WO2001031003A1 - Clonage, expression et caracterisation d'un gene exprime dans des cellules tumorales et implique dans la regulation de la reponse immune - Google Patents

Clonage, expression et caracterisation d'un gene exprime dans des cellules tumorales et implique dans la regulation de la reponse immune Download PDF

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WO2001031003A1
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Definitions

  • the invention relates to the identification and characterization of a new gene expressed in tumor cells and involved in the regulation of the immune response, the cloning and characterization of its cDNA and the corresponding polypeptides.
  • the invention also relates to vectors containing a nucleic acid encoding this gene, cells transformed by such vectors as well as diagnostic methods and methods for selecting a chemical or biochemical compound capable of interacting directly or indirectly with a nucleic acid or polypeptide according to the invention.
  • the invention further relates to compounds for the treatment of immune pathologies, including autoimmune diseases and cancer.
  • genes coding for proteins translocated in subcellular compartments or secreted outside the cell during or after the translational process are of great interest. Mention may in particular be made of genes coding for factor proteins, such as cytokines, or genes coding for membrane receptors which constitute therapeutic targets of choice.
  • proteins such as membrane proteins, present for the most part an N-terminal domain corresponding to a signal peptide, an extracellular domain and a transmembrane domain.
  • the present invention relates to a purified or isolated nucleic acid, characterized in that it comprises a nucleic sequence chosen from the following group of sequences: a) the sequence SEQ ID No. 1; b) the sequence of a fragment of at least 18 consecutive nucleotides, preferably 20, 25, 30, 50, 100 or 200 consecutive nucleotides, of the sequence SEQ ID No. 1 deleted from its terminal polyA fragment, preferably d said fragment of the sequence SEQ ID No. 3.
  • the present invention relates to a purified or isolated nucleic acid, characterized in that it comprises a nucleic sequence chosen from the group of following sequences: a) the sequence SEQ ID No. 1; b) the sequence of a fragment of at least 18 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1 deleted from its terminal polyA fragment; c) a nucleic sequence having a percentage identity of at least 80% after optimal alignment with a sequence as defined in a) or b); d) the complementary sequence or the RNA sequence corresponding to a sequence as defined in a), b) or c), with the exception of the sequence SEQ ID No. 11 of document WO 99/54461, of the sequence SEQ ID No. 51 of document WO 99/06548 and of the three sequences described in the documents of the EMBL database under the identification numbers Al 672868, AA 890726 and Al 301140.
  • WO 99/54461 is a patent document which relates to nucleic acid sequences expressed by tumor endometrial tissues. This document describes in particular among 635 sequences a nucleic sequence SEQ ID No. 11 and its corresponding peptide sequence SEQ ID No. 173 having an identity close to 100% with respectively a fragment of the sequence SEQ ID No. 1 (nt 1597-3313 ) and of the sequence SEQ ID No. 2 (aa 519-1013) of the present invention. This document indicates, page 153, that the peptide sequence SEQ ID No. 173 does not correspond to any sequence whose function is known.
  • WO 99/06548 is a document relating to EST sequences coding for proteins secreted from non-specific tissues.
  • this document describes in particular the nucleic and peptide sequence SEQ ID No. 51 whose sequence aa37-113 (150 amino acids) has a very strong homology with the fragment aa1- 150 of the sequence SEQ ID No. 2 according to the invention (identity of approximately 85% for the fragment of 150 amino acids; ⁇ 94% for the first 135 amino acids).
  • This document also indicates that the DNA corresponding to this 5 ′ sequence SEQ ID No. 51 originates from human prostate tumor tissue (cf. page 40 of the "original source” sequence list).
  • the document "EMBL” Al 672868 describes an mRNA sequence originating from a bank of human colon tissues suffering from Crohn's disease, and exhibiting a high level of identity with the sequence complementary to the cDNA fragment nt 441- 971 of the sequence SEQ ID No. 1 according to the invention.
  • the document "EMBL” AA890726 describes an mRNA sequence originating from a human tissue bank of a parathyroid with sporadic adenoma, and exhibiting a high level of identity with the sequence complementary to the cDNA fragment nt 2779-3309 of the sequence SEQ ID No. 1 according to the present invention.
  • EBL EML A1 301140 describes an mRNA sequence originating from a human pulmonary carcinoid library of the neuroendocrine type described, and having a high level of identity with the complementary sequence of the cDNA fragment in position nt 2736 -3299 of the sequence SEQ ID No. 1 according to the invention.
  • nucleic acid nucleic or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, nucleotide sequence, terms which will be used interchangeably in the present description, is intended to denote a precise sequence of nucleotides, modified or not, making it possible to define a fragment or region of a nucleic acid, which may or may not contain unnatural nucleotides, and which may correspond to both double-stranded DNA, single-stranded DNA and transcripts of said DNAs.
  • nucleotide sequences in their natural chromosomal environment that is to say in the natural state.
  • sequences which have been isolated and / or purified that is to say that they have been taken directly or indirectly, for example by copying, their environment having been at least partially modified.
  • the length of the nucleic acid sequence according to the present invention will be less than 150 kb, even more preferably less than 100 kb, 50 kb, 25 kb, 10 kb or 5 kb.
  • percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical nucleotides or amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • the term “best alignment” or “optimal alignment” is intended to denote the alignment for which the percentage of identity determined as below is the highest. Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by "comparison window" to identify and compare the regions. sequence similarity locale.
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be achieved, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math., 2: 482], using the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol., 48: 443], using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 2444], using computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).
  • the percentage identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences in which the nucleic acid or amino acid sequence to be compared may include additions or deletions compared to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions compared and by multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • nucleic acid sequences having a percentage identity of at least 80%, preferably 90%, 95% or 99% after optimal alignment with a reference sequence, the nucleic acid sequences presenting, with respect to the reference nucleic acid sequence certain modifications such as in particular a deletion, a truncation, an elongation, a chimeric fusion, and / or a substitution, in particular punctual, and whose nucleic sequence has at least 80%, preferably 90%, 95% or 99%, identity after optimal alignment with the reference nucleic sequence.
  • They are preferably sequences whose complementary sequences are capable of hybridizing specifically with the sequence SEQ ID No. 1 of the invention.
  • the specific hybridization conditions or high stringency will be such that they ensure at least 80%, preferably 90%, 95% or 99% identity after optimal alignment between one of the two sequences and the sequence complementary to the other.
  • Hybridization under conditions of high stringency means that the conditions of temperature and ionic strength are chosen in such a way that they allow hybridization to be maintained between two fragments of complementary DNAs.
  • high stringency conditions of the hybridization step for the purpose of defining the polynucleotide fragments described above are advantageously as follows.
  • DNA-DNA or DNA-RNA hybridization is carried out in two stages: (1) prehybridization at 42 ° C for 3 hours in phosphate buffer (20 mM, pH 7.5) containing 5 x SSC (1 x SSC corresponds to a 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate solution), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5% dextran sulfate and 1% salmon sperm DNA; (2) actual hybridization for 20 hours at a temperature depending on the size of the probe (ie: 42 ° C, for a probe of size> 100 nucleotides) followed by 2 washes of 20 minutes at 20 ° C in 2 x SSC + 2% SDS, 1 wash for 20 minutes at 20 ° C in 0.1 x SSC + 0.1% SDS.
  • the last washing is carried out in 0.1 ⁇ SSC + 0.1% SDS for 30 minutes at 60 ° C. for a probe of size> 100 nucleotides.
  • the high stringency hybridization conditions described above for a polynucleotide of defined size will be adapted by the skilled person for oligonucleotides of larger or smaller size, according to the teaching of Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual., Sec. Ed., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1989).
  • variant nucleic sequences are also preferred. of the nucleic sequence SEQ ID No. 1, or of its fragments, that is to say all of the nucleic sequences corresponding to allelic variants, that is to say individual variations of the nucleic sequence SEQ ID No. 1.
  • SEQ ID No. 1 or of its fragments, that is to say all of the nucleic sequences corresponding to allelic variants, that is to say individual variations of the nucleic sequence SEQ ID No. 1.
  • These natural mutated sequences correspond to polymorphisms present in mammals, in particular in humans and, in particular, to polymorphisms which can lead to the onset of a pathology.
  • the present invention relates to the variant nucleic acid sequences in which the mutations lead to a modification of the amino acid sequence of the polypeptide, or of its fragments, coded by the normal sequence of sequence SEQ ID No. 1.
  • variant nucleic sequences any RNA or cDNA resulting from a mutation of a splicing site of the genomic nucleic sequence whose cDNA has the sequence SEQ ID No. 1.
  • the invention preferably relates to a purified or isolated nucleic acid according to the present invention, characterized in that it consists of the sequence SEQ ID No. 1, the complementary sequence or the sequence of the corresponding RNA of the sequence SEQ ID No. 1, preferably its fragment coding for the peptide of sequence SEQ ID No. 2, or of sequence SEQ ID No. 2 deleted from the peptide signed aa1-41.
  • the invention preferably relates to a purified or isolated nucleic acid according to the invention, characterized in that it comprises the sequences chosen from the following sequences: a) the sequences SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 and SEQ ID No. 19; b) the sequence of a fragment of at least 18 nucleotides of the sequence SEQ ID No. 19; c) a nucleic sequence having a percentage identity of at least 80% after optimal alignment with a sequence as defined in a) or b); and d) the complementary sequence or the sequence of the RNA corresponding to a sequence as defined in a), b) or c).
  • the invention preferably relates to a purified or isolated nucleic acid according to the invention, characterized in that its sequence is chosen from the following sequences: a) SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19 and SEQ ID No. 21; b) a nucleic sequence having an identity percentage of at least 80% after optimal alignment with a sequence as defined in a); and c) the complementary sequence or the RNA sequence corresponding to a sequence as defined in a) or b).
  • the primers or probes characterized in that they comprise a sequence of a nucleic acid according to the invention, also form part of the invention.
  • the present invention preferably thus relates to the primers or probes according to the invention which can make it possible in particular to demonstrate or discriminate the variant nucleic sequences, or to identify the genomic sequence of the gene whose cDNA is represented by the sequence SEQ ID No. 1, in particular using an amplification method such as the PCR method, or a related method.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid sequence according to the invention as probe or primer, for the detection, identification, assay or amplification of nucleic acid sequence.
  • the polynucleotides which can be used as probe or as primer in methods of detection, identification, assay or amplification of nucleic sequence will have a minimum size of 15 bases, preferably 20 bases, or better from 25 to 30 bases.
  • All the probes and primers according to the invention can be labeled directly or indirectly with a radioactive or non-radioactive compound by methods well known to those skilled in the art, in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
  • the unlabeled polynucleotide sequences according to the invention can be used directly as a probe or primer.
  • the sequences are generally marked to obtain sequences which can be used for numerous applications.
  • the labeling of the primers or probes according to the invention is carried out with radioactive elements or with non-radioactive molecules.
  • radioactive isotopes used, mention may be made of 32 P, ⁇ P, ⁇ S, 3 H or 125 l.
  • Non-radioactive entities are selected from ligands such as biotin, avidin, streptavidin, dioxygenin, haptens, dyes, luminescent agents such as radioluminescent, chemiluminescent, bioluminescent, fluorescent, phosphorescent agents.
  • the polynucleotides according to the invention can thus be used as a primer and / or probe in methods using in particular the technique of PCR (polymerase chain reaction) (Erlich, HA, New York: Stockton Press, 1989; Innis, MA, et al., Académie Press, 1990; and Rolfs, A., et al., Berlin: Springer-Verlag, 1991).
  • PCR polymerase chain reaction
  • This technique requires the choice of pairs of oligonucleotide primers framing the fragment which must be amplified.
  • the amplified fragments can be identified, for example after electrophoresis in agarose or polyacrylamide gel, or after a chromatographic technique such as gel filtration or ion exchange chromatography, and then sequenced.
  • the specificity of the amplification can be controlled by using, as primer, the nucleotide sequences of polynucleotides of the invention as template, plasmids containing these sequences or else the derived amplification products.
  • the amplified nucleotide fragments can be used as reagents in hybridization reactions in order to demonstrate the presence, in a biological sample, of a target nucleic acid of sequence complementary to that of said amplified nucleotide fragments.
  • the invention also relates to the nucleic acids capable of being obtained by amplification using primers according to the invention.
  • Other techniques for amplifying the target nucleic acid can advantageously be used as an alternative to PCR (PCR-like) using pairs of primers of nucleotide sequences according to the invention.
  • PCR-like will be understood to mean all the methods implementing direct or indirect reproductions of the nucleic acid sequences, or else in which the labeling systems have been amplified, these techniques are of course known, in general these are amplification of DNA with a polymerase; when the original sample is an RNA, a reverse transcription should be carried out beforehand.
  • thermostable ligase which uses a thermostable ligase, the RCR technique (Repair Chain Reaction) described by Segev, D. in 1992 (Kessler C. Springer Verlag, Berlin, New York, 197-205), the CPR (Cycling Probe Reaction) technique described by Duck, P., et al. in 1990 (Biotechniques, 9: 142-147), the Q-beta-replicase amplification technique described by Miele, EA, et al. in 1983 (J. Mol. biol., 171: 281-295) and improved in particular by Chu, BCF, et al.
  • RCR Repair Chain Reaction
  • CPR Cycling Probe Reaction
  • the target polynucleotide to be detected is an mRNA
  • an enzyme of reverse transcriptase type in order to obtain a cDNA from the mRNA contained in the biological sample.
  • the cDNA obtained will then serve as a target for the primers or probes used in the amplification or detection method according to the invention.
  • the probe hybridization technique can be carried out in various ways
  • the most general method consists in immobilizing the nucleic acid extracted from cells of different tissues or cells in culture on a support (such as nitrocellulose, nylon, polystyrene) and incubating, under well defined conditions, the target nucleic acid immobilized with the probe. After hybridization, the excess probe is eliminated and the hybrid molecules formed are detected by the appropriate method (measurement of radioactivity, fluorescence or enzymatic activity linked to the probe).
  • a support such as nitrocellulose, nylon, polystyrene
  • the latter can be used as a capture probe.
  • a probe called a “capture probe”
  • a probe is immobilized on a support and is used to capture by specific hybridization the target nucleic acid obtained from the biological sample to be tested and the target nucleic acid is then detected.
  • a second probe called a “detection probe”, marked by an easily detectable element.
  • the invention comprises a method for the screening of cDNA or genomic DNA libraries, or for the cloning of isolated cDNA or genomic, characterized in that it implements a nucleic sequence according to l 'invention.
  • these methods according to the invention can be used for the identification and thus the obtaining of cDNAs of nucleic variants.
  • screening and / or cloning methods will in particular comprise a step of hybridization of a nucleic acid according to the invention with a nucleic acid contained in a genomic or cDNA library.
  • the invention also includes a method for identifying the nucleic acid sequences which promote and / or regulate the expression of the gene whose cDNA has the sequence SEQ ID No. 1, characterized in that it uses a nucleic acid according to the invention.
  • the computer tools available to those skilled in the art allow him easily to identify, from the genomic nucleic sequences according to the invention, the promoter regulatory boxes necessary and sufficient for the control of gene expression, in particular the TATA, CCAAT boxes, GC, as well as the stimulatory (“enhancer”) or inhibitory (“silent”) regulatory sequences which control in CIS the expression of the genes according to the invention; among these regulatory sequences, mention should be made of TIRE, MRE, CRE.
  • the invention also relates to methods for the identification of mutations carried by the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, in particular responsible mutations, characterized in that they implement a nucleic sequence according to the invention .
  • the invention relates particularly to a method for identifying a nucleic acid of at least 18 consecutive nucleotides of the sequence of the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, said nucleic acid comprising at least one mutation, of preferably responsible for the abnormal expression of said gene, characterized in that it implements a nucleic sequence according to the invention.
  • These methods of identifying these mutations will include in particular the following steps: (i) isolation of the DNA from the biological sample to be analyzed, or obtaining a cDNA from the mRNA of the biological sample ; (ii) specific amplification of the target DNA capable of presenting a mutation using primers according to the invention; (iii) analysis of the amplification products, in particular the size and / or the sequence of the amplification products, with respect to a reference sequence.
  • Also part of the invention are the promoter and / or regulatory sequences of said gene according to the invention having mutations capable of modifying the expression of the corresponding protein.
  • Nucleic acids characterized in that they are capable of being obtained by one of the preceding methods according to the invention, or nucleic acids capable of hybridizing under conditions of high stringency (percentage identity of at least 80 % between one of the two sequences and the complementary sequence of the other) with said nucleic acids, are part of the invention, in particular the nucleic acids of allelic variants of the gene whose cDNA has the sequence SEQ ID No. 1, as well as the genomic sequences of the homologous genes of other mammals such as the mouse.
  • nucleic acid sequence according to the invention as probe or primer for the screening of genomic library or cDNA is of course part of the object of the present invention.
  • the invention comprises a purified or isolated polypeptide encoded by a nucleic acid according to the invention.
  • polypeptide will be used to also denote a protein or a peptide.
  • the present invention relates to a purified or isolated polypeptide, characterized in that it comprises an amino acid sequence chosen from the following group: a) the sequence SEQ ID No. 2; b) the sequence of a fragment of at least 6, 10, 15, 30 or 50 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID No. 2, preferably of a said fragment of the sequence SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8 or SEQ ID No. 10; c) an amino acid sequence having a percentage identity of at least
  • the subject of the invention is a polypeptide of amino acid sequence SEQ ID No. 2, of sequence SEQ ID No. 2 deleted from the fragment aa1-41, or an amino acid sequence having a percentage d identity of at least 80%, preferably 90%, 95% or 99%, after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 2.
  • Protein sequence analysis predicts that the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 has a signal peptide whose sequence is between positions aa 1-41, an extracellular domain whose sequence is between positions aa 42-911 , a transmembrane domain whose sequence is between the positions aa 912-930 and an intracellular domain whose sequence is between the positions aa 931-1013 on the sequence SEQ ID No. 2.
  • polypeptides according to the invention the polypeptide whose sequence is between the positions aa 42-911of the sequence SEQ ID No. 2 corresponding to the extramembrane domain or any fragment of at least 6, 10, 15, 30 is also preferred. or 50 consecutive amino acids of said sequence aa 42-911, preferably consecutive of the sequence SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8 or SEQ ID No. 10.
  • the invention preferably relates to a purified or isolated polypeptide, characterized in that it comprises an amino acid sequence chosen from the following group: a) the sequence SEQ ID No. 2; b) the sequence of a fragment of at least 6 amino acids of the sequence SEQ ID No. 22, preferably of the sequence SEQ ID No. 20; and c) an amino acid sequence having a percentage identity of at least 80% after optimal alignment with a sequence as defined in a) or b).
  • the invention preferably relates to a polypeptide according to the invention, characterized in that its sequence is chosen from the sequences SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4,
  • SEQ ID No. 20 SEQ ID No. 22 or a sequence having an identity percentage of at least 80% after optimal alignment with these sequences.
  • the invention does not relate to polypeptides in natural form, that is to say that they are not taken in their environment.
  • the invention relates to peptides obtained by purification from natural sources, or else obtained by genetic recombination, or even by chemical synthesis and which can then comprise non-natural amino acids.
  • the production of a recombinant polypeptide, which can be carried out using one of the nucleotide sequences according to the invention is particularly advantageous since it makes it possible to obtain an increased level of purity of the desired polypeptide.
  • polypeptide whose amino acid sequence exhibiting a percentage identity of at least 80%, preferably 90%, 95% or 99%, after optimal alignment with a reference sequence is intended to denote the polypeptides exhibiting certain modifications. relative to the reference polypeptide, such as in particular one or more deletions, truncations, an elongation, a chimeric fusion, and / or one or more substitutions.
  • polypeptides whose amino acid sequence having a percentage identity of at least 80%, preferably 90%, 95% or 99% after optimal alignment with the sequence SEQ ID No.
  • the variant polypeptides encoded by the variant nucleic sequences as defined above are preferred, in particular the polypeptides whose amino acid sequence has at least one mutation corresponding in particular to truncation, deletion, substitution and / or addition of at least one amino acid residue with respect to the sequence SEQ ID No. 2 or with one of its fragments, more preferably the variant polypeptides having a mutation linked to a pathology.
  • the invention also includes the cloning and / or expression vectors containing a nucleic acid sequence according to the invention.
  • the vectors according to the invention characterized in that they comprise the elements allowing the expression and / or the secretion of said sequences in a host cell, or even a cell addressing sequence, also form part of the invention.
  • Said vectors will preferably comprise a promoter, translation initiation and termination signals, as well as suitable regions for regulating transcription. They must be able to be maintained stably in the cell and may possibly have specific signals specifying the secretion of the translated protein.
  • control signals are chosen according to the cellular host used.
  • the nucleic acid sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or vectors integrative of the chosen host.
  • plasmid or viral type systems will preferably be used depending on the host cell, the viral vectors possibly being in particular adenoviruses (Perricaudet, M., et al., La Diego, 23: 471 -473, 1992), retroviruses, lentiviruses, poxviruses or herpesviruses (Epstein, A., Medicine / Sciences, 8: 902-911, 1992).
  • adenoviruses Perricaudet, M., et al., La Diego, 23: 471 -473, 1992
  • retroviruses retroviruses
  • lentiviruses lentiviruses
  • poxviruses poxviruses
  • herpesviruses Epstein, A., Medicine / Sciences, 8: 902-911, 1992.
  • viruses When it is desired to integrate the sequence into the chromosomes of the host cell, use may be made, for example, of systems of the plasmid or viral type; such viruses will be, for example, retroviruses (Temin, H. M., Retrovirus vectors for gene transfer, In Kucherlapati R., éd. Gène Transfer, New York, Plénum Press,
  • naked polynucleotides such as naked DNA or naked RNA are preferred according to the technique developed by the company VICAL, artificial yeast chromosomes (YAC) for expression in yeast. , mouse artificial chromosomes (MAC) for expression in murine cells and preferably human artificial chromosomes (HAC, human artificial chromosome) for expression in human cells.
  • YAC artificial yeast chromosome
  • MAC mouse artificial chromosomes
  • HAC human artificial chromosome
  • Such vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods, such as for example lipofection, electroporation, heat shock.
  • the invention further comprises the host cells, in particular the eukaryotic and prokaryotic cells, transformed by the vectors according to the invention as well as the transgenic animals, except humans, comprising one of said cells transformed according to the invention.
  • a preferred cellular host for the expression of the proteins of the invention consists of COS cells.
  • mice, rats or rabbits are preferred, expressing a polypeptide according to the invention.
  • animals such as mice, rats or rabbits are also preferred, characterized in that the gene coding for the protein with sequence SEQ ID No. 2, or whose sequence is coded by homologous gene for these animals, is not functional, is invalidated or has at least one mutation.
  • transgenic animals are obtained for example by homologous recombination on embryonic stem cells, transfer of these stem cells to embryos, selection of the affected chimeras at the level of the reproductive lines, and growth of said chimeras.
  • transgenic animals may overexpress the gene coding for the protein according to the invention, or their homologous gene, or express said gene into which a mutation may be introduced.
  • These transgenic animals are obtained for example by transfection of a copy of this gene under the control of a strong promoter of ubiquitous nature, or selective for a type of tissue, or after viral transcription.
  • These transgenic animals may be made deficient for the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No.
  • the cells and mammals according to the invention can be used in a method for producing a polypeptide according to the invention, as described below, and can also be used as an analysis model.
  • the transformed cells or mammals as described above can thus be used as models in order to study the interactions between the polypeptides according to the invention, and the chemical or protein compounds, involved directly or indirectly in the activities of the polypeptides according to the invention, this in order to study the different mechanisms and interactions involved.
  • polypeptides according to the invention can be used for the selection of products interacting with the polypeptides according to the invention, in particular the protein of sequence SEQ ID No. 2 or its variants according to the invention, as cofactor, or inhibitor, in particular competitive , or also having an agonist or antagonist activity of the activity of the polypeptides according to the invention.
  • said transformed cells or transgenic animals will be used as a model, in particular for the selection of products making it possible to combat pathologies linked to an abnormal expression of this gene.
  • the invention also relates to the use of cell, mammal or polypeptide according to the invention for the screening of chemical or biochemical compound which can interact directly or indirectly with the polypeptides according to the invention, and / or capable of modulating the expression or the activity of these polypeptides.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid sequence according to the invention for the synthesis of recombinant polypeptides.
  • the method for producing a polypeptide of the invention in recombinant form is itself included in the present invention, and is characterized in that the transformed cells, in particular the cells or mammals of the present invention, are cultivated in conditions allowing the expression of a recombinant polypeptide encoded by a nucleic acid sequence according to the invention, and that said recombinant polypeptide is recovered.
  • Recombinant polypeptides characterized in that they are capable of being obtained by said production method, also form part of the invention.
  • the recombinant polypeptides obtained as indicated above can be both in glycosylated and non-glycosylated form and may or may not have the natural tertiary structure.
  • sequences of the recombinant polypeptides can also be modified in order to improve their solubility, in particular in aqueous solvents. Such modifications are known to those skilled in the art, such as the deletion of hydrophobic domains or the substitution of hydrophobic amino acids with hydrophilic amino acids.
  • polypeptides can be produced from the nucleic acid sequences defined above, according to the techniques for producing recombinant polypeptides known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid sequence used is placed under the control of signals allowing its expression in a cellular host.
  • An efficient system for producing a recombinant polypeptide requires having a vector and a host cell according to the invention.
  • These cells can be obtained by introducing into host cells a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then culturing said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.
  • the recombinant polypeptide purification methods used are known to those skilled in the art.
  • the recombinant polypeptide can be purified from cell lysates and extracts, from the culture medium supernatant, by methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoaffinity techniques using '' specific monoclonal or polyclonal antibodies, etc.
  • polypeptides according to the present invention can be obtained by chemical synthesis and this using one of the many known peptide syntheses, for example the techniques using solid phases or techniques using partial solid phases, by condensation of fragments or by a synthesis in conventional solution.
  • polyclonal antibodies can be obtained from a serum of an animal immunized against the polypeptides according to the invention, in particular produced by genetic recombination or by peptide synthesis, according to the usual procedures.
  • Mono- or polyclonal antibodies or their fragments, chimeric or immunoconjugate antibodies, characterized in that they are capable of specifically recognizing the extramembrane domain of the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 are particularly preferred.
  • the specific monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional method of culture of hybridomas described by K ⁇ hler and Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975).
  • the antibodies according to the invention are, for example, chimeric antibodies, humanized antibodies, Fab or F (ab ') 2 fragments. They can also be in the form of immunoconjugates or labeled antibodies in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
  • the invention also relates to methods for the detection and / or purification of a polypeptide according to the invention, characterized in that they use an antibody according to the invention.
  • the invention further comprises purified polypeptides, characterized in that they are obtained by a method according to the invention.
  • the antibodies of the invention in particular the monoclonal antibodies, can also be used for the detection of these polypeptides in a biological sample.
  • polypeptides according to the invention in particular the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 or one of its variants, on sections of specific tissues, by example by immunofluorescence, gold labeling, enzyme immunoconjugates.
  • the antibodies of the invention can be advantageously used in any situation where the expression of a polypeptide according to the invention, normal or mutated, must be observed.
  • Also forming part of the invention are the methods for determining an allelic variability, a mutation, a deletion, a loss of heterozygosity or any genetic anomaly of the gene according to the invention, characterized in that that they use a nucleic acid sequence or an antibody according to the invention.
  • the invention relates to a method for diagnosing a disease associated with the presence of at least one mutation in a gene sequence according to the invention from a biological sample from a patient, characterized in that it comprises the following steps: a) if necessary, isolation of the genomic DNA from the biological sample to be analyzed, or obtaining cDNA from the RNA of the biological sample; b) specific amplification of said DNA sequence of the gene capable of containing a mutation using primers according to the invention; c) analysis of the amplification products obtained and comparison of their sequence with the normal sequence.
  • the invention also includes a method for diagnosing a disease associated with an abnormal expression of a polypeptide according to the invention, in particular the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 or one of its variants, characterized in that one brings one or more antibodies according to the invention into contact with the biological material to be tested, under conditions allowing the possible formation of specific immunological complexes between said polypeptide and said antibody or antibodies, and in that one detects and / or quantifies the immunological complexes possibly formed.
  • These diagnostic methods are intended, for example, to diagnose diseases associated with an abnormal expression of the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, such as overexpression or repression, by determining from a biological sample. of the patient the presence in abnormal quantity of a sequence according to the invention.
  • the nucleic acid sequences analyzed may as well be genomic DNA, cDNA, or mRNA.
  • the methods which make it possible to demonstrate a mutation in a gene relative to the wild-type gene are, of course, very numerous. They can basically be divided into two main categories.
  • the first type of method is that in which the presence of a mutation is detected by comparison of the mutated sequence with the corresponding wild-type sequence
  • the second type is one in which the presence of the mutation is detected indirectly, for example by evidence of mismatches due to the presence of the mutation.
  • probes and primers of the present invention can use the probes and primers of the present invention. They are generally purified hybridization nucleic sequences comprising at least 15 nucleotides, preferably 20, 25 or 30 to 200 nucleotides, characterized in that they can hybridize specifically with a nucleic sequence according to the invention.
  • the specific hybridization conditions are such as those defined above or in the examples.
  • the methods for determining an allelic variability, a mutation, a deletion, or a genetic abnormality preference is given to methods comprising at least one amplification step called by PCR (polymerase chain reaction ) or by PCR-like of the target sequence according to the invention capable of presenting an anomaly using a pair of primers of nucleotide sequences according to the invention.
  • the amplified products may be treated with the appropriate restriction enzyme before detecting or assaying the targeted product.
  • the mutations of the gene according to the invention can be responsible for different modifications of its translation product, modifications which can be used for a diagnostic approach. Indeed, the modifications of antigenicity linked to these mutations can allow the development of specific antibodies. Discrimination of the mutated gene product can be achieved by these methods. All these modifications can be used in a diagnostic approach using several well-known methods based on the use of mono- or polyclonal antibodies recognizing the normal polypeptide or mutated variants, such as for example by RIA or by ELISA.
  • the invention comprises a method of selecting chemical or biochemical compounds capable of interacting directly or indirectly with the polypeptides according to the invention, in particular the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, or with the nucleic acids according to the invention, and / or allowing the expression or activity of the polypeptides according to the invention to be modulated.
  • the invention comprises a method of selecting chemical or biochemical compounds capable of interacting in vitro or in vivo with a nucleic acid sequence according to the invention, characterized in that it comprises contacting a cell expressing normally or abnormally the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 with a candidate compound, and the detection direct or indirect modification of the expression or activity of the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2.
  • the screening can be used to test compounds capable of modifying the level and / or the specificity of expression of the polypeptides according to the invention, in particular the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, either by binding competitively to the binding sites of the transcription factors located in the promoter of the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, either by directly binding to the transcription factors.
  • the level of expression of the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 and its location can be analyzed by hybridization in solution with large probes as indicated in PCT patent WO 97/05277.
  • a quantitative analysis of the expression of the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 can also be carried out using DNA templates, which may include all or part of the cDNA sequence of sequence SEQ ID No. 1 of the present invention, and having a sufficient length to allow specific detection of the expression of mRNAs capable of hybridizing to it.
  • the fragments comprise at least 15, 25, 50, 100 or 500 consecutive nucleotides of the nucleic sequences from which they are derived as described in Schena, et al. (Science, 270: 467-470, 1995).
  • DNAs according to the invention can also be carried out with DNAs according to the invention on DNA matrices according to the description of Pietu et al. (1996).
  • the DNAs according to the invention or their fragments are amplified by PCR and fixed on membranes.
  • MRNAs from different tissues or cells are labeled with radioactive nucleotides. After hybridization and washing under controlled conditions, the hybrid mRNAs are detected with a Phosphor Imager or by autoradiography. The experiments are carried out in duplicate and a quantitative analysis of the differentially expressed mRNAs can be carried out.
  • Another aspect of the present invention relates to methods of identifying molecules capable of binding with the polypeptides according to the invention, in particular the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2.
  • Such molecules can be used to modulate the biological activity of these polypeptides.
  • such molecules can be used to stimulate or reduce the activity of these polypeptides.
  • the invention comprises a method of selecting chemical or biochemical compounds capable of modulating the activity of the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, characterized in that it comprises contacting a polypeptide according to the invention or of a cell according to the invention, with a candidate compound and, the detection of a modification of the activity of the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2.
  • the invention also relates to a method of selecting chemical compounds or biochemical in vivo or in vitro capable of binding with the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, characterized in that it comprises contacting a polypeptide according to the invention or a cell according to the invention , with a candidate compound, and detecting the formation of a complex between the candidate compound and said polypeptide.
  • the peptides or small molecules capable of interacting with the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention can be linked to detectable markers such as radioactive, fluorescent or enzymatic markers. These labeled molecules are brought into contact with said immobilized polypeptide according to the invention, under conditions allowing a specific interaction. After elimination of the molecules which are not specifically fixed, the linked molecules are detected by appropriate means.
  • B1ACORE technology can also be used to screen for compounds capable of interacting with the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2. This technology, described in Szabo, A., et al. (Curr. Opin. Struct.
  • Biol., 5: 699-705, 1995 makes it possible to detect interactions between molecules in real time without the use of labeling. It is based on the phenomenon of SPR (surface plasmon resonance).
  • SPR surface plasmon resonance
  • One of the main advantages of this method is that it allows the determination of the association constants between the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 and the interacting molecules. Thus, it is possible to specifically select the molecules interacting with strong or weak association constants.
  • Proteins or other molecules interacting with the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention can be identified using affinity columns which contain said polypeptide or one of its fragments according to the invention.
  • Said polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, or a fragment thereof can be attached to the column using conventional techniques including chemical coupling to an appropriate column matrix such as agarose, Affi Gel, or d other matrices known to those skilled in the art.
  • the affinity column can contain chimeric proteins in which said polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, or one of its fragments, would be fused for example with gluthation S-transferase.
  • the test molecules described above are then deposited on the column.
  • the molecules interacting with said polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 are retained by the column and can be isolated by elution.
  • the invention also relates to a method of screening and / or of selection of compounds interacting with the promoter and / or regulatory sequences of the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention.
  • nucleic acids coding for proteins interacting with the promoter and / or regulatory sequences of the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention can be screened and / or selected using a single hybrid system such as the one described in the manual accompanying the Clontech One-Hybrid System Matchmaker kit (Catalog N ° K1603).
  • the selection of compounds capable of modifying the expression of the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention by binding to its regulatory and / or promoter sequences can also be carried out using “reporter” genes "Such as alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, or GFP (green fluorescent protein).
  • reporter genes "Such as alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, or GFP (green fluorescent protein).
  • the effect of candidate compounds on the expression resulting from the regulatory and / or promoter sequences of the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention can thus be evaluated.
  • the invention comprises the use of nucleic acid or polypeptide according to the invention, of a cell according to the invention, or of a mammal according to the invention, for the study of the expression or activity of the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention, and / or interactions, direct or indirect, between said polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, and chemical or biochemical compounds which may be involved in its activity.
  • the chemical or biochemical compounds characterized in that they are selected by said methods defined above also form part of the invention.
  • compounds intended to modulate the expression or the activity of the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention is intended to denote the compounds which make it possible in particular to reduce, stabilize or increase the quantity or the specificity of the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention, or of promoting or inhibiting the overall activity or the activity of one of the specific domains of said polypeptide or else of restoring the normal expression of said gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention in the case, for example, where a genetic abnormality is observed.
  • These compounds may for example interact as specific ligands of said polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention or of one of its domains as a cofactor, or an inhibitor, in particular a competitive one, or else having an agonist activity. or antagonist of the activity of said polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention.
  • These compounds may also interact either by neutralizing the specific natural ligands of said polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention and thereby inhibiting the activity of said polypeptide induced by these ligands, or by neutralizing the binding site of these natural ligands .
  • the invention comprises the compounds according to the invention, characterized in that they are agonists or antagonists of the activity of the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention.
  • the invention also comprises compounds according to the invention, characterized in that they are capable of binding to a polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention.
  • polypeptide according to the invention including the polypeptides of sequence SEQ ID No. 173 and SEQ ID No. 51 respectively described in documents WO 99/54461 and WO 99/06458, - a polypeptide according to the invention, characterized in that that it corresponds to a fragment or to the soluble fraction of the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention,
  • nucleic acid according to the invention including the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 11 from document WO 99/54461, of sequence ID No. 51 of document WO 99/06548, of sequence Al 672868, AA 890726 or Al 30140 EMBL documents with corresponding identification number, meaning or antisense, and
  • the invention comprises compounds according to the invention, as a medicament for the prevention and / or treatment of pathologies linked to an abnormality in the expression and / or the activity of the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 according to the invention.
  • the invention comprises compounds according to the invention, as a medicament for the prevention and / or treatment of immune pathologies, in particular for the prevention and / or treatment of autoimmune diseases or cancers.
  • the invention finally comprises compounds according to the invention, as a medicament for the prevention and / or treatment of infections of the viral, fungal, bacterial or parasitic type.
  • the compounds of the invention as active principles of medicament will preferably be in soluble form, associated with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • these compounds will be administered by the systemic route, in particular by the intravenous route, by the intramuscular, intradermal route or by the oral route.
  • Their optimal modes of administration, dosages and dosage forms can be determined according to the criteria generally taken into account in establishing a treatment adapted to a patient such as for example the patient's age or body weight, the severity of his general condition, tolerance to treatment and observed side effects, etc.
  • RNA coding for the peptide with sequence SEQ ID No. 2 was analyzed by Northern Blotting using commercial membranes (Multiple Tissue Northern; Clontech, Palo Alto, CA). Representative results obtained with two different membranes are presented. 1. fetal liver, 2. bone marrow, 3. mononuclear cells, 4. thymus, 5. peripheral nodes, 6. spleen, 7. mononuclear cells, 8. lung, 9. placenta, 10. small intestine, 11. liver, 12. kidney, 13. spleen, 14. thymus, 15. colon, 16. skeletal muscle, 17. heart, 18. brain.
  • RNA encoding the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 was evaluated by PCR in the different subpopulations of unstimulated mononuclear cells: T lymphocytes (line 1), B lymphocytes (line 2), NK cells ( lane 3) and monocytes (lane 4) as well as in dendritic cells generated in vitro (lane 5).
  • T lymphocytes line 1
  • B lymphocytes line 2
  • NK cells lane 3
  • monocytes lane 4
  • the integrity of the RNA as well as the quality of the synthesized cDNA are evaluated by amplifying the cDNA encoding the GAPDH molecule.
  • the mRNA encoding the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 in human tumor lines was analyzed by PCR.
  • the cell lines analyzed are line 1: A549, line 2: THP1, line 3: HTB10, line 4: T24, line 5: Daudi, line 6: A427, line 7: U373, line 8: HEP2, line 9: HT29, line 10: BT20.
  • the mRNA coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 is expressed constitutively by different human tumor lines.
  • COS cells were transfected with the vector pCDNA3.1 containing the complete cDNA coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2.
  • Cytoplamic and non-cytoplasmic fractions of the cells were obtained three days after transfection by freezing / thawing .
  • the protein extracts were separated by SDS-PAGE electrophoresis; the expression of the recombinant protein was evaluated by Western Blotting using an anti-c-myc Ab.
  • Line 1 non-cytoplasmic fraction
  • line 2 cytoplasmic fraction.
  • polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 is expressed in the non-cytoplasmic fraction of the transfected cells.
  • sequences which may contain a transmembrane motif have been searched in the databases of expressed EST (Expressed Sequence Tag) sequence labels.
  • EST # AI301140 based on the fact that the translation product has a transmembrane motif (position 14-34 with a prediction score of 1.868) and that the nucleotide sequence is not homologous to any other sequence known.
  • the nucleotide sequence available http://www.ncbi.nih.nlm.gov) presents an open reading frame of 116 amino acids before a stop codon.
  • the complete cDNA sequence was obtained by a series of PCR amplification cycles of the 5 'end (5'RACE) (Frohman, MA, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 8998-9002, 1988) using commercial kits.
  • the DNA templates were cDNA prepared from the human brain and bone marrow (Marathon-Ready cDNA; Clontech).
  • the prediction of a signal peptide has been defined using software available on the web (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP).
  • the molecule has a predicted molecular weight of 113 kDa, a pI of 6.5 as well as 3 possible glycosylation sites (Threonine and Serine residues).
  • a cDNA clone (# AI301140) encoding a molecule exhibiting a transmembrane motif was selected.
  • the sequence SEQ ID No. 1 of cDNA obtained is 3331 base pairs long and does not show any homology with the molecules present in the databases. It presents an open reading frame of 3042 base pairs encoding a putative protein of 1013 amino acids.
  • the initiation codon is located in position nt 45-47 and the stop codon is located in position nt 3084-3086 of the sequence SEQ ID No. 1.
  • sequence SEQ ID No 2 presents a signal peptide of sequence aa 1-41, an extracellular domain of sequence aa 42-911, a transmembrane domain of sequence aa 912-930 and an intracellular domain of sequence aa 931-1013.
  • sequences SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 9 correspond to fragments of the sequence SEQ ID No. 1 not homologous to the EST sequences selected in Example 1.
  • tissue expression of the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 is analyzed by Northern Blotting using commercial membranes which make it possible to evaluate the expression of an mRNA in different tissues (Multiple Tissue Northern or MTN, Clontech).
  • a cDNA fragment corresponding to fragment nt 385-nt 1137 is generated by PCR using specific primers whose sequence is deduced from the sequence SEQ ID No. 1. After purification, 25 ⁇ g of this fragment are radioactively labeled using a commercial kit (Multiprime DNA labeling kit, Amersham, Amrsham, UK) and the radioactive nucleotide [ ⁇ -32P] -dATP.
  • the labeled probe is purified by chromatography.
  • the membranes are preincubated in the SSC 2X solution (300 mM sodium citrate pH 7 - 3M NaCl - 0.1% sodium dodecyl sulfate) for 2 hours at 50 ° C. with stirring. The membrane is then incubated overnight at 50 ° C with shaking with the radiolabelled probe which will have been denatured by heat (10 minutes at 95 ° C). After three washes (15 minutes at 55 ° C with stirring) in a 0.1% SSC 2X-SDS solution. The membranes are exposed to an autoradiographic film (Kodak, Rochester, NY) for 24 hours. Results
  • the Northern Blotting membranes shown in Figures 1A and 1B, show a strong hybridization signal in peripheral blood mononuclear cells and the small intestine; the mRNA encoding the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 is also expressed in the thymus, the spleen, the brain and the lung.
  • the mRNA encoding the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 is preferentially expressed in human lymphoid tissues.
  • EXAMPLE 3 Expression of the mRNA Coding for the Polypeptide of Sequence ID No. 2 in the Different Populations of Circulating Blood iWéf ⁇ oco / og / e
  • CFN Mononuclear cells
  • the CMNs are resuspended at a concentration of 200 x 10 6 cells / ml and mixed with 1 ml of a 50% solution of sheep erythrocytes (BioMérieux, Marcy l'Etoile, France). The cell suspension is incubated at 4 ° C overnight. After a gentle resuspension, the T cells are isolated by centrifugation on a Ficoll-Hypaque gradient (1500 rpm for 30 minutes at room temperature). The sheep erythrocyte-T lymphocyte complexes are collected at the bottom of the tube. The red blood cells are lysed by two successive hypotonic shocks.
  • the purity of the T cells thus isolated, evaluated by labeling with an anti-CD3 FITC antibody is> 95%.
  • the cells are washed in FACS buffer (10 mM phosphate buffer, pH 7.4 containing 1% bovine serum albumin and 0.01% sodium azide) before being distributed in wells of a plate of culture 96 wells with conical bottom (Nunc, Roskilde, Denmark) at a rate of 2 ⁇ 10 5 cells in a volume of 50 ⁇ l of FACS buffer.
  • FACS buffer 10 mM phosphate buffer, pH 7.4 containing 1% bovine serum albumin and 0.01% sodium azide
  • the cells After 20 minutes of incubation at 4 ° C, the cells are washed twice with 200 ⁇ l of FACS buffer and then are resuspended in 200 ⁇ l of this same buffer.
  • the expression of CD3 on the surface of T lymphocytes is analyzed by FACS.
  • the monocytes are purified by a positive selection technique using magnetic beads coated with an anti-human CD14 antibody (MACS TM system; Miltenyi Biotex, Bergish Gladbach, Germany). Briefly, the mononuclear cells (300 x 10 6 / ml) are incubated with 60 ml of a suspension of beads (Miltenyi) at 4 ° C for 15 minutes in PBS / EDTA buffer 2 mM / bovine serum albumin 0.5% (PBS / EDTA / BSA). After washing, the cells are placed on a column subjected to a magnetic field. After three washes with the PBS / EDTA / BSA solution, the column is removed from the magnetic field and the monocytes are collected by gravity. The purity of the monocytes, evaluated by cytometry on the basis of the size / grain size parameters, is greater than 95%.
  • Immature human dendritic cells are generated in vitro from the purified monocytes as described above.
  • the monocytes are cultured at a concentration of 10 6 cells / ml in the following medium (hereinafter called complete culture medium): RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum (heating at 56 ° C. for 30 minutes), 2 mM L-glutamine, 50 U / ml of penicillin and 50 ⁇ g / ml of streptomycin (Life technologies) in 6-well culture plates (Nunc, Roskilde, Denmark) at a rate of 5 ml of medium per well .
  • complete culture medium hereinafter called complete culture medium: RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum (heating at 56 ° C. for 30 minutes), 2 mM L-glutamine, 50 U / ml of penicillin and 50 ⁇ g / ml of streptomycin (Life technologies) in 6-well culture plates (N
  • the cells are activated with 20 ng / ml of recombinant human IL-4 and 20 ng / ml of recombinant human GM-CSF (R&D Systems, Abingdon, United Kingdom). After 6 days of culture (37 ° C, 5% CO 2 in a humid atmosphere), the phenotype of the cells is defined by cytofluorometry by analyzing the expression of the CD1a and CD83 molecules using a labeled anti-human CD1a antibody fluorescein is an anti-human CD83 antibody (Becton Dickinson) which is detected by an anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with fluorescein (Silenus, Hauworth, Australia). Immature dendritic cells are characterized by an expression of the CD1a molecule (average fluorescence intensity (IMF)> 100) and the absence of expression of the CD83 molecule.
  • IMF average fluorescence intensity
  • NK cells (CD56 + / CD3-) are isolated from CMN by cytofluorometry (positive selection) after labeling with an anti-CD56 antibody labeled with fluorescein (Becton Dickinson) and an anti-CD3 antibody labeled with phycoerythrin. Labeling of the cells with the antibody is carried out as described above. The cells are sorted on a FACS Vantage (Becton Dickinson); the purity is> 98%.
  • B lymphocytes are isolated from tonsils collected after surgical excision. Briefly, the tonsils are mechanically ground and then passed through a sieve of porosity 50 ⁇ m. Mononuclear cells are isolated by centrifugation on a Ficoll-Hypaque gradient as described above. T cells are removed from the CMN suspension by the so-called rosette technique, as described above. The purity of the B cell population is evaluated by cytofluorometry using an anti-CD20 antibody labeled FITC; the purity is> 95%. PCR technique The expression of the RNA coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 was analyzed by PCR in the different CMN subpopulations.
  • the cells are washed twice in PBS and then lysed in the extraction medium for Trizol nucleic acids (Life technologies).
  • the proteins are removed by two successive extractions with Phenol / chloroform / isoamylic acid (25: 24: 1) (Life technologies).
  • An equivalent volume of isopropyl alcohol is added to the aqueous phase to precipitate the nucleic acids (overnight at -20 ° C).
  • the nucleic acids are collected by centrifugation (12,000 rpm, 30 minutes at 4 ° C).
  • the pellet is washed once with an ethanol solution at 70 ° C.
  • RNA After denaturation (65 ° C, 10 min), 2 ⁇ g of total RNA are transcribed inversely in using an oligo-dT primer using a commercial kit (Promega, Madison, Ml) according to the manufacturer's recommendations.
  • the cDNA coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 is amplified by PCR using the following primers: 5'-TGACTCGGAATCACCTCCCAGCT-3 '(SEQ ID No. 11) and 5'-CAAGACGGTGAGCAGGATGGCAGTACAG-3' (SEQ ID No. 12).
  • RNA which was used to prepare the cDNAs is analyzed by evaluating the expression of the cDNA encoding the GAPDH molecule using the following primers:
  • the PCR conditions are: 5 min at 95 ° C, 30 cycles: 1 min at 94 ° C, 1 min at 55 ° C and 1 min at 72 ° C, a final extension of 5 min at 72 ° C.
  • the samples are taken up in the sample buffer (0.25% bromophenol blue, 40% sucrose).
  • the samples are analyzed by electrophoresis in 1% agarose gel which contains ethidium bromide. After migration, the samples are visualized by UV illumination of the gel. Results
  • the mRNA encoding the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 is detected by
  • RNA coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 is selectively expressed by the T lymphocytes of the circulating blood.
  • Example 4 The RNA coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 is expressed in different tumor cell lines. Methodology We evaluated the expression of the mRNA coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 in different lines tumor cells. These cell lines were obtained from ATCC and cultured according to the instructions provided. The extraction of total RNA as well as the synthesis of cDNA were carried out as described above. The expression of the RNA coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 and the GAPDH molecule were analyzed by PCR as described above.
  • the PCR experiments reveal that the following human cell lines constitutively express the mRNA coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2: lung adenocarcinoma (line A549), monocyte leukemia (line THP1), neuroblastoma (line HTB10), bladder carcinoma (T24), burkitt lymphoma (Daudi line), lung carcinoma (line A427), glioblastoma (line U373), larynx carcinoma (line HEP2), colon carcinoma (line HT29) and carcinoma of the breast (line BT20).
  • lung adenocarcinoma line A549
  • monocyte leukemia line THP1
  • neuroblastoma line HTB10
  • bladder carcinoma T24
  • burkitt lymphoma Duudi line
  • lung carcinoma line A427)
  • glioblastoma line U373
  • larynx carcinoma line HEP2
  • colon carcinoma line HT29
  • carcinoma of the breast line BT20.
  • RNA coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 is expressed by a number of tumor lines.
  • Example 5 The recombinant polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 is predominantly expressed in the membrane fraction of the transfected COS cells.
  • COS cells are transfected with the vector pCDNA3.1 (Invitrogen) containing the insert coding for the polypeptide with sequence SEQ ID No. 2.
  • This system makes it possible to add a c-myc epitope to the recombinant molecule.
  • the transfection is carried out by the lipofection technique (Fugene; Boehringer Mannheim, Germany). Three days after transfection, the cells are collected and washed three times with PBS. The cells are then subjected to three rapid freezing / thawing series and then centrifuged at 12,000 revolutions per minute (rpm) for 10 min at 4 ° C. The supernatant corresponds to the cytoplasmic fraction and the pellet to the membrane part plus nucleus plus organelles.
  • rpm revolutions per minute
  • the pellet is resuspended in a 10 mM phosphate buffer, pH 7.4 containing 0.5% of Nonidet P40 and a cocktail of protease inhibitors (Boehringer Mannheim, Germany) for 20 minutes at 4 ° C.
  • the cell lysates are then centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C to remove the nuclei.
  • the supernatants corresponding to the membrane and cytoplasmic fractions are taken up in an equivalent volume of 10 mM phosphate buffer containing 0.1% bromophenol blue, 5% glycerol and 0.1% ⁇ -mercaptoethanol.
  • the proteins are then separated according to their molecular weight by polyacrylamide gel electrophoresis (5% concentration gel - 10% separation gel).
  • a quantity of proteins corresponding to 5 x 10 6 cells is deposited in each line. After migration, the proteins are transferred by Western blotting onto a nitrocellulose membrane. After saturation in a phosphate solution containing 10% skim milk, the membranes are incubated overnight at 4 ° C with shaking with an anti-c-myc antibody (clone 9E10; ATCC, Manassas, VA) at a concentration of 10 ⁇ g / ml. After washing with a phosphate buffer containing 10% skimmed milk, the membranes are incubated with an anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with peroxidase (Amersham) for 2 hours at room temperature with shaking. The membranes are washed in phosphate buffer.
  • an anti-c-myc antibody clone 9E10; ATCC, Manassas, VA
  • the attached antibodies are detected by chemiluminescence using the ECL system from Amersham.
  • Results The Western Blotting presented in FIG. 4 indicates that the recombinant protein is mainly expressed in the insoluble fraction of the cellular extracts (cytoplasmic membrane plus intracytoplasmic organelles). This result as well as the prediction of a potential transmembrane domain suggests that the recombinant polypeptide is expressed on the surface of the transfected cells.
  • the recombinant polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 is expressed in the membrane (non-cytoplasmic) fraction of the transfected COS cells.
  • Example 6 The gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No.
  • a genomic DNA sequence with 98% homology to EST # AI301140 was found on a fragment of chromosome 11q at cluster 33-34. Many tumor susceptibility genes have been located in the 11q23 genomic region -40 (Koreth, J., et al., J. Pathol., 187: 28-38, 1999).
  • the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 is located in chromosome 11 region q33-q34. This result makes it possible to confirm that the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 is implicated in the regulation of the immune response and that an alteration of its expression could be associated with immunological disorders capable of inducing a tumor character in cells presenting a abnormal expression of the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2.

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Abstract

L'invention concerne l'identification et la caractérisation d'un nouveau gène exprimé dans des cellules tumorales et impliqué dans la régulation de la réponse immune, le clonage et la caractérisation de son ADNc ainsi que les polypeptides correspondants. L'invention concerne également des vecteurs contenant un acide nucléique codant pour ce gène, des cellules transformées par de tels vecteurs ainsi que des méthodes de diagnostic et des méthodes de sélection d'un composé chimique ou biochimique capable d'interagir directement ou indirectement avec un acide nucléique ou polypeptide selon l'invention. L'invention concerne en outre des composés pour le traitement de pathologies immunes, notamment les maladies autoimmunes et le cancer.

Description

CLONAGE, EXPRESSION ET CARACTERISATION D'UN GENE EXPRIME DANS DES CELLULES TUMORALES ET IMPLIQUE DANS LA REGULATION DE LA REPONSE IMMUNE.
L'invention concerne l'identification et la caractérisation d'un nouveau gène exprimé dans des cellules tumorales et impliqué dans la régulation de la réponse immune, le clonage et la caractérisation de son ADNc ainsi que les polypeptides correspondants. L'invention concerne également des vecteurs contenant un acide nucléique codant pour ce gène, des cellules transformées par de tels vecteurs ainsi que des méthodes de diagnostic et des méthodes de sélection d'un composé chimique ou biochimique capable d'interagir directement ou indirectement avec un acide nucléique ou polypeptide selon l'invention. L'invention concerne en outre des composés pour le traitement de pathologies immunes, notamment les maladies autoimmunes et le cancer.
De nombreux mécanismes cellulaires normaux ou pathologiques mettent en jeu une expression génétique différentielle, certains gènes s'exprimant dans des tissus donnés à des moments spécifiques et/ou selon des intensités particulières.
Parmi ces gènes, les gènes codant pour des protéines transloquées dans des compartiments subcellulaires ou sécrétées à l'extérieur de la cellule pendant ou après le processus traductionnel présentent un grand intérêt. On peut citer notamment les gènes codant pour des protéines de facteur, telles que les cytokines, ou des gènes codant pour des récepteurs membranaires qui constituent des cibles thérapeutiques de choix.
Ces protéines, telles que les protéines membranaires, présentent pour la plupart un domaine N-terminal correspondant à un peptide signal, un domaine extracellulaire et un domaine transmembranaire.
Ainsi, il reste aujourd'hui un grand besoin d'identifier et de caractériser de tels gènes dont l'expression est spécifique de certains tissus ou cellules, notamment de cellules impliquées dans la régulation de la réponse immune ou de cellules à caractère tumoral. Ceci est justement l'objet de la présente invention.
L'invention a ainsi pour objet l'identification et la caractérisation d'un nouveau gène exprimé préférentiellement chez l'homme dans les tissus lymphoïdes, notamment dans les lymphocytes T périphériques non stimulés, et dans des cellules à caractère tumoral, gène dont le produit de traduction est de type membranaire. Sous un premier aspect, la présente invention a pour objet un acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléique choisie parmi le groupe de séquences suivantes : a) la séquence SEQ ID No. 1 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 18 nucléotides consécutifs, de préférence 20, 25, 30, 50, 100 ou 200 nucléotides consécutifs, de la séquence SEQ ID No. 1 délétée de son fragment polyA terminal, de préférence d'undit fragment de la séquence SEQ ID No. 3.SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7 ou SEQ ID No. 9 ; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 99 %, après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b) ; d) la séquence complémentaire ou la séquence de l'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c).
De préférence, la présente invention concerne un acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléique choisie parmi le groupe de séquences suivantes : a) la séquence SEQ ID No. 1 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 18 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID No. 1 délétée de son fragment polyA terminal ; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b) ; d) la séquence complémentaire ou la séquence de l'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c), à l'exception de la séquence SEQ ID No. 11 du document WO 99/54461 , de la séquence SEQ ID No. 51 du document WO 99/06548 et des trois séquences décrites dans les documents de la banque de données EMBL sous les numéros d'identification Al 672868, AA 890726 et Al 301140.
Le document WO 99/54461 est un document brevet qui concerne des séquences d'acides nucléiques exprimées par des tissus d'endomètre tumoraux. Ce document décrit en particulier parmi 635 séquences une séquence nucléique SEQ ID No. 11 et sa séquence peptidique correspondante SEQ ID No. 173 présentant une identité proche de 100 % avec respectivement un fragment de la séquence SEQ ID No. 1 (nt 1597-3313) et de la séquence SEQ ID No. 2 (aa 519-1013) de la présente invention. Ce document indique, page 153, que la séquence peptidique SEQ ID No. 173 ne correspond à aucune séquence dont la fonction est connue. Le document WO 99/06548 est un document relatif à des séquences EST codant pour des protéines sécrétées de tissus non spécifiques. Parmi les 545 séquences décrites dans la liste des séquences de ce document, ce document décrit en particulier la séquence nucléique et peptidique SEQ ID No. 51 dont la séquence aa37-113 (150 acides aminés) présente une très forte homologie avec le fragment aa1-150 de la séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention (identité d'environ 85 % pour le fragment de 150 acides aminés ; ~ 94 % pour les 135 premiers acides aminés). Ce document indique également que l'ADN correspondant à cette séquence 5' EST SEQ ID No. 51 est originaire d'un tissu tumoral de prostate humaine (cf. page 40 de la liste de séquences "original source").
Le document "EMBL" Al 672868 décrit une séquence d'ARNm provenant d'une banque de tissus humains de côlon atteint de la maladie de Crohn, et présentant un taux d'identité important avec la séquence complémentaire du fragment d'ADNc nt 441-971 de la séquence SEQ ID No. 1 selon l'invention. Le document "EMBL" AA890726 décrit une séquence d'ARNm provenant d'une banque de tissus humains de parathyroïde à adénome sporadique, et présentant un taux d'identité important avec la séquence complémentaire du fragment d'ADNc nt 2779-3309 de la séquence SEQ ID No. 1 selon la présente invention.
Enfin, le document "EMBL" Al 301140 décrit une séquence d'ARNm provenant d'une banque de carcinoïde pulmonaire humain de type neuroendocrine décrite, et présentant un taux d'identité important avec la séquence complémentaire du fragment d'ADNc en position nt 2736-3299 de la séquence SEQ ID No. 1 selon l'invention.
Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucleotide, oligonucleotide, séquence de polynucleotide, séquence nucleotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entendra désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brins, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs.
Il doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. De préférence, la longueur de la séquence des acides nucléiques selon la présente invention sera inférieure à 150 kb, de manière encore plus préférée inférieure à 100 kb, 50 kb, 25 kb, 10 kb ou 5 kb.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math., 2:482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol., 48:443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucleotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 99 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entendra désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 99 %, d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences complémentaires sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID No. 1 de l'invention. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 99 % d'identité après alignement optimal entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre.
Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADNs complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.
L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCI + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42°C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucleotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al. (Molecular cloning : a laboratory manual., Sec. Ed., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Parmi les séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 99 %, après alignement optimal avec la séquence selon l'invention, on préfère également les séquences nucléiques variantes de la séquence nucléique SEQ ID No. 1 , ou de ses fragments, c'est-à-dire l'ensemble des séquences nucléiques correspondant à des variants alléliques, c'est-à-dire des variations individuelles de la séquence nucléique SEQ ID No. 1. Ces séquences mutées naturelles correspondent à des polymorphismes présents chez les mammifères, en particulier chez l'être humain et, notamment, à des polymorphismes pouvant conduire à la survenue d'une pathologie. De préférence, la présente invention concerne les séquences nucléiques variantes dans lesquelles les mutations conduisent à une modification de la séquence d'acides aminés du polypeptide, ou de ses fragments, codé par la séquence normale de séquence SEQ ID No. 1. On entendra également désigner par séquences nucléiques variantes tout ARN ou ADNc résultant d'une mutation d'un site d'épissage de la séquence nucléique génomique dont l'ADNc a pour séquence SEQ ID No. 1.
L'invention concerne de préférence un acide nucléique purifié ou isolé selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il est constitué de la séquence SEQ ID No. 1 , de la séquence complémentaire ou de la séquence de l'ARN correspondant de la séquence SEQ ID No. 1, de préférence son fragment codant pour le peptide de séquence SEQ ID No. 2, ou de séquence SEQ ID No. 2 délétée du peptide signai aa1- 41.
L'invention concerne de préférence un acide nucléique purifié ou isolé selon la l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les séquences choisies parmi les séquences suivantes : a) les séquences SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 et SEQ ID No. 19 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 18 nucléotides de la séquence SEQ ID No. 19 ; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b) ; et d) la séquence complémentaire ou la séquence de l'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c). L'invention concerne de préférence un acide nucléique purifié ou isolé selon l'invention, caractérisé en ce que sa séquence est choisie parmi les séquences suivantes : a) SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19 et SEQ ID No. 21 ; b) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ; et c) la séquence complémentaire ou la séquence de l'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a) ou b). Les amorces ou sondes, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'un acide nucléique selon l'invention, font également partie de l'invention.
La présente invention concerne de préférence ainsi les amorces ou les sondes selon l'invention qui peuvent permettre en particulier de mettre en évidence ou de discriminer les séquences nucléiques variantes, ou d'identifier la séquence génomique du gène dont l'ADNc est représentée par la séquence SEQ ID No. 1, en utilisant notamment une méthode d'amplification telle que la méthode PCR, ou une méthode apparentée.
L'invention concerne également l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention comme sonde ou amorce, pour la détection, l'identification, le dosage ou l'amplification de séquence d'acide nucléique.
Selon l'invention, les polynucléotides pouvant être utilisés comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquence nucléique, présenteront une taille minimale de 15 bases, de préférence de 20 bases, ou mieux de 25 à 30 bases. L'ensemble des sondes et amorces selon l'invention pourront être marquées directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
Les séquences de polynucléotides selon l'invention non marquées peuvent être utilisées directement comme sonde ou amorce.
Les séquences sont généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces ou des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le ^P, le ^S, le 3H ou le 125l. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptenes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique de PCR (réaction en chaîne à la polymérase) (Erlich, H. A., New York : Stockton Press, 1989 ; Innis, M.A., et al., Académie Press, 1990 ; et Rolfs, A., et al., Berlin : Springer-Verlag, 1991). Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N° 4,683,202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie echangeuse d'ions, puis séquences. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée en utilisant comme amorce les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention comme matrice, des plasmides contenant ces séquences ou encore les produits d'amplification dérivés. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés.
L'invention vise également les acides nucléiques susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide d'amorces selon l'invention. D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues, en général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription reverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker, G.T., et al., Nucleic Acids Res., 20:1691-1696, 1992), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh, D.Y., et al. en 1989 (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:1173-1177), la technique 3SR (Self-Sustained Séquence Replication) décrite par Guatelli, J.C., et al. en 1990 (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:1874-1878, et Cell, 85:281-290, 1996), la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) décrite par Kievitis, T., et al. en 1991 (J. Virol., Methods, 35:273-286), la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren, U., et al. en 1988 (Science, 241:1077-1080) et perfectionnée par Barany, F. en 1991 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193), qui emploie une ligase thermostable, la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev, D. en 1992 (Kessler C. Springer Verlag, Berlin, New York, 197-205), la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck, P., et al. en 1990 (Biotechniques, 9:142- 147), la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele, E.A., et al. en 1983 (J. Mol. biol., 171:281-295) et perfectionnée notamment par Chu, B.C.F., et al. en 1986 (Nucleic Acids Res., 14:5591-5603) et Lizardi, P.M., et al. en 1988 (Bio/technology, 6:1197-1202), puis par Burg, J.L ét al. (Mol. and Cell. Probes, 10:257- 271) ainsi que par Stone, B.B., ét al. (Mol. and Cell. Probes, 10:359-370) en 1996.
Dans le cas où le polynucleotide cible à détecter est un ARNm, on utilisera avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en oeuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase reverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention. La technique d'hybridation de sondes peut être réalisée de manières diverses
(Matthews, J.A., et al., Anal. Biochem., 169:1-25, 1988). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tels que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).
Selon un autre mode de mise en oeuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sonde de capture. Dans ce cas, une sonde, dite « sonde de capture », est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite « sonde de détection », marquée par un élément facilement détectable.
Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants, il faut ainsi citer en particulier les oligonucleotides anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucleotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression. Sous un autre aspect, l'invention comprend une méthode pour le criblage de banques d'ADNc ou d'ADN génomique, ou pour le clonage d'ADNc ou génomique isolé, caractérisée en ce qu'elle met en œuvre une séquence nucléique selon l'invention.
Parmi ces méthodes, on peut citer notamment : - le criblage de banques d'ADNc et le clonage des ADNc isolés (Sambrook, J., et al., 1989 ; Suggs, S.V., et al., PNAS 78:6613-6617, 1981 ; Woo, S.L.C., Methods Enzymol., 68:389, 1979), à l'aide des séquences nucléiques selon l'invention ; - le criblage de banques génomiques, par exemple de BACs (Chumakov, I.M., et al., 1992 ; Chumakov, I.M., et al., Nature, 377:175-183, 1995) et éventuellement une analyse génétique en FISH (Cherif, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:6639- 6643, 1990) à l'aide de séquences selon l'invention, permettant l'isolement et la localisation chromosomique, puis le séquençage complet du gène dont l'ADNc à pour séquence la séquence SEQ ID No. 1.
En particulier, ces méthodes selon l'invention pourront être mises en oeuvre pour l'identification et ainsi l'obtention d'ADNc de variants nucléiques.
Ces méthodes de criblage et/ou de clonage comprendront en particulier une étape d'hybridation d'un acide nucléique selon l'invention avec un acide nucléique contenu dans une banque génomique ou d'ADNc.
L'invention comprend aussi une méthode d'identification des séquences d'acide nucléique promotrices et/ou régulatrices de l'expression du gène dont l'ADNc a pour séquence la SEQ ID No. 1, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un acide nucléique selon l'invention.
Les outils informatiques à la disposition de l'homme du métier lui permettent aisément d'identifier à partir des séquences nucléiques génomiques selon l'invention les boîtes régulatrices promotrices nécessaires et suffisantes au contrôle de l'expression génique, notamment les boîtes TATA, CCAAT, GC, ainsi que les séquences régulatrices stimulatrices (« enhancer ») ou inhibitrices (« silencers ») qui contrôlent en CIS l'expression des gènes selon l'invention ; parmi ces séquences régulatrices, il convient de citer TIRE, MRE, CRE. L'invention concerne également des méthodes pour l'identification de mutations portées par le gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, notamment de mutations responsables, caractérisées en ce qu'elles mettent en œuvre une séquence nucléique selon l'invention. L'invention concerne particulièrement une méthode pour l'identification d'un acide nucléique d'au moins 18 nucléotides consécutifs de la séquence du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, ledit acide nucléique comportant au moins une mutation, de préférence responsable de l'expression anormale dudit gène, caractérisée en ce qu'elle met en œuvre une séquence nucléique selon l'invention. Ces méthodes d'identification de ces mutations comprendront en particulier les étapes suivantes : (i) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARNm de l'échantillon biologique ; (ii) amplification spécifique de l'ADN cible susceptible de présenter une mutation à l'aide d'amorces selon l'invention ; (iii) analyse des produits d'amplification, notamment la taille et/ou la séquence des produits d'amplification, par rapport à une séquence de référence.
Font également partie de l'invention, les séquences promotrices et/ou régulatrices dudit gène selon l'invention présentant des mutations susceptibles de modifier l'expression de la protéine correspondante.
Les acides nucléiques caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par une des méthodes précédentes selon l'invention, ou les acides nucléiques capables de s'hybrider dans des conditions de forte stringence (pourcentage d'identité d'au moins 80 % entre une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre) avec lesdits acides nucléiques, font partie de l'invention, notamment les acides nucléiques de variants alléliques du gène dont l'ADNc a pour séquence la SEQ ID No. 1 , ainsi que les séquences génomiques des gènes homologues d'autres mammifères tels que la souris.
L'utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention comme sonde ou amorce pour le criblage de banque génomique ou d'ADNc fait bien entendu partie de l'objet de la présente invention. Sous un autre aspect, l'invention comprend un polypeptide purifié ou isolé codé par un acide nucléique selon l'invention.
Dans la présente description, on utilisera le terme polypeptide pour désigner également une protéine ou un peptide. De préférence, la présente invention concerne un polypeptide purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés choisie parmi le groupe suivant : a) la séquence SEQ ID No. 2 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 6, 10, 15, 30 ou 50 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 2, de préférence d'undit fragment de la séquence SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8 ou SEQ ID No. 10 ; c) une séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins
80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 99 %, après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b).
De manière également préférée, l'invention a pour objet un polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID No. 2, de séquence SEQ ID No. 2 délétée du fragment aa1-41 , ou une séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 99 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 2.
L'analyse de la séquence protéique prédit que le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 présente un peptide signal dont la séquence est comprise entre les positions aa 1-41 , un domaine extracellulaire dont la séquence est comprise entre les positions aa 42-911 , un domaine transmembranaire dont la séquence est comprise entre les positions aa 912-930 et un domaine intracellulaire dont la séquence est comprise entre les positions aa 931-1013 sur la séquence SEQ ID No. 2.
Parmi les polypeptides selon l'invention, on préfère également le polypeptide dont la séquence est comprise entre les positions aa 42-911de la séquence SEQ ID No. 2 correspondant au domaine extramembranaire ou tout fragment d'au moins 6, 10, 15, 30 ou 50 acides aminés consécutifs de ladite séquence aa 42-911 , de préférence consécutifs de la séquence SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8 ou SEQ ID No. 10.
L'invention concerne de préférence un polypeptide purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés choisie parmi le groupe suivant : a) la séquence SEQ ID No. 2 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 6 acides aminés de la séquence SEQ ID No. 22, de préférence de la séquence SEQ ID No. 20 ; et c) une séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b). L'invention concerne de préférence un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce que sa séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4,
SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID
No. 20, SEQ ID No. 22 ou une séquence présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec ces séquences.
Il doit être compris que l'invention ne concerne pas les polypeptides sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement. En effet, l'invention concerne les peptides obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, ou encore par synthèse chimique et pouvant alors comporter des amino-acides non naturels. La production d'un polypeptide recombinant, qui peut être réalisée en utilisant l'une des séquences nucléotidiques selon l'invention est particulièrement avantageuse car elle permet d'obtenir un niveau de pureté accrue du polypeptide désiré.
Par polypeptide dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 99 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entendra désigner les polypeptides présentant certaines modifications par rapport au polypeptide de référence, comme en particulier une ou plusieurs délétions, troncations, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une ou plusieurs substitutions. Parmi les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 99 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 2 ou avec l'un de ses fragments selon l'invention, on préfère les polypeptides variants codés par les séquences nucléiques variantes telles que précédemment définies, en particulier les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présente au moins une mutation correspondant notamment à une troncation, délétion, substitution et/ou addition d'au moins un résidu d'acide aminé par rapport à la séquence SEQ ID No. 2 ou avec l'un de ses fragments, de manière plus préférée les polypeptides variants présentant une mutation liée à une pathologie. L'invention comprend également les vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention.
Les vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils comportent les éléments permettant l'expression et/ou la sécrétion desdites séquences dans une cellule hôte, ou encore une séquence d'adressage cellulaire, font également partie de l'invention. Les vecteurs caractérisés en ce qu'ils comportent une séquence de promoteur et/ou de régulateur selon l'invention, font également partie de l'invention.
Lesdits vecteurs comporteront de préférence un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Ils doivent pouvoir être maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilisera de préférence en fonction de la cellule hôte, des systèmes de type plasmidique ou viral, les vecteurs viraux pouvant notamment être des adénovirus (Perricaudet, M., et al., La Recherche, 23:471-473, 1992), des rétrovirus, des lentivirus, des poxvirus ou des virus herpétiques (Epstein, A., Médecine/Sciences, 8:902-911, 1992). L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes.
Lorsque l'on souhaitera l'intégration de la séquence dans les chromosomes de la cellule hôte, on pourra utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou viral ; de tels virus seront, par exemple, les rétrovirus (Temin, H. M., Retrovirus vectors for gène transfer, In Kucherlapati R., éd. Gène Transfer, New York, Plénum Press,
149-187, 1986), ou les AAV (Carter, B.J., Curr. Op. Biotechnology, 3:533-539, 1993).
Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN nu ou l'ARN nu selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préférée les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple la lipofection, Pélectroporation, le choc thermique.
L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, transformées par les vecteurs selon l'invention ainsi que les animaux transgéniques, excepté l'Homme, comprenant une desdites cellules transformées selon l'invention.
Parmi les cellules utilisables à ces fins, on peut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins, P.O., et al., Curr. Op. Biotechnology, 4:520-525, 1993), mais également les cellules de levure (Buckholz, R.G., Curr. Op., Biotechnology, 4:538-542, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards, OP., et al., Curr. Op. Biotechnology, 4:558-563, 1993), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO), mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en œuvre des baculovirus par exemple (Luckow, V.A., Curr. Op. Biotechnology, 4:564-572, 1993). Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules COS.
Parmi les mammifères selon l'invention, on préférera des animaux tels que les souris, les rats ou les lapins, exprimant un polypeptide selon l'invention. Parmi les mammifères selon l'invention, on préférera également des animaux tels que les souris, les rats ou les lapins, caractérisés en ce que le gène codant pour la protéine de séquence SEQ ID No. 2, ou dont la séquence est codée par le gène homologue pour ces animaux, n'est pas fonctionnel, est invalidé ou présente au moins une mutation. Ces animaux transgéniques sont obtenus par exemple par recombinaison homologue sur cellules souches embryonnaires, transfert de ces cellules souches à des embryons, sélection des chimères affectées au niveau des lignées reproductrices, et croissance desdites chimères.
Ces animaux transgéniques (de préférence souris) pourront surexprimer le gène codant pour la protéine selon l'invention, ou leur gène homologue, ou exprimer ledit gène dans lequel pourra être introduite une mutation. Ces animaux transgéniques, en particulier des souris, sont obtenus par exemple par transfection de copie de ce gène sous contrôle d'un promoteur fort de nature ubiquitaire, ou sélectif d'un type de tissu, ou après transcription virale. Ces animaux transgéniques (de préférence souris) pourront être rendus déficients pour le gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID N° 2, ou leur gène homologue, par inactivation à l'aide du système LOXP/CRE recombinase (Rohlmann, A., et al., Nature Biotech., 14:1562-1565, 1996) ou de tout autre système d'inactivation de l'expression de ce gène. Les cellules et mammifères selon l'invention sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide selon l'invention, comme décrit ci-dessous, et peuvent également servir à titre de modèle d'analyse.
Les cellules ou mammifères transformés tels que décrits précédemment peuvent être ainsi utilisés à titre de modèles afin d'étudier les interactions entre les polypeptides selon l'invention, et les composés chimiques ou protéiques, impliqués directement ou indirectement dans les activités des polypeptides selon l'invention, ceci afin d'étudier les différents mécanismes et interactions mis en jeu.
Surtout, ils peuvent être utilisés pour la sélection de produits interagissant avec les polypeptides selon l'invention, notamment la protéine de séquence SEQ ID No. 2 ou ses variants selon l'invention, à titre de cofacteur, ou d'inhibiteur, notamment compétitif, ou encore ayant une activité agoniste ou antagoniste de l'activité des polypeptides selon l'invention. De préférence, on utilisera lesdites cellules transformées ou animaux transgéniques à titre de modèle notamment pour la sélection de produits permettant de lutter contre les pathologies liées à une expression anormale de ce gène.
L'invention concerne également l'utilisation de cellule, de mammifère bu de polypeptide selon l'invention pour le criblage de composé chimique ou biochimique pouvant interagir directement ou indirectement avec les polypeptides selon l'invention, et/ou capable de moduler l'expression ou l'activité de ces polypeptides.
L'invention concerne également l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention pour la synthèse de polypeptides recombinants.
La méthode de production d'un polypeptide de l'invention sous forme recombinante est elle-même comprise dans la présente invention, et se caractérise en ce que l'on cultive les cellules transformées, notamment les cellules ou mammifères de la présente invention, dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant codé par une séquence d'acide nucléique selon l'invention, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
Les polypeptides recombinants, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par ladite méthode de production, font également partie de l'invention.
Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci-dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle.
Les séquences des polypeptides recombinants peuvent être également modifiées afin d'améliorer leur solubilité, en particulier dans les solvants aqueux. De telles modifications sont connues de l'homme de l'art comme par exemple la délétion de domaines hydrophobes ou la substitution d'acides aminés hydrophobes par des acides aminés hydrophiles.
Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences d'acide nucléique définies ci-dessus, selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur et d'une cellule hôte selon l'invention.
Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucleotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucleotidique transfectée. Les procédés de purification de polypeptide recombinant utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques, etc..
Les polypeptides selon la présente invention peuvent être obtenus par synthèse chimique et ce en utilisant l'une des nombreuses synthèses peptidiques connues, par exemple les techniques mettant en oeuvre des phases solides ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique.
La technique de synthèse en phase solide est bien connue de l'homme du métier. Voir notamment Stewart, J.M., et al. (Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem., Company, Rockford, 111 , 2ème éd., 1984) et Bodansky, M. (Principles of peptide synthesis, 1984). Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondants sont également compris dans l'invention.
Les anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'invention, font partie de l'invention, ainsi que lesdits anticorps ou leurs fragments capables de reconnaître le polypeptide de séquence SEQ ID No. 173 du document WO 99/54461 ou de séquence SEQ ID No. 51 du document WO 99/06548.
Des anticorps polyclonaux spécifiques peuvent être obtenus à partir d'un sérum d'un animal immunisé contre les polypeptides selon l'invention, notamment produit par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, selon les modes opératoires usuels.
On notera notamment l'intérêt d'anticorps reconnaissant de façon spécifique certains polypeptides, variants, ou leurs fragments immunogènes, selon l'invention.
Les anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement le domaine extramembranaire du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 sont particulièrement préférés.
Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kόhler et Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).
Les anticorps selon l'invention sont, par exemple, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. L'invention concerne également des méthodes pour la détection et/ou la purification d'un polypeptide selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en œuvre un anticorps selon l'invention.
L'invention comprend en outre des polypeptides purifiés, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par une méthode selon l'invention. Par ailleurs, outre leur utilisation pour la purification des polypeptides, les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent également être utilisés pour la détection de ces polypeptides dans un échantillon biologique.
Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immunocytochimique ou immuno- histochimique de l'expression des polypeptides selon l'invention, notamment le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 ou l'un de ses variants, sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoconjugués enzymatiques.
Ils pourront permettre notamment de mettre en évidence une expression anormale de ces polypeptides dans les tissus ou prélèvements biologiques. Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en œuvre dans toute situation où l'expression d'un polypeptide selon l'invention, normal ou muté, doit être observée.
Font également partie de l'invention, les méthodes de détermination d'une variabilité allélique, d'une mutation, d'une délétion, d'une perte d'hétérozygotie ou de toute anomalie génétique du gène selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre une séquence d'acide nucléique ou un anticorps selon l'invention.
De préférence, l'invention concerne une méthode de diagnostic de maladie associée à la présence d'au moins une mutation sur une séquence du gène selon l'invention à partir d'un prélèvement biologique d'un patient, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) le cas échéant, isolement de l'ADN génomique à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ; b) amplification spécifique de ladite séquence d'ADN du gène susceptible de contenir une mutation à l'aide d'amorces selon l'invention ; c) analyse des produits d'amplification obtenus et comparaison de leur séquence avec la séquence normale.
L'invention comprend également une méthode de diagnostic de maladie associée à une expression anormale d'un polypeptide selon l'invention, notamment le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 ou l'un de ses variants, caractérisée en ce que l'on met en contact un ou des anticorps selon l'invention avec le matériel biologique à tester, dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre ledit polypeptide et le ou lesdits anticorps, et en ce que l'on détecte et/ou quantifie les complexes immunologiques éventuellement formés. Ces méthodes de diagnostic visent par exemple les méthodes de diagnostic de maladies associées à une expression anormale du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, telle qu'une surexpression ou une répression, en déterminant à partir d'un prélèvement biologique du patient la présence en quantité anormale d'une séquence selon l'invention. Les séquences d'acides nucléiques analysées pourront aussi bien être de l'ADN génomique, de l'ADNc, ou de l'ARNm.
Les méthodes permettant de mettre en évidence une mutation dans un gène par rapport au gène sauvage sont, bien entendu, très nombreuses. On peut essentiellement les diviser en deux grandes catégories. Le premier type de méthode est celui dans lequel la présence d'une mutation est détectée par comparaison de la séquence mutée avec la séquence correspondante sauvage, et le second type est celui dans lequel la présence de la mutation est détectée de façon indirecte, par exemple par évidence de mésappariements dus à la présence de la mutation.
Ces méthodes peuvent mettre en oeuvre les sondes et amorces de la présente invention. Il s'agit généralement de séquences nucléiques d'hybridation purifiées comprenant au moins 15 nucléotides, de préférence 20, 25 ou 30 à 200 nucléotides, caractérisées en ce qu'elles peuvent s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléique selon l'invention.
De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques sont telles que celles définies précédemment ou dans les exemples. Parmi les méthodes de détermination d'une variabilité allélique, d'une mutation, d'une délétion, ou d'une anomalie génétique, on préfère les méthodes comprenant au moins une étape d'amplification dite par PCR (réaction en chaîne par la polymérase) ou par PCR-like de la séquence cible selon l'invention susceptible de présenter une anomalie à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Les produits amplifiés pourront être traités à l'aide d'enzyme de restriction approprié avant de procéder à la détection ou au dosage du produit ciblé.
Les mutations du gène selon l'invention peuvent être responsables de différentes modifications de son produit de traduction, modifications utilisables pour une approche diagnostique. En effet, les modifications d'antigénicité liées à ces mutations peuvent permettre la mise au point d'anticorps spécifiques. La discrimination du produit de gène muté peut être réalisée par ces méthodes. Toutes ces modifications peuvent être utilisées dans une approche diagnostique grâce à plusieurs méthodes bien connues basées sur l'utilisation d'anticorps mono- ou polyclonaux reconnaissant le polypeptide normal ou des variants mutés, comme par exemple par RIA ou par ELISA.
Sous un autre aspect, l'invention comprend une méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables d'interagir directement ou indirectement avec les polypeptides selon l'invention, notamment le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, ou avec les acides nucléiques selon l'invention, et/ou permettant de moduler l'expression ou l'activité des polypeptides selon l'invention.
Ainsi, l'invention comprend une méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables d'interagir in vitro ou in vivo avec une séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'une cellule exprimant normalement ou anormalement le gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 avec un composé candidat, et la détection directe ou indirecte d'une modification de l'expression ou de l'activité du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2.
Le criblage peut être utilisé pour tester des composés capables de modifier le niveau et/ou la spécificité d'expression des polypeptides selon l'invention, notamment le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, soit en se liant compétitivement aux sites de liaison des facteurs de transcription situés dans le promoteur du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, soit en se liant directement aux facteurs de transcription.
Le niveau d'expression du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 et sa localisation peut être analysé par hybridation en solution avec de grandes sondes comme indiqué dans le brevet PCT WO 97/05277.
Une analyse quantitative de l'expression du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 peut aussi être réalisée en utilisant des matrices à ADN, pouvant inclure tout ou partie de la séquence de l'ADNc de séquence SEQ ID No. 1 de la présente invention, et présentant une longueur suffisante pour permettre une détection spécifique de l'expression des ARNm capables de s'y hybrider. De préférence, les fragments comprennent au moins 15, 25, 50, 100 ou 500 nucléotides consécutifs des séquences nucléiques dont ils sont issus comme décrit dans Schena, ét al. (Science, 270:467-470, 1995). Une analyse quantitative de l'expression du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention peut également être réalisée avec des ADNs selon l'invention sur des matrices à ADN selon la description de Pietu et al. (1996). Les ADNs selon l'invention ou leurs fragments sont amplifiés par PCR et fixés sur des membranes. Les ARNm provenant de différents tissus ou cellules sont marqués avec des nucléotides radioactifs. Après hybridation et lavage dans des conditions contrôlées, les ARNm hybrides sont détectés avec un Phosphor Imager ou par autoradiographie. Les expériences sont effectuées en double et une analyse quantitative des ARNm différentiellement exprimés peut être effectuée.
Les techniques mentionnées ci-dessus permettent l'analyse des niveaux d'expression du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention, dans une même cellule ou un même tissu selon des conditions différentes, par exemple d'induction ou de non induction, mais aussi l'analyse de la spécificité tissulaire de cette expression, dans des conditions qui peuvent également varier.
Un autre aspect de la présente invention concerne des méthodes d'identification de molécules capables de se lier avec les polypeptides selon l'invention, notamment le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2. De telles molécules peuvent être utilisées pour moduler l'activité biologique de ces polypeptides. Par exemple, de telles molécules peuvent être utilisées pour stimuler ou réduire l'activité de ces polypeptides. Ainsi, l'invention comprend une méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables de moduler l'activité du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'un polypeptide selon l'invention ou d'une cellule selon l'invention, avec un composé candidat et, la détection d'une modification de l'activité du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2. L'invention a également pour objet une méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques in vivo ou in vitro capables de se lier avec le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'un polypeptide selon l'invention ou d'une cellule selon l'invention, avec un composé candidat, et la détection de la formation d'un complexe entre le composé candidat et ledit polypeptide.
Il existe de nombreuses méthodes pour identifier des ligands du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention.
Par exemple, mais sans s'y limiter, on peut citer une méhode d'identification de molécules capables d'interagir avec le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 utilisant un système de double hybride bactérien ou levure tel que le Matchmaker Two Hybrid System 2, selon les instructions du manuel accompagnant le Matchmaker Two Hybrid System 2 (Catalogue N° K1604-1 , Clontech).
Pour étudier l'interaction du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 avec des petites molécules telles que celles générées par chimie combinatoire, il est possible d'utiliser une microdialyse couplée à une HPLC comme décrit dans Wang et al. (Chromatographia, 44:205-208, 1997), ou une électrophorèse capillaire d'affinité comme décrit dans Busch et al. (J. Chromatogr., 777:311-328, 1997).
Dans d'autres méthodes, les peptides ou petites molécules susceptibles d'interagir avec le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention, peuvent être liés à des marqueurs détectables tels que des marqueurs radioactifs, fluorescents ou enzymatiques. Ces molécules marquées sont mises en contact avec ledit polypeptide selon l'invention immobilisé, dans des conditions permettant une interaction spécifique. Après élimination des molécules non-fixées spécifiquement, les molécules liées sont détectées par des moyens appropriés. La technologie du B1ACORE peut également être utilisée pour effectuer le criblage de composés capables d'interagir avec le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2. Cette technologie, décrite dans Szabo, A., et al. (Curr. Opin. Struct. Biol., 5:699- 705, 1995) permet de détecter des interactions entre molécules en temps réel sans utilisation de marquage. Elle est basée sur le phénomène de SPR (surface plasmon résonance). Un des principaux avantages de cette méthode est qu'elle permet la détermination des constantes d'association entre le le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 et les molécules interagissant. Ainsi, il est possible de sélectionner spécifiquement les molécules interagissant avec de fortes ou de faibles constantes d'association.
Les protéines ou autres molécules interagissant avec le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention, peuvent être identifiées en utilisant des colonnes d'affinité qui contiennent ledit polypeptide ou l'un de ses fragments selon l'invention. Ledit polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, ou l'un de ses fragments, peut être attaché à la colonne en utilisant des techniques conventionnelles incluant le couplage chimique à une matrice de colonne appropriée telle que l'agarose, Affi Gel, ou d'autres matrices connues de l'homme de l'art. Dans un autre aspect de l'invention, la colonne d'affinité peut contenir des protéines chimériques dans lesquelles ledit polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 , ou l'un de ses fragments, serait fusionné par exemple avec la gluthation S-transférase. Les molécules à tester décrites ci-dessus sont ensuite déposées sur la colonne. Les molécules interagissant avec ledit polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 sont retenues par la colonne et peuvent être isolées par élution.
L'invention concerne également une méthode de criblage et/ou de sélection de composés interagissant avec les séquences promotrices et/ou régulatrices du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention.
Les acides nucléiques codant pour des protéines interagissant avec les séquences promotrices et/ou régulatrices du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention, peuvent être criblés et/ou sélectionnés en utilisant un système de simple hybride tel que celui décrit dans le manuel accompagnant le kit Matchmaker One-Hybrid System de Clontech (Catalog N° K1603).
La sélection de composés capables de modifier l'expression du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention en se fixant à ses séquences régulatrices et/ou promotrices peut aussi être réalisée à l'aide de gènes «reporter» tels que la phosphatase alkaline, la β-galactosidase, ou la GFP (green fluorescent protein). L'effet de composés candidats sur l'expression issue des séquences régulatrices et/ou promotrices du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention peut ainsi être évalué.
Sous un autre aspect, l'invention comprend l'utilisation d'acide nucléique ou de polypeptide selon l'invention, d'une cellule selon l'invention, ou d'un mammifère selon l'invention, pour l'étude de l'expression ou de l'activité du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention, et/ou des interactions, directes ou indirectes, entre ledit polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, et des composés chimiques ou biochimiques pouvant être impliqués dans son activité. Les composés chimiques ou biochimiques caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés par lesdites méthodes définies ci-dessus font également partie de l'invention.
Parmi ces composés, on préfère les composés chimiques ou biochimiques permettant de moduler l'expression ou l'activité du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention.
On entend désigner par composés permettant de moduler l'expression ou l'activité du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention, les composés qui permettent notamment de réduire, de stabiliser ou d'augmenter la quantité ou la spécificité du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention, ou de favoriser ou d'inhiber l'activité globale ou l'activité d'un des domaines spécifiques dudit polypeptide ou encore de rétablir l'expression normale dudit gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention dans le cas, par exemple, où une anomalie génétique est constatée.
Ces composés pourront par exemple interagir en tant que ligands spécifiques dudit polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention ou d'un de ses domaines à titre de cofacteur, ou d'inhibiteur, notamment compétitif, ou encore ayant une activité agoniste ou antagoniste de l'activité dudit polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention. Ces composés pourront également interagir soit en neutralisant les ligands spécifiques naturels dudit polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention et en inhibant ainsi l'activité dudit polypeptide induite par ces ligands, soit en neutralisant le site de fixation de ces ligands naturels.
L'invention comprend les composés selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont des agonistes ou des antagonistes de l'activité du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention. L'invention comprend en outre des composés selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont capables de se fixer sur un polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention.
En particulier, parmi ces composés selon l'invention, on préfère les composés caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi :
- un anticorps selon l'invention,
- un polypeptide selon l'invention, dont les polypeptides de séquence SEQ ID No. 173 et SEQ ID No. 51 respectivement décrits dans les documents WO 99/54461 et WO 99/06458, - un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il correspond à un fragment ou à la fraction soluble du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention,
- un acide nucléique selon l'invention, dont l'acide nucléique de séquence SEQ ID No. 11 du document WO 99/54461 , de séquence ID No. 51 du document WO 99/06548, de séquence Al 672868, AA 890726 ou Al 30140 des documents EMBL de numéro d'identification correspondant, sens ou antisens, et
- un vecteur selon l'invention.
Sous un autre aspect, l'invention comprend des composés selon l'invention, à titre de médicament pour la prévention et/ou le traitement de pathologies liées à une anomalie de l'expression et/ou de l'activité du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 selon l'invention.
En particulier, l'invention comprend des composés selon l'invention, à titre de médicament pour la prévention et/ou le traitement de pathologies immunes, notamment pour la prévention et/ou le traitement des maladies autoimmunes ou des cancers.
L'invention comprend enfin des composés selon l'invention, à titre de médicament pour la prévention et/ou le traitement des infections de type virale, fongique, bactérienne ou parasitaire.
Les composés de l'invention en tant que principes actifs de médicament, seront preferentiellement sous forme soluble, associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale. Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids coφorel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc..
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après.
LEGENDES DES FIGURES
Figures 1A et 1B :
L'expression de l'ARN codant pour le peptide de séquence SEQ ID No. 2 a été analysée par Northern Blotting à l'aide de membranes commerciales (Multiple Tissue Northern ; Clontech, Palo Alto, CA). Les résultats représentatifs obtenus avec deux membranes différentes sont présentés. 1. foie foetal, 2. moelle osseuse, 3. cellules mononucléées, 4. thymus, 5. ganglions périphériques, 6. rate, 7. cellules mononucléées, 8. poumon, 9. placenta, 10. intestin grêle, 11. foie, 12. rein, 13. rate, 14. thymus, 15. côlon, 16. muscle squelettique, 17. coeur, 18. cerveau.
L'ARNm codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 est exprimé dans les cellules mononucléées, la rate, le poumon et le petit intestin. Figure 2 :
L'expression de l'ARN codant le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 a été évaluée par PCR dans les différentes sous populations de cellules mononucléées non stimulées : lymphocytes T (ligne 1), lymphocytes B (ligne 2), cellules NK (ligne 3) et monocytes (ligne 4) ainsi que dans les cellules dendritiques générées in vitro (ligne 5). L'intégrité de l'ARN ainsi que la qualité de l'ADNc synthétisé sont évaluées en amplifiant l'ADNc codant pour la molécule GAPDH.
L'ARNm codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 est exprimé dans les cellules mononucléées, la rate, le poumon et le petit intestin. Figure 3 :
L'ARNm codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 dans lignées tumorales humaines a été analysé par PCR. Les lignées cellulaires analysées sont ligne 1 : A549, ligne 2 : THP1, ligne 3 : HTB10, ligne 4 : T24, ligne 5 : Daudi, ligne 6 : A427, ligne 7 : U373, ligne 8 : HEP2, ligne 9 : HT29, ligne 10 : BT20. L'ARNm codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 est exprimé constitutivement par différentes lignées tumorales humaines. Figure 4 :
Les cellules COS ont été transfectées avec le vecteur pCDNA3.1 contenant 5 l'ADNc complet codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2. Des fractions cytoplamiques et non cytoplasmiques des cellules ont été obtenues trois jours après la transfection par congélation/décongélation. Les extraits protéiques ont été séparés par électrophorèse SDS-PAGE ; l'expression de la protéine recombinante a été évaluée par Western Blotting à l'aide d'un Ac anti-c-myc. Ligne 1 : fraction non cytoplasmique, 10 ligne 2 : fraction cytoplasmique.
Le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 est exprimé dans la fraction non cytoplasmique des cellules transfectées.
Exemple 1. Clonage de l'ADNc codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID
15 No. 2
Dans le but d'identifier de nouvelles molécules exprimées sélectivement à la surface des cellules humaines, les séquences pouvant contenir un motif transmembranaire ont été recherchées dans les banques de données d'étiquettes de séquences exprimées EST (Expressed Séquence Tag) humaines.
20 Méthodologie
L'identification de séquences ESTs humaines codant pour des motifs transmembranaires potentiels a été réalisée à l'aide du logiciel TopPred 2 (logiciel de prédiction de protéines membranaires) qui est disponible sur le Web (http://www.biokemi.su.se/TopPred2). Parmi les nombreuses séquences obtenues,
25 nous avons sélectionné l'EST #AI301140 basé sur le fait que le produit de traduction présente un motif transmembranaire (position 14-34 avec un score de prédiction de 1 ,868) et que la séquence nucleotidique n'est homologue à aucune autre séquence connue. La séquence nucleotidique disponible (http://www.ncbi.nih.nlm.gov) présente un cadre de lecture ouvert de 116 acides aminés avant un codon stop. Nous avons
30 ensuite recherché des homologues de la séquence #AI301140 dans la banque de données EST humaines. 18 nouvelles séquences nucléotidiques ont ainsi été sélectionnées sur la base d'une homologie avec la séquence #AI301140. Les clones ont été obtenus auprès de Research Genetics (New York, NY). Les clones bactériens ont été sélectionnés à l'aide de l'antibiotique approprié. L'ADN plasmidique a été purifié
35. à l'aide d'un kit commercial (Midiprep DNA extraction kit, Qiagen, Germany) et séquence en utilisant le kit ABI Prism BigDye Terminator DNA kit (Perkin Elmer Applied Biosystems, Warrington, UK) en suivant les recommandations du fournisseur. La séquence a été analysée avec un séquenceur automatique ABI Prism 377 (Perkin Elmer Applied Biosystems). Les séquences ont été analysées grâce au logiciel d'analyse de séquence Sequencher (Genecodes, Ann Arbor, Ml). Après alignement des différentes séquences, un fragment d'ADN de 1100 paires de bases présentant un cadre ouvert de lecture contenant le codon stop et la queue poly-A a été défini. Ce fragment a été amplifié par PCR à l'aide d'amorces spécifiques correspondant aux extrémités 5' et 3' de la séquence alignée. La séquence d'ADNc complète a été obtenue par une série de cycles d'amplification par PCR de l'extrémité 5' (5'RACE) (Frohman, M.A., ét al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8998-9002, 1988) à l'aide de kits commerciaux. Les matrices d'ADN étaient de l'ADNc préparé à partir de cerveau et de moelle osseuse humaine (Marathon-Ready cDNA ; Clontech). La prédiction d'un peptide signal a été définie à l'aide d'un logiciel disponible sur le Web (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP). La molécule présente un poids moléculaire prédit de 113 kDa, un pi de 6,5 ainsi que 3 sites possibles de glycosylation (résidus Thréonine et Serine ). Résultats
Par analyse des banques de données EST humaines disponibles, un clone d'ADNc (#AI301140) codant pour une molécule présentant un motif transmembranaire a été sélectionné. La séquence SEQ ID No. 1 d'ADNc obtenue est longue de 3331 paires de bases et ne présente aucune homologie avec des molécules présentes dans les banques de données. Elle présente un cadre de lecture ouvert de 3042 paires de bases codant pour une protéine putative de 1013 acides aminés. Le codon d'initiation est localisé en position nt 45-47 et le codon stop est localisé en position nt 3084-3086 de la séquence SEQ ID No. 1. L'analyse de la séquence protéique prédit que cette protéine de séquence SEQ ID No. 2 présente un peptide signal de séquence aa 1-41 , un domaine extracellulaire de séquence aa 42-911, un domaine transmembranaire de séquence aa 912-930 et un domaine intracellulaire de séquence aa 931-1013. Les séquences SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7 et SEQ ID No. 9 correspondent à des fragments de la séquence SEQ ID No. 1 non homologues aux séquences EST sélectionnées à l'exemple 1.
Exemple 2. Expression tissulaire de l'ARNm codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 Méthodologie
L'expression tissulaire du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 est analysée par Northern Blotting à l'aide de membranes commerciales qui permettent d'évaluer l'expression d'un ARNm dans différents tissus (Multiple Tissue Northern ou MTN, Clontech). Un fragment d'ADNc correspondant au fragment nt 385-nt 1137 est généré par PCR à l'aide d'amorces spécifiques dont la séquence est déduite de la séquence SEQ ID No. 1. Après purification, 25 μg de ce fragment sont marqués radioactivement à l'aide d'un kit commercial (Multiprime DNA labelling kit, Amersham, Amrsham, UK) et du nucleotide radioactif [α-32P]-dATP. La sonde marquée est purifiée par chromatographie. Les membranes sont préincubées dans la solution SSC 2X (citrate de sodium 300 mM pH 7 - NaCI 3 M - 0,1 % sodium dodecyl sulfate) pendant 2 heures à 50°C sous agitation. La membrane est ensuite incubée une nuit à 50°C sous agitation avec la sonde radiomarquée qui aura été dénaturée par la chaleur (10 minutes à 95°C). Après trois lavages (15 minutes à 55°C sous agitation) dans une solution SSC 2X-SDS 0,1 %. Les membranes sont exposées à un film autoradiographique (Kodak, Rochester, NY) pendant 24 heures. Résultats
Les membranes de Northern Blotting, présentées dans les figures 1A et 1B, montrent un fort signal d'hybridation dans les cellules mononucléées du sang périphérique et l'intestin grêle ; l'ARNm codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 est également exprimé dans le thymus, la rate, le cerveau et le poumon.
Ainsi, l'ARNm codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 est exprimé preferentiellement dans les tissus lymphoïdes humains. Exemple 3. Expression de l'ARNm codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 dans les différentes populations du sang circulant iWéfΛoco/og/e
Isolement des différentes sous populations cellulaires du sang périphérique Le sang du sujet sain volontaire est prélevé par leucophérèse (en présence d'anticoagulant comme par exemple Phéparinate de lithium). Les cellules mononucléées (CMN) (contenant les lymphocytes T, les lymphocytes B et les monocytes) sont isolées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (densité = 1,077) (Pharmacia, Uppsala, Suède). Brièvement, les cellules du sang sont centrifugées à 1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante. Les CMN, localisées à l'interface Ficoll-plasma, sont récupérées et lavées deux fois en présence de milieu RPMI 1640 (Life technologies). Les lymphocytes T sont purifiés par la technique dite des rosettes. Brièvement, les CMN sont remises en suspension à la concentration de 200 x 106 cellules/ml et mélangées avec 1 ml d'une solution à 50 % d'érythrocytes de mouton (BioMérieux, Marcy l'Etoile, France). La suspension cellulaire est incubée à 4°C pendant une nuit. Après une remise en suspension douce, les cellules T sont isolées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante). Les complexes érythrocytes de mouton- lymphocytes T sont collectés au fond du tube. Les globules rouges sont lysés par deux chocs hypotoniques successifs. La pureté des cellules T ainsi isolées, évaluée grâce à un marquage avec un anticorps anti-CD3 FITC, est > 95 %. Brièvement, les cellules sont lavées dans du tampon FACS (tampon phosphate 10 mM, pH 7,4 contenant 1 % de sérum albumine bovine et 0,01 % d'azide de sodium) avant d'être réparties dans des puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique (Nunc, Roskilde, Danemark) à raison de 2 x 105 cellules dans un volume de 50 μl de tampon FACS. Dans chaque puits est ajouté soit un anticorps anti-CD3 humain marqué FITC (Becton Dickinson), soit un anticorps isotypique contrôle marqué FITC (Becton Dickinson). Après 20 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées 2 fois avec 200 μl de tampon FACS puis sont remises en suspension dans 200 μl de ce même tampon. L'expression de CD3 à la surface des lymphocytes T est analysée par FACS.
Les monocytes sont purifiés par une technique de sélection positive à l'aide de billes magnétiques recouvertes d'un anticorps anti-CD14 humain (système MACS™ ; Miltenyi Biotex, Bergish Gladbach, Allemagne). Brièvement, les cellules mononucléées (300 x 106/ml) sont incubées avec 60 ml d'une suspension de billes (Miltenyi) à 4°C pendant 15 minutes dans le tampon PBS/EDTA 2 mM/sérum albumine bovine 0,5 % (PBS/EDTA/BSA). Après lavage, les cellules sont déposées sur une colonne soumise à un champ magnétique. Après trois lavages avec la solution PBS/EDTA/BSA, la colonne est retirée du champ magnétique et les monocytes sont collectés par gravité. La pureté des monocytes, évaluée par cytométrie sur la base des paramètres taille/granulosité, est supérieure à 95 %.
Les cellules dendritiques humaines immatures sont générées in vitro à partir des monocytes purifiés comme décrit ci-dessus. Les monocytes sont mis en culture à la concentration de 106 cellules/ml dans le milieu suivant (dénommé par la suite milieu de culture complet) : milieu RPMI 1640 supplémenté de 10 % de sérum de veau foetal (chauffage à 56°C pendant 30 minutes), 2 mM de L-glutamine, 50 U/ml de pénicilline et 50 μg/ml de streptomycine (Life technologies) dans des plaques de culture 6 puits (Nunc, Roskilde, Danemark) à raison de 5 ml de milieu par puits. Les cellules sont activées avec 20 ng/ml d'IL-4 humaine recombinante et 20 ng/ml de GM-CSF humaine recombinante (R&D Systems, Abingdon, Royaume Uni). Après 6 jours de culture (37°C, 5 % CO2 en atmosphère humide), le phénotype des cellules est défini par cytofluorométrie en analysant l'expression des molécules CD1a et CD83 à l'aide d'un anticorps anti-CD1a humain marqué à la fluorescéine soit d'un anticorps anti-CD83 humain (Becton Dickinson) qui est détecté par un anticorps anti-immunoglobuline de souris marqué à la fluorescéine (Silenus, Hauworth, Australie). Les cellules dendritiques immatures sont caractérisées par une expression de la molécule CD1a (intensité moyenne de fluorescence (IMF)>100) et l'absence d'expression de la molécule CD83.
Les cellules NK (CD56+/CD3-) sont isolées des CMN par cytofluorométrie (sélection positive) après marquage avec un anticorps anti-CD56 marqué à la fluorescéine (Becton Dickinson) et un anticorps anti-CD3 marqué à la phycoérythrine. Le marquage des cellules avec l'anticorps est réalisé comme décrit ci-dessus. Les cellules sont triées sur un FACS Vantage (Becton Dickinson) ; la pureté est > 98 %.
Les lymphocytes B sont isolés à partir d'amygdales collectés après exérèse chirurgicale. Brièvement, les amygdales sont broyées mécaniquement puis passées sur un tamis de porosité 50 μm. Les cellules mononucléées sont isolées par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque comme décrit ci-dessus. Les lymphocytes T sont retirés de la suspension de CMN par la technique dite des rosettes, comme décrit ci-dessus. La pureté de la population de cellules B est évaluée par cytofluorométrie à l'aide d'un anticorps anti-CD20 marqué FITC ; la pureté est > 95 %. Technique de PCR L'expression de l'ARN codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 a été analysée par PCR dans les différentes sous populations de CMN. Brièvement, les cellules sont lavées deux fois en PBS puis lysées dans le milieu d'extraction des acides nucléiques Trizol (Life technologies). Les protéines sont enlevées par deux extractions successives au Phénol/chloroforme/acide isoamylique (25 : 24 : 1) (Life technologies). Un volume équivalent d'alcool isopropylique est ajouté à la phase aqueuse pour précipiter les acides nucléiques (une nuit à -20°C). Les acides nucléiques sont collectés par centrifugation (12000 rpm, 30 minutes à 4°C). Le culot est lavé une fois par une solution d'éthanol à 70°C. Le culot est remis en suspension dans de l'eau et les ARNs quantifiés par spectrométrie (λ = 260 nm). Après dénaturation (65°C, 10 min), 2 μg d'ARN total sont transcrits de manière inverse en utilisant une amorce oligo-dT à l'aide d'un kit commercial (Promega, Madison, Ml) suivant les recommandations du manufactureur. L'ADNc codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 est amplifié par PCR à l'aide des amorces suivantes : 5'-TGACTCGGAATCACCTCCCAGCT-3' (SEQ ID No. 11) et 5'-CAAGACGGTGAGCAGGATGGCAGTACAG-3' (SEQ ID No. 12).
L'intégrité de l'ARN qui a servi à préparer les ADNc est analysée en évaluant l'expression de l'ADNc codant pour la molécule GAPDH à l'aide des amorces suivantes :
5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (SEQ ID No. 13) et 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (SEQ ID No. 14).
Le mélange réactionnel est le suivant : 1 μl d'ADNc (correspondant à 25 ng d'ARN total), 25 pmoles d'amorce, dNTP 200 μM, MgCI21.5 mM, Tris-HCI 10 mM pH = 8,3, KCI 50 mM et 0,4 unité de Taq polymérase (Perkin Elmer). Les conditions de la PCR sont : 5 min à 95°C, 30 cycles : 1 min à 94°C, 1 min à 55°C et 1 min à 72°C, une extension finale de 5 min à 72°C. Les échantillons sont repris dans le tampon d'échantillon (bleu de bromophénol 0,25 %, sucrose 40 %). Les échantillons sont analysés par électrophorèse en gel d'agarose 1 % qui contient du bromure d'éthidium. Après migration, les échantillons sont visualisés par illumination du gel aux UV. Résultats L'ARNm codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 est détecté par
PCR uniquement dans les lymphocytes T périphériques non stimulés. Il est absent des autres populations de cellules mononucléées testées (cellules NK, lymphocytes B, monocytes). L'ARNm est également détecté dans les cellules dendritiques humaines générées in vitro. Les résultats sont présentés dans la figure 2. Ainsi, l'ARNm codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 est exprimé sélectivement par les lymphocytes T du sang circulant. Exemple 4. L'ARN codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 est exprimé dans différentes lignées de cellules tumorales Méthodologie Nous avons évalué l'expression de l'ARNm codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 dans différentes lignées cellulaires tumorales. Ces lignées cellulaires ont été obtenues auprès de l'ATCC et cultivées selon les instructions fournies. L'extraction de l'ARN total ainsi que la synthèse d'ADNc ont été réalisées comme décrit ci-dessus. L'expression de l'ARN codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 et la molécule GAPDH ont été analysées par PCR comme décrit ci-dessus.
Résultats
Les expériences de PCR (figure 3) révèlent que les lignées cellulaires humaines suivantes expriment constitutivement l'ARNm codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 : adénocarcinome du poumon (lignée A549), leucémie monocyte (lignée THP1), neuroblastome (lignée HTB10), carcinome de la vessie (T24), lymphome de burkitt (lignée Daudi), carcinome du poumon (lignée A427), glioblastome (lignée U373), carcinome du larynx (lignée HEP2), carcinome du colon (lignée HT29) et carcinome du sein (lignée BT20).
Ainsi, l'ARN codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 est exprimé par un certain nombre de lignées tumorales.
Exemple 5. Le polypeptide recombinant de séquence SEQ ID No. 2 est exprimé de façon majoritaire dans la fraction membranaire des cellules COS transfectées Méthodologie
Les cellules COS sont transfectées par le vecteur pCDNA3.1 (Invitrogen) contenant l'insert codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2. Ce système permet d'ajouter un épitope c-myc à la molécule recombinante. La transfection est réalisée par la technique de lipofection (Fugene ; Boehringer Mannheim, Allemagne). Trois jours après la transfection, les cellules sont collectées et lavées trois fois avec du PBS. Les cellules sont ensuite soumises à trois séries de congélation/décongélation rapides puis centrifugées à 12 000 tours par minute (rpm) pendant 10 min à 4°C. Le surnageant correspond à la fraction cytoplasmique et le culot à la partie membranaire plus noyau plus organelles. Le culot est remis en suspension dans un tampon phosphate 10 mM, pH 7,4 contenant 0,5 % de Nonidet P40 et un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Boehringer Mannheim, Allemagne) pendant 20 minutes à 4°C. Les lysats cellulaires sont ensuite centrifugés à 12 000 rpm pendant 10 minutes à 4°C pour enlever les noyaux. Les surnageants correspondant aux fractions membranaires et cytoplasmiques sont repris dans un volume équivalent de tampon phosphate 10 mM contenant 0,1 % de bleu de bromophénol, 5 % de glycérol et 0,1 % de β- mercaptoéthanol. Les protéines sont ensuite séparées selon leur poids moléculaire par électrophorèse en gel de polyacrylamide (gel de concentration 5 % - gel de séparation 10 %). Une quantité de protéines correspondant à 5 x 106 cellules est déposée dans chaque ligne. Après migration, les protéines sont transférées par Western Blotting sur une membrane de nitrocellulose. Après saturation dans une solution phosphate contenant 10 % de lait écrémé, les membranes sont incubées pendant une nuit à 4°C sous agitation avec un anticorps anti-c-myc (clone 9E10 ; ATCC, Manassas, VA) à la concentration de 10 μg/ml. Après lavage avec un tampon phosphate contenant 10 % de lait écrémé, les membranes sont incubées avec un anticorps anti-immunoglobuline de souris marqué à la peroxidase (Amersham) pendant 2 heures à température ambiante sous agitation. Les membranes sont lavées en tampon phosphate. Les anticorps fixés sont détectés par chimioluminescence en utilisant le système ECL de Amersham. Résultats Le Western Blotting présenté dans la figure 4 indique que la protéine recombinante est exprimée majoritairement dans la fraction insoluble des extraits cellulaires (membrane cytoplasmique plus organelles intracytoplasmiques). Ce résultat ainsi que la prédiction d'un domaine transmembranaire potentiel suggèrent que le polypeptide recombinant est exprimé à la surface des cellules transfectées. Ainsi, le polypeptide recombinant de séquence SEQ ID No. 2 est exprimé dans la fraction membranaire (non cytoplasmique) des cellules COS transfectées. Exemple 6. Le gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 est localisé au niveau du chromosome 11q33-11q34 Méthodologie La localisation chromosomique du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 a été obtenue en interrogeant la banque de données Unigene à l'aide de la séquence EST #AI3011410. Résultats
Une séquence d'ADN génomique présentant 98 % d'homologie avec l'EST #AI301140 a été trouvée sur un fragment du chromosome 11q au niveau du cluster 33- 34. De nombreux gènes de susceptibilité aux tumeurs ont été localisés dans la région génomique 11q23-40 (Koreth, J., ét al., J. Pathol., 187:28-38, 1999).
Le gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 est localisé dans le chromosome 11 région q33-q34. Ce résultat permet de confirmer que le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 serait impliqué dans la régulation de la réponse immune et qu'une altération de son expression pourrait être associée à des désordres immunologiques susceptibles d'induire un caractère tumoral aux cellules présentant une expression anormale du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2.

Claims

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléique choisie parmi le groupe de séquences suivantes : a) la séquence SEQ ID No. 1 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 18 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID No. 1 délétée de son fragment polyA terminal ; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b) ; d) la séquence complémentaire ou la séquence de l'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c), à l'exception de la séquence SEQ ID No. 11 du document WO 99/54461, de la séquence SEQ ID No. 51 du document WO 99/06548 et des trois séquences décrites dans les documents de la banque de données EMBL sous les numéros d'identification Al 672868, AA 890726 et Al 301140.
2. Acide nucléique purifié ou isolé selon la revendication 1 ," caractérisé en ce qu'il comprend les séquences choisies parmi les séquences suivantes : a) les séquences SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17 et SEQ ID No. 19 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 18 nucléotides de la séquence SEQ ID No. 19 ; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b) ; et d) la séquence complémentaire ou la séquence de l'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c).
3. Acide nucléique purifié ou isolé selon la revendicaiton 1 ou 2, caractérisé en ce que sa séquence est choisie parmi les séquences suivantes : a) SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID
No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19 et SEQ ID No. 21 ; b) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ; et c) la séquence complémentaire ou la séquence de l'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a) ou b).
4. Méthode pour le criblage de banques d'ADNc ou d'ADN génomique ou pour le clonage d'ADNc ou génomique isolé, caractérisée en ce qu'elle met en œuvre une séquence nucléique selon l'une des revendications 1 à 3.
5. Méthode pour l'identification d'un acide nucléique d'au moins 18 nucléotides consécutifs de la séquence du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, ledit acide nucléique comportant au moins une mutation responsable de l'expression anormale dudit gène, caractérisée en ce qu'elle met en œuvre une séquence nucléique selon l'une des revendications 1 à 3.
6. Méthode pour l'identification de la séquence génomique du gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, de préférence des séquences d'acide nucléique promotrices et/ou régulatrices de l'expression, caractérisée en ce qu'elle met en œuvre une séquence nucléique selon l'une des revendications 1 à 3.
7. Acide nucléique identifié par une méthode selon l'une des revendications 5 et 6.
8. Polypeptide isolé ou purifié codé par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, et 7.
9. Polypeptide purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés choisie parmi le groupe suivant : a) la séquence SEQ ID No. 2 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 6 acides aminés de la séquence SEQ ID No.
22, de préférence de la séquence SEQ ID No. 20 ; et c) une séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins
80 % après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b).
10. Polypeptide selon la revendication 8, caractérisé en ce que sa séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID
No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22 ou une séquence présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec ces séquences.
11. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, et 7.
12. Vecteur selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comporte les éléments nécessaires à son expression dans une cellule hôte.
13. Cellule hôte transformée par un vecteur selon la revendication 11 ou 12.
14. Mammifère, excepté l'Homme, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule selon la revendication 13.
15. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, et 7 comme sonde ou amorce, pour la détection et/ou l'amplification de séquences d'acide nucléique.
16. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, et 7, comme oligonucleotide sens ou antisens.
17. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, et 7, pour la production d'un polypeptide recombinant.
18. Méthode de production d'un polypeptide recombinant, caractérisée en ce que l'on cultive une cellule transformée selon la revendication 13 dans des conditions permettant l'expression dudit polypeptide recombinant et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
19. Polypeptide, caractérisé en ce qu'il est obtenu par une méthode selon la revendication 18.
20. Anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'une des revendications 8 à 10, et 19, le polypeptide de séquence SEQ ID No. 173 du document WO 99/54461 ou SEQ ID No. 51 du document WO 99/06548.
21. Méthode pour la détection et/ou la purification d'un polypeptide, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un anticorps selon la revendication 20.
22. Méthode de diagnostic d'une pathologie associée à une expression anormale du gène codant pour le polypeptide de SEQ ID No. 2, caractérisée en ce que l'on met en œuvre une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, et 7.
23. Méthode de diagnostic d'une pathologie associée à la présence d'au moins une mutation du gène codant pour le polypeptide de SEQ ID No. 2 à partir d'un prélèvement biologique d'un patient, caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes suivantes : a) le cas échéant, isolement de l'ADN génomique à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ; b) amplification spécifique de ladite séquence d'ADN dudit gène susceptible de contenir une mutation à l'aide d'amorces choisies parmi les acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3, et 7 ; c) analyse des produits d'amplification obtenus et comparaison de leur séquence avec la séquence normale correspondante dudit gène.
24. Méthode de diagnostic de pathologie associée à une expression anormale du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, caractérisée en ce que l'on met en contact un ou des anticorps selon la revendication 20 avec le matériel biologique à tester, dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre ledit polypeptide et le ou lesdits anticorps, et en ce que l'on détecte et/ou quantifie les complexes immunologiques éventuellement formés.
25. Méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables de moduler l'activité du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 in vitro ou in vivo, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'un polypeptide selon l'une des revendications 8 à 10, et 19, le polypeptide de séquence SEQ ID No. 173 du document WO 99/54461 ou SEQ ID No. 51 du document WO 99/06548, d'une cellule selon la revendication 13, ou d'un mammifère selon la revendication 14, avec un composé candidat et, la détection d'une modification de l'activité dudit polypeptide de séquence SEQ ID No. 2.
26. Méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables de se fixer au polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'un polypeptide selon l'une des revendications 8 à 10, et 19, le polypeptide de séquence SEQ ID No. 173 du document WO 99/54461 ou SEQ ID No. 51 du document WO 99/06548, d'une cellule selon la revendication 13, ou d'un mammifère selon la revendication 14, avec un composé candidat et, la détection de la formation d'un complexe entre le composé candidat et ledit polypeptide.
27. Méthode de sélection de composés chimiques ou biochimiques capables d'interagir in vitro ou in vivo avec une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, et 7, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'une cellule exprimant normalement ou anormalement le gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 avec un composé candidat, et la détection directe ou indirecte d'une modification de l'expression ou de l'activité du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2.
28. Utilisation de polypeptide selon l'une des revendications 8 à 10, et 19, le polypeptide de séquence SEQ ID No. 173 du document WO 99/54461 ou SEQ ID No.
51 du document WO 99/06548, d'une cellule selon la revendication 13, ou d'un mammifère selon la revendication 14, pour l'étude de l'expression ou de l'activité du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2, et/ou des interactions, directes ou indirectes, entre ledit polypeptide de séquence SEQ ID No. 2 et des composés chimiques ou biochimiques pouvant être impliqués dans l'activité dudit polypeptide de séquence SEQ ID No. 2.
29. Composé, caractérisé en ce qu'il est sélectionné par une méthode selon l'une des revendications 25 à 27.
30. Composé, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi :
- un anticorps selon la revendication 20,
- un polypeptide selon l'une des revendications 8 à 10, et 19, le polypeptide de séquence SEQ ID No. 173 du document WO 99/54461 ou SEQ ID No. 51 du document WO 99/06548, • - un polypeptide selon l'une des revendications 8 à 10, et 19, le polypeptide de séquence SEQ ID No. 173 du document WO 99/54461 ou SEQ ID No. 51 du document WO 99/06548, caractérisé en ce qu'il correspond à un fragment soluble du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2,
- un vecteur selon la revendication 11 ou 12, - un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 et 7, ou l'acide nucléique de séquence SEQ ID No. 11 du document WO 99/54461, de séquence ID No. 51 du document WO 99/06548, de séquence Al 672868, AA 890726 ou Al 30140 des documents EMBL de numéro d'identification correspondant, sens ou antisens.
31. Composé selon l'une des revendications 29 et 30, à titre de médicament.
32. Composé selon la revendication 31 , pour la prévention et/ou le traitement de pathologies liées à une anomalie de l'expression et/ou de l'activité du polypeptide de séquence SEQ ID No. 2.
33. Composé selon l'une des revendications 31 et 32 pour la prévention et/ou le traitement de pathologies immunes, notamment pour la prévention et/ou le traitement des maladies autoimmunes ou des cancers.
34. Composé selon l'une des revendications 31 et 32 pour la prévention et/ou le traitement des infections de type virale, fongique, bactérienne ou parasitaire.
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