JP2002524030A - Ｃ７Ｆ２−新規カリウムチャネルβサブユニット - Google Patents

Ｃ７Ｆ２−新規カリウムチャネルβサブユニット

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新たに同定されたカリウムチャネルβサブユニットに関する。本発明はまた、前記サブユニットをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、チャネル媒介性疾患の診断および治療に適用できるサブユニットポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用した方法に関する。本発明はさらに、診断およｘxび治療に適用できる、アゴニストおよびアンタゴニストを同定するためにポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用した薬剤−スクリーニング方法に関する。本発明はさらに、サブユニットポリペプチドおよびポリヌクレオチドに基づいたアゴニストおよびアンタゴニストを含む。本発明はさらに、サブユニットポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作製するための手順に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 技術分野 本発明は、新たに同定されたカリウムチャネルβサブユニットに関する。本発
明は、また、βサブユニットをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は
、さらに、チャネル媒介性疾患の診断および治療の標的として、βサブユニット
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用する方法に関する。本発明はさらに
、診断および治療に適用できるアゴニストおよびアンタゴニストを同定するため
にポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用する薬剤のスクリーニング方法に
関する。本発明はさらに、βサブユニットポリペプチドおよびポリヌクレオチド
に基づいたアゴニストおよびアンタゴニストを含む。本発明はさらにβサブユニ
ットポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作製するための方法に関する。
【０００２】 背景技術 原形質膜を通過するカリウムの流動は、活動電位の立ち上がりおよび細胞容量
のコントロールを含む、種々の生物過程に影響を与える。カリウムチャネルは、
偏在的な膜内在性蛋白質(integral membrane protein)で、興奮細胞および非興
奮細胞において数多くの機能を果たす（McManus, O. B., J. Bioenerg. Biomemb
r. 23: 537-560(1991)）。多数の異なるクラスのカリウムチャネルが調査されて
おり、生物物理学的特性、生理学的調節および薬理学に基づいて数クラスに分類
されている（Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes, Sunderland
, M. A. Sinauer(1992); Rudy, B. Neuroscience 25: 729-749(1988)）。主要な
種類には、電圧依存的チャネル、カルシウム活性化型チャネルおよびATP感受性
チャネルが含まれる。サブタイプが存在する分類もある。しかし、ある種の機能
は多数の種類のカリウムチャネル間で共有されている（Kukuljan et al., Am. J
. Physiol. 268(Cell Physiol. 37): C535-C556(1995)）。
【０００３】 カリウムチャネル形成蛋白質は、膜貫通セグメントの数が異なる3つのファミ
リーに分類することができる。最も大きいファミリーは、6つの膜貫通セグメン
トを含有する。内向きの修正者は、2つの膜貫通セグメントを有するサブユニッ
トの第2のファミリーを含む。第3のファミリーは、1つだけの膜貫通セグメント
を含有する。これらのチャネルは、組換えＤＮＡ技法を使用して検討されている
。その情報は、上記に引用しているKukuljan et al,に総説されている。
【０００４】 高コンダクタンスのカルシウム活性化型カリウムチャネルは、数多くの独自の
特徴を有する蛋白質グループである。チャネルは細胞内カルシウムおよび膜脱分
極によって活性化される。チャネルは高いシングルチャネルコンダクタンスを示
し、カリウムに対する感受性が高い。チャネルは、チャネルの外側に位置する受
容体部位に結合して、細孔の物理的閉塞によってカリウムの流動を妨害するカリ
ブドトキシンなどの特定の毒素に感受性である。
【０００５】 Knaus et al.(J. Biol. Che. 269:3921-3924(1994))は平滑筋の高コンダクタ
ンスカルシウム活性化型カリウムチャネルのサブユニット組成を報告している。
このカリウムチャネルは、それぞれ、62および31キロダルトンのαおよびβの2
つのサブユニットを含むことが報告されている。アミノ酸配列分析は、ショウジ
ョウバエ(Drosophila)のクローニングされた2つの高コンダクタンスカリウムチ
ャネルとの高い配列相同性を示した。αサブユニット断片の1つのアミノ酸配列
に対する抗ペプチド抗体も、非変性条件下において、βサブユニットを免疫沈降
し、これは両サブユニットの非共有結合的な特異的結合を示している。結果から
、この特定の高コンダクタンスカリウムチャネルのαサブユニットは特定のファ
ミリーのカリウムチャネルのメンバーであり、βサブユニットと非共有結合的な
複合体を形成することが示された。この参照文献は、2つのポリペプチド間の特
定の密接な相互作用を報告している。以下のモデルが提唱されている。αサブユ
ニットは中心のイオンチャネル形成要素で、種々の遮断性毒素の受容体を含有す
る。四量体αサブユニットは非共有結合的に4つのβサブユニットと結合する。
βサブユニットは細孔を形成し、受容体を保有するサブユニットに近接している
（12Å未満）。この高コンダクタンスカリウムチャネルβサブユニットはラット
脳ナトリウムチャネルのβサブユニットおよび骨格筋Ｌ型カルシウムチャネルの
γサブユニットと特徴を共有しており、構造および/または機能が類似している
場合もある。このサブユニットは、多数の電圧依存型およびカルシウム依存型カ
リウムチャネルの保存された構成であることが推測される。
【０００６】 Knaus et al.(J. Biol. Chem. 269: 17274-17278(1994))は平滑筋の高コンダ
クタンスカルシウム活性化型カリウムチャネルのβサブユニットの一次配列およ
び免疫学的特徴を開示している。このアミノ酸配列を使用して、蛋白質をコード
するｃＤＮＡを単離するオリゴヌクレオチドプローブをデザインした。蛋白質は
、他の既知のイオンチャネルのサブユニットと配列相同性がほとんどない2つの
疎水性（推定膜貫通）ドメインを含有することが報告された。この報告から、β
サブユニットは細孔形成サブユニットの特性を調節する際に何らかの役割を果た
すことが示唆されている。例えば、ナトリウムまたはカルシウムチャネルのαサ
ブユニットおよびβサブユニットの同時発現は、αサブユニット単独によって発
現される電流を調節することが証明されている。この参照文献はまた、他のβサ
ブユニットとの小領域の相同性を報告した。例えば、ウサギ心筋のカルシウムチ
ャネルのβ2サブユニットは、検討中のチャネルのβサブユニットの領域と100%
相同である8つのアミノ酸の伸長部を含有することが報告されている。
【０００７】 McManus et al.(Neuron 14: 645-650(1995))は、アフリカツメガエルの卵母細
胞で異種的に発現される高コンダクタンスカリウムチャネルのβサブユニット特
性の機能的寄与を調査した。ウシ平滑筋の高コンダクタンスカリウムチャネルβ
サブユニットの同時発現は、発現されているマウス脳αサブユニットの特性に劇
的な影響を与えることを、この参照文献は報告した。この参考文献は、αサブユ
ニット単独の発現は電圧および細胞内カルシウムによってゲートされるカリウム
チャネルを形成するのに十分であることを言及した。にもかかわらず、αサブユ
ニットおよびβサブユニットをコードするｃＤＮＡを注入した卵母細胞のチャネ
ルは、αサブユニットだけを含むチャネルより、活性化電位およびカルシウムに
対する感受性がはるかに強かった。発現レベル、シングルチャネルコンダクタン
スおよびイオン感受性は影響されないと思われた。さらに、両サブユニットを発
現する卵母細胞のチャネルは、未変性の高コンダクタンスカリウムチャネルの強
力なアゴニストに感受性であったが、αサブユニットだけを含むチャネルは感受
性ではなかった。従って、チャネルのゲート化に対する影響に加えて、βサブユ
ニットが、未変性の高コンダクタンスカリウムチャネルの強力なアゴニストであ
るDHS-Iに対する感受性を与えた。従って、βサブユニット単独の発現は機能的
なカルシウムチャネルを形成しないが、αサブユニットとの同時発現は、αサブ
ユニット単独によって形成されるチャネルとは異なる生物物理学的および薬理学
的特性を有するチャネルを形成した。これらの特性は未変性の高コンダクタンス
カリウムチャネルの特性に近似している。この報告は、電圧およびカルシウムに
対するチャネルの感受性に対する、βサブユニットによって与えられる影響に基
づいて、βサブユニットはチャネルのトランスダクション機序の一部を形成する
ことを結論づけた。この参照文献はまた、これらの特性は、1つの組織のβサブ
ユニットが別の組織のαサブユニットを調節できるキメラマルチマーによって与
えられることを示した。組織特異的または発育特異的な調節と同様に、発現が調
節されたβサブユニットが、哺乳類の高コンダクタンスカリウムチャネル間の機
能的な差を形成する機序を構成している可能性が出てきた。
【０００８】 Meera et al.(FEBS. Lett. 382: 84-88(1996))は、高コンダクタンスカリウム
チャネルのαサブユニットおよびβサブユニットの機能的な結合のためのカルシ
ウム濃度の重要性を開示した。この参照文献は、これらのチャネルが電圧によっ
てだけでなく、マイクロモル範囲のカルシウムによって調節されるという点にお
いて独自であることを指摘した。この著者らは、βサブユニットを「細孔形成α
サブユニットの調節サブユニット」と呼んだ。この参照文献は、細胞内カルシウ
ム濃度が、細胞興奮に関連する濃度範囲において、複合体のαサブユニットおよ
びβサブユニット間の機能的結合を制御することを示した。実験に使用したβサ
ブユニットはヒト平滑筋から誘導された。実験はcＲＮＡをアフリカツメガエル
卵母細胞に注入することによって実施された。チャネル電流およびチャネルの数
が記録された。結果から、αサブユニットおよびβサブユニットを機能的な活性
化モードに移行するには最低のカルシウム濃度が必要であることが示されている
と報告された。局所的なカルシウム濃度の上昇がサブユニットの一方または両方
の立体配座の変化を誘発して、機能的な結合を誘発し、カルシウムおよび電圧に
対してαサブユニットをはるかにより効果的に応答させることが提唱された。こ
の研究より以前には、チャネルはカルシウムおよび電圧により活性化され、カル
シウムが実際に存在しないと決して開かないことが考えられていた。しかし、こ
の報告は、チャネルのαサブユニットは低カルシウム濃度で開き、実際に、１０
０ｎMより低い濃度では、カルシウムとは関係なく、純粋に電圧調節モードによ
り作動することを示した。同様に、この報告は、カルシウム非依存的からカルシ
ウム依存的に、βサブユニットヌル相互作用からβサブユニット活性化型モード
にαサブユニットを移行するカルシウム依存的機序の証拠を提供した。
【０００９】 電圧ゲート化カリウムチャネルのβサブユニットが最近考察されている（Barr
y et al., Ann. Rev. Physiol. 58: 363-394(1996)）。
【００１０】 Oberst et al.(Oncogene 14: 1109-1116(1997))は最近、対応する遺伝子が、46
〜48%のアミノ酸配列がウシ、ヒトおよびイヌ高コンダクタンスカルシウム活性
化型カリウムチャネルの調節βサブユニットと同一であるアミノ酸200個の蛋白
質をコードするウズラｃＤＮＡの核酸配列を同定した。v-mycで形質転換したウ
ズラ胚線維芽細胞における遺伝子発現の研究により、正常な線維芽細胞ではハイ
ブリダイゼーションするが、形質転換した線維芽細胞ではハイブリダイゼーショ
ンしないクローンが単離された。その後の分析では、この配列は試験した全ての
正常な鳥類の線維芽細胞では発現されるが、種々の発癌遺伝子または化学的発癌
物質によって形質転換した種々の細胞系統では検出されないことを明らかされた
。この配列によってコードされる蛋白質は、細胞増殖の調節に関与すると思われ
るカルシウム活性化型カリウムチャネルの調節サブユニットであることが示唆さ
れた。
【００１１】 Rhodes et al.(J. Neurosci. 17: 8246-8258(1997))は、成獣ラット脳内にお
いて2つの哺乳類βサブユニットといくつかのカリウムチャネルαサブユニット
との結合および同時局在化を検討した。実験は、2つのサブユニットは、検討し
た実質的に全てのαサブユニットと結合することを示した。細胞質のβサブユニ
ットと細孔形成αサブユニットの識別的な発現および結合は、興奮細胞における
電圧ゲート化カリウムチャネルの複雑さおよび異種性に大きく寄与することが示
唆された。この結果から、電気生理学的に異なるニューロンのカリウム電流に対
するαサブユニットおよびβサブユニットの識別的な寄与についての生化学的お
よび神経解剖学的な基礎が提供された。
【００１２】 イオンチャネルは薬物作用および開発の主要な標的である。従って、これまで
未知であったイオンチャネル成分を同定し、特徴づけることは製薬学的な開発分
野に有用である。本発明は、これまで未同定のヒトカリウムチャネルβサブユニ
ットを提供することによって現状技術を進行させる。
【００１３】 発明の開示 本発明の一般的な目的はイオンチャネルを調節することである。
【００１４】 従って、本発明の一目的は、新規イオンチャネル成分を同定することである。
【００１５】 本発明の具体的な目的は、イオンチャネル媒介性疾患の治療および診断に適用
できるアッセイの試薬または標的として有用である、Ｃ７Ｆ２ポリペプチドと本
明細書において呼ばれる、新規イオンチャネルβサブユニットポリペプチドを提
供することである。
【００１６】 本発明のさらに別の目的は、イオンチャネル媒介性疾患の治療および診断に適
用できるアッセイの標的および試薬として有用であり、組換え方法による新規イ
オンチャネルポリペプチドを作製するのに有用な新規βサブユニットポリペプチ
ドに対応するポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】 本発明の具体的な目的は、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用してβ
サブユニットの機能または発現を調節する化合物を同定することである。
【００１８】 本発明のさらに別の具体的な目的は、イオン-チャネル関連疾患を治療および
診断するためにβサブユニットの発現または機能を調節する化合物を提供するこ
とである。
【００１９】 本発明の新規βサブユニットポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば
、中枢神経系（CNS）疾患、循環器系疾患および筋骨格系疾患を含むβサブユニ
ット関連または関係疾患の治療に有用である。βサブユニット関連または関係疾
患はまた、新規βサブユニットＣ７Ｆ２が発現される、心臓、胎盤、肺、腎臓、
前立腺、精巣、卵巣、脾臓、小腸および大腸、結腸並びに小脳、大脳皮質、髄質
、脊髄、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻(putanem)、扁桃体、尾状核、脳梁、海
馬、黒質、視床腹部および視床を含む脳組織のような組織の疾患も含む。
【００２０】 従って、本発明は、新規カリウムチャネルβサブユニットの同定に基づいてい
る。
【００２１】 このβサブユニットは、細孔形成αサブユニットとの相互作用に関してイオン
チャネルを調節するのに有用である。従って、βサブユニットを使用してαサブ
ユニット活性を調節することによって、イオンチャネル調節が提供される。
【００２２】 βサブユニットはまた、治療および診断の標的または試薬としてそれ自体有用
である。
【００２３】 従って、本発明は、配列番号1に示されるアミノ酸配列または にATCC
No. として寄託されたｃＤＮＡ（「寄託されたｃＤＮＡ」）によってコー
ドされるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む単離されたβサブユニットポ
リペプチドを提供する。
【００２４】 本発明はまた、配列番号2または寄託されたｃＤＮＡに示される配列を有する
単離されたβサブユニット核酸分子を提供する。
【００２５】 本発明はまた、配列番号1に示されるまたは寄託されたｃＤＮＡによってコー
ドされるアミノ酸配列に実質的に相同であるアミノ酸配列を有する変異体ポリペ
プチドを提供する。
【００２６】 本発明はまた、配列番号2または寄託されたｃＤＮＡに示される核酸配列に実
質的に相同な変異体核酸配列を提供する。
【００２７】 本発明はまた、配列番号1に示されるポリペプチドの断片および配列番号2に示
される核酸配列並びにポリペプチドまたは核酸の実質的に相同な断片を提供する
。
【００２８】 本発明は、βサブユニット核酸分子およびポリペプチドを発現するためのベク
ターおよび宿主細胞を提供し、詳細には組換えベクターおよび宿主細胞を提供す
る。
【００２９】 本発明はまた、ベクターおよび宿主細胞を作製する方法とそれらを使用してβ
サブユニット核酸分子およびポリペプチドを作製するための方法を提供する。
【００３０】 本発明はまた、βサブユニットポリペプチドおよび断片に結合する抗体を提供
する。
【００３１】 本発明はまた、βサブユニットポリペプチドの発現または活性を調節する化合
物をスクリーニングする方法を提供する。調節は、ポリペプチドβサブユニット
のレベルであり、またはβサブユニットポリペプチドを発現する核酸の発現をコ
ントロールするレベルにおける。
【００３２】 本発明はまた、βサブユニットポリペプチドの発現または活性に関連する状態
を治療することを含む、スクリーニングされた化合物を使用してβサブユニット
の発現または活性を調節するための方法を提供する。
【００３３】 本発明はまた、生物試料中のβサブユニットポリペプチドまたは核酸分子の存
在、レベルまたは活性を側底するための診断アッセイを提供する。
【００３４】 本発明はまた、βサブユニットポリペプチドまたは核酸分子中の突然変異の存
在を測定するための診断アッセイを提供する。
【００３５】 発明の詳細な説明 ポリペプチド 本発明は新規カリウムチャネルβサブユニットの発見に基づいている。発現配
列断片（expressed sequence tag; EST）はサル線条体のライブラリーにおいて
同定された。このESTは、ウズラカリウムチャネルβサブユニットと推定される
もの（Oberst et al.,上記に引用）およびヒトカルシウム活性化型カリウムチャ
ネルβサブユニット（Meera et al.,上記に引用）との相同性を有した。ヒトEST
は、サルESTの3’側末端と類似性を有すると同定された。このヒトESTは配列決
定され、サルクローンの3’側末端とほぼ同一であることが見出された。このEST
を、種々のヒト組織における発現についてノーザンブロット分析に使用した。
【００３６】 遺伝子は主に脳内で発現され、皮質領域において最も高く発現され、他の領域
および脊髄内で発現される。脳内では、以下の組織、すなわち、小脳、大脳皮質
、髄質、脊髄、後頭葉、前頭葉、側頭葉、putanem、扁桃体、尾状核、脳梁、海
馬、黒質、視床腹部および視床がノーザンブロットの結果、正のシグナルを示し
た。しかし、心臓、腎臓、胎盤、肺、前立腺、精巣、卵巣、脾臓、小腸および大
腸においても発現が見られる。プローブとしてこの配列を使用して、全長のヒト
胎児脳のクローンが同定され、配列決定され、Ｃ７Ｆ２と命名された。
【００３７】 従って、本発明は、図1に示される推定アミノ酸配列（配列番号1）を有するま
たは寄託されたｃＤＮＡ、ATCC No. によってコードされるアミノ酸配列を
有する新規カリウムチャネルβサブユニットに関する。
【００３８】 寄託物はブタペスト条約に基づいて微生物の国際寄託機関で維持される。寄託物
は当業者に適宜提供され、寄託物が35U.S.C.§112に準拠して要求される許可で
はない。寄託された配列およびその配列によってコードされるポリペプチドは参
照することによって本明細書に組み入れられ、本出願の記載の配列決定エラーな
どの任意の矛盾の場合には調整する。
【００３９】 「Ｃ７Ｆ２βサブユニットポリペプチド」または「Ｃ７Ｆ２βサブユニット蛋
白質」は、配列番号1または寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプ
チドをいう。しかし、「βサブユニット蛋白質」または「βサブユニットポリペ
プチド」という用語はさらに、本明細書に記載する変異体、並びに全長のＣ７Ｆ
２βサブユニットポリペプチドから誘導される断片および変異体を含む。
【００４０】 従って、本発明は、単離または精製されたＣ７Ｆ２カリウムチャネルβサブユ
ニットポリペプチド並びにその変異体および断片を提供する。
【００４１】 Ｃ７Ｆ２βサブユニットポリペプチドは、5つの構造ドメインを示す210残基の
蛋白質である。アミノ末端細胞内ドメインは配列番号1の残基1から残基19付近で
あると同定されている。第1の膜貫通ドメインは配列番号1の20付近から40付近の
残基内であると同定されている。細胞外ループは配列番号1の41付近から167付近
の残基内であると同定されている。第2の膜貫通ドメインは配列番号1の168付近
から192付近の残基内であると同定されている。カルボキシ末端細胞内ドメイン
は193付近から210の残基内であると同定されている。
【００４２】 本明細書において使用されるように、ポリペプチドは、組換えおよび非組換え
細胞から単離される場合には、細胞物質を実質的に含まない場合に、または化学
的に合成される場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まな
い場合に、「単離されている」または「精製されている」といわれる。しかし、
ポリペプチドは、通常では細胞内では結合しない別のポリペプチドと結合されて
もよく、その場合でも「単離されている」または「精製されている」と考えられ
る。
【００４３】 βサブユニットポリペプチドは均質になるまで精製することができる。しかし
、ポリペプチドが均質になるまで精製されていない調製物は有用であり、単離さ
れた形態のポリペプチドを含有すると考えられることが理解される。重要な特徴
は、調製物は、かなりの量の他の成分が存在する場合でも、望ましいポリペプチ
ド機能を可能にすることである。従って、本発明は種々の程度の純度を含む。
【００４４】 一実施態様において、「細胞物質を実質的に含まない」という用語は、約30%
（乾燥重量による）未満の他の蛋白質（すなわち、不純蛋白質）、約20%未満の
他の蛋白質、約10%未満の他の蛋白質または約5%未満の他の蛋白質を有するβサ
ブユニットポリペプチドの調製物を含む。βサブユニットポリペプチドが組換え
によって作製される場合には、それは実質的に培養培地を含まない。すなわち、
培養培地は、蛋白質調製物の容量の約20%未満、約10%未満または約5%未満を占め
る。
【００４５】 「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、合成
に関与する化学的前駆体または他の化学物質からβサブユニットポリペプチドが
分離されている調製物を含む。一実施態様において、「化学的前駆体または他の
化学物質を実質的に含まない」という用語は、約30%（乾燥重量による）未満の
化学的前駆体もしくは他の化学物質、約20%未満の化学的前駆体もしくは他の化
学物質、約10%未満の化学的前駆体もしくは他の化学物質または約5%の化学的前
駆体もしくは他の化学物質を有するポリペプチドの調製物を含む。
【００４６】 一実施態様において、βサブユニットポリペプチドは配列番号1に示されるア
ミノ酸配列を含む。しかし、本発明はまた配列変異体も含む。変異体は生物にお
ける同じ遺伝子座によってコードされる実質的に相同の蛋白質、すなわち対立遺
伝子変異体を含む。変異体はまた、生物の他の遺伝子座位に由来するが、配列番
号1のＣ７Ｆ２βサブユニット蛋白質と実質的な相同性を有する蛋白質を含む。
変異体はまた、Ｃ７Ｆ２βサブユニット蛋白質と実質的に相同であるが、別の生
物に由来する蛋白質,すなわちオーソログ(ortholog)を含む。変異体はまた、Ｃ
７Ｆ２βサブユニット蛋白質と実質的に相同で、化学的合成によって作製される
蛋白質も含む。変異体はまた、Ｃ７Ｆ２βサブユニット蛋白質と実質的に相同で
、組換え方法によって作製される蛋白質も含む。しかし、変異体は、本発明より
以前に開示されたいかなるアミノ酸配列も含まないことが理解される。
【００４７】 本明細書において使用されるように、2つの蛋白質（または蛋白質の領域）は
、アミノ酸配列が少なくとも約55〜60%、典型的には少なくとも約70〜75%、さら
に典型的には少なくとも約80〜85%、最も典型的には少なくとも約90〜95%以上相
同である場合には実質的相同である。本発明によると、実質的に相同であるアミ
ノ酸配列は、以下にさらに詳細に記載するストリンジェントな条件下で配列番号
2に示される配列の核酸配列またはその部分にハイブリダイゼーションする核酸
配列によってコードされる。
【００４８】 2つのアミノ酸配列または2つの核酸の相同性の割合を求めるためには、最もよ
く比較するために配列を並べる（例えば、他方の蛋白質または核酸と最適な状態
で並べるために、一方の蛋白質または核酸中にギャップを導入してもよい）。次
いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌク
レオチドを比較する。一方の配列の1箇所に他方の配列の対応する位置と同じア
ミノ酸残基またはヌクレオチドが占めている場合には、分子はその位置が相同で
ある。本明細書において使用されるように、アミノ酸または核酸の「相同性」は
アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である。2つの配列間の相同性の割合は
、配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性の割合は、同
一位置の数/位置の総数×100に等しい）。
【００４９】 本発明はまた、同一性の程度は低いが、Ｃ７Ｆ２βサブユニットポリペプチド
によって実施される同じ機能の1つ以上を実施するのに十分な類似性を有するポ
リペプチドを含む。類似性は保存的アミノ酸置換によって決定される。このよう
な置換は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を同様の特徴を有する別のアミノ酸
によって置換するものである。保存的置換は表現型的にはサイレントであると思
われる。典型的には、保存的置換は、脂肪族アミノ酸Ala、Val、LeuおよびIle間
の互いの置換であり、ヒドロキシル残基SerおよびThrの置換、酸性残基Aspおよ
びGluの置換、アミド残基AsnおよびGln間での置換、塩基性残基LysおよびArgの
置換並びに芳香族残基Phe、Tyr間の置換である。どのアミノ酸変更が表現的にサ
イレントであると思われるかに関するガイダンスは、Bowie et al., Science247
: 1306-1310(1990)に見出される。
【００５０】
【表１】
【００５１】 同一性および類似性は容易に算出することができる（Computational Molecula
r Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1998; Bi
ocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic
Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griff
in, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersy, 1994; Sequ
ence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987
; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M S
tockton Press, New York, 1991）。2つの配列間の同一性および類似性を測定す
るための好ましいコンピュータープログラム方法には、GCGプログラムパッケー
ジ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Res. 12(1):387(1984)）、BLASTP、
BLASTN、FASTA(Atsul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215:403(1990))が含ま
れるが、それらに限定されない。
【００５２】 変異体ポリペプチドは、アミノ酸配列において1つ以上の置換、欠損、挿入、
変換、融合および末端の切断またはこれらのいずれかの組み合わせによりアミノ
酸配列が異なってもよい。
【００５３】 変異体ポリペプチドは、1つ以上の活性において十分に機能的であっても、ま
たは機能が欠損していてもよい。従って、本発明の場合には、変更は、例えば、
リガンド結合、膜貫通結合、リン酸化およびαサブユニット相互作用に対応する
領域の1つ以上の機能に影響を与えることがある。
【００５４】 十分に機能的な変異体は、典型的には、保存的変更だけまたは重要でない残基
もしくは重要でない領域における変更を含有する。機能的な変異体はまた、機能
が変化しないまたは機能があまり変化しない同様のアミノ酸の置換を含有する。
または、このような置換は機能にある程度正または負に影響を与えることがある
。
【００５５】 非機能的変異体は、典型的には、1つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠損、挿
入、変換もしくは切断または重要な残基もしくは重要な領域における置換、挿入
、変換もしくは欠損を含有する。
【００５６】 示すように、変異体は天然に存在しても、またはβサブユニットポリペプチド
の有用で新規な特徴を提供するように組換え手段もしくは化学的合成によって作
製されてもよい。これは、例えば、細胞外ループに対応する可溶性ペプチドが使
用される場合には、蛋白質凝集を防止することによって、製薬学的組成物から免
疫原性を防止することを含む。
【００５７】 有用な変異体は、リガンド結合特性の変更を含む。例えば、一実施態様は、リ
ガンド結合の程度または速度が増加または低下する結合部位の変更を含む。同じ
部位のさらに有用な変更により、リガンドに対する親和性が高くまたは低くなる
。有用な変異体はまた別のリガンドに対する親和性を提供する変更を含む。別の
有用な変異体は、αサブユニットに対する親和性の低下もしくは増加またはβサ
ブユニットが通常結合するものとは異なるαサブユニットによる結合を提供する
。別の有用な変異体は、αサブユニットの活性化の速度または程度の低下または
増加を提供する。別の有用な変異体は、1つ以上のセグメントが別のβサブユニ
ットの1つ以上のセグメントに機能的に融合する融合蛋白質を提供する。別の有
用な変異体はリン酸化またはグリコシル化の増加または低下を提供する。
【００５８】 機能に必須であるアミノ酸は、部位特異的突然変異またはアラニンスキャニン
グ突然変異（Cunningham et al., Science 244: 1081-1085(1989)）。後者の方
法は、分子の全ての残基に1つのアラニン変異を導入する。次いで、得られた突
然変異分子を、リガンド結合、αサブユニット結合もしくは活性化またはチャネ
ル電流などの生物活性について試験する。リガンド結合およびαサブユニット調
節に重要な部位も、結晶化、核磁気共鳴または光学的親和性標識などの構造分析
によって測定することができる（Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904(1
992); de Vos et al., Science 255:306-312(1992)）。
【００５９】 本発明はまた、Ｃ７Ｆ２βサブユニット蛋白質のポリペプチド断片を含む。断
片は配列番号1に示されるアミノ酸配列から誘導することができる。しかし、本
発明はまた、本明細書に記載するβサブユニット蛋白質の変異体の断片も含む。
【００６０】 しかし、本発明が関する断片は、本発明より以前に開示されている断片を含む
と解釈されるべきではない。
【００６１】 断片は蛋白質の1つ以上の生物活性、例えばαサブユニットまたはリガンドに
結合する能力を保持してもよい。生物学的に活性な断片は、例えば、細胞外ドメ
イン、1つ以上の膜貫通ドメイン、αサブユニット結合ドメインまたは細胞内ド
メインまたはそれらの機能的な部分のようなドメインまたはモチーフを含んでも
よい。このようなペプチドは、例えば鎖長が7、10、15、20、30、35、36、37、3
8、39、40、50、100またはそれ以上のアミノ酸であってもよい。
【００６２】 考えられる断片には、1）配列番号1のアミノ酸約1番目からアミノ酸約19番目
を含むペプチド、2）配列番号1のアミノ酸約20番目からアミノ酸約40番目を含む
ペプチド、3）配列番号1のアミノ酸約41番目からアミノ酸約167番目を含むペプ
チド、4）アミノ酸約168番目からアミノ酸約192番目を含むペプチド、および5）
アミノ酸約193番目からアミノ酸約210番目を含むペプチド、または2、3もしくは
4ドメインなどのこれらの断片の組み合わせが含まれるが、それらに限定されな
い。他の断片は、アミノ酸約210、19、14および167番目などのリン酸化部位並び
にアミノ酸約56および約93番目のグリコシル化部位などの本明細書に記載する種
々の機能的部位を含有する断片を含む。断片は、例えば、機能的部位から1つ以
上の方向に伸長して5、10、15、20、30、40、50または100までのアミノ酸を含ん
でもよい。さらに、断片は、誘導されるドメインの機能を保持する、上記の具体
的なドメインのサブフラグメントを含んでもよい。断片はまた71個のアミノ酸よ
り大きいアミノ酸配列を含む。断片はまた抗原性断片、詳細には図3の高い抗原
性インデックスを有することが示されているものを含む。さらに具体的な断片は
アミノ酸1〜29、306〜326並びにアミノ酸1〜29、30〜65、67〜252、254〜305、3
06〜326、330〜338、342〜347、353〜361および366〜382より大きいもの以外を
含む断片を含む。
【００６３】 従って、考えられる断片はβおよびαサブユニットとの結合部位を規定する断
片、リガンド結合部位を規定する断片、グリコシル化部位を規定する断片、膜結
合を規定する断片およびリン酸化部位を規定する断片を含む。これは、関連する
機能を提供するまたは関連する機能を同定させる別個の断片を意図している。好
ましい実施態様において、断片はαサブユニットおよびβサブユニット結合部位
を含有する。
【００６４】 本発明はまた免疫原性を有する断片を提供する。これらはＣ７Ｆ２βサブユニ
ット蛋白質および変異体のエピトープ形成部分を含有する。これらのエピトープ
形成ペプチドは、βサブユニットポリペプチドまたは領域もしくは断片に特異的
に結合する抗体を形成するのに有用である。これらのペプチドは少なくとも7個
、少なくとも14個または少なくとも約15〜約30個のアミノ酸を含有してもよい。
高い抗原性インデックスを有するペプチドを図3に示す。
【００６５】 抗体を形成するために使用することができる抗原性ポリペプチドの限定的でな
い例には、細胞外ドメインから誘導されるペプチドが含まれる。
【００６６】 エピトープ形成βサブユニットおよびポリペプチドは、任意の従来の手段によ
って作製することができる（Houghten, R. A., Proc． Natl． Acad． Sci． US
A 82: 5131-5135(1985)）。同時の多数のペプチド合成は、米国特許第4,631,211
号に記載されている。
【００６７】 断片は、別個（他のアミノ酸またはポリペプチドに融合しない）であっても、
より大きいポリペプチド内にあってもよい。さらに、いくつかの断片が1つのよ
り大きいポリペプチド内に含まれてもよい。一実施態様において、宿主内での発
現のためにデザインされた断片は、βサブユニット断片のアミノ末端に融合され
た異種プレポリペプチドおよびプロポリペプチド領域並びに断片のカルボキシ末
端に融合された追加の領域を有してもよい。
【００６８】 従って、本発明はキメラまたは融合蛋白質を提供する。これらは、βサブユニ
ット蛋白質と実質的に相同でないアミノ酸配列を有する異種蛋白質に機能的に結
合したβサブユニット蛋白質を含む。「機能的に結合する」は、βサブユニット
蛋白質および異種蛋白質がインフレーム融合することを示す。異種蛋白質はβサ
ブユニット蛋白質のN末端またはC末端に融合されてもよい。
【００６９】 一実施態様において、融合蛋白質はそれ自体βサブユニット機能に影響を与え
ない。例えば、融合蛋白質は、βサブユニット配列がGST配列のC末端に融合され
るGST融合蛋白質であってもよい。他の種類の融合蛋白質には、酵素融合蛋白質
、例えば、βガラクトシダーゼ融合、酵母ツーハイブリッドGAL融合、poly-His
融合およびIg融合が含まれるが、それらに限定されない。このような融合蛋白質
、詳細にはpoly-His融合は組換えβサブユニット蛋白質の精製を容易にすること
ができる。ある種の宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞）において、蛋白質の発
現および/または分泌を異種シグナル配列を使用して増加することができる。従
って、別の実施態様において、融合蛋白質はN末端に異種シグナル配列を含有す
る。
【００７０】 欧州特許出願番号第EP-A-O 464 533号は、免疫グロブリン不変領域を種々の部
分を含む融合蛋白質を開示している。Fcは治療および診断において有用であり、
従って、例えば、薬物動態学的特性が改善される（欧州特許出願番号第EP-A 023
2 262号）。薬剤の発見において、例えば、アンタゴニストを同定する高スルー
プットスクリーニングアッセイの目的のためにヒト蛋白質がFc部分に融合された
。Bennett et al.,JouＲＮＡl of Molecular Recognition 8: 52-58(1995)およ
びJohanson et al., The JouＲＮＡl of Biological Chemistry 270, 16: 9459-
9471(1995)。従って、本発明はまたβサブユニットポリペプチドおよび種々のサ
ブクラスの免疫グロブリン（IgG、IgM、IgA、IgE）の重鎖または軽鎖の不変領域
の種々の部分を含有する可溶性融合蛋白質を含む。免疫グロブリンと同様に、ヒ
ンジ領域において融合が生ずる、ヒトIgG、詳細にはIgG1の重鎖の不変部も好ま
しい。例えば融合蛋白質が免疫のための抗原として使用される場合のように、い
くつかの用途のためには、融合蛋白質が意図された目的に使用された後はFcを除
去することが望ましい。特定の実施態様において、Fc部分は、取り込まれて、第
Xa因子で切断される切断配列によって簡単に除去される。
【００７１】 キメラまたは融合蛋白質は、標準的なＤＮＡ技法によって作製することができ
る。例えば、異なる蛋白質配列をコードするＤＮＡ断片は、従来の技法によりイ
ンフレームでライゲーションされる。別の実施態様において、融合遺伝子は、自
動式ＤＮＡ合成装置を含む従来の技法によって合成することができる。または、
2つの連続する遺伝子断片の間に相補的なオーバーハングを生じ、その後アニー
リングされ、再増幅されてキメラ遺伝子配列を作製するアンカープライマーを使
用した遺伝子断片のPCR増幅を実施することができる。（Ausubel et al., Curre
nt Protocols in Molecular Biology, 1992参照）。さらに、すでに融合部分（
例えば、GST蛋白質）をコードしている多数の発現ベクターを購入することがで
きる。融合部分がβサブユニット蛋白質にインフレーム結合するように、βサブ
ユニット蛋白質をコードする核酸をこのような発現ベクターにクローニングする
ことができる。
【００７２】 別の形態の融合蛋白質は、βサブユニット機能に直接影響を与えるものである
。従って、βサブユニットセグメントの1つ以上が別のβサブユニットの相同な
セグメントによって置換されたβサブユニットポリペプチドは本発明に含まれる
。種々の置換が可能である。種々のセグメントは細胞内アミノおよびカルボキシ
末端ドメイン、2つの膜貫通ドメイン並びに細胞外ループドメインを含む。さら
に詳細には、機能的ドメインはリガンド結合部位を含有するドメイン、リン酸化
部位を含有するドメインおよびαサブユニットに結合するまたはαサブユニット
活性化を調節する機能をする部位を含有するドメインを含む。これらのドメイン
のいずれかまたは特定の部位を含有するサブ領域を別のβサブユニット蛋白質ま
たはαサブユニット活性化を調節する他のサブユニット蛋白質の対応するドメイ
ンまたはサブ領域と置換することができる。従って、特定のドメインまたは機能
的サブ領域の1つ以上を、αサブユニットを調節する別のサブユニットのものと
合わせることができる。従って、未変性のドメインまたはサブ領域の1つ以上が
置換されたキメラβサブユニットを形成することができる。
【００７３】 本発明はまた、βサブユニットが天然に見出されるもの以外のαサブユニット
が置換されるキメラチャネルを含む。従って、βサブユニットは他のαサブユニ
ットを調節する能力について試験される。エンドポイントとしてこれらのαサブ
ユニットに対して実施されるアッセイを使用することによって、βサブユニット
機能の評価が可能になる。この種の構築物では、αサブユニットは、通常は活性
化されないリガンドに対して応答性となりうる。従って、βサブユニットの置換
によって、そのβサブユニットに結合するリガンドを使用してαサブユニットの
活性を調節することができる。
【００７４】 単離されたβサブユニット蛋白質は、天然にそれを発現する、脳、心臓、腎臓
、前立腺、胎盤、肺、精巣、卵巣および腸などの細胞から精製されても、それを
発現するように改変された細胞（組換え体）から精製されても、または既知の蛋
白質合成方法を使用して合成されてもよい。
【００７５】 一実施態様において、蛋白質は組換えＤＮＡ技法によって作製される。例えば
、βサブユニットポリペプチドをコードする核酸分子が発現ベクターにクローニ
ングされ、発現ベクターが宿主細胞に導入され、蛋白質が細胞中で発現される。
次いで、標準的な蛋白質精製技法を使用して、適当な精製スキームによって蛋白
質を細胞から単離することができる。
【００７６】 ポリペプチドは、しばしば、通常20の天然型アミノ酸と呼ばれる20のアミノ酸
以外のアミノ酸を含有する。さらに、末端アミノ酸を含む多数のアミノ酸を、処
理および他の翻訳後修飾などの天然の過程によって、または当技術上既知の科学
的修飾技法によって修飾することができる。ポリペプチド中に天然に存在する普
通の修飾は基礎的なテキスト、詳細な研究論文および文献に記載されており、そ
れらは当業者に既知である。
【００７７】 従って、ポリペプチドはまた、置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによって
コードされない、置換基が含まれる、成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減
期を延長する化合物などの別の化合物に融合される（例えば、ポリエチレングリ
コール）、または追加のアミノ酸が、リーダー配列もしくは分泌配列または成熟
ポリペプチドまたはプロ蛋白質配列を精製するための配列などの成熟ポリペプチ
ドに融合される誘導体または類似物を含む。
【００７８】 既知の修飾には、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビ
ンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の
共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共
有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合による架橋
形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γカルボキシル
化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、
ミリストイル化、酸化、蛋白質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セ
レノイル化、硫酸化、アルギニル化などのトランスファーＲＮＡ媒介性の蛋白質
へのアミノ酸の添加およびユビキチン化が含まれるが、それらに限定されない。
【００７９】 このような修飾は当業者に既知であり、科学文献にかなり詳細に記載されてい
る。いくつかの特に普通の修飾である、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グル
タミン酸残基のγ-カルボキシル化、ヒドロキシル化およびADP-リボシル化は、
例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties、第2版、 T. E. Cregh
ton, W. H. Freeman and Company, New York(1993)などのほとんどの基礎的なテ
キストに記載されている。この件に関しては、Wold, F., Pottranslational Cov
alent Modification of Protenis, B. C. Johnson、編、Academic Press, New Y
ork 1-12(1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646(1990)およびR
attan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 663:48-62(1992)によるなどの多数の詳
細な総説を利用することができる。
【００８０】 周知のように、ポリペプチドは常に完全に直鎖状ではない。例えば、ポリペプ
チドはユビキチン化の結果として分岐することがあり、一般に天然の処理事象お
よび天然には生じない人的な操作によって生じる事象を含む翻訳後事象の結果と
して、分岐を伴ってまたは分岐を伴わず環状となることもある。環状、分岐およ
び分岐環状ポリペプチドは非翻訳天然過程によっておよび合成的な方法によって
合成することができる。
【００８１】 修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含
むポリペプチドのどこで生じてもよい。ポリペプチドのアミノ基もしくはカルボ
キシル基またはその両者の共有結合的修飾によるブロックは天然型ポリペプチド
および合成ポリペプチドにおいて普通である。例えば、大腸菌によって産生され
るポリペプチドのアミノ末端残基は、蛋白質分解処理の前には、常に、Nホルミ
ルメチオニンである。
【００８２】 修飾は、蛋白質の製造段階の官能基であってもよい。組換えポリペプチドでは
、例えば、修飾は宿主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチドのアミノ酸配列
の修飾シグナルによって決定される。従って、グリコシル化が望ましい場合には
、ポリペプチドはグリコシル化宿主、一般には真核細胞において発現されるべき
である。昆虫細胞は、しばしば、哺乳類細胞と同じ翻訳後グリコシル化を実施す
る。その理由は、昆虫細胞は、天然のグリコシル化パターンを有する哺乳類蛋白
質を効率的に発現するように発展されたからである。同様の考えは他の修飾にも
適用される。
【００８３】 同じ種類の修飾は所定のポリペプチドのいくつかの部位において同じ程度また
は異なる程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドは2種以上の種類の
修飾を含有してもよい。
【００８４】 ポリペプチドの用途 本発明のβサブユニットポリペプチド並びにβサブユニット核酸分子、これら
のポリペプチドの調節因子および抗体（本明細書において「作用化合物」とも呼
ばれる）は、Ｃ７Ｆ２関連または関係疾患とも呼ばれるβサブユニット関連また
は関係疾患の調節、診断および治療に有用である。このような疾患には、例えば
、中枢神経系（CNS）疾患、循環器系疾患および筋骨格系疾患が含まれる。CNS疾
患には、アルツハイマー病およびアルツハイマー病に関連する痴呆、（Pick病な
どの）、老人性痴呆、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病お
よび他のびまん性レーヴィ小体疾患（Lewy diffuse body diseases）、ジル-ド-
ラ-ツレット病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺、てんか
ん、クロイツフェルト-ヤコブ病などの先天性および神経変性性疾患、高血圧お
よび睡眠障害などの自律神経性機能障害並びに抑うつ、精神分裂病、分裂情動性
障害、コルサコフ精神病、記憶喪失または加齢による記憶損失のような学習また
は記憶障害、多動症候群、胸腺機能不全（dysthymic disorder）、重症型抑うつ
障害、躁病、強迫性障害、精神活性物質乱用障害、不安、恐怖症、パニック障害
、並びに重症双極性感情（気分）病（BP-I）、軽躁病および重症型抑うつを伴う
双極性感情（気分）病（BP-I）のような双極性感情病、偏頭痛のような神経疾患
などの神経精神障害および肥満が含まれるが、それらに限定されない。さらに別
のCNS-関連疾患には、例えば、その最新版が参照として全体の内容が本明細書に
組み入れられているAmerican Psychiatric Assocation's Diagnostic and Stati
stical manual of Mental Disorders(DSM)に掲載されているものが含まれる。
【００８５】 βサブユニット関連または関係疾患は、抹消から脳への感覚インパルスの伝達
（例えば、疼痛疾患）および/または脳から抹消への運動インパルスの伝導、反
射の統合、感覚インパルスの解釈（例えば、疼痛）、または情緒、知能（例えば
、学習および記憶）、または運動過程に有害に影響することがある。
【００８６】 循環器系疾患には、動脈硬化症、虚血性再潅流障害、再狭窄、動脈炎、血管壁
レモデリング、心室リモデリング、急速心室ペーシング、冠動脈微小塞栓症、頻
脈、徐脈、圧負荷、大動脈屈曲、冠動脈結紮、血管性心疾患、心房性細動、長-Q
T症候群、うっ血性心不全、洞房結節機能不全、心不全、高血圧、心房性細動、
心房粗動、拡張型心筋症、特発性心筋症、心筋梗塞、冠動脈疾患、冠動脈痙攣ま
たは不整脈が含まれるが、それらに限定されない。Ｃ７Ｆ２媒介性または関連疾
患にも、運動失調、筋緊張症、筋波動症のような麻痺および筋力低下などの筋骨
格系の疾患が含まれる。
【００８７】 βサブユニット関連または関係疾患には、Ｃ７Ｆ２が発現される、例えば心臓
、胎盤、肺、腎臓、前立腺、精巣、卵巣、脾臓、小腸および大腸、結腸または胸
腺組織並びに小脳、大脳皮質、髄質、脊髄、後頭葉、前頭葉、側頭葉、putanem
、扁桃体、尾状核、脳梁、海馬、黒質、視床腹部および視床を含む脳組織のよう
な組織の疾患が含まれる。
【００８８】 βサブユニットポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードする核酸配列は
βサブユニットの機能または活性を調節する際に用途が見出される。「調節する
」は、応答をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションすることを
意図する。すなわち、本発明のβサブユニットポリペプチドおよび核酸組成物は
標的の活性に正または負に影響する。
【００８９】 βサブユニット関連または関係する活性には、例えば、神経系のシグナルの受
容、伝導および伝達に関係する神経細胞または筋細胞におけるカリウムチャネル
のようなカリウムチャネルに関与する活性が含まれるが、それらに限定されない
。カリウムチャネル媒介性の活性には、ドーパミンまたはノルエピネフリンのよ
うな神経伝達物質の、例えば、神経細胞のような細胞からの放出、膜の静止電位
、活動電位の波形および周波数並びに興奮の閾値の調節、例えば、神経細胞また
は筋細胞における閾下シナプス反応の統合および後方伝搬性活動電位の伝導など
の過程の調節が含まれる。βサブユニット関連またた関係活性には、例えば、胎
盤、肺、腎臓、前立腺、精巣、卵巣、脾臓、小腸、結腸または胸腺細胞のような
非神経細胞におけるカリウムチャネルに関与する、膜電位、細胞容量およびpH調
節などの活性が含まれる。βサブユニット関連または関係活性には、筋膜電位の
維持、筋収縮および弛緩の調節並びに協調などの筋機能に関与する活性が含まれ
る。好ましいβサブユニット活性は、カルシウムの細孔形成αサブユニットの調
節または調整、特にαサブユニットの活性化である。
【００９０】 従って、一態様において、本発明は、Ｃ７Ｆ２βサブユニットポリペプチドま
たはＣ７Ｆ２βサブユニットポリペプチドを発現する細胞に試験される化合物を
接触させて、Ｃ７Ｆ２βサブユニットポリペプチドが試験化合物に結合するかど
うかを判定し、それによってβサブユニット関連または関係疾患を治療するのに
好適な化合物を同定することによって、βサブユニット関連または関係疾患を治
療するのに好適な化合物を同定するための方法を提供する。
【００９１】 βサブユニットポリペプチドは、Ｃ７Ｆ２βサブユニット蛋白質、領域または
断片に特異的な抗体を作製するのに有用である。
【００９２】 βサブユニットポリペプチドはまた、細胞系システムまたは細胞不含システム
において薬剤スクリーニングアッセイに有用である。細胞系システムは未変性、
すなわち、通常βサブユニット蛋白質を発現する、生検または細胞培養において
増殖した細胞であってもよい。しかし、一実施態様において、細胞系アッセイは
、βサブユニット蛋白質を発現する組換え宿主細胞を含む。
【００９３】 本発明のポリペプチドは、βサブユニット活性を調節する化合物を同定するた
めに使用することができる。Ｃ７Ｆ２βサブユニット蛋白質並びに適当な変異体
および断片を、βサブユニットに結合する能力について候補化合物をアッセイす
るために高スループットスクリーニングに使用することができる。これらの化合
物は、βサブユニット活性に対する化合物の影響を求めるために、さらに、機能
的なβサブユニットに対してスクリーニングされる。望ましい程度にβサブユニ
ットを活性化する（アゴニスト）または不活性化する（アンタゴニスト）化合物
を同定することができる。
【００９４】 βサブユニットポリペプチドを使用して、βサブユニット蛋白質と通常βサブ
ユニット蛋白質と相互作用する標的分子との相互作用を刺激または阻止する能力
について化合物をスクリーニングすることができる。標的はリガンドであっても
、βサブユニット蛋白質が通常相互作用する別のチャネルサブユニット（例えば
、カリウムチャネルのαサブユニット）であってもよい。標的は、リン酸化によ
るなどのβサブユニットを修飾する、カゼインキナーゼIIのような分子であって
もよい。アッセイは、βサブユニット蛋白質または断片に標的分子と相互作用さ
せる条件下においてβサブユニット蛋白質を候補化合物と組み合わせるステップ
と、蛋白質と標的との間の複合体の形成を検出するステップまたはイオン電流も
しくは電流に関連する影響のいずれか、リン酸化、細胞容量の変化、突然変異ま
たは形質転換などの、βサブユニット蛋白質と標的の相互作用の生化学的な結果
を検出するステップとを含む。
【００９５】 本発明はまた、βサブユニットが異種αサブユニットと結合するキメラチャネ
ルを含む。従って、βサブユニットを使用して、薬剤スクリーニングの標的とし
て、並びに診断および治療において異種αサブユニットを調節することができる
。
【００９６】 候補化合物は、例えば、1）小型有機および無機分子（例えば、組み合わせラ
イブラリーおよび天然物ライブラリーから得られる分子）、2）ホスホペプチド
（例えば、ランダムおよび部分的変性、定方向ホスホペプチドライブラリーのメ
ンバー、Songyang et al.,Cell 72:767-778(1993)）、3）抗体（例えば、ポリク
ローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラおよび1本鎖抗
体並びにFab、F(ab')2、Fab発現ライブラリー断片、および抗体のエピトープ結
合断片、および4）Ig末端融合ペプチドおよびランダムペプチドライブラリー（
例えば、Lam et al., Nature 354: 82-84(1991); Houghten et al.,Nature 354:
84-86(1991)参照）およびD型アミノ酸および/またはL型アミノ酸から作製され
る組み合わせケミストリー由来分子ライブラリーのメンバーを含む可溶性ペプチ
ドなどのペプチドを含む。
【００９７】 本発明は、βサブユニット活性を調節（刺激または阻害）する化合物を同定す
るための他のエンドポイントを提供する。アッセイは、典型的には、βサブユニ
ット活性を示すチャネリングにおける事象のアッセイを含む。好ましいアッセイ
はαサブユニットの活性化を含む。
【００９８】 βサブユニットの活性の評価を可能にするアッセイは、当業者に既知であり、
例えば、上記に引用したMcManus et al.(1995), Knaus et al.(1996), Knaus et
al.(1994), Meera et al., and Oberst et al,に見出すことができる。
【００９９】 化合物の結合および/または調節（活性化または阻害）は、リガンド結合また
はαサブユニット結合領域が異種領域によって置換されているキメラサブユニッ
ト蛋白質を使用することによってもスクリーニングすることができる。未変性の
βサブユニットによって認識されるものとは異なるαサブユニットと相互作用す
るαサブユニット結合領域を使用することができる。従って、異なるエンドポイ
ントアッセイが利用可能となる。または、1つまたは2つの膜貫通領域が、未変性
のβサブユニットが誘導される未変性の宿主細胞と異なる宿主細胞に特異的な膜
貫通領域で置換されてもよい。こうすることによって、元の宿主細胞以外におい
て実施されるアッセイが可能になる。または、リガンド結合領域が異なるリガン
ドに結合する領域によって置換され、それによって、異種リガンド結合領域と相
互作用するが、αサブユニット活性化を含むチャネリング機能を変わらず生ずる
試験化合物のアッセイが可能になる。
【０１００】 βサブユニットポリペプチドは、βサブユニットと相互作用する化合物を発見
するようにデザインされた方法において競合結合アッセイにおいても有用である
。従って、化合物は、ポリペプチドに結合または相互作用させられる条件下にお
いてβサブユニットポリペプチドに暴露される。競合するβサブユニットポリペ
プチドも混合物に添加される。試験化合物が競合するβサブユニットポリペプチ
ドと相互作用する場合には、形成される複合体の量またはβサブユニット標的の
活性が低下する。この種のアッセイは、βサブユニットの特定の領域と相互作用
する化合物を探索する場合には特に有用である。従って、標的βサブユニット領
域と競合するポリペプチドは、関心のある領域に相当するペプチド配列を含有す
るようにデザインされる。
【０１０１】 βサブユニットは、所定のαサブユニットの機能を評価するためにも有用であ
る。従って、細胞系アッセイまたは細胞不含アッセイにおいて本発明のβサブユ
ニットおよび所定のαサブユニットを使用して、チャネル電流、受容体の数、細
胞形質転換または任意の他の生物学的エンドポイントの変化を評価することがで
きる。種々のエンドポイントのいずれかによってαサブユニットの突然変異を検
出することができる。さらに、細胞系アッセイまたは細胞不含アッセイによって
、αサブユニットの突然変異を補足（すなわち、修正）するβサブユニットの突
然変異を同定することができる。このようなアッセイは、トランスジェニック動
物の場合と同様に生物レベルでも実施することができると思われる（以下を参照
）。
【０１０２】 細胞不含薬剤スクリーニングアッセイを実施するためには、蛋白質の一方また
は両方の複合体形成していないものから複合体の分離を容易にするためおよびア
ッセイの自動化を可能にするために、βサブユニット蛋白質もしくは断片または
標的分子を固定することが望ましい。
【０１０３】 蛋白質を基質に固定する技法を薬剤スクリーニングアッセイに使用することが
できる。一実施態様において、蛋白質を基質に結合させるドメインを追加する融
合蛋白質を提供することができる。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラー
ゼ/flh385融合蛋白質をグルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St.
Louis, MO）またはグルタチオン誘導化マイクトタイタープレートに吸着させ、
次いで、細胞溶解物（例えば、35S標識化）および候補化合物と合わせ、複合体
形成に移行する条件下（例えば、塩およびpHについて生理的条件下）において混
合物をインキュベーションする。インキュベーション後、ビーズを洗浄して、全
ての未結合標識を除去し、基質を固定し、放射性標識を直接または複合体を解離
した後の上清中で測定する。または、複合体を基質から解離し、SDS-PAGEによっ
て分離し、ビーズ分画中に見られるβサブユニット結合蛋白質の量を標準的な電
気泳動的技法を使用して定量する。例えば、ポリペプチドまたはその標的分子を
、当技術上既知の技法を使用して、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を
利用して固定することができる。または、蛋白質と反応するが、蛋白質と標的分
子の結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに固定し、蛋白質を抗体結合によ
ってウェルに捕獲する。βサブユニット結合蛋白質および候補化合物の調製物を
βサブユニット蛋白質を提示するウェル内でインキュベーションし、ウェル内に
捕獲される複合体の量を定量することができる。GST固定複合体について上記し
たもの以外に、このような複合体を検出するための方法には、βサブユニット蛋
白質標的分子と反応する、またはβサブユニット蛋白質と反応し、標的分子と拮
抗する抗体を使用した複合体の免疫検出、および標的分子に関連する酵素活性を
検出することを利用する酵素結合アッセイが含まれる。
【０１０４】 これらの薬剤スクリーニングアッセイにより同定されたβサブユニット蛋白質
活性の調節因子を、βサブユニットによって媒介される疾患を有する患者を治療
するために使用することができる。これらの治療方法は、本明細書において上記
する製薬学的組成物中の蛋白質活性の調節因子をこのような治療を必要としてい
る被験者に投与するステップを含む。
【０１０５】 βサブユニットポリペプチドはまた、βサブユニット蛋白質によって媒介され
る疾患または疾患の素因を診断するための標的を提供するために有用である。従
って、細胞、組織または器官におけるβサブユニット蛋白質の存在またはレベル
を検出するための方法が提供される。本発明の方法は、相互作用を検出できるよ
うに、生物試料とβサブユニット蛋白質と相互作用することができる化合物を接
触させることを含む。
【０１０６】 βサブユニット蛋白質を検出するための薬剤はβサブユニット蛋白質と選択的
に結合することができる抗体である。生物試料は被験者から単離された組織、細
胞および生体液、並びに被験者体内に存在する組織、細胞および体液を含む。
【０１０７】 βサブユニット蛋白質はまた、種々のβサブユニット蛋白質を有する患者にお
いて活動性の疾患または疾患の素因を診断するための標的となる。従って、βサ
ブユニット蛋白質が生物試料から単離され、異常なβサブユニット蛋白質を生ず
る遺伝的変異の存在についてアッセイされる。これにはアミノ酸置換、欠損、挿
入、再配列（異常なスプライシング事象の結果として）および不適当な翻訳後修
飾が含まれる。分析方法は電気泳動の移動の変化、トリプシンによるペプチド消
化の変化、細胞系アッセイまたは細胞不含アッセイにおけるβサブユニット活性
の変化、リガンド、αサブユニットもしくは抗体結合パターンの変化、等電点の
変化、直接アミノ酸配列決定および蛋白質の突然変異を検出するのに有用な任意
の他の周知のアッセイが含まれる。
【０１０８】 βサブユニット蛋白質を検出するためのin vitro技法には、酵素結合免疫吸着
アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が含まれる
。または、標識した抗βサブユニット抗体を被験者に導入することによって、被
験者内においてin vivoで蛋白質を検出することができる。例えば、被験者にお
ける存在および位置が標準的な画像形成技法によって検出できる放射性マーカー
で抗体を標識することができる。被験者において発現されるβサブユニット蛋白
質の対立遺伝子変異体を検出する方法および試料中のβサブユニット対立遺伝子
の断片を検出する方法が特に有用である。
【０１０９】 βサブユニットポリペプチドはまたゲノム薬理学的分析において有用である。
ゲノム薬理学は、罹患患者において薬剤の性質の変化および異常な作用により薬
剤に応答する臨床的に重要な遺伝的変化を取り扱う。例えば、Eichelbaum, M.(1
996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11):983-985およびLinder, M. W.
(1997) Clin. Chem.43(2):254-266を参照。これらの変化の臨床成果により、患
者の代謝の変化の結果として、ある患者では治療薬が有毒となったり、またはあ
る患者では薬剤による治療が失敗する。従って、患者の遺伝子型は、治療用化合
物が生体に作用する方法または生体が化合物を代謝する方法を決定することがあ
る。さらに、薬物代謝酵素の活性は薬物作用の強度および持続時間に影響を与え
る。従って、患者の遺伝子型に基づいた予防的治療または治療のために、患者ご
とのゲノム薬理学により有効な化合物の選択およびこのような化合物の有効な容
量を選択することができる。いくつかの薬物代謝酵素における遺伝的多型の発見
により、一部の患者では予測された薬物効果が得られないこと、有害な薬物作用
を示すこと、または標準的な薬物用量によって重篤な中毒が経験されることの理
由が説明された。多型は広範な代謝型の表現型および不良な代謝型の表現型で発
現される。
【０１１０】 従って、遺伝的多型により、一集団におけるβサブユニット機能の1つ以上が
別の集団のものとは異なるβサブユニット蛋白質の対立遺伝子蛋白質変異体が得
られる。従って、ポリペプチドにより、標的は治療法に影響を与えることがある
遺伝的素因を確認することができる。従って、リガンドに基づいた治療では、例
えば、多型はリガンド結合およびチャネル活性化において多少活性を示す部位を
生ずることがある。従って、リガンドの選択または用量は、多型を含有する所定
の集団内での治療効果を最大にするように変更されてもよい。遺伝子型分けの別
法として、特定の多型ポリペプチドを同定してもよい。
【０１１１】 βサブユニットポリペプチドまた、臨床試験中および他の治療中に治療効果を
モニターするために有用である。従って、遺伝子発現、蛋白質レベルまたはβサ
ブユニット活性を増加または低下するようにデザインされる薬剤の治療有効性は
、βサブユニットポリペプチドをエンドポイント標的として使用することによっ
て、治療経過中にモニターすることができる。
【０１１２】 βサブユニットポリペプチドはまたβサブユニット関連疾患を治療するために
有用である。従って、治療方法は、サブユニットの細胞外部分と相互作用する分
子と拮抗するβサブユニット蛋白質の可溶性サブユニットまたは断片の使用を含
む。これらのβサブユニットまたは断片は、効果的な拮抗を提供するように、分
子に対する高い親和性を有することができる。
【０１１３】 抗体 本発明はまた、サブユニット蛋白質並びにその変異体および断片に選択的に結
合する抗体を提供する。抗体は、βサブユニット蛋白質と実質的に相同でない他
の蛋白質と結合する場合でも、選択的に結合すると考えられる。これらの他の蛋
白質はβサブユニット蛋白質の断片またはドメインとの相同性を有する。特定領
域のこのような保存により、相同性配列に関して両方の蛋白質に結合する抗体が
生ずる。この場合には、サブユニット蛋白質に結合する抗体は依然として選択的
であると理解される。
【０１１４】 高い抗原性インデックスを示す領域を図3に示す。抗体は、好ましくは、これ
らの領域またはこれらの領域の別個の断片から作製される。しかし、抗体は、本
明細書に記載するペプチドの任意の領域から製造することができる。
【０１１５】 抗体はポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよい。完全な抗
体またはその断片（例えば、FabまたはF(ab')2）を使用することができる。
【０１１６】 抗体を検出可能な物質に結合（すなわち、物理的に結合）することによって、
検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例には種々の酵素、補欠分子
族団、蛍光材料、発光材料、生物発光材料および放射性材料が含まれる。好適な
酵素の例にはセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β
-ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、好適な補欠分
子族団複合体の例にはストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが
含まれ、好適な蛍光材料の例にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレ
セインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルフルオレセイン
、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが含まれ、発光材料の例にはルミノール
が含まれ、生物発光材料の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリ
ンが含まれ、好適な放射性材料の例には125I、131I、35Sまたは3Hが含まれる。
【０１１７】 抗体を作製するためには、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体作製のた
めの標準的な技法を使用して、単離されたβサブユニットポリペプチドを免疫原
として使用して抗体を作成する。全長の蛋白質または抗原性ペプチド断片のどち
らかを使用することができる。高い抗原性インデックスを有する断片を図3に示
す。好ましい断片は、αサブユニットとβサブユニットの結合を低下または完全
に妨害する抗体を作製する。従って、好ましい抗体は、2つのサブユニット間の
結合を低下するまたは完全に阻止するものである。抗原性断片は、典型的には、
少なくとも7つ連続するアミノ酸残基を含む。しかし、抗原性ペプチドは少なく
とも12、少なくとも14のアミノ酸残基、少なくとも15のアミノ酸残基、少なくと
も20のアミノ酸残基または少なくとも30のアミノ酸残基を含んでもよい。一実施
態様において、断片は、例えば、親水性領域のような蛋白質の表面に位置する領
域に対応する。
【０１１８】 適当な免疫原性調製物は、天然、組換えにより発現される蛋白質または化学的
に合成されたペプチドから誘導することができる。
【０１１９】 抗体の用途 抗体は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技法
によってβサブユニット蛋白質を単離するために使用することができる。抗体は
、天然型βサブユニット蛋白質の細胞からの精製および宿主細胞中で発現された
組換えにより作製されたβサブユニット蛋白質の精製を容易にすることができる
。
【０１２０】 抗体は、細胞または組織中のβサブユニット蛋白質の存在を検出して、生物の
種々の組織および正常な発育経過中のβサブユニット蛋白質の発現パターンを求
めるために有用である。
【０１２１】 抗体は、発現量および発現パターンを評価するために、in situ、in vitroま
たは細胞溶解物もしくは上清中のβサブユニット蛋白質を検出するために使用す
ることができる。
【０１２２】 抗体は、発育中の異常な組織分布または異常な発現を評価するために使用する
ことができる。
【０１２３】 全長のβサブユニット蛋白質の断片の抗体による検出はβサブユニットの代謝
回転を同定するために使用することができる。
【０１２４】 さらに、抗体は、βサブユニット機能に関連する疾患の活動期などの疾患状態
またはβサブユニット機能に関連する疾患の素因を有する個体におけるβサブユ
ニット発現を評価するために使用することができる。疾患がβサブユニット蛋白
質の不適当な組織分布、発育上の発現または発現レベルによって生じる場合には
、抗体は正常なβサブユニット蛋白質に対して作製することができる。疾患がβ
サブユニット蛋白質の特定の突然変異によって特徴付けられる場合には、この突
然変異蛋白質に特異的な抗体を使用して、特異的な突然変異βサブユニット蛋白
質の存在をアッセイすることができる。
【０１２５】 抗体は生物の種々の組織の細胞の正常および異常な細胞下の局在化を評価する
ためにも使用することができる。
【０１２６】 抗体は、βサブユニット全体またはβサブユニットの一部、例えば、細胞内領
域、細胞外領域、膜貫通領域およびリガンド結合部位、αサブユニットとの相互
作用部位もしくは例えば、カゼインキナーゼIIによってリン酸化される部位など
の特定の機能的部位に対して形成することができる。
【０１２７】 診断的用途は遺伝的試験だけでなく、治療法をモニターする際にも適用するこ
とができる。従って、治療が最終的にβサブユニット発現レベルまたは異常なβ
サブユニットの存在および異常な組織分布または発育上の発現の適正化を目的と
する場合には、βサブユニットまたは関連する断片に対する抗体は治療の有効性
をモニターするために使用することができる。
【０１２８】 また、抗体はゲノム薬理学的分析に有用である。従って、多型βサブユニット
蛋白質に対して作製された抗体は、治療法の変更を必要とする個体を同定するた
めに使用することができる。
【０１２９】 抗体はまた、電気泳動の移動度、等電点、トリプリンによるペプチド消化およ
び当技術上既知の他の物理的アッセイによって分析される異常なβサブユニット
蛋白質の免疫学的マーカーとしての診断ツールとして有用である。
【０１３０】 抗体は、また組織型分類にも有用である。従って、特定のβサブユニット蛋白
質が特定の組織における発現に関連している場合には、このβサブユニット蛋白
質に特異的な抗体は組織型を同定するために使用することができる。
【０１３１】 抗体は、また法医学的な同定にも有用である。従って、個人が、特定の多型蛋
白質を形成する特定の遺伝子多型に関連している場合には、多型蛋白質に特異的
な抗体は同定の際の助力として使用することができる。
【０１３２】 抗体はまた、サブユニットの機能を遮断、例えば、リガンドの結合またはαサ
ブユニットの結合および/または活性化を遮断するのに有用である。細胞外ルー
プに関与するサブユニット機能は抗体阻害を特に受けやすい。
【０１３３】 これらの用途は、治療がサブユニット機能を阻害することを含む治療内容に適
用することができる。抗体は、機能に必要な部位を含有する特定の断片または細
胞に結合する無傷のβサブユニットに対して作製することができる。
【０１３４】 本発明はまた、生物試料中のβサブユニット蛋白質の存在を検出するために抗
体を使用するためのキットを含む。キットは、生物試料中のβサブユニット蛋白
質を検出するための標識化または標識可能な抗体などの抗体および化合物または
薬剤、試料中のβサブユニット蛋白質の量を測定するための手段、および試料中
のβサブユニット蛋白質の量を標準品と比較するための手段を含むことができる
。化合物または薬剤は好適な容器中で包装されてもよい。キットはさらにβサブ
ユニット蛋白質を検出するためにキットを使用する取扱説明書を含むことががで
きる。
【０１３５】 ポリヌクレオチド 配列番号2の核酸配列は、寄託したヒト全長ｃＤＮＡを配列決定することによ
って得られた。従って、寄託したクローンの配列は両者間の矛盾を調整し、配列
番号2の配列に対する全ての言及は寄託したｃＤＮＡの配列に対する言及を含む
。
【０１３６】 詳細に開示されるｃＤＮＡはコード領域、5'側および3'側未翻訳配列を含む（
配列番号2）。一実施態様において、サブユニット核酸はコード領域だけを含む
。
【０１３７】 ヒトＣ７Ｆ２βサブユニットｃＤＮＡは、鎖長が約210アミノ酸残基である全
長の蛋白質をコードする鎖長約1737ヌクレオチドである。核酸は脳、心臓、腎臓
、胎盤、肺、前立腺、精巣、卵巣並びに小腸および大腸で発現される。配列番号
1のアミノ酸配列の構造分析を図4のハイドロパシープロットに提供する。図は2
つの膜貫通ドメイン、細胞外ループおよび2つの細胞内ドメインの推定構造を示
す。本明細書において使用する、「膜貫通ドメイン」（または「領域」もしくは
「セグメント」）という用語は、原形質膜まで及ぶ疎水性ヘリックスを含む構造
アミノ酸モチーフをいう。
【０１３８】 本発明は、CＤＮＡβサブユニット蛋白質をコードする単離されたポリヌクレ
オチドを提供する。「Ｃ７Ｆ２βサブユニットポリヌクレオチド」または「Ｃ７
Ｆ２βサブユニット核酸」という用語は、配列番号2または寄託したｃＤＮＡに
示される配列をいう。「βサブユニットポリヌクレオチド」または「βサブユニ
ット核酸」という用語はさらにＣ７Ｆ２ポリヌクレオチドの変異体および断片を
含む。
【０１３９】 「単離された」βサブユニット核酸は、天然起源のβサブユニット核酸に存在
する他の核酸から分離されるものである。好ましくは、「単離された」核酸は、
核酸が誘導される生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然の状態で隣接する配列（す
なわち、核酸の5'側および3'側末端に位置する配列）を含まない。しかし、例え
ば約5 KBまでのいくつかの隣接する核酸配列が存在することがある。重要な点は
、組換え発現、プローブおよびプライマーの作製並びにβサブユニット核酸配列
に特異的な他の用途などの本明細書に記載する特定の操作に供することができる
ように、核酸が隣接配列から単離されることである。
【０１４０】 さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、他の細胞材料または
組換え技法によって作製される場合には培養培地または化学的に合成される場合
には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。しかし、核酸分子
は他のコード配列または調節配列に融合されてもよく、その場合でも単離されて
いると考えられる。
【０１４１】 例えば、ベクターに含有される組換えＤＮＡ分子は単離されていると考えられ
る。単離されたＤＮＡ分子のさらに別の例は異種宿主細胞中に維持された組換え
ＤＮＡ分子または（部分的にまたは実質的に）精製されたＤＮＡ分子の溶液が含
まれる。単離されたＲＮＡ分子には本発明の単離されたＤＮＡ分子のin vivoま
たはin vitroＲＮＡ転写物が含まれる。本発明による単離された核酸分子はさら
に合成によって作製されたそのような分子が含まれる。
【０１４２】 βサブユニットポリヌクレオチドは、成熟蛋白質プラス追加のアミノ末端もし
くはカルボキシ末端アミノ酸または（例えば、成熟型が2つ以上のポリペプチド
鎖を有する場合には）成熟ポリペプチドの内側のアミノ酸をコードすることがで
きる。このような配列は、特に、前駆体から成熟型への蛋白質の処理に何らかの
役割を果たし、蛋白質の移動を容易にし、蛋白質の半減期を延長または短縮し、
アッセイまたは作製のための蛋白質の操作を容易にすることができる。一般にin
situの場合と同様に、追加のアミノ酸は、細胞酵素によって成熟蛋白質から処
理される。
【０１４３】 βサブユニットポリヌクレオチドには、成熟したポリペプチド単独をコードす
る配列、リーダー配列または分泌配列（プレプロまたはプロ蛋白質配列）などの
成熟したポリペプチドをコードする配列および追加のコード配列、追加のコード
配列を伴うまたは伴わない成熟したポリペプチドをコードする配列プラス追加の
非コード配列、例えばイントロンおよび転写、ｍＲＮＡ処理（スプライシングお
よびポリアデニル化シグナル）、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定化に役割
を果たす、転写されるが翻訳されない配列などの非コード5'側および3'側配列が
含まれるが、それらに限定されない。また、ポリヌクレオチドは、例えば、精製
を容易にするペプチドをコードするマーカー配列に融合されてもよい。
【０１４４】 βサブユニットポリヌクレオチドはｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態であっても、
クローニングによって得られるまたは化学的合成技法によって作製されるまたは
それらの組み合わせによって作製されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮ
Ａの形態であってもよい。核酸、特にＤＮＡは2本鎖であっても、1本鎖であって
もよい。1本鎖はコード鎖（センス鎖）または非コード鎖（アンチセンス鎖）で
あってもよい。
【０１４５】 βサブユニット核酸は、ヒト胎児脳ｃＤＮＡに相当する、配列番号2に示され
る核酸配列を含む。
【０１４６】 本発明はさらに、遺伝コードの縮重により配列番号2に示される核酸配列とは
異なり、配列番号2に示される核酸配列によってコードされるものと同じ蛋白質
をコードする変異体サブユニットポリヌクレオチドおよびそれらの断片を提供す
る。
【０１４７】 本発明はまた、本明細書に記載する変異体ポリペプチドをコードするβサブユ
ニット核酸分子を提供する。このようなポリヌクレオチドは対立遺伝子変異体（
同じ遺伝子座）、ホモログ（異なる遺伝子座）およびオーソログ（異なる生物）
などの天然型であっても、または組換えＤＮＡ方法もしくは化学的合成によって
構築されてもよい。このような非天然型変異体は、ポリヌクレオチド、細胞また
は生物に適用されるものを含む突然変異技法によって作製することができる。従
って、上記に考察するように、変異体はヌクレオチド置換、欠損、変換および挿
入を含有してもよい。
【０１４８】 変更はコード領域および非コード領域のどちらかまたは両方に生じてもよい。
変更は保存的および非保存的アミノ酸置換を生じてもよい。
【０１４９】 オーソログ、ホモログおよび対立遺伝子変異体は、当技術上既知の方法を使用
して同定することができる。これらの変異体は、配列番号2に示されるヌクレオ
チドと少なくとも約55〜60%、典型的には少なくとも約70〜75%、さらに典型的に
は少なくとも約80〜85%、最も典型的には少なくとも約90〜95%以上相同であるβ
サブユニットをコードする核酸配列またはこの配列の断片を含む。このような核
酸分子は、ストリンジェントな条件下において、配列番号2に示される核酸配列
またはこの配列の断片にハイブリダイゼーションすることができるとして容易に
同定することができる。poly A配列または全てのもしくはほとんどの蛋白質に共
通の配列、全てのK+チャネルβサブユニットまたは全てのチャネルのβサブユニ
ットなどの、一般的な相同性による場合には、厳密なハイブリダイゼーションは
実質的な相同性を示さないことが理解される。さらに、変異体は、本発明より前
に開示されている核酸配列のどれをも含まないことが理解される。
【０１５０】 本明細書において使用される「ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼー
ションする」という用語は、互いに少なくとも55〜60%相同であるβサブユニッ
トをコードする核酸配列が典型的に互いにハイブリダイゼーションするハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄条件を記載することを意図している。条件は、互いに
少なくとも約65%、少なくとも約70%または少なくとも約75%以上相同である配列
が典型的に互いにハイブリダイゼーションするようであってもよい。このような
ストリンジェントな条件は当業者に既知で、Current Protocols in Molecular B
iology, John Wiley&Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見出すことができる。
緊縮ハイブリダイゼーション条件の一例は、約45℃における6×塩化ナトリウム/
クエン酸ナトリウム（SSC）中でのハイブリダイゼーション、次に50〜65℃にお
ける0.2×SSC、0.1%SDS中で1回以上の洗浄である。一実施態様において、ストリ
ンジェントな条件下において配列番号2の配列にハイブリダイゼーションする単
離された核酸分子は天然型核酸分子に相当する。本明細書において使用する、「
天然型」核酸分子という用語は天然に存在する核酸配列を有するＲＮＡまたはＤ
ＮＡ分子をいう（例えば、天然の蛋白質をコードする）。
【０１５１】 本発明はまた、全長のβサブユニットポリヌクレオチドの断片を含むポリヌク
レオチドを提供する。断片は1本鎖であってもまたは2本鎖であってもよく、ＤＮ
ＡまたはＲＮＡを含んでもよい。断片はコード配列または非コード配列、例えば
転写調節配列から誘導されてもよい。
【０１５２】 一実施態様において、βサブユニットコード領域核酸は鎖長が少なくとも216
ヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下において、配列番号2の核酸配
列を含む核酸分子とハイブリダイゼーションする。断片はまた本明細書に記載す
る特定のドメインをコードする核酸配列を含む。断片はまたコード配列全体をコ
ードする核酸を含む。断片はまた成熟蛋白質をコードする核酸を含む。断片はま
た2つ以上のドメインをコードする核酸配列を含む。断片はまた本明細書に記載
する特定の機能部位のアミノ酸に対応する核酸配列を含む。断片はさらに本明細
書に記載するアミノ酸配列の一部をコードする核酸配列を含むが、さらに5'側お
よび/または3'側領域の隣接核酸配列を含む。他の断片は本明細書に記載する特
定のドメインまたは部位のサブフラグメントを含んでもよい。断片はまた上記の
特定のアミノ酸配列に対応する核酸配列またはその断片を含む。これらの実施態
様において、核酸は鎖長が少なくとも20、30、40、50、100、250または500であ
る。本発明による核酸断片は本発明以前に開示されている断片を含むと解釈され
るべきではない。
【０１５３】 しかし、βサブユニット断片は遺伝子全体を含まない任意の核酸配列を含むこ
とが理解される。
【０１５４】 βサブユニット核酸断片は、1〜19付近のアミノ酸残基を含むアミノ末端細胞
内ドメインを含むポリペプチド、第1の膜貫通ドメイン（20付近から40付近のア
ミノ酸残基）を含むポリペプチド、細胞外ループドメイン（41付近から167付近
のアミノ酸残基）を含むポリペプチド、第2の膜貫通ドメイン（168付近から192
付近のアミノ酸残基）を含むポリペプチドおよびカルボキシ末端細胞内ドメイン
（193付近から210のアミノ酸残基）を含むポリペプチドをコードする核酸分子を
含む。ドメインの位置がコンピューター分析によって予測されている場合には、
これらのドメインを構成するアミノ酸残基が、ドメインを規定するために使用さ
れる基準に応じて変化することを当業者は理解している。
【０１５５】 本発明はまた、本明細書に記載するβサブユニット蛋白質のエピトープ形成領
域をコードするβサブユニット核酸断片を提供する。
【０１５６】 単離されたβサブユニットポリ核酸配列、特に断片はＤＮＡプローブおよびプ
ライマーとして有用である。
【０１５７】 例えば、βサブユニット遺伝子のコード領域は、オリゴヌクレオチドプローブ
を合成する既知の核酸配列を使用して単離することができる。次いで、標識化し
たプローブを使用して、コード領域に対応する核酸を単離するためのｃＤＮＡラ
イブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｍＲＮＡをスクリーニングするこ
とができる。さらに、プライマーをPCR反応に使用して、βサブユニット遺伝子
の特定の領域をクローニングすることができる。
【０１５８】 プローブ/プライマーは、典型的には、実質的に純粋なオリゴヌクレオチドを
含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、配列番号2の少なくとも約20、典型
的には約25、さらに典型的には約40、50または75連続するヌクレオチドにストリ
ンジェントな条件下においてハイブリダイゼーションする、上記の核酸配列の領
域、センス鎖またはアンチセンス鎖または他のβサブユニットポリヌクレオチド
を含む。プローブはさらに、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素
補因子のような標識を含む。
【０１５９】 ポリヌクレオチドの用途 βサブユニットポリヌクレオチドは、配列番号1に記載するポリペプチドをコ
ードする全長のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するため、並びに配列番号
1に示される同じポリペプチドを作製する変異体または本明細書に記載する他の
変異体に対応するｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するためのｃＤＮＡおよ
びゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。変異体は
、配列番号1に示されるポリペプチドを単離する同じ組織および生物から単離さ
れても、同じ生物の異なる組織から単離されても、または異なる生物から単離さ
れてもよい。本発明の方法は、発育段階によって支配され、従って生物の発育の
異なる時点の同じ組織内で発現される遺伝子およびｃＤＮＡを単離するのに有用
である。
【０１６０】 プローブは、βサブユニットをコードする遺伝子の全長方向の任意の配列に対
応することができる。従って、それは上記に明記するように、5'側非コード領域
、コード領域および3'側非コード領域から誘導された。
【０１６１】 核酸プローブは、例えば、上記のように、配列番号1の全長のｃＤＮＡまたは
その断片であってもよい。プローブは鎖長が少なくとも20、30、50、100、250ま
たは500のオリゴヌクレオチドであってもよく、ストリンジェントな条件下にお
いてｍＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリダイゼーションするのに十分である。
【０１６２】 本明細書に記載するポリヌクレオチドの断片はまた、本明細書に記載するより
大きい断片または全長のポリヌクレオチドを合成するのに有用である。例えば、
断片をｍＲＮＡの任意の部分にハイブリダイゼーションすることができ、より大
きいまたは全長のｃＤＮＡを作製することができる。
【０１６３】 断片はまた、望ましい鎖長および配列を有するアンチセンス分子を合成するの
に有用である。
【０１６４】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた、βサブユニットポリヌクレオチドの
任意の所定の領域を増幅するPCRのプライマーとして有用である。
【０１６５】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた、組換えベクターを構築するのに有用
である。このようなベクターは、βサブユニットポリペプチドの一部または全て
を発現する発現ベクターを含む。ベクターはまた、βサブユニット遺伝子のin s
itu発現および遺伝子産物を変更するために、細胞内ゲノムなどの別のポリ核酸
配列に組み込むために使用される挿入ベクターを含む。例えば、内因性βサブユ
ニットコード配列を、相同組換えにより、1つ以上の特に導入した変異を含有す
るコード領域の全てまたは一部と交換することができる。
【０１６６】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた、in situハイブリダイゼーション方
法によってβサブユニットポリヌクレオチドの染色体位置を決定するためのプロ
ーブとして有用である。
【０１６７】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた、βサブユニットおよびそれらの変異
体をコードする遺伝子の存在パターンを組織分布に関して決定する、例えば遺伝
子の重複が生じているかどうかおよび重複が組織全てまたはサブセットのみに生
じているかどうかを決定するために有用である。遺伝子は天然型であっても、細
胞、組織または生物に外来から導入されてもよい。βサブユニットポリヌクレオ
チドはまた、本明細書に記載するポリヌクレオチドをコードする遺伝子から作製
されるｍＲＮＡの全てまたは一部に対応するリボザイムをデザインするために有
用である。
【０１６８】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた、βサブユニットポリヌクレオチドお
よびポリペプチドの一部または全てを発現する宿主細胞を構築するために有用で
ある。
【０１６９】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた、βサブユニットポリヌクレオチドお
よびポリペプチドの全てまたは一部を発現するトランスジェニック動物を構築す
るために有用である。
【０１７０】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた、βサブユニットポリペプチドの一部
または全てを発現するベクターを作製するために有用である。
【０１７１】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた、βサブユニット核酸発現レベルを測
定するためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。従って、プロ
ーブは細胞、組織および生物におけるβサブユニット核酸の存在を検出するため
、またはβサブユニット核酸のレベルを測定するために使用することができる。
レベルが測定される核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。従って、本明細
書に記載するポリペプチドに対応するプローブは所定の細胞、組織または生物に
おける遺伝子コピー数を評価するために使用することができる。これは、βサブ
ユニット遺伝子が増幅されている場合には特に関連がある。
【０１７２】 または、プローブは、βサブユニット遺伝子の余分なコピーの位置を染色体外
要素として、またはβサブユニット遺伝子が通常では見出されない染色体への組
込みとして、例えば、均質染色領域として評価するためにin situハイブリダイ
ゼーション状況に使用することができる。
【０１７３】 これらの用途は、正常の結果と比較して、βサブユニット発現の増加または低
下に関与する疾患の診断に関連する。
【０１７４】 ｍＲＮＡを検出するためのin vitro技法にはノーザンハイブリダイゼーション
およびin situハイブリダイゼーションが含まれる。ＤＮＡを検出するためのin
vitro技法にはサザンハイブリダイゼーションおよびin situハイブリダイゼーシ
ョンが含まれる。
【０１７５】 プローブは、被験者の細胞試料中で、例えばｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの
ようなサブユニットコード核酸のレベルを測定することによる、またはβサブユ
ニット遺伝子が突然変異されているかどうかを判定することによるなどの、βサ
ブユニット蛋白質を発現する細胞または組織を同定する診断キットの一部として
使用することができる。
【０１７６】 核酸発現アッセイは、βサブユニット核酸発現または活性を調節する化合物を
同定するための薬剤スクリーニングに有用である。
【０１７７】 従って、本発明は、βサブユニット遺伝子の核酸発現に関連する疾患を治療す
るために使用することができる化合物を同定するための方法を提供する。本発明
の方法は、典型的には、化合物がβサブユニット核酸の発現を調節する能力をア
ッセイし、それによって望ましくないβサブユニット核酸発現によって特徴づけ
られる疾患を治療するために使用することができる化合物を同定することを含む
。
【０１７８】 アッセイは細胞系システムまたは細胞不含システム中で実施することができる
。細胞系アッセイは、βサブユニット核酸を天然に発現する細胞または特定の核
酸配列を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞を含む。
【０１７９】 または、候補化合物は患者またはトランスジェニック動物においてin vivoに
おいてアッセイすることができる。
【０１８０】 βサブユニット核酸発現のアッセイはｍＲＮＡレベルなどの核酸レベルの直接
アッセイまたはシグナル経路に関与する（環状AMPまたはホスファチジルイノシ
トール代謝回転などの）二次化合物のアッセイを含むことができる。さらに、β
サブユニット蛋白質シグナル経路に応答してアップレギュレーションまたはダウ
ンレギュレーションされる遺伝子の発現もアッセイすることができる。この実施
態様では、これらの遺伝子の調節領域が、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝
子に機能的に結合することができる。
【０１８１】 従って、細胞が候補化合物に接触させられ、ｍＲＮＡの発現が測定される方法
においてβサブユニット遺伝子発現の調節因子を同定することができる。候補化
合物の存在下におけるβサブユニットｍＲＮＡの発現レベルを、候補化合物の非
存在下におけるβサブユニットｍＲＮＡの発現レベルと比較する。次いで、この
比較に基づいて候補化合物を核酸発現の調節因子として同定することができ、例
えば、異常な核酸発現によって特徴づけられる疾患を治療するために使用するこ
とができる。ｍＲＮＡの発現が、候補化合物が存在する場合に存在しない場合よ
り統計学的に有意に大きい場合には、候補化合物は核酸発現の刺激剤と同定され
る。核酸発現が候補化合物が存在する場合に存在しない場合より統計学的に有意
に小さい場合には、候補化合物は核酸発現の阻害剤と同定される。
【０１８２】 従って、本発明は薬剤スクリーニングによって、βサブユニット核酸発現を調
節する遺伝子調節因子として同定された化合物を使用して、核酸を標的として用
いた治療方法を提供する。調節は、核酸発現のアップレギュレーション（すなわ
ち、活性化または作用）またはダウンレギュレーション（抑制または拮抗）の両
方を含む。
【０１８３】 従って、βサブユニット核酸発現の調節因子は、薬剤または小分子がβサブユ
ニット核酸発現を阻害する限り、本明細書に記載するスクリーニングアッセイを
使用して同定された小分子または薬剤であってもよい。
【０１８４】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた、臨床試験または治療法においてβサ
ブユニット遺伝子の発現または活性に対する調節化合物の有効性をモニターする
ために有用である。従って、遺伝子発現パターンは、化合物、特に患者が耐性を
形成することがある化合物による治療の持続的な有効性のバロメーターとして使
用することができる。遺伝子発現パターンはまた、罹患細胞の化合物に対する生
理学的な応答を示すマーカーとして使用することができる。従って、このような
モニタリングは化合物の投与の増加または患者が耐性を形成していない別の化合
物の投与を可能にする。同様に、核酸発現レベルが望ましいレベルより低下する
場合には、化合物の投与を比例して低下してもよい。
【０１８５】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた、βサブユニット核酸の定性的な変化
、特に病因に到る定性的な変化の診断アッセイに有用である。ポリヌクレオチド
は、βサブユニット遺伝子およびｍＲＮＡなどの遺伝子発現産物の突然変異を検
出するために使用することができる。ポリヌクレオチドは、βサブユニット遺伝
子の天然に存在する遺伝子の突然変異を検出し、それによって突然変異を有する
被験者がその突然変異によって生じる疾患のリスクがあるかどうかを判定するた
めのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。突然変異は
、遺伝子の1つ以上のヌクレオチドの欠損、付加または置換、変換または転移な
どの染色体転移、異常なメチル化パターンなどのゲノムＤＮＡの修飾または増幅
などの遺伝子コピー数の変化を含む。機能不全に関連するβサブユニット遺伝子
の変異型の検出は、疾患がβサブユニット蛋白質の過剰発現、発現低下または発
現変更によって生じる場合には、活動性疾患または疾患の素因の診断ツールとな
る。
【０１８６】 βサブユニット遺伝子に突然変異を有する個人は、種々の技法によって核酸レ
ベルで検出することができる。ゲノムＤＮＡは直接分析することができ、また分
析前にPCRを使用して増幅することができる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡは同じ方法
で使用することができる。
【０１８７】 ある種の実施態様において、突然変異の検出は、アンカーPCRもしくはRACEPCR
などのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば、米国特許第4,683,195号および同
第4,683,202号）において、またはライゲーション連鎖反応（LCR）（例えば、La
ndegran et al., Science 241:1077-1080(1988); and Nakazawa et al., PNAS 9
1: 360-364(1994)）においてプローブ/プライマーを使用することを含む。この
後者は遺伝子における点変異を検出するのに特に有用である（Abravaya et al/.
Nucleic Acids Res. 23: 675-682(1995)参照）。この方法は、患者から細胞試
料を採取するステップと、試料の細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまた
は両者）を単離するステップと、（存在する場合には）遺伝子のハイブリダイゼ
ーションおよび増殖が生じる条件下で遺伝子に特異的にハイブリダイゼーション
する1つ以上のプライマーを核酸試料に接触させるステップと、増幅産物の存在
または不在を検出するステップまたは増幅産物のサイズを検出するステップと、
鎖長を対照試料と比較するステップとを含む。欠損および挿入は、増幅産物のサ
イズの変化を正常な遺伝子型と比較することによって検出することができる。点
変異は、増幅したＤＮＡを正常なＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ配列にハイブ
リダイゼーションすることによって同定することができる。
【０１８８】 または、βサブユニット遺伝子の突然変異は、例えば、制限酵素消化パターン
の変化をゲル電気泳動によって測定することによって直接同定することができる
。
【０１８９】 さらに、配列特異的リボザイム（米国特許第5,498,531号）を使用して、リボ
ザイム切断部位の形成または損失によって特定の突然変異の存在をスコアリング
することができる。
【０１９０】 好ましくは、ヌクレアーゼ切断消化アッセイまたは融点の差によって、対応配
列を不適性配列から識別することができる。
【０１９１】 特定の位置における配列変化はまた、ＲＮＡseおよびS1保護などのヌクレアー
ゼ保護アッセイまたは化学的切断方法によって評価することができる。
【０１９２】 さらに、突然変異サブユニット遺伝子と野生型遺伝子の配列の差は、直接ＤＮ
Ａ配列決定によって求めることができる。診断アッセイを実施する場合には、質
量分析計（例えば、PCT InteＲＮＡtional Publication No. WO 94/16101号; Co
hen et al, Adv. Chromatogr. 36: 127-162(1996); and Griffin et al., Appl.
Biochem. Biotechnol. 38:147-159(1993)を参照）を含む、種々の自動式配列決
定手法を利用することができる（Biotechniques 19: 448(1995)）。
【０１９３】 遺伝子の突然変異を検出するための他の方法には、切断剤からの保護を使用し
て、ＲＮＡ/ＲＮＡまたはＲＮＡ/ＤＮＡ二重鎖の不適性塩基を検出する方法（My
ers et al., Science 230:1242(1985); Cotton et al., PNAS 85: 4397(1988);
Saleeba et al., Meth. Enzymol. 217: 286-295(1992)）、突然変異および野生
型核酸の電気泳動の移動度を比較する方法（Orita et al, PNAS 86: 2766(1989)
; Cotton et al., Mature. Res. 285: 125-144(1993); and Hayashi et al., Ge
net. Anal. Tech. Appl. 9:73-79(1992)および変性剤が濃度勾配しているポリア
クリルミドゲルにおける突然変異または野生型断片の移動度を変性性濃度勾配ゲ
ル電気泳動を使用してアッセイする方法（Meyer et al., Nature 313: 495(1985
)）が含まれる。点変異を検出するための他の技法の例には、選択的オリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅および選択的プライマー伸長が含
まれる。
【０１９４】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた、必ず疾患を生じるわけではないが、
治療法に影響を与える遺伝子型について個人を試験するのに有用である。従って
、ポリヌクレオチドを使用して、個人の遺伝子型と治療に使用した化合物に対す
る個人の応答との関係を検討することができる（ゲノム薬理学的関係）。本発明
の場合では、例えば、リガンドに対する親和性が変化するβサブユニット遺伝子
の突然変異により、例えば、標準的な濃度のリガンドにより薬剤効果が過剰また
は低下した。または、例えば、αサブユニットとの相互作用が変化するサブユニ
ット遺伝子の突然変異により、機能的な相互作用に影響を与える標準的な濃度の
薬剤で薬剤効果が増加または低下した。従って、本明細書に記載するβサブユニ
ットポリヌクレオチドを使用して、治療のための適当な化合物または用法を選択
するために、個人のβサブユニット遺伝子の突然変異含量を評価することができ
る。
【０１９５】 従って、治療に影響を与える遺伝的変更を示すポリヌクレオチドは、個人にお
いて治療を適合するために使用することができる診断標的となる。従って、これ
らの多型を含有する組換え細胞および動物を作製することにより、治療化合物お
よび用法の効果的な臨床設計が可能になる。
【０１９６】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた、配列が個々の染色体を用いて、染色
体の特定の位置に同定される場合には、染色体同定に有用である。最初にin sit
uまたは他の染色体特異的ハイブリダイゼーションによってＤＮＡ配列を染色体
に対合させる。望ましい種由来の個々の染色体を含有する体細胞ハイブリッドの
PCRスクリーニングに使用することができるPCRプライマーを作製することによっ
て、配列を特定の染色体に関連させることができる。プライマーに相同な遺伝子
を含有する染色体を含有するハイブリッドだけが増幅断片を作製する。サブロー
カリゼーションは染色体断片を使用して実施することができる。他の方法はフロ
ーソートされる標識染色体を予備スクリーニングし、染色体特異的ライブラリー
にハイブリダイゼーションすることによって予備選択することを含む。さらに別
のマッピング方法は従来使用されるものより短いプローブを用いたハイブリダイ
ゼーションを可能にする蛍光in situハイブリダイゼーションを含む。染色体マ
ッピングの試薬を個別に使用して、1つの染色体もしくは染色体の1つの部位をマ
ークすることができ、または一連の試薬を多数の部位および/または多数の染色
体をマークするために使用することができる。遺伝子の非コード領域に対応する
試薬が実際にはマッピング目的には好ましい。コード配列は遺伝子ファミリー内
で保存されている可能性が高いので、交差ハイブリダイゼーションの可能性が増
加する。
【０１９７】 βサブユニットポリヌクレオチドを使用して、少量の生物試料から個人を同定
することもできる。これは、例えば、個人を同定するための制限断片長多型（RF
LP）を使用して実施することができる。従って、本明細書において記載するポリ
ヌクレオチドはRFLPのＤＮＡマーカーとして有用である（米国特許第5,272,057
号を参照）。さらに、βサブユニット配列を使用して、個人のゲノムの選択され
た断片の実際のＤＮＡ配列を決定する別の技法を提供することができる。従って
、本明細書に記載するβサブユニット配列を使用して、配列の5'側および3'側末
端から2つのPCRプライマーを作製することができる。次いで、これらのプライマ
ーを使用してその後の配列決定のために個人のＤＮＡを増幅することができる。
【０１９８】 各個人は独自のセットのこのようなＤＮＡ配列を有するので、この方法で作製
された個人由来の一連の対応するＤＮＡ配列は独自の個人の識別情報となる。ヒ
トにおける対立遺伝子変更は500塩基あたり約1回の頻度で生じることが推定され
る。対立遺伝子変更はこれらの配列のコード領域ではある程度で生じ、非コード
領域ではより大きい程度で生じる。βサブユニット配列を使用して個人および組
織のこのような識別配列を得ることができる。配列はヒトゲノムの独自の断片を
示す。本明細書に記載する配列は、個人のＤＮＡを識別目的のために比較するこ
とができる標準としてある程度使用することができる。
【０１９９】 個人の識別データベースを作製するために配列の一連の試薬が使用される場合
には、同じ試薬をその個人の組織を同定するために後に使用することができる。
独自の識別データベースを使用すると、生存している場合でも、死亡している場
合でも、極めて少量の組織試料から個人の正の識別を実施することができる。
【０２００】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた法医学的な識別手法に使用することが
できる。PCR技術を使用して、1つの毛嚢、体液（例えば、血液、唾液または精液
）などの非常に少量の生物試料から採取されるＤＮＡ配列を増幅することができ
る。次いで、増幅された配列を標準と比較して、試料の起源を同定することがで
きる。
【０２０１】 従って、βサブユニットポリヌクレオチドを使用して、例えば、別の「識別マ
ーカー」（すなわち、特定の個人に独自の別のＤＮＡ配列）を提供することによ
って、ＤＮＡに基づいた法医学的識別の信頼性を高める、ヒトゲノムの特定の遺
伝子座に標的化するPCRプライマーのようなポリヌクレオチド試薬を提供するこ
とができる。上記のように、正確な塩基配列情報を、制限酵素で作製された断片
によって形成されるパターンの正確な代替法として識別に使用することができる
。非コード領域ではより大きい多型が生じるので、非コード領域を標的化する配
列は特に有用で、この技法を使用して個人の識別をより容易にする。断片は少な
くとも12塩基である。
【０２０２】 βサブユニットポリヌクレオチドをさらに使用して、特定の組織を同定するた
めに、例えば、in situハイブリダイゼーション技法に使用することができる標
識化または標識可能なプローブのようなポリヌクレオチド試薬を提供することが
できる。これは、法医病理学者に未知の起源の組織が提供される場合に有用であ
る。一連のβサブユニットプローブを使用して種ごとにおよび/または組織タイ
プごとに組織を同定することができる。
【０２０３】 同様の様式で、これらのプライマーおよびプローブを使用して、組織培養物を
汚染についてスクリーニングすることができる（すなわち、異なる種類の細胞の
混合物が培養物中に存在するかどうかをスクリーニングする）。
【０２０４】 または、βサブユニットポリヌクレオチドを直接使用して、アンチセンスまた
はリボザイム構築物によってβサブユニット遺伝子の発現の転写または翻訳を遮
断することができる。従って、異常に高いまたは望ましくないβサブユニット遺
伝子の発現によって特徴付けられる疾患では、核酸を直接治療に使用することが
できる。
【０２０５】 従って、βサブユニットポリヌクレオチドは細胞、組織および生物におけるβ
サブユニット遺伝子の発現を制御するためのアンチセンス構築物として有用であ
る。ＤＮＡアンチセンスポリヌクレオチドは転写に関与する遺伝子の領域に相補
的であるようにデザインされて、βサブユニット蛋白質の転写および産生を妨害
する。アンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドはｍＲＮＡにハイブリ
ダイゼーションして、ｍＲＮＡのβサブユニット蛋白質への翻訳を遮断してもよ
い。
【０２０６】 核酸発現を阻害するのに有用なアンチセンス分子の例には開始コドンも含む配
列番号2の5'側非翻訳領域に相補的なアンチセンス分子および配列番号2の3'側非
翻訳領域の断片に相補的であるアンチセンス分子が含まれる。
【０２０７】 または、βサブユニット核酸の発現を低下するために、アンチセンス分子のク
ラスを使用してｍＲＮＡを不活性化することができる。従って、これらの分子は
、異常なまたは望ましくない核酸発現によって特徴付けられる疾患を治療するこ
とができる。この技法は、翻訳されるｍＲＮＡの能力を減弱させる、ｍＲＮＡの
1つ以上の領域に相補的な核酸配列を含有するリボザイムによる切断を含む。考
えられる領域にはコード領域、特にβサブユニット蛋白質の機能的な活性に対応
するコード領域が含まれる。
【０２０８】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた、βサブユニット遺伝子発現が異常で
ある細胞を含有する患者に対する遺伝子治療のベクターを提供する。従って、ex
o vivoで操作され、患者に戻される患者の細胞を含む組換え細胞を個人に導入し
、個人の体内で細胞は個人を治療する望ましいβサブユニット蛋白質を産生する
。
【０２０９】 本明細書はまた、生物試料中にβサブユニット核酸が存在するかどうかを検出
するためのキットを含む。例えば、キットは、生物試料中のβサブユニット核酸
を検出するための標識化または標識可能な核酸または薬剤などの試薬、試料中の
βサブユニット核酸の量を測定するための手段、および試料中のβサブユニット
核酸の量を標準品と比較するための手段を含むことができる。化合物または薬剤
は好適な容器中で包装されてもよい。キットはさらにβサブユニットｍＲＮＡま
たはＤＮＡを検出するためにキットを使用する取扱説明書を含むことができる。
【０２１０】 ベクター/宿主細胞 本発明はまた、βサブユニットポリヌクレオチドを含有するベクターおよびβ
サブユニットポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供する。以下により詳細
に記載するように、ベクターはクローニングまたは発現に使用することができる
が、好ましくは、βサブユニットの発現に使用される。好ましくは、発現系は、
αサブユニットおよびβサブユニット両者が発現される宿主細胞を含む。「ベク
ター」という用語は、βサブユニットポリヌクレオチドを輸送することができる
、好ましくは核酸分子である伝達体をいう。ベクターが核酸である場合には、β
サブユニットポリヌクレオチドはベクター核酸に共有結合する。本発明のこの態
様では、ベクターはプラスミド、1本鎖もしくは2本鎖ファージ、1本鎖もしくは2
本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡウィルスベクターまたはBAC、PAC、YACもしくはMACな
どの人工的な染色体を含む。
【０２１１】 ベクターは、染色体外要素として宿主細胞内で維持され、複製し、βサブユニ
ットポリヌクレオチドの追加のコピーを作製することができる。または、ベクタ
ーは宿主細胞ゲノムに組込み、宿主細胞が複製するとβサブユニットポリヌクレ
オチドの追加のコピーを作製することができる。
【０２１２】 本発明はβサブユニットポリヌクレオチドを維持するためのベクター（クロー
ニングベクター）または発現するためのベクター（発現ベクター）を提供する。
ベクターは原核細胞または真核細胞またはその両者で機能することができる（シ
ャトルベクター）。
【０２１３】 発現ベクターは、ポリヌクレオチドの転写が宿主細胞内で可能であるように、
ベクターのβサブユニットポリヌクレオチドに機能的に結合するシス作用型調節
領域を含有する。ポリヌクレオチドは、転写に影響を与えることができる別個の
ポリヌクレオチドと共に宿主細胞に導入されることができる。従って、第2のポ
リヌクレオチドは、シス調節制御領域と相互作用してベクターからのβサブユニ
ットポリヌクレオチドの転写を可能にするトランス作用型因子を提供することが
できる。または、トランス-作用型因子は宿主細胞によって供給されてもよい。
最後に、トランス作用型因子はベクター自体から作製されてもよい。
【０２１４】 しかし、βサブユニットポリヌクレオチドの転写および/または翻訳は細胞不
含系において生じる場合もあることが理解される。
【０２１５】 本明細書に記載するポリヌクレオチドが機能的に結合することができる調節配
列には、ｍＲＮＡ転写を促すプロモーターが含まれる。これらには、バクテリオ
ファージλの左プロモーター、大腸菌のlac、TRPおよびTACプロモーター、SV40
の早期および後期プロモーター、CMV即時型プロモーター、アデノウィルス早期
および後期プロモーター、並びにレトロウィルス長末端反復(LTR)が含まれるが
、それらに限定されない。
【０２１６】 転写を促進する制御領域以外に、発現ベクターは、リプレッサー結合部位およ
びエンハンサーなどの転写を調節する領域も含むことができる。例には、SV40エ
ンハンサー、サイトメガロウィルス即時型エンハンサー、ポリオーマエンハンサ
ー、アデノウィルスエンハンサーおよびレトロウィルスLTRエンハンサーが含ま
れる。
【０２１７】 転写開始および制御の部位を含有する以外に、発現ベクターは転写終了に必要
な配列および転写された領域に、翻訳のためのリボソーム結合部位も含有するこ
とができる。発現のための他の調節制御要素は開始コドンおよび停止コドン並び
にポリアデニル化シグナルを含む。当業者は、発現ベクターに有用な数多くの調
節配列に気づいている。このような調節配列は、例えば、Sambrook et al., Mol
ecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. ed., Cold Spring Harbor Labora
tory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)に記載されている。
【０２１８】 βサブユニットポリヌクレオチドを発現するために種々の発現ベクターを使用
することができる。このようなベクターには、例えば、細菌プラスミド由来のベ
クター、バクテリオファージ由来のベクター、酵母エピソーム由来のベクター、
酵母人工染色体を含む酵母染色体要素由来のベクター、バキュロウィルス、SV40
などのパポバウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、ポックスウィル
ス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウィルスなどのウィルス由来のベクターの
ような染色体、エピソームおよびウィルス由来ベクターが含まれる。ベクターは
また、例えば、コスミドおよびファージミドのような、プラスミドとバクテリオ
ファージ遺伝的要素から誘導されるものなどのこれらの起源の組み合わせから誘
導されてもよい。原核宿主および真核宿主のための適当なクローニングおよび発
現ベクターはSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd
. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)
に記載されている。
【０２１９】 調節配列は1つ以上の宿主細胞に構成的発現を提供してもよく（すなわち、組
織特異的）、1種以上の細胞種において、温度、栄養補助またはホルモンもしく
は他のリガンドなどの異種因子などの誘導的発現を提供してもよい。原核および
真核宿主に構成的発現および誘導的発現を提供する種々のベクターは当業者に既
知である。
【０２２０】 βサブユニットポリヌクレオチドは、既知の技術によってベクター核酸に挿入す
ることができる。最終的に発現されるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列および発現ベク
ターを1つ以上の制限酵素で切断し、次いで断片をライゲーションすることによ
って発現ベクターに結合される。制限酵素消化およびライゲーションの手法は当
業者に既知である。
【０２２１】 適当なポリヌクレオチドを含有するベクターを、既知の技法を使用して増殖ま
たは発現のための適当な宿主細胞に導入することができる。細菌には、大腸菌（
E. coli）、放線菌（Streptomyces）およびネズミチフス菌（Salmonella typhim
urium）が含まれるが、それらに限定されない。原核細胞には、酵母、ショウジ
ョウバエなどの昆虫細胞、COSおよびCHOなどの動物細胞並びに植物細胞が含まれ
るが、それらに限定されない。
【０２２２】 本明細書に記載するように、ポリペプチドを融合蛋白質として発現することが
望ましい場合がある。従って、本発明は、βサブユニットポリペプチドの産生を
可能にする融合ベクターを提供する。融合ベクターは組換え蛋白質の発現を増加
し、組換え蛋白質の可溶性を増加し、例えば、親和性精製のリガンドとして作用
することによって、蛋白質を精製する際に助けとなる。最終的に望ましいポリペ
プチドが融合部分から分離されるように、蛋白質分解切断部位を融合部分の結合
部に導入することができる。蛋白質分解酵素には、第Xa因子、トロンビンおよび
エンテロキナーゼが含まれるが、それらに限定されない。典型的な融合発現ベク
ターには、標的組換え蛋白質に、それぞれ、グルタチオンSトランスフェラーゼ
（GST）、マルトースE結合蛋白質またはプロテインAを融合するpGEX(Smith et a
l.,(1988) Gene 67:31-40)、pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA)およびpR
IT5(Pharmacis, Piscataway, NJ)が含まれる。好適な誘導性非融合大腸菌発現ベ
クターの例には、pTrc(Amann et al., Gene 69:301-315(1988))およびpET11d(St
udier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185: 60-
89(1990))が含まれる。
【０２２３】 宿主細胞が組換え蛋白質を蛋白質分解によって切断できる能力を損なわせておく
遺伝的背景を提供することによって、宿主細菌において組換え蛋白質の発現を最
大にすることができる。（Gottesmann, S., Gene Expression Technology: Meth
ods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California(1990)119-12
8）。または、特定の宿主細胞、例えば大腸菌のコドン使用性を優先的にするよ
うに関心のあるポリヌクレオチドの配列を変更することができる。（Wada et al
.,Nucleic Acids Res. 20:2111-2118(1992)）。
【０２２４】 酵母において機能的である発現ベクターによってβサブユニットポリヌクレオ
チドを発現することができる。例えば、S.セレビシエ（S. cerevisiae）のよう
な酵母における発現ベクターの例には、pYepSec1(Baldari, et al., EMBO J. 6:
229-234(1987))、pMFa(Kurjan et al., Cell 30:933-943(1982))、pJRY88(Schu
ltz et al., Gene 54:113-123(1987)およびpYES2(Invitrogen Corporation , Sa
n Diego, CA)が含まれる。
【０２２５】 βサブユニットポリヌクレオチドはまた、例えば、バキュロウィルス発現ベク
ターを使用して昆虫細胞において発現することができる。培養昆虫細胞（例えば
、Sf9細胞）において蛋白質の発現に利用されるバキュロウィルスベクターには
、pAcシリーズ（Smith et al., Mol. Cell Biol. 3:2156-2165(1983)）およびpV
Lシリーズ（Lucklow et al., Virology 170:31-39(1989)）が含まれる。
【０２２６】 本発明のある種の実施態様において、本明細書に記載するポリヌクレオチドは
哺乳類発現ベクターを使用して哺乳類細胞中で発現される。哺乳類発現ベクター
の例には、pCDM8(Seed, B. Nature 329:840(1987))およびpMT2PC(Kaufman et al
., EMBO J. 6:187-195(1987))が含まれる。
【０２２７】 本明細書に掲載してある発現ベクターは、βサブユニットポリヌクレオチドを
発現するのに有用であると思われる、当業者に利用される既知のベクターを例と
してだけ提供してある。当業者は、本明細書に記載するポリヌクレオチドの維持
、増殖または発現に好適な他のベクターに気づいていると思われる。これらは、
例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. ed
., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)に見
出される。
【０２２８】 本発明はまた、本明細書に記載する核酸配列がベクターに逆方向にクローニン
グされるが、アンチセンスＲＮＡの転写を可能にする調節配列に機能的に結合す
るベクターを含む。従って、アンチセンス転写物は、コード領域および非コード
領域を含む、本明細書に記載するポリ核酸配列の全てまたは一部に作製される。
このアンチセンスＲＮＡの発現はセンスＲＮＡの発現に関連する上記のパラメー
ターの各々に供される（調節配列、構成性または誘導性発現、組織特異的発現）
。
【０２２９】 本発明はまた、本明細書に記載するベクターを含有する組換え宿主細胞に関す
る。従って、宿主細胞は原核細胞、酵母などの下等真核細胞、昆虫細胞などの他
の真核細胞および哺乳類などの高等真核細胞を含む。
【０２３０】 組換え宿主細胞は、当業者に容易に利用可能な技法によって、本明細書に記載
するベクター構築物を細胞に導入することによって作製される。これらには、リ
ン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介性トランスフェク
ション、陽イオン脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、
形質導入、感染、リポフェクションおよびSambrook et al., Molecular Cloning
: A Laboratory Manual. 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Co
ld Spring Harbor, NY(1989)に見出されるものなどの他の技法が含まれるが、そ
れらに限定されない。
【０２３１】 宿主細胞は2つ以上のベクターを含有してもよい。従って、異なる配列が同じ
細胞の異なるベクターに導入されてもよい。同様に、βサブユニットポリヌクレ
オチドは単独または発現ベクターにトランス-作用因子を提供するものなどのβ
サブユニットポリヌクレオチドに関連のない他のポリヌクレオチドと併用して導
入されてもよい。2つ以上のベクターが細胞に導入される場合には、ベクターは
独立して導入されても、同時導入されてもまたはβサブユニットポリヌクレオチ
ドベクターに結合されてもよい。
【０２３２】 バクテリオファージおよびウィルスベクターの場合には、標準的な感染および
形質導入手法によってパッケージングウィルスまたは封入ウィルスとして導入さ
れてもよい。ウィルスベクターは複製能力があっても、複製能力がなくてもよい
。ウィルスの複製が欠損している場合には、複製は、欠損を補足する機能を提供
した宿主細胞において生じる。
【０２３３】 ベクターは、一般に、組換えベクター構築物を含有する細胞の小集団の選択を
可能にする選択可能なマーカーを含む。マーカーは、本明細書に記載するポリヌ
クレオチドを含有する同じベクターに含有されても、別個のベクター上にあって
もよい。マーカーは原核宿主細胞ではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性
遺伝子を含み、真核宿主細胞ではジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性
を含む。しかし、表現型の特徴について選択するいかなるマーカーも有効である
。
【０２３４】 成熟蛋白質は細菌、酵母、哺乳類細胞および他の細胞中で適当な調節配列の制
御下で産生されるが、細胞不含転写および翻訳系を使用して、本明細書に記載す
るＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを使用してこれらの蛋白質を産生すること
もできる。
【０２３５】 ポリペプチドの分泌が望ましい場合には、適当な分泌シグナルをベクターに導
入する。シグナル配列はβサブユニットポリペプチドと同種であっても、これら
のポリペプチドと異種であってもよい。
【０２３６】 ポリペプチドが培地に分泌されない場合には、蛋白質は、凍結融解、超音波処
理、機械的破壊、融解剤の使用等を含む、標準的な破壊手法によって宿主細胞か
ら単離される。次いで、ポリペプチドが回収され、硫酸アンモニウム沈殿、酸性
抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースク
ロマトグラフィー、疎水性-相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロ
マトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマ
トグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーを含む基地の精製方法によって
精製される。
【０２３７】 本明細書に記載するポリペプチドの組換え作製における宿主細胞に応じて、ポ
リペプチドは細胞に応じた種々のグリコシル化パターンを有しても、細菌におい
て作製される場合のようにグリコシル化されなくてもよいことも理解される。ま
た、ポリペプチドは、宿主媒介性過程の結果として最初の修飾されたメチオニン
を含む場合がある。
【０２３８】 ベクターおよび宿主細胞の用途 本明細書に記載するポリペプチドを発現する宿主細胞、特に組換え宿主細胞は
種々の用途を有する。第一に、細胞は、さらに精製して望ましい量のβサブユニ
ット蛋白質または断片を作製することができるβサブユニット蛋白質またはポリ
ペプチドを作製する際に有用である。従って、発現ベクターを含有する宿主細胞
はポリペプチド作製に有用である。
【０２３９】 宿主細胞はまた、βサブユニットまたはβサブユニット断片を含む細胞系アッ
セイを実施するために有用である。従って、未変性のβサブユニットを発現する
組換え宿主細胞は、βサブユニット機能を刺激または阻害する化合物をアッセイ
するために有用である。これはリガンド結合、転写または翻訳レベルでの遺伝子
発現、αサブユニット相互作用およびリン酸化される能力を含む。
【０２４０】 従って、好ましい実施態様において、宿主細胞はαサブユニットおよびβサブ
ユニットまたはそれらの関連する部分を発現する。従って、αサブユニットおよ
びβサブユニット（またはそれらの関連する部分）がβサブユニット機能の検出
に有用なアッセイを提供する細胞系アッセイおよび細胞不含アッセイが提供され
る。好ましい実施態様において、本発明は、細胞がαサブユニットおよびβサブ
ユニットを発現する細胞系アッセイを提供する。
【０２４１】 アッセイエンドポイントはリガンド結合、αサブユニット結合または活性化、
チャネル電流、リン酸化およびαまたはβサブユニットの立体配座変化を含む。
αサブユニットおよびβサブユニットの相互作用は、反応物がエネルギー転移ド
ナーおよびアクセプターで別個に標識され、その結果、ドナーおよびアクセプタ
ーが互いに近接する場合にエネルギー転移が生じて、検出可能な寿命の変化を生
じる方法である、二重標識エネルギー転移に基づいたアッセイにおいて測定する
ことができる。αサブユニットおよびβサブユニット間に形成される複合体を検
出するためのアッセイ方法は蛍光放出または蛍光消失または2つのサブユニット
の標識間の他のエネルギー転移を測定することを含む。一例は、他方のサブユニ
ットが結合したとき、フルオレセイン分子が互いに消光し、溶液の蛍光が低下す
るように位置付けられたフルオレセインで一方のサブユニット標識されるフルオ
レセインホモ消光方法である。この分析技法は当技術上既知であり、当技術の範
囲内である。例えば、米国特許第5,631,169号、米国特許第5,506,107号、米国特
許第5,716,784号および米国特許第5,763,189号を参照。
【０２４２】 宿主細胞はまた、これらの機能が影響されるサブユニット突然変異体を同定す
るために有用である。突然変異体が天然に存在し、病原性を生じる場合には、突
然変異を含有する宿主細胞は、未変性のβサブユニットに対する影響によっては
示されない成熟βサブユニットに対する望ましい影響（例えば、刺激または阻害
機能）を有する化合物をアッセイするのに有用である。
【０２４３】 組換え宿主細胞はまた、異種細胞内または細胞外ドメインによる作用を活性化
または抑制する化合物を評価するために、本明細書に記載するキメラポリペプチ
ドを発現するのに有用である。または、1つ以上の異種膜貫通ドメインを使用し
て、任意の所定の宿主細胞に対する望ましい細胞外ドメインの影響を評価するこ
とができる。この実施態様では、特定の宿主細胞に適合する膜貫通ドメインを使
用してキメラポリペプチドを作製する。
【０２４４】 さらに、種々の機能の1つ以上が増加または低下されるように操作され（すな
わち、リガンド結合またはαサブユニット活性化）、個体におけるβサブユニッ
ト蛋白質を増加または置換するために使用される突然変異体βサブユニットをデ
ザインすることができる。従って、宿主細胞は、異常なβサブユニットを交換す
ることによって、または治療結果を与える異常なβサブユニットを提供すること
によって、治療の利点を提供することができる。一実施態様において、細胞は異
常に活性を示すβサブユニットを提供する。
【０２４５】 別の実施態様において、異常に活性を示さないβサブユニットを提供する。こ
れらのβサブユニットは個体において内因性βサブユニットと競合する。
【０２４６】 別の実施態様において、リガンドまたはαサブユニットに対して内因性βサブ
ユニットと競合するために、活性化されえないβサブユニットを発現する細胞を
個体に導入する。例えば、過剰なリガンドが治療法の一部である場合には、治療
の特定の時点においてこのリガンドを不活性化することが必要である。リガンド
に対して競合するが、βサブユニット活性化に影響されえない細胞を提供するこ
とが有用であると思われる。
【０２４７】 宿主細胞ゲノムにおいて内因性βサブユニットポリペプチド配列のin situ変
更を可能にする相同組換え宿主細胞を作製することもできる。この技術は、国際
公開公報第WO93/09222号、国際公開公報第WO91/12650号および米国特許第5,641,
670号により詳細に記載されている。簡単に説明すると、βサブユニットポリヌ
クレオチドまたはβサブユニット遺伝子の近位もしくは遠位配列に対応する特定
のポリ核酸配列を、遺伝子の発現が影響される宿主細胞ゲノム内に相同組換えに
よって組み込ませる。一実施態様において、内因性配列の発現を増加または低下
する調節配列が導入される。従って、通常ではβサブユニット蛋白質を産生しな
い細胞においてβサブユニット蛋白質を産生することができ、通常ではその蛋白
質を特定のレベルで産生する細胞においてβサブユニット蛋白質を大量に発現す
ることができる。または、遺伝子全体を欠損することができる。突然変異βサブ
ユニット蛋白質を産生するために遺伝子の任意の望ましい領域にさらに別の特定
の突然変異を導入することができる。このような突然変異は、例えば、リガンド
結合部位またはαサブユニット相互作用部位などの特定の機能的領域に導入する
ことができる。
【０２４８】 一実施態様において、宿主細胞は、変更されたβサブユニット遺伝子を含有す
るトランスジェニック動物を作製するために使用することができる受精卵母細胞
または胚性幹細胞であってもよい。または、宿主細胞は、特定のサブセットの細
胞を生じ、動物においてトランスジェニック組織を作製するために使用すること
ができる幹細胞または他の早期組織前駆体であってもよい。相同組換えベクター
の説明はThomas et al.,Cell 51:503(1987)も参照。ベクターは胚性幹細胞系統
に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、導入された遺伝子が
内因性βサブユニット遺伝子と相同組換えしている細胞を選択する（例えば、Li
, E. et al., Cell 69:915(1992)を参照）。次いで、選択した細胞を動物（例え
ば、マウス）の胚盤胞に注射して、凝集キメラを形成する（例えば、Bradley, A
. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell: A Practical Approach, E.
J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987)pp.113-152）。次いで、キメラ配列を
好適な擬似妊娠した雌仮親動物に植込み、出産まで飼育することができる。生殖
細胞.に相同組換えＤＮＡを保有する子孫を使用して、導入遺伝子の生殖系列伝
播によって動物の全ての細胞が相同組換えＤＮＡを含有する動物を育種すること
ができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法はBradley,
A.(1991)Current Opinion in Biotechnology 2:823-829およびPCT InteＲＮＡt
ional Publication Nos.国際公開公報第WO90/11354号、WO91/01140号およびWO93
/04169号にさらに記載されている。
【０２４９】 遺伝的に操作された宿主細胞を使用して、ヒト以外のトランスジェニック動物
を作製することができる。トランスジェニック動物は、好ましくは、動物の細胞
の1つ以上が導入遺伝子を含む哺乳類、例えば、ラットまたはマウスなどのげっ
歯類である。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発育する細胞のゲノムに
組み込まれ、トランスジェニック動物の1つ以上の細胞または組織において成熟
した動物のゲノムに残存する異種ＤＮＡである。これらの動物はβサブユニット
蛋白質の機能を検討するため並びにβサブユニット蛋白質活性の調節因子を同定
および評価するために有用である。
【０２５０】 トランスジェニック動物の他の例はヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、
ヤギ、ニワトリおよび霊長類を含む。
【０２５１】 一実施態様において、宿主細胞はβサブユニットポリ核酸配列が導入された受
精卵母細胞または胚幹細胞である。
【０２５２】 トランスジェニック動物は、核酸を、例えばマイクロインジェクション、レト
ロウィルス感染によって受精卵母細胞の雄性前核に導入し、擬似妊娠した雌仮親
動物中で卵母細胞を生育させることによって作製することができる。βサブユニ
ット核酸配列のいずれかを導入遺伝子としてマウスなどのヒト以外の動物のゲノ
ムに導入することができる。
【０２５３】 発現ベクターに有用な調節配列または他の配列のいずれかがトランスジェニッ
ク配列の一部を形成してもよい。これは、すでに含まれていない場合には、イン
トロン配列およびポリアデニル化シグナルを含む。組織特異的調節配列は導入遺
伝子に機能的に結合して、特定の細胞にβサブユニット蛋白質の発現を促す。
【０２５４】 胚操作およびマイクロインジェクションによってトランスジェニック動物を作
製する方法、特にマウスなどの動物は当技術上便利であり、例えば、共にLeder
et al.,による米国特許第4,736,866号および同第4,870,009号、Wagner et al.,
による米国特許第4,873,191号並びにHogan, B., Manipulating the Mouse Embry
o, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.,1986)
に記載されている。同様の方法は他のトランスジェニック動物を作製するために
使用される。ゲノムにおける導入遺伝子の存在および/または動物の組織または
細胞におけるトランスジェニックｍＲＮＡの発現に基づいてトランスジェニック
創始動物を同定することができる。次いで、トランスジェニック創始動物を使用
して導入遺伝子を保有する別の動物を育成することができる。さらに、導入遺伝
子を保有するトランスジェニック動物をさらに他の導入遺伝子を保有する他のト
ランスジェニック動物に育成することができる。トランスジェニック動物はまた
、動物全体または動物の組織が本明細書に記載する相同組換え宿主細胞を使用し
て作製されている動物を含む。
【０２５５】 別の実施態様において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された
系を含有するトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。このよう
な系の一例はバクテリオファージP1のcre/loxpリコンビナーゼシステムである。
cre/loxpリコンビナーゼシステムの説明は、例えば、Lakso et al.,PNAS 89:623
2-6236(1992)を参照。リコンビナーゼシステムの別の例はS.セレビシエ（S. cer
evisiae）のFLPリコンビナーゼシステムである（O'Gorman et al., Science 251
: 1351-1355(19991)。cre/loxPリコンビナーゼシステムを使用して導入遺伝子の
発現を調節する場合には、Creリコンビナーゼおよび選択された蛋白質をコード
する導入遺伝子を含有する動物が必要である。このような動物は、例えば、一匹
は選択された蛋白質をコードする導入遺伝子を含有し、もう一匹はリコンビナー
ゼをコードする導入遺伝子を含有する2匹のトランスジェニック動物を交配する
ことによって「二重」トランスジェニック動物を構築することによって提供され
る。
【０２５６】 本明細書に記載する非ヒトトランスジェニック動物のクローンも、Wilmut, I.
et al., Nature 385:810-813(1997)およびPCT InteＲＮＡtional Publication
Nos.国際公開公報第WO97/07668号およびWO97/07669号に記載されている方法によ
って作製することができる。簡単に説明すると、トランスジェニック動物の体細
胞のような細胞を単離して、増殖期を出て、G0期に入るように誘導する。次いで
、電気パルスを使用することによって、静止期の細胞を単離した種と同じ種の動
物の除核卵母細胞に静止期の細胞を融合する。次いで、桑実期または胚盤胞まで
発育するように再構築した卵母細胞を培養し、次いで擬似妊娠した雌里親動物に
移す。この雌里親動物から生まれる子孫は、体細胞のような細胞を単離した動物
のクローンである。
【０２５７】 本明細書に記載するポリペプチドを発現する組換え細胞を含有するトランスジ
ェニック動物は、in vivo状況において本明細書に記載するアッセイを実施する
ために有用である。従って、in vivoで存在し、リガンド結合、αサブユニット
活性化およびリン酸化される能力に影響を与えると思われる種々の生理学的要因
はin vitroの細胞不含アッセイまたは細胞系アッセイからは明らかではない。従
って、リガンドおよびαサブユニット相互作用、特定の突然変異βサブユニット
がαサブユニットに与える影響、チャネル機能およびリガンド相互作用並びにキ
メラサブユニットまたはチャネルの影響を含むβサブユニット機能をin vivoに
おいてアッセイするために非ヒトトランスジェニック動物を提供することは有用
である。ヌル突然変異、すなわち、1つ以上のβサブユニットの機能を実質的に
または完全に排除する突然変異の影響を評価することもできる。
【０２５８】 製薬学的組成物 βサブユニット核酸分子、蛋白質（特に、種々のドメインなどの断片）、蛋白
質の調節因子および抗体（本明細書において「活性化合物」とも呼ぶ）をヒトな
どの被験者に投与するのに好適な製薬学的組成物に組み入れることができる。こ
のような組成物は、典型的には、核酸分子、蛋白質、調節因子または抗体および
製薬学的に許容されうる担体を含む。
【０２５９】 本明細書において使用する「製薬学的に許容されうる担体」という用語は、薬
剤投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤
並びに吸収遅延剤等のいずれかおよび全てを含むことが意図される。製薬学的に
活性な物質にこのような媒体および薬剤を使用することは当技術上既知である。
任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない場合を除いて、このよう
な媒体を本発明の組成物に使用することができる。補助的な活性化合物を組成物
に組み入れることもできる。
【０２６０】 本発明の製薬学的組成物は、意図された投与経路に適合性であるように製剤化
される。投与経路の例は非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、
吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与を含む。非経口、皮内または皮下
適用に使用される溶液または懸濁液は以下の成分を含んでもよい：注射用水など
の滅菌希釈剤、生理食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン
、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチル
パラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または炭酸水素ナトリウムなどの抗酸化
剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン
酸などの緩衝液および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調節す
る薬剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節すること
ができる。非経口製剤はガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリ
ンジまたは多数回投与バイアルに封入される。
【０２６１】 注射用用途に好適な製薬学的組成物は滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散
剤および滅菌注射用溶液または分散剤の即時調合用製剤を含む。静脈内投与のた
めには、好適な担体は生理食塩液、静菌水、Cremophor ELTM(BASF, Parsippany,
NJ)またはリン酸緩衝生理食塩液（PBS）を含む。全ての場合において、組成物
は滅菌されていなければならず、注射剤としての使いやすい程度に流動性でなけ
ればならない。組成物は製造および保存条件下において安定でなければならず、
細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は
、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレ
ングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）およびそれらの好適な混合
物溶媒または分散媒であってもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使
用することによって、分散剤の場合には必要な粒子サイズを維持することによっ
ておよび界面活性剤を使用することによって適度な流動性を維持することができ
る。例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメ
ロサール等のような種々の抗菌剤および抗真菌剤によって微生物の活動を防止す
ることができる。多くの場合において、例えば、砂糖、マンニトールなどの多価
アルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムのような等張剤を組成物中に含める
ことが好ましい。組成物に吸収を遅延する、例えば、モノステアリン酸アルミニ
ウムおよびゼラチンのような薬剤を加えることによって注射用組成物の吸収を延
長することができる。
【０２６２】 滅菌注射用溶液は、必要な量の活性な化合物（例えば、βサブユニット蛋白質
または抗βサブユニット抗体）を上記に列挙した成分の1つまたは合わせたもの
と共に適当な溶媒中に組み入れ、必要な場合には、次にろ過滅菌することによっ
て調製することができる。一般に、分散剤は、基本的な分散媒および上記に列挙
したもののうち必要な他の成分を含有する滅菌基剤に活性な化合物を組み入れる
ことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合には
、好ましい調製方法は、先に滅菌ろ過した溶液から活性成分プラス任意の追加の
望ましい成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２６３】 経口用組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用油を含む。それらはゼラ
チンカプセルに封入されるか、または打錠される。経口投与のためには、薬剤は
胃内で分解されないために腸溶形態に含有され、また胃腸管の特定の領域で放出
されるように既知の方法によってコーティングまたは混合される。経口治療投与
の目的のためには、活性な化合物は賦形剤と共に組み入れられ、錠剤、トローチ
またはカプセルの形態で使用される。経口用組成物は、うがい薬として使用する
ための流動性担体を使用して調製することもでき、流動性担体中の化合物は経口
適用されて、口のなかでぶくぶくし（swish）、吐き出されるかまたは嚥下され
る。製薬学的に適合可能な結合剤および/または補助材料を組成物の一部として
加えてもよい。錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は以下の成分、すなわち、微
結晶セルロース、トラガカントまたはゼラチン；デンプンまたは乳糖などの賦形
剤、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）またはトウモロコシデンプンなどの崩
壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステローテス（Sterotes）などの潤滑剤
；コロイド状二酸化ケイ素などの潤滑剤（glidant）；ショ糖またはサッカリン
などの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ風味などの矯味
矯臭剤、または同様の性質を有する化合物のいずれかを含有してもよい。
【０２６４】 吸入による投与のためには、化合物は、二酸化炭素などのガスのような好適な
噴射剤を含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーからエア
ゾールスプレーの形態で送達される。
【０２６５】 全身投与も経粘膜または経皮的な手段によってもよい。経粘膜または経皮的投
与のためには、浸透される障壁に適当な浸透剤を製剤に使用する。このような浸
透剤は、一般に、当技術上既知で、例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤
、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は鼻腔噴霧または坐剤を
使用することによって実施することができる。経皮的投与のためには、活性な化
合物は、一般に、当技術上既知であるように、軟膏、軟膏（salves）、ゲル剤ま
たはクリームに製剤化される。
【０２６６】 化合物はまた、直腸送達のための坐剤の形態（例えば、ココア脂および他のグ
リセライドなどの従来の坐剤用基剤を含む）または停留浣腸剤（retention enem
as）の形態であってもよい。
【０２６７】 一実施態様において、活性な化合物は、植込み物および微小封入型送達システ
ムを含む徐放性製剤などの、化合物を体内から迅速に排泄させない担体を用いて
調製される。エチレンビニルアセテート、ポリアンハイドライド（polyanhydrid
e）、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸など
の生物分解可能生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤を
調製する方法は当業者に明らかである。材料はAlza CorporationおよびNova Pha
rmaceuticals, Inc.からも購入できる。リポソーム懸濁液（感染細胞に標的化す
るリポソームおよびウィルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む）を製薬学
的に許容されうる担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特
許第4,522,811号に記載されるような、当業者に既知の方法により調製すること
ができる。
【０２６８】 投与を容易にし、用量を均一にするために単位用量形態の経口または非経口組
成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において使用する単位用量形
態は、治療する被験者にとって単位用量として好適な物理的に別個の単位をいい
；各単位は、必要な製薬学的担体と関連して望ましい治療効果を生ずるように算
出された活性な化合物の所定の量が含有される。本発明の単位用量形態の規格は
活性な化合物の独自の特徴、達成される特定の治療効果および個人を治療するた
めのこのような活性な化合物を製造する当技術に本質的な限界によって、および
直接依存して支配される。
【０２６９】 本発明の核酸分子はベクターに挿入されて、遺伝子治療ベクターとして使用す
ることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国
特許第5,328,470号）または定位注射（例えば、Chen et al., PNAS 91:3054-305
7(1994)）によって被験者に送達することができる。遺伝子治療ベクターの製薬
学的な製剤は許容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを加えたものであっても
、遺伝子送達基剤を封入した徐放性基質を含んでもよい。または、完全な遺伝子
送達ベクターが組換え細胞から完全な状態で作製される場合には、例えばレトロ
ウィルスベクター、製薬学的組成物は、遺伝子送達系を生ずる1つ以上の細胞を
含んでもよい。
【０２７０】 製薬学的組成物は、投与の説明書と共に、容器、パックまたはディスペンサー
に含めることができる。
【０２７１】 実験 高コンダクタンスカルシウム活性化型カリウムチャネル（maxi-K）の細孔形成
αサブユニットはヒト（hSloと呼ぶ）およびマウス（mSloと呼ぶ）において同定
し、クローニングした。例えば、Knaus, J. Biol. Chem. 269:3921-3924(1994)
およびButler et al., Science 261: 221-224(1993)を参照。高コンダクタンス
カルシウム活性化型カリウムチャネルmaxi-Kにおける新規ヒトカルシウム活性化
型カリウムチャネルβサブユニットＣ７Ｆ２（配列番号2）の機能的役割を検討
するために実験を実施した。
【０２７２】 これらの実験は、Ｃ７Ｆ２とhSloおよびmSloの物理的相互作用がmaxi-Kのチャ
ネル活性を調節することを示しており、これは、Ｃ７Ｆ２はmaxi-Kの機能的βサ
ブユニットであるという主張を裏付けている。
【０２７３】 例 1:Ｃ７Ｆ２とmSloの物理的結合 Ｃ７Ｆ２のオープンリーディングフレーム（配列番号2のヌクレオチド502〜11
31）をpｃＤＮＡ3.1/V5/His-TOPOベクター（Invitrogen）にクローニングして、
V5エピトープ断片を得た。このベクターおよびmSloを含有するベクターをリポフ
ェクタミンまたはFugeneとともにHEK293細胞に一過的に同時トランスフェクトし
た。αサブユニットに対する抗体を用いてmSloを免疫沈澱した。V5-標識Ｃ７Ｆ
２の存在を明らかにするために、V5エピトープ断片に対するモノクローナル抗体
を用いて免疫沈澱物にウェスタンブロット分析を実施した。
【０２７４】 これらの実験は、ヒトＣ７Ｆ２がmSloに結合することを実証しており（データ
は示していない）、Ｃ７Ｆ２とmaxi-Kの細孔形成αサブユニットとの物理的相互
作用を示唆している。これらの結果は、Ｃ７Ｆ２がmaxi-Kのβサブユニットであ
るという主張を確認している。
【０２７５】 例2：Maxi-Kのチャネル活性に対するＣ７Ｆ２とhSloおよびmSloの結合の電気生
理学的結果 トランスフェクトした細胞においてＣ７Ｆ２および緑色蛍光蛋白質（GFP）を
共に発現するために、Ｃ７Ｆ２のオープンリーディングフレームをpIRES-EGFPベ
クター（Clontech）にクローニングした。このベクターおよびmSloを含有するベ
クターをリポフェクタミンまたはFugeneとともにHEK293細胞に一過的に同時トラ
ンスフェクトした。GFPの発現に基づいた記録について細胞を選択した。
【０２７６】 マウスmaxi-Kチャネル（mSlo）の活性化および不活性化動態は、単独で発現さ
れた場合またはＣ７Ｆ２と同時発現された場合に、劇的に異なった（図6）。こ
れらのインサイドアウトパッチクランプ実験は、Ｃ７Ｆ２とmSloの同時発現（横
棒はmSlo+Ｃ７Ｆ２を示す）は、mSlo単独の発現（横棒は、それぞれ、mSlo活性
化およびmSlo不活性化を示す）と比較したとき、マウスmaxi-Kの活性化（mSlo+
Ｃ７Ｆ２活性化）および不活性化（mSlo+Ｃ７Ｆ２不活性化）の時定数を劇的に
増加することを明らかにした。同様の影響はヒトmaxi-K hSloでも見られた。
【０２７７】 3μMのCa++の存在下において、Ｃ７Ｆ２のmSloとの同時発現は最大半減のチャ
ネル活性化の20mVの過分極（左側）シフトを生じ、カルシウムイオンに対するマ
ウスmaxi-Kチャネルの感受性の増加を示唆している（図7）。これは、以前に特
徴付けられたβサブユニットの典型的な挙動である。しかし、Ｃ７Ｆ２がhSloと
同時発現されると最大半減チャネル活性化の20〜50mVの脱分極（右側）シフトが
生じ、カルシウムイオンに対するヒトmaxi-Kチャネルの感受性の低下を示唆して
いる。これは、以前に特徴付けられているβサブユニットと比較してＣ７Ｆ２の
独自で新規な挙動である。
【０２７８】 カルシウムに応答した、maxi-Kチャネルの活性化および不活性化の変化並びに
最大半減チャネル活性化のシフトを生じる、Ｃ７Ｆ２のmSloおよびhSloとの機能
的相互作用は、Ｃ７Ｆ２がmaxi-Kのβサブユニットである主張を確認している。
【０２７９】 本発明は多数の異なる形態で例示することができ、本明細書に記載する実施態
様に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施態様は、本発
明の開示内容により本発明が当業者に詳細に伝達されるように提供される。本発
明の多数の改良および他の実施態様は、本発明が関係し、上記の説明に提供され
る教示内容の利点を有する当業者に明らかになる。特定の用語が使用されている
が、それらは、とくに明記しない限り、当技術おけると同様に使用される。
【０２８０】 本明細書に記載される全ての文献および特許出願は、本発明が関係する当業者
のレベルを示している。全ての文献および特許出願は、個々の文献または特許出
願各々が詳細に且つ個別に参照として組み入れられることを示されるのと同様に
、参照として本明細書に組み入れられている。
【０２８１】 上記の発明はよりよく理解するために例示および実施例によっていくぶん詳細
に説明されているが、所定の変更および改良は添付の請求の範囲内で実施するこ
とができることは明らかである。
【０２８２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｃ７Ｆ２βサブユニット核酸配列（配列番号2）および推定されるアミノ酸配
列（配列番号1）を示す。アミノ酸配列はヌクレオチド（下）に対して番号づけ
てある。アミノ酸1〜19はアミノ末端細胞内ドメインを構成し、アミノ酸20〜40
は第1の膜貫通ドメインを構成し、アミノ酸41〜167は細胞外ループを構成し、ア
ミノ酸168〜192は第2の膜貫通ドメインを構成し、アミノ酸193〜210はカルボキ
シ末端細胞内ドメインを構成する。
【図２ＡおよびＢ】 Ｃ７Ｆ２βサブユニットアミノ酸配列と（A）ヒトカルシウム活性化型カリウ
ムチャネルβサブユニット（配列番号3）（Meera, P. et al., FEBS Letters 38
2:84-88(1996)）および（B）ウズラカルシウム活性化型カリウムチャネルβサブ
ユニット（配列番号4）（Oberst, C. et al., Oncogene 14: 1109-1116(1997)）
の配列の配列比較を示す。配列は、デフォルトパラメーターを使用したClustal
W(1.74)multiple sequence alignment programを使用して並べた。
【図３】 Ｃ７Ｆ２βサブユニットアミノ酸配列の分析を示す：αβターンおよびコイル
領域；親水性、両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数および表面確立（surfac
e probability）。
【図４】 Ｃ７Ｆ２βサブユニットの疎水性プロットを示す。膜貫通セグメントに対応す
る疎水性が高い領域はアミノ酸20〜40および168〜192による。
【図５】 特定の機能部位に対応するアミノ酸のＣ７Ｆ２βサブユニットプンリーディン
グフレームの分析を示す。グリコシル化部位は、細胞外ループ内であると思われ
る、アミノ酸56の部位に相当する。第2のグリコシル化は、細胞外ループのアミ
ノ酸93部位である。環状AMPまたは環状GMP依存的プロテインキナーゼリン酸化部
位は、カルボキシ末端細胞内セグメント無いのアミノ酸210の部位である。プロ
テインキナーゼCリン酸化部位は、第1の膜貫通ドメインの開始部の外側のアミノ
酸19の部位に相当する。これは、以前に参照された（Knaus, H. G. et al., J.
Biol. Chem.269: 17274-17278(1994)）βサブユニットの1つのプロテインキナー
ゼAリン酸化部位に相当する。カゼインキナーゼIIリン酸化部位に相当する部位
は、第1の膜貫通セグメントの開始部に近接するアミノ末端細胞内セグメントの
アミノ酸14の部位である。第2のカゼインキナーゼIIリン酸化部位は、第2の膜貫
通セグメントの開始部に隣接する細胞外ループのアミノ酸167の部位である。
【図６】 HEK293細胞単独中で発現される場合またはＣ７Ｆ２βサブユニットと同時発現
される場合の、マウスmaxi-Kチャネル（mSlo）の活性化および不活性化の時定数
を示す。mSloがＣ７Ｆ２と同時発現される場合、活性化および不活性化の時定数
が増加することに注目すること。
【図７】 mSloが単独で発現された場合またはＣ７Ｆ２βサブユニットと同時発現された
場合、3μＭ Ca++の存在下におけるマウスmaxi-Kチャネル（mSlo）の最大半減の
チャネル活性化を示す。Ｃ７Ｆ２と同時発現された場合の、最大半減の活性化の
一定で、かなり大きい20mVの過分極（左側）シフトに注目すること。
【図８】 hSloが単独で発現された場合またはＣ７Ｆ２βサブユニットと同時発現された
場合、3μＭ Ca++の存在下におけるヒトmaxi-Kチャネル（hSlo）の最大半減のチ
ャネル活性化を示す。Ｃ７Ｆ２と同時発現された場合の、hSloの最大半減の活性
化の20〜50mVの脱分極（右側）シフトに注目すること。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 7/02 9/06 ４Ｃ０８６ 9/00 9/10 ４Ｈ０４５ 9/06 １０１ 9/10 9/12 １０１ 21/00 9/12 21/02 21/00 25/00 21/02 25/06 25/00 25/08 25/06 25/14 25/08 25/16 25/14 25/18 25/16 25/20 25/18 25/24 25/20 25/28 25/24 43/00 １１１ 25/28 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １１１ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 CA12 CA20 DA01 DA02 DA05 DA11 DA12 EA04 GA13 HA11 HA14 HA17 4B063 QA01 QA05 QQ21 QQ41 QQ43 QQ53 QQ61 QQ79 QQ89 QR08 QR32 QR40 QR42 QR48 QR56 QR62 QR77 QR80 QS16 QS25 QS34 QS36 QX02 QX05 QX10 4B064 AG01 CA02 CA05 CA06 CA10 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA58X AA72X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA05 BA25 BD50 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 BA44 CA53 DC50 NA14 ZA02 ZA05 ZA06 ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZA29 ZA36 ZA42 ZA54 ZC42 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 NA14 ZA02 ZA05 ZA06 ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZA23 ZA36 ZA42 ZA54 ZC42 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA20 EA50 FA71 FA74

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、 （b）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるアミ
    ノ酸配列、 （c）配列番号1に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列、 （d）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるアミ
    ノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列、 （e）配列番号1に示されるアミノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列であって
    、前記配列変異体は、ストリンジェントな条件下で配列番号2に示される核酸分
    子にハイブリダイゼーションする核酸分子によってコードされることを特徴とす
    る配列変異体のアミノ酸配列、 （f）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡクローンによってコードさ
    れるアミノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列であって、前記配列変異体はATCC
    受託番号第 に含有されるｃＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリ
    ダイゼーションする核酸分子によってコードされることを特徴とする配列変異体
    のアミノ酸配列、 （g）配列番号1に示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも216個の
    連続するアミノ酸を含む断片、 （h）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるアミ
    ノ酸配列の断片であって、少なくとも216個の連続するアミノ酸を含む断片、 （i）配列番号1に示されるアミノ酸約7番目からアミノ酸約210番目の成熟サブ
    ユニットポリペプチドのアミノ酸配列、 （j）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡクローンによってコードさ
    れる、アミノ酸約7番目からアミノ酸約210番目の成熟ポリペプチドのアミノ酸配
    列、 （k）配列番号1に示されるポリペプチドのアミノ酸約20番目からアミノ酸約40
    番目の膜貫通ドメインに及ぶ領域のアミノ酸配列、 （l）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるポリ
    ペプチドのアミノ酸約168番目からアミノ酸約192番目の膜貫通ドメインに及ぶ領
    域のアミノ酸配列、 （m）（a）〜（l）のポリペプチドのいずれか1つのエピトープ形成領域のアミ
    ノ酸配列、 （n）配列番号1に示されるアミノ末端の細胞内領域のアミノ酸1番目からアミ
    ノ酸約19番目のアミノ酸配列、 （o）配列番号1に示されるポリペプチドのカルボキシル末端の細胞内領域のア
    ミノ酸約193番目からアミノ酸約210番目のアミノ酸配列、および （p）配列番号1に示されるポリペプチドの細胞外ループ領域のアミノ酸約41番
    目からアミノ酸約167番目のアミノ酸配列 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 請求項1の（a）〜（p）に記載のポリペプチドに選択的に結
    合する単離された抗体。
  3. 【請求項３】 （a）配列番号2に示される核酸配列、 （b）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡの核酸配列、 （c）配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列、 （d）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるアミ
    ノ酸配列をコードする核酸配列、および （e）（a）、（b）、（c）または（d）の核酸配列のいずれかに相補的な核酸
    配列 からなる群から選択される核酸配列を有する単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 （a）ストリンジェントな条件下で配列番号2に示される核酸
    配列とハイブリダイゼーションする、配列番号1に示されるアミノ酸配列の配列
    変異体のアミノ酸配列をコードする核酸配列、 （b）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるアミ
    ノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列をコードする核酸配列であって、前記配列
    変異体の前記核酸配列がストリンジェントな条件下でATCC受託番号第 に含
    有されるｃＤＮＡとハイブリダイゼーションすることを特徴とする核酸配列、お
    よび （c）（a）または（b）の核酸配列のどちらかに相補的な核酸配列 からなる群から選択される核酸配列を有する単離された核酸分子。
  5. 【請求項５】 （a）配列番号1に示されるアミノ酸配列の断片をコードする
    核酸配列であって、前記断片が少なくとも216個の連続するアミノ酸を含むこと
    を特徴とする核酸配列、 （b）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるアミ
    ノ酸配列の断片をコードする核酸配列であって、前記断片が少なくとも216個の
    連続するアミノ酸を含むことを特徴とする核酸配列、 （c）配列番号1に示されるアミノ酸配列の断片をコードする核酸配列であって
    、前記断片がアミノ酸1番目からアミノ酸約19番目であることを特徴とする核酸
    配列、 （d）配列番号1に示されるアミノ酸配列の断片をコードする核酸配列であって
    、前記断片がアミノ酸約20番目からアミノ酸約40番目であることを特徴とする核
    酸配列、 （e）配列番号1に示されるアミノ酸配列の断片をコードする核酸配列であって
    、前記断片がアミノ酸約41番目からアミノ酸約167番目であることを特徴とする
    核酸配列、 （f）配列番号1に示されるアミノ酸配列の断片をコードする核酸配列であって
    、前記断片がアミノ酸約168番目からアミノ酸約192番目であることを特徴とする
    核酸配列、 （g）配列番号1に示されるアミノ酸配列の断片をコードする核酸配列であって
    、前記断片がアミノ酸約193番目からアミノ酸約210番目であることを特徴とする
    核酸配列、および （h）（a）〜（g）の核酸配列のいずれかに相補的な核酸配列 からなる群から選択される核酸配列を有する単離された核酸分子。
  6. 【請求項６】 請求項3〜5のいずれか一に記載の核酸配列を含む核酸ベクタ
    ー。
  7. 【請求項７】 請求項6に記載のベクターを含有する宿主細胞。
  8. 【請求項８】 請求項1の（a）〜（p）のポリペプチド配列のいずれかをコ
    ードする核酸配列を宿主細胞に導入するステップと、核酸から蛋白質が発現され
    る条件下で宿主細胞を培養するステップとを含む、請求項1に記載のポリペプチ
    ドのいずれかを生成するための方法。
  9. 【請求項９】 試料中の請求項1に記載のポリペプチドのいずれかの存在を
    検出するための方法であって、試料中のポリペプチドの存在を特異的に検出でき
    る薬剤を前記試料に接触させるステップと、次いでポリペプチドの存在を検出す
    るステップとを含む方法。
  10. 【請求項１０】 前記薬剤が、前記ポリペプチドと選択的に物理的に結合す
    ることができる請求項9に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記薬剤が、前記ポリペプチドに結合する請求項10に記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】 前記薬剤が、抗体である請求項11に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記薬剤が、リガンドである請求項11に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 請求項9に記載の方法に使用される試薬を含むキットであ
    って、前記試薬が前記ポリペプチドと特異的に結合する薬剤を含むことを特徴と
    するキット。
  15. 【請求項１５】 試料中の請求項3〜5のいずれか一に記載の核酸配列のいず
    れかの存在を検出するための方法であって、ストリンジェントな条件下で核酸配
    列とハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドを試料に接触させるステッ
    プと、オリゴヌクレオチドが試料中の核酸配列と結合するかどうかを判定するス
    テップとを含む方法。
  16. 【請求項１６】 その存在が検出された核酸が、ｍＲＮＡである請求項15に
    記載の方法。
  17. 【請求項１７】 試薬が、ストリンジェントな条件下で核酸分子のいずれか
    にハイブリダイゼーションする化合物を含む請求項15に記載の方法に使用される
    試薬を含むキット。
  18. 【請求項１８】 請求項1のポリペプチドのいずれかに結合する薬剤を同定
    するための方法であって、前記ポリペプチドに結合する薬剤を前記ポリペプチド
    に接触させるステップと、前記ポリペプチドに結合された薬剤により形成された
    複合体をアッセイするステップとを含む方法。
  19. 【請求項１９】 請求項1に記載のポリペプチドの活性を調節するための方
    法であって、前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドを発現する細胞に、前記
    ポリペプチドの活性を調節するのに十分な濃度の、前記ポリペプチドに結合する
    薬剤を接触させるステップを含む方法。
  20. 【請求項２０】 前記ポリペプチドの前記活性が、カリウムチャネルの細孔
    形成αサブユニットの活性化である請求項19に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 請求項1に記載のポリペプチドとカリウムチャネルの細孔
    形成αサブユニットとの間の複合体形成を阻害する薬剤を同定するための方法で
    あって、 a）請求項1に記載の前記ポリペプチドまたは請求項1に記載の前記ポリペプ
    チドを発現する細胞に試験される薬剤を接触させるステップと、 b）請求項1に記載の前記ポリペプチドと前記αサブユニットとの間に形成さ
    れる複合体をアッセイして、前記試験される薬剤が前記複合体の形成を阻害する
    かどうか判定するステップと を含む方法。
  22. 【請求項２２】 請求項1に記載のポリペプチドがカリウムチャネルの細孔
    形成αサブユニットに与える調節作用を調節する薬剤を同定するための方法であ
    って、 a）前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドを発現する細胞に試験される
    薬剤を接触させるステップと、 b）前記試験される薬剤が前記調節作用を調節するか判定するステップと を含む方法。
  23. 【請求項２３】 蛋白質の異常な活性または発現に関連する疾患に罹患して
    いる患者を治療する方法であって、患者の蛋白質の活性を調節するのに有効な量
    の前記蛋白質の活性を調節する化合物を患者に投与するステップを含み、それに
    よって、疾患の少なくとも1つの症状が軽減され、前記蛋白質が、 （a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、 （b）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるア
    ミノ酸配列、 （c）配列番号1に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列
    、 （d）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるア
    ミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列、 （e）配列番号1に示されるアミノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列であっ
    て、前記配列変異体が、ストリンジェントな条件下で配列番号2に示される核酸
    分子にハイブリダイゼーションする核酸分子によってコードされることを特徴と
    するアミノ酸配列、 （f）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡクローンによってコード
    されるアミノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列であって、前記配列変異体が、
    ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイ
    ブリダイゼーションする核酸分子によってコードされることを特徴とする配列変
    異体のアミノ酸配列 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。
  24. 【請求項２４】 蛋白質の異常な活性または発現に関連する疾患に罹患して
    いる患者を治療する方法であって、蛋白質、蛋白質をコードする核酸、並びに蛋
    白質をコードするｍＲＮＡか蛋白質をコードするゲノムＤＮＡの一部のうちいず
    れかとアニーリングすることができるアンチセンス核酸からなる群から選択され
    る、患者の蛋白質の活性を調節するのに有効な量の化合物を患者に投与するステ
    ップを含み、それによって、疾患の少なくとも1つの症状が軽減され、前記蛋白
    質が、 （a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、 （b）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるア
    ミノ酸配列、 （c）配列番号1に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列
    、 （d）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるア
    ミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列、 （e）配列番号1に示されるアミノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列であっ
    て、前記配列変異体はストリンジェントな条件下で配列番号2に示される核酸分
    子にハイブリダイゼーションする核酸分子によってコードされることを特徴とす
    る核酸配列のアミノ酸配列、 （f）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡクローンによってコード
    されるアミノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列であって、前記配列変異体はAT
    CC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブ
    リダイゼーションする核酸分子によってコードされることを特徴とする配列変異
    体のアミノ酸配列 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。
  25. 【請求項２５】 患者の蛋白質の異常な活性または発現に関連する疾患を診
    断する方法であって、患者の前記蛋白質をコードする遺伝子の発現レベルを評価
    するステップと、前記遺伝子の発現レベルとその疾患に罹患していないヒトの前
    記遺伝子の正常な発現レベルを比較するステップとを含み、それによって患者の
    前記遺伝子の発現レベルと正常な発現レベルとの差が、患者がその疾患に罹患し
    ている指標となり、前記蛋白質が、 （a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、 （b）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるア
    ミノ酸配列、 （c）配列番号1に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列
    、 （d）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるア
    ミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列、 （e）配列番号1に示されるアミノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列であっ
    て、前記配列変異体はストリンジェントな条件下で配列番号2に示される核酸分
    子にハイブリダイゼーションする核酸分子によってコードされる配列変異体のア
    ミノ酸配列、 （f）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡクローンによってコード
    されるアミノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列であって、前記配列変異体はAT
    CC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブ
    リダイゼーションする核酸分子によってコードされることを特徴とするアミノ酸
    配列 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。
  26. 【請求項２６】 蛋白質に関連する疾患に罹患している患者を治療する方法
    であって、前記蛋白質の活性を調節する化合物を患者の蛋白質の活性を調節する
    のに有効な量で患者に投与するステップを含み、それによって、疾患の少なくと
    も1つの症状が軽減され、前記蛋白質が、 （a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、 （b）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるア
    ミノ酸配列、 （c）配列番号1に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列
    、 （d）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるア
    ミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列、 （e）配列番号1に示されるアミノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列であっ
    て、前記配列変異体がストリンジェントな条件下において配列番号2に示される
    核酸分子にハイブリダイゼーションする核酸分子によってコードされることを特
    徴とする配列変異体のアミノ酸配列、 （f）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡクローンによってコード
    されるアミノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列であって、前記配列変異体がAT
    CC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブ
    リダイゼーションする核酸分子によってコードされることを特徴とする配列変異
    体のアミノ酸配列 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。
  27. 【請求項２７】 蛋白質に関連する疾患に罹患している患者を治療する方法
    であって、蛋白質、蛋白質をコードする核酸、並びに蛋白質をコードするｍＲＮ
    Ａまたは蛋白質をコードするゲノムＤＮＡの一部のいずれかとアニーリングする
    ことができるアンチセンス核酸からなる群から選択される、患者の蛋白質の活性
    を調節するのに有効な量の化合物を患者に投与するステップを含み、それによっ
    て、疾患の少なくとも1つの症状が軽減され、前記蛋白質が、 （a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、 （b）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるア
    ミノ酸配列、 （c）配列番号1に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列
    、 （d）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるア
    ミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列、 （e）配列番号1に示されるアミノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列であっ
    て、前記配列変異体がストリンジェントな条件下で配列番号2に示される核酸分
    子にハイブリダイゼーションする核酸分子によってコードされることを特徴とす
    る配列変異体のアミノ酸配列、 （f）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡクローンによってコード
    されるアミノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列であって、前記配列変異体がAT
    CC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡにストリンジェントな条件下において
    ハイブリダイゼーションする核酸分子によってコードされることを特徴とする配
    列変異体のアミノ酸配列 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。
  28. 【請求項２８】 患者の蛋白質に関連する疾患を診断する方法であって、患
    者の前記蛋白質をコードする遺伝子の発現レベルを評価するステップと、前記遺
    伝子の発現レベルとその疾患に罹患していないヒトの前記遺伝子の正常な発現レ
    ベルを比較するステップとを含み、それによって患者における前記遺伝子の発現
    レベルと正常な発現レベルとの差が、患者がその疾患に罹患している指標となり
    、前記蛋白質が、 （a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、 （b）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるア
    ミノ酸配列、 （c）配列番号1に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列
    、 （d）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡによってコードされるア
    ミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列、 （e）配列番号1に示されるアミノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列であっ
    て、前記配列変異体がストリンジェントな条件下で配列番号2に示される核酸分
    子にハイブリダイゼーションする核酸分子によってコードされることを特徴とす
    る配列変異体のアミノ酸配列、 （f）ATCC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡクローンによってコード
    されるアミノ酸配列の配列変異体のアミノ酸配列であって、前記配列変異体がAT
    CC受託番号第 に含有されるｃＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブ
    リダイゼーションする核酸分子によってコードされることを特徴とする配列変異
    体のアミノ酸配列 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。
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