ES2303359T3 - Canal de potasio kcnq2 derivado de cerebro humano. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 3, poseyendo dicho polipéptido la capacidad para permitir el flujo y/o transporte transmembranal de ión potasio.
Description
Canal de potasio KCNQ2 derivado de cerebro
humano.
La presente invención se refiere a secuencias de
ácido nucleico y de aminoácidos de un nuevo polipéptido de canal de
potasio derivado de cerebro humano y al uso de estas secuencias para
identificar compuestos que modulan la actividad biológica y/o
farmacológica de la biomolécula nativa. La invención se refiere
también a la diagnosis, el estudio, la prevención, y el tratamiento
de trastornos patofisiológicos relacionados con o mediados por la
molécula biológica.
Los canales de potasio son proteínas integrales
de la membrana de gran diversidad molecular y funcional y están
presentes prácticamente en todas las células de los mamíferos. Los
canales de potasio neuronales en el cerebro son responsables
fundamentalmente del mantenimiento de un potencial residual de
membrana negativo, así como de controlar la repolarización de la
membrana después de un potencial de acción. Dependiendo de la
subfamilia a la que pertenece un canal de potasio dado, el mismo
puede ser activado por un cambio en el potencial de membrana, un
aumento en la concentración intracelular de Ca^{2+}, o la fijación
de ligandos a sus receptores que incluyen acetilcolina, adrenalina,
dopamina, galanina, péptido afín al gen de calcitonina,
somatostatina, y ATP. La identidad farmacológica de diversos
canales de potasio con compuertas de voltaje se establece por su
sensibilidad a compuestos estándar capaces de bloquear uno o más
tipos de canales de potasio. Estos compuestos, conocidos como
bloqueadores de los canales de potasio, incluyen cloruro de
tetraetilamonio (TEA), 4-aminopiridina
(4-AP, así como 2-AP y
3-AP), 3,4- y 2,3-diaminopiridina,
BaCl_{2}, CsCl, estricnina, fenciclidina, piridostigmina,
9-aminoacridina, DuP-996
(3,3-bis(4-piridinilmetil)-1-fenilindolin-2-ona;
linopiridina), clofilium, quinidina, aminoquinolinas y quinina. La
gran diversidad molecular y funcional hace de los canales de potasio
una diana potencial de descubrimiento de fármacos para una
diversidad de indicaciones patofisiológicas, que incluyen
degeneración de la memoria, derrame cerebral, epilepsia, esclerosis
múltiple, corea de Hungtington, ansiedad, depresión, psicosis,
incontinencia urinaria, diabetes, asma, parto prematuro,
hipertensión, isquemia cardíaca, dolores de cabeza de tipo migraña,
enfermedades autoinmunes, cáncer, rechazos de injertos y arritmias.
Toral, J., et al., Use of Cultured Human Neuroblastoma
Cells in Rapid Discovery of the Voltage-Gated
Potassium-channel Blockers, J. Pharm.
Pharmacol., 46: 731 (1994).
La despolarización neuronal mediada por los
canales de potasio del cerebro de los mamíferos prolonga la
supervivencia neuronal in vitro y se ha convertido en un
modelo principal de examen de la apoptosis neuronal. (Véase,
v.g., Shan Ping Yu, et al., Mediation of Neuronal
Apoptosis by Enhancement of Outward Potassium Current, Science,
278: 114 (1997). La muerte neuronal apoptótica es un mecanismo
fundamental que regula la eliminación de células precursoras
neuronales durante el desarrollo del cerebro de los mamíferos y es
integral para neurofisiología normal. Se ha demostrado que la
apoptosis inducida por privación de potasio desencadena una cascada
letal de sucesos que incluyen síntesis específica de RNA y
proteínas, inducción de la actividad de una proteasa semejante la
enzima convertidora de interleuquina-1, y generación
de radicales libres. La apoptosis neuronal media también ciertos
estados de enfermedad patofisiológicos. Las investigaciones actuales
se enfocan en la significación de la muerte prematura de neuronas
adultas en las enfermedades neurodegenerativas humanas. Weller, M.,
et al., Developmental and Genetic Regulation of Programmed
Neuronal Death, J. Neural Transm. Suppl., 50: 115 (1997).
La importancia de la integridad bioactiva de la
neurofisiología normal se percibe fácilmente en medicina clínica
hoy en día como resultado de la demostración llamativa de las
consecuencias de la disfunción neuronal. Trastornos del
neurodesarrollo y neurofisiológicos tales como esquizofrenia,
ansiedad, y depresión son sucesos fisiológicos importantes que
implican disfunción neuronal. Se ha propuesto recientemente que la
esquizofrenia, así como condiciones neurodegenerativas que
incluyen las enfermedades de Hungtington, Alzheimer,
Parkinson, y Lou Gehrig, son el resultado de apoptosis neuronal
inadecuadamente tratada. Procesos aberrantes del desarrollo
neurológico han sido atribuidos tanto a muerte neuronal prematura
como al fallo en la eliminación de neuronas en exceso.
Adicionalmente, se ha sugerido que la neurodegeneración catastrófica
en enfermedades neurofisiológicas tales como el derrame cerebral
y la epilepsia son una colaboración molecular entre necrosis y
apoptosis. Stahl, S.M., J. Clin. Psychiatry, Apoptosis: Neuronal
Death by Design, (5): 183 (1997).
Los avances en la clonación de canales de
potasio KQT han ampliado notablemente la comprensión de la
estructura de estas macromoléculas. Wang, Q., et al., Nature
Genet., 12:17 (1996); Wei, A., et al.,
Neuropharma-cology, Vol. 35(7): 805 (1996);
Curran, M.E., et al., Cell, 80:795 (1995); Barhanin, J.,
et al., Nature, 384, 78-80 (1996);
Sanguinetti, M. C., et al., Nature, 384:80 (1996); Attali,
B., Nature, 384:25 (1996).
Recientemente se ha descrito un transcrito de
mRNA con 1,5 kb de longitud total que se supone codifica un
polipéptido de 393 aminoácidos de un canal de potasio procedente de
una línea de neuroblastoma humano. Yokoyama, M., et al.,
Identification and Cloning of
Neuro-blastoma-Specific and Nerve
Tissue-Specific Genes through Compiled Express
Profiles, DNA Research, 3:311 (1996).
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El papel fundamental de los canales de potasio
en la regulación de numerosas funciones neurofisiológicas hace que
los mismos sean dianas particularmente importantes para desarrollo
terapéutico. Lamentablemente, no se ha encontrado todavía ningún
compuesto que bloquee los canales de potasio exclusivamente
en neuronas humanas. De acuerdo con ello, persiste la necesidad de
identificar un canal de potasio de origen neuronal diferenciado
como diana farmacológica para el cribado de compuestos candidato
para la modulación de la actividad neurofisiológica. Tales
moduladores son potencialmente útiles en el tratamiento de
trastornos manifestados por neuronas disfuncionales. Los
bloqueadores selectivos de canales son necesarios además para
abordar la neurofarmacología de los canales de potasio en lo que
respecta a trastornos neurofisiológicos y del desarrollo neurológico
así como para la apoptosis de las neuronas cerebrales.
La identificación y caracterización de
biomoléculas responsables de la activación y manifestación de la
apoptosis neuronal es de la mayor importancia para el desarrollo de
compuestos terapéuticos para el control y/o la interrupción de los
trastornos neurofisiológicos. Stahl, S.M., J. Clin. Psychiatry,
Apoptosis: Neuronal Death by Design, (5): 183 (1997). La
disponibilidad de un ensayo funcional con una capacidad considerable
es una parte indispensable de cualquier programa de descubrimiento
de fármacos enfocado hacia moduladores de canales de potasio. Un
ensayo de este tipo debería ser capaz de escrutar centenares de
compuestos de modo rutinario. Toral, J., et al., Use of
Cultured Human Neuroblastoma Cells in Rapid Discovery of the
Voltage-gated Potassium-channel
Blockers, J. Pharm. Pharmacol., 46:731(1994).
La presente invención está dirigida a un
polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácido
nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 3, poseyendo
dicho polipéptido la facultad de permitir el flujo y/o transporte
transmembranal de iones potasio. En algunas realizaciones, el
polinucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2. La presente
invención está dirigida también a vectores de expresión que
comprenden los polinucleótidos de la invención, así como células
hospedadoras transformadas con dichos vectores de expresión.
La presente invención está dirigida también a un
polipéptido purificado de SEQ ID NO: 3, poseyendo dicho polipéptido
la facultad de permitir el flujo y/o transporte transmembranal de
iones potasio.
La presente invención está dirigida
adicionalmente a un método para producir células que expresan un
polipéptido de SEQ ID NO: 3, poseyendo dicho polipéptido la
facultad de permitir el flujo y/o transporte transmembranal de
iones potasio, comprendiendo dicho método:
a) transformar células hospedadoras adecuadas
con un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica
un polipéptido de SEQ ID NO: 3, poseyendo dicho polipéptido la
facultad de permitir el flujo y/o transporte transmembranal de
iones potasio; y
b) seleccionar células que expresan el
polipéptido codificado por el ácido nucleico introducido.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención está dirigida
adicionalmente a un método para producir un polipéptido de SEQ ID
NO: 3, poseyendo dicho polipéptido la facultad de permitir el flujo
y/o transporte transmembranal de iones potasio, comprendiendo dicho
método:
a) cultivar una célula hospedadora transformada
con un vector de expresión de la presente invención en condiciones
adecuadas para la expresión de dicho polipéptido; y
b) recuperar dicho polipéptido del cultivo de
células hospedadoras.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención está dirigida
adicionalmente a un método de identificación de compuestos que
modulan la actividad biológica de un canal de potasio, que
comprende:
a) combinar un compuesto candidato modulador de
la actividad biológica con un polipéptido de SEQ ID NO: 3,
poseyendo dicho polipéptido la facultad de permitir el flujo y/o
transporte transmembranal de iones potasio; y
b) medir un efecto del compuesto candidato
modulador sobre la facultad de flujo y/o transporte transmembranal
de iones potasio del polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención está dirigida
adicionalmente a un método de identificación de compuestos que
modulan la actividad biológica de un canal de potasio que
comprende:
a) combinar un compuesto candidato modulador de
la actividad biológica de un canal de potasio con una célula
hospedadora que expresa un polipéptido de SEQ ID NO: 3, poseyendo
dicho polipéptido la facultad de permitir el flujo y/o transporte
transmembranal de iones potasio; y
b) medir un efecto de compuesto candidato
modulador sobre la facultad de flujo y/o transporte transmembranal
de iones potasio del polipéptido al que se hace referencia en el
paso (a). En algunas realizaciones, se identifican compuestos como
los que modulan la actividad biológica de un canal de potasio, que
son moduladores de la neurofisiología.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La presente invención está dirigida
adicionalmente al uso de un polipéptido purificado de SEQ ID NO: 3,
o células hospedadoras que expresan dicho polipéptido, o una
preparación producida a partir de dichas células en un cribado para
compuestos que modulan la facultad de flujo y/o transporte
transmembranal de iones potasio de dicho polipéptido.
La Figura 1 muestra SEQ ID NO: 1, que es una
secuencia de ácido nucleico cDNA de 3029 bases que codifica el
nuevo polipéptido del canal de potasio derivado de cerebro humano
que exhibe especificidad tisular para neuronas diferenciadas como
se describe en esta memoria.
La Figura 2 muestra SEQ ID NO: 2, que es la
región estructural traducida de 2565 bases, ATG a TGA, de la
secuencia de ácido nucleico cDNA que codifica el polipéptido del
canal de potasio derivados de cerebro humano que exhibe
especificidad tisular para neuronas diferenciadas como se describe
en esta memoria.
La Figura 3 muestra SEQ ID NO: 3, que es la
secuencia de residuos de 854 aminoácidos del polipéptido del canal
de potasio derivados de cerebro humano que exhibe especificidad
tisular para neuronas diferenciadas como se describe en esta
memoria.
La Figura 4 muestra SEQ ID NO: 4, que es la
secuencia de cDNA de 1425 bases perteneciente al canal de potasio
HNSPC. No. de acceso a Genbank D82346.
La Figura 5 muestra SEQ ID NO: 5, que es la
secuencia de residuos de 393 aminoácidos del canal de potasio HNSPC
descrito recientemente. No. de acceso a Genbank D82346; Yokoyama,
M., et al., Identification and Cloning of
Neuroblastoma-Specific and Nerve
Tissue-Specific Genes through Compiled Express
Profiles, DNA Research, 3:311 (1996).
La Figura 6 muestra SEQ ID NO: 6, que es la
secuencia de 581 residuos de aminoácidos del canal de potasio
humano KvLQT1 descrito recientemente. Núms. de acceso a Genbank
U40990, U71077; Barhanin, J., et al., Nature, 384,
78-80 (1996); Sanguinetti, M. C., et al.,
Nature, 384:80 (1996).
La Figura 7 muestra una alineación de
comparación entre la secuencia de residuos de aminoácidos del nuevo
polipéptido de canal de potasio derivados de cerebro humano
descrito en esta memoria (SEQ ID NO: 3), y las secuencias de
residuos de aminoácidos de los polipéptidos de canal de potasio
HNSPC (SEQ ID NO: 5) y hKvLQT1 (SEQ ID NO: 6). Los residuos de
aminoácidos concentrados están encerrados en recuadros. Los guiones
representan lagunas introducidas para optimizar la alineación. Las
secuencias que se muestran en esta figura se produjeron utilizando
el programa de alineación multisecuencia de software DNASTAR
(DNASTAR Inc., Madison, WI).
La Figura 8 muestra un gráfico de hidropatía de
la secuencia de residuos de aminoácidos del nuevo polipéptido del
canal de potasio derivados de cerebro humano descrito en esta
memoria (SEQ ID NO: 3), y las secuencias de residuos de aminoácidos
de los polipéptidos de canales de potasio HNSPC (SEQ ID NO: 5) y
hKvLQT1 (SEQ ID NO: 6) que muestran segmentos transmembranales
predichos. Kyte, J., Doolittle, R.F., J. Mol. Biol., 157:105
(1982); DNASTAR Inc, Madison WI.
La Figura 9 muestra análisis de transferencias
Northern de tejidos múltiples (Panel A) utilizando la sonda de
ácido nucleico nº 1 que es específica para la región codificante del
polipéptido del canal de potasio derivados de cerebro humano
descrita en esta memoria (SEQ ID NO: 2; (Panel B) y (Panel C))
utilizando la sonda de ácido nucleico No. 2 que es común al cDNA de
HNSPC (SEQ ID NO: 4) y la región codificante del polipéptido de
canales de potasio derivados de cerebro humano descrita en esta
memoria (SEQ ID NO: 2).
La Figura 10 muestra análisis de transferencias
Northern de regiones distintas de cerebro humano (Panel A)
utilizando la sonda de ácido nucleico nº 1 que es específica para la
región codificante del polipéptido del canal de potasio derivados
de cerebro humano descrita en este memoria (SEQ ID NO: 2; (Panel
B)) utilizando la sonda de ácido nucleico No. 2 que es común al
cDNA de HNSPC (SEQ ID NO: 4) y la región codificante del
polipéptido del canal de potasio derivados de cerebro humano
descrita en esta memoria (SEQ ID NO: 2).
La Figura 11 muestra análisis de transferencias
Northern de cerebro humano adulto y cerebro humano fetal, la línea
de células de neuroblastoma imr-32 no inducida e
inducida neuronalmente y astrocitos (Panel A) utilizando la sonda
de ácido nucleico nº 1 que es específica para la región codificante
del polipéptido del canal de potasio derivados de cerebro humano
descrita en esta memoria (SEQ ID NO: 2; (Panel B)) utilizando la
sonda de ácido nucleico No. 2 que es común al cDNA de HNSPC (SEQ ID
NO: 4) y la región codificante del polipéptido del canal de potasio
derivados de cerebro humano descrita en esta memoria (SEQ ID NO:
2).
La Figura 12 ilustra la expresión y actividad de
corrientes K+ funcionales de SEQ ID NO: 3 en las líneas de células
de mamífero COS-7 y HEK 293;
A. La corriente de la subunidad del canal de
potasio derivado de cerebro humano de activación lenta, y no
desactivadora en una célula COS-7 transfectada
frente a la ausencia de corriente en una célula parental. La línea
continua sobre la corriente es un ajuste monoexponencial (\tau =
216 ms).
B. Dependencia del voltaje de activación media
normalizada (\pm SEM; n = 3-12) en estado
estacionario de la corriente subunitaria de SEQ ID NO: 3 expresada
en células COS-7 y HEK 293. Las líneas de trazo
continuo son ajustes de Boltzman a los datos
(COS-7: V_{1/2}: -6 mV, factor de pendiente: 13;
HEK 293: V_{1/2} = 12 mV, factor de pendiente: 18.
C. Dependencia del potencial de inversión de la
subunidad SEQ ID NO: 3 (células HEK 293) de [K+]_{0}. El
potencial de inversión se midió a partir de corrientes pico de cola,
y los potenciales de fijación líquida se corrigieron. La regresión
lineal (línea de trazo continuo) sobre los puntos medios de los
datos (\pm SEM; n = 3-6) revela una pendiente de
59 mV por cada aumento de 10 veces de [K]_{0}, indicativa
de una corriente altamente selectiva de K+, como se predice por la
ecuación de Nernst.
D. Inhibición dependiente de la concentración de
la subunidad SEQ ID NO: 3 por tetraetilamonio (TEA). La línea roja
es un ajuste de Hill a los puntos medios de los datos (\pm SEM, n
entre paréntesis) (CI_{50}: 0,13 mM, factor de pendiente:
0,59).
La Figura 13 ilustra los efectos sobre la
corriente K+ durante la co-transfección de células
COS-7 y HEK 293 con SEQ ID NO: 2 (larga) y SEQ ID
NO: 4 (corta).
A. Familia superpuesta típica de corrientes
provocadas por una serie de pasos de voltaje creciente en una
célula COS-7 transfectada con SEQ ID NO: 2.
B. Familia superpuesta de corrientes obtenidas
con el mismo protocolo que en (A) a partir de un célula
co-transfectada con SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 2 en
una relación de 5:1.
C. Sumario de datos (valor medio \pm SEM, n's
entre paréntesis bajo el eje x) de densidades de corriente
procedentes de todas las células COS-7 y HEK 293
co-transfectadas con combinaciones de SEQ ID NO: 4 y
SEQ ID NO: 2 para las relaciones indicadas (* denota la diferencia
de la densidad de corriente de la célula parental para p < 0,05;
** denota niveles de p < 0,001 por ANOVA de una sola vía).
La Figura 14 ilustra una comparación de las
dependencias del voltaje y cinéticas de activación para corrientes
en células COS-7 transfectadas con hKvQT2L (SEQ ID
NO: 2) (+ vector vacío) frente a células
co-transfectadas con hKvQT2S (SEQ ID NO: 4) +
hKvQT2L (SEQ ID NO: 2) para una relación 5:1. Ni las dependencias
del voltaje de activación (A) ni las cinéticas de activación (B)
diferían significativamente para las corrientes en las células
transfectadas con KvQT2L frente a las células
co-transfectadas con KvQT2L + KvQT2S (ANOVA's de una
sola vía; p > 0,05).
A. Dependencia del voltaje de activación medio
normalizado (\pm SEM; n = 5-6) en estado
estacionario de las corrientes. Las líneas de trazo continuo son
ajustes de Boltzman a los datos (Vector + KvQT2L: V_{1/2}: -6 mV,
factor de pendiente: 13; KvQT2S + KvQT2L 5:1: V_{1/2}: -2 mV,
factor de pendiente: 12).
B. Valores medios de \tau (\pm SEM; n =
5-6) obtenidos a partir de ajustes monoexponenciales
para la activación de corrientes provocada por un intervalo
incrementado de pasos de voltaje.
La Figura 15 muestra el análisis por
transferencia Northern de un tumor cerebral humano. Se detectó una
banda de aproximadamente 2 Kb, correspondiente a la variante de
remodelación corta de hKvQT2 (SEQ ID NO: 4) en las pistas del tumor
cerebral, pero no en las células adyacentes no tumorales del mismo
cerebro, o de tumores de origen no cerebral que producían
metástasis en el cerebro.
La Figura 16 muestra el análisis por
transferencia Northern de líneas de células septales SN56 y SN48 no
diferenciadas, diferenciadas y tratadas con amiloide beta. Se
detectaron bandas específicas de SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 en las
células colinérgicas SN56, pero no en las células SN48 (que carecen
de la corriente de potasio).
La Figura 17 muestra SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8
que son las secuencias respectivas de residuos de aminoácidos de
KvQT3 de rata y humana.
A no ser que se define de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen
el mismo significado que es entendido comúnmente por una persona con
experiencia en la técnica a la que se refiere esta invención.
Actividad biológica, como se utiliza en esta
memoria, hace referencia a la capacidad para permitir el flujo y/o
transporte transmembranal de ión potasio o regular el flujo y/o
transporte transmembranal de ión potasio o la facultad de una
subunidad para fijarse a otra subunidad, ligando, o cofactor y/o
modular de otro modo la actividad farmacológica de un canal de
potasio.
Secuencia de ácido nucleico, como se utiliza en
esta memoria, hace referencia a una secuencia de oligonucleótido,
nucleótido o polinucleótido y fragmentos o porciones de la misma, y
a DNA o RNA de origen genómico o sintético que pueden ser
bicatenarios o monocatenarios, tanto si representan la cadena de
sentido o antisentido. Análogamente, secuencia de aminoácidos y/o
residuos, como se utiliza en esta memoria, hace referencia a
secuencias de péptidos o proteínas o porciones de las mismas.
Purificado, como se utiliza en esta memoria,
hace referencia a moléculas, sean secuencias de ácido nucleico o de
aminoácidos, que se retiran de su ambiente natural y se aíslan o se
separan de al menos otro componente con el que están asociadas
naturalmente.
Como se utiliza en esta memoria, un derivado
funcional de una estructura molecular de canal de potasio o
polipéptido descrito(a) en esta memoria es un compuesto o
entidad que posee una actividad biológica (sea funcional o
estructural) que es sustancialmente similar a SEQ ID NO: 3. El
término "derivados funcionales" tiene por objeto incluir los
"fragmentos", "variantes", "variantes degeneradas",
"análogos" y "homólogos", y a "derivados químicos".
Debe entenderse que el término "variante" se refiere a una
molécula sustancialmente similar en estructura y función a una
molécula entera de canal de potasio o a un fragmento de la misma.
Una molécula es "sustancialmente similar" a un polipéptido de
canal de potasio si ambas moléculas tienen estructuras
sustancialmente similares o si ambas moléculas poseen actividad
biológica similar. El término "análogo" hace referencia a una
molécula sustancialmente similar en función a un polipéptido nativo
entero, o a un fragmento C-terminal del mismo.
El término "modulación" se utiliza en esta
memoria para hacer referencia a la capacidad para intensificar o
inhibir una propiedad funcional de un canal de potasio. El término
"modulación" se utiliza también en esta memoria para hacer
referencia a la capacidad para afectar a la actividad biofísica de
una neurona.
La modulación o regulación de la actividad
biológica, tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a
fijación, bloqueo, antagonización, represión, neutralización, o
secuestración, de una estructura biomolecular de canal de potasio
que incluye, pero sin carácter limitante, el nuevo polipéptido de
canal de potasio descrito en esta memoria; así como a la
"regulación ascendente" o agonización o activación de un
canal de potasio por un compuesto identificado por los medios
descritos en esta memoria.
La modulación de la neurofisiología, como se
utiliza en esta memoria, hace referencia a la regulación
biofisiológica de neuronas y el tratamiento de trastornos
patofisiológicos relacionados con o mediados por neuronas.
"Sustancialmente como se representa", como se utiliza en esta
memoria, hace referencia a proteínas, péptidos y secuencias de DNA
funcionales derivadas que pueden exhibir cambios pero realizan
sustancialmente la misma función biológica, y sustancialmente del
mismo modo.
Fragmento biológicamente activo, como se utiliza
en esta memoria, incluye péptidos que se han truncado con respecto
a los términos N o C, o ambos; o el extremo 5' o 3' correspondiente,
o ambos, de la región codificante del polinucleótido
correspondiente, fragmentos que realizan sustancialmente la misma
función biológica o codifican péptidos que realizan sustancialmente
la misma función, sustancialmente del mismo modo. El término
"biológicamente activo" hace referencia también a la actividad
de una entidad homóloga o análoga que tiene funciones estructurales,
reguladoras o bioquímicas sustancialmente iguales que la entidad
existente naturalmente.
Vector de expresión, como se utiliza en esta
memoria, hace referencia a construcciones de vectores de ácido
nucleico que tienen componentes que dirigen la expresión de regiones
codificantes de proteínas heterólogas que incluyen regiones
codificantes de la presente invención por transcripción y traducción
exactas en células hospedadoras. Los vectores de expresión
contienen usualmente un promotor que dirige las polimerasas para
transcribir la región codificante heteróloga, un sitio de clonación
en el cual se introduce la región codificante heteróloga, y
usualmente señales de poliadenilación. Los vectores de expresión
incluyen, pero sin carácter limitante, plásmidos, vectores
retrovirales, vectores virales y vectores sintéticos.
Células hospedadoras transformadas, como se
utiliza en esta memoria, hace referencia a células que tienen
regiones codificantes de la presente invención integradas de manera
estable en su genoma, o están presentes episómicamente como
entidades replicantes o no replicantes en la forma de ácido nucleico
lineal o transcrito o plásmido circular o vector.
Administración directa, como se utiliza en esta
memoria, hace referencia a la administración directa de constructos
de ácido nucleico que codifican realizaciones (v.g., SEQ ID NO: 3,
molécula de compuesto modulador, molécula antisentido, molécula de
anticuerpo) de la presente invención o fragmentos de los mismos; y
la administración directa de realizaciones de la presente invención
o fragmentos de las mismas, y la introducción in vivo de
moléculas de la presente invención preferiblemente por la vía de un
vector de expresión eucariota efectivo en un vehículo farmacéutico
adecuado. Los polinucleótidos y moléculas terapéuticas de la
presente invención pueden suministrarse también en la forma de
transcritos de ácido nucleico.
Los canales de potasio son los más antiguos
evolutivamente, ubicuos y diversos de los canales iónicos. Presentes
en todos los eucariotas, los canales de potasio ajustan el
potencial residual de membrana y controlan la excitabilidad
eléctrica en diversos tipos de células. Los canales de potasio
realizan funciones en las células tan específicas como la
definición de los intervalos interpico de las células que laten
endógenamente. En el sistema nervioso, los canales de potasio son
reguladores fundamentales de la señalización en virtud de su papel
en el gobierno de la forma y patrón del potencial de acción que son
finalmente críticos para la percepción, el aprendizaje y el
comportamiento. Wei, A., et al., Neuropharmacology, vol. 35
(7): 805 (1996). La importancia de la integridad bioactiva de la
neurofisiología normal se percibe fácilmente en la medicina clínica
actual como resultado de la demostración llamativa de las
consecuencias de la disfunción neuronal.
La apoptosis de las neuronas neocorticales de
ratón, por ejemplo, inducida por privación de suero o por
estaurosporina ha sido asociada con una intensificación precoz de
la corriente rectificadora retardada (I_{K}) y la pérdida de K+
intracelular total. La atenuación de la corriente K+ de salida con
tetraetilamonio (TEA) o K+ extracelular elevado, pero no los
bloqueadores de Ca^{2+}, Cl^{-}, u otros canales K+, reducía la
apoptosis, incluso si se impedían los aumentos en la concentración
intracelular de Ca^{2+}. Adicionalmente, la exposición al
ionóforo de K+ valinomicina o el abridor de los canales K+
cromakalim inducía la apoptosis. El eflujo de K+ intensificado
puede mediar ciertas formas de apoptosis neuronal. Shan Ping Yu,
et al., Mediation of Neuronal Apoptosis by Enhancement of
Outward Potassium Current, Science, 278:114 (1997).
En respaldo de la hipótesis de que el eflujo
incrementado de K+ podría ser un paso primario conducente a la
apoptosis, la aplicación del ionóforo selectivo de K+ valinomicina
desencadena la apoptosis, por ejemplo en timocitos, linfocitos y
células tumorales. La exposición a valinomicina 20 nM durante 24 a
48 horas inducía apoptosis neuronal típica en cultivos corticales,
caracterizada por condensación de cromatina, concentración del
cuerpo celular, fragmentación del DNA internucleosómico, y
sensibilidad a la ciclohemimida. Adicionalmente, 24 a 48 horas de
exposición al abridor de canales de K+ kromakalim, que activa los
canales K_{ATP} así como corrientes afines a I_{K} en las
neuronas centrales de los mamíferos, inducía también apoptosis
neuronal típica. Pruebas existentes sugieren que una
intensificación de larga duración de la corriente de salida K+ es
un mediador clave de las formas de apoptosis neuronal cortical. Shan
Ping Yu, et al. sugieren que las intervenciones dirigidas al
bloqueo del eflujo excesivo de K+, en particular por el canal K+
rectificador retardado no desactivador, se exploren como estrategia
para atenuación de la apoptosis neuronal en estados de enfermedad.
Shan Ping Yu, et al., Mediation of Neuronal Apoptosis by
Enhancement of Outward Potassium Current, Science, 278:114
(1997).
Experimentos recientes de clonación molecular y
expresión funcional han revelado que los genes que subyacen en la
diversidad funcional similar a éste, pueden agruparse en varias
clases conservadas de familias de multigenes. En particular, los
canales KQT tienen regiones de núcleo que los distinguen de los
canales con compuertas de voltaje. Wei, A., et al.,
Neuropharmacology, vol. 35 (7): 805 (1996).
La clase KQT de canales de potasio con
compuertas de voltaje son evolutivamente distintos de los otros
canales de potasio con compuertas de voltaje (Kv). Barhanin, J.,
et al., Nature, 384, 78-80 (1996). Una
diferencia muy notable es la ausencia de un dominio de
tetramerización en el término N que media la asociación específica
de subfamilias. Wei, A., et al., Neuropharmacology, vol. 35
(7): 805 (1996). En las regiones de poros y transmembranal sexta,
un patrón único de residuos conservados distingue los canales KQT de
otros canales Kv, por ejemplo, el motivo ADAL precedente al poro,
el motivo KxPQTW en el poro y el motivo SFFALPAGILGSG en S6.
El primer miembro de la familia de genes KQT es
KvLQT1. Mutaciones de este gen han sido implicadas en una forma de
síndrome QT largo, una enfermedad hereditaria que predispone a los
portadores a arritmias cardíacas. Wang, Q., et al., Nature
Genet., 12: 17 (1996). Recientemente ha sido demostrado por dos
grupos independientes que KvLQT1 y otra proteína transmembranal
simple denominada ISK, se asocian en el corazón para formar la
corriente de potasio de activación lenta, I_{KS}, que es
responsable de la repolarización de los potenciales de acción.
Barhanin, J., et al., Nature, 384, 78-80
(1996); Sanguinetti, M.C., et al., Nature, 384: 80 (1996).
Barhanin et al., y Sanguinetti et al. han
identificado recientemente los componentes moleculares de los
canales K+ lentos rectificadores retardados, un paso crucial en la
investigación para nuevos fármacos anti-arrítmicos.
Nature, 384, 78-80 (1996); Nature, 384: 80 (1996);
Attali, B., Nature, 384: 25 (1996). En las células COS, la
expresión de K_{v}LQT1 inducía una corriente de salida K+
dependiente del voltaje, de activación rápida y desactivación
lenta. El RNA mensajero de K_{v}LQT1 es abundante en el corazón,
el riñón, y las glándulas salivares del ratón, pero es
prácticamente indetectable en el cerebro, los músculos esqueléticos
y el hígado. La identificación molecular del canal I_{KS} debería
ayudar en el diseño de nuevos fármacos antiarrítmicos. Barhanin,
J., et al., Nature, 384: 25 (1996). El análisis por
transferencia Northern de KvLQT1 exhibe la expresión en corazón,
placenta, pulmón, riñón y páncreas humanos; no se detecta señal
alguna en el cerebro. Sanguinetti, M.C., et al., Nature,
384: 80 (1996).
Recientemente, Yokoyama, M., et al.
consignaron un transcrito, que codifica un polipéptido de 393
aminoácidos que ellos denominaron HNSPC (canal de potasio
específico de neuronas humanas), a partir de una línea de células
de neuroblastoma (CHP134). DNA Research, 3: 311 (1996). El
neuroblastoma humano es un neoplasma maligno que se deriva de
neuroblastos o de células nerviosas no diferenciadas procedentes de
nervios simpáticos en la médula suprarrenal o el ganglio simpático.
Los autores exponen la identificación de un gen que se expresa
supuestamente de modo específico en el sistema nervioso. Una
secuencia de cDNA de 1425 bases de longitud total correspondiente
al transcrito de Yokoyama se lista en esta memoria (SEQ ID NO: 4) y
se demuestra que contiene un marco de lectura abierta de 323
aminoácidos que abarca las posiciones 178-1356 de
SEQ ID NO: 4. HNSPC ha sido descrito como poseedor de todas las
características estructurales de un canal de potasio con compuertas
de voltaje expresado específicamente en el sistema nervioso. Tres
transcritos han sido demostrados en análisis por transferencia
Northern utilizando una sonda de longitud total. Un transcrito de
1,5 kb es abundante en líneas de células de neuroblastoma. En el
tejido cerebral humano, aparecía un transcrito de 9,5 kb como
componente principal y aparecían transcritos de 1,5 kb y 3,8 kb
como componentes menores. En el cerebro fetal, son abundantes ambos
transcritos de 1,5 kb y 9,5 kb, pero no un transcrito de 3,8 kb.
Yokoyama, M., et al., Identification and Cloning of
Neuroblastoma-Specific and Nerve
Tissue-Specific Genes through Compiled Express
Profiles, DNA Research, 3:311 (1996).
En esta memoria se describe SEQ ID NO: 1, que es
una secuencia de ácido nucleico cDNA de 3029 bases que codifica un
nuevo polipéptido de canal de potasio derivado de cerebro humano
que exhibe especificidad tisular para neuronas diferenciadas como
se describe ulteriormente, véase más adelante. SEQ ID NO: 2 es la
región estructural traducida de 2565 bases, ATG a TGA, de la
secuencia de ácido nucleico cDNA que codifica el nuevo polipéptido
con especificidad tisular de canal de potasio derivado de cerebro
humano. SEQ ID NO: 3, que es la secuencia de 854 residuos de
aminoácidos del polipéptido de canales de potasio derivados de
cerebro humano con especificidad tisular para neuronas
diferenciadas como se describe en esta memoria.
Para referencia y comparación: SEQ ID NO: 4 es
la secuencia de cDNA de 1425 bases que pertenece al canal de
potasio HNSPC. No. de acceso a Genbank D82346. SEQ ID NO: 5 es la
secuencia de 393 residuos de aminoácidos del canal de potasio
HNSPC descrito recientemente. No. de acceso a Genbank D82346;
Yokoyama, M., et al., Identification and Cloning of
Neuroblastoma-Specific and Nerve
Tissue-Specific Genes through Compiled Express
Profiles, DNA Research, 3:311 (1996). SEQ ID NO: 6, que es la
secuencia de 581 residuos de aminoácidos del canal de potasio
KvLQT1 humano descrito recientemente. Núms. de acceso a Genbank
U40990, U71077; Barhanin, J., et al., Nature, 384,
78-80 (1996); Sanguinetti, M. C., et al.,
Nature, 384:80 (1996).
El polipéptido del canal de potasio derivado de
cerebro humano con especificidad tisular de 854 residuos regulado
por el desarrollo (SEQ ID NO: 3) comparte 37% de homología total al
nivel de aminoácidos con el KvLQT1 de 581 aminoácidos (SEQ ID NO:
6) y 44% de homología total al nivel de aminoácidos con el HNSPC de
393 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) (95% de homología en su secuencia
alineable) (comparación presentada en Fig. 7). El nuevo polipéptido
del canal de potasio derivado de cerebro (SEQ ID NO: 3) tiene 461
aminoácidos adicionales en su porción C terminal cuando se compara
con HNSPC (SEQ ID NO: 5).
Se ha hecho referencia previamente a HNSPC como
"canal de potasio específico de neuronas humanas" sobre la
base del reconocimiento en transferencias Northern de un transcrito
predominante de 1,5 Kb en varias líneas de células de neuroblastoma
no diferenciadas así como una banda de 9,5-10 Kb en
tejido cerebral. Sin embargo, estas bandas fueron detectadas por
Yokoyama et al. utilizando una sonda de la región codificante
de HNSPC que comparte 95% de semejanza regional con el nuevo cDNA
descrito en esta memoria (SEQ ID NO: 1). De hecho, la banda de
9,5-10 Kb observada por Yokoyama et al. en
cerebro humano corresponde al nuevo cDNA (SEQ ID NO: 1) descrito en
esta memoria y no a HNSPC como se describe ulteriormente, véase más
adelante.
El nuevo canal de potasio derivado de cerebro
se expresa a nivel alto después de la diferenciación neuronal.
La diferenciación de las células nerviosas es un proceso crucial en
el desarrollo normal del tejido nervioso así como para la
regulación de la plasticidad celular durante el crecimiento y la
regeneración en condiciones patológicas. La línea de neuroblastoma,
IMR-32 se utiliza extensamente como sistema modelo
para estudiar la diferenciación neuronal. Sher, et al., J.
Neurochemistry, 50: 1708 (1988).
Una sonda de ácido nucleico (a la que se hace
referencia en esta memoria como sonda nº 1, descrita ulteriormente,
véase más abajo) correspondiente a las posiciones 1257 a 1461 de SEQ
ID NO: 2 abarca la región estructural de la cola
C-terminal del nuevo cDNA de canal de potasio
derivado de cerebro. La sonda de ácido nucleico a la que se hace
referencia como sonda No. 2 en esta memoria corresponde a las
posiciones de las bases 989 a 1109 de SEQ ID NO: 2; que abarca la
región codificante relativa para una región de 40 aminoácidos que es
común a la vez a una región central del canal de potasio derivado
de cerebro descrito en esta memoria, y a una región de HNSPC
perteneciente al término C del péptido.
Se demuestra en esta memoria que la sonda de
ácido nucleico 1 identifica una banda muy tenue de
9,5-10 Kb en células IMR-32 no
inducidas, en tanto que demuestra una expresión
espectacularmente regulada en sentido creciente (\sim más de 20
veces) en células IMR-32 diferenciadas (Fig. 11).
Así, existe una asociación fuerte entre la expresión del nuevo
canal de potasio derivado de cerebro y la inducción de la
diferenciación neuronal, lo que pone de relieve la importancia de
la nueva biomolécula en función neurológica.
En transferencias múltiples de tejidos que
utilizan la sonda de ácido nucleico 1, se observa un transcrito
predominante de 9,5-10 Kb exclusivamente en cerebro
humano (Fig. 9). Este transcrito se observa tanto en cerebro adulto
como en cerebro fetal (Fig. 11) y está presente con intensidad
similar en el cerebelo, el córtex cerebral, el bulbo raquídeo, el
lóbulo occipital, el lóbulo frontal, el lóbulo temporal y el putamen
(Fig. 10). La Fig. 9 muestra análisis de transferencias Northern de
tejidos múltiples (Panel A), utilizando la sonda de ácido nucleico
nº 1 que es específica para el polipéptido del canal de potasio
derivados de cerebro humano que codifica la región descrita en esta
memoria (SEQ ID NO: 2); (Panel B) y (Panel C) que utilizan la sonda
de ácido nucleico No. 2 que es común al cDNA de HNSPC (SEQ ID NO:
4) y a la región codificante del polipéptido del canal de potasio
derivados de cerebro humano descrita en esta memoria (SEQ ID NO: 2).
Fig. 10 muestra análisis de transferencias Northern de regiones
distintas de cerebro humano, (Panel A) utilizando la sonda nº 1 de
ácido nucleico que es específica para la región codificante del
polipéptido del canal de potasio derivados de cerebro humano
descrita en esta memoria (SEQ ID no. 2); (Panel B) que utiliza la
sonda de ácido nucleico No. 2 que es común a cDNA de HNSPC (SEQ ID
NO: 4) y la región codificante del polipéptido del canal de potasio
derivados de cerebro humano descrita en esta memoria (SEQ ID NO:
2). Fig. 11 muestra análisis de transferencias Northern de cerebro
adulto humano y cerebro fetal humano, imr-32 y
astrocitos, (Panel A) que utiliza la sonda de ácido nucleido nº 1
que es específica para la región codificante del polipéptido del
canal de potasio derivados del cerebro humano descrita en esta
memoria (SEQ ID NO: 2); (Panel B) que utiliza la sonda de ácido
nucleido No. 2 que es común a cDNA de HNSPC (SEQ ID NO: 4) y la
región codificante del polipéptido de los canales de potasio
derivados de cerebro humano descrita en esta memoria (SEQ ID NO:
2).
El polipéptido del canal de potasio derivados de
cerebro descritos en esta memoria (SEQ ID NO: 3) está regulado a lo
largo del desarrollo y se expresa con especificidad tisular en
cerebro humano y en líneas de células de neuroblastoma que están
inducidas para diferenciación neuronal. Esto es un hecho
significativo que distingue y contrasta funcionalmente la nueva
biomolécula de HNSPC, que se expresa a un nivel bajo en el cerebro
adulto y no está regulada después de diferenciación neuronal de las
líneas de células del neuroblastoma.
El canal de potasio derivado de cerebro se
expresa en las células neuronales y no en las células gliales del
cerebro humano. El cerebro humano está constituido por neuronas
excitables y células gliales no excitables. Las células gliales son
10 veces más abundantes que las células neuronales. Para evaluar si
el nuevo transcrito de canales de potasio (SEQ ID NO: 1) en el
cerebro humano se expresa en células neuronales o no neuronales, se
realizó un análisis por transferencia Northern de las células
gliales no neuronales cultivadas a partir de cerebro fetal humano
primario. El transcrito perteneciente al canal de potasio derivado
del cerebro descrito en esta memoria no se detectaba en el mRNA de
las células gliales, confirmando su expresión específica en las
células neuronales del cerebro (Fig. 11). El transcrito (SEQ ID NO:
1) está presente tanto en el cerebro adulto como en el fetal (Fig.
11).
HNSPC se expresa predominantemente en las
líneas de células de neuroblastoma y no en el cerebro humano. En
contraste, se demuestra en esta memoria que la sonda 2 detecta una
banda predominante de 1,5 Kb a la vez en las células
IMR-32 nativas y diferenciadas (que
representan HNSPC) y una banda adicional de 9,5-10
Kb en las células IMR-32 diferenciadas (que
representan el transcrito perteneciente al nuevo canal de potasio
derivado de cerebro descrito en esta memoria; Fig. 11). Así pues,
HNSPC se expresa predominantemente en las líneas de células del
neuroblastoma pero no es el transcrito predominante en el cerebro
humano.
La sonda 2 captura una banda predominante de
9,5-10 Kb en varias regiones del cerebro (Fig. 9 y
Fig. 10). Estos resultados son muy similares a los encontrados con
la sonda 1 (véase arriba), lo que sugiere una expresión muy alta
del polipéptido de canales de potasio descrito en esta memoria (SEQ
ID NO: 3) en el cerebro humano. Se observa un transcrito de 1,5 Kb
en los testículos, utilizando la sonda 2 (Fig. 9), que representa
HNSPC como ha sido descrito por Yokoyama et al.
En esta memoria se reconoce que el polipéptido
HNSPC (SEQ ID NO: 5) descrito previamente por Yokoyama et
al. está comprendido dentro de la familia KQT. El cDNA descrito
en esta memoria representa un nuevo miembro de los canales de
potasio de la familia KQT. En los tumores cerebrales, la regulación
génica está alterada. Se supone que los tumores cerebrales producen
más HNSPC (SEQ ID NO: 5) en lugar del polipéptido de canales de
potasio con especificidad tisular más largo descrito en esta memoria
(SEQ ID NO: 3), que conduce a una proliferación celular
incrementada. HNSPC (SEQ ID NO: 5) es abundante en líneas de células
neuronales y en cerebro fetal, pero el cerebro adulto tiene poco o
nada de HNSPC, mientras que exhibe abundancia del polipéptido del
canal de potasio con especificidad tisular más largo descrito en
esta memoria (SEQ ID NO: 3). De acuerdo con ello, podría predecirse
que el nuevo cDNA de SEQ ID NO: 1 perteneciente al nuevo canal de
potasio estará regulado en sentido decreciente en los tumores
cerebrales, con aumento concomitante en el cDNA de HNSPC SEQ ID NO:
4.
La región codificante de cDNA de los canales de
potasio derivada de cerebro humano (SEQ ID NO: 2) cuando se
transfecta en células de mamífero da como resultado corrientes de
salida enérgicas con compuertas de voltaje (Fig. 12A, B) que son
selectivas de potasio (Fig. 12C) y pueden ser bloqueadas
poderosamente por TEA (tetraetil-amonio) aplicado
externamente (Fig. 12D). La transfección de células de mamífero con
cDNA de HNSPC, SEQ ID NO: 4 (una variante corta de remodelación de
SEQ ID NO: 1), que produce la subunidad de canales de potasio SEQ ID
NO: 5, no produce corriente funcional alguna. Un constructo EGFP
(Proteína Fluorescente Verde Intensificada)-fusión
de SEQ ID NO: 2 se describe en esta memoria para detectar células
verdes como identificador para la expresión de la subunidad del
canal. Este constructo producía canales funcionales con propiedades
biofísicas y farmacológicas muy similares a la subunidad del canal
"no fusionado" (SEQ ID NO: 3) (véase Fig. 13A).
Adicionalmente, la co-expresión de SEQ ID NO: 3
junto con EGFP-HNSPC da como resultado la supresión
de las corrientes de potasio producidas por la subunidad de la
variante de remodelación larga resultante: SEQ ID NO: 3
(véase, Fig. 13A-D); sin embargo, no se
demuestra alteración significativa alguna en la cinética en las
compuertas del canal (Fig. 14). Véase el Ejemplo
XIV.
XIV.
En el contexto del desarrollo neuronal, se
demuestra que el tejido cerebral en desarrollo inmaduro expresa a
la vez las variantes de remodelación corta y larga de SEQ ID NO: 1,
v.g., SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, mientras que el cerebro adulto
maduro expresa predominantemente la variante de remodelación larga
SEQ ID NO: 3 (véase, Fig. 11). El hecho de que la subunidad
de la versión corta, HNSPC (SEQ ID NO: 5) suprime la función de la
variante larga SEQ ID NO: 3 implica que las frecuencias de disparo
del potencial de acción alteradas son críticas para el cerebro en
desarrollo.
Un análisis por transferencia Northern de mRNA
de tumor cerebral humano ha revelado que el transcrito HNSPC
corto (SEQ ID NO: 4), que está expresado muy débilmente en el
cerebro adulto normal, está regulado crecientemente en los tumores
cerebrales adultos (Fig. 15). Este resultado, teniendo en cuenta la
asociación observada de la variante de remodelación corta (SEQ ID
NO: 4) de la subunidad de canales de potasio derivados del cerebro
con células cerebrales proliferantes tales como líneas de células de
cerebro fetal y líneas de células de neuroblastoma no diferenciadas
(Fig. 11), conduce a la expectativa de que los niveles detectables
del transcrito son indicativos de tejido de tumor cerebral. Dos
formas de RNA de tumor cerebral adulto, un astrocitoma y un glioma,
son positivas para el transcrito corto, SEQ ID NO: 4. El RNA de
control procedente de células adyacentes no tumorígenas del mismo
cerebro era negativo para transcritos de SEQ ID NO: 4. Los tumores
de origen no cerebral que habían producido metástasis en el cerebro
eran también negativos para transcritos de SEQ ID NO: 4. De acuerdo
con ello, la detección del transcrito corto de SEQ ID NO: 4 por PCR
o por anticuerpos, en fluido cerebroespinal de pacientes con
tumores cerebrales puede utilizarse como herramienta de diagnóstico
para monitorizar el progreso de la enfermedad durante el
tratamiento o en cualquier otro caso para propósitos de diagnóstico.
Por ejemplo, la generación de una banda PCR detectable de 107 pb
que es específica para el transcrito corto se realiza utilizando el
iniciador directo: 5' AAC CTC TCG CGC ACA GAC CTG CA 3' (SEQ ID NO:
9) correspondiente a las posiciones 1225-1247 de
SEQ ID NO: 4 así como un Iniciador Inverso: 5' AAC AGT TGC TTG GTG
GCA GGA GCC 3' (SEQ ID NO: 10) correspondiente a las posiciones
1308-1331 de SEQ ID NO: 4. Véase el Ejemplo XV.
Las neuronas colinérgicas basales del
prosencéfalo (Colom et al., J. Neurochem., 70: 1925
(1998)) así como las neuronas corticales (Yu, S., et al.,
Neurobiol. Dis., 5 (2): 81 (1998), que están notablemente
empobrecidas en las primeras fases del curso de la enfermedad de
Alzheimer (AD) expresan un perfil particular de corrientes K+ que
tienen compuertas de voltaje y son sensibles a TEA. Las corrientes
K+ regulan las funciones del ciclo vital; como corolario, se espera
que su alteración conduzca a lesión celular y muerte subsiguiente.
Se ha demostrado que el péptido amiloide beta (A\beta) es un
factor principal en la toxicidad neuronal en los pacientes con AD.
Una línea de células septal colinérgica, SN56, expresa una corriente
de potasio sensible a TEA. Se ha demostrado que A\beta
intensifica las corrientes de potasio en estas células. Se demuestra
que la atenuación de esta corriente por TEA bloquea las neuronas de
toxicidad mediadas por A\beta. Colom, et al., J.
Neurochem. 70: 1925 (1998). Una línea septal no colinérgica (SN 48),
no parece tener corrientes de potasio importantes y es resistente a
la muerte celular inducida por A\beta. Las características
fisiológicas y los perfiles farmacológicos de las corrientes K+ en
SN56 son reminiscentes de las propiedades de dos subfamilias de
productos génicos clonados y caracterizados: la subfamilia
shaw, Kv3.1 y Kv3.2 (Chandy y Gutman, Handbook
of Receptors and Channels, (1995)) de canales con compuertas de
voltaje y la subfamilia KvQT descrita más recientemente,
KvQT2 y KvQT3 (Singh, et al., Nature Genetics
(1998); Charlier, et al., Nature Genetics (1998)).
Para determinar si uno o la totalidad de estos
canales codificaban el canal K+ en células SN56, se realizaron
análisis por transferencia Northern. El RNA total procedente de
células SN48 y SN56 no diferenciadas y diferenciadas se aisló de
acuerdo con protocolos estándar. Se sometieron a pasadas 20
microgramos de cada muestra de RNA, junto con 20 \mug de RNA de
cerebro de rata y de ratón (como controles positivos), en un gel de
agarosa al 1,0%, se transfirieron a nitrocelulosa, y se hibridaron
en condiciones de severidad alta a una sonda marcada con ^{32}P
cebada aleatoriamente, diseñada para seleccionar la subfamilia
shaw de genes (Kv3.1-Kv3.4) o SEQ ID
NO: 2 o SEQ ID NO: 4 (las variantes de remodelación alternativas
larga y corta del gen KvQT2). El autorradiograma se expuso
durante un tiempo suficiente a fin de que incluso el transcrito
menos abundante, en caso de estar presente, fuese claramente
visible. Se detectan bandas intensas de 3,8 Kb y 1,5 Kb, que
corresponden a las variantes larga y corta de remodelación (SEQ ID
NO: 2 y SEQ ID NO: 4), respectivamente, en células SN56 tanto no
diferenciadas como diferenciadas. Esta señal es muy débil (o está
ausente) en las células SN48. Véase la Fig. 16.
Los trastornos epilépticos afectan
aproximadamente a 20-40 millones de personas en todo
el mundo, y el 40% de éstos son epilepsias idiopáticas
generalizadas de etiología desconocida (en Idiopathic Generalized
Epilepsies. Compiladores, Malafosase A. et al., John Libbey,
Londres, 1994). La mayor parte de las epilepsias idiopáticas son
heredades de una manera autosómica dominante. Dos loci en el
cromosoma 20 q13.3 y el cromosoma 8q24, respectivamente, han sido
mapeadas por análisis de enlaces a convulsiones neonatales
familiares benignas. Por clonación posicional de estos loci, dos
grupos han identificado las regiones codificantes hKvQT2 (SEQ ID NO:
3, descrita en esta memoria) y KvQT3 (v.g., SEQ ID NO: 7 (Fig. 17))
que están mutadas en los pacientes epilépticos. Singh N.A. et
al., Nature Genetics, 18, 25 (1998); Biervert C., et al.,
Science, 279: 403 (1998); Charlier C., et al., Nature
Genetics, 18: 53 (1998). En las familias epilépticas se encuentran
varias mutaciones puntuales o mutaciones sin sentido/de
desplazamiento de marco en la región de poros en la posición
post-S6 y en los términos C. Estas mutaciones
conducen a pérdida de función del canal K+ correspondiente. Se ha
demostrado que una truncación de este tipo en la cola C, que
mimetiza la actividad biológica y/o farmacológica de HNSPC
(SEQ ID NO: 5), es no funcional y causa la supresión de las
corrientes de tipo salvaje hKvQT2 (SEQ ID NO: 3), cuando se
co-expresa en oocitos de Xenopus. Biervert C., et
al., Science, 279: 403 (1998). Al menos 11 variantes de
remodelación murinas de mKQT2 (homólogo murino de SEQ ID NO: 3) han
sido descritas, todas las cuales se encuentran en la cola C.
Ninguna de estas variantes de remodelación del terminal C, producía
canales funcionales en oocitos de Xenopus. Nakamura, M., et
al., Receptors and Channels 5: 255 (1998).
Dado que los canales de potasio son tetrámeros
funcionales, una mutación en un solo alelo es suficiente para
causar un fenotipo dominante negativo en una subunidad que podría
ser fatal para la función del canal tetrámero. Por ello, se supone
que la pérdida patológica de función del canal causa
hiperexcitabilidad neuronal como consecuencia de la repolarización
deteriorada en el síndrome epiléptico. Los agonistas de KvQT2
humanos, agonistas de la actividad biológica y/o farmacológica de
SEQ ID NO: 3, por ejemplo, que funcionan como abridores de canales,
se espera que sean útiles en el tratamiento de los ataques y las
epilepsias. Además, se espera que el suministro de una subunidad
normal por terapia génica a un individuo que se encuentra en
necesidad de una subunidad normal, por ejemplo a un individuo que
ha heredado una versión aberrante, posea un valor terapéutico
importante en el tratamiento de los trastornos mediados por niveles
o versiones anormales de SEQ ID NO: 3.
La corriente M es una corriente de potasio con
compuertas de voltaje no desactivadora encontrada en muchos tipos
de células neuronales. Revisado por Marrion N.V., Control of
M-Current, Ann. Rev. Physiol., 59: 483 (1997).
En cada célula del cerebro, la corriente M es dominante en el
control de la excitabilidad de membrana por ser la única corriente
sostenida en el intervalo de iniciación del potencial de acción. La
corriente M puede estar modulada por un amplio conjunto de tipos de
receptores, dando como resultado la intensificación o supresión de
la corriente. De hecho, históricamente, el término corriente M fue
acuñado sobre la base de la supresión observada de una corriente de
potasio dependiente del tiempo y el voltaje por estimulación de
receptores muscaránicos. Brown D.A. y Adams, P.R., Nature, 283: 673
(1980). La supresión de la corriente M da como resultado
despolarización de la membrana, lo que hace las neuronas más
propensas a disparar los potenciales de acción. La corriente está
regulada también sinápticamente, sustentando la supresión sináptica
de la corriente M el lento potencial excitativo
post-sináptico (EPSP) en las neuronas CA3 simpáticas
y del hipocampo. Por esta razón, es evidente que la presencia de la
corriente M ejerce un efecto poderoso en la regulación de la
excitabilidad neuronal. Se ha demostrado que los moduladores de las
corrientes M intensifican la liberación de neurotransmisores y son
por consiguiente atractivos como intensificadores de la
cognición.
Las propiedades biofísicas y farmacológicas del
canal hKvQT2 (SEQ ID NO: 3) expresado en células de mamífero
coinciden estrechamente con las propiedades de la corriente M en las
neuronas, que incluyen las cinéticas de activación y desactivación,
corrientes de cola, y bloqueo por bario. Véase Fig. 12. De
hecho, un heteromultímero de la subunidad del canal de potasio
hKvQT2 (como se describe en esta memoria, v.g., SEQ ID NO: 3) y otro
homólogo de esta familia, KvQT3 (v.g., SEQ ID NO: 7), ha sido
implicado como canal que transporta la corriente M. Neuroscience
Meeting, Wang H.S., et al., Society for Neuroscience, 24: Abs
#792.1 (1998). Véanse Fig. 17 y Fig. 18. Después de la
co-expresión de hKQT2 y hKQT3 en oocitos, la
corriente resultante mimetizaba todas las propiedades de las
corrientes M nativas, que incluyen el bloqueo por TEA.
Adicionalmente, se demostró que los canales KvQT3 (SEQ ID NO: 7)
cuando se expresan solos producen corrientes de potasio muy bajas en
oocitos de Xenopus. Yang, W.P., et al., J. Biol.
Chem., 31: 19419 (1998). Sin embargo, cuando se
co-inyectaron con mRNA de hKvQT2 (SEQ ID NO: 1), se
produjeron corrientes muy fuertes con propiedades nuevas,
indicativas de la heteromultimerización de los dos tipos de
canales.
La participación observada de la subunidad del
canal SEQ ID NO: 3 integral a la formación del canal que codifica
la corriente M tiene una implicación sustancial en el cribado tanto
para la identificación como para el diseño de moléculas pequeñas
que modulen la actividad de la corriente M y modulen por
consiguiente la función neuronal. Para uso en cribados de
descubrimiento de fármacos, se contemplan líneas de células que
expresan de manera estable hKvQT2 (SEQ ID NO: 3) sola o
co-expresan SEQ ID No. 3 y cualquiera de sus
homólogos afines, que incluyen, pero sin carácter limitante, KvQT1
y/o KvQT3 (SEQ ID NO: 7). Funciones neuronales incluyen, por
ejemplo, mejora de la cognición, y trastornos de déficit de
atención, y análogos.
Se generaron anticuerpos para hKvQT2 (SEQ ID NO:
3) y KvQT3 (SEQ ID NO: 7) por utilización de péptidos
correspondientes a las posiciones de los residuos de aminoácidos
644-658 de SEQ ID NO: 3 así como los residuos
639-653 de SEQ ID NO: 7. Estos péptidos se
sintetizaron, se conjugaron a KLH y se utilizaron para inmunizar
conejos. Los antisueros obtenidos 7-8 semanas
después de la inmunización daban títulos muy altos de anticuerpos
para los péptidos en un ELISA (dilución >1:100.000). Los
antisueros se utilizaron para realizar inmunohistoquímica sobre un
tejido cerebral de rata así como tejido cerebral humano. Se
incubaron secciones incrustadas en parafina con una dilución 1:3000
del antisuero primario hKvQT2 o hKvQT3, seguido por una dilución
1:200 de antisuero anticonejo de cabra conjugado con HRP. La
tinción se visualizó utilizando sustrato DAB (Paragon Biotech Inc.,
Baltimore, MD). Se observaron anticuerpos de tinción positiva tanto
para hKvQT2 como para hKvQT3 en las células de Purkinje en el
córtex cerebelar, las células del epéndimo del plexo coroideo, y las
neuronas grandes en el prosencéfalo basal. Se observó una tinción
más débil en las neuronas de varias otras regiones del cerebro, que
incluyen el córtex y el hipocampo. El suero
pre-inmune no exhibe tinción detectable alguna. El
perfil solapante de expresión de hKvQT2 y hKvQT3 era llamativo y
sugestivo de co-localización.
Otros nombres utilizados recientemente para la
subunidad de los canales de potasio derivados de cerebro KvQT2 (SEQ
ID NO: 3) descritos en esta memoria incluyen KQT2 (Wei et
al., 1996, Neuropharmacology, 35: 805-829) y
KCNQ2 (Biervert et al., 1998, Science, 279:
403-406).
La presente invención se refiere a secuencias de
ácido nucleico (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) y de amino-ácidos (SEQ
ID NO: 3) del nuevo canal de potasio derivado de cerebro humano y al
uso de estas secuencias para identificar compuestos que modulan la
actividad de los canales de potasio y la neurofisiología humana.
La invención se refiere adicionalmente al uso de
las secuencias de ácido nucleico descritas en esta memoria en
sistemas de expresión como ensayos para agonistas o antagonistas de
la biomolécula del canal de potasio. La invención se refiere
también a la diagnosis, el estudio, la prevención y el tratamiento
de enfermedades relacionadas con el canal de potasio derivado de
cerebro humano y/o enfermedades mediadas por neuronas
disfuncionales.
De acuerdo con la presente invención, pueden
utilizarse secuencias de polinucleótidos que codifican el canal de
potasio de neuronas humanas (SEQ ID NO: 3) que comprenden
deleciones, inserciones y/o sustituciones de la secuencia de ácido
nucleico SEQ ID NO: 2. Un polinucleótido purificado que comprende
una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido que
tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 es una realización
particularmente preferida de la presente invención.
Secuencias de ácido nucleico que codifican la
secuencia de aminoácidos de la nueva molécula de canal de potasio
específica de neuronas descritas en esta memoria son de una suma
exponencial debida a la sustitución potencial de codones
degenerados (codones diferentes que codifican el mismo aminoácido).
La secuencia de oligonucleótidos seleccionada para expresión
heteróloga está por tanto adaptada preferiblemente para satisfacer
el reconocimiento de codones de tRNA característico más común del
sistema de expresión de hospedadores particular utilizado y
conocido por los expertos en la técnica.
Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden modificarse también por ingeniería genética a fin
de alterar una secuencia codificante por una diversidad de razones,
que incluyen, pero sin carácter limitante, alteraciones que
modifican la clonación, el procesamiento y/o la expresión del
producto génico. Por ejemplo, pueden producirse mutaciones
utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica, v.g.,
mutagénesis orientada para insertar nuevos sitios de restricción,
alterar los patrones de glicosilación, cambiar la preferencia de
codones, etc.
La presente invención se refiere, en parte, a la
inclusión del polinucleótido que codifica la nueva molécula de
canales de potasio en un vector de expresión que puede utilizarse
para transformar células u organismos hospedadores no humanos.
Tales hospedadores transgénicos son útiles para la producción de la
nueva molécula neurofisiológica y variaciones de la misma descritas
en esta memoria.
La secuencia de ácido nucleico proporciona
también el diseño de moléculas antisentido útiles en la regulación
decreciente, disminución o eliminación de la expresión de la
secuencia nucleotídica genómica en células que incluyen, pero sin
carácter limitante, neuronas, y células tumorales o de cáncer.
La biomolécula de canales de potasio humana de
la presente invención puede utilizarse también en ensayos de
cribado para identificar bloqueadores, antagonistas o inhibidores
que se fijan a o emulan el sustrato, o desactivan o compiten de
cualquier otro modo con la biomolécula. El nuevo canal de potasio
puede utilizarse también en ensayos de cribado para identificar
agonistas que activan el canal de potasio o inducen de cualquier
otro modo la producción de o prolongan la duración de vida de la
biomolécula in vivo o in vitro.
La invención se refiere también a compuestos
farmacéuticos y composiciones que comprenden la molécula del
polipéptido de canal de potasio humano sustancialmente como se
representa en SEQ ID NO: 3, o fragmentos de la misma, moléculas
antisentido capaces de alterar la expresión del gen existente
naturalmente, y agonistas, anticuerpos, antagonistas o inhibidores
de la biomolécula nativa. Estas composiciones son útiles para la
prevención y/o el tratamiento de condiciones asociadas con neuronas
disfuncionales y trastornos neurofisiológicos.
Realizaciones particulares preferidas de la
invención están dirigidas a métodos para cribado de compuestos que
modulan la neurofisiología, que interfieren con o inhiben la
actividad biológica de un canal de potasio.
Como se ha expuesto arriba, el análisis por
transferencia Northern revela que la nueva biomolécula está
restringida casi exclusivamente a células neuronales (y no a las
células gliales) de cerebro humano (Fig. 9-11). El
nuevo transcrito se encuentra en abundancia muy escasa en la línea
de células de neuroblastoma IMR-32; sin embargo,
después de diferenciación de estas células a neuronas, se produce
una importante regulación creciente del transcrito (Fig. 11). El
nuevo canal de potasio derivado de cerebro y regulado por el
desarrollo descrito en esta memoria podría desempeñar papeles
cruciales en la modulación de la transmisión sináptica y la
excitabilidad eléctrica en el cerebro. La modulación de la función
de las nuevas biomoléculas descritas en esta memoria, v.g., SEQ ID
NO: 2 y SEQ ID NO: 3 y variaciones de las mismas, podría tener
implicaciones profundas en trastornos cognitivos (v.g., aprendizaje
y memoria), de comportamiento (ansiedad, depresión), psiquiátricos
(v.g. trastornos bipolares, esquizofrenia), neurodegenerativos
(v.g., enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson) y
trastornos del desarrollo (v.g., retraso mental) así como en asma,
migraña, epilepsia y derrame cerebral y tumores cerebrales. De
especial interés sería su papel en los mecanismos apoptóticos de
muerte de células neuronales en la enfermedad de Alzheimer.
La neurofarmacología de un canal de potasio
derivado de cerebro humano regulado por el desarrollo que se expresa
específicamente en las neuronas tiene un potencial importante para
diagnosis, estudio, prevención, y tratamiento de trastornos
patofisiológicos mediados por neuronas disfuncionales. El nuevo
ácido nucleico, así como las biomoléculas peptídicas descritas en
esta memoria tienen valor particular especialmente en la
identificación y el desarrollo de compuestos que modulan la
actividad biológica del canal de potasio in vivo.
La presente invención se refiere a secuencias de
ácido nucleico (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) y de amino-ácidos (SEQ
ID NO: 3) de un nuevo canal de potasio derivado de cerebro humano y
variaciones del mismo y al uso de estas secuencias para identificar
compuestos que modulan la actividad de células especializadas,
especialmente neuronas humanas, como se describe más adelante.
Los compuestos (v.g., moléculas pequeñas,
péptidos, análogos, miméticos) que modulan la actividad biológica
del canal de potasio derivado de cerebro descrito en esta memoria se
contemplan para uso en el tratamiento de una diversidad de
condiciones de enfermedad que incluyen esquizofrenia, ansiedad,
depresión, tumores cerebrales, enfermedades de Huntington,
Alzheimer, Parkinson, y Lou Gehrig, derrame cerebral, epilepsia,
degeneración de la memoria, neurodegeneración esclerosis múltiple,
psicosis, incontinencia urinaria, diabetes, asma, parto prematuro,
hipertensión, isquemia cardíaca y arritmias, dolores de cabeza de
tipo migraña, enfermedades autoinmunes, cáncer, y rechazos de
injertos.
El nuevo canal de potasio derivado de cerebro
humano puede utilizarse para generar anticuerpos de diagnóstico
como se expone más adelante con objeto de detectar niveles anormales
de la biomolécula in vivo. Por tanto, de acuerdo con otro
aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan
anticuerpos contra el polipéptido del canal de potasio que pueden
utilizarse como parte de diversos ensayos de diagnóstico para
detectar trastornos fisiológicos, especialmente
neurofisiológicos.
La presente invención se refiere a un ensayo de
cribado para identificar moléculas que tienen un efecto modulador,
v.g. compuestos que incluyen, pero sin carácter limitante, agonistas
y antagonistas, sobre la actividad biológica del canal de potasio
que comprende el polipéptido del canal de potasio derivado de
cerebro de la presente invención. Un ensayo de este tipo comprende
los pasos de proporcionar un sistema de expresión que produce un
producto de expresión de canal K+ funcional codificado por una
secuencia de ácido nucleico de la presente invención, poner en
contacto el sistema de expresión o el producto del sistema de
expresión con una o más moléculas para determinar su efecto
modulador sobre la bioactividad del producto y seleccionar a partir
de las moléculas un candidato capaz de modular la expresión del
canal K+.
Realizaciones particularmente preferidas de la
presente invención son células hospedadoras transformadas con un
polinucleótido purificado que comprenden una secuencia de ácido
nucleico que codifica el polipéptido que tiene la secuencia
sustancialmente como se representa en SEQ ID no: 3 o un fragmento
biológicamente activo de la misma. Células de este tipo o
preparaciones producidas a partir de ellas pueden utilizarse para
cribado en busca de moduladores farmacológicamente activos de la
actividad del nuevo canal de potasio utilizando métodos que son
bien conocidos en la técnica. Véase, v.g., la Patente de
EE.UU. No. 5.397.702, Assay For and Treatment of Autoimmune
Diseases, expedida el 14 de marzo de 1995; la Patente de EE.UU.
No. 5.637.470, Screening array using cells expressing
recombinant alpha and beta subunits of the mammalian
large-conductance (maxi-K)
potassium channel, expedida el 10 de junio de 1997; la Patente
de EE.UU. No. 5.607.843, Nucleic Acid Sequence Encoding Apamin
Binding Protein, expedida el 4 de marzo de 1997; la Solicitud
Internacional PCT Publicada WO9603415A1, Human Potassium
Channel; y la Patente de EE.UU. No. 5.602.169,
3-substituted oxindole derivatives as potassium
channel modulators, expedida el 11 de febrero de 1997.
Moduladores de este tipo son potencialmente
útiles en el tratamiento de enfermedades que se manifiestan por
células disfuncionales especializadas, en particular neuronas, que
incluyen, pero sin carácter limitante, esquizofrenia, ansiedad,
depresión, tumores cerebrales, enfermedad de Huntington,
enfermedades de Alzheimer, de parkinson, de Lou Gehrig, derrame
cerebral, epilepsia, degeneración de la memoria, neurodegeneración,
esclerosis múltiple, psicosis, esclerosis lateral amiotrófica,
retinitis pigmentosa, degeneración cerebelar, incontinencia
urinaria, diabetes, asma, parto prematuro, hipertensión, isquemia
cardíaca y arritmias, dolores de cabeza de tipo migraña,
enfermedades autoinmunes, cáncer, rechazos de injertos, inflamación
aguda y crónica, alergias, trastornos proliferativos, anemias,
enfermedades neurodegenerativas con componentes inmunológicos, así
como enfermedades autoinmunes que incluyen artritis reumatoide,
diabetes mellitus tipo 1, miastenia grave, lupus eritematoso
sistémico, síndrome de Sjogren, enfermedad mixta del tejido
conectivo, y encefalomielitis alérgica experimental (EAE).
Aplicaciones diagnósticas y terapéuticas
potenciales son fácilmente evidentes para los moduladores de la
biomolécula del canal de potasio humano descrita en esta memoria.
Áreas de trastornos patofisiológicos comunes a enfermedades que
precisan particularmente intervención terapéutica incluyen, pero sin
carácter limitante, trastornos neurofisiológicos manifestados por
neuronas disfuncionales.
De acuerdo con la presente invención,
secuencias de polinucleótidos que codifican el nuevo polipéptido del
canal de potasio neuronal, fragmentos del polipéptido, proteínas de
fusión, o equivalentes funcionales de los mismos pueden utilizarse
en moléculas de DNA recombinante que dirigen la expresión de la
biomolécula neuronal en células hospedadoras apropiadas. Debido a
la degeneración inherente del código genético, otras secuencias de
DNA que codifican sustancialmente la misma secuencia o una secuencia
de aminoácidos funcionalmente equivalente pueden utilizarse para
clonar y expresar la nueva biomolécula neuronal. Como será
comprendido por los expertos en la técnica, puede ser ventajoso
producir nuevas secuencias de nucleótidos codificantes del canal de
potasio que posean codones no existentes naturalmente.
Pueden requerirse también señales de iniciación
específicas para traducción eficiente de una secuencia de ácido
nucleico de canal de potasio. Estas señales incluyen el codón de
iniciación ATG y secuencias adyacentes. En los casos en que la
nueva secuencia de ácido nucleico neuronal, v.g., SEQ ID NO: 2, su
codón de iniciación y secuencias situadas aguas arriba se insertan
en el vector de expresión apropiado, pueden no ser necesarias
señales de control de la traducción adicionales. Sin embargo, en los
casos en que solamente se inserta la secuencia codificante, o una
porción de la misma, deben proporcionarse señales de control de la
transcripción exógenas, con inclusión el codón de iniciación ATG.
Adicionalmente, el codón de iniciación tiene que encontrarse en el
marco de lectura correcto para asegurar la transcripción del inserto
entero. Los elementos de transcripción exógenos y codones de
iniciación pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como
sintéticos.
Las secuencias de ácido nucleico, v.g., SEQ ID
NO: 2, pueden expresarse recombinantemente para producir una
biomolécula de canal de potasio neuronal biológicamente activa por
clonación molecular en un vector de expresión que contenga un
promotor adecuado y otros elementos reguladores de la transcripción
apropiados, y transferirse a células hospedadoras procariotas o
eucariotas para producir el nuevo polipéptido. Técnicas para tales
manipulaciones se describen, por ejemplo, detalladamente en
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, Second Edition,
Cold Spring Harbor Press (1990), y son bien conocidas en la
técnica.
Se describen en esta memoria vectores de
expresión como secuencias de DNA para la transcripción de copias
clonadas de genes y la traducción de sus mRNAs en una célula
hospedadora apropiada. Tales vectores pueden utilizarse para
expresar secuencias de ácido nucleico en una diversidad de
hospedadores tales como bacterias, algas verdeazuladas, células de
plantas, células de insecto, células de hongos, células humanas, y
células animales. Vectores específicamente diseñados permiten el
transporte de DNA entre hospedadores tal como
bacterias-levaduras, o
bacterias-células animales, o
bacterias-células fúngicas, o
bacterias-células de invertebrados.
Pueden utilizarse una diversidad de vectores de
expresión de mamífero para expresar la molécula recombinante con
especificidad neuronal y variaciones de la misma descritas en esta
memoria en células de mamífero. Vectores de expresión de mamífero
disponibles comercialmente que son adecuados para expresión
recombinante incluyen, pero sin carácter limitante, pcDNA3
(Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5
(Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC
37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110),
pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224),
pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198),
pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), e IZD35
(ATCC 37565), pLXIN y pSIR (CLONTECH), pIRES-EGFP
(CLONTECH). INVITROGEN Corporation proporciona una gran diversidad
de vectores/sistemas de expresión de mamífero disponibles en el
comercio que pueden ser utilizados eficazmente con la presente
invención. INVITROGEN, Carlsbad, CA. Véanse también los
productos, vectores y sistemas de PHARMINGEN, San Diego, CA.
Pueden utilizarse también sistemas de expresión
de baculovirus con la presente invención para producir rendimientos
elevados de proteína biológicamente activa. Se prefieren vectores
tales como el sistema de expresión de baculovirus BacPak^{TM} de
CLONETECH, y protocolos que están disponibles comercialmente.
CLONTECH, Palo Alto, CA. Miller, L.K., et al., Curr. Op.
Genet. Dev. 3: 97 (1993); O'Reilly, D.R., et al.,
Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, 127. Se
prefieren también vectores tales como el sistema de expresión de
baculovirus INVITROGEN, MaxBac^{TM}, células de insecto, y
protocolos que están disponibles comercialmente. INVITROGEN,
Carlsbad, CA.
Véase el Ejemplo VI.
Células hospedadoras transformadas con una
secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de canal de
potasio de la presente invención pueden cultivarse en condiciones
adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína
codificada de la célula de cultivo. Realizaciones particularmente
preferidas de la presente invención son células hospedadoras
transformadas con un polinucleótido purificado que comprende una
secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido que tiene
sustancialmente la secuencia representada en SEQ ID NO: 3 o un
fragmento biológicamente activo de la misma. Células de este tipo o
preparaciones producidas a partir de ellas pueden utilizarse para
efectuar cribados respecto a moduladores farmacológicamente activos
de la actividad biológica del canal de potasio. Los moduladores así
identificados pueden ser utilizados para la regulación de la
neurofisiología como se define en esta memoria.
\newpage
Células hospedadoras recombinantes eucariotas
son especialmente preferidas como se describe en otro lugar de esta
memoria o son bien conocidas por los expertos en la técnica.
Ejemplos incluyen, pero sin carácter limitante, levadura, células
de mamífero con inclusión, pero sin carácter limitante, líneas de
células de origen humano, bovino, porcino, de mono y de roedor, y
células de insecto con inclusión pero sin carácter limitante,
líneas de células derivadas de Drosophila y gusano de seda. Líneas
de células derivadas de especies de mamífero que pueden ser
adecuadas y que están disponibles comercialmente, incluyen, pero sin
carácter limitante, células L L-M(TK-) (ATCC
CCL 1.3), células L L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC
CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70),
COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC
CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92),
NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616),
BS-C-1 (ATCC CCL 26) y
MRC-5 (ATCC CCL 171).
Neuronas humanas de STRATAGENE, hNT Neurons,
están disponibles comercialmente para transfección, estudio de
genes de canales iónicos, y cribado de fármacos, La Jolla, CA.
Pleasure, S.J., et al., J. Neuroscience, 12: 1802 (1992); J.
Neuroscience, 35: 585 (1993); Hiraka, G., et al., J. Virol.,
65: 2732 (1991); Wertkin, R., et al., PNAS, 90: 9513 (1993);
Younkin, D.P., et al., PNAS, 90: 2174 (1993).
El vector de expresión puede introducirse en
células hospedadoras que expresan el nuevo polipéptido neuronal de
canales de potasio por la vía de cualquiera de varias técnicas que
incluyen, pero sin carácter limitante, transformación,
transfección, lipofección, fusión de protoplastos, y
electroporación. Kits disponibles comercialmente aplicables para
uso con la presente invención para expresión heteróloga, que
incluyen vectores, reactivos de transfección y condiciones bien
caracterizados(as), y materiales de cultivo de células están
perfectamente establecidos y fácilmente disponibles. CLONTECH, Palo
Alto, CA; INVITROGEN, Carlsbad, CA; PHARMINGEN, San Diego, CA;
STRATAGENE, La Jolla, CA. Las células que contienen el vector de
expresión se propagan clonalmente y se analizan individualmente
para determinar el nivel de producción de la nueva biomolécula de
canal de potasio neuronal. La identificación de clones de células
hospedadoras que expresan el polipéptido puede realizarse por
varios medios, que incluyen, pero sin carácter limitante, la
reactividad inmunológica con anticuerpos descritos en esta memoria,
y/o la presencia de actividad del canal de potasio específico
asociado a la célula hospedadora, y/o la capacidad de reticular
covalentemente el sustrato específico al polipéptido neuronal con
el reactivo de reticulación bifuncional suberato de disuccinimidilo,
o reactivos de reticulación similares.
La biomolécula neuronal de la presente invención
puede expresarse también como una proteína recombinante con uno o
más dominios de polipéptidos adicionales añadidos para facilitar la
purificación de la proteína. Tales dominios facilitadores de la
purificación incluyen, pero sin carácter limitante, péptidos
formadores de quelatos metálicos tales como módulos
histidina-triptófano que permiten la purificación
sobre metales inmovilizados (Porath, J., Protein Exp. Purif. 3: 263
(1992)), dominios de proteína A que permiten purificación sobre
inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema
de purificación por extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp.,
Seattle, WA). La inclusión de una secuencia enlazadora escindible
tal como Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA)
entre el dominio de purificación y la región codificante del canal
de potasio es útil para facilitar la purificación.
Se prefieren sistemas tales como el kit de
purificación de proteínas no desnaturalizante de CLONTECH,
TALON^{TM} para purificación de proteínas marcadas con 6xHis en
condiciones naturales y protocolos que están disponibles
comercialmente. CLONTECH, Palo Alto, CA.
Adicionalmente, puede seleccionarse una cepa de
células hospedadoras por su capacidad para modular la expresión de
las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada de
la manera deseada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen,
pero sin carácter limitante, acetilación, carboxilación,
glicosilación fosforilación, lipidación y acilación. El
procesamiento posterior a la traducción que escinde una forma
naciente de la proteína puede ser importante también para la
inserción, el plegamiento y/o la función correctas. Células
hospedadoras diferentes tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38,
NIH-3T3, HEK 293, etc., tienen maquinaria celular
específica y mecanismos característicos para tales actividades
posteriores a la traducción y pueden seleccionarse a fin de
asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína
extraña introducida.
Para producción de proteínas recombinantes a
largo plazo y con alto rendimiento, se prefiere la expresión
estable. Por ejemplo, líneas de células que expresan de manera
estable el nuevo polipéptido de canal de potasio pueden
transformarse utilizando vectores de expresión que contienen
orígenes de replicación virales o elementos de expresión endógenos
y un gen identificador seleccionable. Después de la introducción del
vector, las células pueden dejarse crecer durante
1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiar
las mismas a medios selectivos. El propósito del identificador
seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia
permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan
satisfactoriamente las secuencias introducidas. Agregados
resistentes de células transformadas de manera estable pueden
hacerse proliferar utilizando técnicas de cultivo de tejidos
apropiadas para el tipo de célula.
La biomolécula neuronal humana descrita en esta
memoria puede producirse en la levadura S. cerevisiae
después de la inserción del cistrón óptimo de cDNA en vectores de
expresión diseñados para dirigir la expresión intracelular o
extracelular de la proteína heteróloga. En el caso de la expresión
intracelular, vectores tales como EmBLyex4 o análogos se ligan al
cistrón de la subunidad beta. Véase, v.g. Rinas, U., et
al., Biotechnology, 8: 543 (1990); Horowitz, B., et al.,
J. Biol. Chem., 265: 4189 (1989). Para la expresión extracelular,
una región codificante del canal de potasio, v.g., SEQ ID NO: 2, se
liga a vectores de expresión de levadura que pueden emplear
cualquiera de una serie de señales de secreción bien caracterizadas.
Los niveles de la molécula del canal de potasio expresada se
determinan por los ensayos descritos en esta memoria.
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Una diversidad de protocolos para detectar y
medir la expresión del nuevo canal de potasio, utilizando
anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para la
proteína se conocen en la técnica. Ejemplos incluyen ensayo de
inmunosorbente unido a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y
clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Puede
emplearse un inmunoensayo de base monoclonal de dos sitios, que
utiliza anticuerpos monoclonales reactivos con dos epítopes no
interferentes. Pueden emplearse también técnicas de fijación
competitivas bien conocidas. Véase v.g., Hampton, R., et al.
(1990), Serological Methods - a Laboratory Manual, APS
Press, St Paul Minn.; Maddox, D.E., et al., J. Exp. Med.
158:1211.
El cDNA de longitud total (SEQ ID NO: 1), por
ejemplo, puede utilizarse en procedimientos estándar para sintetizar
mRNA biológicamente activo para expresión funcional en células
heterólogas, por ejemplo en oocitos de Xenopus, o en diversos tipos
de células de mamífero que incluyen neuronas humanas. Véase, v.g.,
Goldin A, Methods Enzymol, 207:279 (1992); STRATAGENE, hNT Neurons,
commercially available for the study of ion channel genes, La
Jolla, CA.
La región codificante para el nuevo canal de
potasio descrito en esta memoria (v.g., una región que comprende
SEQ ID NO: 2) que codifica el polipéptido que tiene una secuencia
bio-activa sustancialmente como la representada en
SEQ ID NO: 3 o un fragmento biológicamente activo de la misma, puede
clonarse en 3', por ejemplo, a un promotor de bacteriófago, v.g.,
un promotor SP6, T7 o T3. Los vectores PGEM de Promega, Madison, WI,
son ejemplos de vectores preferidos que pueden utilizarse con la
presente invención. Son especialmente preferidos vectores estándar
conocidos en la técnica, tales como pSP64T o pBSTA, que mejoran la
estabilidad del mensaje e incrementan la expresión específica en
oocitos de Xenopus,. Kreig y Melton, Nucleic Acids Res., 12:
7057 (1984). Estos vectores particulares preferidos contienen las
regiones de mRNA no traducidas 5' y 3' de
beta-globina de Xenopus, que flanquean el extremo
5' y una cola poli-A en el extremo 3' del gen.
Un constructo de DNA de vector plasmídico que
contiene una inserción que codifica el nuevo canal de potasio
descrito en esta memoria o un fragmento biológicamente activo del
mismo (v.g., SEQ ID NO: 1, o una región que comprende SEQ ID NO: 2,
o una versión truncada de la misma) puede cortarse luego con una
enzima de restricción para linealizar el constructo 3' a la región
codificante estructural. El vector linealizado debería extraerse
con fenol-cloroformo-alcohol
isoamílico, precipitarse con etanol y re-suspenderse
en agua exenta de RNAsa para uso como molde de transcripción. La
reacción de transcripción, por ejemplo, puede llevarse a cabo como
se describe más adelante para sintetizar mRNA biológicamente activo
para traducción subsiguiente in vivo o in vitro por
métodos que son bien conocidos en la técnica. El kit Message
Machine^{TM}, AMBION, de Austin, TX es especialmente preferido
para sintetizar mRNA biológicamente activo. Alternativamente, los
transcritos de mRNA pueden utilizarse como sondas para análisis de
la distribución tisular por análisis Northern y/o ensayos de
protección de RNAsa.
Se incuba a 37 grados durante
1-2 horas. Se añade 1 \mul de Dnasa exenta de
RNAsa para degradar el DNA molde. Se digiere durante 10 minutos. Se
añaden 75 \mul de agua. Se extrae con fenol/CHCl_{3}. Se
precipita el RNA con etanol. Se guarda en partes alícuotas a -70
grados.
Puede introducirse mRNA biológicamente activo en
células heterólogas para expresión funcional y análisis por métodos
bien conocidos en la técnica. El mRNA sintético de constructos
ilustrativos descritos anteriormente, por ejemplo, puede inyectarse
en oocitos de Xenopus para expresión funcional y análisis.
Goldin, A., Methods Enzymol. 207: 266 (1992). Pueden examinarse
canales de potasio heterólogos utilizando técnicas de pinza de
voltaje estándar de dos electrodos. Véase, v.g., Stuhmer, W.,
Methods in Enzymol., 207: 319 (1992); Kohler, et al.,
Science, 273: 1709 (1996). Las concentraciones de potasio en el
interior de la célula pueden alterarse, por ejemplo, por adición de
un ionóforo de potasio, co-expresión con un receptor
que causa un aumento en el potasio intracelular. Las
concentraciones de potasio pueden alterarse alternativamente por
tracción de parches de dentro afuera y cambio de las
concentraciones de potasio en el medio de baño. V.g. Grissmer, S.,
et al., Calcium-Activated Potassium
Channels in Resting and Activated Human T Lymphocytes, J. Gen.
Physiol., 102: 601 (1993). Pueden ensayarse también parámetros
biofísicos estándar, tales como activación, dependencia de potasio,
conductancia de canales simples, desactivación, corrientes de cola,
selectividad de potasio, y farmacología concienzuda de varios
bloqueadores de canales K que incluyen TEA, Apamin, y otros.
Grissmer, S., et al., Calcium-Activated
Potassium Channels in Resting and Activated Human T Lymphocytes,
J. Gen. Physiol., 102: 601 (1993).
Alternativamente, puede introducirse cRNA (mRNA
sintético procedente de un constructo de cDNA) en células
heterólogas de mamífero; por ejemplo, pueden transformarse RBL (ATCC
#CRL1378), y células 293 (ATCC #CRL 1573), utilizando métodos
estándar de la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse el sistema de
microinyección Eppendorf (Micromanipulator 5171 y Transjector
5242). Las células transformadas pueden analizarse respecto a
corrientes K+ aproximadamente 4 horas después utilizando técnicas
parche-pinza que están bien documentadas.
V.g., Ikeda, et al., Pfueg. Arch. Eur. J. Physiol.,
422: 201 (1992); Grissmer, et al., J. Gen. Physiol., 102:
601 (1993).
Células transfectantes eucariotas transitorias
y/o estables constituidas por la región o regiones
codificante(s) descritas en esta memoria se contemplan para
expresión de alto nivel del nuevo canal de potasio.
Transfectantes eucariotas son realizaciones
preferidas de la presente invención para empleo en estudios de
fijación de dianas farmacológicas para la identificación de
moléculas que bloquean el nuevo canal descrito en esta memoria
in vivo. Son particularmente preferidas células HEK.
La expresión transitoria de regiones
codificantes para el nuevo canal puede lograrse por transfección
directa en células de mamífero, por técnicas estándar. Omari, K.,
et al., J. Physiol., 499: 369 (1997); Panyi, G., et
al., J. Gen. Physiol., 107(3): 409 (1996). La expresión
transitoria de alto nivel puede lograrse utilizando sistemas
virales estándar, v.g., Baculovirus, Adenovirus, o virus Vaccinia.
Los números de canales resultantes de estos sistemas son
típicamente 5-500K por célula. Kamb, A., Methods
Enzymol. 207: 423 (1992); Sun, T., et al., Biochemistry,
33(33): 9992 (1994); Spencer, R.H., et al., J. Biol.
Chem., 272: 2389 (1997).
La transfección estable de células heterólogas
utilizando secuencias que codifican el nuevo canal de potasio
descrito en esta memoria (SEQ ID NO: 3) o variaciones o fragmentos
biológicamente activos del mismo pueden generarse utilizando, por
ejemplo, células NIH-3t3, L929, COS, HEK, o CHO.
Véase, v.g., EMBO, 11 (6): 2033 (1992); Grissmer, et
al., Mol. Pharm., 45: 1227 (1994).
Un vector preferido para uso con la presente
invención es pcDNA/Neo, que está disponible comercialmente de
INVITROGEN, Carlsbad, CA.
Las células, por ejemplo
NIH-3t3, se dejan crecer hasta 50% de confluencia en
placas de 60 mm (los medios y condiciones están de acuerdo con los
requerimientos de la línea de células particular) y se transfectan
con 5 \mug de DNA puro que comprende una región codificante para
el nuevo canal de potasio, v.g. SEQ ID NO: 2, en pCDNA/Neo
utilizando el reactivo Lipofection, como se describe por el
suministrador (LIFE TECHNOLOGIES Gibco BRL, Bethesda, MD). Después
de la transfección, las células se incuban a 37ºC, en condiciones
durante 3 días en medio con 10% de FCS. Las células se siembran
tripsinizadas en cápsulas de 100 mm, y se seleccionan luego con 300
\mug/ml de G418 (Neomicina). Únicamente las células que tienen
integración estable de la región codificante heteróloga crecerán en
presencia de G418, que es conferida por el gen de resistencia a la
neomicina en el plásmido. Los clones aislados se procesan durante
2-3 tandas de purificación y se someten a análisis
parche-pinza respecto a corrientes K+.
Dado que el nuevo gen, v.g., SEQ ID NO: 1 se
expresa a alto nivel en las neuronas diferenciadas, y dado que los
canales de potasio están bloqueados poderosamente por ligandos
particulares que incluyen, pero sin carácter limitante, cloruro de
tetraetilamonio (TEA), 4-aminopiridina
(4-AP, así como 2-AP y
3-AP), 3,4- y 2,3-diaminopiridina,
BaCl_{2}, CsCl, estricnina, fenciclidina, piridostigmina,
9-aminoacridina, DuP-996
(3,3-bis(4-piridinilmetil)-1-fenilindolin-2-ona;
linopiridina), clofilium, quinidina, aminoquinolinas y quinina,
pueden utilizarse diversas líneas de células que sobreexpresan
heterólogamente las regiones codificantes estructurales del nuevo
canal descritas en esta memoria en ensayos de fijación
radiomarcados para efectuar cribados respecto a moléculas
farmacológicamente activas que bloquean el nuevo canal, utilizando
un ligando radiomarcado, como entidad de desplazamiento susceptible
de medición en un ensayo de fijación o ensayo de fijación
competitiva. Pueden utilizarse también toxinas peptídicas que
incluyen, pero sin carácter limitante, esticodactilotoxina, apamina,
caribdotoxina, kaliotoxina, y margotoxina como ligandos en los
ensayos de fijación descritos en esta memoria. Veáse, para
ilustración, el Ejemplo XI.
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Realizaciones de la presente invención son
líneas de células que sobre-expresan heterólogamente
la región codificante del canal de potasio activado por calcio
descrita en esta memoria (v.g., SEQ ID NO: 1 o una versión truncada
biológicamente activa de la misma o una fusión quimérica) y su uso
en ensayos de fijación para identificar moléculas
farmacológicamente activas que bloquean el nuevo canal.
Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo de
fijación radiomarcado que utiliza un ligando radiomarcado como ha
sido descrito previamente por Hill, R.J., Mol. Pharm., 48: 98 (1995)
y Deutsch, C., et al., J. Biol. Chem., 266: 3668 (1991).
Preparaciones de membrana para líneas de células que
sobre-expresan el nuevo canal de potasio descrito
en esta memoria se producen por homogeneización de las células
utilizando un Polytron durante 25 segundos a 13000 rpm y
centrifugación a baja velocidad (100 g) durante 2 minutos. El
sobrenadante se centrifuga a velocidad alta (50.000 g) durante 10
minutos. El sedimento se suspende en 1 ml de tampón de ensayo (NaCl
5 mM, KCL 5 mM, HEPES 10 mM, glucosa 6 mM, pH 8,4) y se diluye a 50
\mug/ml.
Se añaden a cada pocillo de una placa de
microtitulación de 96 pocillos, 130 \mul de tampón de ensayo, y
20 \mul del compuesto de la molécula de test (el fármaco de test
puede ser, por ejemplo, una pequeña molécula, un péptido, un
compuesto análogo o mimético)/tampón de ensayo de control/(ligando
frío 10 nM) inespecífico (sin marcar) 50 \mul de membranas
procedentes de células que sobre-expresan el nuevo
canal de potasio a 50 \mug/ml y 50 \mul de radioligando (25 pM;
NEN, 2200 Ci/mmol) se incuban durante 20 minutos a 21ºC con
mezcladura. El ligando radiomarcado fijado se separa del ligando
radiomarcado libre en solución por filtración sobre Unifilters GF/C
pre-impregnados (Packard Instruments) y lavado
rápido en tampón de lavado enfriado en hielo. Después del secado,
las placas de filtración se someten a conteo de centelleo. Los datos
de los experimentos de saturación se someten a análisis Scatchard y
regresión lineal. Deutsch, et al., J. Biol. Chem., 266: 3668
(1991). Se identifican los compuestos que compiten con el ligando
radiomarcado en cuanto a la fijación del nuevo canal de potasio,
que producen una reducción en los conteos específicos.
En otra realización, un ensayo de centelleo por
proximidad (SPA) que elimina la necesidad de filtros, puede
adaptarse fácilmente para ensayos de cribado de alta capacidad
(HTS). Hoffman, R., et al., Anal. Biochem., 20370 (1992);
Kienuis, C.B.M., et al., J. Recept. Res., 12: 389 (1992).
Se dejan crecer las células hasta confluencia en
DMEM + 10% FCS en placas de 6 pocillos. Las células se incuban en
solución tampón HEPES (en mM: NaCl 137, KCl 4,7, MgSO_{4} 0,6,
CaCl_{2} 1,8, HEPES 20, glucosa 7,7) que contiene ^{86}Rb (5
mCi/ml) durante una noche en una incubadora a 37ºC. Al final de la
incubación, se aspira el HEPES que contiene ^{86}Rb y se lavan
las células con HEPES exento de trazador para retirar el ^{86}Rb
extracelular. Se incuban las células con HEPES exento de trazador
durante 3 minutos y al final de los tres minutos se aspira el HEPES
y se añade a las células HEPES de nuevo aporte. Después que la
liberación basal de ^{86}Rb alcanza un estado estacionario, se
exponen las células a HEPES que contiene una concentración mayor
(20 mM) de KCl durante 6 minutos (3 minx2) seguido por otra solución
que contiene KCl 20 mM y el compuesto de elección durante 12
minutos (3 minx4). Al final del procedimiento se añaden a los
pocillos 500 ml de NaOH y se separan las células por raspado. Las
células de control se tratan con HEPES que contiene KCl 20 mM y
vehículo (DMSO) durante 12 min. Al final del experimento se somete a
conteo la radiactividad en las soluciones aspiradas y las células
en un contador gammma. Se calculan las constantes de velocidad de
eflujo (k min^{-1}), que representa la radiactividad liberada por
minuto expresada como porcentaje de la radiactividad restante en el
tejido. Los resultados se expresan como aumento porcentual máximo en
la constante de velocidad de eflujo obtenida como diferencia entre
el aumento máximo en la constante de velocidad y la constante de
velocidad media durante 10 minutos antes de la aplicación del
compuesto candidato. Véase también el Ejemplo XII.
Alternativamente, una línea de células (v.g.:
HEK 293, CHO, COS o SF9) que expresa heterólogamente una nueva
secuencia de ácido nucleico descrita en esta memoria, v.g., SEQ ID
NO: 2 para producir el péptido biológicamente activo SEQ ID NO: 3,
se incuba con ^{86}RbCl (10 mCi/ml) durante 18 horas a 37 grados
en 5% de CO_{2}. Las células se lavan en medio HBSS con baja
concentración de K+ y se resuspenden a 5,5x10^{6} células/ml en
HBSS con baja concentración de K^{+}. Se incuban 50 \mul de la
suspensión de células durante 15 min a la temperatura ambiente con
10 \mul de compuesto candidato en un pocillo de una placa de
filtración Millipore Multi-Screen de 0,65 \mum de
96 pocillos (#MADV-N6550). La mezcla se incuba luego
durante 20 minutos a la misma temperatura con 125 \mul de
K^{+}-HBSS 140 mM añadidos para iniciar el eflujo
de Rb por despolarización de membrana y se filtra con un colector
de transferencia a vacío TV-1 (Pall Trinity Micro,
Cortland, NY) en placas de microtitulación estándar de 96 pocillos.
Se retiran 100 \mul del filtrado y se someten a conteo en un
contador de centelleo de líquidos Beckman (Palo Alto, CA) durante un
minuto. Los compuestos que inhiben la actividad del canal de
potasio tendrán eflujo de Rb reducido. Véase también el
Ejemplo XII.
Dado que el nuevo canal de potasio descrito en
esta memoria tiene todas las características moleculares de un
canal de potasio con compuerta de voltaje, un ensayo fluorescente
que detecta cambios en el potencial de membrana en las células que
expresan funcionalmente la nueva biomolécula es otro método para
cribado rápido de moléculas pequeñas que modulan la actividad del
canal. Un ensayo de este tipo puede realizarse utilizando tintes
sensibilizadores fluorescentes de potencial de membrana tales como
Bis-oxinol. Brauner, et al., Biochimica et
Biophysica Acta, 771: 208 (1984). Las células que expresan SEQ ID
NO: 2, por ejemplo, se incuban con el tinte y el modulador del
compuesto candidato. La despolarización de la membrana se
desencadena por aumento de la concentración de potasio externamente
a las células. Normalmente, el tinte se distribuye en la membrana
después de la despolarización sensibilizadora, conduciendo a un
cambio de fluorescencia. Las células que expresan SEQ ID NO: 2 se
abrirían en respuesta a la despolarización y el eflujo de los iones
potasio y causarían una hiperpolarización contrapuesta y eficiencia
reducida del tinte para cambiar la fluorescencia. La presencia de
ligandos, sean agonistas o antagonistas del nuevo canal de potasio
modularía cambios de fluorescencia que se detectan ópticamente. El
instrumento FLIPR está disponible actualmente en el comercio de
Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA, y puede adaptarse a un
ensayo de cribado de 96 pocillos muy rápido y sensible.
Véase el Ejemplo XIII.
La presente invención está dirigida también a
métodos para cribado respecto a compuestos que modulan la actividad
biológica del nuevo canal de potasio y/o la actividad biológica de
las neuronas in vivo. Los compuestos que modulan estas
actividades pueden ser DNA, RNA, péptidos, proteínas, o moléculas
orgánicas no proteínicas. Los compuestos pueden modular la
actividad por aumento o atenuación de la expresión del DNA o RNA que
codifica el canal de potasio, o pueden antagonizar o agonizar la
actividad biológica del nuevo canal de potasio propiamente dicho.
Los compuestos que modulan la expresión de DNA o RNA que codifica el
canal de potasio humano o la función del polipéptido pueden
detectarse por una diversidad de ensayos. El ensayo puede ser un
simple ensayo de tipo "sí/no" para determinar si existe un
cambio en la expresión o la función. El ensayo puede hacerse
cuantitativo comparando la expresión o función de una muestra de
test con los niveles de expresión o función en una muestra
estándar.
El canal de potasio derivado de cerebro humano
descrito en esta memoria, sus fragmentos inmunógenos u oligopéptidos
pueden utilizarse para el cribado de compuestos terapéuticos en
cualquiera de una diversidad de técnicas de cribado de fármacos. El
fragmento empleado en un test de este tipo puede estar libre en
solución, fijado a un soporte sólido, transportado en la superficie
de una célula, o localizado intracelularmente. Puede medirse la
supresión de la actividad o la formación de complejos de fijación,
entre la biomolécula del canal de potasio y el agente que se somete
a test. De acuerdo con ello, la presente invención proporciona un
método para el cribado de una pluralidad de compuestos respecto a
afinidad de fijación específica con el polipéptido del canal de
potasio o un fragmento del mismo, que comprende proporcionar una
pluralidad de compuestos; combinar un polipéptido de la presente
invención o un fragmento del mismo con cada uno de una pluralidad de
compuestos durante un tiempo suficiente para permitir la fijación
en condiciones adecuadas; y detectar la fijación de la molécula
trans-activadora, o fragmento de la misma, a cada
uno de la pluralidad de compuestos, identificando de este modo los
compuestos que se fijan específicamente a la biomolécula derivada de
cerebro humano.
Generalmente se prefieren métodos de
identificación de compuestos que modulan la actividad de un
polipéptido de canal de potasio, los cuales comprenden combinar un
compuesto candidato modulador de la actividad biológica de un canal
de potasio con un polipéptido de un canal de potasio que tiene la
secuencia que se describe sustancialmente en SEQ ID NO: 3, y medir
un efecto del modulador del compuesto candidato sobre la actividad
biológica del canal de potasio (v.g., interacción por fijación
física, capacidad de paso de los iones K+, efecto neurofisiológico
sobre las neuronas).
Un método adicional de identificación de
compuestos que modulan la actividad biológica de un canal de
potasio, comprende combinar un compuesto candidato modulador sobre
la actividad biológica de un canal de potasio con una célula
hospedadora que expresa un polipéptido de canal de potasio que tiene
una secuencia sustancialmente como la descrita en SEQ ID NO: 3, y
medir un efecto del compuesto candidato modulador de la actividad
biológica del canal de potasio (v.g., interacción por fijación
física, capacidad de paso de los iones K^{+}, efecto biofísico
medible, efecto neurofisiológico sobre las neuronas).
Otro método preferido es un método de
identificación de compuestos que modulan la neurofisiología, que
comprende combinar un compuesto candidato modulador de la
neurofisiología con un polipéptido de un canal de potasio que tiene
una secuencia sustancialmente como la descrita en SEQ ID NO: 3, y
medir un efecto del compuesto candidato modulador sobe una
actividad biológica del canal de potasio.
Se prefieren también métodos de identificación
de compuestos que modulan la actividad de un canal de potasio y/o
modulan o regulan la neurofisiología, los cuales comprenden combinar
un compuesto candidato modulador con una célula hospedadora que
expresa un polipéptido de canal de potasio (o capaz de
expresar un polipéptido de canal de potasio por v.g. expresión
inducible) que tiene una secuencia sustancialmente como la descrita
en SEQ ID NO: 3, y medir el efecto del compuesto candidato modulador
sobre una actividad biológica o efecto fisiológico del canal de
potasio. Los ensayos celulares preferidos para moduladores están
comprendidos en dos categorías generales:
1) medida directa de la actividad biológica
física del canal de potasio, y 2) medida del efecto fisiológico o
neurofisiológico. Estos métodos pueden emplear el canal de potasio
endógeno derivado de cerebro descrito en esta memoria, o un
polipéptido de canal de potasio recombinante sobreexpresado en
células heterólogas, que incluyen neuronas humanas.
\newpage
A fin de purificar un polipéptido de canal de
potasio para medir una actividad de fijación biológica, la fuente
puede ser un lisado de células enteras, preparado por 1 a 3 ciclos
congelación-descongelación en presencia de
inhibidores estándar de proteasas. El canal de potasio puede
purificarse parcial o completamente por métodos estándar de
purificación de proteínas. Los polipéptidos del canal de potasio
descrito en esta memoria pueden purificarse por cromatografía de
afinidad utilizando anticuerpos específicos descritos en esta
memoria o por ligandos específicos para un identificador epitópico
modificado por ingeniería genética en la molécula recombinante
descrita con mayor detalle en esta memoria. La preparación puede
ensayarse luego respecto a actividad de fijación como se
describe.
Polipéptidos purificados que comprenden la
secuencia de aminoácidos sustancialmente como la que se muestra en
SEQ ID NO: 3 son realizaciones especialmente preferidas de la
presente invención.
Los compuestos que se identifican generalmente
de acuerdo con los métodos descritos, referenciados, y contemplados
en esta memoria que modulan la actividad de un canal de potasio
(preferiblemente regulan la fisiología, y muy preferiblemente
regulan la neurofisiología) son realizaciones especialmente
preferidas de la presente invención.
Una realización especialmente preferida de la
presente invención es un método para el tratamiento de un paciente
que se encuentra en necesidad de dicho tratamiento para una
condición que está mediada por el nuevo canal de potasio derivado
de cerebro humano descrito en esta memoria, que comprende la
administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un
compuesto modulador del canal de potasio identificado por un método
descrito en esta memoria.
Otra realización especialmente preferida de la
presente invención es un método para el tratamiento de un paciente
que se encuentra en necesidad de dicho tratamiento para una
condición que está mediada por neuronas disfuncionales, o un
trastorno neurofisiológico, que comprende la administración de una
cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto modulador del
canal de potasio identificado por un método descrito en esta
memoria.
Una realización adicional especialmente
preferida de la presente invención es un método para el tratamiento
de un paciente que se encuentra en necesidad de dicho tratamiento
por una condición que está mediada por neurofisiología, que
comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz
de un compuesto modulador de la neurofisiología identificado por un
método descrito en esta memoria.
En otra realización de la invención, una
secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de canal de
potasio sustancialmente como la representada en SEQ ID NO: 3 o un
fragmento biológicamente activo de la misma, puede ligarse a una
secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por
ejemplo, para el cribado de compuestos para modulación de la
actividad biológica, que se describe con mayor detalle más adelante,
puede ser útil codificar una molécula quimérica de canal de potasio
como se describe en esta memoria para la expresión en células
hospedadoras heterólogas. Pueden utilizarse también constructos
quiméricos para expresar un "cebo", de acuerdo con métodos
bien conocidos que utilizan un sistema de levadura de dos híbridos,
a fin de identificar péptidos nativos accesorios que pueden estar
asociados con la nueva biomolécula neuronal descrita en esta
memoria. Fields, S., et al., Trends Genet., 10: 286 (1994);
Allen, J.B., et al., TIBS, 20:511 (1995). Ha sido descrito
un sistema de levadura de dos híbridos en el cual pueden detectarse
interacciones proteína:proteína utilizando un ensayo genético
basado en levadura por reconstitución de activadores de la
transcripción. Fields, S., Song, O., Nature 340:245 (1989). El
sistema de dos híbridos utilizaba la capacidad de un par de
proteínas interaccionantes para poner un dominio de activación de
la transcripción en proximidad estrecha con un sitio de fijación de
DNA que regula la expresión de un gen informador adyacente. Con la
presente invención pueden utilizarse sistemas y protocolos
disponibles comercialmente tales como el CLONTECH,
Matchmaker^{TM}. CLONTECH, Palo Alto CA. Véase también
Mendelsohn, A.R., Brent, R., Curr. Op. Biotech., 5:482 (1994);
Phizicky. E.M., Fields, S., Microbiological Rev., 59(1):94
(1995); Yang, M., et al., Nucleic Acids Res.,
23(7):1152 (1995); Fields, S., Stemglanz, R., TIG,
10(8):286 (1994); y las Patentes de EE.UU. 5.283.173,
System to Detect Protein-Protein
Interactions, y 5.468.614.
Sistemas de cribado modificados, por ejemplo,
pueden llevarse a la práctica sea con una lectura positiva o con
una lectura negativa tal como la que figura en las versiones
recientemente desarrolladas del método "Reverse Y2H".
Véase, v.g. Vidal M, Braun P, Chen E, Boeke JD, Harlow E
(1996) Genetic characterization of a mammalian
protein-protein interaction domain by using a yeast
reverse two-hybrid system, Proc Natl Acad Sci U
S A 17; 93(19):10321-10326; Vidal M,
Brachmann RK, Fattaey A, Harlow E, Boeke JD (1996) Reverse
two-hybrid and one-hybrid systems
to detect dissociation of protein-protein and
DNA-protein interactions. Proc Natl Acad Sci U
S A 17; 93(19):10315-10320; White MA (1996)
The yeast two-hybrid system: forward and
reverse, Proc Natl Acad Sci U S A
17;93(19):10001-10003; Leanna CA, Hannink M
(1996), The reverse two-hybrid system: a genetic
scheme for selection against specific protein/protein
interactions, Nucleic Acids Res
1;24(17):3341-3347.
Los anticuerpos monoespecíficos para la
biomolécula neuronal de la presente invención se purifican a partir
de antisueros de mamífero que contienen anticuerpos reactivos contra
el polipéptido o se preparan como anticuerpos monoclonales
reactivos con un polipéptido de canal de potasio derivado de cerebro
humano utilizando la técnica de Kohler y Milstein, Nature, 256:495
(1975). El anticuerpo monoespecífico, como se utiliza en esta
memoria, se define como una sola especie de anticuerpo o una
especie de anticuerpos múltiples con características de fijación
homogéneas para el nuevo canal de potasio derivado de cerebro
humano. Fijación homogénea, como se utiliza en esta memoria, hace
referencia a la capacidad de la especie de anticuerpo para fijarse a
un antígeno o epítope específico, tal como los asociados con el
nuevo activador de la transcripción, como se ha descrito.
Anticuerpos específicos de canales de potasio neuronales humanos se
producen por inmunización de animales tales como ratones, ratas,
cobayos, conejos, cabras, caballos y análogos, prefiriéndose los
conejos, con una concentración apropiada del canal de potasio
neuronal humano con o sin un adyuvante inmune.
Se recoge suero preinmune antes de la primera
inmunización. Cada animal recibe entre aproximadamente 0,1 mg y
aproximadamente 1000 mg del polipéptido del canal de potasio
neuronal asociado con un adyuvante inmune aceptable. Tales
adyuvantes aceptables incluyen, pero sin carácter limitante,
adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund,
precipitado de alumbre, emulsión de agua en aceite que contiene
Corynebacterium parvum y tRNA. La inmunización inicial consiste en
un polipéptido de canal de potasio neuronal en, preferiblemente,
adyuvante de Freund completo en sitios múltiples sea por vías
subcutánea (SC), intraperitoneal (IP) o ambas. Cada animal se
sangra a intervalos regulares, preferiblemente cada semana, para
determinar el título de anticuerpos. Los animales pueden recibir o
no inyecciones de refuerzo después de la inmunización inicial. A
aquellos animales que reciben inyecciones de refuerzo se les
suministra generalmente una cantidad igual del antígeno en adyuvante
incompleto de Freund por la misma ruta. Las inyecciones de refuerzo
se administran a intervalos de aproximadamente 3 semanas hasta que
se obtienen los títulos máximos. Al cabo de aproximadamente 7 días
después de cada inmunización de refuerzo o aproximadamente cada
semana después de una sola inmunización, se sangran los animales, se
recoge el suero, y se guardan partes alícuotas a aproximadamente
-20ºC.
Los anticuerpos monoclonales (mAb) reactivos con
el polipéptido del canal de potasio derivado de cerebro se preparan
por inmunización de ratones endogámicos, preferiblemente Balb/c, con
un polipéptido de canal de potasio. Los ratones se inmunizan por la
ruta IP o SC con aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg, con
preferencia aproximadamente 1 mg, del nuevo polipéptido del canal
de potasio neuronal en aproximadamente 0,5 ml de tampón o solución
salina incorporado(a) en un volumen igual de un adyuvante
aceptable, como se ha expuesto anteriormente. Se prefiere adyuvante
completo de Freund. Los ratones reciben una inmunización inicial el
día 0 y descansan durante aproximadamente 3 a aproximadamente 30
semanas. Los ratones inmunizados reciben una o más inmunizaciones
de refuerzo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg del
polipéptido del canal de potasio neuronal en una solución tampón
tal como solución salina tamponada con fosfato por vía intravenosa
(IV). Se obtienen linfocitos a partir de ratones positivos en
anticuerpos, preferiblemente linfocitos esplénicos, extirpando los
bazos de los ratones inmunizados por procedimientos estándar
conocidos en la técnica. Se producen células de hibridoma por
mezcla de los linfocitos esplénicos con una pareja de fusión
apropiada, preferiblemente células de mieloma, en condiciones que
harán posible la formación de hibridomas estables. Las parejas de
fusión pueden incluir, pero sin carácter limitante: mielomas de
ratón P3/NS1/Ag 4-1; PMC-11;
S-194 y Sp 2/0, prefiriéndose Sp 2/0. Las células
productoras de anticuerpos y las células de mieloma se fusionan en
polietilenglicol, de masa molecular aproximadamente 1000, a
concentraciones que van desde aproximadamente 30% a aproximadamente
50%. Las células de hibridoma fusionadas se seleccionan por
crecimiento en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)
suplementado con hipoxantina, timidina y aminopterina, por
procedimientos conocidos en la técnica. Los fluidos sobrenadantes
se recogen a partir de las células de crecimiento positivo alrededor
de los días 14, 18 y 21 y se criban respecto a la producción de
anticuerpos por un inmunoensayo tal como el radioinmunoensayo en
fase sólida (SPIRA) utilizando el polipéptido del canal de potasio
neuronal humano como antígeno. Los fluidos de cultivo se someten
también a test en el ensayo de precipitación de Ouchterlony para
determinar el isotipo del mAb. Las células de hibridoma procedentes
de pocillos positivos en anticuerpos se clonan por una técnica tal
como la técnica de agar blando de MacPherson, Soft Agar Techniques,
en Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson,
Eds., Academic Press, 1973.
Se producen anticuerpos monoclonales in
vivo por inyección de ratones Balb/c cebados con pristano,
aproximadamente 0,5 ml por ratón, con aproximadamente 2x10^{6} a
aproximadamente 6x10^{6} células de hibridoma aproximadamente 4
días después del cebado. Se recoge fluido de ascitis al cabo de
aproximadamente 8-12 días después de la
transferencia de las células y se purifican los anticuerpos
monoclonales por métodos conocidos en la técnica.
La producción in vitro del mAb
anti-polipéptido del canal de potasio neuronal
humano se lleva a cabo por cultivo de hibridoma en DMEM que
contiene aproximadamente 2% de suero de ternero fetal para obtener
cantidades suficientes del mAb específico. Los mAb se purifican por
métodos conocidos en la técnica.
Los títulos de anticuerpos de los fluidos de
ascitis o de cultivo de hibridoma se determinan por diversos
ensayos serológicos o inmunológicos que incluyen, pero sin carácter
limitante, precipitación, aglutinación pasiva, la técnica de
anticuerpo de inmunosorbente unido a enzima (ELISA) y técnicas de
radioinmunoensayo (RIA). Se utilizan ensayos de diagnóstico
similares para detectar la presencia de la biomolécula del nuevo
canal de potasio en fluidos corporales o tejidos y extractos de
células.
Los ensayos de diagnóstico que utilizan los
anticuerpos específicos del polipéptido del canal de potasio
neuronal humano son útiles para la diagnosis de condiciones,
trastornos o enfermedades caracterizados por expresión anormal del
canal de potasio o expresión de genes asociados con el crecimiento
anormal de células o neurofisiología anormal. Ensayos de
diagnóstico para la biomolécula neural de esta invención incluyen
métodos que utilizan el anticuerpo y una marcador para detectar el
polipéptido del canal de potasio humano en fluidos del cuerpo
humano, células, tejidos o secciones o extractos de tales tejidos.
Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden
utilizarse con o sin modificación. Frecuentemente, los polipéptidos
y anticuerpos se marcarán por fijación de los mismos, sea covalente
o no covalentemente, con una molécula informadora, un sinnúmero de
las cuales son bien conocidas por los expertos en la técnica.
Una diversidad de protocolos para medida del
polipéptido del canal de potasio, que utilizan anticuerpos
policlonales o monoclonales específicos para la proteína respectiva
se conocen en la técnica. Ejemplos incluyen ensayo de
inmunosorbente unido a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y
clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Se
prefiere un inmunoensayo de dos sitios, basado en anticuerpos
monoclonales, que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos con
dos epítopes no interferentes en el polipéptido del canal de potasio
derivado de cerebro humano, pero puede emplearse un ensayo de
fijación competitiva. Estos ensayos se describen, entre otros
lugares, en Maddox, D.E. et al., J. Exp. Med. 158:1211
(1983); Sites, D.P., et al., Basic and Clinical
Immunology, Cap. 22, 4ª Ed., Lange Medical Publications, Los
Altos, CA (1982); Patentes de EE.UU. No. 3.654.090, No. 3.850.752;
y No. 4.016.043.
Con objeto de proporcionar una base para la
diagnosis de una enfermedad, deben establecerse los valores normales
o estándar para la expresión del polipéptido del canal de potasio
humano. Esto se realiza por combinación de fluidos corporales o
extractos de células tomados de individuos normales, sean animales o
humanos, con anticuerpo para la biomolécula del canal neuronal
humano en condiciones adecuadas para formación de complejos que son
bien conocidas en la técnica. La cantidad de formación del complejo
estándar puede cuantificarse por comparación del mismo con una
serie de dilución de controles positivos en la que una cantidad
conocida de anticuerpos se combina con concentraciones conocidas
del polipéptido del canal de potasio purificado. A continuación,
los valores estándar obtenidos a partir de muestras normales pueden
compararse con valores obtenidos a partir de muestras de individuos
potencialmente afectados por un trastorno o enfermedad relacionada
con la expresión de la biomolécula del canal. La desviación entre
los valores estándar y los del individuo establece la presencia del
estado de enfermedad.
Pueden prepararse kits que contienen ácido
nucleico del canal de potasio, anticuerpos para un polipéptido del
canal, o proteínas. Tales kits se utilizan para detectar ácido
nucleico heterólogo que se hibrida al ácido nucleico del canal de
potasio, o para detectar la presencia de fragmentos de proteína o
péptido en una muestra. Dicha caracterización es útil para una
diversidad de propósitos que incluyen, pero sin carácter limitante,
análisis forenses y estudios epidemiológicos.
Las moléculas de DNA, moléculas de RNA, proteína
recombinante y anticuerpos de la presente invención pueden
utilizarse para cribar y medir niveles de DNA, RNA o proteína del
nuevo canal de potasio. Las proteínas recombinantes, moléculas de
DNA, moléculas de RNA y anticuerpos se prestan por sí mismos a la
formulación de kits adecuados para la detección y la tipificación
de la nueva biomolécula del canal de potasio humano. Un kit de este
tipo podría comprender un vehículo compartimentalizado adecuado
para retener en confinamiento estrecho al menos un recipiente. El
vehículo comprendería adicionalmente reactivos tales como
anticuerpos recombinantes del canal de potasio o
anti-canal de potasio adecuados para detectar la
biomolécula del nuevo canal de potasio. El vehículo puede contener
también un medio para detección, tal como un antígeno marcado o
sustratos enzimáticos, o similares.
Secuencias polinucleotídicas que codifican el
nuevo canal de potasio pueden utilizarse para la diagnosis de
condiciones o enfermedades con las cuales está asociada la expresión
de la nueva biomolécula neurofisiológica. Por ejemplo, secuencias
de polinucleótidos que codifican un canal de potasio pueden
utilizarse en ensayos de hibridación o PCR de fluidos o tejidos
procedentes de biopsias para detectar la expresión de la
biomolécula. La forma de tales métodos cualitativos o cuantitativos
puede incluir análisis Southern o Northern, tecnologías de
transferencia de puntos u otras tecnologías basadas en membranas;
tecnologías PCR; y tecnologías de varilla de inmersión, clavija,
chip y ELISA. Todos estos métodos son bien conocidos en la técnica y
constituyen la base de muchos kits de diagnóstico disponibles
comercialmente. Tales ensayos pueden utilizarse también para
evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico
particular en estudios con animales, en pruebas clínicas, o en
monitorización del tratamiento de un paciente individual. Una vez
que se establece la enfermedad, se administra un agente terapéutico
y se genera un perfil de tratamiento. Tales ensayos pueden repetirse
sobre una base regular para evaluar si los valores en el perfil
evolucionan hacia o regresan al patrón normal o estándar. Pueden
utilizarse perfiles de tratamiento sucesivos para mostrar la
eficacia del tratamiento a lo largo de un periodo de varios días o
varios meses.
Las secuencias de polinucleótidos que codifican
el nuevo canal de potasio humano pueden emplearse también en
análisis para mapear localizaciones cromosómicas, v.g., cribado
respecto a asociación funcional con identificadores de enfermedad.
Además, las secuencias descritas en esta memoria se contemplan para
uso en la identificación de polimorfismos de secuencia humanos y
posible asociación con enfermedades así como análisis para
seleccionar la secuencia óptima de entre secuencias polimórficas
posibles para el diseño de compuestos a fin de modular la actividad
biológica y regular por consiguiente trastornos fisiológicos, muy
preferiblemente trastornos neurofisiológicos in vivo.
Adicionalmente, las secuencias se contemplan como herramientas de
cribado para uso en la identificación de individuos humanos y
pacientes apropiados para pruebas terapéuticas clínicas.
\newpage
Es inmediatamente evidente para los expertos en
la técnica que los métodos para producción de anticuerpos pueden
utilizarse para producir anticuerpos específicos para fragmentos del
polipéptido del canal de potasio, o el polipéptido del canal de
potasio humano naciente de longitud total. De modo específico, es
inmediatamente evidente para las personas expertas en la técnica
que pueden generarse anticuerpos que son específicos para la
biomolécula totalmente funcional o fragmentos de la misma.
Las columnas de afinidad de anticuerpos y
polipéptidos de canales de potasio se preparan por adición de los
anticuerpos a Affigel-10 (Biorad), un soporte de gel
que se activa con ésteres de N-hidroxisuccinimida de
tal modo que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el
soporte de cuentas de gel de agarosa. Los anticuerpos se acoplan
luego al gel por enlaces amídicos con la rama espaciadora. Los
ésteres activados restantes se extinguen luego con
etanolamina\cdotHCl 1 M (pH 8). La columna se lava con agua
seguido por glicina\cdotHCl 0,23 M (pH 2,6) para eliminar
cualquier anticuerpo o proteína extraña no conjugado(a). La
columna se equilibra luego en solución salina tamponada con fosfato
(pH 7,3) con detergente apropiado y los sobrenadantes del cultivo
de células o extractos de células, por ejemplo, que contienen el
polipéptido del canal de potasio humano producidos utilizando
detergentes solubilizantes de membrana apropiados se pasan
lentamente a través de la columna. La columna se lava luego con
solución salina tamponada con fosfato/detergente hasta que la
densidad óptica desciende al valor base, después de lo cual se
eluye la proteína con glicina-HCl 0,23 M (pH
2,6)/detergente. El polipéptido del canal de potasio purificado se
dializa luego contra solución salina tamponada con
fosfato/detergente.
Las moléculas del canal de potasio recombinantes
pueden separarse de otras proteínas celulares por el uso de una
columna de inmunoafinidad construida con anticuerpos monoclonales o
policlonales específicos para el polipéptido del canal de potasio
humano naciente de longitud total, o fragmentos polipeptídicos de la
biomolécula.
Los polipéptidos del canal de potasio descritos
en esta memoria pueden utilizarse para purificar por afinidad
efectores biológicos a partir de materiales biológicos nativos,
v.g., tejido de la enfermedad. Los métodos de cromatografía por
afinidad son bien conocidos por los expertos en la técnica. Un
péptido de canal de potasio descrito en esta memoria o un fragmento
eficaz del mismo, se fija a una matriz sólida, v.g. Sepharosa
activada con CNBr de acuerdo con el protocolo del suministrador
(Pharmacia, Piscataway, NJ), y se pasa a través de la columna una
solución de células homogeneizada/tamponada que contiene una
molécula de interés potencial. Después del lavado, la columna
retiene únicamente el efector biológico que se eluye
subsiguientemente, v.g., utilizando ácido acético 0,5 M o un
gradiente de NaCl.
La secuencia de cDNA SEQ ID NO: 1 proporcionada
en esta memoria, puede utilizarse en otra realización de la
invención para estudiar la relevancia fisiológica del nuevo canal de
potasio en células por desactivación de la expresión del gen
endógeno mediante el uso de constructos antisentido.
Para hacer posible que los métodos de regulación
decreciente de la expresión del nuevo canal de potasio de la
presente invención en células de mamífero, puede construirse
fácilmente un constructo ilustrativo de expresión antisentido que
contiene la secuencia de DNA complementaria para la secuencia
descrita sustancialmente como se representa en SEQ ID NO: 2,
utilizando por ejemplo el vector pREP10 (Invitrogen Corporation). Se
espera que los transcritos inhiban la traducción del mRNA del canal
de potasio de tipo salvaje en células transfectadas con este
constructo tipo. Los transcritos antisentido son eficaces para
inhibir la traducción del transcrito del gen nativo, y capaces de
inducir los efectos (v.g., regulación de trastornos
neurofisiológicos) descritos en esta memoria. La traducción se
inhibe muy eficazmente por bloqueo del mRNA en un sitio localizado
en o cerca del codón de iniciación. Así, se prefieren
oligonucleótidos complementarios a la región 5' terminal
correspondiente del transcrito de mRNA del canal de potasio. La
estructura secundaria o terciaria que podría interferir con la
hibridación es mínima en esta región. Además, secuencias que se
encuentran demasiado distantes en la dirección 3' del sitio de
iniciación pueden ser menos eficaces en la hibridación de los
transcritos de mRNA debido a un fenómeno de "lectura completa"
por el cual el ribosoma parece desenredar el dúplex
antisentido/sentido para permitir la traducción del mensaje. Se
contemplan oligonucleótidos que son complementarios para e
hibridables con cualquier porción del nuevo mRNA del canal de
potasio, para uso terapéutico.
La Patente de EE.UU. No. 5.639.595,
Identification of Novel Drugs and Reagents, expedida el 17 de
junio de 1997, describe detalladamente métodos de identificación de
secuencias oligonucleotídicas que exhiben actividad in vivo.
Los vectores de expresión que contienen secuencias
oligonucleotídicas aleatorias derivadas de polinucleótidos
previamente conocidos se transforman en células. Las células se
ensayan luego respecto a un fenotipo resultante de la actividad
deseada del oligonucleótido. Una vez que se han identificado células
con el fenotipo deseado, puede identificarse la secuencia del
oligonucleótido que tiene la actividad deseada. La identificación
puede realizarse por recuperación del vector o por amplificación
mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y secuenciación
de la región que contiene el material de ácido nucleico
insertado.
Las secuencias de nucleótidos que son
complementarias para la secuencia de polinucleótidos que codifica el
nuevo polipéptido del canal de potasio pueden sintetizarse respecto
para terapia antisentido. Estas moléculas antisentido pueden ser
DNA, derivados estables de DNA tales como fosforotioatos o
metilfosfonatos, RNA, derivados estables de RNA tales como
2'-O-alquilRNA, u otros miméticos
oligonucleotídicos. La Patente de EE.UU. No. 5.652.355, Hybrid
Oligonucleotide Phosphorothioates, expedida el 29 de julio de
1997, y la Patente de EE.UU. No. 5.652.356, Inverted Chimeric
and Hybrid Oligonucleotides, expedida el 29 de julio de 1997,
describen la síntesis y el efecto de moléculas antisentido
fisiológicamente estables. Moléculas antisentido de canales de
potasio pueden introducirse en células por microinyección,
encapsulación de liposomas o por expresión a partir de vectores que
albergan la secuencia antisentido. La terapia antisentido puede ser
particularmente útil para el tratamiento de enfermedades en las
cuales es beneficioso modular la actividad biológica del canal de
potasio descrito en esta memoria.
Un polipéptido de canal de potasio descrito en
esta memoria puede administrarse a un individuo por terapia génica.
Un polipéptido de la presente invención puede suministrarse a las
células de órganos diana de esta manera. Inversamente, puede
utilizarse terapia génica antisentido con polipéptidos de
canales de potasio para modular la expresión del polipéptido en las
células u órganos diana y regular con ello la actividad biológica.
La región codificante del polipéptido del canal de potasio puede
ligarse a vectores virales que median la transferencia del ácido
nucleico polipeptídico trans-activador por infección
de células hospedadoras receptoras. Vectores virales adecuados
incluyen retrovirus, adenovirus, virus
adeno-asociados, herpesvirus, virus vaccinia,
poliovirus y análogos. Véase, v.g., la Patente de EE.UU. No.
5.624.820, Episomal Expression Vector for Human Gene
Therapy, expedida el 29 de abril de 1997.
Las regiones codificantes de ácido nucleico de
la presente invención se incorporan en vectores de expresión
eucariotas eficaces, que se administran directamente o se introducen
en células somáticas para terapia génica (un fragmento de ácido
nucleico que comprende una región codificante, preferiblemente
transcritos de mRNA, puede administrarse también directamente o
introducirse en células somáticas). Véase, v.g., la Patente de
EE.UU. No. 5.589.466, expedida el 31 de diciembre de 1996. Tales
ácidos nucleicos y vectores pueden mantenerse episómicos o pueden
incorporarse en el DNA cromosómico hospedador como un provirus o
porción del mismo que incluye la fusión de genes y señales de
transcripción y traducción eucariotas apropiadas, es decir, un
promotor 5' de RNA-polimerasa posicionado
eficazmente respecto al sitio de comienzo de la transcripción y un
codón de iniciación de la traducción ATG del gen de fusión así como
uno o más codones de terminación y señales de poliadenilación del
transcrito situadas eficazmente en posición 3' respecto a la región
codificante. Alternativamente, el DNA del polipéptido del nuevo
canal de potasio puede transferirse a células para terapia génica
por técnicas no virales que incluyen transferencia de DNA
direccionada y mediada por receptores utilizando conjugados
ligando-DNA o conjugados
adenovirus-ligando-DNA, fusión de
membranas por lipofección o microinyección directa. Estos
procedimientos y variaciones de los mismos son adecuados para
terapia génica humana, tanto ex vivo como in vivo, de
acuerdo con métodos establecidos en esta técnica.
La secuencia de ácido nucleico,
oligonucleótidos, fragmentos, porciones o moléculas antisentido de
las mismas, puede(n) utilizarse en ensayos de diagnóstico de
fluidos corporales o tejidos de biopsia para detectar el nivel de
expresión de la nueva molécula de canal de potasio derivada de
cerebro humano. Por ejemplo, secuencias diseñadas a partir de la
secuencia de cDNA SEQ ID NO: o secuencias comprendidas en SEQ ID NO:
2 pueden utilizarse para detectar la presencia de los transcritos
de mRNA en un paciente o para monitorizar la modulación de
transcritos durante el tratamiento.
Un método para amplificación de ácidos nucleicos
diana, o para análisis posterior por ensayos de hibridación, es
conocido como la reacción en cadena de polimerasa ("PCR") o
técnica PCR. La técnica PCR puede aplicarse para detectar
secuencias de la invención en muestras sospechosas utilizando
iniciadores oligonucleotídicos separados unos de otros y basados en
la secuencia genética, v.g., SEQ ID NO: 1 expuesta en esta memoria.
Los iniciadores son complementarios a las cadenas opuestas de una
molécula de DNA bicatenario y están separados típicamente por
aproximadamente 50 a 450 nucleótidos o más (usualmente no más de
2000 nucleótidos). Este método permite preparar los iniciadores
oligonucleotídicos específicos seguidos por ciclos repetidos de
desnaturalización del DNA diana, cebado con iniciadores, y
extensión con una DNA-polimerasa para obtener
fragmentos de DNA de la longitud esperada basándose en la
separación de los iniciadores. Una realización ilustrativa de la
presente invención es una composición de diagnóstico para la
identificación de una secuencia de polinucleótidos que comprende la
secuencia sustancialmente como se representa en SEQ ID NO: 2, que
comprende los iniciadores PCR sustancialmente como se representan
en Ejemplo II. El grado de amplificación de una secuencia diana se
controla por el número de ciclos que se realizan y se calcula
teóricamente por la fórmula simple 2n, donde n es el número de
ciclos. Véase, v.g., Perkin Elmer, PCR
Bibliography, Roche Molecular Systems, Branchburgh, New Jersey;
CLONTECH Products, Palo Alto, CA; Patente de EE.UU. No. 5.629.158,
Solid Phase Diagnosis of Medical Conditions, expedida el 13
de mayo de 1997.
Composiciones farmacéuticamente útiles que
comprenden secuencias pertenecientes al nuevo polipéptido de canal
de potasio, DNA, RNA, secuencias antisentido, o el polipéptido
humano propiamente dicho, o variantes o análogos que tienen
actividad biológica o cualesquiera otros compuestos que modulan la
fisiología celular identificados por métodos citados en esta
memoria, pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos tales
como por mezcla de un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Ejemplos de tales vehículos y métodos de formulación pueden
encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack
Publishing Co., Easton, PA). Para formar una composición
farmacéuticamente aceptable adecuada para administración eficaz,
tales composiciones contendrán una cantidad eficaz de la proteína,
DNA, RNA, o compuesto modulador.
Las composiciones terapéuticas o diagnósticas de
la invención se administran a un individuo en cantidades
suficientes para tratar o diagnosticar trastornos fisiológicos o
trastornos neurofisiológicos humanos. La cantidad eficaz puede
variar de acuerdo con una diversidad de factores tales como el
estado del individuo, el peso, el sexo y la edad. Otros factores
incluyen el modo de administración.
El término "derivado químico" describe una
molécula que contiene restos químicos adicionales que no forman
parte normalmente de la molécula base. Tales restos pueden mejorar
la solubilidad, la semi-vida, la absorción, etc. de
la molécula base. Alternativamente, los restos pueden atenuar
efectos secundarios indeseables de la molécula base o reducir la
toxicidad de la molécula base. Ejemplos de tales restos se describen
en una diversidad de textos, tales como Remington's
Pharmaceutical Sciences.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
uso en la presente invención incluyen composiciones en las cuales
los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz
para alcanzar la finalidad propuesta. La determinación de una dosis
eficaz está perfectamente dentro de la capacidad de los expertos
en la técnica. La dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse
inicialmente en ensayos de cultivo de células, v.g., de células
neoplásticas, o en modelos animales, usualmente ratones, conejos,
perros o cerdos. El modelo animal se utiliza también para alcanzar
un intervalo de concentración y ruta de administración deseables.
Dicha información puede utilizarse luego para determinar dosis y
vías útiles para administración en humanos. Una dosis
terapéuticamente eficaz hace referencia a aquella cantidad de
proteína o sus anticuerpos, antagonistas, o inhibidores que mejoran
los síntomas o la condición. La dosis exacta es seleccionada por el
médico individual teniendo en cuenta el paciente a tratar.
Los compuestos identificados de acuerdo con los
métodos descritos en esta memoria pueden utilizarse solos a dosis
apropiadas definidas por pruebas de rutina a fin de obtener la
modulación óptima de una actividad biológica de canal de potasio
y/o condición fisiológica, o su actividad al tiempo que se minimiza
cualquier toxicidad potencial. Adicionalmente, puede ser deseable
la co-administración o administración secuencial de
otros agentes.
Las composiciones farmacéuticas pueden
proporcionarse al individuo por una diversidad de rutas tales como
la administración subcutánea, tópica, oral e intramuscular. La
administración de las composiciones farmacéuticas se realiza por
vías oral o parenteral. Los métodos de suministro parenteral
incluyen administración tópica, intra-arterial
(directamente al tejido), intramuscular, subcutánea, intramedular,
intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, o
intranasal. La presente invención tiene también el objetivo de
proporcionar formulaciones farmacéuticas tópicas, orales,
sistémicas y parenterales adecuadas para uso en los nuevos métodos
de tratamiento de la presente invención. Las composiciones que
contienen los compuestos identificados de acuerdo con esta
invención como el ingrediente activo para uso en la modulación de
condiciones fisiológicas pueden administrarse en una gran
diversidad de formas de dosificación terapéutica en vehículos de
administración convencionales. Por ejemplo, los compuestos se
pueden administrar en formas de dosificación oral tales como
tabletas, cápsulas (incluyendo cada una formulaciones de liberación
a intervalos regulares y liberación prolongada), píldoras, polvos,
gránulos, elixires, tinturas, soluciones, suspensiones, jarabes y
emulsiones, o por inyección. Análogamente, aquéllos pueden
administrarse también en forma intravenosa (tanto de bolus como de
infusión), intraperitoneal, subcutánea, tópica con o sin oclusión,
o intramuscular, utilizando en todos los casos formas bien
conocidas por aquéllos que tienen una experiencia ordinaria en las
técnicas farmacéuticas. Una cantidad eficaz pero no tóxica del
compuesto deseado puede emplearse como agente modulador del canal de
potasio.
La dosis diaria de los productos puede variarse
a lo largo de una extensa gama desde 0,01 a 1000 mg por adulto
humano/día. Para administración oral, las composiciones se
proporcionan preferiblemente en la forma de tabletas ranuradas o no
ranuradas que contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0,
15,0, 25,0, y 50,0 miligramos del ingrediente activo para el ajuste
sintomático de la dosificación al paciente a tratar. Una cantidad
eficaz del fármaco se suministra ordinariamente a un nivel de
dosificación de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 100
mg/kg de peso corporal por día. De modo más particular, el intervalo
es de aproximadamente 0,001 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal por
día. Aún más particularmente, el intervalo varía desde
aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1 mg/kg. Por supuesto, el
nivel de dosificación variará dependiendo de la potencia del
compuesto particular. Algunos compuestos serán más potentes que
otros. Adicionalmente, el nivel de dosificación variará dependiendo
de la biodisponibilidad del compuesto. Cuanto más biodisponible y
potente sea el compuesto, tanto menor será la cantidad de compuesto
necesaria a administrar por cualquier ruta de suministro, con
inclusión, pero sin carácter limitante, el suministro oral. Las
dosis de los moduladores del canal de potasio se ajustan cuando se
combinan para alcanzar los efectos deseados. Por otra parte, las
dosis de estos diversos agentes pueden optimizarse y combinarse
independientemente para alcanzar un resultado sinérgico en el cual
la patología se reduce más de lo que ocurriría si se utilizara cada
agente por separado. Los expertos en la técnica emplean
formulaciones diferentes para nucleótidos que para proteínas o sus
inhibidores. Análogamente, el suministro de polinucleótidos o
polipéptidos será específico para células y condiciones
particulares.
La SEQ ID NO: 1 de cDNA se identificó a partir
de una investigación inicial de bases de datos para nuevos canales
KvQT. La secuencia parcial de hKvLQT1, número de Acceso a Genbank
U40990, se utilizó en una investigación tblast contra una base de
datos patentada a fin de identificar una secuencia homóloga de ácido
nucleico que se utilizó subsiguientemente para investigar una base
de datos de dominio público y se identificó el clon
Merck-WashU yn72gl1 (número de acceso a Genbank
H23701). La fuente de tejido para el clon
Merck-WashU era una genoteca de cerebro humano. El
tejido se adquirió 17 horas después de la muerte de un varón de 55
años que murió de un aneurisma aórtico roto. El RNA de partida se
preparó a partir de una agrupación de tejidos de cerebro, que
incluían el córtex frontal, parietal, temporal y occipital de los
hemisferios izquierdo y derecho, materia blanca subcortical,
ganglios basales, tálamo, cerebelo, cerebro medio, puente, y bulbo
raquídeo. La síntesis del cDNA se inició utilizando un cebador
NotI-oligo(dT). El cDNA bicatenario se
seleccionó por tamaños, se ligó a adaptadores EcoRI (Pharmacia), se
digirió con NotI, y se clonó en los sitios NotI y EcoRI de un
vector modificado pT7T3 (Pharmacia). La genoteca fue construida por
Bento Soares y se sometió a dos tandas de normalización. Soares,
B., et al., PNAS, 91:9228 (1994). Se obtuvo información de
longitud total utilizando técnicas RACE-PCR 5' y 3'
(amplificación rápida de los extremos del cDNA) de la genoteca de
cDNA de cerebro humano. Schaefer, Anal. Biochem., 227:255
(1995).
El extremo 3' de la nueva secuencia de cDNA
descrita en esta memoria se amplificó a partir de 0,25 ng de cDNA
de cerebro humano de Whole Marathon Ready^{TM} (Clontech, Palo
Alto, CA; Cat. #7400-1) en una reacción de 50 ml
utilizando la Mezcla de DNA-polimerasa KlenTaq
Advantage^{TM} (Clontech Cat. #8417-1) de acuerdo
con las recomendaciones del fabricante. El cDNA de Marathon
Ready^{TM} es un cDNA bicatenario, ligado a adaptadores,
utilizado en la Amplificación Rápida de los Extremos del cDNA
(RACE). Las secuencias del juego de iniciadores son: 5'
AACCTCTCGCGCACAGACCTGCA 3' (directo, correspondiente a las
posiciones de las bases 1058-1080 de SEQ ID NO: 1)
y 5' CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC 3' (inverso, correspondiente al
adaptador de cDNA, remítanse al manual del usuario, Clontech Cat.
#PT1156-1). Los parámetros de los ciclos estaban de
acuerdo con el manual del usuario, programa 1 (resumidamente, PCR
de toque con extensiones de 4 min.). Una parte alícuota de 5 ml se
reamplificó en una reacción de 50 ml utilizando la Mezcla de
DNA-polimerasa KlenTaq Advantage^{TM} de acuerdo
con las recomendaciones del fabricante. Las secuencias de los
iniciadores son: 5' CTCCACGTGGCAGTACTACGAGC 3' (directo,
correspondiente a las posiciones de las bases
1081-1103 de SEQ ID NO: 1) y 5'
ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC 3' (inverso, correspondiente al adaptador
de cDNA, remítanse al manual del usuario). Los parámetros de los
ciclos estaban de acuerdo con el manual del usuario, programa 1
(resumidamente, PCR de toque con extensiones de 4 min). Una parte
alícuota de la PCR ejecutada en un gel de agarosa al 1%/1x TAE, con
EtBr 0,5 \mug/ml. Se cortó un producto de aprox. 1,2 kb, y se
aisló con el Kit de Extracción de Gel QIAGEN (QIAGEN, Santa Clarita,
CA; Cat. #28704). El material eluido del gel se ligó al vector
pT7Blue utilizando el Kit pT7BlueT- Vector Regular más Ligasa
(Novagen, Madison, WI; Cat. #69836-1) y se
transformaron células NovaBlue con reacción de ligación de acuerdo
con las recomendaciones del fabricante. Se secuenciaron 4 colonias,
y se diseñó un iniciador para re-amplificar el
producto RACE a partir de 0,5 ng de cDNA de Whole Marathon
Ready^{TM} de Cerebro Humano y confirmar los datos de la
secuenciación RACE. Se utilizó la Mezcla de
DNA-polimerasa KlenTaq Advantage^{TM} en una
reacción de 50 ml de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Se incluyó DMSO a una concentración final de 5%. Los parámetros de
los ciclos estaban de acuerdo con el manual del usuario, programa 1
(resumidamente, PCR de toque con extensiones de 4 min). Las
secuencias de los juegos de iniciadores son 5'
AACCTCTCGCGCACAGACCTGCA 3' (directo, correspondiente a las
posiciones de las bases 1058-1080 de SEQ ID NO: 1)
y 5' GACCCAAGGCCGCAGGTCCTCACC 3' (inverso, correspondiente a las
posiciones de las bases 2998-3030 de SEQ ID NO:
1).
Se construyó cDNA específico de la primera
cadena SEQ ID NO: 1 utilizando 5 mg de RNA total de Cerebro Humano
(Clontech Cat. #64020-1) y el Sistema de
Preamplificación SUPERSCRIPT^{TM} para la síntesis del cDNA de la
Primera Cadena (Life Technologies, Gaithersburgh, MD; Cat.
#18089-011). Se siguió el protocolo del fabricante
5.1 - Síntesis de cDNA de la Primera Cadena de Transcritos con Alto
Contenido en GC. Secuencia iniciadora utilizada: 5'
GACCCAAGGCCGCAGGTCCTCACC 3' (inverso, correspondiente a las
posiciones de las bases 2998-3030 de SEQ ID NO: 1).
Se amplificó una parte alícuota de 5 ml en una reacción de 50 ml
utilizando la Mezcla de DNA-polimerasa KlenTaq
Advantage^{TM} de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Se incluyó DMSO a una concentración final de 5%. Los parámetros de
los ciclos estaban de acuerdo con el manual del usuario, programa
1, resumidamente, PCR de toque con extensiones de 4 min). Secuencias
de iniciadores:
5' GCCAGGCACCATGGTGCAGAAGTCG 3' (directo,
correspondiente a las posiciones de las bases 1-25
de SEQ ID NO: 1) y 5' CAAAACCTCGGAGGCACCGTGCTG 3' (inverso,
correspondiente a las posiciones de las bases
2614-2637 de SEQ ID NO: 1). La reacción se purificó
con el Kit de Purificación PCR QIAGEN (QIAGEN Cat. #28104) y se ligó
en el vector pCR®II-TOPO utilizando el Kit Promotor
Dual de Clonación® TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA; Cat.
#K4600-01) y se transformaron células TOP10 con la
reacción de ligación de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante. Se seleccionaron 4 colonias para secuenciación del
inserto en ambas direcciones utilizando el secuenciador automático
ABI Prism^{TM} 377. SEQ ID NO: 1 resulta de los datos de
secuenciación de esta región de codificación y los datos 3'UTR de
la secuenciación del producto RACE.
Se obtuvieron tejidos de cerebro fetal humano:
(fetos de 16-22 semanas) comercialmente de la
Anatomic Gift Foundation (Woodbine, GA). Los hemisferios cerebrales
se introdujeron en Solución Salina Equilibrada de Hanks estéril
refrigerada, exenta de calcio y exenta de magnesio (HBSS,
#14170-112, Life
Technologies/Gibco-BRL, Gaithersburgh, MD). Se
extirparon las meninges con fórceps estériles y se disoció
inicialmente el tejido por trituración repetida mediante pipetas
estériles. El tejido se incubó con Tripsina al 0,05%/EDTA 0,53 mM (#
25300-054, Life
Technologies/Gibco-BRL, Gaithersburgh, MD) y 0,15
mg/ml de DNAsa (# D-5025, Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) a 37ºC durante 45 minutos con agitación suave. Se añadió
a la suspensión 10% de Suero Bovino Fetal (FBS,
#160001-036, Gibco-BRL/Life
Technologies, Gaithersburgh, MD) para detener la tripsinización.
Las células se sometieron luego a pasos a través de malla de
polipropileno de 210 \mum y 149 \mum
(#08-670-188 y
#08-670-189, Fisher Scientific,
Pittsburgh, PA) secuencialmente. El filtrado se lavó dos veces y se
suspendió de nuevo en medio completo [DMEM (con
L-glutamina con alto contenido de glucosa y HEPES),
Gibco #12430-054; 100 U-\mug/ml
de penicilina/estreptomicina, Gibco #15070-030; 10%
FBS, Gibco #160001-036]. Las células se extendieron
en placas con una densidad de 80 millones/matraz de 75 cm^{2}
(#12-565-52, Fisher Scientific,
Pittsburgh, PA). Los cultivos se incubaron a 37ºC, 5% CO_{2}
durante 2 semanas (con un solo cambio de medio después de una
semana en cultivo para eliminar los residuos celulares). Los
cultivos maduros estaban constituidos por astrocitos, neuronas,
microglia y oligodendrocitos.
Se obtuvieron cultivos de astrocitos puros por
eliminación del medio completo (que contenía microglia flotante) y
tripsinización de los cultivos 3 veces, lo que eliminó eficazmente
las neuronas, los oligodendrocitos y la microglia unida. Los
astrocitos se lisaron en Tampón RLT (QIAGEN) con 0,01%
b-ME (Sigma Cat. #M7154) en el transcurso de 24
horas, y se congelaron a -80ºC hasta su utilización.
Se cultivaron células de neuroblastoma humano
IMR-32 (ATCC #CCL-127; Rockville,
MD, EE.UU.) en MEM (Specialty Media Cat.
#SLM-034-13), suplementado con 10%
de FBS desactivado por calentamiento (JRH Bioscience Cat. #,
12126-78-H) y
l-glutamina 2 mM (Cellgro Cat.
#20-005-LI) a 37ºC en una atmósfera
modificada con 5% de CO_{2}. Se cambió el medio dos veces por
semana. Las células se diferenciaron con
dibutiril-cAMP 1 mM (Aldrich Cat.
#85-196-5) y
5-bromodesoxiuridina 2,5 \muM (Sigma
B-9285) a los cultivos. Las células se lisaron en
Tampón RLT (QIAGEN) con 0,01% b-ME (Sigma Cat.
#M7154) y se congelaron a -80ºC antes de su utilización.
Las células lisadas se descongelaron en hielo, y
se procesaron a través de un triturador QIA (QIAGEN Cat. #79654)
para homogeneizarlas. Se preparó luego RNA total con el Mini Kit
RNeasy (QIAGEN Cat. #74103) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. La concentración se determinó por absorbancia a 260
nm.
Se precipitaron RNA Total de Cerebro Humano,
Cerebro Humano Fetal y Cerebro de Rata (Clontech Cat. #s
64020-1,64019-1,64060-1)
y se resuspendieron para uso de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante. Se sometieron a pasadas 20 \mug de cada uno de RNA
total de Cerebro Humano, Cerebro Humano Fetal, Cerebro de Rata,
Imr-32 (no diferenciado), Imr-32
(diferenciado), y Astrocitos Humanos Fetales junto con 5 mg de
Escalera de RNA (Life Technologies Cat. #15620-016)
en un gel desnaturalizante de agarosa al 1%/formaldehído 2,2 M/1x
MOPS a 50V durante 4,5 h. Se transfirió el RNA durante una noche a
una membrana de nailon cargada positivamente (Hybond^{TM} N+,
Amersham #RPN203B), de acuerdo con el protocolo del fabricante. El
RNA se reticuló por rayos UV a la membrana utilizando Stratagene's
Stratalinker durante 40 s.
Dos Transferencias Northern de tejidos múltiples
(Cat. #7760-1 y 7759-1) y una
transferencia con RNA de diferentes regiones de cerebro humano
(Cat. #7755-1) se adquirieron de Clontech, Inc.,
conteniendo cada pista aproximadamente 2 mg de RNA poli A+.
Sonda 1: canal de potasio específico nuevo
derivado de cerebro: Corresponde a las posiciones de las bases 1257
a 1461 de SEQ ID NO: 2 que abarca la región codificante para la cola
C-terminal del nuevo polipéptido.
Sonda 2: sonda "común": Corresponde a las
posiciones de las bases 989 a 1109 de SEQ ID NO: 2 que abarca la
región codificante para los 40 primeros aminoácidos de la cola
C-terminal que es común a KvQT2 y HNSPC.
La sonda 1 se generó por amplificación de
1 ng de Cerebro Humano, cDNA de Whole Marathon Ready en una reacción
de 50 ml utilizando la Mezcla de DNA-Polimerasa
KlenTaq Advantage^{TM} de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante. Se incluyó DMSO a una concentración final de 5%. Las
secuencias del juego de iniciadores son 18F y 19R. Un producto de
201 pb se aisló en gel y se cuantificó por absorbancia a 260 nm. Se
marcaron 45 ng de amplicón por extensión de iniciadores con un
iniciador inverso que producirá una sonda de ssDNA antisentido.
Condiciones finales de la reacción: 50 ml, 1x tampón de reacción A,
5% DMSO, 19R 200 nM, dATP, dTTP, dGTP 200 \muM, 5 U de
DNA-polimerasa Taq (Fisher), y 50 mCi de
a^{32}P-dCTP (Dupont NEN). La reacción se incubó
a 94ºC durante 1 min y 72ºC durante 1 min, y se repitió durante un
total de 4 ciclos. El producto marcado se purificó del nucleótido
radiactivo no incorporado utilizando Micro Columnas
ProbeQuant^{TM}/G-50 (Pharmacia) de acuerdo con
las recomendaciones del fabricante.
La sonda 2 se generó por amplificación de
SEQ ID NO: 2 en una reacción de 50 ml utilizando la Mezcla de
DNA-Polimerasa KlenTaq Advantage^{TM} de acuerdo
con las recomendaciones del fabricante. Las secuencias del juego de
iniciadores son: 5' AGAAGAGGCGGAACCCGGCAGCAG 3' (directo,
correspondiente a las posiciones de las bases
989-1012 de SEQ ID NO: 2) y 5'
GGCACGGTGACCGTTCGCTCGTAG 3' (inverso, correspondiente a las
posiciones de las bases 1084-1109 de SEQ ID NO: 2).
La reacción se purificó con el Kit de Purificación QIAGEN PCR, de
acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El amplicón de 121
pb se marcó por extensión con iniciadores con el iniciador inverso
que producirá una sonda de ssDNA antisentido. Condiciones finales
de la reacción: 50 ml, 1x tampón de reacción A, 100 ng de amplicón,
iniciador inverso 200 nM, dATP, dTTP, dGTP 200 mM, 5 U de
DNA-polimerasa Taq (Fisher), y 50 mCi de
a^{32}P-dCTP (Dupont NEN). La reacción se incubó a
94ºC durante 1 min y 72ºC durante 1 min, y se repitió durante un
total de 4 ciclos. El producto marcado se purificó del nucleótido
radiactivo no incorporado utilizando Micro Columnas
ProbeQuant^{TM}/G-50 (Pharmacia) de acuerdo con
las recomendaciones del fabricante.
Se utilizaron sondas radiactivas para hibridar
las dos transferencias de tejidos múltiples, la hibridación
preparada en el laboratorio de los inventores y la transferencia de
Cerebro Humano arriba descritas. Las transferencias se lavaron en
2x SSC y se prehibridaron luego en solución de
Prehibridación/Hibridación NorthernMAX^{TM} a 42ºC durante 1 h.
La solución se reemplazó luego con la misma con adición de
1-2x10^{7} cpm de sonda marcada, y se hibridó
durante una noche a 42ºC. Las transferencias se lavaron luego en
condiciones severas: 2x SSC, 0,5% SDS, 5 min, 2x SSC, 0,1% SDS, 5
min, 0,1x SSC/0,5% SDS 30 min, 37ºC, dos veces y brevemente con
0,1x SSC. Las transferencias se expusieron luego entre 24 y 48 horas
a película de producción de imágenes Biomax MS-1
(Kodak) a -80ºC con dos filtros intensificadores.
Se escindió cDNA de SEQ ID NO: 1 del vector
pCR®II-TOPO (supra) utilizando sitios Eco RI
y se subclonó en el vector de mamífero pCDNA3 (Invitrogen). Para
expresión en oocitos de Xenopus (Timpe, et al.,
Nature, 331:143 (1988)), el cDNA se cortó del vector
pCR®II-TOPO utilizando sitios EcoRV y Hind III y se
subclonó en el vector pKGEM (un vector PGEM modificado de Promega
que contenía secuencias UTR 5' y 3' de b-globina de
Xenopus que flanqueaban el sitio de clonación múltiple para aumentar
la estabilidad del mensaje). Estos constructos pueden utilizarse
para obtener perfiles funcionales, biofísicos y farmacológicos del
nuevo canal de potasio derivado de cerebro utilizando técnicas
estándar parche-pinza y/o oocitos. El nuevo canal K+
específico de neuronas puede expresarse fácilmente en células de
mamífero (v.g., HEK 293, Cos, CHO, RBL-1, etc.) por
transfección transitoria o estable, o por microinyección de RNA en
oocitos de Xenopus para caracterización biofísica y farmacológica
completa utilizando técnicas estándar parche-pinza
(Hammill, O. et al., Pfugers Arch. 391:85 (1981) o
voltaje-pinza de dos electrodos (Soreq, H. y
Seidman., S. Methods Enzymol., 207:225 (1992); Goldstein, A., et
al., PNAS, 83:7503 (1986).
(Generación de vectores de expresión
recombinantes de baculovirus y expresión génica con el Sistema de
Expresión BAC-TO-BAC, Life
Technologies, Gaithersburgh, MD Cat. #10359-016
Sistema de Expresión de Baculovirus
BAC-to-BAC).
Se clona SEQ ID NO: 2 en pFASTBAC1, y el
plásmido recombinante se transforma en células competentes DH10BAC
que contienen el bácmido con un sitio diana
mini-attTn7 y el plásmido adyuvante. El elemento
mini-Tn7 en el plásmido pFASTBAC1 puede
transponerse al sitio diana mini-attTn7 en el
bácmido en presencia de proteínas de transposición proporcionadas
por el plásmido adyuvante. Las colonias que contienen bácmidos
recombinantes se identifican por fragmentación del gen
IacZ\alpha. Se prepara DNA mini-prep de peso
molecular alto a partir de clones seleccionados de E. coli
que contienen el bácmido recombinante, y este DNA se utiliza luego
para transfectar células de insecto.
El vector donante, pFASTBAC1, contiene el
promotor de polihedrina seguido por un MCS extensivo que se extiende
desde BamHI (4032) a Hind III (4137). El sito BamH I se encuentra
37 pb aguas abajo del ATG original del gen de polihedrina, que se
ha mutado a ATT. Por consiguiente, para expresar con éxito una
proteína extraña, el fragmento de DNA extraño debe contener su
propio ATG seguido por un marco de lectura abierto (ORF). El
fragmento de DNA extraño debe clonarse en pFASTBAC1 en la
orientación correcta con respecto al promotor de polihedrina (es
decir, el extremo 5' del gen debe insertarse en el primer sitio
seleccionado del MCS).
Se prepara pFASTBAC1 y el fragmento de DNA
extraño por digestión de 500 ng a 1 \mug de DNA con la o las
endonucleasas de restricción seleccionada(s) en las
condiciones apropiadas. Si se selecciona un solo sitio en el vector
como el sitio de clonación, se desfosforila el vector en las
condiciones apropiadas. Los fragmentos de DNA pueden purificarse
por electroforesis en gel de agarosa y los fragmentos de interés
pueden recuperarse del gel utilizando un cartucho GLASSMAX® o una
purificación equivalente. Se ligan el vector preparado y los
fragmentos del inserto en las condiciones apropiadas.
Para esta clonación inicial, no se utilizan las
células DH10BAC en el sistema. Pueden utilizarse células competentes
de DH5\alpha o DH10B. Se extiende la mezcla de transformación en
placas de agar LB que contienen 100 \mug/ml de ampicilina.
Para análisis de un experimento de clonación
direccional, son suficientes para el cribado 6 colonias; puede ser
necesario analizar 12 o más para una estrategia de clonación no
direccional. Se prepara DNA plasmídico a partir de cultivos
nocturnos utilizando un procedimiento de
mini-preparación (v.g., Schecter, A.I., et
al., Nature 312:513 (1984) y se comprueba la inserción correcta
del gen de interés por digestión con endonucleasas de restricción o
análisis PCR.
1. Se preparan placas de Agar Luria que
contienen:
50 \mug/ml de kanamicina,
7 \mug/ml de gentamicina;
10 \mug/ml de tetraciclina;
300 \mug/ml de Bluo-gal y
40 \mug/ml de IPTG.
\vskip1.000000\baselineskip
Véanse los protocolos adicionales para las
formulaciones (Secciones 5.1 y 5.2)
2. Se descongelan las células DH10BAC
competentes en hielo.
3. Se dispensan 100 \mul de las células en
tubos de polipropileno de 15 ml.
4. Se añade aproximadamente 1 ng del plásmido
recombinante donante (en 5 \mul) y se mezcla suavemente el DNA en
las células golpeando ligeramente el costado del tubo.
5. Se incuba la mezcla en hielo durante 30
min.
6. Se somete a choque térmico la mezcla por
transferencia a un baño de agua a 42ºC durante 45 s.
7. Se enfría la mezcla en hielo durante 2
min.
8. Se añaden 900 \mul de medio S.O.C. a la
mezcla.
9. Se introduce la mezcla en una incubadora de
sacudidas a 37ºC con agitación del medio durante 4 h.
10. Se diluyen serialmente las células,
utilizando medio S.O.C., hasta 10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3} (es
decir, 100 \mul de mezcla de transposición: 900 \mul de medio
S.O.C. = dilución 10^{-1}, y se utiliza ésta para diluir
ulteriormente 10 veces hasta dar la dilución 10^{-2}, y
análogamente para la dilución 10^{-3}).
11. Se ponen 100 \mul de cada dilución en las
placas y se extienden uniformemente por toda la superficie.
12. Se incuba durante al menos 24 h a 37ºC (las
colonias azules pueden no ser visibles antes de 24 h).
Las colonias blancas contienen el bácmido
recombinante, y por tanto, se seleccionan para aislamiento del DNA
de bácmido recombinante. Antes de aislar el DNA, las colonias
candidato se aplican en bandas para asegurar que son realmente
blancas.
1. Se seleccionan colonias blancas de una placa
con aproximadamente 100 a 200 colonias. NOTA: Este número facilita
la diferenciación entre las colonias azules y blancas.
2. Se seleccionan 10 candidatos blancos y se
aplican en bandas a placas nuevas para verificar el fenotipo. Se
incuba durante una noche a 37ºC.
3. A partir de una sola colonia confirmada por
tener un fenotipo blanco en placas que contienen
Bluo-Gal e IPTG, se prepara un cultivo líquido para
aislamiento del DNA de bácmido recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha desarrollado específicamente el protocolo
siguiente para aislar plásmidos grandes (> 100 kb), y se ha
adaptado para aislamiento del DNA de bácmido.
1. Utilizando un palillo mondadientes estéril,
se inocula una sola colonia bacteriana aislada en 2 ml de medio LB
suplementado con 50 \mug/ml de kanamicina, 7 \mug/ml de
gentamicina, y 10 \mug/ml de tetraciclina. Es adecuado un tubo de
polipropileno de 15 ml con tapón de resorte. Se deja crecer a 37ºC
hasta fase estacionaria (hasta 16 h) con sacudidas entre 250 y 300
rpm.
2. Se transfiere 1 ml de cultivo a un tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml y se centrifuga a 14.000 xg durante 1
min.
3. Se retira el sobrenadante por aspiración a
vacío y se resuspende (por agitación vorticial suave, o por pipeteo
alternativo hacia arriba y hacia abajo, en caso necesario) cada
pelet en 0,3 ml de Solución I [Tris-HCl 15 mM (pH
8,0), EDTA 10 mM, 100 \mug/ml de RnasaA]. Se añaden 3 ml de
Solución II (NaOH 0,2 N, 1% SDS) y se mezcla suavemente. Se incuba
a temperatura ambiente durante 5 min. Nota: El aspecto de la
suspensión debe cambiar desde muy turbio a casi translúcido.
4. Se añaden lentamente 0,3 ml de acetato de
potasio 3 M (pH 5,5), y se mezcla suavemente durante la adición. Se
forma un precipitado blanco denso de proteína y DNA genómico de
E. coli. Se deja la muestra en hielo durante 5 a 10 min.
5. Se centrifuga durante 10 min a 14.000 xg.
Durante la centrifugación, se marcador otro tubo de microcentrífuga
y se añaden 0,8 ml de isopropanol absoluto al mismo.
6. Se transfiere suavemente el sobrenadante al
tubo que contiene isopropanol. Se desprecia cualquier material
blanco precipitado. Se mezcla invirtiendo suavemente el tubo durante
unas cuantas veces y se deja en hielo durante 5 a 10 min.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta etapa, la muestra puede guardarse a
-20ºC durante una noche.
7. Se centrifuga la muestra durante 15 min a
14.000 xg a la temperatura ambiente.
8. Se desecha el sobrenadante y se añaden 0,5 ml
de etanol al 70% a cada tubo. Se invierte el tubo varias veces para
lavar el sedimento. Se centrifuga durante 5 min a 14.000 xg a la
temperatura ambiente. (Opcional: repetir el paso 8.)
9. Se retira la mayor cantidad posible del
sobrenadante. Nota: El sedimento puede llegar a desprenderse del
fondo del tubo, por lo que es mejor aspirar cuidadosamente el
sobrenadante que verterlo.
10. Se seca brevemente al aire el sedimento,
durante 5 a 10 min, a la temperatura ambiente y se disuelve el DNA
en 40 \mul de TE. Se deja que la solución se sedimente en el tubo
golpeando ligeramente de vez en cuando el fondo del tubo. El DNA
está generalmente listo para ser utilizado dentro de 10 min, con tal
que los sedimentos no se sequen excesivamente.
11. Se guarda el DNA a -20ºC. Sin embargo, deben
evitarse ciclos repetidos de congelación/descongelación a fin de
evitar una reducción drástica en la eficiencia de transfección.
Las preparaciones de DNA de bácmido pueden
analizarse por electroforesis en gel de agarosa para confirmar la
presencia de DNA de peso molecular alto.
1. Se siembran 9x10^{5} células por pocillo de
35 mm (de una placa de 6 pocillos) en 2 ml de Sf-900
II SFM que contiene penicilina/estreptomicina a concentración final
0,5 X (50 unidades/ml penicilina, 50 up/ml estreptomi-
cina).
cina).
2. Se deja que las células se fijen a 27ºC
durante al menos 1 h.
3. Se preparan las soluciones siguientes en
tubos estériles de 12x 75 mm:
Solución A: Para cada transfección, se
diluyen \sim 5 up de DNA de bácmido mini-prep en
100 \mul de Sf-900 II SFM sin antibióticos.
Solución B: Para cada transfección, se
diluyen \sim 6 \mul de Reactivo CELLFECTIN en 100 \mul de
Sf-900 II SFM sin antibióticos.
4. Se combinan las dos soluciones, se mezclan
suavemente, y se incuban durante 15 a 45 min a LA temperatura
ambiente.
5. Se lavan las células una sola vez con 2 ml de
Sf-900 II SFM sin antibióticos.
6. Para cada transfección, se añaden 0,8 ml de
Sf-900 II SFM a cada tubo que contiene los complejos
lípido-DNA. Se mezcla suavemente. Se aspira el
medio de lavado de las células y se extiende 1 ml de los complejos
lípido-DNA diluidos sobre las células.
7. Se incuban las células durante 5 h en una
incubadora a 27ºC.
8. Se retiran las mezclas de transfección y se
añaden 2 ml de Sf-900 II SFM que contiene
antibióticos. Se incuban las células en una incubadora a 27ºC
durante 48 h.
9. Se ensayan las células en cuanto a actividad
de proteínas 48 a 72 h después del comienzo de la transfección; se
recoge el virus al cabo de 72 h.
1. Cuando se recoge el virus de la transfección,
se transfiere el sobrenadante (2 ml) a un tubo estéril tapado. Se
clarifica por centrifugación durante 5 min a 500 xg y se transfiere
el sobrenadante que contiene el virus a un tubo nuevo.
2. A partir de la transfección inicial, pueden
esperarse títulos virales de 2x10^{7} a 4x10^{7} pfu/ml.
3. Se guarda el virus a 4ºC, protegido de la
luz. Para almacenamiento del virus a largo plazo, se recomienda la
adición de suero bovino fetal (FBS) a una concentración final de al
menos 2% FBS. Se recomienda también el almacenamiento de una parte
alícuota del stock viral a -70ºC.
4. Para determinación del título de virus, puede
realizarse un ensayo en placa. Véase la Sección 5.12, Viral
Plaque Assay, para los procedimientos de extensión en placa.
5. Para amplificación de los stocks virales, se
infecta una suspensión o cultivo de monocapa a una Multiplicidad de
Infección (MOI) de 0,01 a 0,1. Se utiliza la fórmula siguiente:
Por ejemplo, se infecta un cultivo de 50 ml a
2x10^{6} células/ml con 0,5 ml de un stock viral que es 2x
10^{7} pfu/ml, para una MOI de 0,1.
Se recoge el virus al cabo de 48 horas después
de la infección. Esto dará como resultado una amplificación del
virus de aproximadamente 100 veces.
Las condiciones óptimas de infección para
células de insecto pueden variar. Un punto de partida para la
infección es una MOI de 5 a 10. Para más información remítanse a la
referencia 2. Se recomienda que se realicen varios experimentos
para cada proteína a expresar.
Optimización de la MOI: Se infecta una
población de células a MOIs variables (v.g., 1, 2, 5, 10) y se
ensaya la expresión de las proteínas después de la recogida de las
células (o del medio, si la proteína se secreta).
Evolución temporal: Se infectan las
células a MOI constante. Se recogen las células (o el medio) en los
intervalos de tiempo siguientes: 24 h, 48 h, 72 h, y 96 h. Se ensaya
respecto a expresión.
1. Veinticuatro horas antes de la transfección,
se inocula una cápsula de cultivo de tejidos de 60 mm con
4x10^{5}-11x 10^{5} células en crecimiento
exponencial. Las células deben ser 60-80%
confluentes en el momento de la transfección.
2. Se dejan crecer las células durante una noche
en 5 ml del medio de cultivo apropiado.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se transfieren 900 \mul de DMEM estéril
exento de suero y exento de antibióticos (DMEM-SA) a
un tubo de poliestireno.
2. Se añaden 35-100 \mul del
reactivo de transfección LipoTAXI. Se golpea ligeramente el costado
del tubo para favorecer la mezcla.
3. Se añaden 7 \mug del plásmido de control a
la reacción de control y 5-10 \mug del DNA
experimental a la reacción experimental. Para transfecciones
estables, se prepara un control negativo.
4. Se mezcla suavemente (no vorticialmente) y se
incuba durante 15-30 minutos a temperatura
ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se retira el medio de cultivo estándar de la
cápsula de cultivo de tejidos por aspiración.
2. Se añaden 1,5 ml de DMEM (suero opcional) a
la mezcla de transfección en el tubo de poliestireno y se transfiere
luego toda esta mezcla (\sim 2,5 ml) gota a gota a la cápsula de
cultivo de tejidos mientras se hace girar la cápsula.
3. Se incuba durante 4-6 horas
utilizando condiciones estándar de crecimiento (es decir, 37ºC y 5%
CO_{2} en una incubadora humidificada).
4. Se añaden 2,5 ml de DMEM que contiene suero
(DMEM + S) en una concentración doble de la del suero normal a la
cápsula de cultivo de tejidos y se incuba durante una noche.
5. Se reemplaza el medio con 5,0 ml de medio
completo nuevo.
6. Se incuban las células durante
24-72 horas dependiendo del tipo de célula, el
sistema informador, y la actividad de promotores, o se sigue a
Realización de una Transfección Estable.
1. Se separan las células del paso 6 de Adición
de la Solución Activada en la relación deseada (al menos 1:10)
después de la incubación de 24 horas y se incuban a continuación
durante una noche.
2. Se aplican gota a gota antibióticos de
selección a la cápsula de cultivo de tejidos, se agita la cápsula
entre las adiciones gota a gota, a una concentración apropiada para
la línea de células.
3. Se reemplaza el medio y se aplican los
antibióticos de selección recientes cada 4-7 días
(aproximadamente dos veces por semana).
4. Se forman colonias estables al cabo de
1-2 semanas. Las células procedentes de la cápsula
de control de DNA negativa mueren.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se siembran
4x10^{6}-10x10^{6} células por cápsula de 60 mm
en 700 \mul de DMEM-SA.
1. Se transfieren 900 \mul de
DMEM-SA a un tubo de poliestireno.
2. Se añaden 35-100 \mul del
reactivo de transfección LipoTAXI. Se golpea ligeramente el costado
del tubo para favorecer la mezcla.
3. Se añaden 10 \mug del plásmido de control a
la reacción de control y 7-15 \mug del DNA
experimental a la reacción experimental. Para transfecciones
estables, se prepara un control negativo.
4. Se mezcla suavemente (no agitar
vorticialmente) y se incuba durante 15-30 minutos a
la temperatura ambiente.
1. Se añaden 800 \mul de DMEM (suero opcional)
a la mezcla de transfección en el tubo de poliestireno y se
transfiere luego esta mezcla entera (\sim 1,8 ml) gota a gota a la
cápsula de cultivo de tejidos mientras se agita suavemente la
cápsula.
2. Se incuba durante 4-6 horas
utilizando condiciones estándar de crecimiento (es decir, 37ºC y 5%
CO_{2} en una incubadora humidificada).
3. Se añaden 3 ml de DMEM completo reciente a la
cápsula de cultivo de tejidos.
4. Se incuban las células durante
24-72 horas dependiendo del tipo de célula, el
sistema informador, y la actividad del promotor, o se sigue al paso
10 si se realiza una transfección estable.
1. Después de 48 horas, se siembra una cápsula
de cultivo de tejidos nueva a utilizar para la selección a no más
de un tercio de la densidad de las células transfectadas del paso
9.
2. Se aplican gota a gota los antibióticos de
selección a la cápsula de cultivo de tejidos, agitando suavemente
la cápsula entre los goteos, a una concentración apropiada para la
línea de células.
3. Se reemplaza el medio y se aplican
antibióticos de selección nuevos cada 4-7 días
(aproximadamente 2 veces por semana).
4. Se forman colonias estables al cabo de
1-2 semanas. Las células procedentes de la cápsula
de control de DNA negativa mueren.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se transfieren las células transfectadas a
tubos de centrífuga de 15 ml y se centrifuga durante 5 minutos a
200 xg para sedimentar las células.
2. Se separa y desecha el sobrenadante, se añade
1 ml de PBS al sedimento de células, y se transfiere la suspensión
de células resultante a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
3. Se centrifuga el tubo en una microcentrífuga
a 200 xg durante 5 minutos para sedimentar las células.
4. Se separa y desecha el sobrenadante, se añade
1 ml de tampón de lisis al sedimento de células, y se deja a -20ºC
hasta congelación.
5. Se descongela el extracto de células y se
centrifuga el tubo en una microcentrífuga a 12.000 xg durante 5
minutos para sedimentar los residuos celulares.
6. Se transfiere el sobrenadante a un tubo de
microcentrífuga nuevo y se guarda a -20ºC o se sigue al Ensayo
de B-galactosidasa.
El protocolo siguiente está optimizado para
cápsulas de cultivo de tejidos de 100 mm y todos los volúmenes se
refieren a transfección simple.
1. Se inoculan cápsulas de cultivo de 100 mm con
células que crecen exponencialmente a razón de 5x10^{5} células
por cápsula no más de 24 horas antes de la transfección. Estas
células deberían cultivarse durante una noche en 10 ml del medio
apropiado hasta una confluencia de aproximadamente
10-20%. Las series de medio RPMI no pueden
utilizarse para transfección con CaPO_{4}. El exceso de carga
positiva en este medio dará lugar a la formación de un precipitado
denso.
Preparación de la Solución del Precipitado de
DNA (por cápsula de cultivo de 100 mm)
NOTA: La cantidad óptima de DNA
variará dependiendo del tipo de célula que se transfecte. Para el
plásmido de control pWLneo (Life Technologies, Gaithersburgh,
MD), se utilizan 10 \mug/cápsula (en la mayoría de los casos
se recomiendan 10-30 \mug de DNA
circular/cápsula).
2. Se diluye la cantidad deseada de DNA con agua
destilada desionizada hasta 450 \mul.
3. Se deja que la mezcla se incube
10-20 minutos a temperatura ambiente.
4. Se mezcla suavemente la solución para
asegurar una suspensión adecuada. Se añade ésta al cultivo gota a
gota y se agita suavemente la placa para distribuir
uniformemente.
5. Se incuban las células durante
12-24 horas. Dependiendo del tipo de célula, puede
variar el tiempo óptimo de incubación. Se observará un precipitado
fino después de la incubación.
6. Después de 12-24 horas de
incubación, se retira el medio y se lava el cultivo dos veces
utilizando PBS (sin Ca o Mg), o medio sin suero. Se aplica medio
completo reciente (que contiene suero), y se deja que las células
se incuben durante 24 horas con una concentración de CO_{2} óptima
para la línea de células.
7. Se separan las células en las relaciones
deseadas (al menos 1:10) y se incuba durante 24 horas más antes de
aplicar la selección de transfectantes estables.
El protocolo siguiente se ha utilizado para
cápsulas de cultivo de 100 mm y todos los volúmenes se refieren a
una transfección simple. Para el plásmido de control pSV2 Cat (Life
Technologies, Gaithersburgh, MD) se utilizan 2 \mug/cápsula de
100 mm.
1. Deben sembrarse células en crecimiento
exponencial a una densidad que proporcione una confluencia de -100%
en el transcurso de 72 horas. La transfección debe realizarse entre
6 y 24 horas después de la siembra.
2. Se mezcla DNA (1-2
\mug/cápsula de 100 mm) con solución salina tamponada con fosfato
(1x PBS) hasta un volumen final de 170 \mul.
3. Se diluyen 85 \mul de la solución #3 con 85
\mul de 1x PBS.
4. Se combina la mezcla PBS-DNA
con la mezcla de la solución #3-PBS.
5. Se retira el medio de los cultivos y se lava
dos veces con PBS.
6. Se añade la mezcla de DNA (del paso 4) gota a
gota al centro del cultivo y se agita suavemente para distribuir
uniformemente la solución. Se incuba durante 15 minutos a la
temperatura ambiente (-25ºC) sin CO_{2}.
7. Se separa la solución y se lava
suavemente el cultivo con PBS (las células se fijarán
deficientemente en este punto).
8. Se añaden al cultivo 10 ml de medio completo
reciente y se deja crecer en condiciones óptimas de cultivo.
Cuando se utiliza el método de selección de
anti-biótico G418, es importante recordar que no
todas las líneas de células de mamífero son igualmente sensibles a
G418. La concentración letal mínima puede variar desde 100
\mug/ml a 1 mg/ml. Por consiguiente, la concentración a utilizar
para la selección debe determinarse para cada línea de
células antes que pueda comenzar el experimento.
Dado que muchas líneas de células han sido
sometidas ya a este tipo de selección, puede ser útil consultar la
bibliografía disponible. Si no se dispone de información alguna
acerca de la sensibilidad de una línea de células particular, un
modo sencillo de determinar su sensibilidad es dejar crecer los
cultivos en una placa multipocillo con una gama de concentraciones
de G418 entre los pocillos individuales. La concentración óptima es
la mínima que destruye la totalidad de las células en el
transcurso de 10-14 días. (Las células que se
dividen rápidamente pueden destruirse más rápidamente, dado que el
antibiótico parece actuar principalmente sobre las células en
división).
En algunos casos, puede ser posible reducir la
concentración de G418 después de la selección inicial y mantener
todavía el gen identificador seleccionable. Por ejemplo, las células
NIH 3T3 se seleccionan generalmente a 400 \mug/ml de G418, y la
presencia del gen neo puede mantenerse en 250 \mug/ml.
Después que el progreso de selección progresa
hasta el punto en el que son visibles las colonias, es importante
aislar las colonias de una manera que obtenga el número máximo de
células (aumentando la probabilidad de supervivencia del clon), y a
fin de minimizar los riesgos de contaminación de una colonia con
células de otra. Para favorecer la consecución de estas metas, se
recomienda utilizar anillos de clonación cuando se aíslan las
colonias. Los anillos pueden estar hechos de cualquier material
susceptible de tratamiento en autoclave, y tienen un diámetro
interno de 5-10 mm. Se esterilizan los mismos junto
con un par de fórceps medianos y algún tipo de adhesivo (la grasa
de vacío se comporta satisfactoriamente).
Antes de aislar las colonias, se preparan
cápsulas de microtitulación de 24 pocillos para alojar los nuevos
clones. El volumen utilizado para los clones nuevos debería
mantenerse en un mínimo, dado que muchos tipos de células parecen
requerir el soporte de otras células del mismo tipo a fin de crecer
en cultivo. Este soporte puede implicar alguna clase de factor de
crecimiento soluble que puede llegar a ser ineficaz si se diluye
demasiado. En los casos en que el crecimiento de las células es
inicialmente muy escaso (< 5% de la superficie de la cápsula), a
menudo es útil añadir factores de crecimiento a concentraciones
mayores que las usuales.
NOTA: Por ejemplo, si un tipo de célula crece
en los pocillos en medios suplementados con suero de ternero fetal
al 10% en condiciones de cultivo normales, puede ser necesario 20%
de suero de ternero fetal para un crecimiento satisfactorio cuando
las células se siembran a una densidad muy baja. Puede ser útil
también retirar medio de un cultivo más densamente poblado y,
después de filtrar en condiciones estériles, utilizarlo para
suplementar el crecimiento de medio de los cultivos escasamente
poblados.
Para aislar colonias simples utilizando anillos
de clonación, el cultivo que contiene las colonias debe lavarse dos
veces en PBS, después de lo cual debe retirarse de la placa todo el
fluido. Los anillos deben manipularse solamente con fórceps
estériles.
1. Se sumergen los anillos en el adhesivo
estéril y se golpean ligeramente los mismos contra una superficie
seca estéril para extender el adhesivo uniformemente alrededor de
los bordes externos.
2. Se aplican los anillos alrededor de las
colonias a recoger (debe procederse rápidamente a fin de prevenir
el secado).
3. Se añaden 4-5 gotas de
tripsina a cada anillo con una pipeta Pasteur estéril, provista de
un tapón de algodón.
4. Se espera \sim 30 segundos por colonia, y
se disgrega luego la colonia por pipeteado de tripsina
alternativamente hacia arriba y hacia abajo 2-3
veces.
5. Se transfieren las células tripsinizadas a
una placa de 24 pocillos.
6. Se retira parte del medio de la placa de 24
pocillos, se lava el interior del anillo para eliminar cualesquiera
células residuales y se transfiere a la cápsula.
7. Después de \sim 2 horas, se examina la
placa con un microscopio para determinar si las células se han
fijado. Si se han fijado las mismas, se reemplaza el medio en la
placa de 24 pocillos con medio completo reciente a fin de eliminar
cualquier tripsina remanente.
Durante las etapas iniciales del crecimiento del
nuevo clon, es mejor cambiar el medio lo menos frecuentemente
posible (aproximadamente una vez a la semana para cultivos muy
escasamente poblados), lo que favorece el mantenimiento de
cualesquiera factores solubles. Lo mejor es añadir factores de
crecimiento exógenos al medio, en lugar de reemplazar el medio
antiguo con medio que contenga factores de crecimiento
recientes.
Una vez que los cultivos pequeños han crecido
hasta confluencia, los mismos pueden pasarse a recipientes de
cultivo mayores (por regla general, inicialmente placas de
microtitulación de 6 pocillos) y tratarse del mismo modo que otras
células del mismo tipo (la sección original debería mantenerse
durante toda la vida del clon nuevo).
Las membranas se preparan cuando las células HEK
en cada frasco T-150 (o T-175 o
T-225) son confluentes.
La preparación de membranas para cada frasco de
células es como sigue:
1. Se vierte el medio de cultivo de células y se
guarda (dado que el mismo contiene siempre algunas células que se
han desprendido recientemente por la manipulación del frasco).
2. Se lava la capa de células confluente con
aproximadamente 8 ml de solución salina tamponada con fosfato
(PBS), a 37ºC. Esto elimina el suero de ternero fetal residual, que
puede inhibir la tripsina utilizada en el paso 3. Se recoge también
la PBS del lavado, para capturar cualesquiera otras células que se
hayan desprendido.
3. Se añaden aproximadamente 5 ml de
tripsina-EDTA, a 37ºC. Se sacude lentamente el
frasco de modo alternativo hacia atrás y adelante para dejar que la
tripsina invada toda la capa de células. En aproximadamente 30 s,
algunas de las células llegarán a desprenderse; se golpea el frasco
sobre el banco de laboratorio para desprender el resto de las
células. Se añade rápidamente medio reciente al frasco para detener
la reacción con tripsina. Se añaden aproximadamente 10 ml de medio
por cada 5 ml de tripsina. Se pipetea el conjunto
tripsina/células/medio a un tubo de centrífuga. Se lava el frasco
con aproximadamente 5 ml más de medio y se combina con los otros
tubos.
4. Se lavan las células por centrifugación a 250
xg, 8 min. Se suspenden de nuevo los sedimentos de células
individuales en un volumen pequeño de tampón de ensayo, y se
combinan los mismos en un solo tubo.
5. Se homogeneizan las células utilizando un
Polytron, 25 s, 13000 RPM.
6. CENTRIFUGACIÓN A VELOCIDAD BAJA: 800 RPM
(\sim 100 xg) durante 2 min; se guarda el sobrenadante; se desecha
el sedimento.
7. CENTRIFUGACIÓN A VELOCIDAD ALTA: Se
transfiere el sobrenadante a tubos de velocidad alta, y se
centrifuga a 20.000 RPM (50.000 xg), 10 min. Se desecha el
sobrenadante; se añade 1 ml de tampón de ensayo encima del
sedimento.
8. Se congela en hielo seco; se tapan los tubos
y se guardan a -80ºC.
Se diluyen las membranas a 50 \mug/ml, y se
utilizan 2,5 \mug en cada pocillo (50 \mul de 50 \mug/ml).
Los ligandos radiomarcados para uso en este
ejemplo incluyen, pero sin carácter limitante, cloruro de
tetra-etilamonio (TEA),
4-aminopiridina (4-AP, así como
2-AP y 3-AP), 3,4- y
2,3-diaminopiridina, BaCl_{2}, CsCl, estricnina,
fenciclidina, piridostigmina, 9-aminoacridina,
DuP-996
(3,3-bis(4-piridinilmetil)-1-fenilindolin-2-ona;
linopiridina), clofilium, quinidina, aminoquinolinas y quinina.
Se ponen 130 \mul por pocillo en una placa de
96 pocillos
Se añaden 20 \mul de compuesto candidato
(fármaco), o solución de control (más tampón o diluyente del
compuesto de ensayo), o inespecífica (definida con ligando frío 10
nM)
Se añaden las membranas preparadas previamente a
la placa de ensayo, y se preincuban las membranas, más tampón,
compuestos de ensayo, etc. durante 5 min, 21ºC, con mezcladura en un
mezclador de placas Titer-Tek
Se añaden 50 \mul de Radioligando, [final] 25
pM, y se incuba durante 20 min a 21ºC, mezclando en el mezclador de
placas
Se separa el Radioligando fijado del libre por
filtración sobre los Unifilters GF/C preimpregnados; se lava dos
veces rápidamente utilizando tampón de lavado enfriado en hielo
Se deja que las placas Unifilter se sequen
durante una noche
Una vez secas, se añaden 25 \mul de
Microscint-20 a los Unifilters, y se someten a
cómputo en un contador de centelleo Top-Count
(Packard).
Los ligandos radiomarcados para uso en este
ejemplo incluyen, pero sin carácter limitante, cloruro de
tetra-etilamonio (TEA),
4-aminopiridina (4-AP, así como
2-AP y 3-AP), 3,4- y
2,3-diaminopiridina, BaCl_{2}, CsCl, estricnina,
fenciclidina, piridostigmina, 9-aminoacridina,
DuP-996
(3,3-bis(4-piridinilmetil)-1-fenilindolin-2-ona;
linopiridina), clofilium, quinidina, aminoquinolinas y quinina.
Se incuban neuronas (disponibles comercialmente
para cultivo (y para transfección y transformación), así como
células postmitóticas de CNS humano, por ejemplo, de STRATAGENE, La
Jolla, CA) en tubos de poliestireno de 12x 75 mm con un
radioligando (\sim 1-2x10^{3} Ci/mmol). A no ser
que se indique otra cosa, las células se suspenden en medio de
sacarosa isotónico (Medio I) que contiene Na-HEPES
10 mM, KCl 5 mM, NaCl 5 mM, y glucosa 6 mM, pH 8,4, y se incuban
con el radioligando durante 1 h a la temperatura ambiente en un
agitador de sacudidas rotativo. Se determina la fijación
inespecífica en presencia de 10 nM de radioligando frío nativo. Se
diluyen suspensiones stock de células para dar una concentración
final de células de 2,5x10^{5} células/ml en un volumen total de
400 \mul. Al final del periodo de incubación, se diluyen las
muestras con 4 ml de solución de extinción enfriada en hielo, que
contienen NaCl 200 mM, HEPES 20 mM (ácido libre), y se titulan a pH
8,0 con Trisbase. Las muestras extinguidas se filtran a través de
filtros de microfibra de vidrio GF/C, que se han impregnado
previamente en polietilenimina al 0,6%, y se lavan dos veces con
solución de extinción enfriada en hielo. Se someten a pasadas
muestras triplicadas para cada punto experimental. La desviación
estándar de la media es típicamente menor que 5%. Preparaciones de
células diferentes pueden producir relaciones algo distintas de
fijación inespecífica/total de radioligando. Se preparan soluciones
stock del radioligando en NaCl 100 mM, Tris-HCl 20
mM, pH 7,4, y seroalbúmina bovina al 0,1%.
Análisis de los Datos- Los datos de los
experimentos de saturación se someten a análisis Scatchard, y se
realiza una regresión lineal para proporcionar la constante de
disociación de equilibrio (K_{4}) y la concentración máxima de
receptor (B_{max}). Los coeficientes de correlación para estas
determinaciones son típicamente mayores que 0,95. Los datos de los
experimentos de competición se analizan por el método estándar de
Cheng y Prusoff para determinar los valores K_{i}. La constante de
la velocidad de disociación (\kappa_{1}) se determina
directamente a partir de una gráfica de primer orden de disociación
de ligando frente al tiempo. La velocidad de asociación de ligando
(k_{1}) se determina a partir de la ecuación
k_{1}-k_{obe}([LR]_{e}/([L][LR]_{max})),
donde [L] es la concentración de ligando, [LR]_{e} es la
concentración del complejo en equilibrio, [LR]_{max} es el
número máximo de receptores presentes, y k_{obe} es la pendiente
de la gráfica de pseudo-primer orden en
([LR]_{e}/{[L]_{e}-[LR]_{t}}) frente al
tiempo. Las velocidades de asociación y disociación del radioligando
se determinan también por medida de la cinética de fijación de la
entidad radiomarcada para concentraciones diferentes de ligando,
determinación de k_{obe} para cada concentración de ligando a
partir de representaciones semilogarítmicas de estos datos, y
determinación de k_{1} y k-_{1} a partir de la
pendiente y la ordenada en el origen y, respectivamente, de la
gráfica de k_{obe} frente a la concentración de ligando.
Los Ensayos de Fijación de Radioligando pueden
utilizarse con la presente invención sustancialmente como ha sido
descrito por Deutsch, C. et al., J. of Biological Chemistry,
266: No. 6, 3668-3674 (1991).
La despolarización de las células de
neuroblastoma humano por concentraciones altas de iones potasio
extracelulares conduce a la activación de los canales de potasio
con compuertas de voltaje. Se demuestra que la actividad de tales
canales de potasio es monitorizada eficaz y rápidamente por
seguimiento del eflujo de ^{86}Rb a partir de células diana
precargadas en respuesta al estímulo despolarizante. La inclusión de
compuestos con actividad desconocida en el medio de ensayo da como
resultado la identificación de nuevos bloqueadores del canal de
potasio descrito en esta memoria. Véase, Toral, J., et
al., Use of Cultured Human Neuroblastoma Cells in Rapid
Discovery of the Voltage-Gated
Potassium-channel Blockers, J. Pharm.
Pharmacol., 46:731 (1994). El bloqueo de los canales K+
individuales por un compuesto candidato da como resultado una
disminución importante en el eflujo de ^{86}Rb que puede ser
detectada fácilmente por este ensayo. Toral, J. et al., han
utilizado con éxito este ensayo para descubrir varias estructuras
químicas nuevas capaces de bloquear los canales de potasio
provistos de compuertas de voltaje en neuronas y cardiocitos. La
actividad bloqueadora del canal de potasio de estos compuestos ha
sido comprobada por técnicas electrofisiológicas, así como por
eflujo de ^{86}Rb a partir de células de mamífero cultivadas,
transfectadas con canales de potasio neuronales clonados provistos
de compuertas de voltaje.
El ensayo funcional de eflujo de ^{86}Rb de
alta capacidad se realiza en placas de microtitulación de 96
pocillos, representando un método de cribado primario rápido y de
alta capacidad para la detección e identificación de bloqueadores
de canales de potasio. La aplicación se describe para detección de
bloqueadores del canal de potasio en células cultivadas de
neuroblastoma humano. Toral, J. et al., Use of Cultured
Human Neuroblastoma Cells in Rapid Discovery of the
Voltage-Gated Potassium-channel
Blockers, J. Pharm. Pharmacol., 46:731 (1994).
Las células neuronales NT2 humanas altamente
purificadas y células hNT post-mitóticas del sistema
nervioso central para diferenciación frente al fenotipo neuronal,
están disponibles de STRATAGENE, La Jolla, CA, para transfección a
fin de permitir el estudio de los genes de canales de potasio y
ensayos descritos en esta memoria.
MOPS-PSS, pH 7,4 (NaCl 120 mM;
KCl 7,0 mM; CaCl_{2} 2,0 mM; MgCl_{2} 1,0 mM; ouabaína 10
\muM; ácido 4-morfolinapropanosulfónico, MOPS 20
mM).
MOPS-PSS que contiene KCl (80
mM) que reemplaza las concentraciones equivalentes de NaCl.
Los Compuestos Candidato se disuelven a
una concentración stock de 10-100 mM, sea en
MOPS-PSS o en dimetilsulfóxido (DMSO), y se diluyen
subsiguientemente en el tampón de incubación a la concentración
deseada. Los compuestos candidato se disuelven en
MOPS-PSS que contiene seroalbúmina bovina (0,1 @
p/v) a una concentración stock 50-500 \muM.
Se obtienen células de neuroblastoma humano
TE671 de la American Type Culture Collection (HTB 139) y se
mantienen a 37ºC en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)
suplementado con 10% de suero bovino fetal, 4,5 gl^{-1} de
glucosa y L-glutamina 2,0 mM. Las células se
extienden en placas y se cargan con ^{86}Rb en placas de
microtitulación de 96 pocillos como ha sido descrito por Daniel, S.
et al., J. Pharmacol. Methods, 25:185 (1991).
El medio de crecimiento en la placa de
microtitulación se desecha por una sacudida brusca de la placa. La
capa de células adherente se lava 3 veces con 200 \mul de
MOPS-PSS utilizando un pipeteador de 12 canales.
Las células se incuban durante 30 min a la temperatura ambiente, sea
con 200 \mul de MOPS-PSS, o 20 \mul de las
soluciones despolarizantes, en presencia o ausencia de un compuesto
candidato bloqueador del canal de potasio. El sobrenadante (150
\mul) de cada pocillo se retira y se somete a conteo. La capa de
células se solubiliza en 200 \mul de Tween 20 al 0,1% en agua y
se somete también a conteo 150 \mul en un contador de centelleo
de líquidos Packard 2200 CA. Todos los sobrenadantes se someten a
conteo en 7,0 ml de agua destilada.
El porcentaje de eflujo se calcula como
sigue:
y el valor del eflujo porcentual
neto se calcula
como:
% eflujo neto = % eflujo total - %
eflujo
basal
donde % eflujo total es el inducido
por la solución despolarizante que contiene KCl 100 mM. El eflujo
basal es el eflujo (fuga) de ^{86}Rb observado en la solución
salina fisiológica,
MOPS-PSS.
El método FLIPR (Fluorescent Imaging Plate
Reader) fue diseñado inicialmente para comportarse como una
herramienta de cribado de gran volumen para medidas del potencial
de membrana de las células en placas de microtitulación de 96
pocillos. El método FLIPR se aplica a ensayos de fluorescencia, por
ejemplo en la medida de iones intracelulares particulares y el pH
intracelular. FLIPR puede utilizarse también en ensayos no
fluorescentes.
En el modo fluorescente, FLIPR opera por
iluminación del fondo de una microplaca de 96 pocillos y medida de
la fluorescencia de la totalidad de los 96 pocillos utilizando
simultáneamente una cámara CCD refrigerada. La óptica de excitación
en FLIPR ilumina la placa desde el fondo y la óptica de emisión lee
la placa desde el fondo. Esto requiere que la microplaca que se
mide ópticamente en la máquina tenga un fondo claro.
El ensayo de medida típico consiste en la
utilización de una sola placa de 96 pocillos con células y una (o
dos) placas de 96 pocillos con los compuestos candidato a
cribar.
La óptica de detección de FLIPR está basada en
tecnología CCD (dispositivo de carga acoplado refrigerado). Con
cada actualización cinética, el sistema toma una imagen del fondo de
una microplaca, registrando una señal para todos los pocillos
individuales simultáneamente. Se consigue una sensibilidad mejorada
para los ensayos basados en células por detección óptica, lo que
permite el aislamiento de la señal en una monocapa de células. Esta
técnica es muy importante para ensayos en los cuales está presente
fluorescencia de fondo (por ejemplo por un tinte
extra-celular). Con objeto de hacer de FLIPR una
herramienta eficaz de cribado, el instrumento incluye un pipeteador
exacto de 96 pocillos que puede aspirar y dosificar desde dos
microplacas de adición de fluido separadas a una tercera microplaca
que se ensaya ópticamente. El sistema global está controlado por un
PC e interfaz de software basada en Windows. La interfaz proporciona
herramientas flexibles para desarrollo de ensayos, control de
calidad y tratamiento de los datos.
Las medidas se registran para canales de calcio
tanto provistos de compuertas de voltaje como de compuertas de
ligando sobre muchas líneas de células diferentes que incluyen CHO,
HEK, A10, ECV50, células neuronales de cultivos primarios, y otras.
Se utilizan fácilmente indicadores de longitud de onda visible, a
saber Fluo-3 y Calcium Green-1.
Probenecid 250 mM:
Se prepara nuevo cada día
710 mg de Probenecid
5 ml de NaOH 1,0 N - se solubilizan en
5 ml de Hanks' + HEPES 20 mM
\vskip1.000000\baselineskip
Tinte 1 mM:
Molecular Probes Fluo3, AM
F-1241
Calcium Green 1, AM C-3011
\vskip1.000000\baselineskip
1 mg Fluo3, AM o Ca-Green 1,
AM
443 \mul de DMSO - se solubiliza el tinte
443 \mul de Ácido "Pluronic" al 20% en
DMSO
Se guarda la solución en partes alícuotas a
-20ºC.
Puede congelarse y descongelarse varias
veces.
Alternativamente, se prepara una solución de
tinte 2 mM que puede mantenerse congelada, y una solución de Ácido
"Pluronic" al 20% que puede mantenerse a la temperatura
ambiente, y se mezclan las dos soluciones en una relación 1:1 antes
de su utilización.
\vskip1.000000\baselineskip
Ácido ``Pluronic'' al 20%:
Molecular Probes P-6867
Se pesa en un tubo y se solubiliza en DMSO a
37ºC,
por ejemplo: 400 mg/2 ml de DMSO.
Se deja enfriar a la temperatura ambiente y se
divide en partes alícuotas. Se guarda a la temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
DMSO:
Se utiliza DMSO con bajo contenido de agua
Por ejemplo; Sigma D2650 en ampollas de 5 ml
Otros artículos necesarios y utilizados en un
equipo de cultivo de células:
- \bullet
- Pipeteador de 12 canales 50-200 \mul, ejemplo Brinkman, parte #5008130-3
- \bullet
- Boquillas de pipeta estériles de 200 \mul, ejemplo E+K Scientific (Tel: 408-378-2013), parte #3507-R965) (10 gradillas de 96 boquillas)
- \bullet
- Aspirador para retirar el medio de los pocillos de placas. Ejemplo: aspirador múltiple de 12 puntas, parte #851388, o aspirador múltiple de 8 puntas, parte #951381 (de Wheaton Science Products (Tel: 800-225-1437)
- \bullet
- Pipetas serológicas estériles de 5 ml, 10 ml, y 25 ml
- \bullet
- Pipeteador recargable para pipetas de 2-25 ml
- \bullet
- Agua estéril para cultivo de tejidos
- \bullet
- Guantes
- \bullet
- Medio de cultivo para crecimiento de células
- \bullet
- EDTA y Tripsina/EDTA para células vivas
- \bullet
- Hemacitómetro y contador
- \bullet
- Tubos de ensayo estériles de 15 ml y 50 ml
- \bullet
- Solución de NaOH 1 N.
El método se desarrolló básicamente para la
medida del potencial de membrana utilizando el tinte sensible al
voltaje DiBAC(4)_{3} (Molecular Probes
B-438). El protocolo de ensayo fue desarrollado por
el Dr. Vince Groppi de Upjohn-Pharmacia en
Kalamazoo, Michigan.
Un criterio necesario para datos de calidad del
método FLIPR es que las células medidas se encuentren en el fondo
del pocillo. Esto no significa necesariamente que las células sean
adherentes. Esta necesidad es debida a la detección óptica en FLIPR
que mejora la sensibilidad para la fluorescencia procedente del
fondo del pocillo de la microplaca. Pueden utilizarse también
células no adherentes, pero que no se encuentren en suspensión.
Generalmente, las células no adherentes se centrifugan, formando una
pseudomonocapa en el fondo de la placa.
Algunos tipos de células requieren un
recubrimiento (v.g. Poli-D-lisina) a
fin de asegurar la adherencia. Los protocolos típicos implicarían
recubrir las microplacas en un entorno estéril antes de su
utilización.
Se utiliza el procedimiento siguiente para
preparar células que sobreexpresan el nuevo canal de potasio
descrito en esta memoria, v.g. SEQ ID NO: 2, para FLIPR.
Día 1: Cultivos stock de células de expresión
heterólogas transformadas o transfectadas se retiran de matraces
T75 con 1X tripsina/EDTA. Típicamente un matraz T75 contendrá
2x10^{6} células. Las células de expresión heterólogas se diluyen
a aproximadamente 0,25x10^{5} células/ml y se distribuyen 0,2 ml
de células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. De este
modo cada pocillo se extiende en placa con 0,5x10^{4} células
A10. De esta manera, un matraz T75 generará aproximadamente 4 placas
de 96 pocillos confluyentes después de crecimiento durante 3
días.
Día 3: Las células de expresión heterólogas se
alimentan cuidadosamente con medio de nuevo aporte. Debe tenerse
cuidado a fin de no fragmentar la monocapa.
Día 4: Las células están listas para análisis en
FLIPR.
Siguiendo este procedimiento, debería
establecerse una monocapa uniforme de células en cada pocillo en una
placa de 96 pocillos. Si la monocapa aparece no uniforme en algún
caso, se da por terminado el experimento y se preparan cultivos
nuevos.
Una vez seguido el procedimiento anterior hasta
el día 4 (véase la sección precedente) es ahora el momento de
preparar las placas para el ensayo en FLIPR. Basándose en su
renuencia al crecimiento excesivo, las células A10 pueden
utilizarse probablemente con éxito durante los días
4-6.
FLIPR puede incorporar un esquema de calibración
que utiliza pocillos de control positivos y negativos. Los
controles negativos son típicamente adiciones de un tampón fluido no
estimulante. Los controles negativos se utilizan para tener la
seguridad de que el instrumento y el ensayo funcionan adecuadamente,
proporcionando líneas base planas y sin respuesta donde no deba
existir ninguna. Los pocillos de control positivos se utilizan para
monitorizar cambios en la ganancia de señal. La calibración de
ganancia es útil para comparar la totalidad de los datos dentro de
una sola operación a fin de conocer los positivos y calibrar con
ello la placa.
El protocolo siguiente tiene por objeto
proporcionar soluciones suficientes para ensayar aproximadamente 2
microplacas:
1.) Se prepara una solución 20 mM de tampón
HEPES en EBSS por adición de 10 ml de HEPES 1 M a 490 ml de EBSS.
Esta solución es EBSS+H. Se calienta a 37ºC por incubación.
2.) Se preparan 100 ml de EBSS+H que contiene
DiBAC 5 \muM, por adición de 50 \mul de DiBAC 10 mM a 100 ml de
EBSS+H. Esta solución de EBSS+H+D. Se guarda a 37ºC. Esta solución
se utilizará en los pocillos de control negativos, para lavar las
células y también como el medio en solución con las células durante
el ensayo. Se utilizarán aproximadamente 60 ml por placa de ensayo.
El stock de DiBAC 10 mM se prepara a partir del polvo en DMSO. Para
el stock de DiBAC 10 mM: DiBAC se recibe normalmente en cantidades
de 25 mg y es útil para preparar alrededor de \sim 20 partes
alícuotas de 300 \mul en DMSO para congelación y uso
posterior.
3.) Se preparan 50 ml de EBSS+H que contiene
DiBAC 10 \muM, por adición de 50 \mul de DiBAC 10 mM a 50 ml de
EBSS+H. Esta solución es EBSS+H+D. Se guarda a 37ºC. Esta solución
de tinte 10 \muM (2X) se utilizará en FLIPR para preimpregnar las
puntas de las pipetas durante una operación. DiBAC se absorberá en
plástico, y los compuestos de estímulo se preparan en DiBAC
manteniendo de este modo las concentración de tinte en los pocillos
de microplacas medidos ópticamente que contienen las células.
4.) Se preparan 100 ml de EBSS+H+D que contiene
KCl 300 mM por adición de 7,5 ml de KCl 4M a 92,5 ml de EBSS=H y 50
ml de DiBAC 10 mM. Esta solución es EBSS+H+D+KCl300. Se guarda a
37ºC. Esta solución de KCl 10X se utilizará para los pocillos de
control positivos (adición de 20 ml a 180 ml: esto hace la
concentración final de KCl 30 mM) en la placa de adición.
1.) Se retira el medio de crecimiento de las
células con un pipeteador multipocillo. Si se utiliza un pipeteador
de 8 pocillos no se preparan más de 4 filas a la vez a fin de
asegurar que las células no se sequen. Se añaden a las células 250
\mul de EBSS+H+D precalentado. Esto se hace para la placa entera.
Este trabajo debe realizarse en una placa caliente ajustada a 37ºC,
para minimizar las fluctuaciones de temperatura. Se realizan dos
lavados con 250 \mul de EBSS+H+D.
2.) Haciendo de nuevo 4 filas a la vez, se
retiran los 250 \mul de EBSS+H+D y se reemplazan con 180 \mul
de EBSS+H+D precalentado reciente. Debe asegurarse que las puntas
del pipeteador estén preimpregnadas y sean consistentes cuando se
manipulan lavados de tinte a fin de evitar dilución variable.
3.) Después de lavar la placa de células, se
dispone la misma en la incubadora para equilibrar a 37ºC.
4.) Las células deben ensayarse en FLIPR dentro
de 2 horas después del lavado final.
1.) Se ponen 220-250 \mul de
EBSS+H+D en los pocillos de control negativos. El pipeteador se
bajará hasta el nivel de 50 \mul de fluido y típicamente aspirará
sólo 20 \mul por operación, por lo que esta placa puede ser
utilizada varias veces. Pueden utilizarse microplacas claras para
las placas de estímulo. La utilización del pipeteador FLIPR de 96
pocillos con una placa de fondo plano dará como resultado un volumen
muerto de aproximadamente 50 \mul en tanto que una placa de fondo
en v puede tener volúmenes muertos tan bajos con
10-20 \mul.
2.) Se ponen 220-250 \mul de
EBSS+H+D+KCl300 en los pocillos de control positivos diseñados.
3.) Si los desconocidos se encuentran en un
disolvente, debe asegurarse que se incluya la misma concentración
de disolvente en los pocillos de control negativos. En la
experiencia de los autores es posible intentar mantenerse por
debajo de DMSO 0,1%.
4.) Se coloca la placa de adición de fármaco en
la incubadora y se equilibra a 37ºC.
1.) Se pone en marcha el flujo de agua del láser
y se desconecta la corriente eléctrica.
2.) Se enciende el láser. Típicamente, el láser
requerirá aproximadamente 15 a 30 minutos para estabilizarse.
Coherentemente, se recomienda un periodo de calentamiento de
estabilización de calentamiento de 30 minutos para el láser. Se
recomienda también (debido al tiempo de vida del tubo) apagar el
láser si se prevé mantener apagado el mismo durante más de 3 horas,
en caso contrario se dejará el láser encendido.
3.) Se encienden el ordenador, el monitor y el
controlador de la cámara. Debe asegurarse que la cámara CCD se
encuentre a temperatura antes de tomar datos con la cámara. La
temperatura apropiada se indica por una luz vede de "status"
en el controlador de la cámara. Normalmente el enfriamiento de la
cámara requiere aproximadamente 5 minutos.
4.) Se enciende el recinto FLIPR. Se asegura que
el PC está iniciado antes de encender el recinto FLIPR. El
sistema puede bloquearse en caso contrario.
5.) Se enciende el regulador para una fuente de
aire a 80 p.s.i (5,4 atm).
6.) Se aclaran cualesquiera impedimentos,
asegurándose de que el extractor de células está encendido y las
puntas de las pipetas están hacia arriba.
7.) Se pone en marcha el flujo de aire para la
cámara de humedad (ensayos dependientes de la temperatura
únicamente).
8.) Se pone en marcha el código FLIPR haciendo
doble clic en el icono del software de control de FLIPR. El
pipeteador pasará también por el ciclo normal de retorno durante la
puesta en marcha. Si se desea control de la temperatura, y el mismo
no se ha ajustado por defecto en el archivo setup.flp, se inicia por
la opción de bajada de los "calentadores" de montaje. Serán
necesarios aproximadamente 30 minutos para que los sensores de
temperatura se estabilicen. Recuérdese que la opción de control de
temperatura requiere que la fuente de aire regulada a baja presión
debe estar conectada también.
9.) Debe esperarse a que los indicadores de
alarma de temperatura desaparezcan en la ventana de presentación su
se está utilizando control de temperatura.
Debido a la fuerte dependencia de la temperatura
de DiBAC, es una buena idea poner inmediatamente las células en la
cámara de incubación de células del FLIPR una vez retiradas de la
incubadora.
Para reducir el tiempo de estabilización de la
temperatura, la placa de células y la placa de adición deben
retirarse de la incubadora y ponerse en la cámara de incubación de
células en FLIPR tan rápidamente como sea posible. Cuanto más
cuidado tenga el operador en la manipulación de las placas, tanto
más rápida será la estabilización de temperatura de DiBAC y más
rápidamente se estabilizarán las líneas base fluorescentes.
El operador necesita luego establecer los
parámetros a utilizar en el experimento. La elección de la opción
experimental bajo el menú de bajada del montaje realiza esta
función.
Parámetros de ganancia del sistema:
Suponiendo que el láser está ajustado a
aproximadamente 300 mW
Dado que DiBAC es brillante, la F/parada debe
ajustar alrededor de F5,6, es decir parada bajo un tiempo breve de
Exposición de la Cámara, de aproximadamente 0,4 segundos (el modo de
ajustar éstos se describe más adelante).
\vskip1.000000\baselineskip
Parámetros Generales de Montaje:
a.) Longitud de Exposición: (tiempo de
integración de la cámara): usualmente alrededor de 0,4 segundos
b.) Filtro #1 (filtro estándar)
c.) Boquillas de preimpregnación (comprobadas
usualmente, usualmente de la bandeja izquierda)
d.) Adiciones múltiples
e.) Automatización: Elección de opciones por el
usuario
\vskip1.000000\baselineskip
Bajo la Definición de la Primera Secuencia
a.) Intervalo de muestreo (típicamente 20
segundos)
b.) Recuento de la muestra (depende de la
duración del experimento deseada), usualmente 15 minutos son
suficientes para DiBAC, por tanto un tiempo de 20 segundos
actualiza, y en 15 minutos de tiempo de ejecución total, se
tomarían 45 muestras.
c.) Segundo intervalo (usualmente no necesario
con DiBAC, por regla general utilizado sólo para actualizaciones
rápidas)
d.) Adición de fluidos activa comprobada
e.) Volumen de fluido a añadir (usualmente 20
\mul, dado que DiBAC es sensible a la temperatura y se prefieren
volúmenes de adición menores.
f.) Velocidad de dispensación (depende del tipo
de célula, 20 \mul/s es lenta, 80 \mul es rápida, cuanto más
rápida es la velocidad de mezcla tanto mejor es la mezcladura,
dependiendo de lo que soporten las células sin ubicarse de nuevo en
el fondo de la placa.
\vskip1.000000\baselineskip
Bajo pipeteado
a.) Volumen de mezcla (generalmente 40
\mul)
b.) Número de mezclas (generalmente 3, mezclar
de hecho debido que la adición de un volumen pequeño a un volumen
grande, así como la cinética de DiBAC son suficientemente lentas
para permitir la omisión entre actualizaciones.
c.) Posición de la boquilla, no controlada, es
decir las boquillas están fuera del pocillo durante la recogida de
los datos, dado que el experimento DiBAC es lento, el pipeteador
tiene tiempo para subir y bajar alternativamente en el fluido entre
los puntos de muestra, y manteniendo incontrolada esta caja puede
asegurarse que el compuesto no se lixivia en la placa de células
antes del suministro programado.
d.) Adición de fluido, generalmente para DiBAC
ésta se comprobará, es decir el pocillo separará la misma cantidad
de fluido que se añadió, en este ejemplo 20 \mul. Esto asegura que
no hay dependencia alguna de la altura del fluido asociada con la
adición de un componente de fondo muy fluorescente, siendo éste el
DiBAC en solución con los compuestos de adición. Esto puede ser o
no necesario. Con esta caja sin controlar, se añadirá el fluido,
cambiando el volumen total del pocillo a 200 \mul (suponiendo que
ya se han añadido a la placa de células 20 \mul a 180
\mul).
Una vez que se ha definido el experimento, el
usuario realizará una comprobación del nivel de señal utilizando el
"bulbo claro" o la opción de operación "Signal Test". Esta
requiere una exposición de cámara que demanda el tiempo de
exposición de corriente definido en la ventana Setup Experiment y
presenta los conteos de señal para la totalidad de los 96 pocillos
de la placa. La misma presenta también algunas estadísticas de los
conteos de señal medio, mínimo y máximo para la exposición. Dado
que el intervalo dinámico total de la cámara son 65.000 conteos, es
una buena idea trabajar con conteos de señal comprendidos en el
intervalo de 25.000 a 30.000 DiBAC. Para estos niveles de ganancia,
una señal fisiológica DiBAC satisfactoria (v.g. una despolarización
de membrana) será del orden de 5.000 conteos. Así, partiendo con un
intervalo de fluorescencia basal de 25 a 30.000 conteos se facilita
el aseguramiento de que los píxeles individuales de la cámara no se
saturarán durante la recogida de los datos.
Si los conteos de señal son demasiado altos o
demasiado bajos, se recomienda acortar o alargar respectivamente el
intervalo de exposición de la cámara hasta que se consigue el nivel
de señal correcto. Si se requieren tiempos de exposición menores
que 0,4 segundos para volver a los niveles de vídeo deseados, deberá
disminuirse la potencia de la fuente de láser o, alternativamente,
interrumpir la apertura de la cámara. Cada aumento de F/parada de
la cámara reduce la sensibilidad de detección por un factor de 2.
Los intervalos generales para los parámetros de ganancia del
sistema son como sigue:
Potencia del láser: opera entre 150 mW y 1
Vatio: se aconseja dejar aproximadamente 300 mW de tal modo que el
láser se caliente hasta un punto consistente cada día, y aumentar la
potencia cuando se requiere más ganancia.
F/parada de la cámara (opera entre F/2 y F/22);
obsérvese que cada parada es un factor de 2 en sensibilidad siendo
F/2 la apertura máxima, con la máxima sensibilidad. Este es el
parámetro más fácil de cambiar para eliminar la luz, por ejemplo
cuando se realiza el ensayo DiBAC.
Exposición de la Cámara: Se opera durante más de
0,2 segundos, para datos cinéticos (disposición múltiple). Esto es
debido a que, para tiempos de exposición muy cortos, la fluctuación
mecánica en la apertura y cierre del obturador de la cámara puede
añadir ruido a las trazas fluorescentes temporales. Esto no es un
problema para una exposición simple (no cinética).
Una vez que se ha ajustado el nivel de señal, el
operador está listo para comenzar una comprobación de la
estabilidad de la línea base. Esto es usualmente una buena idea a
fin de asegurar que las líneas base fluorescentes se encuentran en
equilibrio térmico, lo que da como resultado fluorescencia plana de
la línea base. Esto puede hacerse comenzando un experimento,
usualmente con actualizaciones de 20 segundos de tiempo, con el
pipeteado desactivado. Este problema es más importante en los
ensayos DiBAC que en los ensayos de calcio intracelular.
Dependiendo de la temperatura del fluido cuando la placa de células
está dispuesta en FLIPR, la estabilización puede llevar unos
cuantos minutos o hasta 20 minutos.
Suponiendo que la líneas base son planas, es
ahora el momento de iniciar el ensayo. Un toque en el icono de
parada en cualquier momento puede detener la línea base. Una vez que
el usuario está satisfecho de la planaridad de las líneas base, el
pipeteador debe reactivarse en la ventana experimental Setup; página
de diálogo: "primera secuencia".
El experimento continuará, con la presentación
en tiempo real de la actualización de los datos fluorescentes
medidos, hasta que se ha completado el número total de medidas. En
este momento, el pipeteador volverá a la estación de carga de la
pipeta en el lado derecho de FLIPR.
Una vez que se ha completado la operación, el
usuario está listo para exportar (o procesar) los datos. Esto
convierte básicamente los archivos de datos brutos, que se han
comprimido y almacenado ya en el disco duro, en conteos de señales
fluorescentes por pocillo. La exportación de los datos se expone en
detalle en la sección 3.5.
Después de la carga de tinte, se requerirán
varios lavados en un tampón salino no fluorescente para reducir los
artefactos de señal asociados con la presencia de tinte extracelular
así como el ruido de fondo asociado con las entidades fluorescentes
en el medio. El principal artefacto presente con un lavado
inadecuado es una disminución brusca de señal después de la adición
del estímulo debido a la dilución del componente fuerte de ruido de
fondo. Recuérdese que por regla general los compuestos están
mezclados en una solución salina no fluorescente, v.g. Hanks,
Earles, etc. y que se hacen grandes adiciones en volumen (v.g. 50
\mul a 100 \mul) a fin de asegurar una mezcladura rápida.
El tampón de lavado de células debería ser la
misma solución utilizada con las células durante el test.
Análogamente, este mismo tampón debería utilizarse para preparar
los compuestos de estímulo a fin de evitar cambios indeseables de
pH, osmolaridad, o morfología en las células durante un experimento
cinético. Típicamente se utilizarán soluciones balanceadas de sal
tales como HBS, PBS o EBSS. Es muy importante que los compuestos
se preparen "exactamente" en el mismo tampón en el que se
lavan y se posan las células antes de la realización del
experimento.
Un protocolo típico consistiría en cargar el
tinte durante 1,5 horas, lavar 3,4 veces con tampón (200 \mul por
pocillo), utilizando por ejemplo un lavador suave tal como el Denley
CellWash. El número exacto de lavados necesarios dependerá del tipo
de células. Algunas veces es conveniente un periodo de espera entre
lavados (dos antes, dos después) a fin de permitir que las células
alcancen de nuevo el equilibrio para una concentración extracelular
más baja de tinte, antes de realizar el lavado final. Si las células
son sólo ligeramente adherentes, se producirá una alternativa entre
el lavado de las células concienzudamente para eliminar el tinte
extracelular, y el lavado de las células fuera de las placas.
La velocidad de suministro del pipeteador
debería ser por regla general aproximadamente 50 \mul/segundo. No
obstante, si las células son sólo ligeramente adherentes, el usuario
puede necesitar reducir la velocidad de dispensación. Una velocidad
de dispensación lenta es del orden de 20 \mul/segundo, y una
velocidad de dispensación rápida es alrededor de 80 \mul/segundo.
Estos valores deben determinarse experimentalmente para cada tipo
de célula, pero generalmente es preferible realizar la dispensación
lo más rápidamente posible a fin de mejorar la mezcladura. La
alternativa es que la velocidad de pipeteado no puede ser tan
enérgica que desaloje las células en el fondo del pocillo. Esto
retirará efectivamente las células fluorescentes del campo de
visión de los píxeles de la cámara, causando con ello grandes
disminuciones (artefactos) en las trazas fluorescentes después de
la adición del fluido.
Al comienzo de una pasada de datos, es útil
realizar un "test de señal" para comprobar el nivel de carga de
tinte en las células. Cuando se estabilizan los protocolos de nivel
de carga, es útil no cargar tinte en la microplaca entera para
obtener una lectura en los conteos fluorescentes del fondo. Estos
pocillos sin carga deberían tratarse exactamente como los pocillos
cargados en términos de pasos de lavado, etc. El componente
dominante de fondo (suponiendo que se utiliza una solución salina
para el tampón durante el experimento) será la fluorescencia de las
microplacas de plástico. La mayoría de las soluciones de tampón
salino tienen una fluorescencia insignificante para longitudes de
onda de excitación de 488 nm.
El trabajo con niveles de fluorescencia
iniciales (por encima del ruido de fondo) de aproximadamente 10.000
a 20.000 conteos (recuérdese que la saturación son 65.000 conteos)
se recomienda para niveles iónicos basales. De nuevo, dependiendo
de los niveles de carga, esto debería ser alcanzable con
aproximadamente 0,300 W de potencia del láser, 0,4 s de tiempo de
integración y un ajuste F/parada de F/2.
1.) Extender las células en placas hasta
confluencia: precisan ser adherentes
2.) Hacer el stock de tinte \sim 2 mM en DMSO
anhidro
3.) Hacer el stock de tinte 1 mM por dilución
con ácido "Pluronic" al 20% p/v (muy necesario conforme a la
experiencia de los inventores)
4.) Hacer el stock de carga de tinte 4 \muM
por adición de 40 \mul de stock 1 mM a 10 ml de tampón de carga o
medio. Esto será suficiente aproximadamente para una placa.
5.) Retirar el medio de crecimiento y el suero
de las células extendidas en placa. Alternativamente, si se carga
en medio y suero, añadir simplemente tinte/medio/suero al
medio/suero existente. Esto elimina un paso de aspiración, no
obstante, si se reduce la concentración de tinte.
6.) Cargar las células con tinte 4 \muM
(\sim 100 \mul por pocillo) durante 1,0 a 1,5 horas)
7.) Lavar las células dos veces con solución
tampón. Se logrará un lavado satisfactorio utilizando volúmenes de
al menos 200 \mul por pocillo.
8.) Incubar de nuevo las células durante 15
minutos.
9.) Lavar dos veces más con tampón, dejando
100-150 \mul en los pocillos. El volumen residual
real depende del grado de dilución deseado en la preparación de la
placa de estímulo. Es importante que los volúmenes finales sean
consistentes a fin de lograr una consistencia satisfactoria de
pocillo a pocillo. Puede ser apropiado realizar 4 lavados con
tampón consecutivamente, sin reincubación. Esto se determina
empíricamente de manera usual basándose en si está presente o no un
artefacto de fuga de tinte en los pocillos de control negativos.
Clonación de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4 en
vectores de expresión de mamífero: Se cortaron cada uno de los
fragmentos EcoRI que contenían las secuencias de región codificante
SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4 a partir de un vector pCR2.1
(Invitrogen, Carlsbad, CA) y se ligaron en el sitio EcoRI de un
vector pcDNA3 (Invitrogen). Las colonias bacterianas transformadas
se cribaron respecto a orientación por PCR, utilizando vector e
iniciadores génicos específicos. Los clones se confirmaron por
secuenciación del DNA.
Generación de un constructo de fusión de SEQ
ID NO: 2 con la Proteína Fluorescente Verde Intensificada (EGFP)
N-terminal: El fragmento EcoRI de SEQ ID NO: 2
en un vector pCR:1 (supra) se ligó en el sitio EcoRI de
pEGFPC1 (Clontech, Palo Alto, CA (Cormack, B.P. et al., Gene,
173:33 (1996))) para generar un constructo de fusión de SEQ ID NO:
2 con EGFP N-terminal. Las colonias bacterianas
transformadas se cribaron respecto a orientación de sentido por PCR
y se confirmaron por secuenciación del DNA.
Transfección: Se transfectaron células
HEK 293 (ATCC, Rockville, MD) como sigue: Se añadieron 70 \mul de
LipoTAXI (Stratagene, La Jolla, CA) a un tubo de poliestireno y se
mezclaron suavemente. Se añadieron dos (2) \mug de pEFGPC1
(vector de control utilizado para rastrear las células
transfectadas) y 5 \mug de uno de los constructos (SEQ ID NO: 2
en pcDNA3 o SEQ ID NO: 4 en pcDNA3) a la mezcla lípido/medio y se
incubó durante 20 minutos. Se añadieron luego dos (2) ml de
OPTI-MEM I y se mezcló suavemente. Las células a
transfectar se lavaron una sola vez con OPTI-MEM I,
y se añadieron los 3 ml de mezcla lípido-DNA a las
células lavadas, después de lo cual se incubaron a 37ºC con 5% de
CO_{2} durante 4-6 horas. Las células se
realimentaron luego con FBS al 10% Desactivado por Calentamiento
(Biowhittaker, Walkersville, MD) DMEM (Mediatech
10-017-CV). Para experimentos de
co-expresión, se utilizaron en este protocolo 2
\mug de pEGFPC1 (vector de control), 5 \mug de pcDNA3QT2L ((SEQ
ID NO: 2 en pcDNA3) y 20 \mug de pcDNA3QT2S (SEQ ID NO: 4 en
pcDNA3). Las células se diluyeron y se extendieron de nuevo en
placa en cápsulas de 35 mm, 24-48 horas antes de la
inmovilización de los parches.
Las células COS-7 (ATCC,
Rockville, MD) se transfectaron como sigue: Se añadieron 25
\mul de Reactivo DMRIE-C (Gibco BRL/Life
Technologies, Gaithersburgh, MD) a 2 ml de OPTI-MEM
I (Gibco BRL/Life Technologies, Gaithersburgh, MD), se mezcló
suavemente y se incubó durante 20 minutos. Se añadieron dos (2)
\mug de pEGFPC1QT2L (EGFP fusionada al término N de SEQ ID NO: 2)
y 7,3 \mug de pcDNA3 o 9,3 \mug de pcDNA3QT2S (SEQ ID NO: 4 en
pcDNA3) (para un exceso 5 molar sobre el constructo hKvQT2L (SEQ ID
NO: 2)) a la mezcla lípido/medio, se mezcló suavemente y se incubó
durante 20 minutos. Se añadieron luego dos (2) ml de
OPTI-MEM I a lo anterior y se mezcló suavemente.
Las células a transfectar se lavaron una sola vez con
OPTI-MEM I, y los 4 ml de la mezcla
lípido-DNA se añadieron a las células lavadas y se
incubaron a 37ºC con 5% de CO_{2} durante 4-6
horas. Las células se realimentaron luego con FBS al 10%
Desactivado por Calentamiento (Biowhittaker, Walkersville, MD) DMEM
(Mediatech 10-017-CV). Se
tripsinizaron las células, se diluyeron y se extendieron de nuevo en
placa en cápsulas de 35 mm, 24-48 horas antes de la
inmovilización de los parches.
Electrofisiología: Todos los registros se
obtuvieron utilizando la configuración convencional de células
enteras (Hammill, O.P. et al., Pfluger Arch., 391,
85-100, 1981). Las células se transfectaron con 5
\mug de pcDNA3 ó 2 \mug de pEGFPQT2L (EGFP fusionada al término
N de SEQ ID NO: 2) 24-48 horas antes de los
experimentos. La solución extracelular era (mM: 160 NaCl, 4,5 KCl,
1 MgCl_{2}, 2 CaCl_{2}, 5 HEPES, 5 glucosa (pH: 7,4 por NaOH,
\sim 325 mOsm). En los experimentos de selectividad de K+, el
Na^{+} equimolar se sustituyó por K^{+}. La solución de
pipeteado era (mM: 150 K-aspartato, 2 MgCl_{2}, 1
CaCl_{2}, 5 HEPES, 1,6 EGTA (pH 7,2 por KOH, \sim 305 mOsm). Se
implementaron los protocolos de voltaje y se adquirieron los datos
utilizando software pClamp 6.0 (Axon Instr., CA). Cambios de
solución y aplicación del fármaco con un sistema de perfusión
local.
Para generar la Fig. 13, se transfectaron las
células con 2 \mug de pEGFPQT2L (SEQ ID NO: 2) y un exceso molar
de 5 ó 10 veces de vector vacío (pcDNA3) o pcDNA3QT2S (SEQ ID NO:
4), 24-48 horas antes de los registros. Las
corrientes se provocaron por pasos de voltaje de 850 ms
incrementados por 10 mV desde -40 mV a 70 mV a partir de un
potencial de retención de -60 mV. Las corrientes se normalizan hasta
la capacitancia de las células para producir densidades de
corriente. Las líneas rojas continuas son ajustes monoexponenciales
a los datos.
Se adquirió una transferencia de tumores humanos
que contenía tejidos enfermos y normales de Invitrogen, Carlsbad CA
(Cat #D5030-01; lote #607337). La transferencia
disponible comercialmente contenía RNA total aislado de tejido
tumoral de cuatro donantes diferentes; el tejido tumoral y el normal
se escindieron en el mismo sitio de operación. Se cargaron 20
microgramos de RNA total por pista y se sometieron a pasadas sobre
un gel desnaturalizante de formaldehído al 1%. El gel se transfirió
a vacío a una membrana de nailon y se fijó por irradiación UV y
secado al horno. Se generó una sonda de DNA marcada con ^{32}P
correspondiente a las posiciones de los nucleótidos
989-1109 de SEQ ID NO: 2 (sonda 2) (supra), y
se hibridó a la transferencia a 42ºC en solución Prehyb/Hyb
NorthernMax (Ambion Inc., Austin, TX). Se realizaron dos veces los
lavados de alta severidad en 2X SSC/0,5% SDS durante 5 min; 2X
SSC/0,1% SDS durante 5 min., 0,1% SSC/0,5% SDS durante 30 min a 37
grados de acuerdo con Sambrook et al., Cold Spring Harbor,
Molecular Cloning (1989). La transferencia se expuso a
película BioMax MS-1 (Kodak, Rochester, NY) durante
5-7 días a -80ºC con dos filtros
intensificadores.
Diversas modificaciones y variaciones de los
métodos y el sistema de la invención descritos serán evidentes para
los expertos en la técnica sin desviarse del alcance de la
invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con
realizaciones específicas preferidas, debe entenderse que la
invención, tal como se reivindica, no debe considerase limitada
impropiamente a tales realizaciones específicas. De hecho, debe
considerarse que diversas modificaciones de los modos descritos
para realización de la invención, que son evidentes para los
expertos en biología molecular o campos afines, están incluidas
dentro del alcance de las reivindicaciones que siguen.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Zeneca Ltd
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 15 Stanhope Gate
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Londres
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TERRITORIO: Gran Londres
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Inglaterra
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): W1Y 6LN
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 0171 304 5000
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 0171 304 5151
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 0171 834 2042
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: POLINUCLEÓTIDOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9726339.6
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 13-DEC-1997
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3029 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2565 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 854 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1425 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 393 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 581 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 872 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 825 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Un polinucleótido purificado que comprende
una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ
ID NO: 3, poseyendo dicho polipéptido la capacidad para permitir el
flujo y/o transporte transmembranal de ión potasio.
2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en
donde la secuencia de polinucleótidos comprende la secuencia de SEQ
ID NO: 2.
3. Un vector de expresión que comprende el
polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2.
4. Una célula hospedadora transformada con el
vector de expresión de la reivindicación 3.
5. Un polipéptido purificado de SEQ ID NO: 3,
poseyendo dicho polipéptido la capacidad para permitir el flujo y/o
transporte transmembranal de ión potasio.
6. Un método para producir células que expresan
un polipéptido de SEQ ID NO: 3, poseyendo dicho polipéptido la
aptitud para permitir el flujo y/o transporte transmembranal de ión
potasio, comprendiendo dicho método:
a) transformar células hospedadoras adecuadas
con un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica
un polipéptido de SEQ ID NO: 3, poseyendo dicho polipéptido la
capacidad para permitir el flujo y/o transporte transmembranal de
ión potasio; y
b) seleccionar células que expresan el
polipéptido codificado por el ácido nucleico introducido.
7. Un método para producir un polipéptido de SEQ
ID NO: 3, poseyendo dicho polipéptido la capacidad de permitir el
flujo y/o transporte transmembranal de ión potasio, comprendiendo
dicho método:
a) cultivar una célula hospedadora de acuerdo
con la reivindicación 4 en condiciones adecuadas para la expresión
de dicho polipéptido; y
b) recuperar dicho polipéptido del cultivo de la
célula hospedadora.
8. Un método de identificación de compuestos que
modulan la actividad biológica de un canal de potasio, que
comprende:
a) combinar un compuesto candidato modulador de
la actividad biológica con un polipéptido de SEQ ID NO: 3,
poseyendo dicho polipéptido la capacidad de permitir el flujo y/o
transporte transmembranal de ión potasio; y
b) medir un efecto del compuesto candidato
modulador sobre la capacidad de flujo y/o transporte transmembranal
de ión potasio del polipéptido.
9. Un método de identificación de compuestos que
modulan la actividad biológica de un canal de potasio, que
comprende:
a) combinar un compuesto candidato modulador de
la actividad biológica de un canal de potasio con una célula
hospedadora que expresa un polipéptido de SEQ ID NO: 3, poseyendo
dicho polipéptido la capacidad de permitir el flujo y/o transporte
transmembranal de ión potasio; y
b) medir un efecto del compuesto candidato
modulador sobre la capacidad de flujo y/o transporte transmembranal
de ión potasio del polipéptido a que se hace referencia en el Paso
(a).
10. Un método de la reivindicación 8 ó 9, en el
cual un compuesto identificado como modulador de la actividad
biológica de un canal de potasio es un modulador de la
neurofisiología.
11. Uso de un polipéptido purificado de SEQ ID
NO: 3, o células hospedadoras que expresan dicho polipéptido, o una
preparación fabricada a partir de dichas células en un cribado de
compuestos que modulan la capacidad de flujo y/o transporte
transmembranal de ión potasio de dicho polipéptido.
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