JP2003530876A - 単離ヒトｇタンパク質共役受容体、ヒトｇｐｃｒタンパク質をコード化している核酸分子、及びそれらの使用 - Google Patents

単離ヒトｇタンパク質共役受容体、ヒトｇｐｃｒタンパク質をコード化している核酸分子、及びそれらの使用

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JP2003530876A JP2001578496A JP2001578496A JP2003530876A JP 2003530876 A JP2003530876 A JP 2003530876A JP 2001578496 A JP2001578496 A JP 2001578496A JP 2001578496 A JP2001578496 A JP 2001578496A JP 2003530876 A JP2003530876 A JP 2003530876A
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ディーアイ，フランセスコ，バレンティナ
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ピーイー コーポレーション （エヌワイ）
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトゲノム中の遺伝子によりコード化されている、本発明のＧＰＣＲペプチドのアミノ酸配列を提供するものである。本発明は特に、単離ペプチド及び核酸分子、ＧＰＣＲペプチドのオルトログ及びパラログの同定方法、及びＧＰＣＲペプチドのモジュレータの同定方法を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体(ＧＰＣＲ)の分野に属し、ＭＡＳ癌原遺伝
子受容体サブファミリー、組み換えＤＮＡ分子、及びタンパク質生成に関連する
ものである。本発明は特に、ヒトの治療方法の開発に用いるための、新規なＧＰ
ＣＲペプチド及びタンパク質、それらのペプチド及びタンパク質分子をコード化
している核酸分子を提供するものである。
【０００２】
【背景技術】Ｇタンパク質共役受容体 Ｇ−タンパク質共役受容体(ＧＰＣＲ)は、細胞内での信号伝達を担うタンパク
質の主要部を構成している。ＧＰＣＲは、アミノ末端の細胞外ドメイン、７つの
膜貫通セグメントを含む膜貫通ドメイン及び３つの細胞外ループ及び３つの細胞
内ループ、及びカルボキシ末端の細胞内ドメインといった、３つの構造上のドメ
インを有する。ＧＰＣＲの細胞外部分にリガンドが結合する際に、細胞内で信号
が伝達され、その結果細胞の生物学的又は生理的な性質が変化する。ＧＰＣＲ、
及びＧタンパク質、効果器（Ｇ−タンパク質により変調される細胞内酵素及びチ
ャネル）は、細胞内二次メッセンジャーの状態を細胞外入力へと結びつけるモジ
ュラー信号システムの構成成分である。
【０００３】 ＧＰＣＲ遺伝子及び遺伝子生成物は、疾患を引き起こす原因薬剤であり得る(S
piegel et al., J. Clin. Invest. 92:1119-1125 (1993); McKusick et al., J.
Med. Genet. 30:1-26 (1993))。ロドプシン遺伝子及びＶ２バソプレッシン受容
体遺伝子に特有の欠陥として、種々の色素性網膜炎を引き起こすこと(Nathans e
t al., Annu. Rev. Genet. 26:403-424(1992))、及び腎性尿崩症を引き起こすこ
と(Holtzman et al., Hum. Mol. Genet. 2:1201-1204 (1993))が示されている。
これらの受容体は、中枢神経系、及び末梢の生理的プロセスにおいて非常に重要
である。進化解析においては、これらのタンパク質は元来、複雑な身体設計、神
経系とともに発達してきたことが示唆されている。
【０００４】 ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは、ファミリーI：ロドプシン及びβ
２−プリン作動性受容体により代表される、現在までに２００以上の特有のメン
バーが示されている受容体(Dohlman et al., Annu. Rev. Biochem. 60:653-688
(1991))；ファミリーII：副甲状腺ホルモン/カルシトニン/セクレチン受容体フ
ァミリー(Juppner et al., Science 254:1024-1026 (1991); Lin et al., Scien
ce 254:1022-1024 (1991));ファミリーIII：代謝性のグルタミン酸塩受容体ファ
ミリー(Nakanishi, Science 258 597:603 (1992));ファミリーIV：走化性、及び
D. discoideumの発達に重要なｃＡＭＰ受容体ファミリー(Klein et al., Scienc
e 241:1467-1472 (1988));ファミリーV：ＳＴＥ２のような菌類交接フェロモン
受容体(Kurjan, Annu. Rev. Biochem. 61:1097-1129 (1992))、の５つのファミ
リーに分類することができる
【０００５】 ここには、推定７つの疎水性セグメントが存在しＧＰＣＲとは無関係と思われ
る、少数の他のタンパク質も含まれており、これらはＧタンパク質との結合を示
さなかった。ショウジョウバエは、光受容体に特有のタンパク質であるｂｒｉｄ
ｅ-ｏｆ-ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ(ｂｏｓｓ)を発現し、この７つの膜貫通セグメント
を持つタンパク質は広範囲にわたって研究されているが、ＧＰＣＲであるという
証拠は示されていない(Hart et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5047-505
1 (1993))。ショウジョウバエ中のちぢれた遺伝子（ｆｚ）もまた、７つの膜貫
通セグメントを持つタンパク質であると考えられる。ｂｏｓｓと同様に、ｆｚも
Ｇタンパク質との結合を示さなかった(Vinson et al., Nature 338:263-264 (19
89))。
【０００６】 Ｇタンパク質は、グアニンヌクレオチドと結合するα、β、及びγサブユニッ
トから成るヘテロ三量体タンパク質ファミリーである。これらのタンパク質は、
通常、例えば７つの膜貫通セグメントを含む受容体のような、細胞表面の受容体
に結合している。リガンドのＧＰＣＲとの結合に引き続いて、立体配座の変化が
Ｇタンパク質に伝達され、これによりαサブユニットに結合しているＧＤＰ分子
がＧＴＰ分子と交換され、β、γサブユニットからの分離を引き起こす。αサブ
ユニットのＧＴＰ結合様式は、典型的には、効果器変調部として機能し、ｃＡＭ
Ｐ（例えば、アデニルシクラーゼの活性化によって）、ジアシルグリセロール、
イノシトールリン酸塩のような二次メッセンジャーの生成を導く。２０種類以上
の異なるαサブユニットがヒトにおいて知られている。これらのサブユニットは
、β、γサブユニットのより小さいプールと関連している。哺乳類のＧタンパク
質の例としては、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、Ｇｓ、及びＧｔが含まれる。Ｇタンパク質
は、Lodish et al., Molecular Cell Biology、(Scientific American Books In
c., New York, N.Y., 1995)に広範囲にわたって記載されており、その内容は参
考文献としてここに折り込まれている。ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、Ｇタンパク質
結合効果器、及び二次メッセンジャーシステムについては、The G-Protein Link
ed Receptor Fact Book, Watson et al., eds., Academic Press (1994)に記述
されている。
【０００７】ＭＡＳ１癌性遺伝子様受容体 ヒトＭＡＳ１癌性遺伝子は、最初、Ｎ１Ｈ３Ｔ３細胞へと転換することにより
見出された。ＭＡＳ１癌性遺伝子は、コトランスフェクション、及び腫瘍原性ア
ッセイを用い、ヒト類表皮癌遺伝子細胞系のＤＮＡからから単離された(Young e
t al., 1984)。予測されるアミノ酸配列に基づくと、ＭＡＳ１遺伝子生成物はＧ
ＰＣＲに典型的な７回膜貫通ドメインを含んでいる。したがって、ＭＡＳ１タン
パク質はおそらく細胞膜内タンパク質である。ＭＡＳ１にコード化されるタンパ
ク質は受容体であり、生育−調整経路の発症性成分を活性化、変調し、発癌の影
響を引き起こし得る。Ｊａｃｓｏｎら(1988)は、ＭＡＳ癌遺伝子が、サブスタン
スＫ受容体と類似した配列であることを示した。このことに基づいて、彼らはそ
れがイノシトール脂質信号経路を通じて作用する分裂促進活性を持ったペプチド
受容体をコードしているものであると予測した。アフリカツメガエル卵細胞、及
びトランスフェクトされた哺乳類細胞系での発現により、ＭＡＳ遺伝子生成物が
機能性アンギオテンシン受容体であることが実証された。
【０００８】 Ｒｏｓｓら(1990)は、ＭＡＳ１癌性遺伝子に関連するＧＰＣＲであるＲＴＡ受
容体を同定した。ＲＴＡは、腸、輸精管、子宮、大動脈の至るところで多量に発
現しているが、肝臓、腎臓、肺、唾液腺ではわずかに検出されるのみである。ラ
ットの脳においては、ＲＴＡ配列は小脳に非常に多量に存在する。ＲＴＡは、前
脳のアンギオテンシン受容体になると考えられるＭＡＳ癌性遺伝子に最も関連し
ている（３４％一致）。しかしながら、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡをそれぞれ、Ｃ
ＯＳ細胞、アフリカツメガエル卵細胞に導入した後、ＲＴＡ受容体へのアンギオ
テンシンの結合は検出されなかった。したがって、ＲＴＡはアンギオテンシン受
容体ではないと結論付けられた。
【０００９】 Ｙｏｕｎｇら(1988)は、ＭＡＳ癌性遺伝子のラット相同体をクローンし、ＤＮ
Ａ配列を決定し、ラットの各種組織における発現を調査した。ラットとヒトのＭ
ＡＳタンパク質の予測配列を比較した結果、親水性アミノ末端ドメインを除いて
、高度に保持されていることが示された。脳の海馬、及び大脳皮質においては、
ＭＡＳＲＮＡの転写が高いレベルで検出されたが、神経組織領域や他の組織にお
いては検出されなかった。この発現パターン、及びＭＡＳタンパク質と既知の受
容体タンパク質との類似性から、ＭＡＳが、通常の神経生理学、及び／又は特定
の神経組織の発達に関連する受容体をコード化しているものと推測される。
【００１０】 新規なＭＡＳ癌性遺伝子様受容体の発見は、癌及び神経変性疾患の予防、診断
、治療のための新規化合物を提供することによって、当該技術分野の要求を満た
すこととなる。（例えば、1）Ross PC, et al., A candidate G protein-couple
d receptor: cloning, sequencing, and tissue distribution. Proc Natl Acad
Sci U S A 1990 Apr;87(8):3052-6; 2) Young D, et al., Characterization o
f the rat mas oncogene and its high-level expression in the hippocampus
and cerebral cortex of rat brain., Proc Natl Acad Sci U S A 1988 Jul;85(
14):5339-42; 3) Young, D.; et al., Isolation and characterization of a n
ew cellular oncogene encoding a protein with multiple transmembrane doma
ins. Cell 45: 711-719, 1984; and 4) Jackson, T. R., et al., The mas onco
gene encodes an angiotensin receptor. Nature 335: 437-440, 1988を参照さ
れたい)。
【００１１】 ＧＰＣＲ、特にＭＡＳ癌原遺伝子受容体サブファミリーのメンバーは、薬剤の
挙動、及び開発、特に、癌及び神経変性疾患の予防、診断、治療のための重要な
ターゲットである。したがって、従来未知のＧＰＣＲを同定し特徴づけることは
、製薬開発の分野において非常に有用である。本発明は、従来未確認のヒトＧＰ
ＣＲを提供することによって、これらの技術の進展に寄与するものである。
【００１２】
【発明の要約】
本発明は、ヒトＧＰＣＲペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列同定に部分的
に基づいたものであり、ＭＡＳ癌原遺伝子受容体サブファミリー、これらの対立
遺伝子変異体、及び他の哺乳類におけるこれらのオルトログに関連するものであ
る。これらの特異なペプチド配列、及びこれらのペプチドをコード化する核酸配
列は、ヒト治療ターゲットの開発のためのモデルとして用いることができ、治療
に用いるタンパク質の同定に有用であり、ヒト治療薬剤の開発のターゲットとな
り得る。
【００１３】 本発明にかかるタンパク質は、これらのタンパク質を発現する細胞中のＭＡＳ
癌原遺伝子受容体サブファミリーにより媒介される信号経路に関連するＧＰＣＲ
である（図１の発現情報を参照：本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺
、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検索に
より確認された（図１））。「信号経路」とは、ここで用いられる場合には、リ
ガンドのＧＰＣＲタンパク質への結合における細胞機能／活性の変調（例えば、
促進又は阻害）のことを指す。これらの機能の例としては、例えば、ホスファチ
ジルイノシトール４，５−ビスホスフェート(ＰＩＰ２)、イノシトール１，４，
５−トリホスフェート(ＩＰ３)、アデニル酸シクラーゼのような信号伝達経路に
関連する細胞内分子の可動化、形質膜の分極、分子の生成又は分泌、細胞成分の
構造変化、ＤＮＡ合成のような細胞増殖、細胞移動、細胞分化、細胞生存が挙げ
られる。
【００１４】 受容体タンパク質によって媒介される応答は、発現される細胞のタイプに依存
している。本発明のＧＰＣＲサブファミリーの他のメンバーを発現する細胞タイ
プに関する情報は、当該技術分野において既に公知である（背景技術、図２に示
される相同性の高いタンパク質に関する情報、及び図１に示される発現情報：本
発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、
心臓、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検索により確認された（図１））。例えば
、いくつかの細胞では、リガンドの受容体タンパク質への結合は、ホスファチジ
ルイノシトール、又はサイクリックＡＭＰの代謝及び代謝回転を通じて、化合物
の放出、チャネルのゲート制御、細胞癒着、細胞移動、細胞分化等のような活性
を促進する。一方で、他の細胞においては、リガンドの結合により異なる結果を
生じる。本発明の特定のＧＰＣＲにより変調される細胞の活性／応答に関わらず
、ＧＰＣＲである受容体タンパク質が、ＧＰＣＲが発現された細胞又は組織にお
ける生物学的経路に導入されることによって、例えばホスファチジルイノシトー
ル、又はサイクリックＡＭＰの代謝及び代謝回転を通じた種々の細胞内信号伝達
経路において、１以上の二次信号を生成するためにＧタンパク質と相互作用する
ことが、当業者において周知である（本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓
、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検
索により確認された（図１））。
【００１５】 「ホスファチジルイノシトールの代謝回転及び代謝」とは、ここで用いられる
場合、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート(ＰＩＰ２)の代謝
回転及び代謝、及びこれらの活性に関係する分子のことを指す。ＰＩＰ２は、形
質膜の細胞質内小葉に見られるリン脂質である。いくつかの細胞では、受容体へ
のリガンドの結合により、形質膜酵素であるホスホリパーゼＣを活性化し、ＰＩ
Ｐ２を次々に加水分解して、１，２−ジアシルグリセロール(ＤＡＧ)、及びイノ
シトール１，４，５−トリホスフェート(ＩＰ３)を生成する。一旦生成されたＩ
Ｐ３は小胞体表面に拡散され、ここでＩＰ３結合部位を持つカルシウムチャネル
タンパク質のようなＩＰ３受容体と結合され得る。ＩＰ３結合によってチャネル
が開かれ、細胞質へのカルシウムイオンの放出をすることができる。また、ＩＰ３ は、特定のキナーゼにより１，３，４，５−テトラホスフェート(ＩＰ４)へと
リン酸化されることもでき、この分子は細胞外媒体から細胞質内へとカルシウム
を流入させる。ＩＰ３及びＩＰ４は、それぞれ１，４−ビホスフェート（ＩＰ２ ）、イノシトール１，３，４−トリホスフェートといった不活性生成物へと、連
鎖的に非常に早く加水分解される。これらの不活性生成物は、細胞におけるＰＩ
Ｐ２合成に再利用される。ＰＩＰ２の加水分解により生成する他の二次メッセン
ジャー、すなわち、１，２−ジアシルグリセロール(ＤＡＧ)は、細胞膜に残存し
、ここで酵素プロテインキナーゼＣを活性化することができる。プロテインキナ
ーゼＣは、通常、細胞中の細胞質に溶解しているが、細胞内のカルシウム濃度が
上昇すると形質膜へと移動し、ここでＤＡＧにより活性化される。他の細胞での
プロテインキナーゼＣの活性化は、例えば、グリコーゲンシンターゼのリン酸化
、又はＮＦ−ｋＢ等の各種転写因子のリン酸化のような種々の細胞応答の結果生
じる。ここで用いられている「ホスファチジルイノシトール活性」という用語は
、ＰＩＰ２又はその代謝産物のうちの１つの活性のことを指す。
【００１６】 受容体の関連することのできるもう１つの信号経路は、ｃＡＭＰ代謝回転経路
である。ここで用いられている「サイクリックＡＭＰ代謝回転及び代謝」とは、
サイクリックＡＭＰ(ｃＡＭＰ)の代謝回転及び代謝、及びこれらの活性に関係す
る分子のことを指す。サイクリックＡＭＰは、特定のＧタンパク質共役受容体の
リガンド由来の刺激に対する応答において産生される二次メッセンジャーである
。ｃＡＭＰ信号経路においては、リガンドのＧＰＣＲへの結合により、ｃＡＭＰ
合成を触媒する酵素アデニルシクラーゼが活性化される。新しく合成されたｃＡ
ＭＰは、続いてｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼを活性化する。この活性化され
たキナーゼは、電位依存性カリウムチャネルタンパク質、及びこれに関連するタ
ンパク質をリン酸化し、これによって活動電位においてもカリウムチャネルを開
くことができなくなる。そして、カリウムチャネルが開かないことによって、外
部流体中のカリウムが増大し、通常再極化される神経細胞膜において、膜内での
減極が持続されるに至る。
【００１７】 ＧＰＣＲを変調する薬剤をターゲットとすることにより、信号活性、及び受容
体により媒介される生物学的プロセスを、特定の細胞及び組織においてアゴナイ
ズ又はアンタゴナイズすることができる（本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、
肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃＤＮ
Ａ検索により確認された（図１））。このようなアゴニズム又はアンタゴニズム
は、治療環境（哺乳類療法）、又は毒性環境（抗がん剤のような抗細胞療法）に
おける生物学的活性の変調のための基礎的な働きをする。
【００１８】
【発明を実施するための最良の形態】概論 本発明は、ヒトゲノムの配列解析に基づいている。ヒトゲノムの配列解析及び
構築に際して、配列情報を解析することによって、当該分野において、ＭＡＳ癌
原遺伝子サブファミリーに関連するＧＰＣＲタンパク質、又はその一部であると
同定されるタンパク質／ペプチド／ドメインに対して、構造及び／又は配列の相
同性を有するペプチドをコード化する、ヒトゲノムの従来未確認のフラグメント
が明らかとなった。これらの配列を用いて、付加的なゲノム配列を構築し、転写
及び／又はｃＤＮＡ配列を単離し、特徴付けた。この解析に基づいて、本発明は
、ヒトＧＰＣＲペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列、これらのＧＰＣＲペプ
チド及びタンパク質をコード化する転写形態の核酸配列、ｃＤＮＡ配列及び／又
はゲノム配列、核酸変異（対立遺伝子情報）、発現の組織分布、及び本発明のＧ
ＰＣＲに対して構造又は配列の相同性を有する、最も関連性の高い既知のタンパ
ク質／ペプチド／ドメインに関する情報を提供するものである。
【００１９】 本発明において提供されるペプチドは、従来未知であることに加えて、商業的
に重要な製品及びサービスの開発において有用であるという点に基づいて選択さ
れ得るものである。特に、本発明のペプチドは、ＭＡＳ癌原遺伝子サブファミリ
ーにおける既知のＧＰＣＲタンパク質、及びその発現パターンに対して相同性及
び／又は構造上の相関性を有していることに基づいて選択される（本発明のＧＰ
ＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓
で発現することがｃＤＮＡ検索により確認された（図１））。この技術は、本発
明の遺伝子と類似した発現パターンを有するこのファミリーのタンパク質及びペ
プチドにおける商業的重要性を確立するものである。本発明のペプチドのより具
体的な性質及びその使用に関しては、本明細書、特に背景技術、図面の注釈に記
載され、及び／又は既知のＭＡＳ癌原遺伝子ファミリー又はＧＰＣＲタンパク質
サブファミリーのそれぞれにおいて周知である。
【００２０】
【実施例の詳細】ペプチド分子 本発明は、ＧＰＣＲファミリーのタンパク質のメンバーであると同定されるタ
ンパク質分子をコード化する核酸配列を提供するものである（図２にタンパク質
配列、図１に転写／ｃＤＮＡ配列、図３にゲノム配列を示す）。図２に提供され
るペプチド配列、同様に本明細書に記載される対立変異体のような明らかな変異
体は、ここでは本発明のＧＰＣＲペプチド、ＧＰＣＲペプチド、又は本発明のペ
プチド／タンパク質と呼ばれる。
【００２１】 本発明は、図２に示されるＧＰＣＲペプチドのアミノ酸配列から成る、あるい
は実質的に成る、あるいはこれを含む単離ペプチド及びタンパク質分子を提供す
る（図１の転写／ｃＤＮＡ、又は図３のゲノム配列に示される核酸分子によりコ
ード化される）とともに、本技術により調製、使用されるこれらのペプチドの明
らかな変異体を提供するものである。これらの変異体については以下で詳述する
。
【００２２】 ここで用いられる場合、ペプチドが細胞物質を実質的に含まない、又は化学前
駆物質あるいは他の化学物質を含まない場合に、ペプチドは「単離」又は「精製
」されたという。本発明のペプチドは、同質又は他の純度になるまで精製するこ
とができる。精製のレベルは使用目的に基づく。重要な性質としては、調製物中
に他の成分が多量に存在していたとしても、要求されるペプチドの機能を発揮で
きるということである（単離核酸分子の性質については、後述する）。
【００２３】 いくつかの使用では、「実質的に細胞物質を含まない」とは、他のタンパク質
（すなわち汚染タンパク質）を約３０％（乾燥重量）未満、他のタンパク質を約
２０％未満、他のタンパク質を約１０％未満、又は、他のタンパク質を約５％未
満有するペプチド調製物を含む。ペプチドが組み換えにより製造される場合、培
地がタンパク質調製物の容量に対して２０％未満のときには、実質的に培地は存
在しないとすることもできる。
【００２４】 「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」という用語は、合成に
関与した化学前駆物質又は他の化学物質から分離されたペプチド調製物をいう。
ある例においては、「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」とは
、化学前駆物質又は他の化学物質を約３０％（乾燥重量）未満、化学前駆物質又
は他の化学物質を約２０％未満、化学前駆物質又は他の化学物質を約１０％未満
、又は、化学前駆物質又は他の化学物質を約５％未満有するＧＰＣＲペプチド調
製物を含む。
【００２５】 単離ＧＰＣＲペプチドは、自然に発現する細胞、発現のために変形された（組
み換え）細胞から精製するか、又は、既知のタンパク質合成方法を用いて合成す
ることができる（本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤
、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検索により確認された
（図１））。例えば、ＧＰＣＲペプチドをコード化している核酸分子は、発現ベ
クター中にクローニングされ、さらにこの発現ベクターは宿主細胞に導入されて
、タンパク質が宿主細胞内で発現する。そして、タンパク質は標準のタンパク質
精製技術を用いた適当な精製スキームによって、細胞から単離することができる
。これら多くの技術については、以下で詳述する。
【００２６】 したがって、本発明は、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２
）から成るタンパク質、例えば、図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．１）や、図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）に
よりコード化されるタンパク質を提供するものである。このようなタンパク質の
アミノ酸配列を図２に示す。このアミノ酸配列がタンパク質の最終的なアミノ酸
配列であるとき、タンパク質はアミノ酸配列から成る。
【００２７】 本発明はさらに、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）から
実質的に成るタンパク質、例えば、図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）や、図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）
によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このようなアミノ酸配
列に微量の付加アミノ酸残基、例えば、最終的にタンパク質中に約１〜１００程
度の付加残基、典型的には１〜２０の付加残基が存在する場合、タンパク質はア
ミノ酸配列から実質的に成る。
【００２８】 本発明はさらに、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を含
むタンパク質、例えば図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．１）及び図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）によりコード
化されるタンパク質を提供するものである。このアミノ酸配列が、タンパク質の
最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部である場合、タンパク質はアミノ酸配列
を含む。このような場合、タンパク質はペプチドのみであるか、又はタンパク質
と自然に結びついているアミノ酸残基、あるいはアミノ酸残基／ペプチド配列に
非相同のアミノ酸残基のような、付加的なアミノ酸分子（コード化された配列と
隣接する）を有することができる。このようなタンパク質は、少量の付加的アミ
ノ酸残基を有するか、又は数百あるいはそれ以上の付加的アミノ酸を含むことが
できる。本発明のＧＰＣＲペプチドが含まれるタンパク質の好適な種として、天
然の成熟タンパク質がある。これらの各種タンパク質を調製／単離する方法につ
いて、以下に簡単に述べる。
【００２９】 本発明のＧＰＣＲペプチドは、キメラ又は融合タンパク質を形成するために、
非相同性の配列に結合することができる。このようなキメラ及び融合タンパク質
は、ＧＰＣＲペプチドに対して実質的に相同性のないアミノ酸配列を有する非相
同タンパク質に、有効に結合されるＧＰＣＲペプチドを含む。「有効に結合され
る」とは、ＧＰＣＲペプチドと非相同タンパク質がフレーム中で融合しているこ
とを示す。非相同タンパク質は、ＧＰＣＲペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合さ
れることができる。
【００３０】 いくつかの使用では、融合タンパク質は、ＧＰＣＲペプチド自体の活性に影響
を及ぼさない。融合タンパク質には、例えば、βガラクトシダーゼ融合、イース
ト２−ハイブリッドＧＡＬ融合、ポリＨｉｓ融合、ＭＹＣ標識、ＨＩ標識及びＩ
ｇ融合といった酵素融合タンパク質が含まれるが、融合タンパク質はこれに限ら
れるものではない。このような融合タンパク質、特にポリＨｉｓ融合は、組み換
えＧＰＣＲペプチドの精製に有用である。ある種の宿主細胞（例えば哺乳類の宿
主細胞）においては、タンパク質の発現及び／又は分泌は、非相同信号配列を用
いることにより増加させることができる。
【００３１】 キメラ又は融合タンパク質は、標準の組み換えＤＮＡ技術により製造すること
ができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードしているＤＮＡフラグメント
は、従来技術に従ってフレーム中に共に配置される。他の例では、融合遺伝子は
、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成することが可能である。あるいは
、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅にアンカープライマーを用い、２つの連続的
な遺伝子フラグメント間に相補的な突出部を形成し、その後アニールすることに
より、キメラ遺伝子配列を再増幅することができる（Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, 1992参照）。さらに、発現ベクターとしては
、既に融合部分（例えばＧＳＴタンパク質）をコード化した多くのものを、商業
的に入手することができる。ＧＰＣＲペプチドをコード化した核酸は、融合部が
フレーム中でＧＰＣＲペプチドに結合するようにして、このような発現ベクター
中にクローニングされることができる。
【００３２】 以上説明したように、本発明はまた、天然のペプチド成熟形態、ペプチドの対
立遺伝子／配列変異体、非天然の組換え誘導変異体、ペプチドのオルトログ及び
パラログなど、本発明のタンパク質のアミノ酸配列における明らかな変異体を提
供、及び実施可能にするものである。このような変異体は、核酸組み換え技術や
タンパク質生化学の分野で公知の技術を用いることにより、容易に生成すること
ができる。しかしながら、この変異体には、本発明以前に公開されている何れの
アミノ酸配列も含まれないものであると理解される。
【００３３】 このような変異体は、ここに示される分子技術や配列情報を用いることにより
、容易に同定／製造することが可能である。さらに、このような変異体は、本発
明のＧＰＣＲペプチドに対する配列及び／又は構造上の相同性に基づいて、他の
ペプチドと容易に区別することができる。相同性／同一性の程度は、主に、ペプ
チドが機能的変異体であるか又は非機能的変異体であるか、パラログファミリー
中に存在する分化量、オルトログ間の進化的相違に基づいている。
【００３４】 ２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するため
に、最適な比較を行う目的で、配列はアラインされる（例えば、最適なアライン
メントのために、ギャップが第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方又は両方
に導入されることができ、非相同性配列は比較を行うために無視することができ
る）。好適な例としては、対象配列の長さの少なくとも３０％、４０％、５０％
、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上が、比較目的に応じてアライン
される。そして、対応するアミノ酸配置又はヌクレオチド配置上の、アミノ酸残
基又はヌクレオチドが比較される。第一配列での配置が、第二配列において対応
する配置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められているとき、分
子はその配置上で同一である（ここで用いられているアミノ酸又は核酸の「同一
性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同意義である）。２つの配列間の同一
性パーセントは、配列において共有される同一配置数の関数であり、ギャップ数
及び各ギャップ長さを考慮し、２つの配列の最適なアラインメントのために導入
される必要がある。
【００３５】 配列の比較、及び２つの配列間における同一性、類似性パーセントの決定は、
数学的アルゴリズムを用いて行うことができる（Computational Molecular Biol
ogy, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomput
ing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press,
New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M
., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Ana
lysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Se
quence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton
Press, New York, 1991）。好適な例としては、２つのアミノ酸配列間の同一性
パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能
）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ・Ｗｕｎｓｃｈアルゴ
リズム（J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）を用い、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マ
トリックス、又はＰＡＭ２５０マトリックス、及びギャップ重量１６、１４、１
２、１０、８、６、４、長さ重量１、２、３、４、５、６を用いて決定される。
他の好適な例としては、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣ
Ｇソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラ
ム（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Res. 12(1)：387（1984））を用い
、ＮＷＳｇａｐｄｎａ.ＣＭＰマトリックス、ギャップ重量４０、５０、６０、
７０、８０、長さ重量１、２、３、４、５、６を用いて決定される。さらに他の
一例としては、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、
ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｙｅｒｓ・Ｗ
. Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム(CABIOS, 4:11-17 (1989))を用い、ＰＡＭ１２０
重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用いて決定さ
れる。
【００３６】 本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば他のファミリー又は関連した配列
を発見するために、配列データベースに対して検索を行う「クエリー配列」とし
て用いられることができる。このような検索は、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡ
ＳＴ、及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）(J. Mol. Biol. 215:4
03-１０ (1990)) を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、
本発明の核酸分子に相同性のあるヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴ
プログラムを用い、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２で行うこ
とができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質に相同性のある
アミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用い、ｓｃｏｒｅ＝５０
、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３で行うことができる。比較目的のギャップアライン
メントを得るために、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ(Nucleic
Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997))を用いることができる。ＢＬＡＳＴ及び
ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる際には、各プログラム（例えば、Ｘ
ＢＬＡＳＴやＮＢＬＡＳＴ）の既定のパラメータを用いることができる。
【００３７】 本発明のペプチドのうちの一つを含むタンパク質において、プロセシングを受
ける前の全長形態と同様に、成熟プロセス形態は、本発明のトランスポーターペ
プチドのうちの１つに対して完全な配列同一性を有していることはもちろん、本
発明のトランスポーターペプチドと同じ遺伝子位置によりコード化されているも
のとして、容易に同定することができる。本発明のＧＰＣＲは、染色体１１上の
マーカーＳＨＧＣ−３２４８６（ＬＯＤ＝１５．４５）、及びＳＨＧＣ−２０６
５３（ＬＯＤ＝１５．４５）の近接に見出される遺伝子によりコード化されてい
る。
【００３８】 ＧＰＣＲペプチドの対立遺伝子変異体は、ＧＰＣＲペプチドの少なくとも一部
に対して高度の（著しい）配列相同性／同一性を有するヒトタンパク質であるこ
とはもちろん、同様に本発明のＧＰＣＲペプチドと同じ遺伝子位置においてコー
ド化されているものとして、容易に同定することができる。遺伝子位置は、対象
となるヒトに対してマッピングされたゲノム配列のような、図３に示されるゲノ
ム情報に基づいて容易に決定することができる（本発明のＧＰＣＲは、染色体１
１上のマーカーＳＨＧＣ−３２４８６（ＬＯＤ＝１５．４５）、及びＳＨＧＣ−
２０６５３（ＬＯＤ＝１５．４５）の近接に見出される遺伝子によりコード化さ
れている）。ここで用いられる場合、アミノ酸配列において、典型的には少なく
とも約７０〜８０％、８０〜９０％、さらに典型的には少なくとも約９０〜９５
％、又はそれ以上の相同性を有する場合には、２つのタンパク質（又はタンパク
質の一領域）は著しい相同性を有している。本発明によれば、著しい相同性を有
するアミノ酸配列は、より詳細には以下に述べられるようなストリンジェントな
条件の下で、ＧＰＣＲペプチドをコード化する核酸分子とハイブリダイズする核
酸配列によりコード化される。
【００３９】 ＧＰＣＲペプチドのパラログは、ＧＰＣＲペプチドの少なくとも一部に対して
、ある程度の著しい配列相同性／同一性を有し、ヒトの遺伝子によってコード化
され、また同様の活性又は機能を有しているものとして、容易に同定することが
できる。アミノ酸配列が、与えられた領域又はドメインを通じて、典型的に少な
くとも約６０％以上、さらに典型的には７０％以上の相同性を有する場合、２つ
のタンパク質は典型的なパラログであると考えられる。このようなパラログは、
より詳細には以下に述べられるような、モデレートからストリンジェントな条件
の下で、ＧＰＣＲペプチドをコード化する核酸分子とハイブリダイズする核酸配
列によりコード化される。
【００４０】 ＧＰＣＲペプチドのオルトログは、ＧＰＣＲペプチドの少なくとも一部に対し
てある程度の著しい配列相同性／同一性を有し、他の生体の遺伝子によってコー
ド化されているものとして、容易に同定することができる。オルトログは、好適
には、哺乳類、さらに好適には霊長類から単離され、ヒトの治療ターゲット及び
治療薬剤の開発のために用いられる。このようなオルトログは、より詳細には以
下に述べられるような、モデレートからストリンジェントな条件の下で、ＧＰＣ
Ｒペプチドをコード化する核酸分子とハイブリダイズするような核酸配列により
コード化され、これはタンパク質を生成する２つの生体の関連性に依存している
。
【００４１】 本発明のＧＰＣＲペプチドの非天然の変異体は、組み換え技術を用いて容易に
生成することできる。このような変異体には、ＧＰＣＲペプチドのアミノ酸配列
中における欠失、付加、置換によるものが含まれるが、これに限定されるもので
はない。例えば、置換の１種として、保存的アミノ酸置換が挙げられる。この置
換は、ＧＰＣＲペプチドにおける特定のアミノ酸が、同様の特徴をもつ他のアミ
ノ酸によって置換されるものである。保存的置換においては、脂肪族のアミノ酸
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの中の一つが他の一つに置換、ヒドロキシル残
基ＳｅｒとＴｈｒとの交換、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕとの交換、アミド残基Ａｓ
ｎとＧｌｎ間の置換、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの交換、芳香族残基Ｐｈｅと
Ｔｙｌとの置換がある。表現型に現れないアミノ酸置換に関する指針については
、Bowie et al., Science 247:1306-1310 (1990)に述べられている。
【００４２】 変異ＧＰＣＲペプチドは、完全に機能しているか、又は、例えばリガンド結合
能、Ｇタンパク質結合能、信号伝達媒介能等のような活性の一つ以上において機
能が欠落していることがある。完全機能的な変異体には、典型的には、保存的な
変異、又は致命的でない残基あるいは領域内での変異体のみが含まれる。図２に
は、タンパク質解析の結果が示されており、致命的なドメイン／領域を特定する
のに使用することができる。機能的変異体には、機能が変化しない、又は著しい
機能変化の無い類似アミノ酸の置換も含まれる。他方、このような置換は、機能
に対してある程度プラス又はマイナスの影響を及ぼすことがある。
【００４３】 非機能性変異体には、典型的には、一つ以上の非保存的なアミノ酸の置換、欠
失、導入、反転、切断、又は致命的な残基あるいは領域での置換、欠失、導入、
反転が含まれる。
【００４４】 機能において必須のアミノ酸は、例えば、特定部位の突然変異誘発、又はアラ
ニンスキャニング突然変異誘発(Cunningham et al., Science 244:1081-1085 (1
989))等の当該分野において既知の方法により、特に図２に示す結果を用いて確
認することができる。後者の手順では、分子内の全ての残基において、単独のア
ラニン突然変異を導入する。この結果生じた変異体分子は、その後、リガンド／
効果器分子結合のような生物活性、又はin vitro増殖活性分析のようなアッセイ
のために試験される。リガンド／受容体結合にとって重要な部位は、結晶化、核
磁気共鳴、光学親和性ラベル等の構造解析によって決定される（Smith et al.,
J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992）; de Vos et al. Science 255:306-312(199
2))。
【００４５】 本発明はＧＰＣＲペプチドのフラグメントを提供し、さらにこれに加えて、該
フラグメント、特に図２に特定された残基を含むフラグメントを含む、及びから
成るタンパク質及びペプチドを提供するものである。しかしながら、本発明に関
連するフラグメントは、本発明より以前に公開されているフラグメントを含むも
のとは見なされない。
【００４６】 フラグメントは、ここで用いられる場合、ＧＰＣＲペプチドに隣接するアミノ
酸残基を、少なくとも８、１０、１２、１４、１６又はそれ以上含んでいる。こ
のようなフラグメントは、１以上のＧＰＣＲペプチドの生物活性を保持する能力
によって選択されるか、あるいは、例えばリガンド、効果器分子との結合、又は
抗原としての挙動等の機能を果たす能力によって選択され得る。特に重要なフラ
グメントは生物活性フラグメントであり、これは例えば、８又はそれ以上のアミ
ノ酸のペプチドである。このようなフラグメントは、典型的には、例えばＧタン
パク質結合部位、膜貫通ドメイン、又はリガンド結合ドメインのような、ＧＰＣ
Ｒペプチドのドメイン又はモチーフを含んでいる。さらに、可能なフラグメント
としては、ドメイン又はモチーフ含有フラグメント、溶解性ペプチドフラグメン
ト、抗原性構造含有フラグメントを含むが、フラグメントはこれに限定されるも
のではない。予想されるドメイン及び機能性部位は、当業者にとって容易に入手
可能な公知のコンピュータプログラム（例えばＰＲＯＳＩＴＥ分析）により、容
易に確認することができる。このような分析結果の１つを図２に示す。
【００４７】 ポリペプチドは、一般に２０天然アミノ酸と呼ばれている２０種のアミノ酸以
外のアミノ酸をしばしば含むことがある。さらに、末端アミノ酸を含む多くのア
ミノ酸は、プロセシング及び翻訳後修飾等の自然の過程、又は当該分野において
公知の化学修飾技術によって修飾され得る。ＧＰＣＲペプチドにおいて自然に生
じる一般的な修飾については、基本的なテキスト、詳細な研究論文及び文献に記
述されており、これは当業者においては周知である（これらの特性のいくつかは
図２において確認される）。
【００４８】 既知の修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、
フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチド又はヌクレオ
チド誘導体の共有結合付加、脂質又は脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジ
ルイノシトールの共有結合付加、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メ
チル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホ
ルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキ
シル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシ
ング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化
などのタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化を含むが、
修飾はこれに限定されるものではない。
【００４９】 したがって、本発明のＧＰＣＲペプチドは、置換されたアミノ酸残基が遺伝子
コードによってコード化されていない、置換基が含まれている、成熟ＧＰＣＲペ
プチドが、例えばＧＰＣＲペプチドの半減期を長くする化合物のような他の化合
物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合しているか、又は付加アミノ酸が
、例えば成熟ＧＰＣＲペプチドの主、副配列、又は精製配列、あるいは成熟ＧＰ
ＣＲペプチドの前タンパク質配列のような成熟ＧＰＣＲペプチドと融合している
といった、誘導体又は類似体をも包含するものである。
【００５０】 このような修飾は当業者には周知であり、科学文献において非常に詳細に記述
されてきた。グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボ
キシル化、ヒドロキシル化、ＡＤＰリボシル化など、特に一般的な修飾は、Prot
eins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W. H
. Freeman and Company, New York (1993)のような、殆どの基本テキストにおい
て記述されている。この点に関する詳細な文献としては、Wold, F., Posttransl
ational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic P
ress, New York 1-12 (1983); Seifter et al. (Meth. Enzymol. 182: 626-646
(1990)) and Rattan et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992) のよう
な多くの文献を利用することができる。
【００５１】タンパク質／ペプチドの使用 本発明のタンパク質は、図面及び背景技術に示される機能情報に関連した、実
質的且つ特異的なアッセイにおいて、例えば、抗体を高める、又は他の免疫反応
を誘発させるため、生物液中でのタンパク質（又はその結合対象、又は受容体）
レベルの定量のためのアッセイに用いる試薬（ラベル化試薬を含む）として、あ
るいは、対応するタンパク質を選択的に発現する組織のマーカー（組織の分化又
は発達のある特定段階、あるいは疾患の状態）として使用することができる。タ
ンパク質が、他のタンパク質と結合しているか又は結合し得る場合（例えば、受
容体−リガンド間相互作用）、このタンパク質を用いて結合相手を同定し、結合
相互作用の阻害剤を同定するシステムを開発することができる。これらの一部又
は全てを使用することにより、試薬グレード、又は商業製品としてのキットフォ
ーマットへの開発が可能となる。
【００５２】 上に列記した使用を実際に行う方法は、当業者にとって周知のことである。こ
のような方法を開示している参考文献としては、“Molecular Cloning: A Labor
atory Manual”2d ed、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J.,
E. F. Fritsch and T. Maniatis eds., (1989) “Methods in Enzymology: Guid
e to Molecular Cloning Techniques”、Academic Press, Berger, S. L. and A
. R. Kimmel eds., (1987)がある。
【００５３】 本発明のペプチドの潜在的な用途は、主にタンパク質の起源に基づいており、
同様にタンパク質の分類／作用に基づいている。例えば、ヒトから単離したＧＰ
ＣＲ、及びそれらのヒト／哺乳類オルトログは、哺乳類の治療用医薬、例えば、
ヒト用の医薬、特に受容体を発現する細胞又は組織の変調に用いられる医薬を発
見するためのターゲットとして有用である（本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓
、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃＤ
ＮＡ検索により確認された（図１））。全ての医薬製剤のうちの約７０％がＧＰ
ＣＲの活性を変調する。無脊椎動物及び哺乳類のオルトログの組み合わせは、無
脊椎動物に特異的な薬剤を発見するための選択的スクリーニング法に用いること
ができる。背景技術及び図面に記載されている構造情報及び機能情報には、本発
明の分子の特異的及び本質的な使用が提供される。このような使用は、ここに示
されている情報と、当業者において既知の情報、及びルーチン実験を用いて、容
易に決定することができる。
【００５４】 この受容体ポリペプチド（本発明以前に開示されている変異体及びフラグメン
トを含む）は、ＧＰＣＲに関連する生物学的アッセイに有用である。このような
アッセイは、特にこの受容体を発現する細胞及び組織において、本発明の一つが
属するＧＰＣＲサブファミリーに特異的なＧＰＣＲ関連症状の診断及び治療に有
用な、公知のＧＰＣＲの機能、活性、あるいは性質の何れかに関係している（本
発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、
心臓、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検索により確認された（図１））。
【００５５】 この受容体ポリペプチドは、細胞系、又は無細胞系における薬剤スクリーニン
グアッセイにおいても有用である。細胞系では、天然型、すなわち受容体タンパ
ク質を正常に発現する細胞であり、生体組織検査、又は細胞培地中で増殖するこ
とができる（本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎
児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検索により確認された（図
１））。しかしながら、ある例では、細胞系アッセイは、受容体タンパク質を発
現する組み換え宿主細胞に関連している。
【００５６】 ポリペプチドは、自然状態又は変異型で受容体に関連する特定の疾患又は症状
を引き起こすタンパク質の受容体活性を変調する化合物を同定するために用いる
ことができる。本発明のＧＰＣＲと、適切な変異体及びフラグメントの両者は、
受容体への結合能力を持つ候補化合物をアッセイするための高効率スクリーンに
おいて使用することができる。これらの化合物は、さらにこれらの受容体活性に
対する影響を判定するために、機能性受容体に対してスクリーニングを行うこと
ができる。さらにこれらの化合物は、動物又は無脊椎動物系における、活性／効
果を判定するために試験することができる。化合物は、受容体を望ましい程度ま
でに活性化（アゴニスト）又は不活性化（アンタゴニスト）するかどうか判定さ
れる。
【００５７】 さらに、この受容体ポリペプチドは、受容体タンパク質と、受容体タンパク質
と通常相互作用する分子、例えば、受容体タンパク質が通常相互作用する信号経
路のリガンド又は構成成分、との間での相互作用を促進又は阻害する能力を持つ
化合物（例えば、Ｇタンパク質、又はｃＡＭＰに関連する他の相互作用物質、ホ
スファチジルイノシトール代謝回転及び／又はアデニル酸シクラーゼ又はホスホ
リパーゼＣ活性化）をスクリーニングするのに用いることができる。このような
アッセイでは、一般的には、受容体タンパク質又はフラグメントがターゲット分
子と相互作用し、タンパク質とターゲットとの複合物を検出するか、又はＧタン
パク質リン酸化、ｃＡＭＰ又はホスファチジルイノシトール代謝回転、アデニル
酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ活性化などの信号伝達に関連した効果の何れか
のような、受容体タンパク質とターゲットとの間の相互作用の生化学的な結果を
検出することのできる条件で、受容体タンパク質と候補化合物とが結合される工
程が含まれる。
【００５８】 候補化合物としては、例えば、１）最後部がＩｇの融合ペプチド、及びランダ
ムペプチドライブラリを含む可溶性ペプチド（例えば、Lam et al., Nature 354
:82-84 (1991); Houghten et al., Nature 354:84-86 (1991)参照）、及びＤ−
及び／又はＬ−型アミノ酸からできている組み合わせ化学誘導分子ライブラリを
含むペプチド、２）ホスホペプチド（例えば、ランダム、又は部分的に変質した
ホスホペプチドライブラリ。例えば、Songyang et al., Cell 72:767-778 (1993
)参照）、３）抗体（例えば、ポリクローン抗体、モノクローン抗体、ヒト化抗
体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆａｂ発現ラ
イブラリフラグメントを含む単鎖抗体、及び抗体のエピトープ結合フラグメント
）、４）小さな有機及び無機分子（例えば、組み合わせ及び天然生成物ライブラ
リから得られる分子）が含まれる。
【００５９】 ある候補化合物は、リガンド結合と競合する受容体の可溶性フラグメントであ
る。他の候補化合物には、変異受容体、又は受容体機能に影響を及ぼす変異体を
含む適切なフラグメントがあり、このためにリガンドとの競合が起こる。したが
って、例えば、高い親和性を有するか、又はフラグメントがリガンドと結合し解
離しないような、リガンドと競合するフラグメントが本発明に含まれる。
【００６０】 本発明はさらに、受容体活性を変調（促進又は阻害）する化合物を同定するた
めの、他のエンドポイントアッセイを含む。このアッセイは、一般的に、受容体
活性を示す信号伝達経路における挙動のアッセイに関連している。このため、細
胞増殖のような細胞プロセスや、受容体タンパク質依存信号カスケードに対する
応答が上方又は下方調節される遺伝子発現についてのアッセイが行うことができ
る。ある１つの例では、これらの遺伝子の調節領域は、ルシフェラーゼのような
容易に検出することのできるマーカーと結合することができる。
【００６１】 受容体により媒介される、生物学的又は生化学的な機能は、何れもエンドポイ
ントアッセイとして用いることができる。これらは、ここに記載されている全て
の生化学的又は生化学的／生物学的挙動を含み、ここに引用される文献にはこれ
らのエンドポイントアッセイのターゲットが折り込まれており、また、他の機能
については、当業者において公知であるか、又は図面、特に図２の情報を用いて
、容易に確認することができる。具体的には、受容体を発現する細胞又は組織の
生物学的機能についてのアッセイを行うことができる（本発明のＧＰＣＲは、甲
状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発現する
ことがｃＤＮＡ検索により確認された（図１））。
【００６２】 結合及び／又は活性化合物は、キメラ受容体タンパク質を用いることによりス
クリーニングを行うこともでき、アミノ末端細胞外ドメイン又はその一部、ある
いは、７つの膜貫通セグメントの何れか又は細胞内又は細胞外ループの何れか、
及びカルボキシ末端細胞内ドメインのような膜貫通ドメイン全体あるいはサブリ
ジョン又はその一部は、異種ドメイン又はサブリジョンにより置換され得る。例
えば、Ｇタンパク質結合領域は、異なるＧタンパク質と相互作用するものとして
用いられることができ、この場合、天然の受容体によって認識される。したがっ
て、異なる一組の信号伝達成分を、活性化のエンドポイントアッセイとして利用
することができる。あるいは、膜貫通部全体又はサブリジョン（膜貫通セグメン
ト、又は細胞内、細胞外ループ）は、アミノ末端細胞外領域及び／又はＧタンパ
ク質結合領域の由来する宿主細胞とは異なる宿主細胞に特有の膜貫通部全体又は
サブリジョンと置換することができる。これにより、受容体の由来する特定の宿
主細胞以外のものにおいてアッセイを行うことが可能となる。あるいは、アミノ
末端細胞外ドメイン（及び／又はリガンド結合領域）は、他のリガンドと結合す
るドメイン（及び／又は他の結合領域）と置換することができ、このため、異種
のアミノ末端細胞外ドメイン（又は領域）と相互作用をするが、信号伝達の起こ
るようなテスト化合物のアッセイが提供される。最終的に、天然の信号伝達経路
の一部である転写調整配列に結合され得る検出容易なコード領域を含むリポータ
ー遺伝子により活性化が検出される。
【００６３】 この受容体ポリペプチドはまた、受容体と相互作用する化合物を発見するため
設計される方法である競争結合アッセイにも有用である。このために、化合物が
ポリペプチドと結合又は相互作用できる条件下で、化合物を受容体ポリペプチド
と接触させる。可溶性受容体ポリペプチドもまた混合物中に加えられる。テスト
化合物が可溶性受容体ポリペプチドと相互作用する場合、受容体ターゲットから
形成される複合体の量、又は活性は減少する。このタイプのアッセイは、特に受
容体の特定領域と相互作用する化合物を模索する場合に有用である。このため、
ターゲットとなる受容体領域と競合する可溶性ポリペプチドは、対象となる領域
に対応したペプチド配列を含むように設計されている。
【００６４】 無細胞系薬剤のスクリーニングアッセイを行うためには、タンパク質の一方又
は両方の非複合化形態からの複合化形態の分離を効率化し、アッセイを自動化す
るために、受容体タンパク質又はフラグメント、そのターゲット分子の何れかを
固定化するのが望ましい場合がある。
【００６５】 薬剤スクリーニングアッセイにおいては、マトリックスにタンパク質を固定化
する技術を使用することができる。ある例では、タンパク質にマトリックスに結
合することのできるドメインを付加した融合タンパク質を得ることができる。例
えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、グルタチオンセ
ファローズビーズ（Sigma Chemical, St． Louis， MO）又はグルタチオン誘導
マイクロタイタープレート上に吸着され、細胞溶解物（例えば、３５Ｓ−ｌａｂ
ｅｌｅｄ）と候補化合物とが結合され、複合体形成条件（例えば、塩及びｐＨの
生理学的条件）の下で混合物がインキュベートされる。インキュベートの後、非
結合ラベルの除去のためにビーズは洗浄され、マトリックスを固定化して、放射
性ラベルを直接、又は複合体を分離した後の上澄みを測定することにより定量さ
れる。あるいは、複合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりマトリックスから分離するこ
とができ、標準の電気泳動技術を用いることによって、ゲルからビーズフラクシ
ョン中の受容体結合タンパク質のレベルを定量することができる。例えば、ポリ
ペプチド又はそのターゲット分子のどちらかが、当業者に周知の技術を利用して
、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を用いて固定化される。あるいは、タ
ンパク質と反応し、タンパク質とターゲット分子との結合を妨げない抗体は、プ
レートのウェルに誘導化され、このタンパク質は抗体との結合によりそのウェル
の中に捕らえられる。受容体結合タンパク質の組成物と候補化合物は、受容体タ
ンパク質存在ウェル中でインキュベートされ、ウェルに捕らえられた複合体の量
を測定することができる。このような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ固
定複合体による前述の方法に加えて、受容体タンパク質ターゲット分子に反応性
のある抗体、又は、受容体タンパク質に反応性がありターゲット分子と競合する
抗体を用いた複合体の免疫検出法、及びターゲット分子と関連する酵素活性の検
出に基づく酵素結合アッセイが含まれる。
【００６６】 本発明のＧＰＣＲのうちの１つを変調する薬剤は、上述の分析方法を単独ある
いは組み合わせて用いることにより同定することができる。一般的には、最初と
最後に細胞系又は無細胞系のシステムを用いて、動物又は他のモデルシステムに
おける活性を確認することが好ましい。このようなモデルシステムは、当業者に
周知であり、本記載において容易に用いることができる。
【００６７】 これらの薬剤スクリーニングアッセイによって同定される受容体タンパク質活
性のモジュレータは、ＧＰＣＲを発現する細胞又は組織に処置することにより、
受容体経路により媒介される疾患を患う患者の治療に用いることができる（本発
明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心
臓、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検索により確認された（図１））。これらの
治療方法には、薬剤組成物中のＧＰＣＲ活性のモジュレータを患者の治療に必要
な量投与する工程が含まれており、このモジュレータはここに記載されるように
して同定される。
【００６８】 本発明の他の観点では、ＧＰＣＲと結合又は相互作用する、又はＧＰＣＲ活性
に関連している他のタンパク質を同定するために、２−ハイブリッドアッセイ又
は３−ハイブリッドアッセイ（U.S. Patent No. 5,283,317; Zervos et al. (19
93) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054
; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993)
Oncogene 8:1693-1696; and Brent WO94/10300参照）において、ＧＰＣＲタン
パク質を「ｂａｉｔタンパク質」として使用することができる。このようなＧＰ
ＣＲ結合タンパク質は、例えば、ＧＰＣＲ媒介信号経路の下流因子としてのＧＰ
ＣＲタンパク質、又はＧＰＣＲターゲットによる信号の伝達に関与している。あ
るいは、このようなＧＰＣＲ結合タンパク質は、ＧＰＣＲ阻害剤であることがあ
る。
【００６９】 ２−ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメ
インから成る、大部分の転写調節因子のモジュラー性に基づいている。簡単に言
うと、このアッセイでは２つの異なるＤＮＡ構造を利用する。一方の構造におい
ては、ＧＰＣＲタンパク質をコードしている遺伝子は、既知の転写調節因子（例
えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコード化している遺伝子に融合される
。他方の構造においては、ＤＮＡ配列ライブラリから得られ、未確認のタンパク
質（「ｐｒｅｙ」又は「ｓａｍｐｌｅ」）をコード化しているＤＮＡ配列が、既
知の転写調節因子の活性化ドメインをコード化している遺伝子に融合される。「
ｂａｉｔタンパク質」及び「ｐｒｅｙタンパク質」が生体内で相互作用すること
ができ、ＧＰＣＲ依存複合体を形成する場合、転写調節因子のＤＮＡ結合ドメイ
ン及び活性化ドメインは近接する。この近接により、転写調節因子に反応する転
写調節部位に有効に結合可能なリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を行
うことができる。リポーター遺伝子の発現は検出することが可能であり、機能的
転写調節因子を含んでいる細胞コロニーを単離し、ＧＰＣＲタンパク質と相互作
用するタンパク質をコード化するクローン遺伝子を得るために使用することがで
きる。
【００７０】 本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイによって同定される新規な薬
剤に関する。したがって、ここに記載されるようにして同定された薬剤を適当な
動物のモデルに使用することも本発明の範囲内である。例えば、本発明で同定さ
れた薬剤（例えばＧＰＣＲ変調薬剤、アンチセンスＧＰＣＲ核酸分子、ＧＰＣＲ
特異抗体、又はＧＰＣＲ結合対象）は、これらの薬剤の処方における有効性、毒
性、副作用を判定するために、動物、又は他のモデルで用いることができる。あ
るいは、本発明で同定された薬剤は、このような薬剤の作用のメカニズムを決定
するために、動物又は昆虫のモデルで使われることができる。さらに、本発明は
、ここに記載されるような治療のために、前述のスクリーニングアッセイにより
同定された新規な薬剤の使用に関する。
【００７１】 本発明のＧＰＣＲタンパク質は、ペプチドにより媒介される疾患又は疾患素質
の診断のためのターゲットを提供するのに有用である。したがって、本発明は、
細胞、組織、又は生体中におけるタンパク質（又はコード化したｍＲＮＡ）の存
在、あるいはそのレベルを検出する方法を提供するものである（本発明のＧＰＣ
Ｒは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓で
発現することがｃＤＮＡ検索により確認された（図１））。この方法は、生物サ
ンプルと、受容体タンパク質との相互作用能力を有する化合物との接触に関係し
ており、ここでは相互作用について検出することができる。このようなアッセイ
は、単検出形態、又は抗体チップアレイのような多検出形態で提供される。
【００７２】 サンプル中のタンパク質を検出する１つの薬剤は、タンパク質に選択的に結合
することのできる抗体である。生物サンプルには、被験者から単離されるか、又
は被験者の内部に存在する組織、細胞、生物液体が含まれる。
【００７３】 本発明のペプチドは、ペプチド変異体を持つ患者のタンパク質の活性、疾患又
は疾患素質の診断に用いるためのターゲット、特に現存するタンパク質ファミリ
ー以外のものとして知られる活性、及び症状のターゲットを提供するものである
。したがって、ペプチドは生物学的サンプルから単離されることができ、また、
異常ペプチドを生じる遺伝子突然変異の存在についてアッセイを行うことができ
る。これは、アミノ酸置換、欠失、挿入、再配置（異常なスプライシング挙動の
結果生じる）、及び不適当な翻訳後の修飾を含む。分析方法としては、変容電気
泳動移動度、変容トリプシンペプチド消化、細胞系又は無細胞系アッセイによる
変容ＧＰＣＲ活性、リガンド又は抗体の変容結合パターン、変容等電点、直接ア
ミノ酸配列、及びタンパク質の変異の検出に有用な他の公知のアッセイ技術を含
む。このようなアッセイは、単検出形態、又は抗体チップアレイのような多検出
形態で提供される。
【００７４】 ペプチドのIn vitro検出技術としては、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩ
ＳＡｓ）、ウェスタンブロット、抗体、又はタンパク質結合剤のような検出試薬
を用いた免疫沈降、免疫蛍光検査法を含む。あるいは、ラベルされた抗ペプチド
抗体、又は他のタイプの検出試薬を被験者に導入することにより、被験者のin v
ivo検出を行うことができる。例えば、被験者中のこのマーカーの存在及び位置
を標準のイメージング技術によって検出することができる放射性マーカーを、抗
体にラベルすることができる。被験者において発現されたペプチドの対立変異体
を検出する方法、及びサンプル中のペプチドのフラグメントを検出する方法は、
特に有用である。
【００７５】 ペプチドはまた、ゲノム薬理学分析においても有用である。ゲノム薬理学では
、薬剤の変化の傾向と、影響を受けたヒトの異常挙動に従って、薬剤に対しての
応答における著しい遺伝的変異について臨床的に取り扱う。例えば、Eichelbaum
, M. (Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11): 983-985 (1996))、及びLin
der, M.W. (Clin. Chem. 43(2):254-266 (1997))を参照されたい。これらの変異
の臨床的な結果、個人の代謝変異の結果として、ある個人に対しては治療薬剤が
重い毒性となり、又はある個人に対しては治療の失敗に終わる。このように、個
人の遺伝子型は、体内で治療化合物を作用させる方法、又は体が化合物を代謝す
る方法を決定することができる。さらに、酵素を代謝させる薬剤の活性は、薬剤
の作用の強度と期間に影響する。このように、個人のゲノム薬理学は、個人の遺
伝子型に基づいた予防、又は治療的な処置において、効果的な化合物、又はこの
ような化合物の効果的な投与量の選択を可能とする。遺伝子多形性の発見により
、酵素代謝性の薬剤において、患者が期待される薬効を得られない、不自然な薬
効を示す、又は標準の投薬量から重大な毒性を被るといったことの理由を説明す
ることができる。多形性は、強い代謝系の表現型と弱い代謝系の表現型で表され
ることができる。したがって、遺伝子の多形性は、ある集団の受容体機能の１つ
以上が他の集団のそれと異なるような、受容体タンパク質の対立タンパク質変異
に至るかもしれない。このように、ペプチドは治療法に影響する遺伝子の素因を
確認するためのターゲットとなり得る。このため、リガンドベースの治療におい
て、多形性は、末端アミノ基の細胞外ドメイン及び／又は他のリガンド結合領域
におけるリガンド結合活性及び受容体活性が、より高い、又はより低いことを引
き起こし得る。したがって、多形性を含む集団においては、治療効果を最大にす
るように、リガンド投薬量は必然的に修正される。遺伝子型に代わるものとして
は、特定の多形性のペプチドを同定することができる。
【００７６】 ペプチドはまた、タンパク質の発現がない、発現が不適当、又は発現が不必要
であることによって特徴づけられる障害の治療に有用である（本発明のＧＰＣＲ
は、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発
現することがｃＤＮＡ検索により確認された（図１））。したがって、治療方法
としては、ＧＰＣＲタンパク質又はフラグメントの使用が含まれる。
【００７７】抗体 本発明は、本発明のペプチド、このようなペプチドを含むタンパク質、それら
の変異体及びフラグメントの１つに選択的に結合する抗体を提供するものである
。ここで用いられる場合、抗体がターゲットペプチドと結合し、無関係なタンパ
ク質と強く結合しないような場合には、抗体は選択的にターゲットペプチドと結
合している。抗体がターゲットペプチドと実質的に相同性の無い他のタンパク質
と結合していても、そのペプチドが抗体のターゲットとなるペプチドに対してフ
ラグメント又はドメインにおける相同性を有している限り、抗体は選択的にペプ
チドを結びつけると考えられる。この場合、ペプチドに結合している抗体は、あ
る程度の交差反応性を持つにも関わらず、選択的であると理解される。
【００７８】 ここで用いられる場合、抗体は当該分野で認められているものと同じ用語で定
義され、これらは、哺乳類生体により生成され、抗原の攻撃に対して応答するマ
ルチサブユニットタンパク質である。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体、及びＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２、及びＦｖのような抗体のフ
ラグメントが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００７９】 ターゲットペプチドを得るための、抗体の生成及び／又は同定について、多く
の方法が知られている。このような方法のいくつかは、Harlow, Antibodies, Co
ld Spring Harbor Press,(1989)に記載されている。
【００８０】 一般に、抗体を生成するためには、単離ペプチドを免疫原として用い、例えば
ラット、ウサギ又はマウスのような哺乳類生体に投与される。全長タンパク質、
抗原性ペプチドフラグメント又は融合タンパク質が用いられる。特に重要なフラ
グメントは、図２に特定されているような機能性ドメインをカバーするものであ
り、また、タンパク質アラインメント法を使用して容易に確認することができる
ような、ファミリーと配列相同性又は相違性を持つドメインである。
【００８１】 抗体は、ＧＰＣＲタンパク質の領域、又は単離されたフラグメントから好適に
調製される。抗体は、ここに記載されるペプチドの何れの領域からも調製するこ
とができる。しかしながら、好適な領域としては、機能／活性及び／又はＧＰＣ
Ｒ結合対象相互作用に関係している領域が含まれる。図２は特に重要な領域を特
定するのに用いることができ、配列アラインメントは保持された特異な配列フラ
グメントを特定するのに用いることができる
【００８２】 抗原性フラグメントは、典型的には、少なくとも８つの隣接するアミノ酸残基
を含んでいる。しかしながら、抗原性ペプチドは、少なくとも１０、１２、１４
、１６以上のアミノ酸残基を含むことができる。このようなフラグメントは、例
えば、タンパク質の表面上に位置する領域、例えば、親水性領域に対応するフラ
グメントのような物理的な性質、あるいは配列の特異性（図２参照）に基づいて
選択することができる。
【００８３】 本発明の抗体の検出は、検出可能物質と抗体とのカップリング（すなわち、物
理的な結合）によって容易にすることができる。検出可能物質の例としては、例
えば、種々の酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、及
び放射性物質が含まれる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシ
ダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリン
エステラーゼが含まれ、好適な補欠分子族の例としては、ストレプトアビジン／
ビオチン、アビジン／ビオチンが含まれ、好適な蛍光性物質の例としては、ウン
ベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアン酸塩、ローダ
ミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、又は
フィコエリトリンが含まれ、発光性物質の例としては、ルミノールが含まれ、生
物発光性物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが含
まれ、そして、適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、
又は３Ｈが含まれる。
【００８４】抗体の使用 抗体は、アフィニティクロマトグラフィ、又は免疫沈降のような標準の技術に
よって、本発明のタンパク質の１つを単離するために用いることができる。抗体
は、細胞からの天然タンパク質、及び宿主細胞に表現される組換えによって生成
されたタンパク質の精製を容易にすることができる。さらに、このような抗体は
、組織や生体内のタンパク質の発現パターンを決定するため、細胞や組織内にお
ける本発明のタンパク質の存在の検出に、通常の開発段階を経ずに用いることが
できる。さらに、このような抗体は、発現の量及びパターンを評価するために、
in situ、in vitro、細胞溶解物中、及び上澄み中でのタンパク質の検出に用い
ることができる。また、このような抗体は、生物学的症状の発展又は進行間にお
ける、異常な組織分布、又は異常な発現を評価するのに用いることができる（本
発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、
心臓、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検索により確認された（図１））。全長タ
ンパク質の循環フラグメントにおける抗体検出は、代謝回転を確認するのに用い
ることができる。
【００８５】 さらに、抗体は、タンパク質機能、特に受容体を発現する細胞及び組織におけ
るタンパク質機能に関連した疾患の活発な段階、又は該疾患素因を持つ個人とい
った、疾患の症状発現を評価するのに用いることができる（本発明のＧＰＣＲは
、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発現
することがｃＤＮＡ検索により確認された（図１））。障害が不適当な組織分布
、発展性の発現、タンパク質の発現レベル、又は発現／進行状態に起因する場合
、抗体を通常のタンパク質に対して調製することができる。障害がタンパク質の
特定の変異により特徴づけられる場合、この変異タンパク質に特異的な抗体を、
特定の変異タンパク質の存在のアッセイを行うために用いることができる。
【００８６】 抗体はまた、生体内の各種組織における、細胞の正常又は異常な細胞小器官の
位置を評価するのに用いることができる（本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、
肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃＤＮ
Ａ検索により確認された（図１））。診断としての使用は、遺伝子のテストだけ
でなく、治療法をモニターすることにも適用することができる。したがって、治
療が最終的に、発現レベル、又は異常配列及び異常組織分布の存在、又は発展性
の発現を修正することを目指すものである場合、タンパク質又は関連するフラグ
メントに直接的に対する抗体を、治療の有効性をモニターするために用いること
ができる。
【００８７】 さらに、抗体はゲノム薬理学分析において有用である。したがって、多形タン
パク質に対して調製される抗体は、治療法の修正を必要とする個人を特定するた
めに用いることができる。抗体はまた、電気泳動、等電点、トリプシンペプチド
消化、当該分野において周知な他の物理的なアッセイによって分析される、異常
タンパク質の免疫学的マーカーのような診断上のツールとしても有用である。
【００８８】 抗体はまた、組織型の分類にも有用である（本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎
臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃ
ＤＮＡ検索により確認された（図１））。このように、特定のタンパク質が特定
の組織中の発現と相関していた場合、このタンパク質に特異的な抗体を、組織型
を同定するために用いることができる。
【００８９】 抗体はまた、タンパク質機能を阻害するのに有用であり、例えば、リガンドの
ような結合相手へのＧＰＣＲペプチドの結合をブロックする。これらの使用は、
タンパク質の機能阻害に関連する治療法における、治療環境において適用される
ことができる。抗体は、例えば、結合をブロックすることにより、ペプチド活性
の変調（アゴナイズ又はアンタゴナイズ）を阻害することに用いることができる
。抗体は、機能のために必要な部位を含む特定のフラグメントに対して、又は細
胞又は細胞膜と関係している完全タンパク質に対して調製される。図２に、本発
明のタンパク質に関する構造情報を示す。
【００９０】 本発明は、生物学的サンプル中のタンパク質の存在を検出するために抗体を用
いたキットも包含する。キットには、ラベル化された、又はラベル化可能な抗体
と、生物学的サンプル中でタンパク質を検出するための化合物又は試薬を含み、
；サンプル中のタンパク質量を決定する手段；標準サンプルのタンパク質量と比
較する手段；及び使用の説明、とを含む。このようなキットは、単一のタンパク
質、又はエピトープを検出するために提供されるか、又は抗体検出アレイのよう
に、多数のエピトープのうちの１つを検出するように設定されることができる。
アレイとしては、核酸アレイが後述され、また抗体アレイのための同様の方法も
開発されている。
【００９１】核酸分子 本発明は、さらに本発明のＧＰＣＲペプチド又はタンパク質をコード化する単
離核酸分子（ｃＤＮＡ、転写及びゲノム配列）を提供するものである。このよう
な核酸分子は、本発明のＧＰＣＲペプチドの１つ、又はこれらの対立変異体、又
はこれらのオルトログ又はパラログをコード化する核酸分子から成る、実質的に
成る、又は含んでいる。
【００９２】 ここで用いられる場合、「単離」核酸分子は、核酸の天然起源における他の核
酸の存在から分離されたものである。好ましくは、「単離」核酸は、その核酸の
由来となる生物のゲノムＤＮＡにおいて、核酸の天然フランキング配列（すなわ
ち、５’、及び３’末端に位置する配列）は含まない。しかしながら、例えば、
約５ＫＢ、４ＫＢ、３ＫＢ、２ＫＢ又は特に１ＫＢ以上又はこれ以下、特に配列
によりコード化された隣接ペプチドのように、いくつかのフランキングヌクレオ
チド配列があるが、同一の遺伝子の配列によりコード化されたペプチドは、ゲノ
ム配列中のイントロンにより分離されている。重要な点は、核酸が、ここに記載
されているような特定の操作、例えば、組み換え発現、プローブやプライマーの
調製、核酸配列のための他の使用等に取り扱うことができるように、遠くの重要
でないフランキング配列から分離されているということである。
【００９３】 さらに、例えば、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、組み換え技術に
より製造される場合には他の細胞物質、又は培地、また化学的に合成される場合
には前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。しかしながら、この核酸分子
は、他のコード化又は調整配列に融合されることができるが、これは単離された
ものとして考えられる。
【００９４】 例えば、ベクターに含まれる組み換えＤＮＡ分子は、単離されたものとして考
えられる。さらに、単離したＤＮＡ分子の例としては、非相同的な宿主細胞に保
持された組み換えＤＮＡ分子、又は溶液中で精製（部分的又は実質的に）された
ＤＮＡ分子が含まれる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明の単離したＤＮ
Ａ分子の、in vivo又はin vitroＲＮＡ転写物が含まれる。本発明において、単
離された核酸分子としてはさらに、合成的に製造された分子が含まれる。
【００９５】 したがって、本発明は、図１又は３ [ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写配列）、及
びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３（ゲノム配列）]において示されるヌクレオチド配列か
ら成る核酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に示されるタンパク質をコ
ード化する核酸分子を提供するものである。ヌクレオチド配列がこの核酸分子の
完全なヌクレオチド配列であるとき、核酸分子はヌクレオチド配列から成る。
【００９６】 本発明はさらに、図１又は３ [ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写配列）、及びＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．３（ゲノム配列）]において示されるヌクレオチド配列から実質
的に成る核酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に示されるタンパク質を
コード化する核酸分子を提供するものである。核酸分子において、最終的にこの
ようなヌクレオチド配列がごくわずかの付加核酸残基、例えば１〜３００の付加
ヌクレオチドとともに存在するとき、核酸分子はヌクレオチド配列から実質的に
成る。
【００９７】 本発明はさらに、図１又は３ [ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写配列）、及びＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．３（ゲノム配列）]において示されるヌクレオチド配列を含む核
酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に示されるタンパク質をコード化す
る核酸分子を提供するものである。核酸分子の最終的な核酸配列の少なくとも一
部がこの核酸配列である場合、核酸分子はヌクレオチド配列を含む。これによる
と、核酸分子は、そのヌクレオチド配列だけであるか、又は付加的な核酸残基、
例えば、自然に関する核酸配列、又は非相同的な核酸配列を有することもできる
。このような核酸分子は、ごくわずかの付加的なヌクレオチドを有するか、又は
数百又はそれ以上の付加的なヌクレオチドを含むこともできる。これらの種々の
タイプの核酸分子を容易に生成／単離する方法については、以下に簡単に述べる
。
【００９８】 図１及び３には、コード及び非コードの配列の両者が提供される。本発明のヒ
トゲノム配列（図３）、及びｃＤＮＡ／転写配列（図１）より、図中の核酸分子
は、ゲノムイントロン配列、５’と３’の非コード配列、遺伝子調節領域、及び
非コード遺伝子間配列を含んでいる。一般に、図１と図３の両者に記載されてい
るこのような配列の特徴は、当該分野において公知の計算ツールを用いて容易に
特定することができる。以下で議論されるように、いくつかの非コーディング部
位、特にプロモーターのような遺伝子の調節因子は、例えば、非相同的な遺伝子
発現の制御、遺伝子活性を変調する化合物同定のターゲット等の種々の目的にと
って有用であり、ここに提供されるゲノム配列のフラグメントとして特別にクレ
ームされている。
【００９９】 単離した核酸分子は、成熟したタンパク質に加えて付加的アミノ末端あるいは
カルボキシ末端アミノ酸、又は成熟ペプチド内のアミノ酸（例えば、成熟形態が
１以上のペプチド鎖を有する場合）をコード化することができる。このような配
列は、前駆体から成熟した形態へのタンパク質のプロセシングにおいて、タンパ
ク質搬送の促進、タンパク質半減期の延長あるいは短縮、又はタンパク質のアッ
セイ又は製造の際の操作の効率化、又は他の事象における役割を果たし得る。一
般に、in situの場合、付加アミノ酸は細胞酵素によって成熟したタンパク質へ
とプロセシングされる。
【０１００】 上述したように、単離した核酸分子は、単独でＧＰＣＲペプチドをコード化し
ている配列、成熟したペプチドをコード化している配列、そして、主、又は副配
列（例えば、pre-pro、pro-protein配列）のような付加的なコード配列を含むが
、これに限定されるものではなく、付加的なコード配列に加えて、付加的な非コ
ード配列、例えば、イントロンと非コード５´及び３´配列のような、転写され
るものの翻訳はされずに、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシング及びポ
リアデニル化を含む）、リボソームの結合、及びｍＲＮＡの安定性の役割を果た
すものを、含んでも含まなくても良い。加えて、核酸分子は、例えば、精製を容
易にするようなペプチドをコード化した配列のマーカーと融合されることもでき
る。
【０１０１】 単離した核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態、あるいはクローニング
、化学合成技術又はその組み合わせによって生成するｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ
を含むＤＮＡの形態をとり得る。核酸、特にＤＮＡは、二重鎖、又は単鎖であり
得る。単鎖の核酸は、コード鎖（センス鎖）、又は非コード鎖（アンチセンス鎖
）であり得る。
【０１０２】 本発明はさらに、本発明のペプチドのフラグメントをコード化する核酸分子と
同様に、上記したような本発明のＧＰＣＲタンパク質の明らかな変異体をコード
化する核酸分子を提供するものである。このような核酸分子は、対立変異体（同
一位置）、パラログ（異なる位置）とオルトログ（異なる生体）のように自然に
発生するか、あるいは組み換えＤＮＡ法又は化学合成によって生成され得る。こ
のような非自然に発生する変異体は、核酸分子、細胞又は生体に適用されるもの
を含む突然変異生成技術によって生成され得る。したがって、上述したように、
変異体にはヌクレオチドの置換、欠失、倒置、挿入が含まれる。変異は、コード
、非コード領域のどちらか、又は両方で起こることができる。変異は、保持及び
非保持アミノ酸置換の両方で生じることができる。
【０１０３】 本発明はさらに、図１及び３に示される核酸分子の非コードのフラグメントを
提供するものである。好適な非コードのフラグメントとしては、プロモーター配
列、エンハンサ配列、遺伝子変調配列、遺伝子終止配列が含まれるが、これに限
定されるものではない。このようなフラグメントは、非相同的な遺伝子発現の制
御、及び遺伝子変調薬剤の同定を行うためのスクリーニングの開発において有用
である。プロモーターは、図３のゲノム配列における５’からＡＴＧ開始部位に
おいて容易に確認される。
【０１０４】 フラグメントは、１２又はそれ以上の隣接するヌクレオチド配列を含む。さら
に、フラグメントは少なくとも３０、４０、５０、１００、２５０、又は５００
のヌクレオチド長であり得る。フラグメントの長さは使用目的に基づく。例えば
、フラグメントは、ペプチドのエピトープ結果領域をコード化することができる
か、又はＤＮＡプローブ及びＤＮＡプライマーとして有用である。このようなフ
ラグメントは、オリゴヌクレオチドプローブを合成するため、既知のヌクレオチ
ド配列を用いて単離することができる。ラベル化されたプローブは、コード化領
域と対応する核酸を単離するため、ｃＤＮＡライブラリ、ゲノムＤＮＡライブラ
リ、又はｍＲＮＡのスクリーニングに用いることができる。さらに、プライマー
は、遺伝子の特定領域をクローンするためのＰＣＲ反応に用いることができる。
【０１０５】 プローブ／プライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチ
ド又はオリゴヌクレオチドペアを含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、少
なくとも１２、２０、２５、４０、５０又はそれ以上の連続的ヌクレオチドに、
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされたヌクレオチド配列領域を含む
。
【０１０６】 オルトログ、ホモログ、及び対立変異体は、当該技術分野において周知の方法
を用いて同定することができる。ペプチドの項で述べたように、これらの変異体
は、ペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含み、図面に示されるヌクレオ
チド配列、又はこの配列のフラグメントに対して、典型的には、６０−７０％、
７０−８０％、８０−９０％、より典型的には、少なくとも９０−９５％以上の
相同性を有するものである。このような核酸分子は、図面に示されるヌクレオチ
ド配列、又はこの配列のフラグメントに対してモデレートな条件からストリンジ
ェントな条件の下でハイブリダイズが可能なものとして、容易に同定することが
できる。対立変異体は、コード化している遺伝子の遺伝子位置により、容易に決
定されることができる（本発明のＧＰＣＲは、染色体１１上のマーカーＳＨＧＣ
−３２４８６（ＬＯＤ＝１５．４５）、及びＳＨＧＣ−２０６５３（ＬＯＤ＝１
５．４５）の近接に見出される遺伝子によりコード化されている）。
【０１０７】 「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、ここで用
いられる場合、互いにハイブリダイズして残存する、ペプチドをコード化してい
るヌクレオチド配列が、互いに少なくとも６０−７０％の相同性を有する程度に
ハイブリダイズ、及び洗浄が行われる条件を意味している。この条件では、ハイ
ブリダイズして残る配列が、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なく
とも約８０％、又はそれ以上となる。このようなストリンジェントな条件は、当
業者においては周知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John W
iley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。ストリンジェント
なハイブリダイズ条件の１つの例では、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウ
ム（ＳＳＣ）中、約４５℃でハイブリダイズし、その後、０．２ＸＳＳＣ０．１
％ＳＤＳ中、５０〜６５℃で洗浄する。低ストリンジェンシーのモデレートなハ
イブリダイズ条件の例は、当業者において周知である。
【０１０８】核酸分子の使用 本発明の核酸分子は、プローブ、プライマー、化学合成中間体、及び生物学ア
ッセイにおいて有用である。核酸分子は、図２に示されているペプチドをコード
化する全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するため、及び図２に示すペプチ
ドと同一又は関連したペプチドを生成する変異体（対立遺伝子、オルトログ等）
に対応するゲノムクローンを単離するための、メッセンジャーＲＮＡ、転写／ｃ
ＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして有用である
。
【０１０９】 プローブは、図に示されている核酸分子の全長における、どんな配列とも対応
することができる。したがって、それは５’非コード領域、コード領域、及び３
’非コード領域から誘導することができる。しかしながら、すでに述べたたよう
に、フラグメントは本発明以前に公開されたフラグメントを含まないものと見な
される。
【０１１０】 核酸分子はまた、核酸分子の何れかの領域を増幅するＰＣＲのプライマーとし
ても有用であり、必要な長さ及び配列のアンチセンス分子の合成においても有用
である。
【０１１１】 核酸分子はまた、組み換えベクターの製造にも有用である。このようなベクタ
ーとしては、ペプチド配列の一部、又は全部を表現する発現ベクターが含まれる
。ベクターはまた、挿入ベクターも含み、これは他の核酸分子中に統合され、例
えば、細胞ゲノム中で遺伝子及び／又は遺伝子生成物のin situ発現を変化させ
るために用いられる。例えば、内生コード配列では、１つ以上の特異的に導入さ
れた変異を含むコード領域の一部、又は全部との相同的な組み換えを経て置換さ
れ得る。
【０１１２】 核酸分子はまた、タンパク質の抗原部分を発現することにも有用である。
【０１１３】 核酸分子はまた、in situハイブリダイゼーション法により、核酸分子の染色
体の位置を決定するためのプローブとしても有用である（本発明のＧＰＣＲは、
染色体１１上のマーカーＳＨＧＣ−３２４８６（ＬＯＤ＝１５．４５）、及びＳ
ＨＧＣ−２０６５３（ＬＯＤ＝１５．４５）の近接に見出される遺伝子によりコ
ード化されている）。これは、特定のタンパク質が、ここに記載されるタンパク
質の対立変異体であるかどうかを判定する場合に、特に有用である。
【０１１４】 核酸分子はまた、以下で説明するような本発明の核酸分子の遺伝子調節領域を
含むベクターの製造にも有用である。
【０１１５】 核酸分子はまた、ここに記載される核酸分子から生成されるｍＲＮＡの一部又
は全部と対応しているリボザイムの設計にも有用である。
【０１１６】 核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を表現している宿主細
胞の製造にも有用である。
【０１１７】 核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を表現している遺伝子
組み換え動物の製造にも有用である。
【０１１８】 核酸分子はまた、ペプチドの一部又は全部を表現しているベクターの製造にも
有用である。
【０１１９】 核酸分子はまた、核酸発現の存在、レベル、形態、分布を決定するためのハイ
ブリダイゼーションプローブとしても有用である。したがって、プローブは、細
胞、組織、生体中での核酸分子の存在の検出、又はレベルの決定に用いることが
できる（本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の
脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検索により確認された（図１）
）。レベルを決定される核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。したがって、こ
こに記載されるペプチドに対応するプローブは、与えられた細胞、組織、生体中
での発現及び／又は遺伝子コピー数の評価に用いることができる。これらの使用
は、正常の場合と比較して、ＧＰＣＲタンパク質が増加又は減少していることに
関係する障害の診断に適している。
【０１２０】 ｍＲＮＡのin vitro検出技術には、ノーザンハイブリダイゼーション、及びin
situハイブリダイゼーションが含まれる。ＤＮＡのin vitro検出技術には、サ
ザンハイブリダイゼーション、及びin situハイブリダイゼーションが含まれる
。
【０１２１】 プローブは、ＧＰＣＲタンパク質を発現する細胞又は組織の判定を行う診断テ
ストキットの一部として用いることができ、これは、例えば、被験者の細胞サン
プル中の、受容体をコード化した核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮ
Ａのレベルを測定するか、又はＧＰＣＲ遺伝子が変異していないか判定するもの
である（本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の
脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検索により確認された（図１）
）。
【０１２２】 核酸発現アッセイは、ＧＰＣＲ核酸発現、特に受容体を発現する細胞及び組織
中での核酸発現を変調する化合物を同定するための薬剤スクリーニングにおいて
有用である（本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎
児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検索により確認された（図
１））。
【０１２３】 したがって、本発明は、ＧＰＣＲ遺伝子の核酸発現に関連した障害の治療に用
いる化合物を同定する方法を提供するものである。この方法には、典型的には、
ＧＰＣＲ核酸の発現を変調する化合物の能力についてアッセイを行うこと、及び
その後、不必要なＧＰＣＲ核酸発現により特徴づけられる障害を治療するのに用
いることができる化合物を同定することが含まれる。このアッセイは、細胞系及
び無細胞系において行われることができる。細胞系のアッセイには、天然にＧＰ
ＣＲ核酸を表現している細胞（本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、
白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検索によ
り確認された（図１））、又は特定の核酸配列を表現するために設計された組み
換え細胞が含まれる。
【０１２４】 ＧＰＣＲ核酸発現のアッセイは、例えばｍＲＮＡレベルのような核酸レベル、
又は信号経路に関連する副次化合物の直接的なアッセイと関連させることができ
る。さらに、ＧＰＣＲタンパク質信号経路における応答性を向上、又は低下させ
る遺伝子の発現についてもアッセイすることができる。この例として、これらの
遺伝子の調節領域は、ルシフェラーゼのようなリポーター遺伝子に有効に結合さ
れることができる。
【０１２５】 したがって、ＧＰＣＲ遺伝子発現のモジュレータは、細胞と候補化合物とを接
触させ、ｍＲＮＡの発現を判定する方法により同定することができる。候補化合
物の存在下でのＧＰＣＲｍＲＮＡの発現レベルは、候補化合物非存在下でのＧＰ
ＣＲｍＲＮＡの発現レベルと比較される。この比較に基づいて、候補化合物は核
酸発現のモジュレータとして同定され、例えば、異常核酸発現により特徴付けら
れる障害の治療に用いることができる。候補化合物存在下でのｍＲＮＡの発現が
、非存在下のものと比較して統計的に著しく大きい場合、候補化合物は核酸発現
の促進剤として同定される。候補化合物存在下でのｍＲＮＡの発現が、非存在下
のものと比較して統計的に著しく小さい場合、候補化合物は核酸発現の阻害剤と
して同定される。
【０１２６】 本発明はさらに、ＧＰＣＲ核酸発現を変調するための遺伝子モジュレータ、特
にタンパク質を発現する細胞及び組織における活性を変調するための遺伝子モジ
ュレータとしての薬剤スクリーニングを経て同定された化合物をターゲットとし
て用いる治療方法を提供するものである（本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、
肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃＤＮ
Ａ検索により確認された（図１））。変調には、上方調整（例えば、活性化又は
アゴニゼーション）、下方調整（抑制又はアンタゴニゼーション）の両者、又は
核酸発現が含まれる。
【０１２７】 あるいは、薬剤又は小分子がタンパク質を発現している細胞又は組織中でＧＰ
ＣＲ発現を阻害するものである限りは、ＧＰＣＲ核酸発現のモジュレータは、こ
こに記載されるスクリーニングアッセイを用いて同定される薬剤又は小分子であ
り得る（本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の
脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検索により確認された（図１）
）。
【０１２８】 核酸分子はまた、臨床試験又は治療方法において、ＧＰＣＲ遺伝子の発現及び
活性に対する変調化合物の効果をモニターするのに有用である。したがって、遺
伝子発現パターンは、化合物、特に患者の耐性を向上させる化合物を用いた治療
における、継続的な効果のバロメータとなり得る。遺伝子発現パターンはまた、
化合物に対する細胞の生理的反応を示すマーカーとなり得る。したがって、この
ようなモニタリングにより、化合物の投与量の増加、又は患者が耐性を示さない
代替化合物の投与を行うことができる。同様に、核酸発現のレベルが望ましいレ
ベルまで低下したならば、化合物の投与をこれに比例して減少することができる
。
【０１２９】 核酸分子はまた、ＧＰＣＲ核酸発現の質的変化、特に疾患に至る質的変化の診
断アッセイにも有用である。核酸分子は、ＧＰＣＲ遺伝子、及びｍＲＮＡのよう
な遺伝子発現生成物における突然変異の検出に用いることができる。核酸分子は
、ＧＰＣＲ遺伝子において自然発生した遺伝子突然変異を検出し、その変異を持
つ被験者が変異により生じる障害の危険性を有しているかどうかを判定するため
のハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。突然変異には、
欠失、付加、又は遺伝子中の１以上のヌクレオチドの置換、倒置又は転移のよう
な染色体の組み換え、異常メチル化パターンのようなゲノムＤＮＡの修飾、又は
増幅のような遺伝子コピー数の変化が含まれる。機能障害に関連するＧＰＣＲ遺
伝子の変異体の検出は、疾患がＧＰＣＲタンパク質の過剰発現、過小発現、変異
発現の結果生じる場合に、活性又は感受性の診断ツールを提供するものである。
【０１３０】 ＧＰＣＲ遺伝子における突然変異をもたらしている個体は、種々の技術によっ
て核酸レベルにおいて検出されることができる（本発明のＧＰＣＲは、染色体１
１上のマーカーＳＨＧＣ−３２４８６（ＬＯＤ＝１５．４５）、及びＳＨＧＣ−
２０６５３（ＬＯＤ＝１５．４５）の近接に見出される遺伝子によりコード化さ
れている）。ゲノムＤＮＡは、直接又は予めＰＣＲを用いて増幅した後で分析さ
れることができる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡも、同様にして用いることができる。あ
る使用においては、突然変異の検出は、例えば、アンカーＰＣＲ、ＲＡＣＥＰＣ
Ｒのような、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）(例えば、U.S. Patent No. 4,683
,195, 及び 4,683,202参照)、又は他のものとして、リゲーション連鎖反応（Ｌ
ＣＲ）(例えば、Landegran et al., Science 241:1077-1080 (1988); 及び Naka
zawa et al., PNAS 91:360-364 (1994)参照)において、プローブ／プライマーの
使用に関連し、特に後者は遺伝子中の変異位置の同定に有用である（Abravaya e
t al., Nucleic Acids Res. 23:675-682 (1995)参照）。この方法には、患者か
ら細胞サンプルを収集する工程と、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、
ｍＲＮＡ又はその両方）を単離する工程と、遺伝子（もし存在すれば）のハイブ
リダイズ及び増幅が起こりうる条件下で遺伝子に特異的にハイブリダイズする１
以上のプライマーと核酸とを接触させる工程と、増幅生成物の存在又は非存在を
検出するか、又は増幅生成物のサイズを検出し、コントロールサンプルの長さと
比較する工程を含む。欠失及び挿入は、増幅生成物のサイズの変化を、正常な遺
伝子型と比較することにより検出することができる。点突然変異は、増幅ＤＮＡ
と正常なＲＮＡ、又はアンチセンスのＤＮＡ配列とハイブリダイズすることによ
って確認することができる。
【０１３１】 あるいは、ＧＰＣＲ遺伝子の突然変異は、例えば、ゲル電気泳動により決定さ
れる制限酵素消化パターンの変更により、直接的に確認することができる。
【０１３２】 さらに、配列特定リボザイム(U.S. Patent No. 5,498,531)は、リボザイム開
裂部位の成長又は減少により、特定の変異の存在の評点のために用いることがで
きる。完全に一致する配列は、ヌクレアーゼ開裂消化アッセイ、又は融点の違い
によって、不一致の配列から分離することができる。
【０１３３】 特定位置での配列変化は、ＲＮａｓｅ及びＳ１保護、又は化学開裂法のような
ヌクレアーゼ保護アッセイによって評価することができる。さらに、変異体ＧＰ
ＣＲ遺伝子と野生型遺伝子との配列の相違は、直接ＤＮＡ配列解析によって決定
することができる。種々の自動化された配列解析手段は、診断アッセイ（Naeve,
C.W., (1995) Biotechniques 19:448）の実行において有用であり、これらには
、マススペクトルによる配列解析（例えば、PCT International Publication No
. WO 94/16101; Cohen et al., Adv. Chromatogr. 36:127-162 (1996), and Gri
ffin et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159 (1993)参照）も含まれ
る。
【０１３４】 遺伝子中の突然変異を検出する他の技術の例としては、ＲＮＡ／ＲＮＡ、又は
ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から、不一致の塩基を検出するために、開裂試薬から保護
する方法（Myers et al., Science 230:1242 (1985), Cotton et al., PNAS 85:
4397 (1988), Saleeba et al., Meth. Enzymol. 217:286-295 (1992)）、変異体
と野生型の核酸の電気泳動移動度を比較する方法（Orita et al., PNAS 86:2766
(1989); Cotton et al., Mutat. Res. 285:125-144 (1993); and Hayashi et a
l., Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79 (1992)）、及び変性剤の勾配を含んだ
ポリアクリルアミドゲル中での変異体又は野生型のフラグメントの動きを、勾配
ゲル電気泳動を用いてアッセイする方法（Myers et al., Nature 313:495 (1985
)）が含まれる。点突然変異を検出する他の技術の例としては、選択的オリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長が
含まれる。
【０１３５】 核酸分子は、治療方法としての効果を持つにも関わらず、必ずしも疾患を引き
起こすわけではない遺伝子型のための、個人テストにおいても有用である。この
ため、核酸分子は、個人の遺伝子型と、治療に用いられる化合物に対する個人の
応答との相関（薬理ゲノム相関）についての研究に用いることができる。したが
って、ここに記載されている核酸分子は、治療のための適切な化合物及び投与量
を選択するために、個人のＧＰＣＲ遺伝子の変異についての評価に用いることが
できる。
【０１３６】 このように、治療に影響する遺伝子変異を示す核酸分子は、個人におけるテイ
ラー治療に用いることのできる診断ターゲットを提供するものである。したがっ
て、これらの多形性を含んだ組み換え細胞及び組み換え動物の製造は、治療化合
物及び薬剤投与についての効果的な臨床設計を可能とする。
【０１３７】 核酸分子は、細胞、組織、及び生体におけるＧＰＣＲ遺伝子発現を制御するた
めのアンチセンス構成物として有用である。ＤＮＡアンチセンスの核酸分子は、
転写に関連する遺伝子の部位に対して相補的になるよう設計され、それ故に、Ｇ
ＰＣＲタンパク質の生成と転写が防がれる。アンチセンスのＲＮＡ又はＤＮＡ核
酸分子はｍＲＮＡへとハイブリダイズされ、これによりＧＰＣＲタンパク質中で
のｍＲＮＡの翻訳がブロックされる。
【０１３８】 あるいは、ある種のアンチセンス分子は、ＧＰＣＲ核酸の発現を減少させるた
め、不活性化ｍＲＮＡに用いることができる。したがって、これらの分子は、異
常、又は不必要なＧＰＣＲ核酸の発現により特徴づけられる障害の治療に用いる
ことができる。この技術は、翻訳されるｍＲＮＡの能力が減少したｍＲＮＡの１
以上の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む、リボザイムによる開裂に関連し
ている。可能な領域としては、コード領域、特に、リガンド結合のような、ＧＰ
ＣＲタンパク質の触媒活性及び他の機能活性に対応したコード領域が含まれる。
【０１３９】 核酸分子はまた、ＧＰＣＲ遺伝子発現において異常な細胞を持つ患者の遺伝子
治療のためのベクターを提供するものである。このため、組み換え細胞には、ex
vivoで調製され患者に戻される細胞が含まれ、個人の体内に導入されてそこで
個人の治療のために必要とされるＧＰＣＲタンパク質を生成する。
【０１４０】 本発明は、生物学的サンプル、特に通常この受容体を発現する細胞及び組織中
のＧＰＣＲ核酸の存在を検出するために抗体を用いたキットも包含する（本発明
のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓
、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検索により確認された（図１））。例えば、キ
ットは、ラベル化された、又はラベル化可能な核酸、又は生物学的サンプル中で
ＧＰＣＲ核酸を検出することのできる試薬を含み、；サンプル中のＧＰＣＲ核酸
量を決定する手段；標準サンプルのＧＰＣＲ核酸量と比較する手段、とを含むこ
とができる。この化合物又は試薬は適当な容器に封入することができる。このキ
ットは、さらにＧＰＣＲタンパク質ｍＲＮＡ又はＤＮＡの検出キットとして使用
するための説明を含むことができる。
【０１４１】核酸アレイ 本発明はさらに、核酸検出キットを提供するものであり、これらは、例えば、
図１及び３(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１，３)に示される配列情報に基づいた核酸分子
のアレイ又はマイクロアレイである。
【０１４２】 ここで用いられている、「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン
又は他の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体の
ような基盤の上に合成された、別個のポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチ
ドのアレイのことを指す。１つの例として、マイクロアレイは、US Patent 5,83
7,832, Chee et al., PCT application W095/11995 (Chee et al.), Lockhart,
D. J. et al. (1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680) 及び Schena, M. et al.
(1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619)に記載される方法にしたがっ
て調製、使用され、これらの全ては参考としてここに折り込まれる。他の例では
、このようなアレイは、Brown et al., US Patent No. 5,807,522.に記載される
方法により製造される。
【０１４３】 マイクロアレイ又は検出キットは、好適には、多数の特異的な単鎖の核酸配列
を構成し、通常は合成アンチセンスのオリゴヌクレオチドか、又はｃＤＮＡのフ
ラグメントのどちらかが固体支持体上に固定される。オリゴヌクレオチドは、好
適には約６〜６０のヌクレオチド長、より好適には１５〜３０のヌクレオチド長
、最も好適には２０〜２５のヌクレオチド長である。あるタイプのマイクロアレ
イ又は検出キットには、７〜２０のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのみを
使うことが好適であり得る。マイクロアレイ又は検出キットは、既知の５’又は
３’配列を含んだオリゴヌクレオチド、全長配列を含んだオリゴヌクレオチド、
又は配列長さの特定領域から選択された特異なオリゴヌクレオチドを含むもので
あり得る。マイクロアレイ又は検出キットにおいて用いられるポリヌクレオチド
は、遺伝子又は対象となる遺伝子において特異的なオリゴヌクレオチドであり得
る。
【０１４４】 マイクロアレイ又は検出キットにおいて、既知の配列のオリゴヌクレオチドを
製造するために、対象となる遺伝子（又は、本発明により確認されたＯＲＦ）は
、典型的には、核酸配列の５’から開始、又は３’で終了するコンピュータアル
ゴリズムを用いて試験される。典型的なアルゴリズムでは、遺伝子に特異的な長
さに規定されたオリゴマーが同定され、ハイブリダイゼーションに好適な範囲に
ＧＣ成分を持ち、ハイブリダイゼーションの妨害となると予測される二次構造を
持たない。ある条件では、マイクロアレイ又は検出キットにおいて、オリゴヌク
レオチドのペアを用いることが好適であり得る。オリゴヌクレオチドの「ペア」
は、好適には配列の中央に位置している１つのヌクレオチドを除いては、同一で
ある。ペアの２つ目のオリゴヌクレオチド（一方とは不一致）はコントロールと
して用いられる。オリゴヌクレオチドペアの数は、２から１００万の間である。
オリゴマーは、光誘導化学プロセスを用いて、基盤上の指定領域で合成される。
基盤は、紙、ナイロン又は他の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他
の適当な固形支持体である。
【０１４５】 他方、オリゴヌクレオチドは、PCT application W095/251116 (Baldeschweile
r et al.)に記載されているように、化学カップリング手段、及びインクジェッ
トアプリケーション装置を用いて基盤の表面上で合成され、これらの全ては参考
としてここに折り込まれる。他の観点では、ドット（又はスロット）ブロットに
似た「格子」アレイでは、真空システム、加熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合工
程を用いて、ｃＤＮＡ、又はオリゴヌクレオチドを基板の表面上に配置、結合さ
せることができる。上記のようなアレイは、手工、又は利用可能な装置（スロッ
トブロット、又はドットブロット装置）、材料（適当な固形支持体）、及び機械
（ロボット装置を含む）を用いて製造され、また、８、２４、９６、３８４、１
５３６、６１４４又はこれ以上、又は２から１００万の間の他の数のオリゴヌク
レオチドを含んでもいても良く、商業的に用いられる装置を効果的に使用するこ
とが適している。
【０１４６】 マイクロアレイ又は検出キットを用いてサンプルの分析を行うために、生物サ
ンプルから得られたＲＮＡ又はＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブ中に
調製される。ｍＲＮＡが単離され、そしてｃＤＮＡが調製され、アンチセンスの
ＲＮＡ(ａＲＮＡ)を調製するためのテンプレートとして用いられる。ａＲＮＡは
蛍光性ヌクレオチドの存在化で増幅し、ラベル化されたプローブがマイクロアレ
イ又は検出キットにおいてインキュベートされ、そして、プローブの配列がマイ
クロアレイ又は検出キット中の相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさ
れる。インキュベート条件は、正確に相補的に一致しているか、又は各種程度の
相補性でハイブリダイゼーションが起こるように調節される。ハイブリダイズし
ていないプローブを除去した後、蛍光のレベルとパターンを判定するためにスキ
ャナが用いられる。スキャンされたイメージは、マイクロアレイ又は検出キット
上の、相補性の程度、及び各々のオリゴヌクレオチド配列の相対的な量を決定す
るために試験される。生物学的サンプルは、体液（例えば血、尿、唾液、痰、胃
液、その他）、培養細胞、生体組織検査、又は他の組織調製品の何れかより得ら
れる。検出システムでは、同時に全ての異なる配列において、ハイブリダイゼー
ションの存在、非存在、及び量を計測するのに用いられる。このデータは、サン
プル中での、配列、発現パターン、変異、変異体、又は多形性といった、大規模
な相関性の研究に用いられる。
【０１４７】 本発明は、このようなアレイを用いて、本発明のＧＰＣＲタンパク質／ペプチ
ド、及びこの遺伝子／タンパク質の対立変異体の発現を同定するための方法を提
供するものである。詳細には、このような方法は、テストサンプルと一つ以上の
核酸分子とのインキュベートと、テストサンプル中の成分と核酸分子との結合に
ついてのアッセイとが含まれる。このようなアッセイは、少なくとも遺伝子の一
つが本発明の遺伝子及び／又は本発明のＧＰＣＲ遺伝子の対立変異体である、多
くの遺伝子又は対立遺伝子を含むアレイに関連している。
【０１４８】 テストサンプルと核酸分子のインキュベートの条件は様々である。インキュベ
ーション条件は、使用されるアッセイの形式、使用される検出方法、及びアッセ
イに用いられる核酸分子のタイプ及び性質に依存する。一般的に入手可能なハイ
ブリダイゼーション、増幅、又はアレイアッセイの形式の何れかを認識している
当業者は、ここに記載されるヒトゲノムの新規フラグメントを用いるに当って、
容易に適用を行うことができる。このようなアッセイの例は、Chard, T, An Int
roduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science P
ublishers, Amsterdam, The Netherlands (1986); Bullock, G. R. et al., Tec
hniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL Vol. 1 (1 98
2), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985); Tijssen, P., Practice and Theory of En
zyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular B
iology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985)に
記載されている。
【０１４９】 本発明のテストサンプルには、細胞、タンパク質、細胞からの膜抽出物が含ま
れている。上記の方法に用いられるテストサンプルは、アッセイの形式、検出方
法の性質、及びアッセイのサンプルとして用いられる組織、細胞、又はその抽出
物に基づいて変化する。核酸抽出物又は細胞抽出物の調製方法は、当業者におい
て周知であり、用いられるシステムと調和するサンプルを得ることにより、容易
に適用することができる。
【０１５０】 本発明の他の例としては、本発明のアッセイを行うために必要な試薬を含むキ
ットが提供される。
【０１５１】 特に本発明は、（ａ）ここに記載されるＧＰＣＲのフラグメントと結合するこ
とのできる１以上の核酸分子を含む第一の容器、（ｂ）１以上の洗浄試薬、結合
核酸を検出することのできる試薬を含む他の１以上の容器、とを含む１以上の容
器に区分され、封入されたキットを提供するものである。
【０１５２】 詳細には、区分されたキットとしては、試薬が個別の容器に含まれているキッ
トが含まれる。このような容器としては、小さいガラスの容器、プラスチック容
器、帯状のプラスチック、ガラス又は紙、又はシリカのようなアレイ材料が含ま
れる。このような容器は、サンプルと試薬が混合して汚染しないように、１つの
区分から他の区分へと試薬を効率的に移動することができ、またそれぞれの容器
の試薬又は溶液は他の容器へと定量的に添加することができる。このような容器
には、テストサンプルを入れる容器、核酸プローブを含む容器、洗浄試薬（例え
ば、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ−緩衝液等）を含む容器、及び結合プローブを検
出に用いられる試薬を含む容器を含む。当業者は、本発明にかかる従来未知のＧ
ＰＣＲ遺伝子を容易に認識し、ここに開示されている配列情報を用いて定型的に
確認することができ、さらにこれを当業者において周知の確立されたキット形態
、特に発現アレイに容易に組み込むことができる。
【０１５３】ベクター／宿主細胞 本発明はまた、ここに記載される核酸分子を含んだベクターを提供するもので
ある。「ベクター」という用語は、ビヒクルのことを指し、好適には核酸分子で
あり、核酸分子の輸送をすることができるもののことである。ベクターが核酸分
子である場合、核酸分子はベクターの核酸と共有結合している。本発明のこの観
点では、ベクターには、プラスミド、単鎖又は二重鎖のファージ、単鎖又は二重
鎖ＲＮＡ又はＤＮＡのウイルス性ベクター、又はＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＯＲ
ＭＡＣのような人工染色体が含まれる。
【０１５４】 ベクターは宿主細胞中に染色体外の成分として保持され、そこで核酸分子の付
加的なコピーを複製及び生成する。あるいは、ベクターは宿主細胞のゲノム中に
組み込まれ、宿主細胞の複製の際に核酸分子の付加的なコピーを生成する。
【０１５５】 本発明は、核酸分子の保持のためのベクター（クローニングベクター）、又は
核酸分子の発現のためのベクター（発現ベクター）を提供するものである。この
ベクターは、原核生物細胞又は真核生物細胞、又はその両方で機能することがで
きる（シャトルベクター）。
【０１５６】 発現ベクターは、ベクター中で核酸分子と有効に結合したｃｉｓ作用性調節領
域を含み、これにより宿主細胞中での核酸分子の転写が可能となる。この核酸分
子は、転写に影響を及ぼす核酸分子と分離されて、宿主細胞に導入されることが
できる。したがって、第二の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写を行う
ｃｉｓ調節制御領域と相互作用するトランス作用性因子を提供し得る。あるいは
、トランス作用性因子は宿主細胞により提供され得る。最終的に、トランス作用
性因子は、ベクター自身から作り出すことができる。しかしながら、いくつかの
例では、核酸分子の転写及び／又は翻訳は無細胞系でも起こり得る。
【０１５７】 ここに記載される核酸分子の調整配列は、目的のｍＲＮＡ転写のためのプロモ
ーターを含んで有効に結合されることができる。これらには、バクテリオファー
ジλからの左部プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉからのｌａｃ、ＴＲＰ及びＴＡＣプ
ロモーター、ＳＶ４０からの初期及び後期のプロモーター、ＣＭＶの極初期のプ
ロモーター、アデノウイルスの初期及び後期のプロモーター、及びレトロウイル
スのＬＴＲが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１５８】 転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターはまた、リプレッサー結合部
位やエンハンサのような転写を調整する領域を含むものであり得る。この例とし
ては、ＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルスの極初期のエンハンサ、ポリ
オーマエンハンサ、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスＬＴＲエンハ
ンサが含まれる。
【０１５９】 転写の開始及び制御領域を含む場合に加えて、発現ベクターはまた、転写のた
めのリボソーム結合部位である転写領域における、転写終了のために必要な配列
を含むことができる。他の発現調整制御成分としては、開始及び終止コドンと同
様に、ポリアデニル化信号が含まれる。当業者は、発現ベクターに有用な多数の
調整配列を知り得る。このような調整配列は、例えば、Sambrook et al., Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)に記載されている。
【０１６０】 各種の発現ベクターは、核酸分子の発現に用いることができる。このようなベ
クターには、染色体、エピソーム、ウイルス由来のベクター、例えば、バクテリ
アプラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、人工酵母染色体のような
酵母染色体成分、バクロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、バクシニ
アウイルス、アデノウイルス、ポクスウイルス、シュードラビスウイルス、及び
レトロウイルスのようなウイルス由来のベクターが含まれる。ベクターはまた、
これらの起源の組み合わせから誘導することができ、例えば、コスミド及びファ
ージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝子成分から誘導するこ
とができる。原核及び真核生物の宿主細胞のための適切なクローニングベクター
及び発現ベクターは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Man
ual. 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, (1989)に記載されている。
【０１６１】 調整配列では、１以上の宿主細胞の構成的な発現（すなわち組織特異性）、又
は、温度、養分添加、又はホルモンや他のリガンドのような外生の要因による１
以上の細胞タイプでの指示的な発現を提供するものである。原核及び真核生物の
宿主細胞において構成的、及び指示的に発現する種々のベクターは、当業者にお
いて周知である。
【０１６２】 核酸分子は、周知の方法によってベクター核酸内に導入されることができる。
通常、最終的に発現するＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列と発現ベクターが１以上の限
定酵素により開裂し、その後フラグメントが共に結合することによって、発現ベ
クターと結合される。制限酵素の消化及び結合の手順は、当業者において周知で
ある。
【０１６３】 適切な核酸分子を含んでいるベクターは、公知の技術を用いて、増殖又は発現
のために適切な宿主細胞内へ導入することができる。バクテリア細胞には、Ｅ．
ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、及び Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍが含まれるがこれに限定されるものではない。真核生物細胞には、
酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのような昆虫細胞、ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞のような
動物細胞、及び植物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１６４】 ここに記載されているように、融合タンパク質としてのペプチドの発現が望ま
しい。したがって、本発明はペプチドの生成が可能な融合ベクターを提供するも
のである。融合ベクターは組み換えタンパク質の発現及び溶解性を向上すること
ができ、また、例えば、アフィニティー精製のためのリガンドの作用によって、
タンパク質精製を向上することができる。タンパク質分解性開裂部位は融合部分
との結合位置に導入され、このために、目的となるペプチドは最終的に融合部分
から分離される。タンパク質分解酵素としては、ファクターＸａ、スロンビン、
エンテロキナーゼが含まれるが、これに限定されるものではない。典型的な融合
発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）、マルトースＥ結
合タンパク質、又はタンパク質Ａのそれぞれをターゲット組み換えタンパク質に
融合した、ｐＧＥＸ（Smith et al., Gene 67:31-40 (1988)）、ｐＭＡＬ（New
England Biolabs, Beverly, MA）、ｐＲＩＴ５（Pharmacia、Piscataway、NJ）
が含まれるが、これに限定されるものではない。好適な指示的非融合Ｅ．ｃｏｌ
ｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Amann et al., Gene 69:301-315 (198
8)、ｐＥＴ１１ｄ（Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in
Enzymology 185:60-89 (1990)）が含まれる。
【０１６５】 組み換えタンパク質の発現は、遺伝子背景を与えることによって、宿主バクテ
リアにおいて最大化することができ、宿主細胞は組み換えタンパク質のタンパク
質分解性の開裂欠損能力を有する（Gottesman, S., Gene Expression Technolog
y: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (199
0) 119-128）。あるいは、対象となる核酸分子の配列は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ
のような特定の宿主細胞のために優先的に使用されるコドンとなるように変更さ
れることができる（Wada et al., Nucleic Acids Res. 20:2111-2118 (1992)）
。
【０１６６】 核酸分子はまた、酵母において作用する発現ベクターにより発現されることも
できる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母中で発現するベクターの例とし
ては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari, et al., EMBO J. 6:229-234 (1987)）、ｐ
ＭＦａ（Kurjan et al., Cell 30:933-943(1982)）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et
al., Gene 54:113-123 (1987)）、ｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San
Diego, CA）が含まれる。
【０１６７】 核酸分子はまた、例えば、バクロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞内
で表現されることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中のタンパク
質の発現に利用されるバクロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Smith et
al., Mol. Cell Biol. 3:2156-2165 (1983)）、及びｐＶＬシリーズ（Lucklow
et al., Virology 170:31-39 (1989)）が含まれる。
【０１６８】 本発明のある例においては、ここに記載されている核酸分子は、哺乳類発現ベ
クターを用いて哺乳類の細胞内で表現される。哺乳類発現ベクターの例としては
、ｐＣＤＭ８（Seed, B. Nature 329:840(1987)）、及びｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman
et al., EMBO J. 6:187-195 (1987)）が含まれる。
【０１６９】 ここに列記されている発現ベクターとしては、核酸分子を表現するために有用
であり、当業者が利用可能なベクターとして周知のもののみが示されている。こ
こに記載されている核酸分子の維持増殖、又は発現に好適な他のベクターは、当
業者において周知である。これらは、例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F., a
nd Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold S
pring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sprin
g Harbor, NY, 1989に記載されている。
【０１７０】 ここに記載されている核酸配列がベクター中に逆方向にクローンされたベクタ
ーは、アンチセンスＲＮＡの転写を許す調整配列に結合可能であるが、本発明は
、また、このようなベクターも包含するものである。このように、アンチセンス
転写は、ここに記載され、コード、非コード領域の両方が含まれている核酸分子
配列の、全部又は一部を生成することができる。そして、このアンチセンスのＲ
ＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現（調整配列、構成的、又は指示的発現、組織
特異発現）に関して、前記した各パラメータに対応する。
【０１７１】 本発明はまた、ここに記載されるベクターを含む組み換え宿主細胞に関連する
ものである。したがって、宿主細胞には、原核生物細胞、酵母のような低真核生
物細胞、昆虫細胞のような他の真核生物細胞、及び哺乳類の細胞のような高真核
生物細胞が含まれる。
【０１７２】 組み換え宿主細胞は、当業者が容易に利用可能な技術により、ここに記載され
るように構成されるベクターを細胞中に導入することによって調製することがで
きる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキス
トラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、トランスダクション、インフェクション、リポフェク
ション、及びSambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2n
d, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbor, NY, 1989)に記載されているような他の技術が含まれ
るが、これらに限定されるものではない。
【０１７３】 宿主細胞は、１以上のベクターを含むことができる。このため、異なるヌクレ
オチド配列が、同じ細胞の異なるベクター中に導入されることができる。同様に
、核酸分子は、単独で、又は発現ベクターのトランス作用因子を与えているよう
な、関連のない他の核酸分子と共に導入されることができる。１以上のベクター
が細胞内に導入される場合、ベクターは単独で導入されるか、共に導入されるか
、又は核酸分子ベクターに結合されることができる。
【０１７４】 バクテリオファージ及びウィルスベクターの場合、これらは標準的なインフェ
クション及びトランスダクションの操作により、封入又はカプセル化されたウイ
ルスとして細胞内に導入されることができる。ウィルスベクターは、複製可能、
又は複製欠陥であり得る。ウイルスの複製に欠陥がある場合、欠陥を補完する機
能が与えられた宿主細胞内で複製が起こり得る。
【０１７５】 ベクターは一般に、組み換えベクターの構成物を含む細胞の部分母集団の選択
を可能とする選択性マーカーを含む。このマーカーは、ここに記載される核酸分
子を含む同一のベクター内か、又は別のベクター中に含まれることができる。マ
ーカーには、原核生物宿主細胞のためのテトラサイクリン又はアンピシリン−抵
抗遺伝子、及び真核生物宿主細胞のためのジヒドロフォレート還元酵素又はネオ
マイシン耐性が含まれる。しかしながら、表現型特性の選択性を提供するマーカ
ーは何れの場合にも有効である。
【０１７６】 成熟タンパク質は、バクテリア、酵母、哺乳類の細胞、及び他の細胞において
、適切な調整配列の制御下で生成されることができるが、無細胞系転写及び翻訳
システムもまた、ここに記載されるＤＮＡ構成物から誘導されるＲＮＡを用い、
これらのタンパク質を生成するために用いることができる。
【０１７７】 ペプチドの分泌が必要とされる場合、これがＧＰＣＲのようなタンパク質を含
むマルチ膜貫通ドメイン内で達成されることは難しく、適切な分泌信号がベクタ
ー中に組み込まれる。信号配列は、これらのペプチドに内生であるか、又はペプ
チドに非相同であり得る。
【０１７８】 ペプチドが媒体内で分泌されない場合、典型的にはＧＰＣＲの場合、タンパク
質は、凍結融解、超音波処理、機械的破壊、分解試薬等の標準的な破壊操作によ
って、宿主細胞から単離されることができる。ペプチドは、硫酸アンモニウム沈
降、酸抽出、又はアニオン又はカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロー
スクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマト
グラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、レクチンクロマトグラフ
ィ、又は高速液体クロマトグラフィを含む、公知の精製方法によって、回収、精
製されることができる。
【０１７９】 また、ここに記載されているペプチドの組み換え製造の宿主細胞に依存して、
ペプチドは種々のグリコシル化パターンを有し、細胞に依存して、バクテリア内
で製造される際にグリコシル化されないかもしれないことが理解される。さらに
、ペプチドは、ホストを媒介する過程の結果として、いくつかの場合で最初に修
飾されたメチオニンを含むものであり得る。
【０１８０】ベクター及び宿主細胞の使用 ここに記載されているペプチドを表現している組み換え宿主細胞には、種々の
使用用途がある。まず、この細胞はＧＰＣＲタンパク、又はペプチドの生成に有
用であり、ＧＰＣＲタンパク質又はフラグメントを必要量生成するために、さら
に精製を行うことができる。このため、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチ
ドの生成に有用である。
【０１８１】 宿主細胞は、ＧＰＣＲタンパク質、又はＧＰＣＲタンパク質フラグメントに関
連している細胞系のアッセイ、例えば上記したもの、同様に当業者において周知
の他の形態のものの実行において有用である。このため、天然のＧＰＣＲタンパ
ク質を表現している組み換え宿主細胞は、ＧＰＣＲタンパク質機能を促進又は阻
害する化合物のアッセイに有用である。
【０１８２】 宿主細胞はまた、機能的な影響を受けるＧＰＣＲタンパク質変異体を同定する
ために有用である。変異が自然に生じて病理を引き起こすような場合、突然変異
を含む宿主細胞は、天然のＧＰＣＲタンパク質の効果を示さずに、ＧＰＣＲタン
パク質変異体に要求される効果（例えば、機能を促進、又は阻害）を持つ化合物
のアッセイに有用である。
【０１８３】 遺伝子的に工作された宿主細胞は、さらにヒト以外の遺伝子組み換え動物を生
産するために用いることができる。遺伝子組み換え動物は、好適には哺乳類であ
り、例えば、１以上の細胞が組み換え遺伝子を含んだ、ラット又はマウスのよう
な齧歯動物である。組み換え遺伝子は、成長中の遺伝子組み換え動物の細胞のゲ
ノムに組み込まれ、１以上の細胞型又は組織において、成熟した動物のゲノム中
に残存する外生のＤＮＡである。これらの動物は、ＧＰＣＲタンパク質の機能の
研究、及びＧＰＣＲタンパク質活性のモジュレータの同定及び評価に有用である
。遺伝子組み換え動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、羊、犬、牛、ヤギ
、鶏、及び両生類が含まれる。
【０１８４】 遺伝子組み換え動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス
感染によって、受精卵母細胞の雄性前核細胞内に核酸分子を導入し、卵母細胞が
偽妊娠性の雌性育成動物中で育成されることにより作製される。何れのＧＰＣＲ
タンパク質ヌクレオチド配列も、マウスのようなヒト以外の動物のゲノム中に組
み換え遺伝子として導入されることができる。
【０１８５】 発現ベクターに有用な調整配列、又は他の配列は、何れも組み換え遺伝子配列
の一部分を形成することができる。イントロン配列及びポリアデニル化信号が、
すでに含まれていない場合には、これも含まれる。組織特異性調整配列は、特定
の細胞に対しＧＰＣＲタンパク質が直接発現するために、組み換え遺伝子に有効
に結合されることができる。
【０１８６】 受胎操作及びマイクロインジェクションを通して、遺伝子組み換え動物を生産
する方法、特にマウスのような動物を用いる方法は、当業界において一般化され
ており、例えば、U.S. Patent Nos. 4,736,866、及び 4,870,009, by Leder et
al., U.S. Patent No. 4,873,191 by Wagner et al. and in Hogan, B., Manipu
lating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, N.Y., 1986) に記載されている。また、同様の方法が、他の遺伝子
組み換え動物の生産のために用いられている。最初の遺伝子組み換え動物は、ゲ
ノム中の組み換え遺伝子の存在及び／又は動物の組織や細胞内での遺伝子組み換
えｍＲＮＡの発現に基づいて確認されることができる。最初の遺伝子組み換え動
物は、その後、さらに組み換え遺伝子を有する動物を繁殖するために用いられる
ことができる。その上、組み換え遺伝子を有している遺伝子組み換え動物は、さ
らに他の組み換え遺伝子を有する他の遺伝子組み換え動物へと生育されることが
できる。遺伝子組み換え動物はまた、ここに記載されている相同的な組み換え宿
主細胞を用いて製造された、全ての動物又は動物の組織を含む。
【０１８７】 他の例では、ヒト以外の遺伝子組み換え動物は、組み換え遺伝子の調節された
発現を行う選択システムを含むものとして生産されることができる。このような
システムの１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナ
ーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムについての記載
は、例えば、Lakso et al. PNAS 89:6232-6236 (1992)参照。リコンビナーゼシ
ステムのもう一つの例は、Ｓ. ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼシ
ステムである (O'Gorman et al. Science 251:1351-1355 (1991)。ｃｒｅ／ｌｏ
ｘＰリコンビナーゼシステムが組み換え遺伝子の発現の調節に用いられる場合は
、動物において、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び選択されたタンパク質の両方をコー
ド化している組み換え遺伝子が含まれていることが必要である。このような動物
は、例えば、一方は選択されたタンパク質をコード化した組み換え遺伝子を持ち
、他方はリコンビナーゼをコード化した組み換え遺伝子を持った２つの組み換え
遺伝子動物を交配させることにより、「二重」遺伝子組み換え動物を構成するこ
とによって提供される。
【０１８８】 ここに記載されるヒト以外の遺伝子組み換え動物のクローンは、また、Wilmut
, I. et al. Nature 385:810-813 (1997)、及びPCT International Publication
Nos. WO 97/07668 and WO 97/07669に記載されている方法に従って生産される
ことができる。簡単に述べると、遺伝子組み換え動物からの細胞、例えば体細胞
は、単離されて、成長サイクルから出てＧ０相に入れられるように誘導すること
ができる。静止細胞は、例えば、電気パルスの使用によって、単離された静止細
胞と同種の動物の細胞核を取り除かれた卵母細胞に融合されることができる。再
構成された卵母細胞は、桑実胚又は芽細胞に発達するように培養され、その後、
偽妊娠性の雌性育成動物中に移される。この雌性育成動物から誕生する子孫は、
細胞、例えば体細胞を単離した動物のクローンとなる。
【０１８９】 ここに記載されているペプチドを表現する組み換え細胞を含んだ遺伝子組み換
え動物は、in vivoの環境で、ここに記載したようなアッセイを行うために有用
である。したがって、生体内に存在し、リガンド結合、ＧＰＣＲタンパク質活性
化、信号伝達に影響を与えている各種の生理学的ファクターは、in vitroの無細
胞系又は細胞系のアッセイでは明らかにならないかもしれない。このため、これ
らは、リガンド相互作用、ＧＰＣＲタンパク質機能及びリガンド相互作用に対す
る特定の変異体ＧＰＣＲタンパク質の影響、及びキメラＧＰＣＲタンパク質の影
響を含むＧＰＣＲタンパク質機能を、in vivoでアッセイするための、ヒト以外
の遺伝子組み換え動物を提供するために有用である。また、実質的に又は完全に
一つ以上のＧＰＣＲタンパク質機能を除去する突然変異である、ｎｕｌｌ変異の
影響を評価することも可能である。
【０１９０】 本明細書において、上に記載された全ての刊行物及び特許は、ここに参考とし
て折り込まれている。本発明に記載された方法及びシステムの各種修正及び変形
は、本発明の範囲及び精神から外れない限り、当業者において明らかなものであ
る。本発明は、特定の好適な具体例に関連して記述されているが、特許請求の範
囲に記載された発明は、このような特定の実施例に不当に限定されないと理解さ
れるべきである。実際に、本発明を実施するための上記方法の各種変形は、分子
生物学又は関連分野の当業者において明らかであり、このようなものも特許請求
の範囲に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明のＧＰＣＲをコード化するｃＤＮＡ分子又は転写配列のヌクレ
オチド配列を示す。さらにここでは、ＡＴＧ開始、終止、及び組織分布のような
構造及び機能情報が示され、これを利用してこの分子配列に基づく発明の特定用
途を容易に決定することができる（本発明のＧＰＣＲは、甲状腺、腎臓、肝臓、
肺、白血球、胎盤、胎児の脳、睾丸、心臓、膵臓で発現することがｃＤＮＡ検索
により確認された（図１））。
【図２】 図２は、本発明のＧＰＣＲの予測アミノ酸配列を示す。さらにここでは、タン
パク質ファミリー、機能、変更部位のような構造及び機能情報が示され、これを
利用してこの分子配列に基づく発明の特定用途、及び本発明のタンパク質の重要
なフラグメントを容易に決定することができる。
【図３】 図３は、本発明のＧＰＣＲタンパク質をコード化している遺伝子領域のゲノム
配列を示す。さらにここでは、イントロン／エクソン構造、プロモーター位置等
のような構造及び機能情報が示され、この分子配列に基づく発明の特定用途、プ
ローブ及びプライマーの設計、及び非相同遺伝子発現の制御に用いるための重要
なフラグメントを容易に決定することができる。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｂ０６５ Ｃ１２Ｍ 1/00 1/19 ４Ｃ０８４ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｈ０４５ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 Ｆ 33/566 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クラフチク，アニバル アメリカ合衆国 メリーランド州 20850 ロックビル，ウェスト グーデ ドライ ブ 45，セレーラ内 (72)発明者 ディーアイ，フランセスコ，バレンティナ アメリカ合衆国 メリーランド州 20850 ロックビル，ウェスト グーデ ドライ ブ 45，セレーラ内 (72)発明者 ビーズリー，エレン，エム アメリカ合衆国 メリーランド州 20850 ロックビル，ウェスト グーデ ドライ ブ 45，セレーラ内 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB03 BB20 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB04 4B024 AA01 AA11 AA19 BA63 CA04 CA09 DA02 EA04 GA11 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 FA15 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ05 QQ13 QQ41 QR31 QR55 QR77 QR80 QR82 QS34 4B064 AG20 CA01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA46X AA50X AA90X AA91X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA17 NA14 ZC41 ZC42 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA50 DA75 EA50 FA72 【要約の続き】

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記グループから選択されるアミノ酸配列から成る単離ペプ
    チド。 （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列; （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配
    列であって、該対立変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）
    に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
    る核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列; （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配
    列であって、該オルトログは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）
    に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
    る核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列;及び （ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、
    該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とする
    アミノ酸配列。
  2. 【請求項２】 下記グループから選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチ
    ド。 （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列; （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配
    列であって、該対立変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）
    に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
    る核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列; （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配
    列であって、該オルトログは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）
    に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
    る核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列;及び （ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、
    該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とする
    アミノ酸配列。
  3. 【請求項３】 請求項２記載のペプチドに選択的に結合する単離抗体。
  4. 【請求項４】 下記グループから選択されるヌクレオチド配列から成る単離
    核酸分子。 （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチ
    ド配列; （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体をコード化す
    るヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（
    転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件
    下でハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチド配列; （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログをコード化す
    るヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（
    転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件
    下でハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチド配列;及び （ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化
    するヌクレオチド配列であって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接する
    アミノ酸を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。 （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
  5. 【請求項５】 下記グループから選択されるヌクレオチド配列を含む単離核
    酸分子。 （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチ
    ド配列; （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体をコード化す
    るヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（
    転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件
    下でハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチド配列; （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログをコード化す
    るヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（
    転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件
    下でハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチド配列;及び （ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化
    するヌクレオチド配列であって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接する
    アミノ酸を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。 （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
  6. 【請求項６】 請求項５記載の核酸分子を含む遺伝子チップ。
  7. 【請求項７】 請求項５記載の核酸分子を含むヒト以外の遺伝子組み換え動
    物。
  8. 【請求項８】 請求項５記載の核酸分子を含む核酸ベクター。
  9. 【請求項９】 請求項８記載のベクターを含む宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 請求項１記載の何れかのペプチドを製造する方法であって
    、（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を宿
    主細胞内に導入し、ペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細
    胞を培養する方法。
  11. 【請求項１１】 請求項２記載の何れかのペプチドを製造する方法であって
    、（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を宿
    主細胞内に導入し、ペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細
    胞を培養する方法。
  12. 【請求項１２】 サンプル中における請求項２記載の何れかのペプチドの存
    在を検出する方法であって、サンプル中の該ペプチドの存在を特異的に検出する
    試薬とサンプルとを接触させ、該ペプチドの存在を検出する方法。
  13. 【請求項１３】 サンプル中における請求項５記載の核酸分子の存在を検出
    する方法であって、ストリンジェントな条件下で該核酸分子にハイブリダイズす
    るオリゴヌクレオチドとサンプルとを接触させ、サンプル中で該核酸分子とオリ
    ゴヌクレオチドが結合するかどうかを判定する方法。
  14. 【請求項１４】 請求項２記載のペプチドのモジュレータを同定する方法で
    あって、該ペプチドと試薬とを接触させ、該試薬が該ペプチドの機能又は活性を
    変調したかどうかを判定する方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１４記載の方法において、前記試薬は前記ペプチド
    を発現する発現ベクターを含む宿主細胞に対して与えられる方法。
  16. 【請求項１６】 請求項２に記載の何れかのペプチドに結合する試薬を同定
    する方法であって、ペプチドと試薬とを接触させ、接触混合物中にペプチドと試
    薬とが結合した複合体が形成されるかどうかをアッセイする方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１６記載の方法により同定された試薬と、薬学的に
    許容可能なそれらの担体とを含む薬剤組成物。
  18. 【請求項１８】 ヒトＧタンパク質共役受容体により媒介される疾患又は症
    状を治療する方法であって、請求項１６記載の方法で同定された試薬を薬学的に
    有効な量、患者に投与する方法。
  19. 【請求項１９】 請求項２に記載のペプチドの発現のモジュレータを同定す
    る方法であって、該ペプチドを発現する細胞と試薬とを接触させ、該試薬が該ペ
    プチドの発現を変調したかどうかを測定する方法。
  20. 【請求項２０】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列と少なくと
    も７０％の相同性を持つアミノ酸配列を有する単離ヒトＧタンパク質共役受容体
    ペプチド。
  21. 【請求項２１】 請求項２０のペプチドにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に
    示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を持つアミノ酸配列を有する
    ペプチド。
  22. 【請求項２２】 ヒトＧタンパク質共役受容体ペプチドをコード化している
    単離核酸分子であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）に示さ
    れる核酸分子と少なくとも８０％の相同性を有している核酸分子。
  23. 【請求項２３】 請求項２２の核酸分子において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（
    転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子と少なくとも９０％の相同性を有し
    ている核酸分子。
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