JP2005519637A - 新規なｇタンパク質共役レセプターである、ｍｉｄ２４１レセプター - Google Patents

新規なｇタンパク質共役レセプターである、ｍｉｄ２４１レセプター Download PDF

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Abstract

本発明は、Ｇタンパク質共役レセプターのスーパーファミリーに属する新たに同定されたレセプターに関する。本発明はまた、このレセプターをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、レセプター媒介性障害における診断および処置のための標的としてレセプターポリペプチドおよびレセプターポリヌクレオチドを使用する方法に関する。本発明はさらに、診断および処置のためのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための、レセプターポリペプチドおよびレセプターポリヌクレオチドを使用する薬物スクリーニング方法に関する。本発明はさらに、レセプターポリペプチドおよびレセプターポリヌクレオチドを生成するための手順に関する。

Description

（関連出願）
本願は、２００１年１０月９日に出願された米国仮特許出願６０／３２８，２８０の優先権を主張し、この内容は、本明細書中で参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、Ｇタンパク質共役レセプターのサブファミリーに属する新規に同定されたレセプターに関連する。本発明はまた、このレセプターをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、レセプター媒介性障害の診断および処置のための標的として、レセプターポリペプチドおよびレセプターポリヌクレオチドを使用する方法に関する。本発明はさらに、診断および処置のためのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためにレセプターポリペプチドおよびレセプターポリヌクレオチドを使用する薬物スクリーニング法に関する。本発明はさらに、このレセプターポリペプチドおよびレセプターポリヌクレオチドに基づくアゴニストおよびアンタゴニストを包含する。本発明はさらに、このレセプターポリペプチドおよびレセプターポリヌクレオチドを生成するための手順に関する。
（発明の背景）
（Ｇタンパク質共役レセプター）
Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）は、細胞内におけるシグナル伝達を担うタンパク質の主要なクラスを構成する。ＧＰＣＲは、以下の３つの構造ドメインを有する：アミノ末端細胞外ドメイン、７回膜貫通セグメント、３つの細胞外ループおよび３つの細胞内ループを含む膜貫通ドメイン、ならびにカルボキシ末端細胞内ドメイン。ＧＰＣＲの細胞外部分に対してリガンドが結合するときに、細胞の生物学的特性または生理学的特性における変化を生じるシグナルが細胞内で変換される。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質およびエフェクター（Ｇタンパク質によって調節される、細胞内酵素およびチャネル）とともに、細胞外インプットに細胞内第２メッセンジャーの状態を接続するモジュラーシグナル系の構成要素である。
ＧＰＣＲ遺伝子およびＧＰＣＲ遺伝子産物は、疾患を引き起こす潜在的な因子である（Ｓｐｉｅｇｅｌら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１１１９−１１２５（１９９３）；ＭｃＫｕｓｉｃｋら，Ｊ；Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３０：１−２６（１９９３））。ロドプシン遺伝子およびＶ２バソブレッシンレセプター遺伝子の特異的な欠損は、種々の形態の網膜炎色素症（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ）（Ｎａｔｈａｎｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２６：４０３−４２４（１９９２））、および腎性糖尿病無味症（ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎｓｉｐｉｄｕｓ）を引き起こすことが示されている（Ｈｏｌｔｚｍａｎら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１２０１−１２０４（１９９３））。これらのレセプターは、中枢神経系および末梢神経系の生理学的プロセスの両方に対して臨床的に重要である。進化的解析によって、これらのタンパク質の祖先は、もともと、複雑なボディプランおよび神経系に呼応して発達してきたことが示唆されている。
ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは、以下の５つのファミリーに分類され得る：ファミリーＩ（このファミリーは、ロドプシンおよびβ２アドレナリン作動性レセプターによって代表されかつ現在においては２００を超える固有のメンバーによって代表されるレセプターである（Ｄｏｈｌｍａｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：６５３−６８８（１９９１）））；ファミリーＩＩ（上皮小体ホルモン／カルシトシン／セレクチンレセプターファミリー（Ｊｕｐｐｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１０２４−１０２６（１９９１）；Ｌｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１０２２−１０２４（１９９１）））；ファミリーＩＩＩ（代謝調節型のグルタミン酸レセプターファミリー（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８ ５９７：６０３（１９９２））；ファミリーＩＶ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの走化性および発生において重要なｃＡＭＰレセプターファミリー（Ｋｌｅｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１４６７−１４７２（１９８８）））；ならびにファミリーＶ（真菌類の交配フェロモンレセプター（例えば、ＳＴＥ２）（Ｋｕｒｊａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：１０９７−１１２９（１９９２）））。
７つの推定疎水性セグメントを提供しかつＧＰＣＲとは無関係であるような他のタンパク質の少数のメンバーもまた存在し；これらは、Ｇタンパク質に結合することは示されていない。ショウジョウバエは、光レセプター特異的タンパク質である、「ｂｒｉｄｅ ｏｆ ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ（ｂｏｓｓ）」（これは、広範に研究されておりかつＧＰＣＲであるとの証拠が示されていない７回膜貫通セグメントタンパク質である）を発現する（Ｈａｒｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５０４７−５０５１（１９９３））。このショウジョウバエの遺伝子である「ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ｆｚ）」はまた、７回膜貫通セグメントを有するタンパク質と考えられている。ｂｏｓｓと同様に、ｆｚは、Ｇタンパク質に結合することが示されていない（Ｖｉｎｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２６３〜２６４（１９８９））。
Ｇタンパク質は、グアニンヌクレオチドに結合する、αサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニットから構成されるヘテロ三量体タンパク質のファミリーを表している。これらのタンパク質は、細胞表面レセプター（例えば、７回膜貫通セグメントを含むレセプター）に通常は連結している。リガンドがＧＰＣＲに結合した後に、コンフォメーション変化はＧタンパク質に伝達され、これによって、このαサブユニットに、結合したＧＤＰ分子をＧＴＰ分子へと交換させ、そして、βγサブニットから解離させる。αサブユニットのＧＴＰ結合形態は、代表的には、エフェクター調節部分として機能し、第２メッセンジャー（例えば、（例えば、アデニルシクラーゼの活性化による）ｃＡＭＰ）、ジアクリルグリセロールまたはイノシトールホスフェートの産生を引き起こす。２０を超える異なる型のαサブユニットがヒトにおいては公知である。これらのサブユニットは、βサブユニットおよびγサブユニットのより小さいプールと結合する。哺乳動物のＧタンパク質の例としては、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、ＧｓおよびＧｔが挙げられる。Ｇタンパク質は、Ｌｏｄｉｓｈら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９５）（この内容は、本明細書中おいて、参考して援用される）において広範に記載されている。ＧＰＣＲ系（Ｇタンパク質およびＧタンパク質結合エフェクターならびに第２メッセンジャー）は、「Ｔｈｅ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔ Ｂｏｏｋ」（Ｗａｔｓｏｎら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））において概説される。
ＧＰＣＲは、薬物作用および薬物開発のための主要な標的である。したがって、これまで未知のＧＰＣＲを同定および特徴づけするための薬物開発の分野において有益である。本発明は、これまでの未知であったヒトＧＰＣＲを提供することによって技術状態を推し進める。
（発明の要旨）
新規のＧＰＣＲを同定することが本発明の目的である。
ＧＰＣＲ媒介性障害の処置および診断に適用可能なレセプターアッセイにおける試薬または標的として有用である新規のＧＰＣＲポリペプチドを提供することが本発明のさらなる目的である。
ＧＰＣＲ媒介性障害の処置および診断に適用可能なレセプターアッセイにおける試薬および標的として有用でありそして組換え法による新規のレセプターペプチドを産生するのに有用である新規のＧＰＣＲレセプターポリペプチドに対応するポリヌクレオチドを提供することが本発明のさらなる目的である。
本発明の具体的な目的は、アゴニストおよびアンタゴニストとして作用しかつ新規のレセプターの発現を調節する化合物を同定することである。
本発明のさらなる具体的な目的は、ＧＰＣＲ関連障害の処置および診断のためのレセプターの発現を調節する化合物を提供することである。
したがって、本発明は、新規のＧＰＣＲの同定に基づき、ＭＩＤ ２４１レセプターとして示される。
本発明は、配列番号１において示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む単離されたＭＩＤ ２４１レセプターポリペプチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２に示される配列を有する単離されたＭＩＤ ２４１レセプター核酸分子を提供する。
本発明はまた、配列番号１に示されるアミノ酸配列に実質的に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む改変体ポリペプチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２に示されるヌクレオチド配列に実質的に相同な改変体核酸配列を提供する。
本発明はまた、配列番号１に示されるポリペプチドのフラグメントおよび配列番号２に示されるヌクレオチド配列のフラグメント、ならびにこのポリペプチドまたは核酸の実質的に相同なフラグメントを提供する。
本発明はまた、これらのレセプター核酸分子およびポリペプチドを発現するためのベクターおよび宿主細胞、特に、組換えベクターおよび宿主細胞を提供する。
本発明はまた、これらのベクターおよび宿主細胞を作製する方法、ならびにこれらを使用してレセプター核酸分子およびポリペプチドを産生するための方法を提供する。
本発明はまた、このレセプターポリペプチドおよびフラグメントに選択的に結合する抗体を提供する。
本発明はまた、このレセプターポリペプチドの活性を調節する化合物についてスクリーニングする方法を提供する。調節は、このポリペプチドレセプターのレベル、またはこのレセプターポリペプチドを発現する核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の発現を制御するレベルであり得る。
本発明はまた、特に、スクリーニングされた化合物を使用して、レセプターポリペプチド活性を調節するためのプロセスを提供し、このプロセスは、このレセプターポリペプチドの発現に関連する状態を処置することを含む。
本発明はまた、生物学的サンプルの中の、レセプターポリペプチドまたは核酸分子の存在およびレベルを決定するための診断アッセイを提供する。
本発明はまた、レセプターポリペプチドまたは核酸分子における変異の存在を決定するための診断アッセイを提供する。
（発明の詳細な説明）
（レセプター機能／シグナル経路）
ＭＩＤ ２４１レセプタータンパク質は、シグナル伝達経路に関与するＧＰＣＲである。本明細書中で使用される場合、「シグナル伝達経路」は、ＧＰＣＲ（ＭＩＤ ２４１タンパク質）へのリガンドの結合のときの細胞機能／細胞活性の調節（例えば、刺激または阻害）をいう。このような機能の例としては、シグナル伝達経路に関与する細胞内分子（例えば、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）、イノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）およびアデニル酸シクラーゼ）の動員；形質膜の分極；分子の産生または分泌；細胞内成分の構造の変化；細胞増殖、例えば、ＤＮＡ合成；細胞移動；細胞分化：ならびに細胞生存が挙げられる。ＭＩＤ ２４１レセプタータンパク質は、成人の下垂体、心臓、小腸、結腸、副腎および脳全体にわたって発現される。このＭＩＤ ２４１レセプタータンパク質はまた、結腸腫瘍および結腸腫瘍細胞株において高度に発現される。低レベルの発現は、腎臓組織およびヒト内皮、肺、頸部細胞、乳房細胞、卵巣および肝臓において指向される。従って、ＭＩＤ ２４１レセプタータンパク質のシグナル伝達経路に関与する細胞としては、これらの組織由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
ＭＩＤ ２４１ポリペプチドは、リガンドソマトスタチンを結合するＧＰＣＲである、ソマトスタチン５レセプターと相同性を共有する。ソマトスタチンは、そのレセプターと結合した場合、種々の組織において様々な影響を有する。ソマトスタチンレセプター（ＳＳＴＲ）は、アデニリルサイクラーゼの阻害、ホスホチロシンホスファターゼの活性化、ならびにＭＡＰＫおよびホスホリパーゼＣの調節に関与するいくつかのシグナル伝達経路と関連付けられている。さらに最近、ＳＳＴＲ５の活性化は、髄様甲状腺癌におけるＤＮＡ合成を増大することが報告されている。ＳＳＴＲ５の発現はまた、下垂体腫、甲状腺癌、前立腺癌および前立腺転移を含む複数の腫瘍組織において観察されている。しかし、本発明者らは、数種の肺腫瘍、１種の頸部腫瘍および４／４の結腸原発性腫瘍における発現しか見出していない。前立腺癌患者を細胞傷害性ＳＳＴアナログで処置することにより、腫瘍増殖が阻害される。現在の仮説によると、ＳＳＴＲ５は、結腸直腸癌におけるＤＮＡ合成および腫瘍の進行を阻害し得る。ＭＩＤ ２４１とＳＳＴＲ５との間に相同性があると仮定すると、ＭＩＤ ２４１は類似の活性を有する可能性がある。
このレセプタータンパク質によって媒介される応答は、細胞型に依存している。例えば、いつかの細胞において、このレセプタータンパク質に対するリガンドの結合は、ホスファチジルイノシトールまたは環状ＡＭＰの代謝および代謝回転を介する化合物の放出、チャネルの開閉、細胞接着、移動、分化などのような活性を刺激し得るが、他の細胞においては、このリガンドの結合は、異なる結果を生じる。レセプタータンパク質によって調節される細胞活性／応答に関わらず、タンパク質がＧＰＣＲでありかつＧタンパク質と相互作用して、種々の細胞内シグナル伝達経路（例えば、細胞内における、ホスファチジルイノシトールまたは環状ＡＭＰの代謝および代謝回転）において１以上の第２シグナルを生成することは普遍的である。
発現プロファイリングの結果は、ヒトＭＩＤ ２４１は、種々の組織において発現されるが、結腸腫瘍においては主に上方制御されることを示す。ＭＩＤ ２４１の発現は、Ｔａｑ Ｍａｎ分析により決定される正常な結腸組織と比較して、結腸腫瘍に主に制限された。発現を、結腸腫瘍、結腸転移および結腸腫瘍細胞株において評価した。発現を、正常な結腸組織または非腫瘍形成性結腸細胞株と比較した。
本明細書中で使用される場合、「ホスファチジルイノシトールの代謝回転および代謝」とは、ホスファチジルイノシトール４，５ビスホスフェート（ＰＩＰ２）の代謝回転および代謝に関与する分子をいい、そして、それらの分子の活性をいう。ＰＩＰ２は、細胞膜の細胞質リーフレット（ｌｅａｆｌｅｔ）において見出されるリン脂質である。レセプターに対するリガンドの結合によって、幾つかの細胞においては、細胞膜酵素のホスホリパーゼＣ（これは、順に、ＰＩＰ２を加水分解して１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）を産生する）を活性化させる。一旦形成されると、ＩＰ３は小胞体表面に散在し得、ここでは、ＩＰ３は、ＩＰ３レセプター（例えば、ＩＰ３結合部位を含むカルシウムチャネルタンパク質）に結合し得る。ＩＰ３結合は、チャネルの開口を誘導し得、カルシウムイオンが細胞質中に放出されることを可能にする。ＩＰ３はまた、特定のキナーゼによってリン酸化され、カルシウムが細胞外媒体から細胞質へと入ることを可能にする分子であるイノシトール１，３，４，５テトラホスフェート（ＩＰ４）を形成する。ＩＰ３およびＩＰ４は、その後それぞれは不活性産物であるイノシトール１，４−ビホスフェート（ＩＰ２）およびイノシトール１，３，４−トリホスフェートへと非常に迅速に加水分解され得る。これらの不活性産物は、ＰＩＰ２を合成するために細胞により再利用され得る。ＰＩＰ２、すなわち、１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の加水分解によって生成される他の第２のメッセンジャーは、細胞膜内にとどまっており、ここで、これは、酵素であるプロテインキナーゼＣを活性するための役割を担い得る。プロテインキナーゼＣは、通常、細胞の細胞質中で溶解して見出されるが、細胞内カルシウム濃度の増加に従い、この酵素は細胞膜へと移動し得、ここで、これはＤＡＧによって活性化され得る。様々な細胞におけるプロテインキナーゼＣの不活性化によって、種々の細胞応答（例えば、グリコーゲンシンターゼのリン酸化または種々の転写因子（例えば、ＮＦ−κＢ）のリン酸化）を生じる。「ホスファチジルイノシトール活性」という語句は、本明細書中で使用される場合、ＰＩＰ２の活性またはその代謝活性をいう。
このレセプターが関わり得る別のシグナル伝達経路は、ｃＡＭＰ代謝回転経路である。本明細書中で使用される場合、「環状ＡＭＰ代謝回転および環状ＡＭＰ代謝」とは、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の代謝回転および代謝ならびにこれらの分子の活性に関与する分子をいう。環状ＡＭＰは、特定のＧタンパク質共役レセプターのリガンド誘導刺激に応答して産生される第２メッセンジャーである。ｃＡＭＰシグナル伝達経路において、ＧＰＣＲに対するリガンドの結合によって、ｃＡＭＰ合成を触媒する酵素であるアデニルシクラーゼの活性化が生じ得る。新規に合成されたｃＡＭＰは、順に、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼを活性化し得る。この活性化されたキナーゼは、電位依存型カリウムチャネルタンパク質（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）または結合タンパク質をリン酸化し得、そして、活動電位の間にこのカリウムチャネルが開口しないようにし得る。このカリウムチャネルが開口し得ないことは、カリウムの外向きの流れの減少を生じ、ニューロンの膜を正常に再分極させ、長期化した膜脱分極に導き得る。
（ポリペプチド）
本発明は、新規Ｇ共役タンパク質レセプターの発見に基づく。具体的には、発現配列タグ（ＥＳＴ）が、Ｇタンパク質共役レセプター配列に対する相同性に基づいて選択された。このＥＳＴは、それが含む配列に基づいてプライマーを設計するために使用され、ヒトｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを同定するのに使用された。ポジティブクローンが配列決定され、そしてオーバーラップしたフラグメントはアセンブリされた。このアセンブリされた配列の分析によって、クローニングされたｃＤＮＡ分子は、Ｇタンパク質共役レセプターをコードすることが明らかにされた。
従って、本発明は、配列番号１において示される推定アミノ酸配列を有する新規のＧＰＣＲに関する。ＭＩＤ ２４１ ＧＰＣＲが、細胞内で切断されて、アミノ酸５８〜３６０を含む成熟形態を生成することが予想される（図１を参照のこと）。成熟ペプチドにおいて、アミノ酸１〜２０は、アミノ末端細胞外ドメインを構築し、アミノ酸２１〜２５１は膜貫通ドメインを占める領域を構築し、そしてアミノ酸２５２〜３６０は、カルボキシ末端細胞内ドメインを構築することが予測される。膜貫通ドメインは、５個の膜貫通セグメント、２個の細胞外ループおよび２つの細胞内ループを含む。これらの膜貫通セグメントは、アミノ酸約２１〜アミノ酸約４２、アミノ酸約１０２〜アミノ酸約１２２、アミノ酸約１４６〜アミノ酸約１７０、アミノ酸約１９４〜アミノ酸約２１８、およびアミノ酸約２２９〜アミノ酸約２５１で見出される（図２を参照のこと）。膜貫通ドメイン全体を占める領域内には、２つの細胞内ループおよび２つの細胞外ループが存在する。２つの細胞内ループは、アミノ酸約４３〜アミノ酸約１０１、およびアミノ酸約１７１〜アミノ酸約１９３で見出される。２つの細胞外ループは、アミノ酸約１２３〜アミノ酸約１４５、およびアミノ酸約２１９〜アミノ酸約２２８で見出される。
未成熟タンパク質において、アミノ酸１〜４０は、アミノ末端細胞外ドメインを構築し、アミノ酸４１〜３０７は、膜貫通ドメインを占める領域を構築し、そしてアミノ酸３０８〜３６０は、カルボキシ末端細胞内ドメインを構築することが予測される。この未成熟タンパク質の推定膜貫通ドメインは、６個の膜貫通セグメント、３個の細胞外ループおよび２個の細胞内ループを含む。これらの膜貫通セグメントは、アミノ酸約４１〜アミノ酸約６５、アミノ酸約７７〜アミノ酸約９８、アミノ酸約１５８〜アミノ酸約１７８、およびアミノ酸約２０２〜アミノ酸約２２６、アミノ酸約２５０〜アミノ酸約２７４、およびアミノ酸約２８５〜アミノ酸約３０７で見出される（図２を参照のこと）。成熟タンパク質中の推定膜貫通ドメインは、未成熟タンパク質中と同じであることを認識することが重要である。唯一の違いは、未成熟タンパク質について予測される第１の膜貫通ドメインが、成熟タンパク質には存在しないことである。膜貫通ドメイン全体を占める領域内には、２個の細胞内ループおよび２個の細胞外ループが存在する。２個の細胞内ループは、アミノ酸約９９〜アミノ酸約１５７、およびアミノ酸約２２７〜アミノ酸約２５１に見出される。２個の細胞外ループは、アミノ酸約６６〜アミノ酸約７６、およびアミノ酸約１７９〜アミノ酸約２０１、およびアミノ酸約２７５〜２８４に見出される。
膜貫通ドメインは、残基１３６〜１３８において、ＧＰＣＲシグナル伝達サイン、ＤＲＹを含む。この配列は、ＧＰＣＲ中の残基１３７に不変アミノ酸のアルギニンを含む。
ＭＩＤ ２４１レセプターとタンパク質パターンのＰｒｏｓｉｔｅデータベースとの比較は、７回膜貫通セグメントロドプシンスーパーファミリーに対するハイスコアを示す。図１の下線付きの領域は、ＧＰＣＲサイン、具体的には、ＧＰＣＲにおいて保存されるアルギニン残基の位置を示す。最も一般的に保存される配列は、アスパラギン酸、アルギニン、トリプシン（ＤＲＹ）のトリプレットである。ＤＲＹは、シグナル伝達と関連している。アルギニンは不変である。アスパラギン酸は、いくつかのＧＰＣＲ中に保存的に配置される。この場合、アルギニンは、配列ＤＲＹに見出され、これは、レセプターのロドプシンスーパーファミリーのＧＰＣＲ中のＤＲＹまたは不変アルギニンの位置と一致する。ＭＩＤ ２４１オープンリーディングフレームの分析は、特定の機能的部位に対応するアミノ酸を示す。Ｎ−グリコシル化部位は、アミノ酸約１３〜１６、２６〜２９および１８７〜１９０に見出される。グルコサミノグリカンの結合部位は、アミノ酸約２１〜２４に見出される。ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼおよびｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼのリン酸化部位は、アミノ酸約２３９〜２４２、２４４〜２４７および３２２〜３２５に見出される。タンパク質キナーゼＣのリン酸化部位は、アミノ酸約１４７〜１４９、２４２〜２４４および３６０〜３６２に見出される。カゼインキナーゼＩＩのリン酸化部位は、アミノ酸約１８９〜１９２に見出される。Ｎ−ミリストイル化部位は、アミノ酸約１８〜２３、５４〜５９、１８３〜１８８、１９５〜２００、２３２〜２３７、３２６〜３３１および３５６〜３６１に見出される。原核生物膜リポタンパク質脂質結合部位は、アミノ酸約２５０〜２６０、１２５〜１４１および３６１〜３６３に見出される。さらに、ＧＰＣＲサインの位置に対応し、かつ不変アルギニンを含むアミノ酸は、配列ＤＲＹ中のアミノ酸約１２５〜１４１に見出される。微小体Ｃ末端標的化シグナルは、アミノ酸約３６１〜３６３に見出される。「ＭＩＤ ２４１レセプターポリペプチド」または「ＭＩＤ ２４１レセプタータンパク質」とは、配列番号１のポリペプチドをいう。しかし、用語「レセプタータンパク質」または「レセプターポリペプチド」は、本明細書中で記載される多数の改変体、ならびに全長ＭＩＤ ２４１ポリペプチド由来のフラグメントおよび改変体（例えば、配列番号３）をさらに含む。従って、本発明は、単離または精製されたＭＩＤ ２４１レセプターポリペプチドならびにその改変体およびフラグメントを提供する。
ＭＩＤ２４１ポリペプチドは、３個の主要構造ドメインを示す３６０残基のタンパク質である。アミノ末端細胞外ドメインは、配列番号１の残基１〜約２０内にあると同定されている。膜貫通ドメインは、配列番号１の残基約２１〜約２５１内にあると同定されている。カルボキシ末端細胞内ドメインは、配列番号１の残基約２５２〜３６０内にあると同定されている。膜貫通ドメインは、膜を占める７個のセグメントを含む。成熟タンパク質中の膜貫通セグメントは、アミノ酸約２１〜アミノ酸約４２、アミノ酸約１０２〜アミノ酸約１２２、アミノ酸約１４６〜アミノ酸約１７０、アミノ酸約１９４〜アミノ酸約２１８、およびアミノ酸約２２９〜アミノ酸約２５１に見出される。膜貫通ドメイン全体を占める領域内には、２個の細胞内ループおよび２個の細胞外ループが存在する。２個の細胞内ループは、アミノ酸約４３〜アミノ酸約１０１およびアミノ酸約１７１〜アミノ酸約１９３に見出される。２個の細胞外ループは、アミノ酸約１２３〜アミノ酸約１４５、およびアミノ酸約２１９〜アミノ酸約２２８に見出される。
未成熟のタンパク質において、アミノ酸１〜４０はアミノ末端の細胞外ドメインを構成し、アミノ酸４１〜３０７は膜貫通ドメインにわたる領域を構成し、そしてアミノ酸３０８〜３６０はＣ末端の細胞内ドメインを構成すること予測される。未成熟タンパク質の予測される膜貫通ドメインは、６つの膜貫通ドメイン、３つの細胞外ループおよび２つの細胞内ループを含む。膜貫通セグメントは、約アミノ酸４１〜約アミノ酸６５、約アミノ酸７７〜約アミノ酸９８、約アミノ酸１５８〜約アミノ酸１７８、および約アミノ酸２０２〜約アミノ酸２２６、約アミノ酸２５０〜約アミノ酸２７４、および約アミノ酸２８５〜約アミノ酸３０７に見出される。膜貫通ドメイン全体にわたる領域内には、２つの細胞内ループおよび２つの細胞外ループが存在する。２つの細胞内ループは、約アミノ酸９９〜約アミノ酸１５７および約アミノ酸２２７〜約アミノ酸２５１に見出される。２つの細胞外ループは、約アミノ酸６６〜約アミノ酸７６および約アミノ酸１７９〜約アミノ酸２０１、ならびに約アミノ酸２７５〜約アミノ酸２８４において見出される。
膜貫通ドメインは、残基１３６−１３８でＧＰＣＲシグナル伝達サイン、ＤＲＹを含む。この配列としては、ＧＰＣＲにおける不変のアミノ酸である残基１３７のアルギニンが挙げられる。
ＢＬＡＳＴ分析に基づいて、最も高い配列相同性がＧＰＣＲのロドプシンスーパーファミリーに示された。
本明細書中で使用される場合、組換え細胞および非組換え細胞から単離される際、細胞物質を実質的に含まない場合、または化学合成される際に、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない場合、ポリペプチドは、「単離」または「精製」されたといわれる。しかし、ポリペプチドは、細胞に通常結合しておらず、なお「単離」または「精製」されていると考えられる別のポリペプチドに結合され得る。
レセプターポリペプチドは、均一に精製され得る。しかし、ポリペプチドが均一に精製されていない調製物は、有用であり、そして単離された形態のポリペプチドを含むと考えられることが理解される。重要な特徴は、この調製物が、顕著な量の他の成分の存在下でさえもポリペプチドの所望の機能を可能にすることである。従って、本発明の種々の程度の精製を包含する。
１つの実施形態において、用語「細胞物質を実質的に含まない」は、約３０％未満（乾燥重量）の他のタンパク質（すなわち、汚染タンパク質）、約２０％未満の他のタンパク質、約１０％未満の他のタンパク質、または約５％未満の他のタンパク質を有するレセプターポリペプチドの調製物が挙げられる。レセプターポリペプチドが、組換え生成される場合、これはまた、培養培地を実質的に含み得ない（すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満を示す）。
用語「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、レセプターポリペプチドの調製物を含み、ここでこれは、その合成に関する化学物質前駆体または他の化学物質から分離される。１つの実施形態において、用語「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」としては、約３０％未満（乾燥重量）の化学物質前駆体または他の化学物質、約２０％未満の化学物質前駆体または他の化学物質、約１０％未満の化学物質前駆体または他の化学物質、あるいは約５％未満の化学物質前駆体または他の化学物質を有するポリペプチドの調製物が挙げられる。
１つの実施形態において、レセプターポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む。しかし、本発明はまた、配列改変体を包含する。改変体としては、生物において同じ遺伝子座によってコードされる実質的に相同なタンパク質が挙げられる（すなわち、対立遺伝子改変体）。改変体はまた、生物中の他の遺伝子座由来だが、配列番号１のＭＩＤ ２４１レセプタータンパク質に対する実質的な相同性を有するタンパク質を包含する。改変体はまた、ＭＩＤ ２４１レセプタータンパク質に実質的に相同性だが、別の生物に由来するタンパク質を含む。例えば、ヒトＭＩＤ ２４１は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＭＩＤ ２４２４と８０％相同性、Ｍａｃａｃａ ｍａｃａｃａｌ ＭＩＤ １３０７９と９９％相同性、そしてＲａｔｔｕｓ ｒａｔｔｕｓ ＭＩＤ ４６０１に８０％相同性を共有する。改変体はまた、化学合成によって生成されるＭＩＤ ２４１レセプタータンパク質に実質的に相同であるタンパク質を含む。改変体はまた、組換え方法によって生成されたＭＩＤ ２４１レセプタータンパク質に実質的に相同性であるタンパク質を含む。しかし、改変体が本発明の前に開示された、いずれのアミノ酸配列も含まないことが理解される。
本明細書中で使用される場合、２つのタンパク質（またはタンパク質の領域）は、アミノ酸配列が少なくとも約５０〜５５％、約５５〜６０％、代表的には少なくとも約７０〜７５％、より代表的には少なくとも約８０〜８５％、そして最も代表的には少なくとも約９０〜９５％以上相同性である場合に、実質的に相同性である。本発明に従う実質的に相同なアミノ酸配列は、以下により完全に記載されるようなストリンジェントな条件下で、配列番号２に示される配列の核酸配列またはその一部にハイブリダイズする核酸配列によってコードされる。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性のパーセントを決定するため、この配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、最適な整列のために第１のアミノ酸および第２のアミノ酸の１つもしくは両方、または核酸配列にギャップが導入され得、そして非相同配列は、比較目的のためには無視され得る）。好ましい実施形態において、比較目的のために整列された参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％である（例えば、３６０個のアミノ酸残基を有する、本明細書中のアミノ酸配列に対して第２配列を整列させる場合、少なくとも８０個のアミノ酸残基、好ましく少なくとも１００個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１２０個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも１４０個のアミノ酸残基、およびさらにより好ましくは少なくとも２００個、２５０個、３００個、３６０個以上のアミノ酸残基が整列される）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列位置が、第２の配列において対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占領される場合、分子はその位置で同一である（本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。２つの配列間の同一性のパーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数であり、２つの配列の最適な整列のために導入されることが必要であるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。
本発明はまた、低い程度の同一性を有するが、ＭＩＤ ２４１ポリペプチドによって実行される１つ以上の同じ機能を実行するために十分な類似性を有するポリペプチドを包含する。類似性は、保存アミノ酸置換によって決定される。このような置換は、同様の特徴の別のアミノ酸によってポリペプチド中の所定のアミノ酸を置換する置換である。保存的置換は、表現型的にサイレントであるようである。代表的に保存的置換とみなされるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの互いか、その間での置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、および芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントである可能性があるかについてのガイダンスは、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出される。
Figure 2005519637
Figure 2005519637
配列の比較ならびに２つの配列間の同一性パーセントおよび類似性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）においてＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクス、ならびにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４およびレングスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスならびにギャップウェイト４０、５０、６０、７０、または８０およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。別の実施形態において、２種のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントが、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル、ギャップレングスペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて決定される。
本発明の核酸配列およびタンパク質配列は、公共のデータベース（例えば、他のファミリーメンバーまたは関連の配列を同定するためのデータベース）に対して検索を実行するために「照合配列」としてさらに使用され得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）を用いて実行され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、語長＝３）を用いて実行され得る。比較目的のためのギャップ整列を得るために、ギャップＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２（１９９７））に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴプログラムおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用する際、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期パラメータが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
改変体ポリペプチドは、１つ以上の置換、欠失、挿入、転移、融合、および短縮またはこれらのいずれかの組み合わせによってアミノ酸配列と異なり得る。
改変体ポリペプチドは、完全に機能的であり得るか、または１つ以上の活性において、機能を欠き得る。従って、この場合において改変体は、例えば、リガンド結合、膜会合、Ｇタンパク質結合およびシグナル伝達に対応する領域の１つ以上の機能に影響し得る。
完全に機能的な改変体は、代表的に保存的改変体、または重要でない残基もしくは重要でない領域中の改変のみを含む。機能的改変体はまた、機能において何の変化も生じないか、または有意でない変化を生じる類似のアミノ酸の置換を含み得る。あるいは、このような置換は、いくらかの程度で機能にポジティブにまたはネガティブに影響し得る。
非機能的改変体は、代表的に、１つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、転移、または重要な残基もしくは重要な領域における短縮または置換、挿入、転移または欠失を含む。
示されるように、改変体は、天然に存在し得るか、または組換え手段もしくは化学合成によって作製され得、レセプターポリペプチドに有用かつ新規な特徴を提供する。これは、タンパク質凝集を予防することによって薬学的処方物からの免疫原性を予防する工程を包含する。
有用な改変体は、リガンド結合特性の改変をさらに含む。例えば、１つの実施形態は、リガンドの結合を生じるが、放出を生じないか、または遅い放出（ｓｌｏｗｅｒ ｒｅｌｅａｓｅ）を生じる結合部位での改変を含む。同じ部位でのさらなる有用な改変は、リガンドについて高い親和性を生じ得る。有用な改変としてはまた、別のリガンドへ親和性を提供する変化が挙げられる。別の有用な改変としては、結合を可能にするが、リガンドによる活性化を防ぐことを可能にする改変が挙げられる。別の有用な改変としては、膜貫通Ｇタンパク質結合／シグナル伝達ドメインにおける改変が挙げられ、これは、適切なＧタンパク質による結合の減少または増加を提供するか、あるいはレセプターが正常に会合しているものとは異なるＧタンパク質による結合を提供する。別の有用な改変は、融合タンパク質を提供し、ここで１つ以上のドメインまたはサブ領域が、別のＧタンパク質結合レセプター由来の１つ以上のドメインまたはサブ領域に必要に応じて融合される。
機能にとって必須のアミノ酸は、当該分野において公知の方法（例えば、部位特異的変異、またはアラニンスキャニング変異（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））によって同定され得る。後者の手順は、分子中の各々の残基で単一のアラニン変異を導入する。次いで、生じた変異分子は、生物学的活性（例えば、レセプター結合、もしくはインビトロでの生物学的活性）、またはインビトロでの増殖活性について試験される。リガンドレセプター結合に重要な部位はまた、構造分析（例えば、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）；ｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））によって決定され得る。
実質的に相同性は、核酸配列またはアミノ酸配列の全体、あるいはこれらの配列のフラグメントに対してであり得る。
従って、本発明はまた、ＭＩＤ ２４１レセプタータンパク質のポリペプチドフラグメントを含む。フラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に由来し得る。しかし、本発明はまた、本明細書中に記載されるようなＭＩＤ ２４１レセプタータンパク質の改変体のフラグメントを包含する。
しかし、本発明に関するフラグメントは、本発明の前に開示され得るフラグメントを包含するように構築されない。
本明細書中で使用される場合、フラグメントは、アミノ酸１〜アミノ酸３６０の少なくとも１０個連続したアミノ酸を含む。フラグメントは、タンパク質の生物学的活性（例えば、Ｇタンパク質またはリガンドに結合する能力）、およびレセプター抗体を生成するための免疫原として使用され得るフラグメントの１つ以上を保持する。
生物学的に活性なフラグメント（例えば、１０、１２、１５、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００以上のアミノ酸長であるペプチド）は、ドメインまたはモチーフ（例えば、細胞外ドメインまたは細胞内ドメインまたはループ、１つ以上の膜貫通セグメント、またはその一部、Ｇタンパク質結合部位、またはＧＰＣＲサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）、グリコシル化部位、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼおよびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ、ならびにプロテインキナーゼＣのリン酸化部位、ならびにミリストイル化部位）を含み得る。
可能性のあるフラグメントとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：１）配列番号１の約アミノ酸１〜約アミノ酸２０の全体のアミノ末端細胞外ドメインまたはその一部を含む可溶性ペプチド；２）配列番号１の約アミノ酸２５２〜約アミノ酸３６０のカルボキシ末端細胞内ドメインの全体を含むペプチドまたはその一部；３）約アミノ酸２１〜約アミノ酸２５１の膜貫通ドメイン全体にわたる領域を含むペプチド；４）任意の特定の膜貫通セグメントまたはその一部；５）任意の３つの細胞内ループまたは３つの細胞外ループ、あるいはその一部。
フラグメントは、タンパク質の生物学的活性（例えば、Ｇタンパク質またはリガンドに結合する能力）の１つ以上を保持し得る。フラグメントはまた、レセプター抗体を生成する免疫原として有用であり得る。
生物学的に活性なフラグメントは、ドメインまたはモチーフ（例えば、細胞外ドメインもしくは細胞内ドメインまたはループ、１つ以上の膜貫通セグメント、またはその一部、Ｇタンパク質結合部位、またはＧＰＣＲサイン、グリコシル化、グリコサミノグリカン接着部位、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、プロテインキナーゼＣリン酸化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、Ｎミリストイル化部位、原核生物膜リポタンパク質接着部位、ならびにミクロボディＣ末端標的化シグナル）を含み得る。このようなペプチドは、例えば、１０、１５、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００以上のアミノ酸長であり得る。
可能性のあるフラグメントとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：１）配列番号１の約アミノ酸１〜約アミノ酸２０のアミノ末端細胞外ドメインの全体を含む可溶性ペプチドまたはその一部；２）配列番号１の約アミノ酸２５２〜約アミノ酸３６０のカルボキシ末端細胞内ドメインの全体を含むペプチドまたはその一部；３）配列番号１の約アミノ酸２１〜約アミノ酸２５１の膜貫通ドメインの全体にわたる領域を含むペプチドを含むペプチドまたはその一部；４）約アミノ酸２１〜約アミノ酸４２、約アミノ酸１０２〜約アミノ酸１２２、約アミノ酸１４６〜約アミノ酸１７０、約アミノ酸１９４〜約アミノ酸２１８、および約アミノ酸２２９〜約アミノ酸２５１の任意の成熟タンパク質の特定の膜貫通セグメントまたはその一部；５）約アミノ酸４３〜約アミノ酸１０１、約アミノ酸１７１〜約アミノ酸１９３、約アミノ酸１２３〜約アミノ酸１４５、および約アミノ酸２１９〜約アミノ酸２２８の任意の２つの細胞内ループもしくは２つの細胞外ループ、またはその一部。
他の可能性のあるフラグメントとしては、以下の未成熟タンパクのフラグメントが挙げられるがそれらに限定されない：１）配列番号１の約アミノ酸１〜約アミノ酸４０のアミノ末端細胞外ドメインの全体を含む可溶性ペプチドまたはその一部；２）配列番号１の約アミノ酸３０８〜約アミノ酸３６０のカルボキシ末端細胞内ドメインの全体を含むペプチドまたはその一部；３）配列番号１の約アミノ酸４１〜約アミノ酸３０７の膜貫通ドメインの全体にわたる領域を含むペプチドまたはその一部；４）約アミノ酸４１〜約アミノ酸６５、約アミノ酸７７〜約アミノ酸９８、約アミノ酸１５８〜約アミノ酸１７８、約アミノ酸２０２〜約アミノ酸２２６、および約アミノ酸２５０〜約アミノ酸２７４の任意の成熟タンパク質の特定の膜貫通セグメントまたはその一部；５）約アミノ酸９９〜約アミノ酸１５７、約アミノ酸２２７〜約アミノ酸２５１、約アミノ酸６６〜約アミノ酸７６、約アミノ酸１７９〜約アミノ酸２０１、および約アミノ酸２７５〜約アミノ酸２８４の任意の２つの細胞内ループもしくは３つの細胞外ループ、またはその一部。フラグメントとしては、上記のフラグメントの組み合わせ（例えば、１つ以上の膜貫通セグメントと組み合わされたアミノ末端ドメイン、および付随の細胞外ループもしくは細胞内ループまたは１つ以上の膜貫通セグメント、および付随の細胞内ループもしくは細胞外ループおよびカルボキシ末端ドメイン）がさらに挙げられる。従って、任意の上記のフラグメントが組み合わせられ得る。他のフラグメントとしては、約アミノ酸６〜３６０の成熟タンパク質が挙げられる。他のフラグメントは、本明細書中に記載される種々の機能的部位（例えば、グリコシル化部位、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位およびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、プロテインキナーゼＣリン酸化部位、Ｎ−ミリストイル化部位、およびＧＰＣＲサイン配列を含む配列）を含む。例えば、フラグメントは、機能的部位から一方、または両方の方向に伸長して５、１０、１５、２０、３０、４０、５０から１００までのアミノ酸を含み得る。さらに、フラグメントは、上記の特定のドメインのサブフラグメントを含み得、このサブフラグメントは、その由来するドメインの機能を保持する。
フラグメントはまた、図１において高い抗原性指標を有することが示されている抗原フラグメントおよび特異的フラグメントを含む。
従って、可能性のあるフラグメントとしては、以下が挙げられる：リガンド結合部位を規定するフラグメント、膜会合を規定するフラグメント、Ｇタンパク質とシグナル伝達との相互作用を規定するフラグメント、ならびにグリコシル化部位、グリコサミノグリカン接着部位、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位およびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、プロテインキナーゼＣリン酸化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位およびＮ−ミリストイル化部位を規定するフラグメント。関連の機能を提供するか、または同定される関連の機能を可能にする別個のフラグメントによって、これは意図される。好ましい実施形態において、このフラグメントは、リガンド結合部位を含む。
本発明はまた、免疫原性の特徴を有するフラグメントを提供する。これらは、ＭＩＤ ２４１レセプタータンパク質および改変体のエピトープ保有部位を含む。これらのエピトープ保有ペプチドは、レセプターポリペプチドもしくは領域もしくはフラグメントに特異的に結合する抗体を惹起するために有用である。これらのペプチドは、少なくとも１０、１２、少なくとも１４、または少なくとも約１５〜約３０アミノ酸の間を含み得る。
抗体を産生するために使用され得る抗原性ポリペプチドの非制限的な例としては、以下が挙げられる：アミノ末端細胞外ドメイン、または任意の細胞外ループ由来のペプチド。高い抗原性指標を有する領域は、図１に示される。しかし、細胞内産抗体（「細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」）もまた包含され、これは、細胞内レセプターペプチド領域を認識する。
レセプターポリペプチド（本発明の以前に開示され得た改変体およびフラグメントを含む）は、ＧＰＣＲに関する生物学的アッセイについて有用である。このようなアッセイは、ＧＰＣＲ関連状態の診断および処置に有用な既知のＧＰＣＲの機能または活性または特性のいずれかを含む。
エピトープ保有レセプターおよびポリペプチドは、任意の従来法（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５））によって生成され得る。同時多ペプチド合成は、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。
フラグメントは、別個（他のアミノ酸またはポリペプチドに融合していない）であり得るか、またはより大きいポリペプチド内であり得る。さらに、いくつかのフラグメントは、単一のより大きいポリペプチド内に含まれ得る。１つの実施形態において、宿主中での発現のために設計されたフラグメントは、レセプターフラグメントのアミノ末端に融合した異種プレポリペプチドおよびプロポリペプチド領域、ならびにフラグメントのカルボキシ末端に融合したさらなる領域を有し得る。
従って、本発明は、キメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。これらは、レセプタータンパク質に実質的に相同性ではないアミノ酸配列を有する異種タンパク質に作動可能に連結したレセプタータンパク質を含む。「作動可能に連結した」は、レセプタータンパク質および異種タンパク質がインフレームで融合されていることを示す。異種タンパク質は、レセプタータンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
１つの実施形態において、融合タンパク質は、本質的にレセプター機能に影響しない。例えば、融合タンパク質は、ＧＳＴ融合タンパク質であり得、ここでレセプター配列は、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合している。他の型の融合タンパク質としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：酵素融合タンパク質（例えば、βガラクトシダーゼ融合、酵母ツーハイブリッドＧＡＬ融合物、ポリＨｉｓ融合物およびＩｇ融合物）。このような融合タンパク質（特に、ポリＨｉｓ融合物）は、組換えレセプタータンパク質の精製を容易にし得る。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、タンパク質の発現および／または分泌は、異種シグナル配列を用いることによって増加され得る。故に、別の実施形態において、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む。
ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３は、免疫グロブリン定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。Ｆｃは、治療および診断において有用であり、従って、例えば、改善された薬物動態学の特徴を生じる（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。薬物送達において、例えば、ヒトタンパク質は、アンタゴニストを同定するための高処理スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合された。Ｂｅｎｎｅｔｔら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ．８：５２−５８（１９９５））およびＪｏｈａｎｓｏｎら（Ｊ；Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１６：９４５９−９４７１（１９９５））。従って、本発明はまた、種々のサブクラスの免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖または軽鎖の定常領域のレセプターポリペプチドおよび種々の部分を含む可溶性融合タンパク質を含む。融合がヒンジ領域で生じるヒトＩｇＧ（特に、ＩｇＧ１）の重鎖定常部分が、免疫グロブリンとして好ましい。いくつかの使用のために、融合タンパク質が意図された目的のために使用された後（例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用された際）にＦｃが除去されることが望ましい。特定の実施形態において、Ｆｃ部分は、切断配列によって単純な方法で除去され得、これはまた組み込まれてＸａ因子を用いて切断され得る。
キメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。例えば、異なるタンパク質配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の技術によってインフレームで一緒にライゲーションされる。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成を含む従来技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、アンカープライマーを用いて実行され得、これは２つの連続した遺伝子フラグメントの間に相補的オーバ−ハングを発生させ、これは、その後アニールされ再増幅されキメラ遺伝子配列を生じ得る（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２を参照のこと）。さらに、多くの発現ベクターが、市販されており、これらはすでに融合部分（例えば、ＧＳＴタンパク質）をコードしている。レセプタータンパク質コード核酸は、このような発現ベクターにクローン化され得、その結果、融合部分は、インフレームでレセプタータンパク質に連結される。
融合タンパク質の別の形態は、レセプター機能に直接影響する。従って、レセプターポリペプチドは、本発明によって包含され、ここでレセプタードメイン（またはその一部）の１つ以上は、別のＧタンパク質共役レセプターまたは他の型のレセプターから相同ドメイン（またはその一部）によって置換されている。従って、種々の置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）が可能である。アミノ末端細胞外ドメイン、またはそのサブ領域（例えば、リガンド結合）は、別のリガンド結合レセプタータンパク質からドメインまたはサブ領域で置換され得る。あるいは、膜貫通ドメインの全体、または任意の７つのセグメントもしくはループ、またはその一部（例えば、Ｇタンパク質結合／シグナル伝達）が、置換され得る。最終的に、カルボキシ末端細胞内ドメインまたはサブ領域が、置換され得る。従って、キメラレセプターは、１つ以上のネイティブドメインまたはサブ領域が置換されて形成され得る。
単離されたレセプタータンパク質は、本明細書中に開示されるように、それを天然に発現する細胞（例えば、脳（特にグリア細胞）、ＣＤ３４＋細胞）、およびそれを発現するように改変（組換え）された細胞株（例えば、ＨＥＫ ２９３およびＪｕｒｋａｔ）から精製されたか、または公知のタンパク質合成方法を用いて合成された系統から精製され得る。
１つの実施形態では、このタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により生成される。例えば、このレセプターポリペプチドをコードする核酸分子は、発現ベクターへクローン化され、この発現ベクターが、宿主細胞へ導入され、そしてこのタンパク質がその宿主細胞中で発現される。次いで、このタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームにより細胞から単離され得る。
ポリペプチドは、しばしば、２０個の天然に存在するアミノ酸と通常いわれる２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含む。さらに、多くのアミノ酸（末端のアミノ酸を含む）は、天然のプロセス（例えば、プロセシングおよび他の翻訳後修飾）によるか、または当該分野で周知の化学的改変技術により、改変され得る。ポリペプチドにおいて天然に生じる通常の改変は、基本書、詳細な論文および研究文献に記載され、そしてこれらは、当業者に周知である。
従って、このポリペプチドはまた、置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基ではないか、置換基が含まれているか、成熟ポリペプチドが別の化合物（例えば、そのポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール））と融合されているか、またはさらなるアミノ酸（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列または成熟ポリペプチドもしくはプロプロテイン配列の精製のための配列）が成熟ポリペプチドに融合されている、誘導体またはアナログを包含する。
公知の改変は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド生成、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒロドキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられるが、これらに限定されない。
このような改変は、当業者に周知であり、科学文献により詳細に記載される。いくつかの特定の一般的な改変（例えば、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγカルボキシル化、ヒロドキシル化およびＡＤＰ−リボシル化）は、最も基本的な文献（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第二版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）など）に記載される。多くの詳細な概説は、本テーマに対して利用可能である（Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １〜１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６〜６４６（１９９０）およびＲａｔｔａｎらＡｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８〜６２（１９９２）などによる）。
また周知のように、ポリペプチドは、かならずしも常に完全に直鎖状というわけではない。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝され得、そして天然のプロセシング事象を含む翻訳後事象および天然には生じない人為的操作によって引き起こされる事象の結果として一般的に分枝を有するかまたは有さない環状であり得る。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、非翻訳自然プロセスによっておよび合成方法によって合成され得る。
改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含むポリペプチドにおいてどこにでも生じ得る。共有改変による、ポリペプチドにおけるアミノ基もしくはカルボキシル基、または両方の妨害は、天然に存在するポリペプチドおよび合成ポリペプチドにおいて一般的である。例えば、タンパク質分解性プロセシングの前にＥ．ｃｏｌｉによって作製されるポリペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど必ずＮ−ホルミルメチオニンである。
改変は、タンパク質が作製される方法の関数であり得る。例えば、組換えポリペプチドについて、改変は、宿主細胞翻訳後改変能力によって決定され、そして改変は、ポリペプチドアミノ酸配列に伝達する。従って、グリコシル化が、所望される場合、ポリペプチドは、グリコシル化宿主（一般的に真核生物細胞）において発現されるべきである。昆虫細胞は、しばしば哺乳動物細胞と同じ翻訳後グリコシル化を実行し、この理由で、昆虫細胞発現システムは、グリコシル化のネイティブパターンを有する哺乳動物タンパク質を有効に発現するよう開発される。同様の考察は、他の改変に適用する。
改変の同じ型は、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じかまたは異なる程度で存在し得る。また、所定のポリペプチドは、１つより多くの型の改変を含み得る。
推測されるドメインおよび機能部位は、当業者に公知であり、そして容易に利用可能であるコンピュータープログラム（例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ分析）によって、容易に同定可能である。
（ポリペプチドの使用）
このレセプターポリペプチドは、ＭＩＤ ２４１レセプタータンパク質、ＭＩＤ ２４１レセプター領域またはＭＩＤ ２４１レセプターフラグメントに特異的な抗体を産生するのに有用である。高度な抗原性指標スコアを有する領域を、図３に示す。
このレセプターポリペプチド（本発明以前に開示され得た改変体およびフラグメントを含有する）は、ＧＰＣＲに関係する生物学的アッセイに有用である。このようなアッセイは、ＧＰＣＲに関係する状態の診断および処置に有用な、任意の既知のＧＰＣＲ機能または活性または特性に関する。
このレセプターポリペプチドはまた、薬物スクリーニングアッセイ、細胞ベースの系または無細胞系において有用である。細胞ベースの系は、バイオプシーとして、または細胞培養において拡大された、ネイティブ（すなわち、レセプタータンパク質を正常に発現する細胞）であり得る。しかし、１つの実施形態において、細胞ベースのアッセイはレセプタータンパク質を発現する組換え宿主細胞を含む。
このポリペプチドを使用して、レセプター活性を調節する化合物を同定し得る。ＭＩＤ ２４１タンパク質ならびに適切な改変体およびフラグメントのいずれも、ハイスループットスクリーニングにおいて使用され得、レセプターに結合する能力について、候補化合物をアッセイし得る。これらの化合物をさらに機能性レセプターに対してスクリーニングして、その化合物のレセプター活性に対する作用を決定し得る。レセプターを所望の程度に活性化する（アゴニスト）かまたは不活性化する（アンタゴニスト）化合物を、同定し得る。
このレセプターポリペプチドを使用して、レセプタータンパク質と、レセプタータンパク質と正常に相互作用する標的分子との間の相互作用を、刺激または阻害する能力について、化合物をスクリーニングし得る。この標的は、レセプタータンパク質が正常に相互作用する、リガンドまたはシグナル伝達経路の成分（例えば、ｃＡＭＰもしくはホスファチジルイノシトール代謝回転および／またはアデニル酸シクラーゼ、あるいはホスホリパーゼＣの活性化に関係するＧタンパク質あるいは他の相互作用因子）であり得る。このアッセイは、レセプタータンパク質またはフラグメントが標的分子と相互作用し得る条件下で、レセプタータンパク質を候補化合物と組み合わせる工程、およびそのタンパク質と標的との間の複合体形成を検出する工程またはそのレセプタータンパク質と標的との相互作用（例えば、Ｇタンパク質リン酸化、ｃＡＭＰまたはホスファチジルイノシトールの代謝回転、およびアデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼＣの活性化のような、シグナル伝達の任意の関連作用）の生化学的結果を検出する工程を、包含する。
候補化合物としては、例えば、以下が挙げられる：１）可溶性ペプチドのようなペプチド（Ｉｇテール化された融合ペプチドおよびランダムベプチドライブラリーのメンバーを含む（例えば、Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４（１９９１）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４〜８６（１９９１）を参照のこと）、ならびにＤ配置および／またはＬ配置のアミノ酸から作製されるコンビナトリアル化学由来の分子ライブラリー；２）ホスホペプチド（例えば、ランダムかつ部分的に縮退した、指向性のホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ ７２：７６７〜７７８（１９９３）を参照のこと）；３）抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イデオタイプ抗体、キメラ抗体、および単鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、および抗体のエピトープ結合フラグメント）；ならびに４）有機低分子および無機低分子（例えば、コンビナトリアルライブラリーおよび天然産物ライブラリーから得られた分子）。
１つの候補化合物は、可溶性の全長のレセプターまたはリガンド結合に対して競合するフラグメントである。他の候補化合物としては、変異レセプターまたは適切なフラグメント（レセプター機能に影響し、従ってリガンドに対して競合する変異体を含む）が挙げられる。従って、リガンドに対して競合するフラグメント（例えば、高い親和性で）、またはリガンドを結合するが放出させないフラグメントは、本発明によって包含される。
本発明は、レセプター活性を調節（刺激または阻害）する化合物を同定するための、他の目的を提供する。このアッセイは、代表的には、レセプター活性を示すシグナル伝達経路における事象のアッセイを含む。従って、レセプタータンパク質依存性のシグナル伝達カスケードに応答して上方制御または下方制御される遺伝子の発現をアッセイし得る。１つの実施形態において、このような遺伝子の調節領域は、容易に検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）と作動可能に連結され得る。あるいは、レセプタータンパク質、またはレセプタータンパク質標的のリン酸化もまた測定され得る。
レセプターによって媒介される、任意の生物学的機能または生化学的機能は、目的のアッセイとして使用され得る。これらの目的のアッセイは、本明細書中、本明細書中に列挙された参考文献（これらの目的のアッセイ標的について、参考として包含される）に記載された全ての生化学的事象または生化学的／生物学的事象、ならびに当業者に公知の他の機能の全てを含む。
結合化合物および／または活性化化合物もまた、アミノ末端の細胞外ドメインもしくはその部分、膜貫通ドメイン全体、またはそのサブ領域（ｓｕｂｒｅｇｉｏｎ）（例えば、任意の７つの膜貫通セグメントまたは任意の細胞内ループもしくは細胞外ループ、ならびにカルボキシ末端細胞内ドメインもしくはその部分は、異種性のドメインまたはサブ領域により置き換えられ得たキメラレセプタータンパク質を使用することにより、スクリーニングされ得る。例えば、異なるＧタンパク質と相互作用し、次いでネイティブなレセプターによって認識される、Ｇタンパク質結合領域を使用し得る。従って、異なるセットのシグナル伝達成分は、活性化のための目的のアッセイとして利用可能である。あるいは、膜貫通部分全体またはサブ領域（例えば、膜貫通セグメント、または細胞内ループもしくは細胞外ループ）は、アミノ末端細胞外ドメインおよび／またはＧタンパク質結合領域が由来する宿主細胞とは異なる宿主細胞に特異的な、膜貫通部分全体または膜貫通サブ領域全体と置き換えられ得る。このことは、そのレセプターが由来する特定の宿主細胞以外の細胞においてアッセイを実施することを可能にする。あるいは、アミノ末端細胞外ドメイン（および／または他のリガンド結合領域）は、異なるリガンドを結合するドメイン（および／または他の結合領域）により置き換えられ得、これによって、異種性のアミノ末端細胞外ドメイン（または領域）と相互作用するが、以前としてシグナル伝達を生じる試験化合物についてのアッセイを提供する。最終的に、ネイティブなシグナル伝達経路の一部である転写調節配列と作動可能に連結された、容易に検出可能なコード領域を含むレポーター遺伝子によって、活性化を検出し得る。
レセプターポリペプチドはまた、このレセプターと相互作用する化合物を発見するために設計された方法での競合結合アッセイにおいて、有用である。従って、化合物がこのポリペプチドを結合することを可能にするか、またはそうでなければポリペプチドと相互作用することを可能にする条件下で、その化合物をレセプターポリペプチドに曝す。また、可溶性ポリペプチドレセプターをその混合物に添加する。試験化合物が可溶性レセプターポリペプチドと相互作用する場合、この化合物は形成される複合体の量またはレセプター標的からの活性を低下させる。この型のアッセイは、レセプターの特定の領域と相互作用する化合物を求める場合に特に有用である。従って、標的のレセプター領域と競合する可溶性ポリペプチドを、目的の領域に対応するペプチド配列を含むように設計する。
無細胞薬物スクリーニングアッセイを実施するために、ならびにこのアッセイの自動化に適応するために、タンパク質の片方または両方の複合体化していない形態からの複合体の分離を容易にするよう、レセプタータンパク質もしくはフラグメント、またはその標的分子のいずれかを固定化することが望ましい。
タンパク質をマトリクス上に固定化するための技術を、薬物スクリーニングアッセイにおいて使用し得る。１つの実施形態において、そのタンパク質をマトリクスに結合することを可能にするドメインを付加した、融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＭＩＤ ２４１融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、またはグルタチオンで誘導化されたマイクロタイタープレート上に吸着し得、次いでこれらを細胞溶解物（例えば、３５Ｓ標識された細胞溶解物）および候補化合物と混ぜ合わせ、そしてこの混合物を、複合体形成を成す条件下（例えば、生理的条件の塩およびｐＨ）でインキュベートする。インキュベートの後、そのビーズを洗浄して未結合の標識をすべて取り除き、そしてこのマトリクスを固定しそして放射性標識を直接的に測定するか、またはこの複合体の解離の後に上清中の放射性標識を測定する。あるいは、この複合体をマトリクスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてビーズ画分中に見出されるレセプター結合性タンパク質のレベルを、標準的な電気泳動技術を使用してゲルから定量し得る。例えば、当該分野で周知の技術を使用するビオチンおよびストレプトアビジンの結合体化を利用して、ポリペプチドまたはその標的分子のいずれかを固定化し得る。あるいは、タンパク質と反応性であるが、そのタンパク質が標的分子に結合することを阻害しない抗体を、プレートのウェルへと誘導体化し得、そしてそのタンパク質を抗体結合体によってウェル中に捕捉し得る。レセプター結合性タンパク質および候補化合物の調製物を、レセプタータンパク質が存在するウェル中でインキュベートし、そしてウェル中に捕捉された複合体の量を定量し得る。このような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ固定化複合体についての上記の方法に加えて、レセプタータンパク質標的分子と反応性の抗体、またはレセプタータンパク質と反応性でありかつ標的分子と競合する抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびに標的分子と関連する酵素活性の検出に基づく、酵素連結アッセイが挙げられる。
これらの薬物スクリーニングアッセイに従って同定されるレセプタータンパク質活性のモジュレーターを使用して、成人下垂体、心臓、小腸、結腸、副腎、および脳におけるような、ＭＩＤ２４１タンパク質を発現する細胞を処置することによって、例えば、レセプター経路によって媒介される障害を有する被験体を処置し得る。これらの処置方法は、本明細書中に記載されるような薬学的組成物中のタンパク質活性のモジュレーターを、このような処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する。
結腸に関与する障害としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：先天性異常（例えば、閉鎖症および狭窄症、メッケル憩室、先天性神経節細胞欠損巨大結腸−ヒルシュスプルング病）；腸炎、例えば、下痢および赤痢、感染性全腸炎（ウイルス性胃腸炎、細菌性腸炎、壊死性腸炎、抗生物質関連性腸炎（偽膜性腸炎）、ならびにコラーゲン蓄積大腸炎およびリンパ球性腸炎を含む）、種々の腸管炎症障害（寄生虫および原生動物、後天性免疫不全症候群、移植、薬物誘発性腸損傷、放射線性腸炎、好中球減少性腸炎（盲腸炎）を含む）、ならびに転移腸炎（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ ｃｏｌｉｔｉｓ）；突発性炎症性腸疾患、例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎；結腸の腫瘍、例えば、非腫瘍性ポリープ、アデノーマ、家族性症候群（ｆａｍｉｌｉａｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、結腸直腸発癌、結腸直腸癌、およびカルチノイド。ＭＩＤ２４１は、結腸腫瘍中で主に発現されるので、本発明は、本明細書中に記載されるような薬学的組成物中のＭＩＤ２４１タンパク質活性のモジュレーターを、結腸癌を有すると診断された被験体に投与する工程を包含する処置方法を提供する。
細胞増殖障害および／または細胞分化障害の例としては、癌（例えば、癌腫、肉腫、転移性障害または造血腫瘍性障害（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（例えば、白血病））が挙げられる。転移性腫瘍は、多数の原発腫瘍型（前立腺、結腸、肺、胸部および肝臓起源の腫瘍を含むが、これらに限定されない）から生じ得る。本発明のＭＩＤ２１４分子を使用して、種々の増殖障害をモニター、処置および／または診断し得る。このような障害としては、造血腫瘍性障害が挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「造血腫瘍性障害」は、造血の起源の増殖性／腫瘍性細胞に関与する疾患（例えば、骨髄系統、リンパ球系統、もしくは赤血球系統、またはこれらの前駆細胞から生じる疾患）を含む。好ましくは、この疾患は、未分化型急性白血病（例えば、正赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病）から生じる。さらなる例示的な骨髄性障害としては、急性前骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｐｒｏｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ（１９９１）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７−９７に総説される）；リンパ性悪性腫瘍（以下が挙げられるがこれらに限定されない：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（これは、Ｂ系統ＡＬＬおよびＴ系統ＡＬＬを含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病（ｐｒｏｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＰＬＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＬＬ））およびワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられるがこれらに限定されない。さらなる悪性リンパ腫の形態。
本明細書中で使用される場合、「内皮細胞障害」は、異常であるか無秩序であるかまたは望ましくない内皮細胞活性（例えば、増殖、遊走、新脈管形成、または血管新生）；あるいは新脈管形成に関連する細胞表面接着分子または遺伝子（例えば、ＴＩＥ−２、ＦＬＴおよびＦＬＫ）の異常な発現によって特徴付けられる障害を含む。内皮細胞障害としては、腫瘍形成、腫瘍転移、乾癬、糖尿病性網膜症、子宮内膜症、グレーヴズ病、虚血性疾患（例えば、アテローム硬化症）、および慢性炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ）が挙げられる。
肝臓に関与する障害としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：肝臓損傷；黄疸および胆汁うっ滞（例えば、ビリルビンおよび胆汁形成）；肝不全および肝硬変（例えば、肝硬変、門脈圧亢進症（腹水、門脈体静脈吻合、および巨脾腫症を含む）；感染障害（例えば、ウイルス性肝炎（Ａ〜Ｅ型肝炎感染および他の肝炎ウイルスによる感染を含む）、臨床病理症候群（例えば、キャリア状態、無症候性感染、急性ウイルス性肝炎、慢性ウイルス性肝炎、および劇症性肝炎；自己免疫肝炎；薬物および毒素によって誘発された肝臓疾患（例えば、アルコール性肝疾患）；先天性代謝異常および小児科肝臓疾患（例えば、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、α１−アンチトリプシン欠損、および新生児肝炎）；肝内胆汁路疾患（例えば、２次胆汁肝硬変、１次胆汁肝硬変、１次硬化性胆管炎、および胆汁樹（ｂｉｌｉａｒｙ ｔｒｅｅ）の異常；循環性障害（例えば、肝臓への血流障害（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ）（肝動脈損傷（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）および門脈閉塞および血栓症を含む）、肝臓を通る血流の障害（受動性うっ血および小葉中心性壊死、および肝臓紫斑病を含む）、肝静脈流出閉塞（ｏｕｔｆｌｏｗ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）（肝静脈血栓症（バッド−キアーリ症候群）および静脈閉塞病を含む）；妊娠に関連する肝疾患（例えば、子かん前症および子かん）、妊娠性急性脂肪肝（ａｃｕｔｅ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｏｆ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ））、および妊娠性肝内（ｉｎｔｒｅｈｅｐａｔｉｃ）胆汁うっ滞；器官または骨髄移植の肝性合併症（例えば、骨髄移植後の薬物毒性、対宿主性移植片病、および肝臓拒絶）、ならびに肝臓同種移植片に対する非免疫原性損傷；腫瘍および腫瘍様状態（例えば、結節性過形成、腺腫、および悪性腫瘍（例えば、肝臓の原発癌および転移腫瘍を含む））。
本明細書中に記載される方法によって処置または診断され得る障害としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：肝臓における線維組織の蓄積に関連した障害（例えば、既存の線維の崩壊および縮合を伴う細胞外マトリクスの産生と分解との間の不均等から生じる障害）。本明細書中に記載される方法を用いて、ホメオスタシスをかき乱すプロセス（例えば、炎症性プロセス、毒性傷害または変化した肝臓血流から生じる組織損傷）、および感染（例えば、細菌、ウイルスおよび寄生生物の）を包含する、広範な種々の因子によって誘発される肝細胞壊死または肝細胞傷害を診断または処置し得る。例えば、この方法は、肝臓障害（例えば、門脈圧亢進高血圧または肝臓線維症）の早期検出のために用いられ得る。さらに、この方法を用いて、先天性代謝異常に起因する肝臓線維症（例えば、蓄積障害（例えば、ゴシェ病（脂質異常）またはグリコーゲン蓄積症）から生じる線維症、Ａ１−アンチトリプシン欠損）；外因性物質の蓄積（例えば、貯蔵）を媒介する障害（例えば、ヘモクロマトーシス（鉄過剰負荷症候群）および銅蓄積疾患（ウィルソン病））、毒性代謝産物の蓄積を生じる障害（例えば、チロシン血症、果糖血症およびガラクトース血症）ならびにペルオキシソーム障害（例えば、ツェルヴェーガー症候群）を検出し得る。さらに、本明細書中に記載される方法は、種々の化学物質または薬物（例えば、メトトレキサート、イソニアジド（ｉｓｏｎｉｚａｉｄ）、オキシフェンイサチン、メチルドパ、クロルプロマジン、トルブタミドまたはアルコール）の投与に関連した肝臓傷害、または肝臓での血管障害発現（例えば、肝臓内もしくは肝臓外のいずれかでの胆汁流動の閉塞、または例えば、慢性心不全、静脈閉塞病、門脈血栓症もしくはバッド−キアーリ症候群から生じる、肝臓循環における変化）を表す肝臓傷害の早期検出および早期処置に有用であり得る。
脳に関する障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ニューロンに関連する障害、およびグリア（例えば、星状細胞、稀突起膠細胞、上衣細胞、および小グリア細胞）に関連する障害；頭蓋内圧およびヘルニア形成から生じる脳水腫、ならびに水頭症；奇形および発育疾患（例えば、神経管欠損、前脳奇形、後窩奇形、および脊髄空洞症および水脊髄症）；周産期脳損傷；脳血管疾患（例えば、低酸素症、虚血、および梗塞形成に関連する障害（低血圧症、低灌流、および低流動状態（全大脳虚血および局所大脳虚血）、局所血液供給の閉塞からの閉塞症を含む）、頭蓋内出血（大脳内（実質内）出血、クモ膜下出血および破裂性漿果状動脈瘤、および大動脈奇形を含む）、高血圧脳血管疾患（裂孔梗塞、細隙出血、および高血圧性脳障害を含む））；感染（例えば、急性髄膜炎（急性化膿（菌）髄膜炎および急性無菌性（ウイルス）髄膜炎を含む）、急性化膿性感染（脳腫瘍、硬膜下蓄膿症、および硬膜外蓄膿症を含む）、慢性細菌性髄膜脳炎（結核症およびミコバクテリア症を含む）、神経梅毒、および神経ボレリア症（ライム病）、ウイルス性髄膜脳炎（節足動物媒介性（Ａｒｂｏ）ウイルス脳炎、単純疱疹ウイルス１型、単純疱疹ウイルス２型、水痘−帯状疱疹ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｚｏｓｔｅｒ）、サイトメガロウイルス、灰白髄炎、狂犬病、およびヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１髄膜脳炎（亜急性脳炎）を含む）、空胞ミオパシー、ＡＩＤＳ関連ミオパシー、末梢神経障害、および小児のＡＩＤＳ、進行性多病巣性白質脳症、亜急性硬化性汎脳炎、真菌髄膜脳炎、神経系の他の感染疾患）；伝染性海綿状脳障害（プリオン疾患）；脱髄疾患（多発性硬化症、異型多発性硬化症、急性播種性脳脊髄炎および急性壊死性出血性脳脊髄炎、および他の脱髄を伴う疾患を含む）；変性疾患（例えば、大脳皮質に影響を与える変性疾患（アルツハイマー病およびＰｉｃｋ病を含む）、大脳基底核および脳幹の変性疾患（振せん麻痺、特発性パーキンソン病（振せん麻痺）を含む）、進行性核上性麻痺、皮質基底変性、多発性全身性萎縮症（線条体黒質、シャイ−ドレーガー症候群、およびオリーブ橋小脳萎縮症、およびハンチントン病を含む））；脊髄小脳変性（脊髄小脳性運動失調（フリートライヒ運動失調、および毛細管拡張性運動失調を含む）、運動ニューロンに影響を与える変性疾患（筋萎縮側索硬化症（運動ニューロン疾患）、延髄脊髄萎縮症（ケネディ症候群）、および脊髄筋萎縮症を含む））；先天性代謝異常（例えば、白質萎縮症（クラッベ病、異染性白質萎縮症、副腎脳白質ジストロフィー、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病、およびキャナヴァン病を含む）、ミトコンドリア脳ミオパシー（リー病および他のミトコンドリア脳ミオパシーを含む））；中毒性および後天性代謝疾患（ビタミン欠乏（例えば、チアミン（ビタミンＢ１）欠乏およびビタミンＢ１２欠乏）を含む）、代謝妨害の神経続発症（低血糖症、高血糖症、および肝性脳障害を含む）、毒性障害（一酸化炭素、メタノール、エタノールおよび放射線（メトトレキサートと放射線誘導傷害の組み合わせを含む））；腫瘍（例えば、神経膠腫（星状細胞腫（原線維（びまん性）星状細胞腫および多形性グリア芽細胞腫）を含む）、ピロサイト（ｐｉｌｏｃｙｔｉｃ）星状細胞腫、多形性黄色星状膠細胞腫、および脳幹神経膠腫、乏突起膠腫、および脳室上衣細胞腫および関連室傍大量病変、ニューロン腫瘍、未分化型新生物（髄芽腫を含む）、他の実質性腫瘍（原発性脳リンパ腫、生殖細胞腫瘍、および松果体実質性腫瘍を含む）、髄膜腫、転移性腫瘍、新生物随伴症候群、末梢神経鞘腫瘍（神経鞘腫、神経線維腫、および悪性末梢神経鞘腫瘍（悪性神経鞘腫）を含む）、および神経皮膚症候群（母斑症）（神経線維腫症（１型神経線維腫症（ＮＦ１）および２型神経線維腫症（ＮＦ２）を含む）を含む）、結節硬化症、およびフォン・ヒッペル−リンダウ病）。
心臓に関する障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：心不全（心肥大、左心不全および右心不全が挙げられるが、これらに限定されない）；虚血性心疾患（狭心症、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患および突然心臓死が挙げられるが、これらに限定されない）；高血圧性心疾患（全身性（左側）高血圧性心疾患および肺性（右側）高血圧性心疾患が挙げられるが、これらに限定されない）；心臓弁疾患（石灰化大動脈狭窄、先天性二尖動脈の石灰化および僧帽弁環状石灰化のような石灰化によって生じる弁変性、および僧帽弁のミクソイド変性（僧帽弁逸脱症）、リウマチ熱およびリウマチ心疾患、感染性心内膜炎、ならびに非感染性疣贅（例えば、非細菌性血栓性心内膜炎および全身性エリテマトーデスの心内膜炎（リブマン−サックス病））、カルチノイド心臓病、および人工弁の合併症；心筋疾患（拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、および心筋炎が挙げられるが、これらに限定されない）；心膜疾患（心内膜液浸出および心膜血腫が挙げられるが、これらに限定されない）および心膜炎（急性心膜炎および治癒型心膜炎が挙げられるが、これらに限定されない）、ならびにリウマチ様心臓病；腫瘍性心臓病（原発性心臓腫瘍（ｐｒｉｍａｒｙ ｃａｒｄｉａｃ ｔｕｍｏｒ）、例えば、粘液腫、脂肪腫、乳頭状弾性線維腫、横紋筋腫、および肉腫）、および新生物の非心臓性影響（ｃａｒｄｉａｃ ｅｆｆｅｃｔ）が挙げられるが、これらに限定されない）；先天性心臓疾患（左右シャント−−遅発性チアノーゼ（例えば、心房中隔欠損症、心室中隔欠損症、開存動脈管、および房室性中隔欠損）、右左シャント−−早期チアノーゼ（例えばファロー四徴症、大動脈の転移、総動脈幹、三尖弁閉鎖症、および総肺静脈結合異常症）、閉塞性先天性異常（例えば、大動脈の縮窄、肺動脈弁狭窄症および閉鎖症）、ならびに大動脈狭窄症および閉鎖症、ならびに心臓移植に関与する障害。
このレセプターポリペプチドはまた、処置（特に、結腸腫瘍において）に関して上で議論されたように、レセプタータンパク質によって媒介される疾患（成人下垂体、心臓、小腸、結腸、副腎、および脳を含むがこれらに限定されない）または疾患に対する素因を診断するための標的を提供するために有用である。従って、細胞、組織、または生物中のレセプタータンパク質の存在またはレベルを検出するための方法が提供される。この方法は、相互作用が検出され得るように、レセプタータンパク質と相互作用し得る化合物と生物学的サンプルとを接触させる工程を包含する。
レセプタータンパク質を検出するための１つの薬剤は、レセプタータンパク質に選択的に結合し得る抗体である。生物学的サンプルとしては、被検体から単離された組織、細胞および生物学的流体、ならびに被検体中に存在する組織、細胞および流体が挙げられる。
レセプタータンパク質はまた、改変体レセプタータンパク質を有する患者における活発な疾患または疾患に対する素因を診断するための標的を提供する。従って、レセプタータンパク質は、生物学的サンプルから単離され得、異常なレセプタータンパク質を生じる遺伝子性変異の存在についてアッセイされ得る。このこととしては、アミノ酸の置換、欠失、挿入、（異常なスプライシング事象の結果としの）再配置、および不適切な翻訳後修飾が挙げられる。分析方法としては、変化した電気泳動移動度、変化したトリプシンペプチド消化物、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイにおける変化したレセプター活性、リガンド結合様式または抗体結合様式における変化、変化した等電点、直接のアミノ酸配列決定、およびタンパク質中の変異を検出するのに有用な、任意の他の公知アッセイ技術が挙げられる。
レセプタータンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素連結イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光検査が挙げられる。あるいは、被検体に標識した抗レセプター抗体を導入することによって、被検体中のタンパク質をインビボで検出し得る。例えば、被検体の中で存在および位置を標準的な画像化技術によって検出し得る、放射性マーカーを用いて、抗体を標識し得る。被検体中に発現したレセプタータンパク質の対立遺伝子改変体を検出する方法、およびサンプル中のレセプタータンパク質のフラグメントを検出する方法は、特に有用である。
レセプターポリペプチドはまた、薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃ）分析に有用である。薬理ゲノム学は、変更された薬物の性質（ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）および罹患した人における異常な作用に起因した薬物に対する応答における臨床的に有意な遺伝的改変を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０−１１）：９８３−９８５（１９９６））およびＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６（１９９７））を参照のこと。これらの改変の臨床的成果は、代謝における個々の改変の結果として、特定の個体における治療薬の重篤な毒性、または特定の個体における薬物の治療不全を生じる。よって、個体の遺伝子型は、治療化合物が体内で作用する方法または身体がその化合物を代謝する方法を決定し得る。さらに、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続の両方に影響する。よって、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型に基づく予防処置または治療処置のために効果的な化合物およびこのような化合物の効果的な投薬量の選択を可能にする。いくつかの薬物代謝酵素における遺伝的多型の発見は、幾人かの患者がなぜ期待された薬物効果を得ないのか、なぜ誇張された薬物効果を示すのか、またはなぜ標準的薬物投薬量からの重篤な毒性を被るのかを説明した。多型は、広範な代謝薬（ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）の表現型およびわずかな代謝薬の表現型において示され得る。よって、遺伝的多型は、レセプタータンパク質の対立遺伝子タンパク質改変体を導き得、ここで、１つの集団における１つ以上のレセプター機能は、別の集団におけるレセプター機能とは異なる。よって、このポリペプチドは、標的に処置モダリティーに影響し得る遺伝的素因を確認させる。よって、リガンドベースの処置において、多型は、アミノ末端細胞外ドメインならびに／またはリガンド結合およびレセプター活性化の際により活性であるかもしくはあまり活性でない他のリガンド結合領域に生じ得る。よって、リガンド用量は、多型を含む所定の集団内での治療効果を最大化するために改変される必要がある。遺伝子型決定の代替として、特定の多型ポリペプチドが同定され得る。
レセプターポリペプチドはまた、臨床試験および他の処置の間の治療効果をモニタリングするために有用である。よって、遺伝子発現、タンパク質レベルまたはレセプター活性を増加または減少させるように設計されている薬剤の治療的有効性は、終点標的（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｔａｒｇｅｔ）としてこのレセプターポリペプチドを使用して、処置の経過にわたってモニタリングされ得る。
レセプターポリペプチドはまた、レセプター関連障害を処置するために有用である。よって、処置方法は、可溶性レセプターまたはリガンド結合に競合するそのレセプタータンパク質のフラグメントの使用を包含する。これらのレセプターまたはフラグメントは、効果的な競合を提供するために、リガンドに対するより高い親和性を有し得る。
（抗体）
本発明はまた、ＭＩＤ２４１レセプタータンパク質ならびにその改変体およびフラグメントに選択的に結合する抗体を提供する。抗体は、レセプタータンパク質と実質的に相同ではない他のタンパク質にもまた結合する場合でさえ、選択的に結合するとみなされる。これらの他のタンパク質は、このレセプタータンパク質のフラグメントまたはドメインと相同性を共有する。特定の領域におけるこの保存は、相同配列のために両方のタンパク質に結合する抗体を惹起する。この場合、このレセプタータンパク質に結合する抗体はなお選択的であることが理解される。
抗体を作製するために、単離されたレセプターポリペプチドが、ポリクローナル抗体調製物およびモノクローナル抗体調製物について標準的技術を使用して抗体を作製するために、免疫原として使用される。全長タンパク質または抗原性ペプチドフラグメントのいずれかが使用され得る。高い抗原性指標を有する領域を、図１に示す。
抗体は、好ましくは、これらの領域から、またはこれらの領域内の別々のフラグメントから調製される。しかし、抗体は、本明細書中に記載されるようなペプチドの任意の領域から調製され得る。好ましいフラグメントは、リガンド結合を減少させるかまたは完全に阻止する抗体を生成する。抗体は、完全なレセプターまたはそのレセプターの一部（例えば、細胞内カルボキシ末端ドメイン、アミノ末端細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン全体または特定のセグメント、任意の細胞内ループまたは細胞外ループ、あるいは上記の任意の部分）に対して生じさせられ得る。抗体はまた、特定の機能的部位（例えば、リガンド結合部位、Ｇタンパク質結合部位、またはグリコシル化、リン酸化もしくはミリストイル化されている部位）に対して生じさせられ得る。
抗原性フラグメントは、典型的に、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基を含む。しかし、抗原性ペプチドは、少なくとも１２アミノ酸残基、少なくとも１４アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含み得る。１つの実施形態において、フラグメントは、タンパク質の表面上に位置する領域（例えば、親水性領域）に対応する。しかし、これらのフラグメントは、本発明より前に開示され得るフラグメントのいずれかを含むと解釈されない。
抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。
検出は、検出可能な物質に抗体を結合させる（すなわち、物理的に結合する）によって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、そして適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
適切な免疫原性調製物は、ネイティブなタンパク質、組換え発現されたタンパク質または化学合成されたペプチド由来であり得る。
（抗体用途）
抗体を使用して、アフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的技術によってレセプタータンパク質を単離し得る。抗体は、細胞からの天然のレセプタータンパク質、および宿主細胞中に発現される組換え的に産生されたレセプタータンパク質の精製を容易にし得る。
抗体は、生物における種々の組織の中でのレセプターの発現パターンおよび正常な発達の経過にわたるレセプターの発現パターンを決定するために、細胞または組織におけるレセプタータンパク質の存在を検出するために有用である。
抗体を使用して、発現の量およびパターンを評価するために、インサイチュで、インビトロで、または細胞溶解物中もしくは細胞上清中でレセプタータンパク質を検出し得る。
抗体を使用して、発達中の異常な組織分布または異常な発現を評価し得る。
全長レセプタータンパク質の循環するフラグメントの抗体検出を使用して、レセプターの代謝回転を同定し得る。
さらに、抗体を使用して、疾患状態における（例えば、その疾患の活性段階において、またはレセプター機能に関連する疾患に対する素因を有する個体において）レセプター発現を評価し得る。レセプタータンパク質の不適切な組織分布、発生的発現、または発現レベルによって障害を生じる場合、抗体は、正常なレセプタータンパク質に対して調製され得る。障害がレセプタータンパク質中の特定の変異によって特徴付けられる場合、この変異タンパク質に対して特異的な抗体を使用して、特定の変異レセプタータンパク質の存在についてアッセイし得る。しかし、細胞内レセプターペプチド領域を認識する細胞内で生じた抗体（「細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」がまた、含まれる。
抗体をまた使用して、生物における種々の組織中の細胞の正常な細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）局在および異常な細胞内局在を評価し得る。抗体は、レセプター全体またはそのレセプターの一部（例えば、アミノ末端細胞外ドメインまたは細胞外ループの部分）に対して生じさせられ得る。
診断的用途は、遺伝的試験においてのみならず、処置モダリティーをモニタリングする際にも適用され得る。よって、処置が究極的にレセプター発現レベルまたは異常なレセプターの存在および異常な組織分布または発生的発現を補正することを目的とする場合、レセプターまたは関連するフラグメントに対して指向される抗体を使用して、治療効率をモニタリングし得る。
さらに、抗体は、薬理ゲノム学分析に有用である。よって、多型レセプタータンパク質に対して調製された抗体を使用して、改変された処置モダリティーを必要とする個体を同定し得る。
抗体はまた、電気泳動的移動度、等電点、ペプチドのトリプシン消化、および当業者に公知の他の物理的アッセイによって分析される異常なレセプタータンパク質についての免疫学的マーカーとしての診断ツールとして有用である。
抗体はまた、組織タイピングに有用である。よって、特定のレセプタータンパク質が特定の組織における発現と相関された場合、このレセプタータンパク質に特異的な抗体を使用して組織型を同定し得る。
抗体はまた、法医学的同定に有用である。よって、個体が、特定の多型タンパク質を生じる特定の遺伝的多型と相関された場合、この多型タンパク質に特異的な抗体は、同定の補助として使用され得る。
抗体はまた、レセプター機能を阻害する（例えば、リガンド結合をブロックする）ために有用である。
これらの用途はまた、処置が、レセプター機能を阻害することを包含する治療の状況において適用され得る。抗体を使用して、例えば、リガンド結合を阻害し得る。抗体は、機能に必要とされる部位を含む特定のフラグメントに対して、または細胞と結合するインタクトなレセプターに対して調製され得る。
本発明はまた、生物学的サンプル中のレセプタータンパク質の存在を検出するための抗体を使用するためのキットを含む。本キットは、標識された抗体または標識可能な抗体のような抗体、および生物学的サンプル中のレセプタータンパク質を検出するための化合物または薬剤；このサンプル中のレセプタータンパク質の量を決定するための手段；ならびにこのサンプル中のレセプタータンパク質の量を標準と比較するための手段、を備え得る。この化合物または薬剤は、適切な容器中にパッケージングされ得る。本キットはさらに、レセプタータンパク質を検出するためのキットを使用するための指示書を備え得る。
（ポリヌクレオチド）
具体的に開示されたｃＤＮＡは、コード領域ならびに５’および３’非翻訳配列を含む（配列番号２）。
ヒトＭＩＤ２４１レセプターｃＤＮＡは、約１２８５ヌクレオチド長であり、そして約３６０アミノ酸残基長である全長タンパク質をコードする。この核酸は、本明細書中で開示されるように（例えば、結腸腫瘍において）発現される。配列番号１のアミノ酸配列の構造分析は、図３のヒドロパシープロットに提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「膜貫通セグメント」は、原形質膜にまたがる疎水性ヘリックスを含む構造的アミノ酸モチーフをいう。膜タンパク質の膜貫通ドメイン全体は、約アミノ酸２１〜約アミノ酸２５１にわたる。５つのセグメントは膜にまたがり、そしてこのドメイン中に２つの細胞内ループおよび２つの細胞外ループが存在する。
本発明は、ＭＩＤ２４１レセプタータンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。用語「ＭＩＤ２４１ポリヌクレオチド」または「ＭＩＤ２４１核酸」は、配列番号２に示される配列をいう。
「単離された（単離した）」レセプター核酸は、このレセプター核酸の天然の供給源に存在する他の核酸とは別の核酸である。好ましくは、「単離された（単離した）」核酸は、その核酸が由来する生物中のゲノムＤＮＡ中のその核酸に天然に隣接する配列（すなわち、その核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。しかし、例えば、約５ｋＢまでのいくつかの隣接ヌクレオチド配列であり得る。重要な点は、その核酸が隣接配列から単離されており、その結果、本明細書中に記載される特定の操作（例えば、組換え発現、プローブおよびプライマーの調製、ならびにレセプター核酸配列に特異的な他の用途）に供され得る。
さらに、「単離された（単離した）」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、他の細胞性物質を、または組換え技術によって産生される場合は培養培地を、または化学的に合成される場合は化学的前駆物質もしくは他の化学物質を、実質的に含み得ない。しかし、核酸分子は、他のコード配列または調節配列に融合され得、そしてなお単離されたと認識される。
例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、単離されたと認識される。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明の単離されたＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明に従う単離された核酸分子はさらに、合成により生成されるこのような分子を含む。
レセプターポリヌクレオチドは、成熟タンパク質と、さらなるアミノ末端アミノ酸もしくはカルボキシル末端アミノ酸、または（例えば、成熟形態が１つより多いポリペプチド鎖を有する場合）成熟ポリペプチドの内部アミノ酸とをコードし得る。このような配列は、前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシングにおける役割を果たし得るか、タンパク質輸送、タンパク質半減期の延長もしくは短縮を容易にするか、または特にアッセイまたは産生のためにタンパク質の操作を容易にする。インサイチュでの場合に一般的であるように、さらなるアミノ酸は、細胞内酵素によって成熟タンパク質からプロセスされ得る。
レセプターポリヌクレオチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：成熟ポリペプチドのみをコードする配列、成熟ポリペプチドおよびさらなるコード配列（例えば、リーダー配列または分泌配列（例えば、プレプロタンパク質配列またはプロタンパク質配列））をコードする配列）、さらなるコード配列を伴うかもしくは伴わない成熟ポリペプチドをコードする配列とさらなる非コード配列（例えば、イントロンならびに非コード５’配列および非コード３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性における役割を担う、転写されるが翻訳されない配列）。さらに、ポリヌクレオチドは、例えば、精製を容易にするペプチドをコードするマーカー配列に融合され得る。
レセプターポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡ（クローニングによって、または化学合成技術によって、あるいはその組み合わせによって得られるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）の形態であり得る。核酸、特にＤＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖核酸は、コード鎖（センス鎖）であっても非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
１つの実施形態において、レセプター核酸は、コード領域のみを含む。
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因してよって配列番号２に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同一のタンパク質をコードする、配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは異なる改変体レセプターポリヌクレオチドおよびそのフラグメントを提供する。
本発明はまた、本明細書中に記載される改変体ポリペプチドをコードするレセプター核酸分子を提供する。このようなポリヌクレオチドは、対立遺伝子改変体（同一の遺伝子座）、ホモログ（異なる遺伝子座）、およびオルソログ（異なる生物）のように、天然に存在し得るか、あるいは、組換えＤＮＡ法または化学合成によって構築され得る。このような天然に存在しない改変体は、変異誘発技術（ポリヌクレオチド、細胞または生物に適用される技術を含む）によって作製され得る。よって、上記のように、改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失、転位および挿入を含み得る。
バリエーションは、コード領域および非コード領域のいずれかまたは両方に生じ得る。バリエーションは、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の両方を生成し得る。
オルソログ、ホモログおよび対立遺伝子改変体は、当該分野において周知の方法を使用して同定され得る。これらの改変体は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列またはこの配列のフラグメントに対して、５０％、少なくとも約５５％、典型的には少なくとも約７０〜７５％、より典型的には少なくとも約８０〜８５％、最も典型的には少なくとも約９０〜９５％またはそれより高く相同であるレセプターをコードするヌクレオチド配列を含む。このような核酸分子は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列またはこの配列のフラグメントにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るとして、容易に同定され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、一般的な相同性に起因する場合に実質的な相同性を示さないことが理解される（例えば、ポリＡ配列、または全てのタンパク質もしくはほとんどのタンパク質に共通する配列、全てのＧＰＣＲ、あるいは全てのファミリーＩ ＧＰＣＲ）。さらに、改変体は、本発明より前に開示されていたかもしれない核酸配列のいずれもを含まないということが、理解される。
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、互いに少なくとも５０％、５５％相同なレセプターをコードするヌクレオチド配列が代表的に互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載することを意図する。この条件は、互いに少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％またはそれより高い相同性の配列が代表的に互いにハイブリダイズしたままであるような条件であり得る。このようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の１例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で５０℃〜６５℃にて１回以上の洗浄である。１つの実施形態では、ストリンジェントな条件下で配列番号２の配列にハイブリダイズする単離されたレセプター核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在するヌクレオチド配列を有する（例えば、天然のタンパク質をコードする）、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
さらに、本発明は、全長レセプターポリヌクレオチドのフラグメントを含むポリヌクレオチドを提供する。このフラグメントは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、そしてＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。このフラグメントは、コード配列または非コード配列のいずれか由来であり得る。
フラグメントは、ヌクレオチド１〜約ヌクレオチド１３０のうちの１２個より多く連続したヌクレオチド配列、約ヌクレオチド１３１〜約ヌクレオチド１２２１のうちの２４個より多いヌクレオチド、および約ヌクレオチド１２２１〜約ヌクレオチド１２８５のうちの１２個より多いヌクレオチドを含み得る。
単離されたレセプター核酸フラグメントは、ストリンジェントな条件下で、配列番号２のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。他の実施形態において、この核酸は、少なくとも、３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、２５０ヌクレオチド長または５００ヌクレオチド長である。
別の実施形態において、単離されたレセプター核酸は、アミノ酸１〜アミノ酸３６０のコード領域全体をコードする。別の実施形態において、この単離されたレセプター核酸は、成熟タンパク質の約アミノ酸５７〜アミノ酸３６０に対応する配列をコードする。他のフラグメントは、本明細書中に記載されるアミノ酸フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む。さらなるフラグメントは、本明細書中に記載される特定のドメインまたは部位のサブフラグメントを含み得る。本発明に従う核酸フラグメントは、本発明より前に開示されていたかもしれないフラグメントを含むと解釈されるべきではない。
レセプター核酸フラグメントはさらに、本明細書中に記載されるドメイン、また記載されるサブ領域、および特定の機能的部位に対応する配列を含む。レセプター核酸フラグメントはまた、そのドメイン、セグメント、ループ、および上記の他の機能的部位の組み合わせを含む。従って、例えば、レセプター核酸は、アミノ末端細胞外ドメインおよび１つの膜貫通フラグメントに対応する配列を含み得る。当業者は、可能である多くの置換を認識する。
しかし、レセプターフラグメントが、遺伝子全体を含まない任意の核酸配列を含むことが、理解される。
レセプター核酸フラグメントは、以下を含む：アミノ酸残基１〜約２０を含むアミノ末端細胞外ドメインを含むポリペプチド、膜貫通ドメイン（アミノ酸残基約２１〜約２５１）にわたる領域を含むポリペプチド、カルボキシ末端細胞内ドメイン（アミノ酸残基約２５２〜約３６０）を含むポリペプチド、およびＧタンパク質レセプターシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）をコードするポリペプチド（１３６〜１３８または約１２５〜約１４１の周辺アミノ酸残基）をコードする核酸分子、７回膜貫通セグメント、細胞外ループまたは細胞内ループ、ならびにグリコシル化部位、ｃＡＭＰ依存的プロテインキナーゼリン酸化部位およびｃＧＭＰ依存的プロテインキナーゼリン酸化部位、プロテインキナーゼＣリン酸化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、アミド化部位およびＮ−ミリストイル化部位のいずれかをコードする核酸分子。これらのドメインの位置がコンピュータ分析によって予測される場合、当業者は、これらのドメインを構成するアミノ酸残基が、これらのドメインを規定するために使用される基準に依存して変動し得るということを認識する。
本発明はまた、本明細書中に記載されるレセプタータンパク質のエピトープ保有領域をコードするレセプター核酸フラグメントを提供する。
単離されたレセプターポリヌクレオチド配列、および特にフラグメントは、ＤＮＡプローブおよびプライマーとして有用である。
例えば、レセプター遺伝子のコード領域は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために既知のヌクレオチド配列を使用して単離され得る。次いで、標識されたプローブを使用して、コード領域に対応する核酸を単離するために、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー、またはｍＲＮＡをスクリーニングし得る。さらに、プライマーは、レセプター遺伝子の特定の領域をクローニングするためにＰＣＲ反応において使用され得る。
プローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、代表的には、配列番号２のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖または他のレセプターポリヌクレオチドの、少なくとも、約１２個、代表的には約２５個、より代表的には約４０個、５０個または７５個連続したヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。プローブはさらに、標識（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子）を含む。
（ポリヌクレオチド用途）
レセプターポリヌクレオチドは、プローブ、プライマーについて、および生物学的アッセイにおいて有用である。ポリヌクレオチドを使用してＧＰＣＲ特性またはＧＰＣＲ機能を評価する場合（例えば、本明細書中に記載されるアッセイにおいて）、全て以下のｃＤＮＡ全体が有用であり得る。この場合、本発明より前に公知であるかもしれないフラグメントでさえ含まれる。従って、例えば、ＧＰＣＲ機能に特異的に指向されるアッセイ（例えば、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を評価すること）は、公知のフラグメントの使用を含む。さらに、レセプター機能を評価するための診断法はまた、任意のフラグメント（本発明より前に公知であったかもしれないフラグメントを含む）を用いて実施され得る。同様に、レセプター機能不全の処置を含む方法において、当該分野において公知であったかもしれないフラグメントを含む全てのフラグメントが含まれる。
レセプターポリヌクレオチドは、配列番号１に記載されるポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンを単離するため、ならびに配列番号１に示されるのと同一のポリペプチドを産生する改変体または本明細書中に記載される他の改変体に対応するｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンを単離するための、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとして有用である。改変体は、配列番号１に示されるポリペプチドを単離したのと同一の組織および生物、同一の生物由来の異なる組織、または異なる生物から単離され得る。発生的に制御されており、それゆえ、生物の発生における異なる時点で同一組織または異なる組織において発現され得る遺伝子およびｃＤＮＡを単離するために、本方法は有用である。
プローブは、レセプターをコードする遺伝子の全長に沿った任意の配列に対応し得る。従って、プローブは、５’非コード領域、コード領域、および３’非コード領域由来であり得る。しかし、考察したように、フラグメントは、本発明より前に開示されたフラグメントを含み得るフラグメントと解釈されるべきではない。
核酸プローブは、例えば、配列番号１の全長ｃＤＮＡ、またはそのフラグメント（例えば、少なくとも、１２ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、２５０ヌクレオチド長または５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド）であり得、そしてｍＲＮＡまたはＤＮＡにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするに十分であり得る。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドのフラグメントはまた、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドのより長いフラグメントまたは全長を合成するために有用である。例えば、フラグメントは、ｍＲＮＡの任意の部分にハイブリダイズし得、そしてより長いｃＤＮＡまたは全長ｃＤＮＡが産生され得る。
フラグメントはまた、所望の長さおよび配列のアンチセンス分子を合成するために有用である。
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプターポリヌクレオチドの任意の所定の領域を増幅するための、ＰＣＲについてのプライマーとして有用である。
レセプターポリヌクレオチドはまた、組換えベクターを構築するために有用である。このようなベクターとしては、レセプターポリペプチドの一部または全部を発現する発現ベクターが挙げられる。ベクターとしてはまた、レセプター遺伝子および遺伝子産物のインサイチュでの発現を変更するために別のポリヌクレオチド配列に（例えば、細胞ゲノムに）組み込むために使用される挿入ベクターが挙げられる。例えば、内因性レセプターコード配列は、１つ以上の特異的に導入された変異を含むコード領域の全てまたは一部との相同組換えを介して置換され得る。
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプタータンパク質の抗原性部分を発現するために有用である。
レセプターポリヌクレオチドはまた、インサイチュハイブリダイゼーション法によってレセプターポリヌクレオチドの染色体部分を決定するためのプローブとして有用である。
レセプターポリヌクレオチドプローブはまた、組織分布に関してレセプターおよびその改変体をコードする遺伝子の存在のパターンを決定するために（例えば、遺伝子重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が生じているのか否か、そして、この重複が組織の全てもしくはあるサブセットのみで生じるのか否かを決定するために）有用である。遺伝子は、天然に存在しても、細胞中、組織中もしくは生物中に外因的に導入されていてもよい。
レセプターポリヌクレオチドはまた、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドをコードする遺伝子から産生されるｍＲＮＡの全てまたは一部に対応するリボザイムを設計するために有用である。
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプターポリヌクレオチドおよびレセプターポリペプチドの一部または全てを発現する宿主細胞を構築するために有用である。
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプターポリヌクレオチドおよびレセプターポリペプチドの全てまたは一部を発現するトランスジェニック動物を構築するために有用である。
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプターポリペプチドの一部または全てを発現するベクターを作製するために有用である。
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプター核酸発現のレベルを決定するためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。従って、このプローブを使用して、細胞中、組織中および生物中のレセプター核酸の存在を検出し得るか、またはレセプター核酸のレベルを測定し得る。そのレベルが決定される核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。従って、本明細書中に記載されるポリペプチドに対応するプローブを使用して、所定の細胞中、組織中、または生物中の遺伝子コピーの数を評価し得る。これは、レセプター遺伝子の増幅が存在する場合に特に適切である。
あるいは、プローブをインサイチュハイブリダイゼーションの状況において使用して、レセプター遺伝子の余分なコピーの位置を染色体外エレメント上として、またはこのレセプター遺伝子が通常見出されない染色体中に組み込まれていると（例えば、均質な染色領域として）評価し得る。
これらの用途は、正常な結果と比較したレセプター発現の増大または減少に関連する障害の診断に適切である。
ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。
プローブは、例えば、被験体由来の細胞サンプル中のレセプターコード核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）のレベルを測定することによって、あるいはレセプター遺伝子が変異しているか否かを決定することによって、レセプタータンパク質を発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用され得る。
核酸発現アッセイは、レセプター核酸発現を調節する化合物を同定するための薬物スクリーニングに有用である。
従って、本発明は、レセプター遺伝子の核酸発現に関連する障害を処置するために使用され得る化合物を同定するための方法を提供する。本方法は、代表的には、その化合物がレセプター核酸の発現を調節する能力をアッセイする工程、および、従って所望されないレセプター核酸発現によって特徴付けられる障害を処置するために使用され得る化合物を同定する工程、を包含する。
このアッセイは、細胞ベースの系および無細胞系において行われ得る。細胞ベースのアッセイは、レセプター核酸を天然で発現する細胞、または特定の核酸配列を発現するように遺伝子操作されている組換え細胞を含む。
あるいは、候補化合物が、患者またはトランスジェニック動物においてインビボでアッセイされ得る。
レセプター核酸発現についてのアッセイは、核酸レベル（例えば、ｍＲＮＡレベル）の直接アッセイ、またはこのシグナル伝達経路（例えば、ｃＡＭＰまたはホスファチジルイノシトールの代謝回転）に関与する付随的な化合物に対する直接アッセイを含み得る。さらに、レセプタータンパク質シグナル経路に応じてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子の発現もまたアッセイされ得る。この実施形態において、これらの遺伝子の調節領域は、ルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子に作動可能に連結され得る。
従って、細胞を候補化合物と接触させ、そしてｍＲＮＡ発現が測定される方法において、レセプター遺伝子発現のモジュレーターが同定され得る。候補化合物の存在下でのレセプターｍＲＮＡ発現レベルは、候補化合物の非存在下でのレセプターｍＲＮＡ発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて核酸発現のモジュレーターとして同定され得、そして、例えば、異常な核酸発現によって特徴付けられ得る障害を処置するために使用され得る。ｍＲＮＡ発現が候補化合物の存在下でその非存在下よりも統計的に有意に高い場合、この候補化合物は、核酸発現の刺激因子として同定される。核酸発現が候補化合物の存在下でその非存在下よりも統計的に有意に低い場合、この候補化合物は、核酸発現のインヒビターとして同定される。
従って、本発明は、レセプター核酸発現を調節するために、薬物スクリーニングを介して遺伝子モジュレーターとして同定された化合物を標的としての核酸とともに使用する処置方法を提供する。調節は、アップレギュレーション（すなわち、活性化またはアゴナイゼーション）またはダウンレギュレーション（抑制または拮抗）の両方あるいは核酸発現を含む。
あるいは、レセプター核酸発現のモジュレーターは、（薬物または低分子がレセプター核酸発現を阻害する限り）本明細書中で記載されるスクリーニングアッセイを使用して同定される低分子または薬物であり得る。
レセプターポリヌクレオチドはまた、臨床試験または処置レジメンにおけるレセプター遺伝子の発現または活性に対する調節化合物（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の有効性をモニタリングするために有用である。従って、遺伝子発現パターンは、その化合物（特に、患者が耐性を発達させ得る化合物）での処置の持続有効性についてのバロメータとして役立て得る。遺伝子発現パターンはまた、冒された細胞のその化合物に対する生理学的応答を示すマーカーとして役立て得る。従って、このようなモニタリングは、この化合物の増加投与または患者が耐性にならなかった代替の化合物の投与のいずれかを可能にする。同様に、核酸発現レベルが所望のレベル未満になる場合、この化合物の投与は、比例して減少され得る。
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプター核酸の定性的変化（特に、病理につながる定性的変化において）についての診断アッセイに有用である。このポリヌクレオチドを使用して、レセプター遺伝子および遺伝子発現産物（例えば、ｍＲＮＡ）中の変異を検出し得る。このポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして使用して、レセプター遺伝子中に天然に存在する遺伝子変異を検出し、それにより、この変異を有する被験体がこの変異によって生じる障害の危険性があるか否かを決定し得る。変異としては、遺伝子中の１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加または置換、染色体再配置（例えば、逆位または転位）、ゲノムＤＮＡの改変（例えば、異常なメチル化パターン）、あるいは遺伝子コピー数の変化（例えば、増幅）が挙げられる。機能不全に関連するレセプター遺伝子の変異形態の検出は、活性な疾患について、または疾患に対する感受性（その疾患がレセプタータンパク質の過剰発現、過少発現または変更された発現により生じる場合）についての診断ツールを提供する。
レセプター遺伝子中に変異を保有する個体は、種々の技術によって核酸レベルで検出され得る。ゲノムＤＮＡは、直接分析されても、分析前にＰＣＲを用いることによって増幅されてもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡは、同一の方法で使用され得る。
特定の実施形態において、変異の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）、あるいはライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０（１９８８）；ならびにＮａｋａｚａｗａら、ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４（１９９４）を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、後者は、遺伝子中の点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２（１９９５）を参照のこと）。この方法は、患者から細胞サンプルを収集する工程、このサンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはこれらの両方）を単離する工程、（存在するならば）遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、この核酸サンプルをその遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーと接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程またはその増幅産物のサイズを検出する工程およびコントロールサンプルとその長さを比較する工程、を包含し得る。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較した増幅産物のサイズ変化によって検出され得る。点変異は、増幅されたＤＮＡを正常なＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることによって同定され得る。
あるいは、レセプター遺伝子中の変異は、例えば、ゲル電気泳動によって決定される制限酵素消化パターンにおける変更によって、直接同定され得る。
さらに、配列特異的リボザイム（米国特許第５，４９８，５３１号）を使用して、リボザイム切断部位の発達または喪失により特定の変異の存在についてスコア付けし得る。
完全に一致した配列は、ヌクレアーゼ切断消化アッセイによって、または融解温度の差異によって、ミスマッチした配列と区別され得る。
特定の位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護およびＳ１保護）または化学的切断法によって評価され得る。
さらに、変異体レセプター遺伝子と野生型遺伝子との間の配列差異は、直接的ＤＮＡ配列決定によって決定され得る。診断アッセイ（（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）を行う場合、種々の自動化配列決定手順（質量分析法による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２（１９９６）；およびＧｒｉｆｆｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９（１９９３）を参照のこと）を含む）が利用され得る。
遺伝子中の変異を検出するための他の方法としては、以下が挙げられる：切断剤からの保護が、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出するために使用される方法（Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２（１９８５）；Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ ８５：４３９７（１９８８）；Ｓａｌｅｅｂａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５（１９９２））、変異体核酸および野生型核酸の電気泳動的移動度が比較される方法（Ｏｒｉｔａら、ＰＮＡＳ ８６：２７６６（１９８９）；Ｃｏｔｔｏｎら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４（１９９３）；およびＨａｙａｓｈｉら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９（１９９２））、ならびにある勾配の変性剤を含むポリアクリルアミドゲルにおける変異体フラグメントおよび野生型フラグメントの移動が変性勾配ゲル電気泳動によってアッセイされる方法（Ｍｙｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５（１９８５））。点変異を検出するための他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、および選択的プライマー伸長が挙げられる。
レセプターポリヌクレオチドはまた、必ずしも疾患を引き起こさないが、それにもかかわらず処置様式に影響を与える遺伝子型について個体を試験するために有用である。従って、このポリヌクレオチドを使用して、個体の遺伝子型と処置に使用される化合物に対するその個体の応答との間の関係（ゲノム薬理学的関係）を研究し得る。この場合、例えば、リガンドに対する変更された親和性を生じるレセプター遺伝子中の変異は、このレセプターを活性化するリガンドを標準的な濃度で用いたとき、過剰な薬物効果または低下した薬物効果を生じ得る。従って、本明細書中に記載されるレセプターポリヌクレオチドを使用して、処置のために適切な化合物または投薬レジメンを選択するために、個体におけるレセプター遺伝子の変異含量を評価し得る。
従って、処置に影響する遺伝的バリエーションを提示するポリヌクレオチドは、個体において処置を調節する（ｔａｉｌｏｒ）ために使用され得る診断標的を提供する。従って、これらの多型を含む組換え細胞および組換え動物の産生は、処置化合物および投薬レジメンの効果的な臨床的設計を可能にする。
レセプターポリヌクレオチドはまた、その配列が個々の染色体そしてその染色体上の特定の位置に同定される場合に、染色体同定のために有用である。第１に、ＤＮＡ配列は、インサイチュハイブリダイゼーションまたは他の染色体特異的ハイブリダイゼーションによってその染色体に一致させられる。配列はまた、所望の種由来の個々の染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用され得るＰＣＲプライマーを調製することによって特定の染色体に相関され得る。そのプライマーに相同な遺伝子を含む染色体を含有するハイブリッドのみが、増幅フラグメントを与える。下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、染色体フラグメントを使用して達成され得る。他のストラテジーとしては、標識したフローソート（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔ）した染色体を用いるプレスクリーニングおよび染色体特異的ライブラリーへのハイブリダイゼーションによるプレ選択が挙げられる。さらなるマッピングストラテジーとしては、伝統的に使用されるプローブより短いプローブを用いるハイブリダイゼーションを可能にする蛍光インサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。染色体マッピングのための試薬が、単一染色体または染色体上の単一部位をマーキングするために個々に使用され得るか、あるいは試薬のパネルが、複数の部位および／または複数の染色体をマーキングするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、実際にマッピング目的に好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内でより保存されているようであり、従って染色体マッピングの間の交叉ハイブリダイゼーションの機会を増加させる。
レセプターポリヌクレオチドはまた、小さな生物学的サンプルから個体を同定するために使用され得る。これは、例えば、個体を同定するために制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を使用して行われ得る。従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドは、ＲＦＬＰのためのＤＮＡマーカーとして有用である（米国特許第５，２７２，０５７号を参照のこと）。
さらに、レセプター配列を使用して、個体のゲノム中の選択されたフラグメントの実際のＤＮＡ配列を決定する代替の技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載されるレセプター配列を使用して、この配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、続く配列決定のために個体からＤＮＡを増幅し得る。
この様式で調製された個体からの対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体がこのようなＤＮＡ配列の独特なセットを有するので、独特な個体の同定を提供し得る。ヒトにおける対立遺伝子バリエーションが各５００塩基当たり約１回の頻度で生じると見積もられている。対立遺伝子バリエーションは、これらの配列のコード領域においてある程度で生じ、非コード領域においてより高程度で生じる。レセプター配列を使用して、個体および組織からこのような同定配列を取得し得る。この配列は、ヒトゲノムの独特なフラグメントを示す。本明細書中に記載される各配列は、ある程度、標準として使用され得、これに対して、個体由来のＤＮＡが、同定目的のために比較され得る。
これらの配列からの試薬のパネルを使用して個体に対する独特な同定データベースを生成する場合、これらの同じ試薬を後程使用して、その個体由来の組織を同定し得る。独特な同定データベースを使用して、（生きているかまたは死んでいる）個体のポジティブ同定は、非常に小さな組織サンプルからなされ得る。
レセプターポリヌクレオチドはまた、法医学的同定手順において使用され得る。ＰＣＲ技術を使用して、非常に小さな生物学的サンプル（例えば、単一の毛包、体液（例えば、血液、唾液、または精液）から得られたＤＮＡ配列を増幅し得る。次いで、増幅された配列は、そのサンプルの起源の同定を可能にする標準と比較され得る。
従って、レセプターポリヌクレオチドを使用して、ヒトゲノム中の特定の遺伝子座に標的化されるポリヌクレオチド試薬（例えば、ＰＣＲプライマー）を提供し得、この試薬は、例えば、別の「同定マーカー」（すなわち、特定の個体に独特な別のＤＮＡ配列）を提供することによって、ＤＮＡベースの法医学的同定の信頼度を増加させ得る。上記のように、実際の塩基配列情報が、制限酵素によって生成されたフラグメントによって形成されるパターンに対する正確な代替物として同定に使用され得る。非コード領域に標的化される配列は、特に有用である。なぜなら、より多い多型が、非コード領域に生じ、この技術を使用して個体を識別することを容易にするからである。
レセプターポリヌクレオチドをさらに使用して、ポリヌクレオチド試薬（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション技術において使用され得る、例えば、標識されたプローブまたは標識可能なプローブ）を提供して、特定の組織を同定し得る。これは、法医学の病理学者が起源未知の組織を提示される場合に有用である。レセプタープローブのパネルを使用して、種および／または器官型によって組織を同定し得る。
同様の様式において、これらのプライマーおよびプローブを使用して、組織培養物を夾雑物についてスクリーニングし得る（すなわち、培養物中の異なる細胞型の混合物の存在についてスクリーニングし得る）。
あるいは、レセプターポリヌクレオチドを直接使用して、アンチセンス構築物またはリボザイム構築物によってレセプター遺伝子配列の転写または翻訳をブロックし得る。従って、レセプター遺伝子の異常に高い発現または所望されない発現によって特徴付けられる障害において、核酸は、処置のために直接使用され得る。
従って、レセプターポリヌクレオチドは、細胞中、組織中および生物中でのレセプター遺伝子発現を制御するためのアンチセンス構築物として有用である。ＤＮＡアンチセンスポリヌクレオチドは、転写に関連する遺伝子の領域に相補的であるように設計され、レセプタータンパク質の転写、ゆえにその産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡポリヌクレオチドまたはアンチセンスＤＮＡポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡにハイブリダイズし、従ってｍＲＮＡのレセプタータンパク質への翻訳をブロックする。
核酸発現を阻害するに有用なアンチセンス分子の例としては、開始コドンもまた含む配列番号２の５’非翻訳領域のフラグメントに相補的なアンチセンス分子、および配列番号２の３’非翻訳領域のフラグメントに相補的なアンチセンス分子が挙げられる。
あるいは、あるクラスのアンチセンス分子を使用して、レセプター核酸の発現を減少させるためにｍＲＮＡを不活化し得る。従って、これらの分子は、レセプター核酸の異常な発現または所望されない発現により特徴付けられる障害を処置し得る。この技術は、ｍＲＮＡが翻訳される能力を減弱させる、ｍＲＮＡ中の１つ以上の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むリボザイムによる切断を含む。可能性のある領域は、コード領域、特に、レセプタータンパク質の触媒活性および他の機能的活性（例えば、リガンド結合）に対応するコード領域を含む。
レセプターポリヌクレオチドはまた、レセプター遺伝子発現が異常である細胞を含む患者における遺伝子治療のためのベクターを提供する。従って、エキソビボで操作された患者の細胞を含みそして患者に戻される組換え細胞が、個体に導入され、ここで、この細胞は、その個体を処置するために所望のレセプタータンパク質を産生する。
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるレセプター核酸の存在を検出するためのキットを包含する。例えば、キットは、生物学的サンプル中のレセプター核酸を検出し得る標識核酸もしくは標識薬剤、または標識可能な核酸もしくは標識可能な薬剤のような試薬；サンプル中のレセプター核酸の量を決定するための手段；およびサンプル中のレセプター核酸の量と標準とを比較するための手段を含み得る。この化合物または因子は、適切な容器にパッケージされ得る。このキットはさらに、レセプターのｍＲＮＡまたはＤＮＡを検出するのにこのキットを使用するための指示書を含み得る。
（ベクター／宿主細胞）
本発明はまた、レセプターポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。用語「ベクター」は、レセプターポリヌクレオチドを輸送し得るビヒクル（好ましくは、核酸分子）をいう。ベクターが核酸分子である場合、レセプターポリヌクレオチドは、ベクター核酸に共有結合している。本発明のこの局面において、ベクターとしては、プラスミド、一本鎖または二本鎖のファージ、一本鎖または二本鎖のＲＮＡウイルスベクターまたはＤＮＡウイルスベクター、あるいは人工染色体（例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、またはＭＡＣ）が挙げられる。
ベクターは、染色体外エレメントとして宿主細胞中で維持され得、染色体外で複製し、そしてレセプターポリヌクレオチドのさらなるコピーを生成する。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得、そして宿主細胞が複製する際にレセプターポリヌクレオチドのさらなるコピーを生成し得る。
本発明は、レセプターポリヌクレオチドの維持のためのベクター（クローニングベクター）または発現のためのベクター（発現ベクター）を提供する。ベクターは、原核生物細胞もしくは真核生物細胞またはその両方（シャトルベクター）において機能し得る。
発現ベクターは、ベクター中で、レセプターポリヌクレオチドに作動可能に連結されたシス作用性調節領域を含み、その結果、宿主細胞中でのそのポリヌクレオチドの転写が可能になる。このポリヌクレオチドは、転写に影響し得る別個のポリヌクレオチドと共に、宿主細胞中に導入され得る。従って、第２のポリヌクレオチドは、ベクターからのレセプターポリヌクレオチドの転写を可能とするよう、シス作用性調節制御領域と相互作用するトランス作用性因子を提供し得る。あるいは、トランス作用性因子は、宿主細胞により供給され得る。最後に、トランス作用性因子は、ベクター自体から産生され得る。
しかし、いくつかの実施形態において、レセプターポリヌクレオチドの転写および／または翻訳は、無細胞系で起こり得ることが理解される。
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドが作動可能に連結される調節配列としては、ｍＲＮＡ転写を指示するプロモーターが挙げられる。これらとしては、バクテリオファージλ由来の左プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌａｃプロモーター、ＴＲＰプロモーター、およびＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０由来の初期プロモーターおよび後期プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター、アデノウイルス初期プロモーターおよびアデノウイルス後期プロモーター、ならびにレトロウイルス長末端反復が挙げられるがこれらに限定されない。
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターはまた、リプレッサ結合部位およびエンハンサーのような、転写を調節し得る領域を含み得る。例としては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、およびレトロウイルスＬＴＲエンハンサーが挙げられる。
転写の開始および制御のための部位を含むことに加えて、発現ベクターはまた、転写終結に必要とされる配列、および転写される領域においては、翻訳のためのリボソーム結合部位を含み得る。発現のための他の調節制御エレメントとしては、開始コドンおよび終止コドンならびにポリアデニル化シグナルが挙げられる。当業者は、発現ベクターにおいて有用な多数の調節配列を認識している。このような調節配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、（１９８９）に記載されている。
種々の発現ベクターが、レセプターポリヌクレオチドを発現するために使用され得る。このようなベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベクター、およびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント（酵母人工染色体を含む）、ウイルス（バキュロウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス）由来のベクター）が挙げられる。ベクターはまた、これらの供給源の組み合わせから誘導され得る（例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメントから誘導されるベクター（例えば、コスミドおよびファージミド））。原核生物宿主および真核生物宿主のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、（１９８９）に記載されている。市販されるいくつかの例示的なベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．３、ＰＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ、ｐＦａｓｔ ＢＡＣ、ｐＦａｓｔ Ｂａｃ Ｈｔ（Ｎｔ（ｈｉｓ）、ｐＦａｓｔ Ｂａｃ Ｃｔ（Ｃｔ ｈａｓ）、ｐＥＴ、ｐＥＴ−Ｈｔ、ｐＥＴ−Ｃｔ、およびｐＧｅｘ−ＧＰＩが挙げられる。
調節配列は、１つ以上の宿主細胞において構成的発現を提供し得る（すなわち、組織特異的）か、または１つ以上の宿主型において誘導性発現（例えば、温度、栄養添加物、または他の外因性因子（例えば、ホルモンまたは他のリガンド））を提供し得る。原核生物宿主および真核生物宿主において構成的発現および誘導性発現を提供する種々のベクターは、当業者に周知である。
レセプターポリヌクレオチドは、周知の方法論によりベクター核酸に挿入され得る。一般的に、最終的に発現されるべきＤＮＡ配列は、１つ以上の制限酵素でこのＤＮＡ配列および発現ベクターを切断し、次いでこれらのフラグメントをひとつに連結することにより、発現ベクターに連結される。制限酵素消化および連結の手順は、当業者に周知である。
適切なポリヌクレオチドを含むベクターは、周知技術を用いて、増殖または発現のために適切な宿主細胞に導入され得る。細菌細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが挙げられるがこれらに限定されない。真核生物細胞としては、酵母、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞）、および植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書中に記載されるように、融合タンパク質としてポリペプチドを発現することが望ましくあり得る。従って、本発明は、レセプターポリペプチドの生成を可能にする融合ベクターを提供する。融合ベクターは、組換えタンパク質の発現を増大し得、組換えタンパク質の可溶性を増大し得、そして例えば、アフィニティー精製のためのリガンドとして作用することにより、このタンパク質の精製を補助し得る。タンパク質分解切断部位は、融合部位の連結部に導入され得、その結果、所望のポリペプチドが、最終的に、融合部位から分離され得る。タンパク質分解酵素としては、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられるがこれらに限定されない。代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９９８））、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）（それぞれ、標的組換えタンパク質に、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを融合する）が挙げられる。適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５（１９８８））およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９（１９９０））が挙げられる。
組換えタンパク質の発現は、宿主細菌において、その宿主細胞が組換えタンパク質をタンパク質分解切断する能力を損傷しているという遺伝的背景を提供することにより最大化され得る（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、Ｓ．、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１１９−１２８）。あるいは、目的のポリヌクレオチドの配列は、特定の宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する優先的なコドン使用頻度を提供するよう変更され得る（Ｗａｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８（１９９２））。
レセプターポリヌクレオチドはまた、酵母において機能する発現ベクターにより発現され得る。酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４（１９８７））、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎら、Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３（１９８７））、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が挙げられる。
レセプターポリヌクレオチドはまた、例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞において発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５（１９８３））およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９））が挙げられる。
本発明の特定の実施形態において、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドは、哺乳動物発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、Ｂ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７））およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５（１９８７）が挙げられる。
本明細書中に列挙される発現ベクターは、レセプターポリヌクレオチドを発現するのに有用な、当業者に利用可能な周知ベクターの単なる例示として提供される。当業者は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの維持、増殖、または発現のために適切な他のベクターを認識している。これらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９において見出される。
本発明はまた、本明細書中に記載される核酸配列が、逆方向でベクター中にクローニングされているが、アンチセンスＲＮＡの転写を可能にする調節配列に作動可能に連結されているベクターを包含する。従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列（コード領域および非コード領域の両方を含む）の全てまたは一部に対するアンチセンス転写物が、生成され得る。このアンチセンスＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現に関して上記に記載したパラメータ（調節配列、構成性発現または誘導性発現、組織特異的発現）の各々の影響を受ける。
本発明はまた、本明細書中に記載されるベクターを含む組換え宿主細胞に関する。従って、宿主細胞としては、原核生物細胞、下等真核生物細胞（例えば、酵母）、他の真核生物細胞（例えば、昆虫細胞）、および高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）が挙げられる。
組換え宿主細胞は、当業者が容易に利用可能な技術によって、本明細書中に記載されるベクター構築物をこの細胞に導入することにより調製される。これらとしては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション、および他の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）に見出される技術）が挙げられるがこれらに限定されない。
宿主細胞は、１つより多くのベクターを含み得る。従って、異なるヌクレオチド配列は、同じ細胞の異なるベクターに導入され得る。同様に、レセプターポリヌクレオチドは、単独でかまたはそのレセプターポリヌクレオチドと関連しない他のポリヌクレオチド（例えば、発現ベクターに対するトランス作用性因子を提供するポリヌクレオチド）と共に導入され得る。１つより多くのベクターが細胞中に導入される場合、ベクターは、独立して導入され得るか、同時に導入され得るか、またはレセプターポリヌクレオチドベクターに連結され得る。
バクテリオファージおよびウイルスベクターの場合、これらは、感染および形質導入の標準的な手順によって、パッケージウイルスまたはカプセル化ウイルスとして細胞中に導入され得る。ウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。ウイルス複製が欠損している場合、複製は、その欠損を補完する機能を提供する宿主細胞中で起こる。
ベクターは、一般的に、組換えベクター構築物を含む細胞の部分集団の選択を可能にする選択マーカーを含む。このマーカーは、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドを含む同じベクター中に含まれ得るか、または別のベクターに含まれ得る。マーカーとしては、テトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子（原核生物宿主細胞用）およびジヒドロ葉酸レダクターゼ耐性またはネオマイシン耐性（真核生物細胞用）が挙げられる。しかし、表現型形質についての選択を提供する任意のマーカーが有効である。
成熟タンパク質が、適切な調節配列の制御下で、細菌、酵母、哺乳動物細胞、および他の細胞において生成され得るが、無細胞転写および翻訳系もまた、本明細書中に記載されるＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてこれらのタンパク質を生成するために使用され得る。
ポリペプチドの分泌が所望される場合、適切な分泌シグナルが、ベクター中に組み込まれる。シグナル配列は、レセプターポリペプチドに対して内因性であり得るか、またはこれらのポリペプチドに対して異種であり得る。
ポリペプチドが培地に分泌されない場合、タンパク質は、標準的な破壊手順（凍結解凍、超音波破砕、機械的破壊、溶解剤の使用等を含む）によって宿主細胞から単離され得る。次いで、このポリペプチドは、周知の精製方法（硫酸アンモニウム沈殿、酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィーを含む）によって収集および精製され得る。
本明細書中に記載されるポリペプチドの組換え産生における宿主細胞に依存して、このポリペプチドは、その細胞に依存して、種々のグリコシル化パターンを有し得るか、または、細菌において生成される場合のように、グリコシル化されなくてもよいこともまた理解される。さらに、このポリペプチドは、宿主により媒介されるプロセスの結果として、いくつかの場合、開始改変メチオニンを含み得る。
（ベクターおよび宿主細胞の使用）
本明細書中に記載されるポリペプチドを発現する宿主細胞、特に、組換え宿主細胞は、種々の用途を有する。第１に、この細胞は、所望の量のレセプタータンパク質またはフラグメントを生じるようさらに精製され得る、レセプタータンパク質またはポリペプチドを生成するのに有用である。従って、発現ベクターを含有する宿主細胞は、ポリペプチド生成に有用である。
宿主細胞はまた、レセプターまたはレセプターフラグメントに関する細胞ベースのアッセイを実施するのに有用である。従って、ネイティブのレセプターを発現する組換え宿主細胞は、レセプター機能を刺激または阻害する化合物についてアッセイするために有用である。これとしては、リガンド結合、転写または翻訳のレベルでの遺伝子発現、Ｇタンパク質相互作用、およびシグナル伝達経路の成分が挙げられる。
宿主細胞はまた、これらの機能が影響を及ぼすレセプター変異を同定するのに有用である。この変異が天然で生じ、そして病理を引き起こす場合、この変異を含む宿主細胞は、ネイティブレセプターに対するそれらの効果により示されないかもしれない、変異体レセプターに対する所望の効果（例えば、機能の刺激または阻害）を有する化合物をアッセイするのに有用である。
組換え宿主細胞はまた、異種アミノ末端細胞外ドメイン（または他の結合領域）による活性化を活性化または抑制する化合物を評価するために本明細書中に記載のキメラポリペプチドを発現するのに有用である。あるいは、膜貫通ドメイン全体（またはその一部）にまたがる異種領域は、任意の所定の宿主細胞に対する所望のアミノ末端細胞外ドメイン（または他の結合領域）の効果を評価するために使用され得る。この実施形態において、特定の宿主細胞と適合する膜貫通ドメイン全体（またはその一部）にまたがる領域が、キメラベクターを作製するために使用される。あるいは、異種カルボキシ末端細胞内ドメイン（例えば、シグナル伝達ドメイン）が、宿主細胞中に導入され得る。
さらに、種々の機能（例えば、リガンド結合またはＧタンパク質結合）のうちの１つ以上が増加または減少するよう操作された変異体レセプターが設計され得、そして個体においてレセプタータンパク質を増強または置換するために使用され得る。従って、宿主細胞は、異常なレセプターを置換することによるか、または治療的結果を提供する異常なレセプターを提供することにより治療的利益を提供し得る。１つの実施形態において、この細胞は、異常に活性であるレセプターを提供する。
別の実施形態において、この細胞は、異常に不活性なレセプターを提供する。これらのレセプターは、個体において内因性レセプターと競合し得る。
別の実施形態において、活性化され得ないレセプターを発現する細胞は、リガンドに対して内因性レセプターと競合するよう個体に導入される。例えば、過剰なリガンドが処置様式の一部である場合、処置の特定の時点でこのリガンドを不活化する必要があり得る。リガンドについて競合するが、レセプター活性化により影響を受け得ない細胞を提供することは、有益である。
宿主細胞ゲノムにおいて内因性レセプターポリヌクレオチド配列のインサイチュでの変更を可能にする相同組換え宿主細胞もまた、生成され得る。この技術は、ＷＯ９３／０９２２２、ＷＯ９１／１２６５０、および米国特許第５，６４１，６７０号により十分に記載されている。簡単に言うと、レセプターポリヌクレオチドに対応する特定のポリヌクレオチド配列またはレセプター遺伝子の近位もしくは遠位の配列は、相同組換えにより宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ここで、この遺伝子の発現が影響され得る。１つの実施形態において、内因性配列の発現を増加または減少させる調節配列が導入される。従って、レセプタータンパク質は、通常それを産生しない細胞において産生され得るか、またはレセプタータンパク質の増加した発現が、通常特定のレベルでそのタンパク質を産生する細胞において生じ得る。あるいは、遺伝子全体が欠失され得る。なおさらに、特定の変異が、その遺伝子の任意の所望の領域に導入されて、変異レセプタータンパク質が生成され得る。このような変異は、例えば、特定の機能的領域（例えば、リガンド結合部位またはＧタンパク質結合部位）に導入され得る。
１つの実施形態において、宿主細胞は、変更されたレセプター遺伝子を含むトランスジェニック動物を生じるために使用され得る、受精した卵母細胞または胚性幹細胞であり得る。あるいは、宿主細胞は、細胞の特定のサブセットを生じる、幹細胞または他の初期組織前駆体であり得、動物中でトランスジェニック組織を生じるのに使用され得る。相同組換えベクターの説明については、Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ ５１：５０３（１９８７）もまた参照のこと。このベクターは、胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、そして導入遺伝子が内因性レセプター遺伝子と相同組換えされた細胞が選択される（例えば、Ｌｉ，Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ ６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。次いで、選択された細胞は、動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入され、凝集キメラが形成される（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７）１１３−１５２頁を参照のこと）。次いで、キメラ胚は、適切な偽妊娠雌養母動物に移植され得、そして胎芽が出産される。その生殖細胞において相同組換えＤＮＡを有する子孫は、その動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列伝達により相同組換えＤＮＡを含む動物を交配するために使用され得る。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：８２３−８２９ならびにＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；およびＷＯ９３／０４１６９にさらに記載されている。
遺伝子操作された宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。トランスジェニック動物は、好ましくは、哺乳動物、例えば、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）であり、この動物の１つ以上の細胞が導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、トランスジェニック動物を生じる細胞のゲノムに組み込まれ、そしてトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織において成熟動物のゲノムで維持される外因性ＤＮＡである。これらの動物は、レセプタータンパク質の機能を研究するため、ならびにレセプタータンパク質活性のモジュレーターを同定および評価するために有用である。
トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、および両生類が挙げられる。
１つの実施形態において、宿主細胞は、レセプターポリヌクレオチド配列が導入された受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。
トランスジェニック動物は、受精した卵母細胞の雄性前核に核酸を（例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により）導入し、そしてこの卵母細胞を偽妊娠雌養母動物において発生させることにより生成され得る。任意のレセプターヌクレオチド配列が、導入遺伝子として、非ヒト動物（例えば、マウス）のゲノムに導入され得る。
発現ベクターにおいて有用な任意の調節配列または他の配列は、トランスジェニック配列の一部を形成し得る。これは、既に含まれていないのであれば、イントロン配列およびポリアデニル化シグナルを含む。組織特異的調節配列は、導入遺伝子に作動可能に連結されて、特定の細胞に対するレセプタータンパク質の発現を指示し得る。
胚操作およびマイクロインジェクションを通じてトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製する方法は、当該分野で慣習的となっており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号（両方ともＬｅｄｅｒらによる）、米国特許第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒらによる）、およびＨｏｇａｎ，Ｂ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）に記載される。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック初代動物は、そのゲノムにおける導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織または細胞におけるトランスジェニックｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック初代動物は、導入遺伝子を保有するさらなる動物を交配するために使用され得る。さらに、導入遺伝子を有するトランスジェニック動物はさらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物と交配され得る。トランスジェニック動物としてはまた、その動物全体または動物中の組織が、本明細書中に記載される相同組換え宿主細胞を用いて生成された動物が挙げられる。
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物が、作製され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明については、例えば、Ｌａｋｓｏら、ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２３６（１９９２）を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５（１９９１））。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が、導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要とされる。このような動物は、「二重」トランスジェニック動物の構築を通じて（例えば、一方は、一方は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方は、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む、２つのトランスジェニック動物を交配することによって）提供され得る。
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）ならびにＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９に記載される方法に従って生成され得る。簡単に言うと、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）が単離され得、そして増殖サイクルを出て、Ｇ０期に入るよう誘導され得る。次いで、静止細胞は、例えば、電気パルスの使用を通じて、静止細胞が単離されたのと同一種の動物由来の除核卵母細胞に融合され得る。次いで、再構築された卵母細胞は培養され、それによって、桑実胚または胚盤胞に成長し、次いで偽妊娠雌養母動物に移される。この雌養母動物の子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離された動物のクローンである。
本明細書中に記載されるポリペプチドを発現する組換え細胞を含むトランスジェニック動物は、インビボの状況で本明細書中に記載されるアッセイを実施するのに有用である。従って、インビボで存在し、リガンド結合、レセプター活性化、およびシグナル伝達をもたらし得る種々の生理学的因子は、インビトロ無細胞アッセイまたは細胞ベースのアッセイから明らかではないかもしれない。従って、インビボレセプター機能（リガンド相互作用、レセプター機能およびリガンド相互作用に対する特定の変異レセプターの効果、ならびにキメラレセプターの効果を含む）をアッセイするために、非ヒトトランスジェニック動物を提供することが有用である。ヌル変異（１つ以上のレセプター機能を実質的または完全に失った変異）の効果を評価することもまた可能である。
（薬学的組成物）
レセプターの核酸分子、タンパク質（特に、アミノ末端細胞外ドメインのようなフラグメント）、タンパク質のモジュレーター、および抗体（本明細書中で、「活性化合物」とも呼ばれる）は、被験体（例えば、ヒト）に投与するのに適切な薬学的組成物中に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的には、核酸分子、タンパク質、モジュレーター、または抗体と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む。
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合性の、任意および全ての、溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のための、このような媒体および因子の使用は、当該分野で周知である。任意の従来型の媒体または因子が活性化合物に不適合性である範囲を除いて、このような媒体は、本発明の組成物において使用され得る。補充の活性化合物もまた、この組成物中に組み込まれ得る。本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路に適合性であるように処方される。投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（局所）、経粘膜投与、および直腸投与）が挙げられる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される、溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈液（例えば、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗細菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝剤（例えばアセテート、シトレートまたはホスフェート）、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張度を調整するための因子。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または塩化ナトリウム）で調整され得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て可能なシリンジ、または複数用量のバイアルに封入され得る。
注射可能な使用に適切な薬学的組成物としては、無菌水溶液（水溶性の場合）または無菌分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＪ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は、無菌でなければならず、そして容易な注射可能性が存在する程度に流動性であるべきである。この組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散液の場合には必要とされる粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって、達成され得る。多くの場合において、組成物中に、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトール、塩化ナトリウム）を含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅滞させる因子（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）をこの組成物中に含めることによって、もたらされ得る。
滅菌注射可能な溶液は、上で列挙した成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒に、必要量の活性化合物（例えば、レセプタータンパク質または抗レセプター抗体）を組み込み、所望される場合、続いて滅菌濾過することによって、調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、上で列挙した、基本的分散媒体および必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって、調製される。滅菌注射可能な溶液の調製用の滅菌粉末の場合において、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これによって、活性成分およびさらなる任意の所望な成分の粉末が、予め滅菌濾過したその溶液から得られる。
経口組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用キャリアを含有する。これらは、ゼラチンカプセル内に封入され得るか、または錠剤内に圧縮され得る。経口投与について、因子は、胃の中を耐えるように腸溶性形態で含まれ得るか、または公知の方法によってＧＩ管の特定の領域に放出されるように、さらにコーティングもしくは混合され得る。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬として使用するための流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中の化合物は、経口的に適用され、うがいされて（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合可能な結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分、または類似の性質の化合物のいずれかを含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）；崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；潤沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅ）；潤滑剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；または、芳香剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料）。
吸入による投与のために、化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器もしくはディスペンサ、または噴霧器から、エアゾールスプレーの形態で送達される。
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によってであり得る。経粘膜投与または経皮投与のために、透過すべきバリアに適切な浸透剤が、処方物において使用される。このような浸透剤は、一般に、当該分野で公知であり、そしてこれらの浸透剤としては、例えば、経粘膜投与用の、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与のために、活性化合物は、当該分野で一般に公知のように、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム中に処方される。
この化合物はまた、坐剤の形態（例えば、カカオ脂および他のグリセリドのような従来型の坐剤基剤を用いる）または直腸送達用の保持浣腸剤の形態で調製され得る。
１つの実施形態において、活性化合物は、身体からの急激な排出に対して、この化合物を保護するキャリアを用いて調製される（例えば、移植物およびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出処方物）。生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が、使用され得る。このような処方物を調製するための方法は、当業者に明らかである。この材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．からも商業的に入手され得る。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されたリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
投与を容易にし、そして投薬量を均一にするために、投薬単位形態の経口用組成物または非経口用組成物を処方することが、特に有利である。本明細書中で使用される場合、投薬単位形態とは、処置されるべき被験体に対する単一投薬量として適した、物理学的に別々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアとともに所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、活性化合物の独自の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置に対してこのような活性化合物を配合する技術における固有の制限によって決定され、そしてそれらに直接依存する。
本発明の核酸分子は、ベクター中に挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号）によってか、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら、ＰＮＡＳ ９１：３０５４〜３０５７（１９９４）を参照のこと）によって、被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれた徐放性マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター（例えば、レトロウイルスベクター）が組換え細胞からインタクトに産生され得る場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１種以上の細胞を含み得る。
薬学的組成物は、投与説明書と一緒に、コンテナ、パック、またはディスペンサ内に含まれ得る。
本発明は、異なる多くの形態で具体化され得るが、本明細書中に示される実施形態を制限するとは解釈されるべきではなく；むしろ、これらの実施形態は、この開示により、本発明が当業者に完全に伝わるように、提供される。前述の記載において示された教示の利点を有する本発明の多くの改変および他の実施形態が、本発明が属する分野の当業者に思い浮かべられる。特定の用語が用いられるが、これらの用語は、他に指示がない限り、当該分野で用いられるのと同じように使用される。
図１は、ＭＩＤ ２４１のアミノ酸配列（配列番号１）および核酸配列（配列番号２）を示す。配列番号２において、Ｇタンパク質シグナル伝達サインは、下線を付けられている。 図２は、ＭＩＤ ２４１の未成熟ポリペプチド配列および成熟ポリペプチド配列を示す。斜線領域は、未成熟タンパク質から切断されると予測されるアミノ酸を示す。下線は、予測される膜貫通ドメインを示す。 図３は、ＭＩＤ ２４１レセプター疎水性プロットを示す。このアミノ酸は、１〜３６０に対応し、そして７個の膜貫通セグメントを示す。
【配列表】
Figure 2005519637
Figure 2005519637

Claims (15)

  1. 細胞中のポリペプチドのレベルまたは活性を調節する因子を同定するための方法であって、該ポリペプチドは、以下：
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子改変体のアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列であって、
    ここで、該配列改変体は、配列番号２に示される核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、アミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、該フラグメントは、少なくとも１０個連続したアミノ酸を含む、フラグメント；
    （ｅ）配列番号１に示される、約アミノ酸６〜約アミノ酸３６０の、成熟レセプターポリペプチドのアミノ酸配列；
    （ｆ）約アミノ酸１〜約アミノ酸３６０の、配列番号１に示されるポリペプチドのアミノ酸配列；
    （ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つのエピトープ保有領域のアミノ酸配列；
    からなる群より選択され、
    該方法は、該因子を、該ポリペプチドを発現し得る細胞と接触させ、その結果、該ポリペプチドのレベルまたは活性が該細胞において該因子によって調節され得る工程、および該ポリペプチドのレベルまたは活性を測定する工程を包含し、ここで、該細胞は、結腸、結腸腫瘍、副腎下垂体、心臓、小腸、副腎、および脳の細胞からなる群に由来する、方法。
  2. 細胞をスクリーニングして、該細胞中のポリペプチドのレベルまたは活性を調節する因子を同定する方法であって、ここで、該ポリペプチドが、以下：
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子改変体のアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列であって、
    ここで、該配列改変体は、それぞれ、配列番号２に示される核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、アミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、該フラグメントは、少なくとも１０個連続したアミノ酸を含む、フラグメント；
    （ｅ）配列番号１に示される、約アミノ酸６〜約アミノ酸３６０の、成熟レセプターポリペプチドのアミノ酸配列；
    （ｆ）約アミノ酸１〜約アミノ酸３６０の、配列番号１に示されるポリペプチドのアミノ酸配列；
    （ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つのエピトープ保有領域のアミノ酸配列；
    からなる群より選択され、
    該方法は、該因子を、該ポリペプチドを発現し得る細胞と接触させ、その結果、該ポリペプチドのレベルまたは活性が該細胞において該因子によって調節され得る工程、および該ポリペプチドのレベルまたは活性を測定する工程を包含し、ここで、該細胞が、結腸、結腸腫瘍、副腎下垂体、心臓、小腸、副腎、および脳の細胞からなる群に由来する、方法。
  3. 前記因子が、ペプチド；ホスホペプチド；抗体；有機分子；および無機分子からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  4. サンプル中のポリペプチドの存在を検出するための方法であって、該方法は、該サンプルを、該サンプル中での該ポリペプチドの存在の検出を特異的に可能にする因子と接触させる工程、次いで該ポリペプチドの存在を検出する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、以下：
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子改変体のアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列であって、
    ここで、該配列改変体は、それぞれ、配列番号２に示される核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、アミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、該フラグメントは、少なくとも１０個連続したアミノ酸を含む、フラグメント；
    （ｅ）配列番号１に示される、約アミノ酸６〜約アミノ酸３６０の、成熟レセプターポリペプチドのアミノ酸配列；
    （ｆ）約アミノ酸１〜約アミノ酸３６０の、配列番号１に示されるポリペプチドのアミノ酸配列；
    （ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つのエピトープ保有領域のアミノ酸配列；
    からなる群より選択され、
    ここで、該サンプルが、結腸、結腸腫瘍、副腎下垂体、心臓、小腸、副腎、および脳の細胞からなる群から選択される細胞に由来する、方法。
  5. ポリペプチドのレベルまたは活性を調節するための方法であって、該方法は、
    該ポリペプチドを、因子が該ポリペプチドのレベルまたは活性を調節する条件下で該因子と接触させる工程を包含し、ここで、該ポリペプチドが、以下：
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子改変体のアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列であって、
    ここで、該配列改変体は、それぞれ、配列番号２に示される核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、アミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、該フラグメントは、少なくとも１０個連続したアミノ酸を含む、フラグメント；
    （ｅ）配列番号１に示される、約アミノ酸６〜約アミノ酸３６０の、成熟レセプターポリペプチドのアミノ酸配列；
    （ｆ）約アミノ酸１〜約アミノ酸３６０の、配列番号１に示されるポリペプチドのアミノ酸配列；
    （ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つのエピトープ保有領域のアミノ酸配列；
    からなる群より選択され、
    ここで、該調節が、結腸、結腸腫瘍、副腎下垂体、心臓、小腸、副腎、および脳の細胞からなる群より選択される組織に由来する細胞において生じる、方法。
  6. 細胞中の核酸分子のレベルまたは活性を調節する因子を同定するための方法であって、ここで、該核酸分子は、以下：
    （ａ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列；
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；
    （ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、該配列改変体は、それぞれ、配列番号２に示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；
    （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
    （ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該フラグメントは、少なくとも１０個連続したアミノ酸を含む、ヌクレオチド配列；ならびに
    （ｇ）（ｆ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
    からなる群より選択される核酸配列を有し、
    該方法は、該因子を、該核酸分子を発現し得る細胞と接触させ、その結果、該核酸分子のレベルまたは活性が該細胞において該因子によって調節され得る工程、および該核酸分子のレベルまたは活性を測定する工程を包含し、ここで、該細胞は、結腸、結腸腫瘍、副腎下垂体、心臓、小腸、副腎、および脳の細胞からなる群に由来する、方法。
  7. 細胞をスクリーニングして、該細胞中の核酸分子のレベルまたは活性を調節する因子を同定する方法であって、ここで、該核酸分子が、以下：
    （ａ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列；
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；
    （ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、該配列改変体は、それぞれ、配列番号２に示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；
    （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
    （ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該フラグメントは、少なくとも１０個連続したアミノ酸を含む、ヌクレオチド配列；ならびに
    （ｇ）（ｆ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
    からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、
    該方法は、該因子を、該核酸分子を発現し得る細胞と接触させ、その結果、該核酸分子のレベルまたは活性が該細胞において該因子によって調節され得る工程、および該核酸分子のレベルまたは活性を測定する工程を包含し、ここで、該細胞は、結腸、結腸腫瘍、副腎下垂体、心臓、小腸、副腎、および脳の細胞からなる群に由来する、方法。
  8. 細胞をスクリーニングして、該細胞中の核酸分子と相互作用する因子を同定する方法であって、ここで、該核酸分子が、以下：
    （ａ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列；
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；
    （ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、該配列改変体は、それぞれ、配列番号２に示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；
    （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
    （ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該フラグメントは、少なくとも１０個連続したアミノ酸を含む、ヌクレオチド配列；ならびに
    （ｇ）（ｆ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
    からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、
    該方法は、該因子を、該核酸分子と該因子との間での相互作用を可能にし得る細胞と接触させ、その結果、核酸分子が該因子と相互作用し得る工程、および該相互作用を測定する工程を包含し、ここで、該細胞は、結腸、結腸腫瘍、副腎下垂体、心臓、小腸、副腎、および脳の細胞からなる群に由来する、方法。
  9. サンプル中の核酸分子の存在を検出するための方法であって、該方法は、該サンプルを、該サンプル中での該核酸分子の存在の検出を特異的に可能にする因子と接触させる工程、次いで該核酸分子の存在を検出する工程を包含し、ここで、該核酸分子は、以下：
    （ａ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列；
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；
    （ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、該配列改変体は、それぞれ、配列番号２に示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；
    （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
    （ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該フラグメントは、少なくとも１０個連続したアミノ酸を含む、ヌクレオチド配列；および
    （ｇ）（ｆ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
    からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、
    ここで、該サンプルは、結腸、結腸腫瘍、副腎下垂体、心臓、小腸、副腎、および脳の細胞からなる群より選択される組織に由来する、方法。
  10. 核酸分子のレベルまたは活性を調節するための方法であって、該方法は、該核酸分子を因子と、該因子が該核酸分子のレベルまたは活性を調節するのを可能にする条件下で接触させる工程を包含し、該核酸分子は、以下：
    （ａ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列；
    （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；
    （ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、該配列改変体は、それぞれ、配列番号２に示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；
    （ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
    （ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該フラグメントは、少なくとも１０個連続したアミノ酸を含む、ヌクレオチド配列；および
    （ｇ）（ｆ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
    からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、
    ここで、該調節は、結腸、結腸腫瘍、副腎下垂体、心臓、小腸、副腎、および脳の細胞からなる群より選択される組織においてである、方法。
  11. 前記検出する工程が、細胞に関する障害を有する被験体に由来する該細胞においてである、請求項４に記載の方法。
  12. 前記調節が、細胞に関する障害を有する被験体に由来する該細胞においてである、請求項５に記載の方法。
  13. 前記障害が結腸癌である、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記障害が結腸癌である、請求項１２に記載の方法。
  15. ＭＩＤ ２４１を用いて結腸癌を処置するための、方法。
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