される配列に対応する29750ヌクレオチドのゲノムDNA断片であって、contig AC097467 (長さ178204塩基対)の115117〜143828塩基の間 (version v.7.29a3 NCBI/Ensembl of July 12, 2002,http://www.ensembl.org)に含まれ、染色体4q32.1上に、無名のマーカー(anonymous markers) D4S1053およびD4S571の間 (161.25メガベース(Mb)〜161.28 Mbの領域)に位置する断片
からなる群より選択される配列に対応する。
- エキソン1:位置101〜300に対応する200塩基対を含む(配列番号17);
- エキソン2:位置1157〜1295に対応する139塩基対を含む(配列番号18);
- エキソン3:位置2050〜2134に対応する85塩基対を含む(配列番号19);
- エキソン4:位置3615〜3935に対応する321塩基対を含む(配列番号20);
- エキソン5:位置8259〜8485に対応する227塩基対を含む(配列番号21);
- エキソン6:位置14930〜15023に対応する94塩基対を含む(配列番号22);
- エキソン7:位置16715〜16962に対応する248塩基対を含む(配列番号23);
- エキソン9:位置21187〜21355に対応する169塩基対を含む(配列番号25);
- エキソン10:位置21911〜22000に対応する90塩基対を含む(配列番号26);
- エキソン11:位置23731〜23892に対応する162塩基対を含む(配列番号27);
- エキソン12:位置24014〜24159に対応する146塩基対を含む(配列番号28);
- エキソン13:位置24343〜24475に対応する133塩基対を含む(配列番号29);
- エキソン14:位置29166〜29650に対応する485塩基対を含む(配列番号30)。
- GenBankデータベースにおいて、受理番号AK024730およびAK024812の下で記載される配列、ならびに受理番号BU198882、BM693711、
でもある。
タンパク質についての上記の配列の同一性の定義を、核酸分子に対して類推により適用する。
「異型ポリヌクレオチド」の用語は、突然変異および/またはその相補DNAが、配列番号15または配列番号45の配列のポリヌクレオチドであるmRNAを有するゲノム配列のスプライス部位の変異に起因するいずれのRNAまたはcDNAを意味することを意図する。
本発明によるプローブおよびプライマーは、検出可能および/または定量可能なシグナルを得るために、放射活性または非放射活性化合物を用いて、当業者に公知の方法により直接または間接的に標識することができる。
これらの技術は、もちろん当業者に完全に知られている。
「ハイブリダイゼーションのための通常の条件」の表現は、J. Sambrook、D.W. Russell (2000) Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載のものを意味することを意図する。
遺伝子の転写プロフィールを測定する上記の方法は、遺伝子の転写レベルを、予め選択された対照試料との比較により評価することにある工程も含み得る。該対照は、例えば本発明によるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の正常または変更された転写を示す生体試料からなることができ、これに対して遺伝子の転写プロフィールを測定する該方法を同じ条件下で適用する。
a) 少なくとも1つの本発明によるプローブまたは1つのプライマー対;
b) 該プローブまたはプライマーと生体試料の核酸との間の通常のハイブリダイゼーションを行うのに必要な試薬;
c) 増幅反応を行うのに必要な試薬;
d) プローブと生体試料の核酸との間に形成されたハイブリッド、または形成された増幅核酸を検出および/またはアッセイするのに必要な試薬
を含む、上記の方法を行うための試薬キットでもある。
このようなキットは、得られる結果の質を確実にするために、陽性または陰性の対照も含み得る。生体試料から核酸を精製するのに必要な試薬も含むことができる。
このようなベクターは、発現、および任意に宿主細胞におけるタンパク質の分泌に必要な要素を含み得る。
該ベクターは、好ましくはプロモーター、転写開始および終結シグナル、ならびに転写調節に適切な領域を含む。これらは細胞内で安定に保持されることが可能であるべきであり、翻訳されたタンパク質の分泌を明示する特異的シグナルをエンコードする配列、例えば強力な普遍的プロモーター、または特定の細胞および/または組織の種類に選択的なプロモーターを任意に含み得る。これらの種々の調節配列は、用いられる細胞宿主により選択される。
自律複製系のうち、宿主細胞により、プラスミドまたはウイルスタイプの系を用いるのが好ましい。ウイルスベクターは、特にアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスまたはヘルペスウイルスであり得る。当業者は、これらの系のそれぞれに用い得る技法を知っている。
配列を宿主細胞の染色体に組み込むことが望まれる場合、例えばプラスミドまたはウイルスタイプの系を用いることができる。このようなウイルスは、例えばレトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)である。
このようなベクターは、当業者により通常用いられる方法により調製され、それから得られる組換えベクターは、適切な宿主に、標準的な方法、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショック、化学的膜透過化後の形質転換、細胞融合により導入することができる。
本発明の目的のために用い得る細胞のうち、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、特に哺乳動物細胞、または植物細胞を挙げることができる。例えばバキュロウイルスを用いる方法を用い得る昆虫細胞も挙げることができる。
本発明によると、好ましくは、ヒト以外のトランスジェニック生物は、機能的でないか、または突然変異を有する本発明によるポリヌクレオチドを含む細胞を有するものである。
本発明によると、トランスジェニック動物は、好ましくはヒト以外の哺乳動物、より好ましくはげっ歯動物、特にマウスまたはラットである。
よって本発明による形質転換された宿主細胞、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物は、本発明によるタンパク質をエンコードする遺伝子、またはそれらの相同遺伝子を発現するかもしくは過剰発現するか、あるいは突然変異が導入された該遺伝子を発現することができる。
本発明によるタンパク質、特に天然のASAPタンパク質は、当業者に公知の技法により精製することができる。つまり、タンパク質は、細胞溶解産物および抽出物、または培養上清から、分画、クロマトグラフィー法、特に親和性クロマトグラフィー法、特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いる免疫親和性技術などのような個別にまたは組み合わせで用いる方法により精製することができる。
精製技術としては、例えばJ Sambrook & DW Russell (2000、Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載のようなグルタチオン-セファロース(またはアガロース)上での親和性クロマトグラフィーを挙げることができる。
- 第一工程において、試験される物質と、本発明によるポリヌクレオチドまたはタンパク質とを接触させ、そして
- 第二工程において、該物質と本発明によるポリヌクレオチドまたはタンパク質との間に形成された複合体を、いずれの適切な方法により検出する
ことを特徴とする、本発明によるポリヌクレオチドまたはタンパク質と、直接または間接的に、インビトロで相互作用可能な物質のスクリーニング方法でもある。
- 第一工程において、ASAPタンパク質を発現する生体試料の細胞を、試験される物質と接触させ、
- 第二工程において、該ASAPタンパク質の活性に対する該物質の影響を、いずれの適切な手段により測定し、そして
- 第三工程において、該活性を調節可能な物質を選択する
ことを特徴とする。
本発明の目的のために、「ASAPタンパク質の活性」の用語は、ASAPタンパク質または対応する転写産物(mRNA) の発現と、該ASAPタンパク質の生物活性、例えば有糸分裂紡錘体の機構、または異常もしくは頓挫性有糸分裂の誘導に対するその影響との両方を意味することを意図する。
該測定は、上記で規定されるプローブ、プライマーまたは抗体を用いて行われるのが有利である。
このような物質は、例えば核酸、脂質、糖、タンパク質、ペプチド、タンパク質-脂質、タンパク質-糖、ペプチド-脂質もしくはペプチド-糖ハイブリッド化合物、化学的ブランチが付加されたタンパク質もしくはペプチドのような生体高分子、または化学分子であり得る。
上記のように、本発明によるタンパク質の過剰発現は、細胞分裂、結果として細胞増殖をブロックする。このことにより、これは、例えば癌に関連する病理の治療において用い得る有糸分裂抑制剤としての使用のための優れた候補となる。
同様に、上記のように、本発明によるタンパク質の過剰発現は、有糸分裂紡錘体の機構を妨げ、かつ異常および頓挫性有糸分裂を誘導する(多核細胞、単極または多極紡錘体)。
- 図1は、ヒトasap遺伝子の染色体局在化および構造を表す。
- 図2は、種々のヒト組織について、hASAPプローブとのハイブリダイゼーション後のノザンブロッティングにより得られるシグナルを表す。
- 図3は:
(A) 配列番号15のポリヌクレオチドのオルトログ(ortholog)であるマウスポリヌクレオチドに対応するプライマーで、種々のマウス組織を用いて得られたRT-PCR産物のアガロースゲル電気泳動により;
(B) 電気泳動後、メンブレン上へのゲルのトランスファーおよび内部mASAPプローブとのハイブリダイゼーションの後に
得られた結果を表す。
核は、ヨウ化プロピジウムまたはヘキスト(Hoechst) 33286 (4A:63×対物レンズ;4B、4Cおよび4D:100×対物レンズ)で染色される。
- 図5は、α-チューブリンとのヒトASAPタンパク質の共局在化を示す。図5A:α-チューブリンの細胞性局在化、図5B:ASAPタンパク質の局在化、図5C:2種のタンパク質の共局在化を示す2つの画像の重ね合わせ。
実施例1:全長ASAPコーディング配列の構築
ASAPタンパク質のcDNAの全長配列を、2つのオーバーラップ断片:
- PCRにより、クローンAI885274から、プライマー
constFIS-1F (5'-ATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (配列番号31)および
constFIS-2R (5'-AGGCCTCAAATGATGCTAATGC-3' (配列番号32);
を用いて増幅される断片A:
- クローンAI671785から、プライマー:
constFIS-2F (5'-ATCATTTGAGGCCTGGAAGGC-3') (配列番号33)および
constFIS-1R (5'-AAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3') (配列番号34)
を用いて増幅される断片B
から増幅する。
インシリコ(in silico)での全長ASAPコーディング配列の決定、およびインビトロでのその再構築が、遭遇した主要な困難であった。特に、プライマーおよび3'領域の種々のPCRの選択は、配列がポリAに富むので注意を要した。
図1は、ヒトasap遺伝子の染色体局在化および構造を示す。
asap遺伝子の完全な構成およびその染色体局在化を、実施例1で得られたcDNAの配列を、ヒトゲノムの配列とWellcome Trust Sanger Instituteプログラム(http://www.ensembl.oriz/genome/central/)およびより特異的にはBLASTサーチプログラム(http://genome.cse.ucsc.edu/)を用いて比較することにより得た。
インターネットサイト(http://npsa-bil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa#automat.pl?page=/NPSA/npsa#secons.html)上でアクセス可能なプログラムを用いるタンパク質のコンピュータ分析により、これがβ-シートを欠損し、特にアミノ酸420〜620の間の領域でα-ヘリックスに富む(ここはほぼα-ヘリックスのみでつくられる)ことが明らかになる。
これらの要素は、ASAPタンパク質が新規なMAPであるとみなすことを可能にする。
a) ノザンブロッティングによる分析
放射活性プローブの調製:
放射性標識されることとなるDNAを、低融点(LMP)ゲル上で、S. Rouquierら(Genomics、17、330〜340、(1993))により記載される方法に従って単離する。このようにして単離された約100 ngのDNAを、ランダムプライミングにより(Klenowフラグメント、Promega)、[α32P dCTP] (Amersham)の存在下に、A.P. FeinbergおよびB. Vogelstein (Anal. Biochem.、132、6〜13、(1983))により記載された技術に従って標識する。これらのプローブを、Sephadex G-50カラム上でJ SambrookおよびDW Russell (2000、Cold Spring Harbor Laboratory Press)により記載された技術に従って精製する。ハイブリダイゼーションを、変性放射活性プローブ2・106 Cpm/mlの存在下に一晩行う。
種々の組織からのヒトmRNAを含有するClontech社からの2枚のノザンブロッティングメンブレン(Human MTN BlotおよびHuman MTN Blot II、Ref. 7760-1および7759-1)を、上記のようにして標識した全長hASAP cDNAとハイブリダイズさせた。メンブレンを、ホルムアミドの存在下に42℃でClontech社のプロトコルに従ってハイブリダイズさせた。メンブレンハイブリダイゼーションコントロールは、アクチンプローブにより行った。メンブレンを0.1×SSC/0.1% SDS中に42℃の温度で15分間、2回、高ストリンジェントで洗浄した。次いでメンブレンを、オートラジオグラフィーによるか、またはPhosphorImager上で分析した。
試験した組織は、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、血液白血球、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓であった。
図2は、これらの結果を示す。
2つのシグナルが検出された:
- 前立腺において、約2.6 kbにシグナルがあり、これはmRNAのサイズに対応する;
- 脳において、しかしながら高い分子量(9 kb)にシグナルがあり、これはプレメッセンジャーまたは高分子量のイソ型に対応する。
分析を、種々のマウスの組織、つまり脳、心臓、結腸、肝臓、小腸、骨格筋、膵臓、肺、腎臓、脾臓および精巣からの全RNAについて行った。
b.1) マウスのオートロガスcDNAの取得
種々のマウスの組織の細胞からの全RNAを、Sigma社の「mammalian total RNA kit」を用いて抽出した。RNAを、Invitrogen社からのSuperscript IIキットを用いて、供給業者が推奨する条件に従って、オリゴdTプライマーを用いて逆転写した。得られた産物を、1%アガロースゲル電気泳動により確かめた。続いて、このようにして得られた各試料1μlを、PCR (反応液25μl、30サイクル(94℃で15秒、55℃で30秒、72℃で30秒))により、マウスasap遺伝子に特異的なプライマー(mFIS-1F、5'-ACA ACG AAT AAC AGA GTG TCC-3' (配列番号35)およびmFIS-2R、5'-ACT CCT GAT AAA CAG CTG CC-3' (配列番号36))を用いて増幅させた。
電気泳動後、得られた増幅産物を、毛細管現象により、電荷を帯びたナイロンメンブレンに、1.5 M NaCl/0.5 M NaOHバッファー中に、サザン法(アルカリトランスファー)に従ってトランスファーした。次いでメンブレンを、データバンク(GenBank) (http://expression.gnf.org/promoter/tissue/images/41739#s#at.png)においてヒトASAP配列との比較の後に選択したマウスクローンAW06131中に含まれる配列を増幅することによりつくった放射性標識したmASAPプローブ(配列番号44)とハイブリダイズさせた。
図3は、これらの結果を示す。
主要なシグナルが精巣および脳で得られ、これはゲル上において明確に見えることが記載される(図3A)。
ゲルのトランスファーおよび内部プローブとのハイブリダイゼーション後に、非常に弱いシグナルが他の組織において検出されることが記載される(図3B)。
結果として、mASAPタンパク質をエンコードするmRNAは、精巣および脳で主に発現される。マウス精巣RNAからRT-PCRにより増幅されるマウス全長cDNAは、配列番号45の配列に対応し、対応タンパク質(mASAP)は、配列番号46の配列に対応する。
a) 真核発現ベクターでのhASAP cDNAのサブクローニング
実施例1で得られたhASAP cDNAを、3種の発現ベクターに挿入した:
1- C-末端の位置に融合された緑色蛍光タンパク質(GFP)を有する状態のpEAK10-EGFP中へ(ベクター1) (pEAK10、Edge Biosystemsからのベクター (フランスのQ.BIOgene、Illkirchにより流通)、この中にはEGFPタンパク質(増強緑色蛍光タンパク質(enhanced green fluorescent protein))が、参考文献I.:Gaillardら、Eur. J. Neurosci、15 409〜418、2002に従って導入されている);
3- N-末端側にMYC タグを含むGLOMYC3-1の中へ(ベクター3)、該ベクターは、ベクターpcDNA3.1 (Invitrogen)に由来し、この中には、HindIII-BamHI 部位において5'非翻訳領域(5'UTR)とMYCタグが挿入され、XbaI部位でグロブリンの3'UTR領域(SpeI-XbaI断片)が挿入されている。
hFIS-Exp1F (5'-GCCACCATGTCTGATGAAGTTTTTAGCAC-3) (配列番号37)および
hFIS-Exp1R (5'-GAAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3') (配列番号38)
を用いて調製。
このベクターを、EcoRVで開裂し、脱リン酸化した。ベクター10 ngを、DNA挿入断片とのライゲーションに用いた。PCR産物をリン酸化し、high PURE PCR kit (Roche)で精製した。挿入断片100 ngを、ライゲーション[最終容量10μl (Biolabsリガーゼ)中に16℃で12時間、標準的な条件(SambrookおよびRussell)に従う]に用いた。
Glomyc-FIS1F:(5'-TAATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (配列番号39)および
Glomyc-FIS1R:(5'-TCAAAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3') (配列番号40)
を用いて調製。
クローニング条件は、PEAK-GFPへのクローニングについて記載したものと同じである。
YFP-FIS1F (5'-AATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (配列番号41)および
Glomyc-FIS1R (配列番号40) (上記を参照)
を用いる。
クローニング条件は、PEAK-GFPへのクローニングについて記載したものと同じであり、ベクターは予めSma1で切断しておく。
PEAK-GFP:58℃でアニーリング、72℃で45秒の伸長、および残りについて標準的な条件。プライマー:constFIS-2F (配列番号33)およびGFP-1R (5'-TCAGCTTGCCGTAGGTGGC-3') (配列番号42)。
YFP:55℃で1分間のアニーリング:プライマー:YFP-2F (5'-ATGGTCCTGCTGGAGTTCG-3') (配列番号43)およびhFIS-Exp1R (配列番号38)。
Glomyc:44℃でアニーリング、72℃で45秒の伸長。プライマー:constFIS-2F (配列番号33)およびSP6。組換え体を、販売先で調整した自動配列決定によりPCR製品(Genome Express、Meylan)を用いて配列決定した。
上記の段落a)で用いたのと類似のストラテジーを用いて、標準的なプロトコルに従って精製可能なGSTとの融合タンパク質を産生するように、hASAP cDNAをベクターpGEX-4T2 (AMERSHAM)中にクローニングした。
上記の段落a)で用いたのと類似のストラテジーを用いて、mASAP cDNAを、次のベクターにクローニングした:
- pGEX-4T2 (AMERSHAM)、標準的なプロトコルに従って精製可能なGSTとの融合タンパク質を産生するように。
- pEYFP-C1、直接の免疫蛍光により検出可能な黄色蛍光タンパク質(YFP)との融合タンパク質(N-末端融合)を産生するように。
d.1) 材料および方法
得られたベクターを、リン酸カルシウム法によるか、またはより日常的には、jetPEI法(GDSP10101、Qbiogene)を製造者の推奨に従って用いて、次の細胞株にトランスフェクションした:
- PEAK (参照番号37937、Edge Biosystems (フランスのQ.BIOgene、Illkirchにより流通))、ヒトASAP構築物についてのみ、
- HEK-293 (ATCC (American Tissue Culture Collection) 参照番号CRL-1573;p 53 -/- 同期化不能(non-synchronizable))、ヒトおよびマウスASAP構築物について、
- 形質転換していないNIH3T3 (マウスASAP構築物)、および
- U-2 OS (ATCC HTB-96; p 53 +/-、同期化可能)。
ベクター3)について、MYCタグを、TEBU (9 E10、カタログ番号SC-40、Santa Cruz Biotechnology、CA)により流通している抗-MYC一次抗体、およびフルオロクロムで標識した抗マウスIgGヤギ二次抗体Alexa-594 (Molecular Probes、参照番号A-11032、フランスにおいてInterchim, Montluconにより流通)を用いて、細胞を固定化し、そしてこれを0.1% Triton X 100で透過可能にした後で検出した。スライドを分析し、画像をZeiss Axiophot顕微鏡で収集した。
- 細胞性局在化
図4は、HEK-293株で過剰発現させたhASAPタンパク質の細胞性局在化を示す(PI = ヨウ化プロピジウム)。
ベクター1)、2)および3)での種々のトランスフェクションに対応するスライドの蛍光顕微鏡下の観察は、同じタイプのプロフィールを示す。hASAPおよびmASAPタンパク質の局在化は、細胞質性であり、その線維性のプロフィールは、チューブリンフィラメントのそれを思い起こさせる。
最後に、トランスフェクションされた細胞の有糸分裂は、染色体機構および有糸分裂紡錘体のレベルでのhASAPおよびmASAPタンパク質の局在化プロフィールの両方の観点において、異常であるようである。hASAPおよびmASAPタンパク質の星型の局在化プロフィールは、中心体の周りの星状体の微小管の核形成の特徴である(図4Cおよび4D)。
さらに、U-2 OS細胞の同期化および周期中の種々の時間での細胞抽出物の回収により、ASAPタンパク質が細胞周期の全ての段階(間期、S、G2/M)で実際に存在することが確認された。
図5は、ヒトASAPタンパク質のα-チューブリンとの共局在化を示す。同様に、マウスASAPタンパク質は、α-チューブリンと共局在化する。
図5Aは、抗-チューブリン抗体(Alexa-594、Molecular Probe)を用いる免疫蛍光により検出されるα-チューブリンの細胞性局在化を示す。
図5Bは、YFP (黄色蛍光タンパク質)で標識したASAPタンパク質の局在化を示す。
図5Cは、2つの画像の重ねあわせを示し、2つのタンパク質の共局在化を証明する。
a) 抗体製造
次のASAPタンパク質構築物を、原核生物発現ベクターpGEX 4T-2 (AMERSHAM)に、実施例4に記載されるようにしてクローニングした:
- 全ヒトASAPタンパク質(配列番号1)、
- 可能性がある(potential) MAPドメインを含むC-末端部分(残基1〜421、配列番号47)を欠失させたヒトタンパク質、
- 全マウスタンパク質(配列番号46)。
タンパク質をイー・コリ(E. coli)内で発現させ、標準的なプロトコルにより精製した。次いでウサギを精製ASAPタンパク質で標準的なプロトコルに従って免疫し、免疫された血清を回収した。
全hASAPタンパク質または可能性があるMAPドメインを含むC-末端部分を欠失させたhASAPタンパク質に指向された単一特異的ポリクローナル血清を、HEK-293およびU-2 OS細胞について標準的なプロトコルに従って、ウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光により試験した。
ウェスタンブロッティングにより、全hASAPタンパク質に指向された単一特異的ポリクローナル血清は、内因性ASAPタンパク質に対応する約110 kDaの見かけの分子量を有するタンパク質を、HEK-293細胞およびU-2 OS細胞の両方において検出した。これらの条件下で、抗-FLAG抗体は、等しい分子量を有するタンパク質を、FLAG タグと融合されたhASAPタンパク質を発現するためのベクターでトランスフェクションされた対照のHEK-293またはU-2 OS細胞で検出した。
可能性があるMAPドメインを含むC-末端部分を欠失させたhASAPタンパク質に指向された単一特異的ポリクローナル血清は、免疫蛍光により同じプロフィールを示し、ウェスタンブロッティングにより約110 kDaのタンパク質を検出した。
mASAPタンパク質に指向された単一特異的ポリクローナル血清は、どの細胞のタイプがASAPを発現したか、および細胞周期のどの段階でそれが発現されたかを、マウスの精巣切片についての免疫蛍光により検出するために用いた。
BRCTドメインを含むN-末端部分を欠失させた(Ndel1:残基304〜647 (配列番号48);Ndel2:残基411〜647 (配列番号49);Ndel3:残基478〜647 (配列番号50))か、またはMAPドメインを含むC-末端部分を欠失させた(Cdel1:残基1〜477 (配列番号51);Cdel2:残基1〜418 (配列番号52);Cdel3:残基1〜303 (配列番号53)) hASAPタンパク質をエンコードするcDNAの断片を、適切なプライマーを用いるPCRにより増幅させ、発現ベクターpEAK10-EGFP (GFPとのC-末端融合)、およびpEYFP-C1 (YFPとのN-末端融合)に、実施例4に記載したのと類似のプロトコルに従ってクローニングした。
同じ欠失について、N-末端部分にYFPを含むか、またはC-末端部分にGFPを含む構築物を用いて、類似のプロフィールが得られたことが記載される。
hASAPタンパク質の機能分析は、干渉RNA (iRNA)を用いる遺伝子の発現不活性化からなる実験により完了する。
Claims (2)
- 配列番号1の配列のタンパク質、配列番号46のタンパク質および配列番号1または配列番号46の全体配列と少なくとも90%の同一性を有する配列で表され、かつ細胞内での過剰発現が該細胞の細胞分裂をブロックするタンパク質からなる群より選択される中心体結合(ASAP)タンパク質の活性を活性化または阻害することができる物質をスクリーニングする、
− 第一工程において、前記ASAPタンパク質を発現する生体試料の細胞を、試験される物質と接触させ、
− 第二工程において、該物質の、有糸分裂紡錘体機構または異常な有糸分裂および有糸分裂の頓挫の誘導に対する影響を、いずれの適切な手段により測定し、かつ
− 第三工程において、該活性を活性化または阻害することができる物質を選択する
ことを特徴とする方法。 - a)配列番号1の配列のタンパク質、配列番号46のタンパク質および配列番号1または配列番号46の全配列と少なくとも90%の同一性を有する配列で表され、かつ細胞内での過剰発現が該細胞の細胞分裂をブロックするタンパク質からなる群より選択される中心体結合(ASAP)タンパク質、または
b)a)で規定されるタンパク質の少なくとも10個連続するアミノ酸のペプチドを特異的に認識することができるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含むことを特徴とする、ASAPタンパク質の過剰発現に関連する有糸分裂紡錘体機構における妨害および/または異常な有糸分裂および有糸分裂の頓挫の誘導を示す細胞を検出および/または選択するためのキット。
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