MXPA01000952A

MXPA01000952A - Nueva -subunidad del canal de potasio, c7f2-a.

Info

Publication number: MXPA01000952A
Application number: MXPA01000952A
Authority: MX
Inventors: Rory Curtis
Original assignee: Millennium Pharm Inc
Priority date: 1998-07-27
Filing date: 1999-07-27
Publication date: 2002-08-20
Also published as: EP1100521A4; CA2335643A1; EP1100521A1; WO2000006183A1; JP2002524030A; AU5232799A

Abstract

La presente invencion se refiere a una ?-subunidad del canal de potasio, recientemente identificada. La invencion tambien se refiere a polinucleotidos que codifican para la subunidad. La invencion se refiere adicionalmente a metodos que, usan polipeptidos y polinucleotidos de la subunidad, aplicables a la diagnosis y tratamiento de los trastornos mediados por el canal. La invencion se refiere adicionalmente a metodos de seleccion de farmacos que usan los polipeptidos y pilinucleotidos para identificar agonistas y antagonistas, aplicables a la, diagnosis y tratamiento. La invencion abarca adicionalmente agonistas y antagonistas basados en los polipeptidos y polinucleotidos de la subunidad. La invencion se refiere adicionalmente a procedimientos para. producir los polipeptidos y polinucleotidos de la subunidad.

Description

NUEVA ß - SUBUNIDAD DEL CANAL DE POTAS IO , C 7 F2 -A CAMPO DE LA INVENC IÓN La presente invención se refiere a una ß-subunidad del canal de potasio, recientemente identificada. La invención también _ se refiere a polinucleótidos que codifican para la ß-subunidad. La invención se refiere adicionalmente a métodos que usan los polipéptidos y polinucleótidos de la ß-subunidad, como un objetivo para la diagnosis y el tratamiento en los trastornos mediados por el canal. La invención se refiere adicionalmente a métodos de selección de fármacos usando los polipéptidos y polinucleótidos para identificar agonistas y antagonistas, aplicables a la diagnosis y tratamiento. La invención abarca adicionalmente agonistas, y antagonistas basados en los polipéptidos y polinucleótidos de la ß-subunidad. La invención se refiere adicionalmente a procedimientos para producir los polipéptidos y polinucleótidos de la ß-subunidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El flujo de potasio a través de la membrana plasmática afecta diversos procesos biológicos incluyendo la activación potencial de acción y el control del volumen celular. Los canales de potasio son proteinas ubicuas, integrales de membrana que sirven para numerosas funciones en las células excitables y no excitables (McManus, O.B., J. Bioenerg. Biomembr. 23:537-560 (1991) ) . Han aparecido muchas clases diferentes de canales de potasio y se han separado en clases basándose en sus propiedades biofísicas, regulación fisiológica y farmacología (Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes, Sunderland, M.A. Sinauer (1992); Rudy, B., Neuroscience 25:729-749 (1988) ) . Los tipos principales incluyen los canales dependientes del voltaje, activados por calcio y sensibles a ATP. Existen algunos subtipos dentro de las clasificaciones. Sin embargo, ciertas caracteristicas funcionales se comparten entre los muchos tipos de canales de potasio (Kukuljan et al., Am . J., Physiol. 268 (Cell Physiol. 37) : C535-C556 (1995)) . Las proteinas formadoras del canal de potasio se pueden agrupar en tres familias que difiere en el número de segmentos de trans-membrana. La familia, más grande contiene seis segmentos que abarcan la membrana. - Los rectificadores interiores comprenden la segunda familia con subunidades que tienen dos segmentos de trans-membrana. La tercera familia contiene solo un segmento de trans-membrana. Estos canales se han estudiado usando técnicas de ADN recombinante. La información se ha revisado en Kukuljan et al., citado anteriormente.

Los canales de potasio activados por calcio, de alta conductancia son un grupo de proteinas con varias caracteristicas únicas. Los canales se activan por calcio intracelular, asi como por la despolarización de la membrana. Los canales exhiben una alta conductancia en el canal individual y son altamente selectivos para el potasio. Son sensibles a toxinas específicas, tal como caribdotoxina que se une a un sitio receptor localizado en el vestíbulo externo del canal e impide el flujo de potasio por la oclusión física del poro . Knaus et al., (J. Biol. Chem. 269:3921-3924 (1994)) reportó la composición de la subunidad del canal de potasio activado por calcio, de alta conductancia a partir del músculo liso. Este canal de potasio se reporta que está compuesto de dos subunidades, a y ß, de 62 y 31 kilodalton, respectivamente. El análisis de la secuencia de aminoácidos mostró una alta homología de secuencia con dos canales de potasio de alta conductancia, clonados a partir de Dros oph i l a . Un anticuerpo anti-péptido dirigido contra la secuencia de aminoácidos de uno de los fragmentos de la a-subunidad también podría in unoprecipi tar , bajo condiciones de no-desnaturalización, la ß-subunidad, demostrando la asociación específica no covalente de ambas subunidades. Los resultados indicaron que la a-subunidad de este canal de potasio específico de alta conductancia es un miembro de una familia específica de canales de potasio y forma un complejo 'no covalente con una ß- subunidad. La referencia informó de una interacción específica y estrecha entre los dos polipéptidos. Se propuso el siguiente modelo. La a-subunidad es el elemento formador de canal iónico, central y contiene el receptor para las varias toxinas de bloqueo. Se asocia de manera no covalente una a- subunidad de tetrámero con cuatro ß-subunidades . Las ß-subunidades están e'n proximidad cercana (menos de 12 Á) a la subunidad que porta el receptor y formadora de poro. Esta ß-subunidad del -canal de potasio de alta conductancia comparte características con~la ß-subunidad de los canales de sodio del cerebro de la rata y la ?-subunidad de los canales de calcio tipo L del músculo esquelético y puede ser análoga en estructura y/o función. Se especula que esta subunidad es un constituyente conservado de muchos canales de potasio dependientes del voltaje y de calcio. Knaus et al., (J. Biol. Chem. 269:17274-17278 (1994)) describió la secuencia primaria y la caracterización inmunológica de la ß-subunidad del canal de potasio activado por calcio de alta conductancia a partir del músculo liso. La secuencia de aminoácidos se usó para diseñar sondas de oligonucleótidos con las cuales se aislan los ADNc que codifican para la proteína. La proteína se reportó que contiene dos dominios hidrófobos (transmembrana, putativo) que tienen poca homología de secuencia a las subunidades de otros canales iónicos conocidos. Los informes han sugerido que la a-subunidad juega un papel en la modulación de las propiedades de la subunidad formadora de poro. Por ejemplo, la co-expresión de las a- y ß-subunidades del canal de sodio o potasio se ha demostrado que modula las corrientes expresadas de las a-subunidades solas. La referencia también informa de pequeñas regiones de homología con otras ß-subunidades. Se informa, por ejemplo, que la ß2-subunidad del canal de calcio cardiaco de conejo contiene un tramo de ocho aminoácidos que son 100 % homólogos a una región de la ß-subunidad del canal bajo estudio . McManus et al. (Neuron 14:645-650" (1995)) examinó la contribución funcional de las propiedades de la ß-subunidad de los canales de potasio de alta conductancia expresados heterólogamente en oocitos de Xen opus . La referencia informó que la co-expresión de la ß-subunidad del canal de potasio de alta conductancia del músculo liso bovino tiene efectos dramáticos en las propiedades de las a-subunidades expresadas del cerebro de ratón. La referencia señala que la expresión de una a-subunidad sola es suficiente para generar canales de potasio que se activan por voltaje y calcio intracelular. Sin embargo, los canales de los oocitos inyectados en los ADNc que codifican tanto para a- y ß-subunidades son mucho más sensibles al voltaje de activación y calcio que los canales compuestos de la a-subunidad sola. Los niveles de expresión, la conductancia del canal individual, y la selectividad iónica parecieron no estar afectados. Además,' los canales de los oocitos que expresan ambas subunidades son sensibles a un potente agonista de los canales de potasio de alta conductancia, nativos, en tanto que los canales compuestos de la a-subunidad sola fueron insensibles. De esta manera, además de sus efectos en la activación de canal, la ß-subunidad confirió sensibilidad a DHS-I, un potente agonista de los canales de potasio nativos de alta conductancia. Por consiguiente, en tanto que la expresión de la ß-subunidad sola no da por resultado un canal de potasio funcional, la coexpresión con la a-subunidad formó canales con propiedades biofísicas y farmacológicas distintas de los canales formados por la a-subunidad sola. Estas propiedades asemejan más cercanamente a aquellas de los canales de potasio de alta conductancia, nativos. El informe concluyó que en base al efecto en la sensibilidad al canal al voltaje y calcio conferido por la ß-subunidad, que la ß-subunidad puede formar parte de la maquinaria de transducción del canal. sta referencia también mostró que estas propiedades se podrían conferir por multímeros quiméricos en los cuales una ß-subunidad de un tejido fuera capaz de modular la a-subunidad del otro tejido. Surgió la posibilidad que la expresión regulada de las ß-subunidades, como una regulación específica del tejido o específica del desarrollo, podría constituir un mecanismo para generar diversidad funcional entre los canales de potasio de.' alta conductancia de mamí feros . Meera et al. (FEBS Lett. 382:84-88 (1996)) describió la importancia de la concentración de calcio para el acoplamiento funcional entre las a-y ß-subunidades de los canales de potasio de alta conductancia. La referencia citó que estos canales son únicos ya que se modulan no solo por el voltaje, sino también por el calcio en el intervalo micromolar. Se refieren en la ß-subunidad como "la subunidad reguladora para la a-subunidad formadora de poro". La referencia demostró que la concentración de calcio intracelular controla el acoplamiento funcional entre las a- y ß-subunidades del complejo en un intervalo de concentración pertinente a la excitación celular. La ß-subunidad usada para los experimentos se derivó del músculo liso humano. Los experimentos se realXzaron al inyectar ARNc en oocitos de Xen opus . Las corrientes de canal y el número de canales se registraron. Los resultados se reportaron puesto que demuestran que se requirió una concentración mínima de calcio para cambiar las a- y ß-subunidades a un modo activado, funcional. Se propuso que un aumento en la concentración local del calcio inducirá un cambio conformacional en una o ambas de las subunidades, activando el acoplamiento funcional y provocando que la a-subunidad responda de una forma mucho más eficiente al calcio y al voltaje. Antes de este trabajo, se pensaba que los canales eran activados por calcio y voltaje y nunca se abrirían , en la ausencia virtual del calcio. Sin embargo, él informe demostró que la a-subunidad del canal se abrirá a una baja concentración de calcio y en efecto, llega a ser independiente del calcio a concentraciones menores de 100 nm, operando de acuerdo a un modo puramente regulado por voltaje. De manera similar, los resultados proporcionaron evidencia para un mecanismo dependiente del calcio que cambia la a-subunidad desde un modo independiente a.l calcio a un modo dependiente al calcio y de una interacción nula con la ß-subunidad a un modo activado por la ß- subunidad . Las ß-subunidades de los canales de potasio activados con voltaje se han revisado recientemente (Barry et al., Ann. Rev. Physiol. 58 : 363-394 (1996) ) . Oberst et al. (Oncogene 14:1109-1116 (1997)) identificó recientemente una secuencia de ácido nucleico en el ADNc de codorniz en la cual el gen correspondiente codifica para una proteína de 200 aminoácidos con 46-48% de identidad de secuencia de aminoácidos . a las ß-subunidades reguladoras del canal de potasio activado por calcio, de alta conductancia, bovino, humano y canino. Los estudios de la expresión génica en fibroblastos de embriones de codorniz, transformados, con v-myc al aislamiento de un clon que híbrida en los fibroblastos normales, pero no en los transformados. El análisis subsecuente reveló que la secuencia se esperó en todos los fibroblastos avícolas, normales probados, pero fue indetectable en una variedad de líneas celulares transformadas por una variedad de oncogenes o carcinógenos químicos. Se sugirió que la proteína codificada por esta secuencia es una subunidad reguladora de un canal de potasio activado con calcio comprendido potencialmente en la regulación de la proliferación celular. Rhodes et al. (J. Neurosci 17:8246-8258 (1997)) examinó la asociación y la co-locali zación de dos ß-subunidades de mamífero con varias a-subunidades del canal de potasio en el cerebro de la rata adulta. El experimento mostró que las dos subunidades se asocian con virtualmente todas las a-subunidades examinadas. Sugirió que la expresión diferencial y asociación de las ß-subunidades citoplasma ticas con las a-subunidades formadoras de poro podría contribuir de manera significativa a la complejidad y heterogeneidad de los canales de potasio activados con voltaje en células excitables. Los resultados proporcionaron una base bioquímica y neuroanatómica para la contribución diferencial de las a- y ß-subunidades a corrientes de potasio neuronales, ' electrofisiológicamente diversas . Los canales iónicos son un objetivo principal para la acción y desarrollo de fármacos. Por consiguiente, es valioso para el campo del desarrollo farmacéutico, identificar y caracterizar componentes previamente no conocidos de los canales iónicos. La presente invención hace avanzar el estado de la técnica al ' proporcionar una ß-subunidad del canal de potasio, humana, previamente no identificada.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Es un objeto general de la invención modular los canales iónicos. Por lo tanto, es un objeto de la invención identificar nuevos ' componentes de los canales iónicos . Es un objeto específico de la invención proporcionar nuevos polipéptidos de la ß-subunidad de canales iónicos, referidos en la presente como polipéptidos C7F2, que son útiles como reactivos u objetivos en ensayos aplicables al tratamiento y diagnosis de trastornos mediados por los canales iónicos . Es un objeto adicional de la invención proporcionar polinucleótidos que corresponden a los nuevos polipéptidos de la ß-subunidad que son útiles como objetivos y reactivos en ensayos aplicables al tratamiento y diagnosis de trastornos mediados por canales iónicos/ útiles para producir nuevos polipéptidos de canales iónicos por métodos recombinantes . Un objeto específico de la invención es identificar compuestos que actúan como agonistas y antagonistas y modulen la función o expresión de la ß-subunidad . Un objeto específico, adicional de la invención es proporcionar los compuestos que modulan la expresión o función de la ß-subunidad para el tratamiento y diagnosis de los trastornos relacionados a los canales iónicos. Los nuevos polipéptidos y polinucleótidos de la ß-subunidad de la invención son útiles para el tratamiento de los trastornos relacionados o asociados con la ß-subunidad, incluyendo por ejemplo, trastornos del sistema nervioso central (CNS), trastornos del sistema cardiovascular, y trastornos del sistema, musculoesquelético. Los trastornos relacionados o asociados con la ß-subunidad también incluye trastornos de tejidos en los cuales se expresa la nueva ß-subunidad C7F2, por ejemplo, tejido del corazón, placenta, pulmón, riñon, próstata, testículos, ovarios, bazo, intestino delgado y grueso, colon, o timo, así como en tejidos del cerebro, incluyendo cerebelo, corteza cerebral, médula, espina dorsal, lóbulo occipital, lóbulo frontal, lóbulo temporal, putanem, amígdala, caudado, cuerpo colosum, hipocampo, sustancia nigra, subtálamo y tálamo. La invención se basa de esta manera en la identificación de una nueva- ß-subunidad del canal de potasio . Esta ß-subunidad es útil para modular los canales de iónicos en vista de su interacción con la a-subunidad formadora de poro. Por consiguiente, al usar la ß-subunidad para modular la actividad de la a-subunidad, se proporciona la modulación del canal de iónico. La ß-subunidad también es útil per s e como un objetivo o reactivo para el tratamiento y diagnos is .

La invención proporciona de este modo polipéptidos aislados de la ß-subunidad que incluyen un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO 1. La invención también proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico de la ß-subunidad que tienen la secuencia mostrada en SEC ID NO 2. La invención también proporciona polipéptidos variantes que tienen una secuencia de aminoácidos que es substancialmente homologa a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO 1. La invención ,'también proporciona secuencias variantes de adido nucleico que son substancialmente homologas a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID NO 2. La invención también proporciona fragmentos del polipéptido mostrado en SEC ID NO 1 y los nucleótidos en SEC ID NO 2, así como fragmentos substancialmente homólogos del polipéptido o ácido nucleico. La invención también proporciona vectores y células hospedadoras para la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la ß-subunidad y los polipéptidos y particularmente vectores recombinantes y células hospedadoras. La invención también proporciona métodos para elaborar los vectores y células hospedadoras y métodos para usarlos y para producir las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de la ß-subunidad. La invención también proporciona anticuerpos que se unen selectivamente a los polipéptido y fragmentos de la ß-subunidad. La invención también proporciona métodos para seleccionar compuestos que modulan la expresión o actividad de los polipéptidos de la ß-subunidad. La modulación puede ser al nivel de la ß-subunidad del polipéptido o al nivel del control de la expresión del ácido nucleico que expresa al polipéptido de la ß-subunidad. La invención también proporciona un proceso para modular la expresión o actividad de la ß-subunidad usando los compuestos seleccionados, incluyendo tratar condiciones relacionadas a la expresión o actividad de los polipéptidos de la ß-subunidad . La invención también proporciona ensayos de un diagnóstico para determinar la presencia, nivel o actividad de los polipéptidos de la ß-subunidad o las moléculas de ácido nucleico en una muestra biológica. La invención también proporciona, ensayos de diagnóstico para determinar la presencia de una mutación en los polipéptido o moléculas de ácido nucleico de la ß-subunidad.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos de la ß-subunidad C7F2 (SEC ID NO 2) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEC ID NO 1) . La secuencia de aminoácidos se numera con respecto a los nucleótidos (posteriormente) . Se predice que los aminoácidos 1-19 constituyen el dominio intracelular, amino-terminal, 20-40 constituyen el primer dominio transmembrana, 41-167 constituyen el asa extracelular, 168-192 'constituyen el segundo dominio transmembrana, y 193-210 constituyen el dominio intracelular carboxi-terminal. Las Figuras 2A y B muestran una comparación y secuencia de la secuencia de aminoácidos de la ß-subunidad C7F2 con (A) la secuencia de una ß-subunidad (SEC ID NO 3) (Meera, P. Et al., FEBS Letters 382:84-88 (1996)) del canal de potasio activada por calcio, humana y (B) una ß-subunidad (SEC ID NO 4) - (Oberst, C. et al., Oncogene 14:1109-1116 (1997)) del canal de potasio activada por calcio, de codorniz. Las secuencias se alinearon usando el programa de alineación de secuencia múltiple Clustal (1.74) usando parámetros por omisión. La Figura 3 muestra un análisis de la secuencia de aminoácidos de la ß-subunidad C7F2: las regiones aßvuelta y es.piral; hidrofilicidad, regiones antipáticas, regiones flexibles; índice antigénico y probabilidad superficial., La Figura 4 muestra una gráfica de hidrofobicidad de la ß-subunidad C7F2. Las regiones de alta hidrofobicidad que corresponden a los segmentos transmembrana se presentan de los aminoácidos 20-40 y 168-192. La Figura 5 muestra un análisis del cuadro de lector abierto de la ß-subunidad C7F2 para los aminoácidos que corresponden a los sitios funcionales específicos. Se encuentra un sitio de glicosilación que corresponde el sitio en el aminoácido 56, que estaría en el asa extracelular. Se encuentra un segundo sitio de glicosilación en el sitio del aminoácido 93, también en el asa extracelular. Se encuentra un sitio de fosforilación de proteína-cinasa dependiente de AMP cíclica o GMP cíclica en el sitio del aminoácido 210, que está en el segmento intracelular carboxi-terminal. Un sitio de fosforilación de proteína-cinasa C corresponde al sitio en el aminoácido 19, que está justo por afuera del comienzo del primer dominio transmembrana. Esto corresponde al sitio de fosforilación de proteína-cinasa A en una de las ß-subunidades previamente referidas (Knaus, H.G. et al., J. Bíol. Chem. 269:17274-17278 (1994)) . Se encuentra un sitio que corresponde a un sitio de fosforilación de caseína-cinasa II en el sitio del aminoácido 14, también en el segmento intracelular amino-terminal cercano al comienzo del primer segmento de trans-membrana. Se encuentra un segundo sitio de fosforilación de caseína-cinasa II en el sitio del aminoácido 167, que está en la asa extracelular justo adyacente ,' al regreso del segundo segmento de trans-membrana. ' La Figura 6 muestra las constantes de tiempo de activación y desactivación del canal de maxi-K de ratón (mSlo) cuando se expresa en células HEK293 solas o cuando se co-expresa con la ß-subunidad C7F2. Se señala que el incremento en las constantes de tiempo de activación y desactivación cuando mSlo se co-expresa con C7F2. La Figura 7 muestra la activación media-máxima de canal del canal maxi-K de ratón (mSlo) en la presencia de Ca+ + 3 µM cuando mSlo se expresa sola o se co-expresa con la ß-subunidad C7F2. Se señala el cambio de hiperpolarización (hacia la izquierda) de 20 mV consistente y altamente significativo de la activación media-máxima de mSlo cuando se co-expresa con C7F2. La Figura 8 muestra la activación media-máxima de canal del canal maxi-K humano (hSlo) en la presencia de Ca+ + 3 µM .cuando hSlo se expresa sola o se co-expresa con la ß-subunidad C7F2. Se señala el cambio de despolarización de 20-50 mV (hacia la derecha) de la activación media máxima de canal de hSlo cuando se co-expresa con C7F2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Polipéptidos La invención se basa en el descubrimiento de una nueva ß-subunidad del canal de potasio. Se identificó una marca de secuencia expresada (EST) en una colección de secuencias de ADN del cuerpo estriado de mono. Esta EST tiene homología a una ß-subunidad putativa del canal de potasio de codorniz (Oberst et al., citado anteriormente) y una ß-subunidad del canal de potasio, activada por calcio, humana (Meera et al., citada anteriormente) se identificó una EST humana con similitud al extremo 3' de la EST de mono. Esta EST humana se secuenció y encontró que .'es casi idéntica al extremo 3' del clon de mono. Esta EST se usó en un análisis de transferencia Northern para la expresión en -varios tejidos humanos. El gen se expresa de manera preferencial en el cerebro con mayor expresión en las regiones corticales pero con expresión en otras regiones y en la médula espinal. En el cerebro, los siguientes tejidos mostraron una señal positiva en la transferencia Northern': cerebelo, corteza cerebral, médula, médula espinal, lóbulo occipital, lóbulo frontal, lóbulo temporal, putamen, amígdala, caudado, corpus colosum, hipocampo, substancia nigra, subtálamo y tálamo. Sin embargo, la expresión también se encuentra en corazón, riñon, placenta, pulmón, próstata, testículos, ovario e intestino delgado y grueso. Usando la secuencia como una sonda, se identificó y se secuenció y se designó C7F2 un clon humano de longitud completa a partir del cerebro fetal. La invención se refiere de esta manera a una nueva ß-subunidad del canal de potasio que tiene la secuencia deducida de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO 1)'. El "polipéptido de la ß-subunidad C7F2" o "proteína de la ß-subunidad C7F2" se refiere al polipéptido en SEC ID NO 1. El término "proteína de ß-subunidad" o "polipéptido de ß-subunidad'X sin embargo, incluye adicionalmente las variantes descritas en la presente, así como fragmentos derivados del polipéptido y variantes de la ß-subunidad C7F2 de longitud completa. La presente invención proporciona de este modo un polipéptido aislado o purificado de la ß-subunidad del canal de potasio C7F2 y variantes y fragmentos del mismo. El polipéptido de la ß-subunidad C7F2 es una proteína de 210 residuos que exhibe 5 dominios estructurales. El dominio intracelular, amino-terminal se identifica que está dentro de los residuos 1 a aproximadamente residuo 19 en SEC ID NO 1. El primer dominio de transmembrana se identifica que está dentro de los residuos desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 40 en SEC ID NO 1. El asa extracelular se identifica que está dentro de los residuos desde aproximadamente 41 a 167 en SEC ID NO 1. El segundo dominio de transmembrana se identifica que está dentro de los residuos desde aproximadamente 168 a aproximadamente 192 en SEC ID NO 3. El dominio intracelular carboxi-terminal se identifica que está dentro de los residuos de aproximadamente 193 a 210. Como se usa en la presente, un polipéptido se dice que está "aislado"' o "purificado" cuando está substancialmente libre del material celular cuando se aisla a partir de células recombinantes y no recombinantes, o libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Sin embargo, un polipéptido se puede unir a otro polipéptido con el cual normalmente no está asociado en una célula y aún se considera "aislado" o "purificado". Los polipéptidos de la ß-subunidad se pueden purificar hasta la homogeneidad. Se entiende, sin embargo, que las preparaciones en las cuales los polipéptidos no se purifican a homogeneidad son útiles y se considera que contienen una forma aislada del polipéptido. La característica crítica es que la preparación permita la función deseada del polipéptido, aún en la presencia de cantidades considerables de otros componentes. De esta manera, la invención abarca varios grados de pureza. En una modalidad, el término "substancialmente libre de material celular" incluye preparaciones del polipéptido de la ß-subunidad que tienen menos de 30 % (en peso seco) de otras proteínas (es decir, proteínas contaminantes), menos de aproximadamente 20 % de otras proteínas, menos de aproximadamente 10 % de otras proteínas, o menos de aproximadamente 5 % de otras proteínas. Cuando el polipéptido de la ß-subunidad se produce de manera recombinante, puede estar substancialmente libre del medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20 %, menos de aproximadamente 10, o menos de aproximadamente 5 % del volumen de la preparación de proteína. El término "substancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones del polipéptido de la ß-subunidad en las cuales . se separa de los precursores químicos u otros productos químicos que están comprendidos en su síntesis. En una modalidad, el lenguaje "subg tancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluyen preparaciones del polipéptido que tienen menos de aproximadamente 30 % (en peso seco) de precursores químicos u otros productos químicos, menos de aproximadamente 20 % de precursores químicos u otros productos químicos, menos de aproximadamente 10 % de precursores químicos u otros productos químicos, o menos de aproximadamente 5 % de precursores químicos u otros productos químicos. En una modalidad, el polipéptido de la ß-subunidad comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO 1. Sin embargo, la invención también abarca variantes de la secuencia. Las variantes incluyen una proteína substancialmente homologa codificada por el mismo locus genético en un organismo, es decir, una variante alélica. Las variantes también abarcan proteínas derivadas de otros locus genéticos en un organismo, pero que tienen homología substancial a la proteína de la ß-subunidad C7F2 de SEC ID NO 1. Las variantes también incluyen proteínas substancialmente homologas a la proteína de la ß-subunidad C7F2 pero derivadas de otro organismo, es decir, un ortólogo. Las variantes también incluyen proteínas que son substancialmente homologas a la proteína de la ß-subunidad C7F2 que se producen por síntesis química. Las variantes también incluyen proteínas que son substancialmente homologas a la proteína de la ß-subunidad C7F2 que se producen por métodos recombinantes. Sin embargo, se entiende que las variantes excluyen cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas antes de la invención. Como se usa en la presente, dos proteínas (o una región. de las proteínas) son substancialmente homologas cuando las secuencias de aminoácidos son al menos aproximadamente 55-60 %, típicamente al menos aproximadamente 70-75 %, de manera más típica al menos aproximadamente 80-85 %, y de forma más típica al menos aproximadamente 90-95 % ó más homologas. Una secuencia de aminoácidos substancialmente homologa, de acuerdo con la presente invención, se codificará por una secuencia de ácido nucleico que hibridiza a la secuencia de ácido nucleico, o una porción de la misma, de la secuencia mostrada en SEC ID NO 2 bajo condiciones severas como se describe más completamente de manera posterior. Para determinar el por ciento de homología de las dos secuencias de 'aminoácidos, o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir separaciones en la secuencia de una proteína o ácido nucleico para alineación óptima con la otra proteína o ácido nucleico) . Los residuos o nucleóiidos de aminoácidos en las posiciones correspondientes de aminoácidos o posiciones de nucleótidos entonces se comparan. Cuando una posición a una secuencia está ocupara por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido como la posición correspondiente en la otra secuencia, entonces las moléculas son homologas en esa posición. Como se usa en la presente, la "homología" de aminoácidos o ácido nucleico es equivalente a la "identidad" de aminoácido o ácido nucleico. El por ciento de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, por ciento de homología igual al número de posiciones idénticas /número total de posiciones, veces 100) . La invención también abarca polipéptidos que tienen un grado menor de identidad pero que tienen suficiente similitud para realizar una o más de las mismas funciones realizadas por el polipéptido de la ß-subunidad C7F2. La similitud se determina por la substitución conservadora de aminoácidos. Estas substituciones son aquellas que substituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Las substituciones conservadoras probablemente van a ser fenotípicamente ausentes. Típicamente, vistas como substituciones conservadoras están los reemplazos, o para otros, entre los aminoácidos alifáticos, Ala, Val, Leu e lie; intercambio de residuos de hidroxilo, Ser y Thr, intercambio de residuos á_cidos, Asp y Glu, substitución entre los residuos de amida, Asn y Gln, intercambio de residuos básicos, Lys y Arg y reemplazos entre los residuos aromáticos, Phe, Tyr. La guía con respecto a qué cambios de aminoácidos van a ser probablemente fenotípicamente ausentes se encuentra en Bo ie et al., Science 247:1306-1310 (1990) . TABLA 1 Substituciones conservadoras de aminoácidos Se puede calcular, fácilmente tanto la identidad como la similitud (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press. New York, 1988; Biocomput ing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.S., ed., Academíc Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffín, A.N., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994: Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. And Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991) . Los métodos preferidos del programa de cómputo para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen de manera enunciativa y sin limitación, el paquete del programa de GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Res. 12(1) :387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990)) . Un polipéptido variante puede diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más substituciones, supresiones, inserciones, inversiones, fusiones y truncamientos o combinación de éstos . Los polipéptidos variantes pueden ser completamente funcionales o pueden carecer de una función en una o más actividades. De esta manera, en el presente caso, las variaciones pueden afectar la función, por ejemplo, de una o más de las regiones que corresponden a la unión de ligando, asociación transmembrana, fosforilación y la interacción de la a-subunidad. Las variantes completamente funcionales contienen típicamente sólo la variación conservadora o variación en residuos no críticos o en regiones no críticas. Las variantes funcionales también pueden contener substitución de aminoácidos similares que no dan por resultado cambio o un cambio insignificante en la función. De manera alternativa, estas substituciones pueden afectar de manera positiva o negativa la función en algún grado . Las variantes no funcionales contienen típicamente una o más substituciones, supresiones, inserciones, inversiones o truncamientos de aminoácidos no conservadoras o una substitución, inserción, inversión, o supresión en un residuo crítico o región crítica. Como se indica, las variantes se pueden presentar de forma natural o se pueden elaborar por medios recombinantes o síntesis química para proporcionar características útiles y novedosas para el polipéptido de la ß-subunidad. Esto incluye prevenir la inmunogenicidad de formulaciones farmacéuticas al- prevenir la agregación dB proteínas, por ejemplo, si se usan los péptidos solubles que corresponden a la asa extracelula r . Las variaciones útiles incluyen alteración de la característica de unión a ligando. Por ejemplo, una modalidad comprende una variación en el sitio de unión que da por resultado un grado o proporción incrementada tí disminuida de la inhibición a ligando. Una Variación útil adicional en el mismo sitio puede dar por resultado una mayor o menor afinidad para el ligando. Las variaciones útiles también incluyen cambios que proporcionan afinidad por otro ligando. Otra variación útil proporciona afinidad producida o incrementada para la a-subunidad o para la unión con una a-subunidad diferente que una con la cual está asociada normalmente la ß-subunidad. - Otra variación útil proporciona una proporción o grado reducido o incrementado de activación de la a-subunidad. Otra variación útil proporciona una proteína de fusión en la cual se fusiona de manera operativa uno o más segmentos a uno o más segmentos de otra ß-subunidad. Otra variación útil proporciona un incremento o disminución en la fosforilación o glicosilación. Los aminoácidos que ,son esenciales para la función se pueden identificar por métodos conocidos en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida a la secuencia o la mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham et al., Science 244:1081-1085 (1989)) . Este último procedimiento introduce mutaciones individuales de alanina en cada residuo en la molécula. Las moléculas mutantes resultantes luego se prueban para la actividad biológica tal como unión a ligando, asociación o alteración de la a-subunidad, o corrientes de canal. Los sitios que son críticos para la unión a ligando y la modulación de la a-subunidad también se pueden determinar por análisis estructural tal como cristalización, resonancia magnética nuclear o marcado por fotoafinidad (Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992); de Vos et al., Science 255: 306-312 (1992) ) . La invención también incluye fragmentos polinucleótidos de la proteína de la ß-subunidad C7F2. Los fragmentos se pueden derivar de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO 1. Sin embargo, la invención también abarca fragmentos de las variantes de la proteína de la ß-subunidad como se describe en la presente. Los fragmentos a los cuales corresponde la invención, sin embargo, no se van a considerar como que abarcan fragmentos que se pudieron haber descrito antes de la presente invención. Los fragmentos pueden retener una o más de las actividades biológicas de la proteína, por ejemplo, la capacidad para, la unión a una a-subunidad o ligando. Los fragmentos biológicamente activos pueden comprender un dominio o porción, por ejemplo, un dominio extracelular, uno o más dominios transmembrana, el dominio de unión a la a-subunidad, o dominios intracelulares o partes funcionales de los mismos. Estos péptidos pueden ser por ejemplo, de 7, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 ó más aminoácidos de longitud. Los posibles fragmentos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación: 1) péptidos que comprenden desde aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 19 de SEC ID NO 1; 2) péptidos que comprenden desde el aminoácido 20 a aproximadamente al aminoácido 40 de SEC ID NO 1; 3) péptidos que comprenden desde aproximadamente el aminoácido 41 a aproximadamente al aminoácido 167 de SEC ID NO 1; 4) péptidos que comprenden desde aproximadamente el aminoácido 168 hasta aproximadamente el aminoácido 192; y 5) péptidos que comprenden desde aproximadamente el aminoácido 193 al aminoácido 210, o combinaciones de estos fragmentos tal como dos, tres, o cuatro dominios. Otros fragmentos incluyen fragmentos que contienen varios de estos funcionales descritos en la presente tal como sitios de fosforilación tal como aproximadamente los aminoácidos 210, 19, 14 y 167, y sitios de glicosilación alre'dedor _de los aminoácidos 56 y 93. Los fragmentos, por ejemplo, pueden extenderse en una o ambas direcciones desde el sitio funcional para abarcar 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ó hasta 100 aminoácidos. Adicionalmente, los fragmentos pueden incluir sub-fragmentos de los dominios específicos mencionados anteriormente, sub-fragmentos que retienen la función del dominio de la cual se deriva. Los fragmentos también incluyen secuencias de aminoácidos mayores de 71 aminoácidos. Los fragmentos también incluyen fragmentos antigénicos y específicamente aquellos que muestran tener un alto índice antigénico en la Figura 3. Los fragmentos específicos adicionales incluyen los aminoácidos 1 a 29, 306 a 326, y los fragmentos incluyendo pero más de los aminoácidos 1-29, 30-65, 67-252, 254-305, 306-326, 330-338, 342-347, 353-361 y 366-382. Por consiguiente, los posibles fragmentos incluyen fragmentos que definen el sitio de asociación entre los ß- y a-subunidades, los fragmentos que definen un sitio de unión a ligando, los fragmentos que definen un sitio de glicosilación, los fragmentos que definen la asociación de membrana, y los fragmentos que definen los sitios de fosforilación. Por estos, se entiende un fragmento discreto que proporciona la función pertinente o permite que se identifique la función pertinente. En una modalidad preferida, el fragmento contiene el (los) sitio (s) de la asociación de las a- y ß-subunidades. La invención también proporciona fragmentos con propiedades inmunogénicas. Éstas contienen una porción que tiene epítope de la proteína de la ß-subunidad C7F2 y variantes. Estos péptidos que tienen epítopes son útiles para formular anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de la ß-subunidad o una región o fragmento. Estos péptidos pueden contener al menos 7, al menos 14, o entre al m'enos aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos. En la Figura 3 se muestran péptidos que tienen un alto índice antigénico . Los ejemplos no limitantes de polipéptido antigénicos que se pueden usar para generar anticuerpos incluyen péptidos derivados del dominio ext acelular . La ß-subunidad que tiene el epítope y los polipéptidos se pueden producir por cualquier medio convencional (Houghten, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985)) . En la Patente de los Estados Unidos No. 4,631,211 se describe la síntesis simultánea de múltiples péptidos. Los fragmentos pueden ser discretos (no fusionados a otros aminoácidos o polipéptidos) o pueden estar dentro de un polipéptido más grande. Además, varios fragmentos pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido de. unión más grande. En una modalidad, el fragmento diseñado para la expresión en un hospedador puede tener regiones pre- y pro-pol ipépt ido heterólogas fusionadas al término amino del fragmento .de la ß-subunidad y una región adicional fusionada al término carboxilo del fragmento . La invención proporciona de este modo proteínas quiméricas o de fusión. Éstas comprenden una proteína de la ß-subunidad enlazada operativamente a una proteína heteróloga que tiene una secuencia de aminoácidos substancialmente no homologa a la proteína _ de la ß-subunidad. "Operativamente enlazada" indica que la proteína de la ß-subunidad y la proteína heteróloga se fusionan en cuadro. La proteína heteróloga se puede fusionar al N-término o C-término de la proteína de la ß-subunidad. En una modalidad, la proteína de fusión no afecta per se la función de la ß-subunidad. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión a GST en la cual se fusionan las secuencias de la ß-subunidad al C-término de las secuencias de GST. Otros tipos de proteínas de fusión incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, proteínas de fusión enzimática no por ejemplo, fusiones de beta-galactosidasa , fusiones de GAL dos-híbridos de levadura, fusiones de poly-His y fusiones de Ig. Estas proteínas de fusión, particularmente las fusiones de poly-His, pueden facilitar la purificación de la péptido recombinante de la ß-subunidad. En ciertas células hospedadoras, (por ejemplo, células hospedadoras de mamífero), la expresión y/o secreción de una proteína se pueden incrementar la usar una secuencia de señal heterólóga. Por lo tanto, en otra modalidad, la proteína de fusión contiene una secuencia de señal heteróloga en su N-término. La EP-A-0 , 464 , 533 describe proteínas de fusión que comprenden varias porciones de las regiones constantes de inmunoglobina . La Fe es útil en la terapia y diagnosis y de esta manera da por resultado, por ejemplo, propiedades farmacscinéticas mejoradas (EP-A 0,232,262) . En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, las proteínas humanas se han fusionado con porciones Fe para el propósito de ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas. Bennett et al., Journal of Molecular Recognition 8:52-58 (1995) y Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry 270, 16:9459-9471 (1995) . De esta manera, esta invención también abarca proteínas solubles de fusión que contienen un polipéptido de la ß-subunidad y varias porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de varias subclases (IgG, IgM, IgA, IgE) . Preferida como la inmunoglobulina es la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, particularmente la IgGl, donde se presenta la fusión en la región de juntura. Para algunos usos, es deseable remover el Fe después de que la proteína de fusión se ha usado para su propósito propuesto, por ejemplo cuando la proteína de fusión se va a usar como antígeno para inmunizaciones. En una modalidad particular, la parte Fe se puede remover de una manera simple por una secuencia de escisión que también se incorpora y se puede escindir con el factor Xa. Se puede producir una proteína quimérica o de fusión por técnicas normales de ADN recombinante. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias de proteínas de proteínas se ligan conjuntamente en cuadro de acuerdo con las técnicas convencionales. En otra modalidad, el gen de fusión se puede sintetizar por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores automatizados de ADN. De manera alternativa, la amplificación por PCR de los fragmentos génicos se puede llevar a cabo usando cebadores de fijación que dan origen a salientes entre dos fragmentos génicos consecutivos que se pueden fijar subsecuentemente y re-amplificar para generar una secuencia génica quimérica (ver, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1992) . Además,- muchos vectores de expresión están comercialmente disponibles, que codifican ya para una porción de fusión (por ejemplo, una proteína de GST) . Se puede clonar un ácido nucleico que codifica para la proteína de la ß-subunidad en un vector de expresión tal que la porción de fusión se enlace en cuadro a la proteína de la ß-subunidad. Otra forma de proteína de fusión es una que afecta directamente las funciones de la ß-subunidad. Por consiguiente, un polipéptido de la ß-subunidad abarcado por la presente invención en el cual se han reemplazado uno o más de los segmentos de la ß-subunidad por segmentos homólogos de otra ß-subunidad. Son posibles varias permutaciones. Los varios segmentos incluyen los dominios amino- y carboxi-terminales , intracelulares, los dos dominios transmembrana, y el dominio de asa extracelular. De manera más específica, los dominios funcionales incluyen el dominio que contiene el sitio de unión al ligando, los dominios que contienen los sitios de fosforilación, y el dominio que contiene el sitio que funciona para unir la a-subunidad o modular la activación de la ß-subunidad. Cualquiera de estos dominios o subregiones de los mismos que contienen un sitio específico se puede reemplazar con el dominio o subregión correspondiente de otra proteína de ß-subunidad, u otra proteína de subunidad que module la activación de la a-subunidad. Por consiguiente, se puede combinar uno o más de los dominios específicos o regiones funcionales con aquellos de otra subunidad que module una a-subunidad. De, esta manera, se puede formar ß-subunidades quiméricas en las cuales se ha reemplazado uno o más de los dominios nativos o subregiones . La invención también abarca canales quiméricos en los cuales está substituida una a-subunidad diferente de una con la cual se encuentra de forma natural la ß-subunidad. Por lo tanto, la ß-subunidad se puede probar para la capacidad para modular otras a-subunidades. Usando ensayos dirigidos hacia estas a-subunidades como puntos terminales, se permite la valoración de la función de la ß-subunidad. Con este tipo de construcción, se puede hacer que una a-subunidad sea sensible a un ligando por el cual no se activa normalmente. De esta manera, mediante la substitución de la ß-subunidad, un ligando que se une a esa ß-subunidad se puede usar para modular la actividad de la a-subunidad . La proteína aislada de la ß-subunidad se puede purificar a partir de células que la expresan de forma natural, tal como del cerebro, corazón, riñon, próstata, placenta, pulmones, testículos, ovario e intestino, se purifica de células que se han alterado para • expresarla (recombinante) o se sintetiza usando métodos conocidos de síntesis proteica . En una modalidad, la proteína se produce por técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de la ß-subunidad se clona en un vector de expresión, el vector de expresión introducido en una célula hospedadora y la proteína expresada en la célula hospedadora. La proteína entonces se puede aislar de la célula por un esquema apropiado de purificación usando técnicas normales de purificación de proteínas. Los polipéptidos contienen frecuentemente aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos referidos comúnmente como los 20 aminoácidos que se presentan de forma natural. .Adicionalmente, muchos aminoácidos, incluyendo los .aminoácidos terminales, se pueden modificar por procesos naturales, tal como modificaciones de procesamiento y otras pos-t ransduccionales , o por técnicas de modificación química bien conocidas en la técnica. Las modificaciones comunes que se presentan de forma natural en los polipéptidos se describen en textos básicos, artículos detallados y en la literatura de investigación, y son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por consiguiente, los polipéptidos también abarcan derivados o análogos en los cuales un residuo substituido en aminoácido no es uno codificado por el código genético, en el cual se incluye un grupo sustituyente, en el cual se fusiona el polipéptido maduro con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o en el cual se fusionan los aminoácidos adicionales al polipéptido maduro, tal como una secuencia guía o secretoria o una secuencia para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia pro-p'roteína . Las modificaciones conocidas incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una porción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótidos, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlaces de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de pi roglutamano , formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de fijación de GPI, hidroxilación , yodinación, metilación miris toilación, oxidación, procesamiento proteolítico , fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación y ubiquitinación. Estas modificaciones son bien conocidas por aquellos expertos en Xa técnica y se han descrito en mayor detalle en la literatura científica. Varias modificaciones particularmente comunes, glicosilación, unión de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, por ejemplo, se describen en muchos textos básicos tal como Proteins-S t ructure and Molecular Properties, 2a. Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993) . Muchas revisiones detalladas están disponibles en esta materia, tal como por Wold, F., Pos ttrans lat ional Covalent Modification of Proteins, B.C., Johnson, Ed., Academic Press, New York 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990) y Rattan et al., Ann N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992) . Como es bien sabido, los polipéptidos no siempre son completamente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden ramificar como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser circulares, sin o con ramificación, en general como resultado de los eventos de post-traducción, incluyendo el evento de procesamiento natural y eventos ocasionados por manipulación humana que no se presentan de forma natural. Los polipéptidos circulares, ramificados y ramificados circulares se pueden sintetizar por procesos naturales no transduccionales y por métodos sintéticos. Las modificaciones pueden presentarse en cualquier lugar en un polipéptido, incluyendo la estructura peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los términos amino o carboxi. El bloqueo del grupo amino carboxilo en un polipéptido, o en ambos, por una modificación covalente, es común en los polipéptidos que se presentan de manera natural y los sintéticos. Por ejemplo, el residuo amino-terminal de polipéptidos elaborado en E . Col i , antes del procesamiento proteolítico , casi invariablemente será N-formi lmet ionina . Las modificaciones 'pueden ser una función de cómo se elabora la proteína. Para polipéptidos recombinantes, por ejemplo, las modificaciones se determinarán por la capacidad de modificación post-t ransduccional de la célula hospedadora y las señales de modificación en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por consiguiente, cuando se desea la glicosilación, se debe expresar un polipéptido en un hospedador de glicosilación, en general una célula eucariótica. Las células de insecto llevan a cabo frecuentemente las glicosilaciones pos t- transduccionales como las células de mamífero y por esta razón, se han desarrollado sistemas de expresión de células de insecto para expresar de manera eficiente proteínas de mamífero que tienen un patrón negativo de glicosilación. Las consideraciones similares se aplican a otras modificaciones. El mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o variable grado en varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener más de un tipo de modifi cación.

Usos de polipéptidos Los polipéptidos de la ß-subunidad, así como las moléculas de ácido nucleico de la ß-subunidad, moduladores de estos polipéptidos, y anticuerpos (también referidos en la presente como "compuestos activos") de la invención son útiles en la modulación, diagnosis y tratamiento de los trastornos asociados o relacionados con la ß-subunidad, también referido como trastornos- asociados _o relacionados con C7F2. Estos trastornos incluyen, por ejemplo, trastornos del sistema nervioso central (CNS), trastornos del sistema cardiovascular, y trastornos del sistema musculoesquelético. Los trastornos de CNS incluyen de manera enunciativa y sin limitación, trastornos cognitivos y neurodegenerativos tal como la enfermedad de Alzheimer y demencias relacionadas a la enfermedad de Alzheimer (tal como la enfermedad de Pick), demencia senil, demencia de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson y otras enfermedades del cuerpo difuso de Lewy. Síndrome de Gilíes de la Tourette, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, palsia supranuclear progresiva, epilepsia, y de trastornos de función autonómica de la enfermedad de Jakob-Creut zfieldt tal como hipertensión y trastornos del sueño, y trastornos neuropsiquiátricos, tal como depresión esquizofrenia, trastorno esqui zo-afect ivo , psicosis de korsakoff, trastornos de, aprendizaje o memoria, por ejemplo, amnesia o pérdida de memoria relacionada con la edad, trastorno de déficit de atención, trastorno distímico, trastorno depresivo principal, manía, trastorno obsesivo-compulsivo, trastorno de uso de substancias ps icoact i as , ansiedad, fobias, trastorno de pánico, tal como trastorno afectivo bipolar, por ejemplo, trastorno afectivo bipolar severo (humor) (BP-I), trastorno afectivo bipolar (humor) con hipomanía y depresión mayor (BP-II), trastornos neurológicos, por ejemplo, migraña y obesidad. Los trastornos relacionados al CNS, adicionales incluyen por ejemplo, aquellos listados en el manual de Diagnóstico y Estadística de Trastornos Mentales (DSM) de la Asociación Psiquiátrica Americana, la versión más corriente de la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Los trastornos relacionados o asociados con la ß-subunidad pueden afectar de manera perjudicial el transporte de impulsos sensoriales desde -la periferia al cerebro (por ejemplo, trastornos de dolor) y/o conductancia de impulsos motores desde el cerebro a la periferia; integración de reflejos; interpretación de impulsos sensoriales (por ejemplo dolor); o procesos emocionales, intelectuales (por ejemplo, aprendizaje y memoria) o motores. Los trastornos del sistema cardiovascular incluyen de manera enunciativa y sin limitación, ateroesclerosis, lesión por reperfusión de isquemia, restenosis, inflamación arterial, remoldeo de la pared vascular, remoldeo ventricular, paso ventricular rápido, microembolia coronaria, taquicardia, bradicardia, sobrecarga de presión, flexión aórtica, ligación de arterias coronarias, enfermedad cardiaca vascular, fibrilación arterial, síndrome de QT largo, falla cardiaca congestiva, disfunción del nodo del seno, angina, falla cardiaca, hipertensión fibrilación arterial, palpitación arterial, cardiomiopatía dilatada, cardiomiopatía idiopática, infarto al miocardio, enfermedad de las arterias coronarias, espasmos de la arteria coronaria o arritmia. Los trastornos relacionados o mediados por C7F2 también incluyen trastornos del sistema musculoesquelético tal como parálisis y debilidad muscular, por ejemplo, ataxia, miotonia, y mioquimia. Los trastornos asociados o relacionados con la ß-subunidad también incluyen trastornos de tejidos en los cuales se expresa C7F2, por ejemplo, tejido de corazón, placenta, pulmón, riñones, próstata, testículos, ovario, bazo, intestino grueso y delgado, colon o timo, así como en tejidos del cerebro, incluyendo cerebelo, corteza cerebral, médula, médula espinal, glóbulo occipital, glóbulo frontal, glóbulo temporal, putanem, amígdala, caudado, cuerpo colosum, hipocampo, sustancia nigra, subtálamo y tálamo. Los polipéptidos de la ß-subunidad y las secuencias de nucleótidos que codifican para los polipéptidos encuentran uso en la modulación de una función o actividad de la ß-subunidad. Por "modulación" se propone la regulación ascendente o regulación descendente de una respuesta. De esta manera, el polipéptido de la ß-subunidad y las composiciones de ácido nucleico de la invención afectan la actividad objetivo desde una manera ya sea positiva o negativa. Las actividades asociadas o relacionadas a la ß-subunidad incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, una actividad que comprende un canal de potasio, por ejemplo, un canal de potasio en una célula neuronal o una célula muscular, asociada con la recepción, conducción y transmisión de señales por ejemplo en el sistema nervioso. Las actividades mediadas por el canal de potasio incluyen liberación de neurotransmisores, por ejemplo, dopamina o norepinefrina, de células, por ejemplo, células neuronales, modulación del potencial en descanso de las membranas, formas de onda y frecuencias de potenciales de acción, y umbrales de excitación; y modulación de procesos tal como integración de las respuestas sinápticas de sub-umbral y la conductancia de los potenciales de acción de propagación de respaldo por ejemplo en células neuronales y células musculares. Las actividades asociadas o relacionadas a la ß-subunidad también incluyen actividades que comprenden un canal de potasio en las células no neuronales, por ejemplo, células de placenta, pulmón, riñon, próstata, testículo, ovario, bazo, intestino delgado, colon o timo, tal como potencial de membrana, volumen celular y regulación del pH. En las actividades asociadas o relacionadas a la ß-subunidad incluyen actividades comprendidas en la función muscular tal como el mantenimiento del potencial de la membrana muscular, regulación de la andrelaj ación de la contracción muscular, y coordinación. Una actividad preferida de la ß-subunidad es la modulación o regulación de la a-subunidad formadora de poro de un canal de potasio, particularmente la activación de la a-subunidad. Por consiguiente, ' en un aspecto, esta invención proporciona un método para identificar un compuesto adecuado para tratar un trastorno asociado o relacionado con la ß-subunidad al poner en contacto un polipéptido de la ß-subunidad C7F2, o una célula que expresa el polipéptido del a ß-subunidad C7F2, con un compuesto de prueba y determinar si el polipéptido de la ß-subunidad C7F2 se une al compuesto de prueba, identificando de este modo un compuesto adecuado para tratar una trastorno asociado o relacionado con la ß-subunidad . Los polipéptidos de la ß-subunidad son útiles para producir anticuerpos específicos para la proteína, regiones o fragmentos de la ß-subunidad C7F2. Los polipéptidos de la ß-subunidad también son útiles en los ensayos de, selección de fármacos, en los sistemas libres de. células o basados en células. Los sistemas basados en células pueden ser células nativas, es decir, que expresen normalmente la proteína de la ß-subunidad, como una biopsia o se extiende en un cultivo celular. En una modalidad, sin embargo, los ensayos basados en células comprenden células hospedadoras recombinantes que expresan la proteína de la ß-subunidad . Los polipéptidos se pueden usar para identificar compuestos que modulan la actividad de la ß-subunidad. Tanto la proteína como las variantes y fragmentos apropiados de la ß-subunidad C7F2 se pueden usar en ' selecciones de alta producción para valorar compuestos candidatos para la capacidad para unirse a la ß-subunidad. Estos compuestos se pueden seleccionar adicionalmente contra una ß-subunidad funcional para determinar el efecto en el compuesto en la actividad de la ß-subunidad. Se pueden identificar los compuestos que activan (agonista) o inactivan (antagonistas) la ß-subunidad a un grado deseado. Los polipéptidos de la ß-subunidad se pueden usar para seleccionar un compuesto para la capacidad para estimular o inhibir la interacción entre la proteína de la ß-subunidad y una molécula objetivo que interactúa normalmente con la proteína de la ß-subunidad. El objetivo puede ser un ligando u otra subunidad de canal con la cual interactúa normalmente la proteína de la ß-subunidad (por ejemplo, la a-subunidad en el canal de potasio. El objetivo puede ser una molécula que modifique la ß-subunidad tal como por fosforilación, por ejemplo, caseína-cinasa II. El ensayo incluye los pasos de combinar la proteína de la ß-subunidad con un compuesto candidato bajo condiciones que permitan que la proteína o fragmento de la ß-subunidad interactúen con la molécula objetivo, y detectar la formación del complejo ante la proteína y el objetivo o para detectar la consecuencia bioquímica de la interacción con la proteína de la ß-subunidad y el objetivo, tal como corrientes iónicas o cualquiera de los efectos asociados- de las corrientes, fosforilación, cambio del volumen celular, mutagénesis o transformación. La invención también abarca canales quiméricos en los cuales una ß-subunidad está asociada con una a-subunidad heteróloga. De esta manera, la ß-subunidad se puede usar para modular las a-subunidades heterólogas, como un objetivo para la selección de fármacos y en la diagnosis y tratamiento. Los compuestos candidatos incluyen por ejemplo 1) pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas (por ejemplo, moléculas obtenidas de colecciones de secuencias de ADN de productos naturales y de combinación); 2) fosfopépt idos (por ejemplo, miembros de colecciones de secuencias de ADN de fosfopépt idos dirigidos, aleatorios y parcialmente degenerados, ver por ejemplo, Songyang et al., Cell 72:767-778 (1993)); 3) anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, ant i-idiot ípicos , quiméricos y de cadena individual así como Fab, F(ab')2, fragmentos de la colección de secuencias de ADN de expresión de Fab, y fragmentos de unión a epítope de los anticuerpos; y 4) péptidos tal como péptidos solubles, incluyendo péptidos de fusión prolongados a Ig y miembros de las colecciones de secuencias de ADN de péptidos aleatorios (ver por ejemplo, Lam et al., Nature 354:82-84 (1991); Houghten et al., Nature 354:84-86 (1991) y colecciones de secuencias de ADN moleculares derivadas de química de coplbinación elaboradas de aminoácidos de configuración de D- y/o L. La invención proporciona otros puntos terminales para identificar compuestos que modulan (estimulan o inhiben) la actividad de la ß-subunidad. Estos ensayos comprenden típicamente un ensayo de eventos en la canalización que indica la actividad de la ß-subunidad. Un ensayo preferido comprende la activación de la a-subunidad. Los ensayos que permiten la valoración de la actividad de la ß-subunidad se conocen por aquellos expertos en la técnica y se pueden encontrar por ejemplo en McManus et al. , (1995) , Kanaus et al., (1996), Kanaus et al., (1994), Meera et al., y Oberst et al., citado anteriormente. También se pueden seleccionar compuestos de unión y/o • modulación (de activación o inhibición) al usar las proteínas quiméricas de la subunidad en la cual la región de unión a la a- subunidad o unión a ligando se reemplaza por una región heteróloga. Por ejemplo, se ruede usar una región de unión a la a-subunidad que interactúa con una diferente a-subunidad qae aquella que se reconoce por la ß-subunidad nativa. Por consiguiente, está disponible un diferente en ayo de punto terminal. Alternativamente, se pueden reemplazar una o dos regiones transmembrana con porciones transmembrana específicas a una célula hospedadora que es diferente de la cé± la hospedadora nativa de la cual se deriva la ß-subunidad nativa. Esto permite que el ensayo se realice en otra diferente de la célula hospedadora original. Alternativamente, la región de unión al ligando se puede reemplazar .por una región que se une a un ligando diferente, permitiendo de este modo un ensayo para compuestos de prueba que interactúan con la región de unión al ligando heterólogo pero que aún provocan la función de canalización, incluyendo la activación de la a-subunidad . Los polipéptidos de la ß-subunidad también son útiles en los ensayos de "nión por competición en métodos diseñados para descubrir compuestos que interactúan con la ß-subunidad. De esta manera, se expone un compuesto a un polipéptido de la ß- subunidad bajo condiciu.ies que permiten que el compuesto se una o intetactúe de otro modo con el polipéptido. También __e adiciona la mezcla del polipéptido de la ß-subuni'.'a de competencia. Si el compuesto de prueba interactúa con el polipéptido de la ß-subunidad de c apetencia, disminuye la cantidad ae complejo formada o la actividad del objetivo de la ß-subunidad. Este tipo de ensayo es particularmente útil en casos en los cuales se buscan compuestos que ínter-actúen cor regiones específicas de la ß-subunidad. De esta manera, el polipéptido que compite con la región objetivo de la ß-subunidad se diseña para contener secuencias peptídicas que corresponden a la región de interés . También es útil una ß-subunidad para valorar la función de una a-subunidad dada. De esta manera, la alteración en las corrientes de canal, número de receptores, transformación de células, o cualquier otro punto terminal biológico se puede valorar usando .la ß-subunidad de la presente invención en ensayos basados en células o libres de células con una a-subunidad dada. La mutación en la a-subunidad se puede detectar por cualquiera de los varios puntos terminales. Además, las mutaciones en la ß-subunidad que complementan (es decir, corrigen) las mutacione° en la a-subunidad se puede identificar a través de los ensayos basados en células o libres de células. Estos ensayos aún se pudieran realizar a nivel del organismo, como con un animal transgénico (ver posteriormente) . Para realizar los ensayos de selección de fármacos libres de células, es deseable inmovilizar ya sea la proteína de la ß-subunidad, o fragmento, o su molécula objetivo para facilitar la separación de los complejos de las formas no vueltas complejas de una o ambas de las proteínas, así como para acomodar la automatización del ensayo. Se pueden usar técnicas para inmovilizar proteínas en matrices en los ensayos de selección de fármacos. En una . modalidad, se puede proporcionar una proteína de fusión que adiciona un dominio que permite que la protoína se una a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión de glutat iona-S-trans ferasa/flh385 se pueden adsorber sobre cuentas de glu at iona-safarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtítulo dérivat izadas con glutationa, que luego se combinan con lisados celulares (por ejemplo, marcados con 35S) y el compuesto candidato, y la mezcla se incuban bajo condiciones' conductoras en la formación del complejo (por ejemplo, condiciones fisiológicas para sal y pH) . Después de la incubación, se lavan las cuentas para remover cualquier marca no unida, y la matriz inmovilizada y la radiomarca se determinan directamente, o en el sobrenadante después de que disocian los complejos. De manera alternativa, los complejos se pueden disacociar de la matriz, se separan por SDS-PAGE, y el nivel de la proteína de unión a la ß-subunidad encontrado en la reacción de las cuentas se codifica del gel usando técnicas normales de electroforesis. Por ejemplo, se puede inmovilizar ya sea el polipéptido o su molécula objetivo utilizando la conjugación de biotina y estreptavina usando técnicas bien conocidas en la técnica. De manera alternativa, los anticuerpos reactivos con la proteína pero que no interfieren con la unión de la proteína a su molécula objetivo se pueden derivatizar a las cavidades de la placa, y la proteína se atrapa en las cavidades por conjugación de anticuerpos. La preparación de una proteína de unión a la ß-subunidad y un compuesto candidato se incuban en las cavidades que presentan la proteína de la ß-subunidad y se puede cuantificar la cantidad del complejo atrapado en la cavidad. Los métodos para detectar estos complejos, además de aquellos descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GTS, incluyen inmunodetección de complejos usando anticuerpos reactivos con la molécula objetivo de la pie-.? eina de la ß-subunidad, cuando son reactivos con la proteína de la ß- subunidad y compiten con la molécula objetivo; así como ensayos enlazados a enzimas que dependen de la detección de una actividad enzimática asociada con la molécula objetivo. Los moduladores de la actividad de la proteína de la ß-subunidad identificados de acuerdo a estos ensayos de selección de fármacos se pueden usar para tratar un sujeto con un trastorno mediado por la ß-subunidad. Estos métodos de tratamientos incluyen los pasos de administrar los modulares de la actividad proteica en una composición farmacéutica como se describe en la presente, a un sujeto en necesidad de este tratamiento. Los polipéptidos de la ß-subunidad también son útiles para proporcionar un objetivo para la diagnosis de una enfermedad o predisposición a la enfermedad mediada por la proteína de la ß-subunidad. Por consiguiente, se proporcionan métodos para detectar la presencia, o niveles de, la proteína de la ß-subunidad en una célula, tejido u organismo. El método comprende poner en contacto una muestra biológica con un compuesto capaz de interactuar con la proteína de la ß-subunidad tal que se pueda detectar la interacción. Un agente para detectar la proteína de la ß-subunidad es un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a la proteína de la ß-subunidad.

Una muestra biológica incluye tejidos, células y sc fluidos biológicos aislados a partir de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presences dentro de un sujeto. La proteína de la ß-subunidad también proporciona un objetivo para la diagnosis de la enfermedad activa, o predisposición a enfermedad, en un paciente que tiene una proteína variante de la ß-subunidad. De esta manera, la proteína de la ß-subunidad se puede aislar de una muestra biológica, valorar para la presencia de una mutación genética que da por resultado una proteína anormal de la ß-subunidad. Esto incluye la substitución, supresión, inserción, re-arreglo de aminoácidos (como resultado de los eventos de empalme anormales), y la modificación post-t ransduccional inapropiada. Los métodos analíticos incluyen movilidad electroforétic alterada, digestión con péptido tríptico alterado, actividad alterada de la ß-subunidad en un ensayo basado en células o libre de células, alteración en el ligando, a-subunidad o patrón de unión a anticuerpo, punto isoeléctrico alterado, secuenciación directa de aminoácidos y cualquiera otra de las técnicas de ensayo conocidas útiles para detectar las mutaciones en una pr^teína. Las técnicas i n vi tro para la detección de la proteína de la ß-su unidad incluy ensayos inmunoabsorbentes enlazado a enzimas (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. De manera alternativa, la proteína se puede detectar in vi vo en un sujeto al introducir en el sujeto un anticuerpo anti-ß- subunidad, marcado. Por ejemplo, al anticuerpo se le puede marcar con un marcador radioactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto se puede detectar por técnicas norm,ales de formación de imágenes. Particularmente .útiles en los métodos que detectan la variante alélica de una proteína de la ß-subunidad expresada en un sujeto y métodos para detectar los fragmentos de una proteína de la ß-subunidad en una muestra'. Los polipéptidos de la ß-subunidad también son útiles en los análisis farmacogenómicos . Los farmacogenómicos tratan con variaciones hereditarias clínicamente , significativas en respuesta a los fármacos debido a la disposición alterada de fármacos y acción anormal en personas afectadas. Ver, por ejemplo, Eichelbaum, M. (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23 ( 10 -11 ) : 938 - 985 y Linder, M.W. (1997) Clin. Chem. 43 ( 2 ) : 254 -266. Los resultados clínicos de estas variaciones dan por resultado toxicidad severa de fármacos terapéuticos en ciertos individuos o falla terapéutica de fármacos en ciertos individuos como resultado de la variación individual en el metabolismo. De esta manera, el genotipo del individuo puede determinar la manera en que actúa un compuesto terapéutico en el cuerpo o en la manera en que el cuerpo metabolice el compuesto. Además, la actividad de las enzimas de metaboli zación de los fármacos afectan tanto la intensidad como la duración de la acción del fármaco. _ De esta manera, los farmacogenómicos del individuo permiten la selección de compuestos efectivos y dosis efectivas de estos compuestos para el tratamiento profiláctico o terapéutico basado en el genotipo del individuo. El descubrimiento de los polimorfismos genéticos en algunas enzimas de metabolización de fármacos ha explicado porqué algunos, pacientes no obtienen los efectos espéralos de los fármacos, muestra cómo un efecto exagerado al fármaco o experimentan toxicidad seria de dosis normales de fármacos. Los polimorfismos se pueden expresar en el fenotipo del met abolí zador extensivo y el fenotipo del metabolizador pobre. Por consiguiente, el polimorfi srto genético puede conducir a variantes alélicas de la proteína de la proteína de la ß-subunidad en la cual una o más las funciones de la ß-subunidad en una población es diferente de aquellas en otra población. Los polipéptidos permiten de este modo que un objetivo acierte una predisposición genética que puede afectar la modalidad del tratamiento. De esta maneía, en un tratamiento basado en ligandos, por ejemplo, el poliraoiíisrao puede originar sitios que son más o menos activos de la unión a ligando, y la activación de canal. Por consiguiente, se puede modificar la elece-ión o dosis de ligando para aumentar al máximo el efecto terapéutico dentro de una población dada qu contiene el polimorfismo. Como una alternativa a la genotipificación , se podrían identificar los polipéptidos polimórficos específicos . Los polipéptidos de la ß-subunidad también son útiles para monitor car los efectos terapéuticos durante los ensayos clínicos y otro tratamiento. De esta manera, la efectividad terapéutica de un agente que se ha diseñado para incrementar o disminuir la expresión génica, niveles de proteína o actividad de la ß-subunidad se puede monitorear durante el transcurso del tratamiento usando los polipéptidos de la ß-subunidad como un objetivo de punto terminal. Los polipéptidos de la ß-subunidad también son útiles para tratar trastornos asociados con la ß-subunidad. Por consiguiente, los métodos para el tratamiento incluyen el uso de la subunidad soluble o fragmentos de la pioteín'a de la subunidad que compiten por moléculas que interactúan con las porciones extracelular:..3 de la subunidad. Estas ß-subunidades o fragmenl. s pueden tener una mayor afinidad para la molécula, para proporcionar competición efectiva.

Anticuerpos La invención también proporciona anticuerpos que se unen selectivamente a la proteína de la subunidad y sus variantes y fragmentos. Un anticuerpo sé considera que solo es selectivamente, aún si también se une a otras proteínas que no son substancialmente homologas con la proteína de la ß-subunidad. Estas otras proteínas comparten la homologia con un fragmento o dominio de la proteína de la ß-subunidad. Esta conservación en regiones específicas da origen de anticuerpos que se unen tanto a proteínas en virtud de la secuencia homologa. En este caso, se entenderá que el anticuerpo que se una a la proteína de la subunidad es aún selectivo. En la Figura 3 se muestran las regiones que muestran un alto índice antigérico. Se preparan de manera preferente anticuerpos a partir de estas regiones o de iragmentos discretos en estas regiones. Sin embaigo, se pueden preparar anticuerpos de cualquier región del pépti o como se describe en la presente. Los anticuerpos p .den ser policlonales o monoclonales. Se puede USÚG un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo , (por ejemplo, Fab o F(ab')2) . La detección se puede facilitar por el acoplamiento (es decir, ligación física) del anticuerpo a una substancia detectable. Los ejemplos de substancias detectables incluyen varias enzimas, grupos , prostáticos, materiales fluorescentes, materiales luminescentes , materiales bioluminescentes , y material radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o acet ilcolina-est erasa ; los ejemplos de complejos adecuados del grupo prostético incluyen es traptavidina/biotina y avidina/biotina ; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona , fluoresceína, isotiocionat o de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina , fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina ; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminescentes incluyen luciferasa, luciferina y aequerin, y los ejemplos del material radioactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S ó 3H. Para generar anticuerpos, se usa un polipéptido aislado de la ß-subunidad como un inmunógeno para generar anticuerpos usando técnicas normales para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Se pueden usar ya sea la proteína de longitud completa o el fragmento peptídico, antigénico. Los fragmentos que tienen un alto índice antigénico se muestran en la Figura 3. Un fragmento preferido produce un anticuerpo que disminuye o impide compeletamente la asociación entre las a- y ß-subunidades. Por consiguiente, un anticuerpo preferido es uno que disminuye o inhibe completamente la asociación entre las dos subunidades. Un fragmento antigénico comprenderá típicamente al menos 7 residuos contiguos de aminoácido. El péptido antigénico puede comprender sin embargo al menos 12, al menos 14 residuos de aminoácido, al menos 15 residuos de aminoácido, al menos 20 residuos de aminoácido, o al menos 30 residuos de aminoácido. En una modalidad, los fragmentos corresponden a regiones que s<= localizan en la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrófilas. Se puede derivar una preparación inmunogénica apropiada a partir de un?, proteína nativa, recombinantemente expresada o péptidos químicamente sintetizados.

Usos de anticuerpos Los anticuerpos se pueden usar para aislar una proteína de la ß-sabunidad por técnicas normales, tal como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Los anticuerpos que facilitan la purificación de la proteína natural de la ß- subunidad a partir de células y de la proteína de la ß-subunidad recombinantemente producida expresada en células hospedadoras. Los anticuerpos son útiles para detectar la presencia de la proteína de la ß-subunidad en células o tejidos para determinar el patrón de expresión de la ß-subunidad entre varios tejidos en un organismo y durante el transcurso del desarrollo normal . Los anticuerpos se pueden usar para detectar la proteína de la ß-subunidad ín si t u , i n vi tro , o en lisado celular o sobrenadante a fin de evaluar la abundancia y patrón de la expresión. Los anticuerpos se pueden usar para valorar la distribución anormal de tejido o expresión anormal durante el' desarrollo. La detección de anticuerpos de fragmentos en la proteína de la ß-subunidad de longitud completa se puede usar para identificar el recambio metabólico de la ß-subunidad. Además, los antic ícipos se pueden usar para valorar la expresión d la ß-subunidad en estados de enfermedad tal como en etapas activas de la enfermedad o en un,' individuo con una predisposición hacia la enfermedad relacionada a la función de la ß-subunidad. Cuando un trastorno se provoca por una distribución i iapropiada de tejido, la expresión en desarrollo, b nivel de expresión de la proteína de la ß-subunidad, el anticuerpo se puede preparar contra la proteína normal de la ß- subunidad. Si un trastorno se caracteriza por una mutación específica en la proteína de la ß- subunidad, se pueden usar anticuerpos específicos para esta proteína mutante para valorar la presencia de la proteína mutante específica de la ß-subunidad . Los anticuerpos también se pueden usar para valorar ubicaciones subcelulares normales y anormales de células en varios tejidos en un organismo . Se pueden desarrollar anticuerpos contra la ß-subunidad completa o porciones de la ß-subunidad, por ejemplo, las regiones intracelulares, la región extracelular, las regiones transmembranas, y los sitios funcionales específicos tal como el sitio de unión a ligando, el sitio de interacción con la a-subunidad, o sitios que se fosforilan, por ejemplo, por caseína-cinasa II. Los usos de diagnósticos se pueden aplicar, no solo en la prueba genérica, sinc también en el monitorco de una modalidad de tratamiento. Por consiguiente, donde el tratamiento se propone finalmente en la corrección del nivel de expresión de la ß-subunidad o la presencia de ß-subunidades anormales y distribución anormal de tejido o expresión de desarrollo, los anticuerpos dirigidos contra la ß-subunidad o fragmentos pertinentes se pueden usar para monitorear la eficacia terapéutica. Adicionalmente, los anticuerpos son útiles en el análisis farmacogenómico . De esta manera, los anticuerpos preparados contra las protex.nas polimórficas de la ß-sabunidad se pueden usar para identificar individuos que requieren modalidades modificadas de tratamiento. Los anticuerpos también son útiles como herramientas de diagnóstico como un marcador inmunológico para una proteína anormal de la ß-subunidad analizada por movilidad electroforética, punto isoeléctrico, digestión de péptidos trípticos, y otros ensayos físicos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los anticuerpos también son útiles para la tipificación de tejido. De esta manera, donde hubo una proteína específica de la ß-subunidad se ha correlacionado con la expresión en un tejido específico, los anticuerpos que son específicos para esta proteína de la ß-subunidad se pueden usar para identificar un tipo de tejido. Los anticuerpos también son útiles en la identificación forense. Por consiguiente, donde se ha correlacionado un individuo con un polimorfismo genético específico que da por resultado una proteína polimórfica específica, se puede usar un anticuerpo específico para la proteína polimórfica con la finalidad de identificación. Los anticuerpos también son útiles para inhibir la función de la subunidad, por ejemplo, bloquear la unión a ligando o la unión a la a- subunidad y/o activación de la misma. La función de la subunidad que comprende la asa extracelular es particularmente responsable para la inhibición del anticuerpo. Estos usos también se puedei. aplicar en un contexto terapéutico en el cual -.? tratamiento comprende la inhibición de la función de la subunidad. Se pueden preparar anticuerpos contra fragmentos específicos que contienen sitios requeridos para la función o contra la ß-subunidad intacta asociada con una célula. La invención también abarca equipos para usar anticuerpos para detectar la presencia de una proteína de una ß-subunidad en una muestra biológica. El equipo puede comprender anticuerpos tal como un anticuerpo marcado o marcable y un compuesto o agente para detectar la oroteína de la ß-subunidad en una muestra, biológica. Un medio para determinar la cantidad de la proteína de la ß-subunidad en la muestra, un medio para comparar la cantidad de la proteína de la ß-subunidad en la muestra con una norma. El' compuesto o agente se pueden empacar en un recipiente adecuado. El equipo puede comprender además instrucciones para usar el equipo para detectar la proteína de la ß- subunidad .

Polinucleót dos La secuencia de nucleótidos en S11C ID NO 2 se obtuvo al secuenciar 'el ADNc en longitud completa, humano. El ADNc específicamente descrito comprende la región de codificació , las secuencias no traducidas en 5' y 3' (SEC ID NO 2) . En una modalidad, el ácido nucXico de la subunidad comprende solo la región de codificación. El ADNc de la ß-sabunidad C7F2 humana es de aproximadamente 1737 nucleótidos de longitud y codifica para una proteína ce longitud completa que aproximadamente 210 residuos de aminoácidos de longitud. El ácido nucleico se expresa en cerebro, corazón, riñon, placenta, pulmón, próstata, testículos, ovario, e intestino delgado y grueso. En el análisis estructural de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO 1 se proporciona en la Figura 4, una gráfica de hidropatía. La figura muestra la estructura putativa de los dos dominios transmembrana, el asa extracelular y los dos dominios intracelulares. . Como se usa en la presente, el término "dominio transmembrana" (o "región" o "segmento") se refiere a una porción estructural de aminoácidos (_ue incluye una hélice hidrófoba que abarca la membrana plasmática. La invención proporciona polinucleótidos aislados que codifican para una proteína de la ß- subunidad C7F2. El término "polinucleótido de la ß-subunidad C7F2" o "ácido nucleico de la ß- subunidad C7F2" se refiere a la secuencia mostrada en SEC ID NO 2. El término "polinucleótido de la ß-subunidad" o "ácido nucleico de la ß-subunidad" incluye adicionalmente variantes y fragmentos del polinucleótido de C7F2. Un ácido nucleico "aislado" de la ß-subunidad es uno que se separa de otro ácido nucleico presente en la fuente natural del ácido nucleico de la ß-subunidad. De manera preferente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el ácido nucleico. Sin embargo, pueden haber algunas secuencias de nucleótidos de flanqueo, por ejemplo, de hasta aproximadamente 5KB. El punto importante es que el ácido nucleico se aisle de secuencias de flanqueo tal que se pueda someter a las manipulaciones específicas descritas en la presente tal como expresión recombinante, preparación de sondas y cebadores, y otros usos específicos a las secuencias de ácido nucleico de la ß-subunidad. Además, una molécula "aislada" de ácido nucleico, tal como una molécula de ADNc, puede estar substancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinan es, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan de manera química. Sin embargo, la molécula de ácido nucleico se puede fusionar a otras secuencias de codificación o reguladoras y se considera aún aislada . Por ejemplo, las moléculas re ombinantes de ADN contenidas en un vector se consideran aisladas. Los ejemplos adicionales de las moléculas aisladas de ADN incluyen moléculas de ADN recombinante mantenidas en _élulas hcspedadoras heterólogas o moléculas de ADN purificadas (ya sea parcial o substancialmente) en solución. Las moléculas aisladas de ARN incluyen transcriptos de ARN í n vi vo o in vi t ro de las ...oléculas aisladas de ADN de la presente invención. Las moléculas aisladas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención incluyen adicionalmente moléculas producidas de manera sintética. Los polinu'. leót idos de la ß-subunidad pueden codificar paca la proteína madura más los aminoácidos amino-- o carboxi-terminales , adicionales, o aminoácidos interiores al polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica, por ejemplo) . Estas secuencias pueden jugar un papel en el procesamiento de una proteína a partir de un precursor a una forma madura, facilitan el tráfico de proteínas, prolongan o acortan la vida media de la proteína o facilita la manipulación de una proteíná para el ensayo o producción, entre otras cosas. Como es en general el caso in si t u , los aminoácidos adicionales se pueden procesar lejos de la proteína madura por enzimas celulares. Los polinucleótidos de la ß-subunidad incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, la secuencia que codifica para el péptido maduro solo. La secuencia ?-?e codifica para el polipéptido maduro y las secuencias de codificación adicionales, tal como una secuencia guía o secretoria (por ejemplo, una secuencia pre-pro ó pro-proteína, la secuencia que codifica para el polipéptido maduro, con o sin las secuencias adicionales de codificación, más las secuencias adicionales de no codificación, por ejemplo intrones y secuencias de no codificación en 5' y 3' tal como en las secuencias transcritas pero no traducidas que juegan un papel en la trascripción, procesamiento de ARNm (incluyendo señales de empalme y poliadenilación), unión a ribosoma y estabilidad del ARNm. Además, el polinucleótido se puede fusionar a una secuencia marcadora que codifica por ejemplo, para un polipéptido que facilita la purificació . Los polinucleó idos de la ß-subunidad pueden estar en la forma de ARN, tal como ARNm, o en la forma de ADN, incluyendo ADNc y ADN genómico obtenido por clonación o producido por técnicas de síntesis química o por una combinación de las mismas. El ácido nucleico,, especialmente el ADN, puede ser de doble hebra o d,e hebra individual. El ácido nucleico de hebia individual puede ser la hebra de codificación (hebra homosentido) o la hebra de no codificación (hebra antisentido) . Un ácido nucleico de la ß-subunidad comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID NO 2, que corresponde al ADNc de cerebro fetal humano . La invención proporciona adicionalmente polinucleótidos variantes de la subunidad, y fragmentos de los mismos, que difieren de la secuencia de nucleótid'js mostrada en SEC ID NO 2 debido a la degeneración del código genético y que codifican de esta manera para la misma proteína como aquella codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en '"¡EC ID NO 2. La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico de Id ß-subunidad que codifican para los polipéptidos variantes descrieos en la presente. Estos polinuc leótidos pueden presentarse de forma natural tal cono variantes aiélicas (mxsmo locus), homólogos (difeiente locus), y ortólogos (diferentes organismos), no 'se pueden construir por métodos de ADN recombinante o por síntesis química.

Estas variantes que no se presentan de forma natural se puede elaborar por técnicas de mutagénesis, incluyendo aquellas aplicadas a los polinucleótidos, células u organismos. Por consiguiente, como se analiza anteriormente, las variantes pueden contener substituciones, supresiones, inversiones • e inserciones de nucleótidos. La variación puede presentarse en cualquiera o ambas de las regiones de codificación y no-codificación. Las variaciones pueden producir substituciones tanto conservadoras como no conservadoras de aminoácidos. Los ortólogos, homólogos y variantes alélicas se pueden identificar usando métodos bien conocidos en la técnica. Estas variantes comprenden una secuencia . de nucleótidos que codifica para una ß-subunidad que es al menos cerca de 55-60 %, típicamente al menos cerca de 70-75%, en forma más típica al p -iios cerca 80-85 %, y en la forma más típica al menes cerca de 90-95 % ó más homologa a la secuencia de nucleótido-; mostrada en SEC ID NO 2 ó un fragmento de esta secuencia. Estas moléculas de ácido nucleico se pueden identificar fácilmente como que son capaces de hibridarse bajo condiciones severas, en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID NO 2 o un fragmento de la secuencia. Se entiende que la hibridación severa no indica' homología substancial donde es debido a la homología substancial, tal como secuencias de poly A, las secuencias comunes a todas o la mayoría de las proteínas, todas las ß-subunidades del canal de K+ o todas las ß-subunidades de los canales. Además, se entiende que las variaciones no incluyen ninguna de las secuencias de ácido nucleico que se pueden haber descrito antes de la invención. Como se usa en la1 presente, el término "híbrida bajo condiciones severas" se propone para describir condiciones para la hibridación y lavado bajo lo cual las secuencias de nucleótidos que codifican para una ß-subunidad al menos 55-60 % homologa entre sí permanecen típicamente hibridadas entre sí. Las condiciones pueden ser tal que las secuencias al menos aproximadamente 65 %, al menos de aproximadamente 70 %, o al menos aproximadamente 75 % ó más homologas entre sí, se mantiene típicamente hibridadas entre, sí. Estas condiciones severas se conocen por aquellos expertos en la técnica y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo de condiciones de hibridación severas son hibridación en 6X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguí 'o por uno o más lavados en 0.2 X SSC, SDS al 0.1% a 50-65°C. En una modalidad, una molécula aislada de ácido nucleico de la ß-subunidad que híbrida bajo condiciones severas a la secuencia de S?C ID NO 2 corresponde a una molécula de ácido nucleico que se presenta de forma natural. Como se usa en la presente, una molécula de ácido nucleico que "se presenta de forma natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se presenta en la naturaleza (por ejemplo, codifica para una proteína natural) . La invención también proporciona polinucleótidos que comprenden un fragmento de los polinucleótidos de la "ß-s'ubunidad de longitud completa. El fragmento puede ser de hebra doble o individual y puede comprender ADN o ARN. El fragmento se puede derivar de ya sea la secuencia de codificación o no- codi ficación , por ejemplo, la secuencia reguladora trascripcional . El ácido nucleico de la región de codificación de la ß-subunidad es de al menos 216 nucleótidos de longitud e híbrida bajo condiciones severas a la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO 2. Los fragmentos también incluyen aquellas secuencias de ácido nucleico que codifican para los dominios específicos descritos en la presente. Los fragmentos también incluyen ácidos nucleicos que codifican para la secuencia completa de codificación. Los fragmentos también incluyen ácidos nucleicos que codifican para la proteína madura. Los fragmentos también incluyen secuencias de ácido nucleico que cocifican para dos o más dominios. Los fragmentos también incluyen secuencias de ácido nucleico que corresponden a los aminoácidos en sitioa funcionales específicos descritos en la presente. Los fragmentos incluyen adicionalmente secuencias de ácido nucleico que codifican para una porción de la secuencia de aminoácidos descrito en la presente, pero que incluyen adicionalmente secuencias de nucleótidos de franqueo en las regiones 5' y/o 3' . Otros fragmentos pueden incluir subfragmentos de los dominios específicos cu sitios descritos en la presente. Los fragmentos también incluyen secuencias de ácido nucleico que corresponden a las secuencias específicas de aminoácidos descritas anteriormente o fragmentos de las mismas. En estas modalidades, de ácido nucleico es de al menos 20, 30, 40, 50, 100, 250 ó 50 nucleótidos de longitud.

Los fragmentos de ácido nucleico, de acuerdo con la presente invención, no se van a considerar como que abarcan aquellos fragmentos que pueden haber sido descritos antes de la invención. Sin embargo, se entiende que un fragmento de una ß-subunidad incluye cualquier secuencia de nucleótidos que no incluya el gen completo. Los fragmentos de ácido nucleico de la ß-subunidad incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido que comprende un dominio intracelular amino-terminal que incluye los residuos de aminoácidos desde 1 a aproximadamente 19, um polipéptido que comprende el primer dominio transmembrana (residuos de aminoácido desde aproximadamente 20 a aproximadamente 40), un polipéptido que compr-ende el dominio de asa extracelular (residuos de aminoácidos desde aproximadamente 41 a aproximadamente 167), un polipéptido que comprende el segundo dominio transmembrana (residuos de aminoácidos de aproximadamente 168 a aproximadamente 192) y un polipéptido que comprende el dominio intracelular carboxi-terminal (residuos de aminoácidos de aproximadamente 193 a 210) . Donde la ubicación de los dominios se ha predicho por análisis de computadora, un experto en la técnica apreciará que los residuos de aminoácidos que constituyen estos dominios pueden variar dependiendo de los criterios usados para definir los dominios. La invención también proporciona fragmentos de ácido nucleico de la ß-subunidad que codifican para las regiones que tienen el epítope de las proteínas de la proteína de la ß-subunidad descritas en la presente. Las secuencias aisladas de polinucleótido de la ß-subunidad, y especialmente fragmentos, son útiles como sondas y cebadores de ADN. Por ejemplo, la región de codificación de un gen de ß-subunidad se puede aislar usando la secuencia conocida de nucleótidos para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Una zona marcada luego se puede usar para seleccionar una colección de secuencias de ADN de ADNc, una colección de secuencias de ADN de ADN cenómica, o un ARNm para aislar el ácido nucleico que corresponde a la región de codificación. Además, se pueden usar cebadores en reacciones de P.CR para clonar regiones específicas de los genes de la ß-subunidad. Una sonda/cebador comprende típicamente oligonucleótido substancia lmer. te purificado. El oligonucleótido comprende típicamente una región de secuencia de nucleótidos, como se describe anteriormente, que hibrida bajo condiciones severas a al menos aproximadamente 20, típicamente aproximadamente 25, de manera más típicamente aproximadamente 40, 50, ó 75 " ueleótidos consecutivos de SEC ID NO 2, hebra homosentido o antisentido, u otros polinucleótidos de la ß- subunidad. Una sonda comprende adicionalmente una marca, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, enzima, o co-factor enzimático.

Usos de polinucleótidos Los polinucleótidos de la ß-subunidad son útiles como una sonda de hibridación para el ADNc y el ADN genómico para aislar un ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican para el polipéptido descrito en SEC 'ID NO 1 y para aislar el ADNc y clones génicos que corresponden a variantes que producen el mismo polipéptido mostrado en SEC ID NO 1 ó las otras va'riantes descritas en la presente. Se pueden usar variantes del mismo tejido y organismo del cual se aisló el polipéptido mostrado en SEC ID NO 1, diferentes tejidos del mismo organismo o de diferentes organismos. Este método es útil para aislar genes de ADNc que se controlan en desarrollo y por lo tanto se pueden expresar en el mismo tejido en diferentes puntos en el desarrollo de un organismo. La sonda puede corresponder a cualquier secuencia a lo largo de la longitud completa del gen que codifica para la ß-subuni dad . Por consiguiente, se puede derivar de las regiones de no codificación en 5', la región de codificación, como se específica anteriormente y regiones de no codificación de 3' . Las sondas de ácido nucleico pueden ser por ejemplo, el ADNc de longitud completa de SEC ID NO 1, o el fragmento de la misma, como se describe anteriormente. La sonda puede ser un oligonucleótido de al menos 20, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente bajo condiciones severas a ARNm o ADN. Los fragmentos de los polinucleótidos descritos en la presente también son útiles para sintetizar grandes fragmentos o polinucleótidos de longitud completa descritos en la presente. Por ejemplo, se puede hibridar un fragmento a cualquier porción de un ARNm y se puede producir un ADNc más grande o de longitud completa. Los fragmentos también son útiles para sintetizar moléculas antisentido de la longitud y secuencia deseadas. Los polinucleótidos de la ß-subunidad también son útiles como cebadores para PCR para amplificar cualquier región dada de un polinucleótido de la ß-subunidal. Los polinucleótidos de la ß-subunidad también son útiles para construir vectores recombinantes. Estos vectores incluyen vectores de expresión que expresan una porción de, o todo de, los polipéptidos de la ß-subunidad. Los vectores también incluyen vectores de inserción, usados para integrarse en otra secuencia de polinucleótido, tal como en el genoma celular, para alterar in si t u la expresión de genes de la ß-subunidad y productos génicos. Por ejemplo, una secuencia de codificación endógena de la ß-subunidad se pueden reemplazar vía recombinación homologa con toda o parte de la región de codificación que contiene una o más mutaciones específicamente introducidas. Los polinucleótidos de la ß-subunidad también son útiles como sondas para determinar las posiciones cromosómicas de los polinucleótidos de la ß-subunidad por medio de métodos de hibridación in si t u . Las sondas de los polinucleótidos de la ß-subunidad también son útiles para determinar patrones de la presencia del gen que codifica para las ß-subunidades y sus variantes con respecto a la distribución del tejido, por ejemplo, si se ha presentado la duplicación génica y si la duplicación se presenta en todos o un subconjunto de tejidos. Los genes se pueden presentar de forma natural o pueden haber cido introducidos en una célula, tejido u organismo de forma exógena. Los polinucleótidos de la ß-subunidad también son útiles para diseñar ribozimas que corresponden a todos, o parte del ARNm producido de genes que codifican para los polinucleótidos descritos en la presente . Los polinucleótico.s de la ß-subunidad también son útiles para construir células hospedadoras que expresen una parte, o todos los polinucleótidos y polipéptidos de la ß-subunidad. También, los polinucleótidos de la ß- subunidad son útiles para construir animales transgénicos que expresen todos, o una parte de los polinucleótidos o polipéptidos de la ß-subunidad. Los polinucleótidos de la ß-subunidad también son útiles para .elaborar vectores que expresen parte, o todo, de los polipéptidos de la ß-subunidad. Los polinucleótidos de la ß-subunidad también son útiles como sonda- de hibridación para determinar el nivel de la expresión del ácido nucleico de la ß-subunide '. Por consiguiente, las sondas se pueden usar para detectar la presencia de, o para determinar los niveles de el ácido nucleico de la ß-subunidad en células, tejidos y en organismos. El ácido nucleico cuyo nive_ se determina puede ser ADN o ARN. Por consiguiente, se pueden usar sondas que corresponden a los polinucleótidos descritos en la presente para valorar el número de copia génica en una célula dada, tejido u organismo. Esto es particularmente pertinente en casos en los cuales exista una amplificación de los genes de ia ß-subun'dad. De manera alternativa, la sonda se puede usar en un contexto de hibridación i n s i t u para valorar la posición de las copias extras de los genes de la ß-subunidad, como en elementos ext racromosómicos o como se. obtengan cromosomas en los cuales el gen de la ß-subunidad no se encuentra normalmente, por ejemplo, como una región de tinción homogénea. Estos usos son pertinentes para la diagnosis de trastornos que comprenden un incremento o disminución en la expresión de la ß-subunidad con relación a los resultados normales. Las técnicas i n vi t ro para la detección del ARNm incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones i n s i t u . Las técnicas in vi t ro para detectar ADN incluyen hibridaciones Southern e hibridaciones in s i t u . Se pueden usar sondas como una parte de un equipo de prueba de diagnóstico para identificar células o tejidos que expresan una proteína de la ß-subunidad, ta] como el medir un nivel de un -ácido nucleico que codifica para la subunidad en una muestra de células "'e un sujf , por ejemplo, ARNir o ADN genómico, o determinar si se ha mutado un gen de la ß-subunidad. Los ensayos de expresión de ácido nucleico son útiles para la selección de fármacos para identificar compues-os que modulan la expresión o actividad del ácido nucleico de la ß-subunidad. La invención pro orciona de este modo un método para identificar un compuesto que se puede usar para tratar un trastorno asociado con la expresión de ácido nucleico del gen de la ß- subunidad. El método inc-uye típicamente vaiorar la capacidad del compuesto para modular la expresión del ácido nucleico' de la ß-subunidad y de esta manera identificar un compuesto que se puede usar para tratai un trasto-no carac erizado per la expresión indeseada del ácido nucleico de la ß- subunidad . Los ensayos se pueden realizar en sistemas basados en células o libre de células. Los ensayos basados en células incluyen células que expresan de forma natural el ácido nucleico de la ß-subunidad o células recombinantes manejadas genéticamente para expresar las secuencias específicas de ácido nucleico . De manera alternativa, se pueden valorar compuestos candidatos in vi vo en pacientes o en animales transgénicos. El ensayo para la expresión de ácido nucleico de la ß-subunidad puede comprender ensayo directo en niveles de á'-ido nucleico, tal como niveles de ARNm, o en 'Compuestos colaterales comprendidos en la ruta de señal (tal como AMP cíclico o recambio metabólico de fosfatidilinositol). Adicionalmente, la expresión de genes que se reg lan asc ndentement o descendentemente en respuesta a la ruta de señales de la proteína de la ß-subunidad también se pueden valorar. En esta modalidad, las regiones reguladoras de estos genes se pueden enlazar operablemente a un gen indicador tal como luci ferasa . De esta manera, los moduladores de la expresión del gen de le. ß-subunicad se pueden identificar en un método en donde una célula se pone en contacto con un compuesto candidato y se determina la expresión del ARNm. El nivel de expresión del ARNm de la ß-subunidad en la presencia de los compuestos candidatos se compara al nivel de expresión del ARNm de la ß-?ubunidad er. la ausencia del compuesto candidato. El compuesto candidato entonces se puede identiiiear como un modulador de la expresión de ácido nucleico basándose en esta comparación y se usa por ejemplo, para tratar un trastorno caracterizado por la expresión anormal de ácido nucleico. Cuando la expresión de ARNm e«tá estrictamente mayor de forma significativa en la presencia del compuesto candidato que en su ausencia, identifica al compuesto candidato como un estimulador de la expresión del ácido nucleico. Cuando la expresión del ácido nucleico es estadísticamente menor de forma significativa en la presencia del compuesto candidato que en su ausencia,^ se identifica al compuesto candidato como un inhibidor de la expresión del ácido nucleico. Por consiguiente, la invención proporciona métodos de tratamiento, con el ácíd^ nucleico como objetivo, usando un compuesto identificado a través de la selección ce fármacor como un modulador génico para modular la expresión del ácido nucleico de la ß-subunided. La modulación iacluye tanto la regulación ascendente (es decir, activación o agonización) o regulación descendente (supresión o ant agoni zación ) de la expresión de ácido nucleico. De manera alternativa, un modulador para la expresión del ácido nucleico de la ß-subunidad puede ser una molécula pequeña o fármaco identificado usando los ensayos de selección descritos en la presente mientras que el fármaco o molécula pequeña inhibe la expresión del ácido nucleico de la ß-subunidad. Los polinucleótidos de la ß-subunidad también son útiles para monitorear la efectividad de los compuestos moduladores en la expresión o actividad del gen de la ß-subunidad en ensayos clínicos o en un régimen de tratamiento. De esta manera, el patrón de la expresión génica puede servir como un barómetro para la efectiv.dad continua del tratamiento con el compuesto, particularmente con compuestos a los cuales pueda desarrollar resistencia un paciente. El patrón de expresión génica también puede servir como un marcador indicativo de una respuesta fisiológica de las células afectadas al compuesto. Por consiguiente, este monitorep permitirá ya sea la administración incrementada, del compuesto o la administración de compuestos alternativos a los cuales no ha llegado a ser resistente el paciente. De manera similar, si el •"ivel de la expresión de ácido nucleico cae por debajo de un nivel deseable, se _ podría disminuir conmensuradamente la administración del compuesto. Los pclinucleóti 'os de ? a ß-subu^ idad también son útiles en los ensayos de diagnóstico para cambios cualitativos en -1 ácido nucleico de la ß-subunidad, y particularmente en cambios cualitativos que conduzca: a la p.tología. Los polinucleótidos se pueden usar para detectar mutaciones en los genes de _.a ß-suburidad y los productos de expresión génica tal como ARNm. Los polinucleótidos se puedei. usar como sondas de hibridación para detectar mutaciones genéticas que se presentan de forma natural en el gen de la ß-subunidad y determinar de este modo si un sujeto con la mutación está en nesgo de un trasto rno provocado por la mutación. Las mutaciones incluyen supresión, adición o substitución de uno o más nucleótidos en el gen, re-arreglo cromcsómico tal como inversión o transposición, modificación del ADN genómico tal como patrones anormales de metilación o cambios en el número de copia génica tal como amplificación. La detección de una forma mutada del gen de la ß-subunidad asociado con una disfunción proporcionan herramienta del diagnóstico para una enfermedad activa o susceptibilidad a la enfermedad cuando la enfermedad resulta de una sobre-expresión, sub-expr -¿sión, o expresión alterada de una proteína de _a ß-subunidad. Los individuos que tienen mutaciones en el gen de la ß-subunidad se pueden detectar a nivel de ácido nucleico por una vaciedad de técnicas. El ADN genómico se puede analizar directamente o se puede amplificar al usar PCR antes del análisis. J— ttu- -. ts . En cier' as modali ades, la detección ce la mutación comprende el uso de una sonda/cebador en una reacción en cadena de la . olimerasa (PCR) (ver por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,683,195 y 4,6 3,202), te como PCI de fijación o RACE PCR, o alternati amente, en una reacción de cadena de ligación (LCR) (ver, pe: ejemplo, Landegran et al., Science 241:1077-1080 (1988); y Nakazawa et ai., PN7-S 9.: 360-364 (1994)), esta última puede ser particular, ente útil para detectar mutaciones de punto en el gen (ver, Abravaya et al., Nucleic Acids Res. 23:67 -682 (1995; ) . Este método puede incluir los pasos de recolectar la muestra de células de un paciente, y aislar el ácido nucleico (por ejemplo, genómico, ARNm o ambos) de las células de la muestra, poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que hibridan específicamente el gen bajo condiciones tal que se presente la hibridación y amplificación del gen (si está presente), y detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o detectar eí tamaño del producto de amplificación y comparar la -longitud a una muestra de control. Se pueden detectar las expresiones e inserciones por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación al genotipo normal. Las mutaciones de punto se pueden identificar al hibridar el ADN amplificado a ARN normal o secuencias de ADN antisentir'o. De manera alternativa, las mutaciones en un gen de ß-subu idad se pueden identificar directamente, por ejemplo, p.or alteraciones en los patrones de digestión con enzimas de restricción determinados por electroforesis en gel. Adicionalmev. te, se pv den usar ribozimas específicas de la secuencia (Patente de los Estados Unidos No. 5,498 531) para ountuar la presencie de mutaciones específicas por el desarrollo o pérdida de un sitio de incisión de ribozima. Las secuencias perfectamente correspondidas se pueden distinguir de las secuencias mal correspondidas por ensayos de digestión de incisión con nucleasa o por diferencias en la temperatura ,e fusión. Los cambios en la secuencia en ubicaciones específicas también se pueden valorar con ensayos de protección de nucleasa tal como RNAsa y protección SI por métodos de incisión química. Adicionalmente, se pueden determinar diferencias de secuencias entre un gen de subunidad mutante y un gen tipo silvestre por secuenciación de ADN directo. Se puede uti_izar una variedad d" procedimientos automatizados de secuenciación cuando se realicen los ensayos de diagnóst. co (Biotechniques 19:448 ' (_ 95)), incluyendo secuenciación por espectrometría de masas (ver, por ejemplo, la Publicación I"ternacion?l PCT No WO 94/16101; Cohén et al., Ade Chromatogr. 36:127-162 (1996); y Griffir. et al., Appl. Biochem.

Bíotechnol. 38:147-159 (1993)) . Otros métodos par detectar mutacione: en el gen incluyen métodos en los cuales se usa la protección de agen JS de és .sión par- detectar bases mal correspondidas ' en ARN/ARN o dúplex ARN/ADN (Myers et al., : . ience 23U-1242 (15¿5); Cotton et al., PNAS 85:439 (1938); S'leeba et al., Meth. Enzymol. 217:286-295 (1992)), movilidad electroforética de acido nucl-ico mutante y tipo silvestre se comparan (Orita et al., PNAS 86:2766 (1989); Cotton et al., utat. Re_ 285:125-144 (1993); y Hayashi et al., Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79 (1992)), y ei movimiento de los .ragmentos mutantes o tipo silvestre en geles de / poliacrilamida que contiene un '-radíente de desnaturante se valora usando la electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (Myers et al., Nature 313:495 (1985)) . Los ejemplos de otras técnicas para detectar mutaciones de punto incluyen, hibridación selectiva con oligonucleótidos, amplificación selectiva, y extensión con cebadores selectivos. Los polinucleótidos de la ß-subunidad también son útiles para probar un individuo para un genotipo que mientras que necesariamente no provoca la enfermedad, sin embargo afecta la modalidad en el tratamiento. De esta ranera, los polinucleótidos se oueden usar para estudiar la relación entre el genotipo del individuo y la respuesta del individuo a un compuesto usado oara el tratamiento relación farmacogenómica ) . En el presente caso, por ejemplo, ur.i mutación en el gen de la ß-subunidad que da por resultado afinidad alterada para el ligando, por ejemp-o, podría dar por resultado un efecto excesivo o disminuido del fármaco con con ent racione - normales del ligando. De manera alternativa, por ejemplo, una mutación en el gen de la ß-subunidad que aa por resultado una interacción alterada con la, a-subunidad podría dar por resultado ur. efecto incrementad, o disminuido del fármaco con concentraciones normales de un fármaco que afecta esta interacción func: ..nal. Por consiguiente, los polinucleótidos de la ß-subunidad descritos en la presente se pueaen usar para valorar el contenido de la mutación del gen de la ß-subunidad en un individuo a fin de seleccionar un compuesto apropiado o régimen de dosis para el tratamiento . De esta manera, los polinucleótidos que exhiben variaciones genéticas que e ectan al tratamiento proporcionan un objetivo de diagnostico que se puede usar para trazar el tratamiento en un individuo. Por consiguiente la función de las células recombinantes de animales que contienen estos polimorfismos permite el diseño clínico efectivo de los compuestos de tratamiento y los regímenes de dosis. Los polinucleótidos de la ß-subunidad también son útiles para la identificación de cromosomas cuando la secuencia se identifica con un cromosoma individual y a una ubicación particular en el cromosoma. Primero, la secuencia de ADN se hace corresponder al cromosoma por ibridación específica del cromosoma o in si t u . También se puede correlaci nar seciencias a cromosomas específicos al comparar cebadores de PCR que se puede usar para la selección por PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas individuales en 1 .s especie .deseadas. Únicamente, los híbridos que contienen el cromosoma que contiene el gen heterólogo al sbador producirá un fragmento amplificado. Se puede lograr la sub- localización usar.do fragmen.os cromosemicos . Otras estrategias incluyen la pre-selección con cromosomas marcados clasificados por flujo y la preselección por hibridación a colecciones de secuencias de ADi específicas del cremosoma. Las estrategias adicionales de. correlación incluyen hibridación i n c i t u por fluorescencia pr entras que permite la hibridación con sondas más cortas que aquellas usadas de manera tradicional Se pueden usar reactivos para la correlación cromosómica de forma individual para mercar un cromosoma individual o un sitio individual en el cromosoma, o paneles de reactivos se pueden usar para marcar sitios múltiples y/o cromosomas múltiples. Los reactivos que correspondan a las regiones de no-codificación de los genes vealmente son preferidos para los propósi os de correlación. Les secuencias de codificación 3e van a conservar más probablemente dentro de las familias de genes, incrementando de este modo la oportunidad de hibridaciones cruzadas durante la correlación cromosómica . También se pueden usar los polinucleótidos de la ß-subunidad para identificar individuos a partir de pequeñas muestras biológicas. Estos se pueden hacer por ejemplo u ando el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) para identificar un individuo. . C _ esta m=nera, los polinucleótidos descritos en, la presente son útiles como marcadores ae ADN par RFLP (ver, Patente de los Estados Unidos No. 5,272,057) . Además, la secuencia de la ß-subunidad se puede usar para proporcionar una técnica alternativa que determina la secuencia real de ADN ae fragmentos seleccionados en el genoma de un individuo. De esta manera, las secuencias de la ß-subunidad descritas en la presente . se pueden usar para preparar dos cebadores de PCR de los extremos 5' y 3' de las secuencias. Estos cebadores se pueden usar para amplificar ADN de un individuo para la secuenciación subsecuente. Los paneles de las secuencias de ADN correspondientes de individuos preparados de esta manera pueden proporcionar identificaciones individuales únicas, puesto que cada individuo tendrá un conjunto único de estas secuencias de ADII. Se estima que la variación alélica en humanos se presenta con una frecuencia de aproximadamente una por cada 500 bases. La variación miélica se presenta en algún grado en las regiones de codificación de estas secuencias, v a un mayor grado en las regiones de no-codificación. Las secuencias de la ß- .ubunidad e pueden usar para obtener estas secuencias de identificación a partir de individuos de tejido. I s secuencias representan fragmentos únicos del genoma humano. Cada una de las secuencias des ritas en " presente se puede usar, en algún grado, como una norma contra la cual se puede comparar "1 ADN de un individuo, para propósitos de identificación. Si se usa un panel - e reactivos de las secuencias para generar una base de datos única de identificación para un ?: dividuo, estos mismos reactivos se pueden usar más tarde para identificar el tejido de ese individuo. Usando ".a base de datos única de identificación, se puede hacer una identificación positiva c.l individuo, vivo o muerto, de muestras de tejido extremadamente pequeñas . Los polinucleótidos de la ß-subunidad también se pueden usar en procedimientos de identificación forense. Se p ede usar tecnología de PCR para amplificar secuencias de ADN tomadas de mu ,-stras biológicas muy ^equeñas, tal como un folículo individual de cabello, fluidos corporales (por ejemplo sangre, saliva o semen) . La secuencia amplificada entonces se puede comparar a una norma que permite la identificación del origen de la muestra. Los polinucleótidos de la ß-subunidad de esta manera se pueden usar para proporcionar reactivos de pol inucleótic ->s , por ejemplo, cebadores de PCR, dirigidos a locus específicos en el genoma humano, qur pueden mejorar la confiabilidad de las identificaciones forenses basadas en ADN por ejemplo ".1 proporcionar otro "marcador de identificación" (es decir, otra secuencia de ADN que ee única a un individuo particular) . Como se describe anteriormente, se puede usar la información real de la secancia base para la identificación como, una alternativa exacta a patrones formados por fragmentos -enerados por enzimas de restricción. Las secuencias dirigidas a la región de no codificación son particularmente útiles puesto que el mayor polimorfismo se presenta en las regiones de no codificación, haciendo más fácil diferenciar individuos usando esta técnica. Los fragmentos son de al menos 12 bases. Los polinucleótidos de la ß-subunidad se pueden usar adiciona lmente para proporcionar reactivos de polinucleótidos, por ejemplo, sondas marcadas o marcables que se pueden usar por ejemplc en una técnica de hibrid'ación in s i t u , para identificar un tejido específico. Esto es útil en casos en los cuales se presenta un patólogo forense con un tejido de origen desconocido. Los paneles de las sondas de la ß-subunidad se pueden usar para identificar tejido por especie y/o por tipo de órgano . De una manera similar, estos cebadores y sondas se pueden usnr para seleccionar cultivo de tejido para contaminación (es decir, seleccionar la presencia de unr mezcla d'e diferentes tipos de células en un cultivo) . De manera alternativa, se pueden usar los polinucleótidos de la ß-subunidad directamente para bloquear la trascripción o trade -ción de la expresión el gen de la ß-subunidad por medio de las construcciones antisentido o ce ribozima. De esta manera, en un trastorno caracterizado por la expresión anormalmente alta o indeseable del ge., de la ß-subunidad, se pueden usar directamente para el tratamiento los ácidos nucleicjs. De esta manera, los polinucleótidos de la ß-subunidad son útiles como cons t ruccicnes antisentido para controlar la expresión de la ß-subunidad en células, tejido., y organismos. Se diseña un polinucleótido anti-sentido de ADN para ser complementario a una región del gel comprendido en la trascripción, que previene la trascripción y por lo tanto la produce' ón ie la proteína de la ß- subu¡ idad. Un poli -. ucleótido de ..RM o ADN ant itent ido hibridará al .ARNm y de c .ca manera bloqueará la traducción del -ARNuri en la proteína de la ß-subunidad. Los ejemplos de moléculas antisentido útiles para inhibir la expresión de áci .o nucleico incluyen moléculas ant i ent ido complementarias a un fragmento de la región no traducida en 5' de SEC ID NO 2 que también incluye el codón de inicio y las moléculas antisentido que son complementarias a un fragmento de la región no traducida en 3' de SEC ID NO 2. De manera alternativa se puede usar una clase de moléculas antisentido para inactivar el ARNm a fin de disminuir "a exprés ' ón del é ido nucleico de la ß-suL>.anidad . Por consiguiente, estas moléculas p eclen tr tar un trastorno caracterizado por la expresión anormal o indeseada de ácido nucleico de ¡a e.;Dunidad. Esta técnica comprende la escisión por medio de ribozimas que contienen secuencias de núcleo -dos complementarias a una o más regiones en ßl ARNm que atenúa la capacidad del ARNm para ser traaucido. Las posibles regiones inclu en regiones de codificación y particularmente regiones ue codificación que corresponden a las actividades funcionales de la proteína de la ß-subuni „ad .

También, los polinucleótidos de la ß- aubunidad proporcionan vectores para la terapia génica en pacientes .;ue contienen células que son anormales en la expresión del gen de la ß- subunidad. De esta manera, las célalas recombinantes, que incluyen las células del paciente que se han ...anejado' e.-: vi vo y ?e regresan al paciente, se introducen • en un individuo donde las células producen la prcteína deseada de la ß-subunidad para tratar al individuo. La invención también abarca equipos para detectar la presencia de un ácido nucleico de la ß-subunidad en una muestra biológica. Por ejemplo, el equipo puede comprender reactivos tal como un ácido nucleico marcado o marcaole o agente capaz de detectar el ácido nucleico de la ß-subunidad en una muestra biológica; un medio para ceterminar la cantidad del ácido nucleico de la ß-subunidad en la muestra; un medio para comparar la cantidad del ácido nucleico de la ß-subunidcd y una muestra con una norma. El compuesto o agente se puede empacar en el recipiente adecuado. El equipo puede comprender adicionalmente inst ucciones para usar el equipo para detectar el ARNm o ADN de la ß-subunidad.

Vec ores/células hospedadoras La invención también propor iona vectores que contienen los polinucleótidos de la ß-subunidad y a células hospedadoras que contienen los polinucleótidos de la ß-subunidad. Como se describe más completamente de manera posterior, se pueden usar vectores pa"a clonar o para la expresión pero se usan de manera preferente para la expresión de la ß-su :nidad. "" 2 manera p-eferente, los sistemas de expresión incluyen células hospedadoras en las cuales se expresan tanto las a como las ß-subunidades. El- término "vector" se refiere a un vehícu a, de mantra preferente a una molécula de ácido nucleico, que puede transportar los polinucleótiaos de la -subunidaa. Cuando el vector es una molécula de ácido nucleico, los polinucleótidos de la ß-subunidad ee enlazan covalentemente al ácido nucleico del vector. Con este aspecto de ia invención, el vector incluye un plásmido, un fago de hebra individual o doble, un vector viral de ARN o ADN, . de hebra i: -ividual o doble, un cromosoma artificial, tal como BAC, PAC, YAC, OR MAC. Se puede mantener un vector en la célula hospedadora como un elemento extracromos mico donde se repite y producen copias adicionales de los polinucleótidos de la ß-subunidad. De manera alternativa, el vector puede integrarse en el genoma de la célula l.ospedadora y producir copias adicionales de los polinucleótidos de la ß- subunidad cuando se replica la célula hospedadora. La invención proporciona vectores para el mantenimiento (vectores de 'clonación) o vectores para la expresión (vector-- i de expresión) de los polinucleótidos de la ß-subunidad. Los vectores pueden funcionar en cé 1u1 - procar; óticas y eucarióticas o en ambas (vectores transportadores) . Los vectores de expresión contienen regiones reguladoras de cis-acción que se enlazan operablemente en el vector a las polinucleótidos de la ß-subunidad tal que la trascripción de los polinucleótidos se per i e en una célula hospedadora . Los pol i ucleoti dos se pueden int roducir en la célula tospedador con U' polinucleótido separado capaz de afectar la trascripción . De esta manea, el segundo polinucleótidos puede proporcionar un factor de trans-acción que interactúa con la región de control cis-reguladora, para permitir la trascripción de los polinucleótidos de la ß-subunidad desde el vector. .De manera alternativa, se puede suministrar un factor de trans -activación por una célula hospedadora. Finalmente, se puede producir un factor de trans-act ivación a partir del vector mismo . Sin embargo, se entiende que en algunas mo'dalidades , la trascripción y/o traducción de los polinuclec uidos de la ß-subunidad puede presentarse en un sistema libre de células. La secuencia reguladora a la cual se pueden enlazar operablemente los polinucleótidos descritos en la presente incluye promotores para dirigir la trascripción de ARNm. Estos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, el promotor izquierdo del bacteriófago- ?, el lac, TRP, y promotores TAC a partir de E . Col i , los promotores tempranos y tardíos de SV40, y los promotores tempranos inmediatos de CMV, los n>romotores tempranos y tardíos de adenovirus, y las repeticiones terminales largas de retrovirus. Además de controlar las regiones que promueven la tra: cripción, los vectores de expresión pueden incluir regiones que modulan la trascripción, tal como les sitios de unión a represores e intensificadores. Los ejemplos incluyen el int ensi ficade de .740, el int ens ificador temprano inmediato de citomegalovirus, el intensificador de polioma, ir. tensific adores de adenovirus e intensificadores de LTR de retrovirus. Además de contener sitios para la iniciación y control de ,1a trascripción, los vectores de expresión pueden contener sus fuerzas necesarias para la terminación de la trascripción y, en la región transcripta un sitio de unión ribosoma para la traducción. Otros elementos de control reguladores para la expresión incluyen codones de iniciación y terminación así como señales de poliadenilación. La persona experta en la técnica estará consciente de las numerosas secuencias reguladoras que son útiles en los vectores de expresión. Estas secuencias reguladoras se describen por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning: A. Laboratory Manual. 2a. ed., Col. Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) . Se pueden usar una variedad de vectores de expresión para expresar un polinucleótido de la ß-subunidad. Estos vectores incluyen vectores derivados de virus ^romosómicc - y episomales, por ejemplo vectores derivados de plásmidos bacterianos, a partir de bacteriófago, de episomas de levadura, elementos cromosómicos de levadura, incluyendo cromosoma artifi'ci - les de legadura, de virus tal como baculovirus; papovavirus tal como SV40, virus de vaccinia, adenoviius, poxvirus, virus de pseudorabias , y retrovirus. Los vectores también se pueden de.ivar de co.ribinacion " _ de estas fuentes tal como aquellas derivadas de plásmido y elementos genéticos de bac _ eriófago , por ejemplo, cósmidos y fagemidos. Los vectores de expresión y clonación apropiados para los hospedadores procarióticos y eucarióticos se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Sp.ing Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, MY (1989) . La secuencia reguladora puede proporcionar expresión constitutiva en' una o más células hospedadoras (es decir, específica del tejido) o puede proporcionar expresión inducible en uno o más tipos celulares tal como por temperatura, aditivo nutriente, factor exógeno tal como una hormona u otro ligando. Una variedad de vectores que proporcionan expresión constitutiva e inducible en hospedadores procarióticos y eucarióticos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los polinucleótidos de la ß-subunidad se pueden insertar en e_ ácido nucTeico del vector por metodología bien conocida. En general, la secuencia de ADN que finalm~nte se expresará se une a un vector de expresión al escindir la secuencia de ADN y el vector de expre -ion con una o más enzimas de restricción y luego ligando conjuntamente los frugment. _. Los procedimientos para la digestión con enzimas de restricción y ligación son bien ce..ocidos- p.. aquellos expertos en la técnica . El vector que con.iene el olinucleótido apropiado se puede introducir en una célula hospedadora apropiaaa para la propagación o expresión usando técnicas bien conocidas. Las células bacterianas incluyen, de manera enunciativa y _ sin limitación, E . 'ol í , S t i ' p t omyces , y Sa lm on el l a typh im uri um . Las células eucarióticas incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, células de levadura, insecto tal como Drosoph i l a , células de animales tal ce.o célula COS y CHO, y células de planta. Como se describe en' la presente, puede ser deseable expresar el polipéptido como una proteína de fusión. Por consiguiente, ia invención proporciona vectores de fusión que permiten la producción de los polipéptidos de la ß-subunidad. Los vectores de fusión pueden incrementar la expresión de una proteína recombinante, e incrementar la solubilidad de la proteína recombinante y ayudar en la purificación de la proteína al actuar por ejemplo como un ligado para la purificación por afinidad. Se puede introducir un sitio dt. incisión proteolíti^a en la unión de la porción de fusión de modo que el polipéptido deseado se pueda separar finalmente de la porción de fusión. Las enzimas proteolíticas incluyen pero no se limitan, a, facto Xa, trambina y enterocinasa. Los vectores típicos de expresión de fusión incluyen pGEX (Smith et al., (1988) cene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway NJ) que Xsionan la glutationa-S-tr nsferasa (GST), proteína de unión a maltosa E, proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante objetivo. Los ejemplos de vectores de expresión de E . Col i no de fusión inducibles, adecuado^ incluyen pTrc (Amann et al., Gene 69:301-315 (1988) y pET lid (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185:60-89 (1990)) . Se puede aumentar al máximo la expresión de la proteína recombinante en una bacteria hospedadora al roporcionar,' un fondo genético en donde la célula hospedadora tenga una capacidad impedida para escindir p: ateolí ticamente la proteína recombinante. (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods ín Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128) . De manera alternativa, _a secuencia de los polinucleótidos de interés se puede alterar para proporcionar de manera preferencial el codón usado para una célula hospedadora específica, por ejemplo E . Col i . (Wada e t a l . , Nu clei :. Aci ds Res . 20:2111-2118 (1992) ) . Los polinucleótidos de la ß-subunidad también se pueden expresar por vectores de expresión que son operativos en la levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en levadura, por ejemplo, S . Certí vi s i a e incluye pYepSecl (Baldari, et al., EMBO J. 6:229-234 (1987), pMFa (Kurjan et al., Cell 30:933-943 (1982)), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54:113-123 (1987)), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San. Diego, CA) . Los polinucleótidos de la ß-subunidad también se pueden expresar en células de insecto usando por ejemplo vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas 'por ejemplo células Sf9) incluyen las series pAc (Smith et al., Mol. Cell Biol. 3:2156-2165 (lr33)) y las series pVL (Lucklow et al., Virology 170:31-39 (1989)) . En ciertas modalidad''' de la invención, los polinucleótidos descritos en la presente se expresan en células de mamífero usando vectore: de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluy :,.: ?CDM8 (Seed, B. Nature 329:840 (1987)) y pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. 6:187-195 (1987)) . Los vectores de expresión listados en la presente se proporcionan -a manera c- ejemplo únicamente en los vectores bien conocidos disponibles por aquellos expertos en la técnica que serían útiles para expresar los polinucleótidos de la ß-subunidad. La persona esperta en __a técnica será consciente de que otros vectores adecuados para la propagación de mantenimiento o expresión de los polinucleótidos descritos en la presente. Estos se encuentran por ejemplo en Sa-farook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nX. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. La invención también abarca vectores en los cuales las secuenc:- -* s de ácido nucleico descritas en la presente se clonan en el vector en la orientación invertida, pero se enlazan operablemente a una secuencia reguladora que permite la trascripción de la ?RN ar isentido. De esta manera, se puede producir un trascripto antisentido en toda, o un porción de las secuencias de polinucleótido descritas en la presente, e incluyen regio;. -s tanto de codificación como de no de codificación.' La expresión de este ARN antisentido se somete a cada ur a de los parámetros descritos anteriormente y con relación a la expresión cel ARN ..omosentiao (secuencias reguladoras, expresión constitutiva o inducible, expresión específica del tejid-, . La invención también se refiere a células hospedadoras recombinantes que contienen los vectores descritos en la presente. Por lo tanto, las células hospedadora-s incluye: células procarióticas, células ucarióticas inferiores tal como levadura, otras células eucarióticas tal como células de insecto, y células eucarióticas superiores, tal como células de mamífero.

Las células hospedadoras recombinantes se preparan al introducir las construcciones de vector descritas en la presente- en las células proteíniaas fácilmente disponibles para la persona experta en la técnica. Estas incluyen pero no se limitan a, transfección con fosfato de calcio, trascripción medida por DEAE-dextrano, transfección mediada con lípido catiónico, electroporación, transducción, infección, lipofección y otras técnicas tal como aquellas encontradas en Sambrook, et ai., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, e- ., Cold. Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989) . Las células hospedadoras pueden contener más de un vector. De esta manera, se pueden introducir diferentes secuencias de nucleótidos en diferentes vectores de la misma célula de manera similar, los polinucleótidc s de la ß-subunidad se pueden introducir ya sea solos o con otros polinucleótidos que no están relación? -'os a los polinucleótidos de la ß-subunidad tal como aquellos que proporcionan factores '.e trans- = ctuación para los vectores de expresión. Cuando se introduce más de un vector en una célula, los vectore' de pueden introducir de manera independiente, se cointroducen o unen al vecto.,' del poli •"ucleótidc de la ß-subunidad. En el caso del bacteriófago . vectores virales, estos se pueden intrc..:cir en las células como virus empacados o encapsulados per procedimientos normales por infección y transducción. Los vectores individuales pueden ser competentes en la r_plicación o defectuosos en la replicación. En el caso en el cual la replicación viral sea defectuosa, la replicació se presentará en células hospedadoras que proporcionan funciones que complementan los defectos. Los vectores incluyen en general marcadores seleccionables que permiten la selección de sub-poblaciones de células que contienen las construcciones de vector de recombin inte . El marcador puede estar contenido en el mismo vector que contiene los polinucleótidos descritos en la presente o puede estar en un vector separado. Los marcadores incluyen genes de resistencia a tetraciclina o ampicilina por las células hospedadoras procarióticas y resistencia a dihidrofdlato reductasa o hermicina para células hospedadoras eucarióticas. Sin embargo, cualquier marcador que proporcione selección oara un rasgo fenotípico será efectivo. En tanto que las proteínas maduras se pueden producir en bacterias, levaduras, células de mamífero y otras células bajo el control en las secuencias reguladoras apropiadas, un sistema de trascripción y traducción libras de células también se pueden usar para producir esas proteína usando ARN derivado de las construcciones de AD1 descritas en la presente. Donde se desea la secreción del polipéptido, se incorporan señales apropiadas de secreción en el vector. La secuenci de señal puede ser endógena a los polipéptidos de la ß- subunidad o heteróloga a estos polipé -idos . Donde el polipéptido no sea secreto en el medio, la proteína se puede aislar de la célula hospedadora por técnicas de disrupción normales, incluyendo congelación, descongelación, tratamiento consumido, disrupción mecánica, uso de agentes de lisis y similares. El pólipéptido entonces se puede recuperar y purificar por métodos de purificación bien conocidos que incluyen precipitación por sulfato de amonio, extracción acida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxilapatita, cromatografía con lectina, o cromatografía líctida de al" o desempe- o. También se entiende que dependiendo de la célula hospedadora e.i la producción recor .inante de los polipéptidos descritos en la presente, los polipéptidos pueden tenet varios patrones de glicosilación, dependiendo de la célula, o pueden estar no glicosilados como cuando sr producen en bacterias. Además, los polipéptidos pueden incluir una metionina inicial modificada en als.nos casos como resultado de un proceso mediado por el hospedador .

Usos de vectores ?_ células hosp ¿dadoras Las células hospedadoras que expresan los polipéptidos descritos en la presente, y particularmente las células hospedadoras recombinantes, tienen una variedad de usos. Primero, las células son útiles para producir proteínas o polipéptidos de la ß-subunidad que se puede purificar adicionalmente para producir cantidades deseadas de la proteína de la ß-subunidad o fragmentos. De esta manera, las células hospedadoras que contienen vectores de expresión son útiles para la producción de polipéptidos . Las células hospedadoras también son útiles para llevar a cabo ensayos basados en células que comprenden la ß-subunidad o fragmentos de la ß-subunidad. De esta manera, una célula hospedadora recombinante que exprese una ß-subunidad nativa es útil para valorar compuestos que estimulen o inhiban la función de la ß-subunidad. Esto incluye unión al ligando, expresión génica al nivel de trascripción o traducción, interacción con la a-subunidad, y la capacidad para ser fosforilc dos . Por consiguiente, en modalidades preferidas, las célu_as hosped.idoras expresan tanto las a- " como ß-subunidades o porciones pertinentes de las mismas. Per lo tanto, los ensayos basado= en células y libres de células se proporcionan en los cuales tanto las a- -orno ß-subc_.?idades (o porciones pertinentes de las mismas) proporcionan ensayos útiles para la detección ae la función de la ß-subunidad. En una modalidad preferida, la invención proporciona un ensayo basado en células en el cual la célula expresa tanto las a- como las ß-subunidades . Los puntos terminales de ensayo incluyen unión a ligando, asociación o activación de la a-subunidad, corrientes de canal, fosforilación, y cambios conformacionales en ya sea la a- o ß-subunidad. La interacción de la a- y ß-subunidad se pueden medir en ensayos basados en transferencia de energía de marca dual, métodos en los cuales los reactivos se marcan de manera separada con un donador de transferencia de energía y un aceptor, tal que los resultados de la transferencia de energía cuando el donador y el aceptor se ponen en proximidad cercana entre sí, produciendo un cambio detectable en el tiempo de v: a. Los métodos de ensayo para la detección de un complejo formado en-1 re las a- y ß-subuni dades ir "luyen determinar la emisión fluorescente o enfriamiento fluorescente u otra transferencia de energía entre "os marbet s o marcas en las dos subunidades. Un ejemplo es un método de inmunoenfr iamient o c fluoresceína en el cual se marca una tubunidad con fluoresceína colocada tal que cuando la otra sut anidad se une las moléculas de fluoresceína se enfrían entre sí y disminuye la fluorescencia de la solucMn. Esta técnica analítica es bien conocida y está dentro del ámbito de la técnica. er por ej-mplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,631,169; Patente de los Estados Unidos No. 5,506,1C , Patente de los Estados Unidos No. 5 , 16 , 784 ; y Patente de los Estados Unidos No. 5,763,189. Las células hospeda oras también son útiles para identificar utant.s de la s bunidad en las cuales son afectadas estas funciones. Si los mutantes se presentan de forma natural y dan orisen a una patología, las células hospedadoras que contienen las mutaciones son útiles para valorar los compuestos que tienen un efecto deseado en la ß-subunidad mutante (por ejemplo, función de estimulación o inhibición) que no se puede indicar por su efecto en la ß-subunidad nativa. Las células hospedadoras recombinantes también son útiles para expresar los polipéptidos quiméricos descritos en la presente para valorar compuestos que activan o suprimen la activación por medio de un dominio extracelular o int acelular, heterólogo. De manera alternativa, se pueden usar uno o más dominios transm^ ibrana heterólogos para valorar el efecto de un dominio extracelular deseado en cualquier célula hospedadora dada. En esta modalidad, se ha usado el dominio transmembrana compatible ce .' la célula hospedadora específica para elaborar el polipéptido quimérico. Adicionalmente, se pueden diseñar ß- subunidades mutantes en las cuales una o más de las varias funciones se maneja para ser :ncrementaca o disminuida (es decir, unión a ligando o activación de la a-subunidad) y se usa para aumentar c reemplazar las proteínas de la ß-subunidad en un individuo. De esta manera, las células hospedadoras pueden proporcionar un beneficio terapéutico al reemplazar una ß-subunidad anormal o al proporcionar una ß-subunidad anormal que proporcione un resultado terapéutico. En una modalidad, las células proporcionan ß-subunidades que son anormalmente activas. En otra modalidad, las células proporcionan ß-subunidades que son anormalmente activas. Estas ß-subunidades pueden competir con las ß-subunidades endógenas en el individuo. En otra modalidad, las células que expresan las ß-subunidades que no se pueden activar, se introducen en un individuo a fin de competir con as ß-subunidades endógenas para el ligando o la a-subunidad. Por ejemplo, en el caso en el que el ligando excesivo es parte de una modalidad de tratamiento, puede rer necesario inactivar este ligando en un punto específico en el tratamiento. La prensión de aélulas que compiten por el ligando, pero que no se pueden afectar por la activación de la ß-subunidad, será benéfico. Las células hospedadoras homólogamente recombinantes también se p eden producir, lo que permite la alteración i n s i t u de las secuencias del polinucleótido de la ß-sutanidad enaógenas 'en un genoma de célula hospedadora. Esta tecnología se describe más completamen e en WO 93X9222, WC 91/12650 y la U.S. 5,641,670. De manera breve, las secuencias de polinucleótido específicas jue corresponden a los polinucleótidos o secuencias de la ß-subunidad próximas o distantes a un gen de la ß-subunidad se les permite integrar en un genoma de célula hospedadora por recombinación homologa cuando se puede afectar la expresión del gen. En una modalidad, las secuencias reguladoras se introducen ya sea para incrementar o disminuir la expresión de una secuencia endógena. Por consiguiente, se puede producir una proteína de la ß-subunidad en una célula que no reproduce normalmente, o la expresión incrementada de la proteína e e la ß-sufcunidad puede dar por resultado una célula :pae produce normalmente la proteína a un nivel específico. De manera alternativa, se puede suprimir el gen completo. Aún además-, se pueden introducir mutacior es específicas en cualquier región deseada del gen para producir proteínas mutantes de la ß-subunidad. Estas mutaciones se pueden introducir, por ejemplo, en las regiones funcionales específicas tal como el sitio de unión a ligando o el sitio de interacción de la a-subuni dad . En una odalidad, i. as células hospedadoras pueden ser un oocito fertilizado o células madre embriónicas que se pueden usar para producir un animal transgénico que contienen el gen alterado de la ß-subunidad. De manera alternativa, la célula nospedadora puede ser una célula cebada u otro precursor de tejido temprano que da origen a un subconjunto específico de cXulas y se puede usar para producir tejidos transgénicos en un animal. Ver también, Thomas at al., Ceil 51:503 (1987) para una descripción de los vectores de recombinación homólogos. El vector se introduce en una línea de células cebadas embriónicas (por ejemplo por electroforación) y 1.3 células en las cuales el gen introducido se ha recombinado homólogamente con el gen endógeno de ia ß-subun'áad se selecciona (ver por ejemplo Li, E. Et al., Cell 69:915 (1992)) .

Las células seleccionadas luego se inyectan en un b__astocito de un ani.r.al (por ejemplo, un ratón) para formar quireras de agregación (ver por ejemplo, Bradley, A. in Tera toca rcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Aproach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152) . Luego se puede implantar un embrión quimérico en un animal adoptivo, hembra, pseudopreñado , adecuado y el embrión se pone a término. La progenie que tiene el ADN homólogamente recombinado en sus células germen se puede usar para reproducir animales en los cuales todas las células del animal contienen el ADN h omólogamente recombinado por transmisión en la línea de germen del transgen. Los ir. ¿todos r_ra construir vectores de recombinación homólogos y animales recombinantes homólogos ae descrit -n adicionalmente en Bradley, A. (1991) Current Opinión in Biotechnology 2:823-829 y er. las Publ - aaciones L.ternacionaXs PCT Nos. WO 90/11354, WO 91/01140; y WO 93/04169. Las célula., hospedadoras genéticamente manejadas se pueden usar para producir animales transgénicos no .manos. Un animal t ransgéni <~o es preferentemente un mamífero, por ejemplo, un roedor, tal como una ata o ratón, en el cual >'na o más de l s células del animal incluyen un tr,.n .gen. Un transgen es el genoma de una célula del cual se desarrc' Ja un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro en uno o más tipos celulares o tejidos -el animal transgénico. Estos animales son útiles para estudiar la función de la proteína de ia ß-subur '.dad e identificar y evaluar moduladores de la actividad de la proteína de la ß-subunidad. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, polloa y anfibios. En una modalidad, µna célula hospedadora es un oocito fe.tilizado o una célula cebada embriónica en la cual se han introducido las secuencias de polinuc " eót ido de la ß-subunidad. Se puede producir un animal transgénico al introducir ácido r.acleico e" el pronúcleo de macho de un oocito fertilizado, por ejemplo, por microinyección, infe. ion retroviral y al permitir que el oocito desarrolle un animal adoptivo hembra pseudopreñado . Cualquiera de las secuencias de nucleótidos de la ß-subunidad se pueden introducir como un transgen e.. el genoma de un animal no humano, tal como un ratón. Cualquiera de las ecuencias reguladoras u otras útiles en los vectores de expresión puede firmar parte de la aecuencia transgénica. Esto incluye secuencias intrónicas y señales de poliadenilación, si no este . incluidas ya. Una(s) secuencia;-:) regulad -.ra ( s ) especí fica ( s ) Hr. i tejido se pueden hacer o: .rablemente al transge ? para dirigir la expresión de la proteína de la ß- subunidea a célula particulares. Los métodos para gener r animales transgénic 3 vía . "nipulación de embriones y microinyección, par icularmente animales tal como ratones, han Íleo, do a ser convencionales en la técnica y se describen por ejemplo, en las Pa entes de los Estados Unide-- Nos. 4,736,866 y 4 , 8 "? 0 , 009 , ambas por Leder et al., Patente de los Estados Unidos l.o. 4,873," 31 por Wagner et al., y en Hogan, B., Manipuiating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Labe :atory Pr_ s, Cold Spring Fnrbor, N.Y., 1986) . Se usan métodos similares p ra la producción de caos animales t ransc-'.n icos . Se puede identificar un animal fundador ran génico b sándose en la prese, cia del transgen en su genoma y/o expresión del APHm transgénico on te idos o células de animales. Un anir.nl fundador transgéniro luego se puede usar para reproducir animales adicionales que tienen el transgen. Además, los animales transgénicos que tienen un transger. se pu.,den reproducir adicionalmente a otros animales transgénicos que tienen otros transgenes. Un animal transgénico también incluye animales en los cuales el animal completo o tejidos en el animal ee han producido usando células hospedador-.s homólo? nente recombinantes descritas en la presente. En otra modalidad, se pueden producir animales transgénicos no humanos que contienen sistemas seleccionadas que permiten la expresión regulada del transgen. Un ejemplo de este sistema es el sistema de cre/loxP-recombinasa del bacteriófago Pl . Para una 'descripción del sistema cre/l oxP- r ty tombinasa , ver, por ejemplo Lakso et al., PNAS 89:6232-6236 (1992). Otro ejemplo de un ejemplo de recort.oinasa es el sistema de FLP-recombinaea de S . Cerevi si a e (O'Gorman et al., Science 251:1351-1355 (1991) . Si se usa un sistema del cre/ioxP-recomb inasa para regular la expresión del tr-. sgen, lo" animales rué contienen transgenes que codi 'can tanto para Cr'e-recombinasa como una proteína S-leccionac, se requieren. Estos animales se pueden proporcionar a través de la construcción de animales "doble" transgénicos, por ejemplo, al acoplar dos animales transgénicos, uno que contiene un transgen que codifica para una proteína seleccionada y el otro que contiene un transgen que codifica para una recombinasa. Los clones de los animales transgénicos no humanos descritos en ..a presente también se pueden producir de acuerdo a los. métodos descritos en Wilmut, I. et al., Nature 385:810-813 (1997) y las Publicaciones Internacionales de PCT Nos. WO 97/07668 y WO 97/07669. En resumen, una célula, por ejemplo, una nélula somática, del animal transgénico se puede aislar e inducir a que salga el ciclo de crecimiento e introducir en fase G0. La célula quiescente luego se puede fusionar, por ejemplo, a través de. uso de impulsos eléctricos, a un oocito enucleado de un animal de la misma especie del cual t a aisla 1 - célula quiescente. El oocito reconstruido luego se cultiva tal que Qísarrolle a morul.. o bl a st coitos y luego se transfiere a un animal adoptivo hembra pseudop r eñado . __a deseen ..encia nacida de este animal adoptivo hembra será un clon del animal del caal se ai-la la célula, por ejemplo, la célula somática . Los aniña les trap.génicos que contienen células recombinant s que expresan los polipéptidos descritos en la presente son útiles para llevar a cabo lo. ensayos descritos • en la presente en un contexto in vi v . Por consiguiente, los varios factores fisiológicos que están presentes in vi vo y que podrían efectuar la unión a ligando, activación de la a-subunided, y la capacidad para ser fosforilados no pueden ser evidentes a partir de los ensayos basados en células o libres de células in vi tro . Por consiguiente, es útil proporcionar animales transgénicos no humanos para valorar la función de la ß-subunidad .'in vi vo incluyendo la anteracció: de la "'-subunidad y el ligando, el efecto de las ß-subunidades mutantes específicas en la a-subunidad, f nción de canal y la interacción con ligando y el efecto de las subunidades quiméricas o canales. También es posible valorar el efecto de las mutaciones nulas, que son mutaciones que elXninan substancial o completamente una o más funciones de la ß-subunidad.

Compos_ clones farmacéu icas Las mole -ulas de . aido nucleico de la ß-subunidad, proteína (particularmente fragmentos tal como los varios dominios)', moduladores de la proteina, y anticuerpos (también referidos en la presente como "compuestos activos") se pueden incorporan, en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto, por ejemplo un humano. Estas composiciones comprenden típicamente la molécula de ácido nucleico, proteína, modulador, o anticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptable . Como se usa en la presente, el lenguaje "portaaor farmacéuticamente aceptable" se propone que incluya cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes de retraso de absorción e isotónico?, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de estos medios y agentes para subrlar : • as farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto a lo que respecta a cualq-?¡er medio convencional . agente ene sea incompa t , ble con el compuesto activo, estos medios se pu< Hen usar er. las com-.-s iciones de la invención. Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar en ' as compos nones. Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su ruta propuesta de a-dminist ración . Los ejemplos de rutas de adminis t ración inci yen adminis ración parenteral, por ejemplo intravenosa, in t rad?-rmica , subcutánea, ora.. (por ejemplo, inhalación) , transdérmica, (tópica), t ransmucósica y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes bacterianos tal como alcohol bencílico o met ilparabenos ; antioxidantes tal como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tal como ácido e t ilendiaminatet raacét ico ; amortiguadores tal como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tal como cloruro de sodio o Jextrosa. El pH se puede ajustar con áci os o gases, tal como ácido clorhídrico o hidr-óxido de sodio. La preparación parenteral e puede encerrar e~ ampollas, jeringas desechables o múltiples frascos de dosis elaborados de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el use inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. Para a administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agu.. bacterio=tát ica , Cremophor ELMR (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina aaortiguada con fosfato (PBS) . En todos los casos, la comprsición debe ser estéril y debe ser fluida al grado que salga fácilmente en la jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe estar conservada contra la acción aontaminante de microorganismos tal como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de expresión que contiene por ejemplo agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal corrí, lecitine por el mantenimiento del tamaño requerido de partícula ^n ia clase de dispersión y por el use de agente: tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr por varios egentes antibacterianos y antifun ales, por ejemplo, parabenos, c 1 oroou anol , fenol, ácido ascórbico, timerosai y similares. En muchos casos, será preferible incluí1" agen es isotónicos, or ejemplo azúcares, polia Icohci es tal como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar al incluir en la composición un agente que retrase la abso ción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Ld3 soluciones inyectables, estériles se pueden preparar al incorporar el compuesto activo (por ejemplo, un- proteína '"e la ß-subunidad o un anticuerpo ant i-ß-subuni dad ) , en la cantidad requerida en un solvento apropiada con una o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, cono se requiere, seguido por esterilización filtrada. En general, las dispersiones se preparan al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio básico de expresión y ios otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente.

En el caso de polvos estériles para la preparación y soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente aeseado adicional de una solución filtrada previamente estéril de la misma. Las composiciones orales incluyen en general un diluyante inerte o un portador comestible. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o comprimir en tabletas. Para la administración oral, el agente puede estar contenido en formas esféricas para sobrevivir al estómago o revestido adicionalmente o mezclado para ser liberado en - na región particular del tracto gastrointestinal por métodos conocidos. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usar en la forma de tabletas, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un portador fluido para el uso como un lavado bucal, en donde el compuesto en el portador o fluido se aplica oralmente y se cruje y espectora o traga. Los agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes se pueden incluir como parte ce la com eisición . Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar; un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de traganto o gelatina, un excipiente tal como almidón o lactosa, -, agente ce desintegración t l como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante ta" como esLearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal corno dióxido de silicio coloidal; an agente ~-dul coran t tal como sacarosa o sacarina; o un agente sabor zante tal como menta, salicil to de meti _o o sabor naranja. Para la administración por inhalación, los compuestos se dist. '.buyen er la forma de una aspersión en aerosol desde un recipiente presura aado o distribuid ~r que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, an nebulitador. La administración sistémica también puede ser per medio tt-nsmucósic o transdarmico . Para la administración t ransmucósica o transdérmica, se usan en la formulacie.a penetrantes apropiados a la barrera que se va a permear. Estos penetrantes se conocen- en general en la técnica e incluyen por ejemplo, para la administración transmucósica , detergentes, sales villares, y derivados de ácido fusídicc. La administración transmucósica se puede lograr a través uel uso de aspersiones en nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas como se conoce en general en la técnica .

Los compuestos también se pueden preparar en la forma de supo itorios (por ejemplo con bases convencionales de supositorio tal como manteca de cacao ;• otros g"?céridos) o enemas de retención para distribución rectal. En una mod lidad, los compuestos activos se preparan con portadores que protegerán al compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como formulación de liberación controlada, incluyendo implante y sistema de distribución microenc apsulados . Los polímeros biocompa t i bles , biodegrcdables s r pueden us . , tal como acetato de etilen-vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoés- .res y ác-?o poliláctico. Los métodos para la preparación de estas formulaciones serán evidentes para aqi -líos expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener ce manera comercial ... partir G Alza Corporation y Nova P' armaceut icals , Inc. Las suspensiones liposcmicas (incluyendo -iposomas dirigidos a células _nfectadas con anticuerpos monoclonales a antígenos virales) también se pueden usar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar ae acuerdo a métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,522,811. Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en la forma de eosis unitaria para "acuidad de administración y uniformidad de dosis. La forma de dosis unitaria como se usa en " present- se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias _.ara el s; _ eto que sa va a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuea o activo -alculada para producir el objeto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerió . La esp :cificación para las formas de unidad de dosis de la invención se dictan por y son directamente dependientes de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica para la formacón de compuestos de este compuesto activo para el tratamiento de individuos. Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden insertar en vectores y usar como vectores de terapia genica. Los vectores de terapia génica se pueden distribuir a un sujeto por ejemplo por inyección intravenosa, administración local (U.S. 5,328,470) o por inyección estereot áct ica (ver por ejemplo, Chen et al., PNAS 91 : 3054 -3 C 57 (1994) ) . La preparación farmacéutica del vector de terapia gé?ica puede incluir el vector ee terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la cual se incruste el vehículo de distribución g"-nica. D<= manera a. "ernati a, donde el vector dé distribución génica completo se puede producir intacto de célu ...s recom" .nantes, por ejemplo, vectores retrovirales , la preparación farmacéutica p :ede incluir una o aás células que producen el sistema de distribución génica. Las com. asiciones . armacéut icas se pueden incluir en un recipiente, paquete o distribuidor o G-spensador junto ^on instrucciones para la administración .

PA'TS EXPERIMENTAL La a-subunioaa formadora de poro del canal de potas-o activado por calcio de alta conductancia (maxi-K) se ha identificado y clonado en humanos (llamada hSlo) y ratones (llamada mSlo) . Ver por ejemplo, Knaus, J. Biol. Chem. 269:3921-392 (1994), y Butler et al.,' Science 261:221-224 (1993) . Los experimentos se llevaron a cabo para examinar el papel funcional de la ß-subunidad C7F2 (SEC ID NO 2) del canal de potasio, activado por calcio, humana, novedosa en el canal de potasio maxi-K activado por calcio de alta conductancia. Es "os expt amentos muestran ~jue un-interacción física de C7F2 ccn hSl-- y mSl modifican la actividad - a canal de maxi-K, soportando el reclamo que C7F2 es una ß-subunidad funcional ae maxi-K.

E emplo 1 : Asoc-t.ción físicA de C7F2 con mSlo El cuadro de lector abierto de C7F2 (nucleótidos 502-1131 de SEC IJ NO 2) se clonó en el vector pcDNA3.1 /V5 /His-TOPO (Invitrogen) para proporcionar una marca de epítope V5. Este vector y un vector que contiene mSlo se co-transfectaron ae manera transiente en células HEK293 con lipofectamina o Fu eno . El mSlo se inmunoprecipi tó con anticuerpos dirigidos contra la a-subunidad. Los inmunoprecipi tados se sometieron a la transferencia Western con anticuerpos monoclonales dirigidos contra la marca del epítope V5 para revelar la presencia del C7F2 marcada con V5. Estos experimentos demuestran que la C7F2 humana puede asociarse con mSlo (datos no mostrados), sugi iendo una interacción física de C7F2 con la a-subunidad formadora de poro de maxi-K. Estos resultados confirman el reclamo que la C7F2 es una ß-subunidad para 'maxi-K.

Ejemp1o 2 : Consecuencias electrofisiológicas de la asociación de C7F2 con hSlo _ naSlo en actividad de canal de maxi-K El cuadro de lectura abierto de C7F2 se clonó en el vector pIRES-EGFP (Clontech) para expresar tanto C7F2 como la proteína fluorescente verde (GFP, en células transfectadas. Er te vect • r y los vectores que contienen ya sea hSlo o mSlo ne co-tranafectaron de manera transiente en células HEK293 con lipcfectamina o Fugenc . e seleccionaran las células para la grabación basándose en la expresión de GFP. La cinética activación y desactivación del canal maxi-K de ratón (mSlo) fue dramáticamente aiferente cuando se expresó solo o cuando se coexpresó con C7F2 (iigura 6) . Estos experimentos al revés de parche-sujeción revelaron que la coexpresión de C7F2 con mSlo (barras horizontales marcadas mSlo + C7F2) -incrementó dramáticamente las constantes de tie* po de activación (activación de mSlo + C7F2) y desactivación (desactivación de mSlo + C7F2) cel maxi-K de ratón cuando se comparó la expresión de mSlo solo (barras horizontales marcadas de activación de mSlo y desactivación de mSlo, respectivamente) . Se vieron efectos similares para hSlo de maxi-K humano. En la presencia de Ca++ 3 µM, la coexpresión de C7~" con mSlo provocó un cambio de hiperpolari zación (hacia la izquierda) de 20 mV de la activación de canal media máxima, sugiriendo sensibilidad incrementada dei canal maxi-K de ratón a iones de calcio (Figura 7) . Este es el comportamiento típico de la ß-subunidad previamente caracterizada. Sin ' bargo,' cuando se expresa C7F2 con hSlo, existe ur. cambio de despolarización de 20-50 mi (hacia 1 - derecha) de la activación media máxima de canal, sugiriendo sensibilidad disminuida del canal maxi-K hu 'ano a iones de calcio (Figura 8) . Este un comportamiento nuevo y único de C7F2 en comparación a la ß-subunidad previamente caracterizada . La interacc ' ón funcional de C7F2 con mSlo y hSlo, que conduce a cambios en la cinética de activac.ón y desactivación del canal maxi-K junto con cambios en la activación media máxima del canal en respuesta a calci' . confirma el reclamo que C7F2 es una ß-subunidad para maxi-K. Esta ir. - unción se puede incorporar en muchas formas diferentes y no se debe considerar como que ¿e limita las modalidades expuestas en la presente; más bien, estas modalidades se proporcionan 6 ~ modo cue esta descripción transportará completamente la invención a aquellos expertos en la técn.-ca. Muchas modificaciones y otras modalidades de la invención llegarán a la mente ae una p-t =ona experta en la técnica a la cual corresponde esta invención teniendo el beneficio de las enseñanzas presentas en la descripción anterior. Aunque se emplean términos específicos, se usan como están en la técnica a menos que se indique de otra 'manera.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de experiencia en la técnica a la cual corresponde esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente como referencia al mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara específica e individualmente para ser incorporada como referencia . Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos - de claridad y de entendimiento, será obvio que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

LIS1 DE SECUENCIAS <110> Curtís, Rory Glucksmann, Maria A. <120> NUEVl, ß-SUBUNIDAD DEL CANAL DE POTASIO, C7F2-A <130> 5800-5A, 035800/184814 <140> <141> <150> 09/123, 020 <151> 1398-07-27 <16Q> 4. <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 210 <-212> PRT <213> Homo sapiens <400> Met Ala Lys Leu Arg Val Ala Tyr Glu Tyr Thr Glu Ala Glu Asp Lys 1 5 10 15 Ser lie Arg Leu Gly Leu Phe Leu lie lie Ser Gly Val Val Ser Leu 20 25 30 Phe lie Phe Gly Phe Cys Trp Leu Ser Pro Ala Leu Gln Asp Leu Gln 35 40 45 Ala Thr Glu í-la Asn Cys Thr Val Leu Ser Val Gln Gln He Gly Glu 50 55 • 60 Val Phe Gla Cys Thr Phe Thr Cys Gly Ala Asp Cys Arg Gly Thr Ser 65 7C 75 80 Gln Tyr Pro Cys Val Gln Val Tyr Val Asn Asn Ser Glu Ser Asn Ser 85 90 95 13£ Arg Ala Leu L_a His Ser As,, Glu His Gln leu Leu Thr Asn Pro Lys 100 105 - 110 Cys Ser T\r He Pro Pro Cys Lys Arg Glu Asn Gln Lys Asn Leu Glu 115 120 125 Ser Val Met Asn Trp Gln GIn Tyr Trp Lys Asp Glu He Gly Ser Gln 130 12" 140 Pro Phe Thr Cys Tyr Phe Asn Gln His Gln Arg Pro Asp Asp Val Leu 145 150 155 160 Leu His Arg Thr His A¿p Glu He Val Leu Leu Hi s Cys Phe Leu Trp 165 170 175 Pro Leu Val Tnr Phe Val Va- Gly Val Leu He Val Val Leu Thr He 180 185 . 190 Cys Ala L_ s Ser Leu Ala Val Lys Ala Glu Ala Met Lys Lys Arg Lys 195 200 ' 2C5 Phe Ser 210 < 2 1 0 > 2 < 2 1 1 >' 1 60 3 ^ 2 12 > ADN <213> Homo sapiens <220> <221> inseguro <222> (1) .. (1608) <223> n^ a, o g, o t, o c <400> 2 Lagcagggnc gacccacgcg tscggcacgg gggagccccc gggctcgccc cagctcagac 60 actcctagcc t.cgggcagc tgccgggcga gtcagcggng tagcggccag cgggcgatgg 120 agacagagag acacccgacg agag_ ggcg gggtggggga ggcggggaga gtgcgggggc 180 ggaggctggc agggggcgct ggaagctgga gcggtccgtg cgctccccgc gcccgagggt 240 gcaggaggct ctgeu.gcggc tgctgcaccg cggggcccsg gcggcggctg gggggctggg 300 13. gggcgctgcc gccgrcgccg ccgggggcgt cgctjggcctc y_ ccctttg ttctcgcgcg 360 ctccccctcg ccgccca-tc ccctgctgtc gcgcggcggc ggtggcg gcggcggctc 420 ctcccgcccg asntagtcgg gctcggcgcc gggggcggga 00jgg gggg ggagcacgcc 480 agccgccgag - tggggggc gatgs---- -ag ctccgggtgg ~ ai-gagta cacggaagcc 540 5 gaggacaaga gcatccggct cggcttg l ctcatcatct jgccjtcgt gtcgctcttc 600 atcttcggct tct-ctggct gagtcccgc_, ctgcaggatc I g- agccac ggaggccaat 660 cscacggtgc tgtcggu ca gcagatcggc -.u g gttcg <-i jaa^ctt cacctgtggc 720 gccgactgca ggggcaccta gcagtacccc tgcgtccagg t t acgtgaa caactctgag 780 tccaactcta g^gcgctgct gcacagccac gagcaccagc tcetgaccaa ccccaagtgc 840 10 tcctatatca ctccctgtaa gagac aaat cagaagaatt .ja agtgt catgaattgg 900 caacagtact ggaaagatga gattggttcc cagccattta clt ctattt taatcaacat 960 caaagaccag atgaujtgct tctgcatcgc actcatgatg agattctcct cctgcattgc 1020 tccctctggc ccctggtgac atttgtggtg ggcgttctca ttgtggtcct gaccatctgt 1080 gccaagagct tcjcggtcaa ggcggaagcc atgnayaagf goacigttctc ttaaagggga 1140 15 aggaggcttg tagaaagcaa agta^ -^ag ctgta-tcat ~ ..Ccicgcgt ccacctgcgg 1200 aacctgtgtt tcctggcgca ggagatggac agggccacga cagggctctg agaggctcat 1260 ccctcagtgg caaogaaac aggcacaact ggaagacttg gaacctcaaa gcttgtattc 1320 c„tctgctgt agcaatgcjCt aaagggtcaa gaucttagct gtatggcgta actatttcag 1380 aaaaccctat aagaagttca ttttctttca aaagtaacag tatattattt gtacagtgta 1440 20 gtatacaaac rattatgatt tatgctc-tt aaaaatatta aaatagagtg gtctgtgtta 1?00 ttttctattt ccttttttat gcttagaaca ccagggttta aaaaaaaaaa aaaagggcgg lc60 acatctgggt ctcatttgct tctgctaggt taaactttta cttg caa 1*08 <210> 3 25 <211> 211 <212> PRT <213> Homo .apiens <220> 30 <221> INSEGURO <222> (1) .. (211) <223> Xaa = cualquier aminoácido <400> 3 JJ Met Val Lys Lys Leu Val Met Ala Gln Lys Xaa Arg Gly Glu Thr Arg 1 5 10 15 i3e Ma Leu Cys Le Gly Val Thr st Val Val C. Ala Val He Thr Tyr 20 25 30 Tyr He Le. Val Thr Thr /al Leu Xaa Pro Leu Tyr CX Lys Ser Val 35 40 45 Trp Thr Gln :iu Ser Lys Cys His Leu He Glu Thr Asn Xaa He Arg 50 5. 60 Asp Gln Glu Glu Xaa Leu Lys Xaa Xaa Gly Lys Lys Xaa Xaa Xaa Val 65 70 75 80 Pro Gln Tyr Pro Cys Leu Xaa Xaa Trp Val Asn Val Ser Ala Ala Gly 85 90 95 Ang Trp Ala Vai Leu Tyr His i r Glu Asp Arg Anp Gln Asn Gln 100 105 110 Gln Cys Ser Tyr He Pro Gly Ser Val Asp Asn Tyr Gln Thr Ala Arg 115 120 125 Ala Asp Val lu Lys Val Arg Ala Lys Phe Gln Glu Gln Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Gln Val Ph^ Tyr Cys Phe Ser Ala Pro Arg Gly Asn Glu Thr Ser Val 145 150 155 160 Leu Phe Gin Arg Leu Tyr Gly Pro Gln Ala Leu Leu Phe Ser Leu Fhe 165 170 175 Trp Pro Thr Le_ Leu Leu Thr Gly Gly Leu L a He He a Met Val 180 185 190 Lys Ser _.x Gln Tyr Lea Ser He Leu Ma Ala Gln Lys Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa 210 <210> 4 <211> 213 .Z12> PRT <213> Phasianidae ten . sp <220> <221> INS- URO <222> (1) .. (213) <223> Xaa = cualquier aminoácido <400> 4 Met Leu Ma L s Lys Leu Va. Thr Ma Gln Lys Arg Gly Glu Thr Arg 1 5 10 15 Ma Leu Leu Gly Leu Gly Met Val Ala Cys Ser Met Met Met Tyr 20 25 30 Phe Phe He Gly He Thr Xaa He Val Pro Phe Tyr Thr Lys Ser Val 35 40 45 Trp Thr Thr Glu Thr He Cys Lys Val Leu Lys Ala Asn Xaa He Lys 50 55 60 Asp Lys Thr His Cys Tnr Asn Ser Glu Gly Ser Glu Asp Glu Asp He 65 70 75 80 Phe His Tyr Pro Cys Leu Gl- "tal Trp Val Asn Leu Thr Ma Ser Gly 85 90 95 Gln Glu V. _. Met Leu Tyr Hís Thr Xaa Glu Asp Thr Leu Glu Arg Asn 100 105 110 Pro Lys Cys 1er Tyr Val Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Asn Ser Glu Asn 115 120 125 Ser Lys Glu Val Lys Ma Arg He Glu Thr He Ma Ser Asn Phe Lys 130 135 140 Lys Tyr Gln Thr Phe Pro Cys Tyr Tyr Asp Pro Gly Gly Met Gln Thr 145 150 ' 155 160 . n Val He Leu Ser Arg Le-. Tyr Pro Pro Lys Gly Leu Leu Phe Thr 165 170 175 Phe Leu Trp Pro Thr Leu Met Phe Thr Gly Gly Cys Leu He He Val 180 185 190 Leu Val Lys He Ser Gln Tyr Phe Ser Val Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ser 195 200 205 Ma Arg Gln Xaa Xaa 210

Claims

NOVED— 5 LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invente, se considera como ana novedaa y, por lo tanto, se reclama nomo propiedad lo contenido en las s igui entes REIVINDICACiaNES : 1. Un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de: (a) la secuencia • da aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1; ( - ) la secuencia de aminoácidos de una variante alélica de la secuencia de aminoácidos mostrad, en SEQ If NO. 1; (c) la secuencia de aminoácidos de una variante aa variante de secuencia de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 en donde la variante de secuc .cia se codifica por una molécula de ácido nucleico que híbrida a la molécu! a de ácido nuc.-'Xco mos - ada en fEQ ID NO. 2 bajo condiciones severas; (d) un fragmento • de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1, en donde el fragmento comprende al menes 216 aminoácidos contiguos; (e) la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la subunidad madura de aproximadamente el aminoácido 7 a aproximadamente el aminoácido 210, mostrado n SEQ ID NO. 1; (f) la secuencia de aminoácidos de la región qu ^ abarca -1 dominio tranrmembrana del polipéptido mostrado en SEQ ID NO. 1, desde aproxim .damente e" aminoáci'o 20 a aproximadamente el aminoácido 40; ( 'i la sec ancia de aminoácidos de un epítope que abarca la región de cualquiera de los polipéptidos de ! a ¡ - ( f ) ; (h) la secuencia de aminoácidos de la región int.acelular _ mino-terminal mostrada en SEQ ID NO. 1 desde el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 19; 'i) la secuencia de aminoácidos de la región intracelu. r sarcoxi-terminal del polipéptido mostrado en SEQ ID NO. 1 desde aproximadamente ci aminoá. ido 193 al aminoácido 210; y (jj la secuencia de aminoácidos de la región de haz extracelular del polipéptido mostrado en SEQ ID NO. 1 tsde aproximadamente el aminoácido 41 a aproximadamente el aminoácido 167. 2. Un anticuerpo aislado que se une selectivamente a un polipéptido según la reivindicación 1, (a)-(j) . 3. Una molécula aislada de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID t0. 2; (b) una secuencia de nucleótidos que codific para la iecuencia ae aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1; y (e) una -ecuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de la secuencia de núcleot_dos en (a.e o (b) . 4. Una molécula aislada de ácido nucleico que tiene -na secuen.ia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos de una cariante de secuencia de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 que híbrida a la secuencia de ..ucleótido mostrada en SEQ ID NO bajo condiciones severas; y (b, una secuencia de nucleótidos complementaria a "as secuencias de nucleótidos en (a) . 5. Una molécula aislada de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ' ID NO. 1 en donde el fragmento comprende al menos 216 aminoácidos contiguos; (b) una secuencia , de nucleótidos que codifica para un _ agmento "o la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO 1, en donde el fragmento es desde e _. aminoácido 1 a aproximadamente ei aminoácido 19; (a) una so.uencia c. nucleótidos que codifica para un fragmento de la secuencia de aminoácidos most. da en SE1 ID NO 1, en donde el fragmento es desde aproximadamente el aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 40; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de la secuencia de aminoácidcs mostrada en SEQ ID NO 1, en donde el fragmento es des^e el aminoácido 41 a aproxim. damente ei aminoácido 67; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica oara un fragmento de la secuencia de aminoácidos mostrada en SFQ ID NO 1, en donde el fragmeni o es desde aproximadamente el aminoácido 168 a aproximadamente el aminoácido 192; ( ) una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de la secuencia de a inoác.dos mostrada en SEQ IN NO 1, en donde el fragmento es desde el aminoácido 193 a aproximadamente el a inoácido 210; y (g) una secuencia de nucleótidos complementara a cualquiera de la secuencia de nucleót-dos en (a)-(f) . 6. Un vector de ácido nucleico que comprende las secu.. cias de ácido nucleico en cualquiera de las reivindicaciones 3-5. 7. Una célula hos'edadora que contiene al vector de la reivindicación 6. 8. Un método para producir cualquiera de los poiipéptidos en la reivindicación 1, que comprende introducir una t-cuencia de nucleótidos que codifica para cualquiera de las secuencias de polipéptido en (a)-( , en una célula hospedadora, y cultivar la célula hospedadora bajo condiciones en las cuales se expresen las proteínas desde el ácido nucleico . 9. Un métoao para detectar la presencia de cualquiera de los polipéptidos en la reivindicación i en una muestra, el método comprende poner en contacto la muestra con un agente que permite específicamente la detección de la presencia del polipéptido en la muestra y entonces detectar la presencia del polipéptido. 10. El método según la reivindicación 9, en donde ei agente es capaz de la asociación física selecti/a con el polipéptido. 11. El método según la reivindicación 10, en donde el agente se une al polipéptido. 12. El método según la reivindicación 11, en doñee el agent es un anticuerpo. 13. El método según la reivindicación 11, en donde el agente e¿ un ligando. 14. Un equipo que comprende reactivos usados para el método según la reivindicación 9, en donde los reactivos comprenden un agente que se une específicamente al polipéptido. 15. Un método para detectar la presencia de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico en cualqu'era de las reivindicaciones 3-5 en una muestra, el método comprende poner en contacto la muestra con un o " igonucleótido que híbrida a las secuencias de ácido nucleico bajo condiciones severas y que determina si el oligonucleótido se une a la secuencia de ácido nucleico en la muestra. 16. El pXtodo según la reivindicación 15, en donde el ácido nucleico, cuya presencia se detecta, es el ARNm. 17. Un equipo que comprende reactivos usados para el método de la reivindicación 15, en donde los reactivos comprenden un compuesto que híbrida bujo condiciones severas a cualquiera de las moléculas de ácido nucleico. 18. Un r atodo para identificar un agente que se une a cualquiera de los polipéptidos en la reivindicación 1, el método comprende poner en contacto el polipéptido de un agente que se une al polipéptido y valorar el complejo formado con el agente unido al polipéptido. 19. Un método para modular la actividad de un polipéptido en la reivindicación 1, el método comprende poner en contacto el polipéptido o una célula que exprese el polipéptido, con un agente que se une al polipéptido en una concentración suficiente para modular la actividad del polipépt ido . 20. En método según la reivindicación 19, en donde la actividad del polipéptido es la activación de una a-subunidad formadora de poro y un canal de potación. 21. Un método para identificar un agente que inhibe la formación de un complejo entre un polipéptido de la reivindicación 1 y una a-subunidad formad<~ra de poro de un canal de potación, el método comprende los pasos de: a] poner en contacto el polipéptido de la reivindicación 1, o una célula que exprese el polipéptido de la reivindic-ción 1, con un agente de prueba; y b valorar el complejo formado entre el polipéptido de la reivindicación 1 y la a-subunidad para determinar _, i el agen _e de prueba inhibe la formación del complejo. 21. Un métce o para identificar un agente que modula un efecto regulador de un polipéptido de la reivindicación 1 en una a-subunidad formadora de poro de un canal de potación, el método comprende los pasos ae: a) poner en contacto el polipéptido, o una célula que exprese ei polipéptido, con un agente de prueba; y b) determinar si el agente de prueba modula el efecto regulador. 23. Un método para tratar un paciente afligido con un trastorno asociado con actividad o expresión anormal de una proteína, el método comprende administrar al paciente un compuesto que modula ia actividad de la proteína en una cantidad efectiva .ara modular la actividad de la proteína en el paciente, por lo cual al menos se mitiga un síntoma del trastorno, en donde la proteína tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo ?ue consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 ; (b) la secuencia de aminoácidos de una variante alélica de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1; y (c) la secuencia ae aminoácidos de una variante de secuencia de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 ^ donde la variante de secuencia se codifica por una molécula de ácido nucleito que híbrida a la molécula de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO. 2 bajo condiciones severas. 24. Un método para tratar un paciente afligido con un trastorno asociado con actividad o expresión anormal de una proteína, el método comprende administrar al paciente, en una cantidad efectiv-: para modular la actividad de la proteína en el paciente un compuesto seleccionado del grupo que consicte de la proteína, un ácido nucleico que codifica para la proteína, y un ácido nucleico antiser..ido que es 'capaz de fijarse con cualquiera de un ARNm que codifica para la proteína y una porción de un ADN ~enómico que codifica para la proteína, por lo cual se alivia al menos un síntoma del trastorno, donde le proteína tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste ce : (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1; (b) la secuencia de aminoácidos de una variante alélica de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1; y (c) la secuencia de aminoácidos de una variante de secuencia de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 en donde la variante de secuencia se codifica por una molécula de ácico nucleico que híbrida a la molécula de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO. 2 bajo condiciones severa^ . 25. Un método para diagnosticar un trastorno asociado con actividad o expresión anormal de una proteína en un paciente, el método compren.'' e valorar el nivel de expresión de un gen que codifica para la proteína en el paciente y comparar e" nivel de expresión del gen con el nivel normal de expresión del gen en un humano no afligid. con el trastorno, por lo cual una diferencia entre el nivel de expresión del gen en el pacienta y el ni al normal de expresión es una indicación que el paciente' está afligido con el trastorno, en dor-'e el paciente tiene una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1; (b) la secuencia de aminoácidos de una variante alélica de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1; y (c) la secuencia de aminoácidos de una variante de secuencia de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 en donde la variante de secuencia se codifica por una molécula de ácido nucleico que híbrida a la molécula de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO. 2 bajo condiciones severas. 26. Un r .todo para tratar un p. > iente afligido con un trastorno relacionado a una proteína, el mételo comprende administro'" al paciente, un compuesto que modula la actividad de la prot ,ina en ur - cantidad efectiva para modular la actividad de ía proteína en el paciente, or lo cual se aXvia al rr -nos un síntoma del trastorno, en donde la proteína tiene una secuencia de aminoác dos selecc -onada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID ro. 1; (b) la secuencia de aminoácidos de una variante alélica de la se -uencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1; y (c' la sec-tncia de aminoácidos de una variante de secuencia de la secuencia de aminoá~?dos most: -.da en SEr ID NO. 1 en donde la variante de secuencia se codifica por una molécula ce ácido nucleico c.e hibrida a la molécula de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO. ? bajo condic.ones severas. 27. Un método para tratar un paciente afligido con un trastorno relacionado a una proteina,. el método comprende administrar al paciente, en una cantidad efectiva para modular la actividad de la proteína en el paciente, un compuesto seleccionado del grupo que consiste de la proteina, un acide nucleico que codifica para la proteína y un ácido nucleico antisentido que es capaz de fijarse con cualquiera de un ARNi.i que codifica para la proteína y una porción de ?n ADN genómicr que codifica para la proteína, por J <-> cual se alivia al menos un síntoma del trastorno, en donde la proteín tiene una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste de: (a) la secuencia dt aminoácidos moatrada en SEQ ID NO. 1; (IX la secuencia de aminoácidos de una variante alélica de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ II NO. 1; y (c) la secuencia de aminoácidos de una variante de secuencia de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 en donde 1 •-• variante de secuencia se coaifica por una molécula de ácido nucleico que híbrida a la molécula de ácido nuci-ico mostrada en S?Q ID NO. 2 bajo condicicrj.es severas. 28. Un método para diagnosticar un trastorno relacionado a una proteína en un paciente, ei método comprende valorar el nivel de expresión de un gen que codifica para la proteína en el paciente y comparar el nivel de expresión del gen con el nivel normal de expresión del gen en un humano no afligido con el trastorno, por lo cual una diferencia entre el nivel de expresión del gen en el paciente y el nivel normal de expresión es 15: una indicación que e " pacien e está aflig lo con el trastorno, en donde Ja proteina tiene una secuencia de aminoácidos se " eccionada del grupo que consiste de: ( J ' la secu ncia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1; (b) la secuencia .e aminoácido:* de una variante alélica de la secuencia de aminoácidos rrostrada en SEQ ID N>- 1; y (c) la secuencia de aminoácidos de una variant - de secuencia .e la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 en donde la variante de secuencia se codif-ta por una molécula de ácido nucleico que hibrida a la molécula de ácido nucleico ...estrada tn SEQ ID NO. 2 bajo condiciones severas.