JP2023518412A - 酸性プロテアーゼを使用するペグフィルグラスチムの遊離ｎ末端の決定 - Google Patents

酸性プロテアーゼを使用するペグフィルグラスチムの遊離ｎ末端の決定 Download PDF

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Abstract

本開示は、治療用タンパク質上でのＮ末端修飾の存在、及び／又はフィルグラスチム（従って、ＰＥＧ化バージョンは、ペグフィルグラスチムである）等の治療用タンパク質のＮ末端でのＰＥＧ化等のＮ末端修飾の効率を決定するための材料及び方法を提供する。

Description

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本開示の一部である配列表を、テキストファイルとして、本明細書と同時に提出している。この配列表を含むテキストファイルの名称は、２０２１年３月１８日に作成した「５５２００＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、サイズは２，０６４バイトである。この配列表の主題は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））は、ＰＥＧ－アルデヒドとの反応によりフィルグラスチム（顆粒球コロニー刺激因子；Ｇ－ＣＳＦ、ＧＣＳＦ）のＮ末端アミン上で連結が生じる条件を使用して、このフィルグラスチムにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを付着させることにより製造されている。しかしながら、たとえ特殊な条件を使用しても、ある程度の割合のＰＥＧ－アルデヒドが、フィルグラスチム中の他の第１級アミン基と反応する可能性がある。フィルグラスチム分子は、５つの第１級アミン基を含んでおり、最初の且つ最も望ましいものは、Ｎ末端上に位置しているが、他の４つは、それぞれ、１７位、２４位、３５位、及び４１位でのリシン残基の側鎖上に位置している。ＰＥＧ化が、リシン残基の側鎖ではなく、たしかにＮ末端で起きていると決定するためには、分析方法は、Ｎ末端と全てのリシン残基とを区別可能でなければならず、これらのリシン残基の中でも、Ｌｙｓ－１７は、Ｎ末端に近いことから最も困難である。ＰＥＧが様々な部位に存在する場合には、ＰＥＧ化フィルグラスチムをクロマトグラフィーで分離することは困難である。従って、断片化技術を適用して、ＰＥＧ化フィルグラスチムをより小さい断片へと開裂しなければならない。ＰＥＧの大きいサイズ（約２０ｋＤａ）及びその不均質な性質に起因して、ＰＥＧが様々な部位に位置しているフィルグラスチム断片の分離は、依然として困難なままである。例えば、ＰＥＧ分子がＮ末端（例えば、存在する場合にはＮ末端メチオニン）に付着しているか、又は例えばＬｙｓ－１７で付着しているかを区別するために、これら２つの残基を、化学的方法又は酵素的方法のいずれかにより分離しなければならない。歴史的に、Ｅｄｍａｎ分解を使用して修飾ポリペプチドのＮ末端ＰＥＧ化が評価されてきたが、当該技術分野では、フィルグラスチムのＮ末端上でのＰＥＧ化又は他のコンジュゲーションの効率を評価するためのさらなる方法が必要とされている。
本明細書で説明されているように、本開示は、様々な実施形態において、治療用タンパク質上でのＮ末端修飾の存在を決定するための、及び／又はフィルグラスチム等の治療用タンパク質のＮ末端でのＮ末端修飾（例えばＰＥＧ化；従って、ＰＥＧ化バージョンは、フィルグラスチムである）の効率を決定するための材料及び方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、ポリペプチドの非修飾（例えば「遊離」）Ｎ末端の量を測定する方法であって、（ａ）このポリペプチドを含むサンプルと、非特異的プロテアーゼとを、このポリペプチド内の１箇所又は複数箇所の部位での開裂、及び１位でのＮ末端アミノ酸と最初のリシンアミノ酸との間での１回だけの開裂を可能にする条件下でインキュベートする工程；（ｂ）工程（ａ）で生成された開裂生成物を分離する工程；並びにコントロール標準と比較することにより、このポリペプチドの非修飾の遊離Ｎ末端の量を測定する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、このポリペプチドは、組換え体である。
一実施形態では、本開示は、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ポリペプチドの非修飾（例えば「遊離」）Ｎ末端の量を測定する方法であって、（ａ）このＧ－ＣＳＦポリペプチドを含むサンプルと、非特異的プロテアーゼとを、このＧ－ＣＳＦポリペプチド内の１箇所又は複数箇所の部位での開裂、及び１位でのＮ末端メチオニンと１６位でのリシンとの間での１回だけの開裂を可能にする条件下でインキュベートする工程；（ｂ）工程（ａ）で生成された開裂生成物を分離する工程；並びに（ｃ）コントロール標準と比較することにより、このＧ－ＣＳＦポリペプチドの非修飾の遊離Ｎ末端の量を測定する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、このＧ－ＣＳＦポリペプチドは、組換え体である。
他の実施形態では、前述した方法であって、前記サンプルは、修飾Ｇ－ＣＳＦポリペプチドと、非修飾Ｇ－ＣＳＦポリペプチドとの混合物を含み、この修飾Ｇ－ＣＳＦポリペプチドは、少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾を含む、方法が提供される。
さらに他の実施形態では、前述した方法であって、Ｇ－ＣＳＦポリペプチドは、ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））、ペグフィルグラスチム－ｊｍｄｂ（Ｆｕｌｐｈｉｌａ（登録商標））、ＩＮＮ－ペグフィルグラスチム（Ｐｅｌｇｒａｚ（登録商標））、Ｌａｐｅｌｇａ（登録商標）、Ｐｅｌｍｅｇ（登録商標）、ペグフィルグラスチム－ｃｂｑｖ（Ｕｄｅｎｙｃａ（登録商標））、ペグフィルグラスチム－ｂｍｅｚ（Ｚｉｅｘｔｅｎｚｏ（登録商標））、及びＧｒａｓｕｓｔｅｋ（登録商標）からなる群から選択される、方法が提供される。一実施形態では、Ｇ－ＣＳＦポリペプチドは、ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））である。
本開示はまた、様々な実施形態において、前述した方法であって、非特異的プロテアーゼは、１５位でのロイシンと、１６位でのロイシンとの間を開裂し、１５個のアミノ酸長のペプチド（ペプチドＭ１－Ｌ１５）が生成される、方法も提供する。
他の実施形態では、前述した方法であって、非特異的プロテアーゼは、ペプシンである、方法が提供される。
本開示は、様々な実施形態において、前述した方法であって、工程（ａ）での条件は、（ａ）約１．５～約４．０のｐＨで、（ｂ）約２５℃～約６０℃の温度で、及び（ｃ）約５分～約６０分の時間にわたり、インキュベートすることを含む、方法を提供する。一実施形態では、この条件は、（ａ）約２．２のｐＨで、（ｂ）約３７℃の温度で、及び（ｃ）約１５分の時間にわたり、インキュベートすることを含む。
さらに他の実施形態では、前述した方法であって、工程（ｂ）の分離を、ペプチドＭ１－Ｌ１５の他の開裂生成物からの分離を可能にする条件下で実行する、方法が提供される。一実施形態では、工程（ｂ）の分離を、クロマトグラフィー及び電気泳動から選択される方法により実行する。別の実施形態では、このクロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）からなる群から選択される。別の実施形態では、このＨＰＬＣは、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）である。さらに他の実施形態では、クロマトグラフィーは、カラムと、約０．０１ｖ／ｖ％～約０．２ｖ／ｖ％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とを含む。関連の実施形態では、このＴＦＡの濃度は、約０．０２ｖ／ｖ％～約０．０３ｖ／ｖ％である。さらに別の実施形態では、このＴＦＡの濃度は、約０．０２５ｖ／ｖ％である。
他の実施形態では、前述した方法であって、測定する工程（ｃ）を質量分析により実行する方法が提供される。一実施形態では、この質量分析は、エレクトロスプレーＭＳ、及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（Ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ－ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）から選択される。
さらに他の実施形態では、前述した方法であって、コントロール標準は、既知の量の修飾Ｇ－ＣＳＦポリペプチドと、既知の量の非修飾Ｇ－ＣＳＦポリペプチドとを含む、方法が提供される。
本開示は、一実施形態において、ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））の非ＰＥＧ化遊離Ｎ末端の量を測定する方法であって、（ａ）ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））を含むサンプルと、非特異的プロテアーゼとを、このペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））内の１箇所又は複数箇所の部位での開裂、及び１位でのＮ末端メチオニンと１６位でのリシンとの間での１回だけの開裂を可能にする条件下でインキュベートする工程であり、前記条件は、（ａ）約２．２のｐＨで、（ｂ）約３７℃の温度で、及び（ｃ）約１５分の時間にわたり、インキュベートすることを含む、インキュベートする工程；（ｂ）工程（ａ）で生成された開裂生成物を、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）により分離する工程；並びに（ｃ）コントロール標準と比較することにより、ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））の非ＰＥＧ化遊離Ｎ末端の量を測定する工程を含む方法を提供する。
潜在的なＰＥＧ化部位を示すペグフィルグラスチムの配列（配列番号１）を示す。 フィルグラスチム及びペグフィルグラスチムに関するキモトリプシン消化物の比較を示す。 主要なＮ末端ペプチドＭ１－Ｌ１５が生成されたペプシン消化を示す、フィルグラスチムのペプチドマッピングプロファイルを示す。クロマトグラムを、３０分での２％～３５％アセトニトリルのアセトニトリル勾配によるＡｇｉｌｅｎｔ １２６０システムで得た。移動相は、０．０２％（ｖ／ｖ）のＴＦＡを含んでいた。 ペプシンで消化されたフィルグラスチム及びペグフィルグラスチムのペプチドマッププロファイルの比較を示す。 ６つの異なるＵＰＬＣカラムロットでの０．０２％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ溶離液による、ペグフィルグラスチムと、５％フィルグラスチムが添加されたペグフィルグラスチムとの重複プロファイルを示す。 ６つの異なるＵＰＬＣカラムロットでの０．０２５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ溶離液による、ペグフィルグラスチムと、５％フィルグラスチムが添加されたペグフィルグラスチムとの重複プロファイルを示す。 ４つの異なるＵＰＬＣカラムロットでの０．０３％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ溶離液による、ペグフィルグラスチム（黒色のトレース）と、５％フィルグラスチムが添加されたペグフィルグラスチム（青色のトレース）との重複プロファイルを示す。 溶離液中の０．０２５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡによる、５％フィルグラスチム参照標準が添加されたペグフィルグラスチム参照標準のプロファイルを示す。 ペグフィルグラスチム、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ、Ｅｐｏｇｅｎ、及びロミプロスチムのペプシン消化物のクロマトグラムの比較を示す。 各添加レベルに関する遊離Ｎ末端メチオニンの決定された％に関するプロットを示す。 各レベルで決定された遊離Ｎ末端メチオニンの％に関する残差プロットを示す。 レベル３（約２％遊離Ｎ末端メチオニン）サンプルクロマトグラムの安定性の比較を示す。 （図１１A）図１１Ａは、総面積に関するロバストネスを示す。 （図１１Ｂ）ノイズ（ピーク間）に関するロバストネスを示す。 （図１１Ｃ）Ｐ２ ＲＴに関するロバストネスを示す。 （図１１Ｄ）Ｐ２面積に関するロバストネスを示す。 （図１１Ｅ）Ｐ３ ＲＴに関するロバストネスを示す。 （図１１Ｆ）Ｐ３面積に関するロバストネスを示す。 （図１１Ｇ）Ｐ１ ＲＴに関するロバストネスを示す。 遊離Ｎ末端メチオニンの％決定のロバストネスを示す。
本開示は、治療用タンパク質上でのＮ末端修飾の存在を決定するのに、及び／又はフィルグラスチム等の治療用タンパク質のＮ末端でのＮ末端修飾（例えば、一実施形態ではＰＥＧ化；従って、ＰＥＧ化バージョンは、ペグフィルグラスチムである）の効率を決定するのに有用な方法及び材料を提供することにより、当該技術分野での前述の必要性に対処する。
様々な実施形態では、ペグフィルグラスチムを、酸性条件下において、非特異的プロテアーゼであるペプシンにより消化させる。消化されたペプチドを、紫外性（ＵＶ）検出を備えた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）により分離する。Ｎ末端での１５個の残基を含むタンパク質分解ペプチドを、ペグフィルグラスチムサンプル中において既知の量のフィルグラスチムを添加することにより、標準的な検出方法による遊離Ｎ末端メチオニンの定量に使用する。サンプルのペプシンペプチドマッププロファイルを、ペグフィルグラスチム参照標準と比較して、同一性を確認する。
定義
本明細書で使用される場合、「フィルグラスチム」は、フィルグラスチム（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））を指しており、「Ｇ－ＣＳＦ」と互換的に使用され得る。本開示により同様に企図されるバイオ後続品として、フィルグラスチム－ａａｆｉ（Ｎｉｖｅｓｔｙｍ（登録商標））、ｔｂｏ－フィルグラスチム（Ｇｒａｎｉｘ（登録商標））、フィルグラスチム－ｓｎｄｚ（Ｚａｒｘｉｏ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ペグフィルグラスチム」は、ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））を指しており、フィルグラスチムのＰＥＧ化バージョンである。本開示により同様に企図されるバイオ後続品として、ペグフィルグラスチム－ｊｍｄｂ（Ｆｕｌｐｈｉｌａ（登録商標））、ＩＮＮ－ペグフィルグラスチム（Ｐｅｌｇｒａｚ（登録商標））、Ｌａｐｅｌｇａ（登録商標）、Ｐｅｌｍｅｇ（登録商標）、ペグフィルグラスチム－ｃｂｑｖ（Ｕｄｅｎｙｃａ（登録商標））、ペグフィルグラスチム－ｂｍｅｚ（Ｚｉｅｘｔｅｎｚｏ（登録商標））、及びＧｒａｓｕｓｔｅｋ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「Ｇ－ＣＳＦ」という用語は、「顆粒球コロニー刺激因子」を意味する。本明細書で使用される場合、Ｇ－ＣＳＦは、化学的に修飾されているか又は遺伝子的に修飾されており、且つ当該技術分野で既知の方法により、組換えにより産生され得る。Ｇ－ＣＳＦは修飾され得、例えば、ＰＥＧ（フィルグラスチム）又は他の分子により修飾され得る。一実施形態では、Ｇ－ＣＳＦは、Ｎ末端で修飾されている。別の実施形態では、Ｇ－ＣＳＦは、Ｎ末端メチオニンで修飾されている。別途記載されていない限り、Ｇ－ＣＳＦという用語は、フィルグラスチムを指しており、ＰＥＧ化Ｇ－ＣＳＦ又はＧ－ＣＳＦコンジュゲートという用語は、ペグフィルグラスチムを指している。
「少なくとも１」という語句は、本明細書で称される場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はより多くであり得る。
「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」は、工業生産から医薬まで多くの用途で使用されているポリエーテル化合物である。ＰＥＧはまた、その分子量に応じて、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）又はポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても既知である。ＰＥＧの構造は、一般的に、Ｈ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨと表される。
本明細書で使用される場合、「非特異的プロテアーゼ」という用語は、アミノ酸配列基質を厳密に必要とすることなく、タンパク質のより小さいポリペプチド又は単一のアミノ酸への分解であるタンパク質分解を触媒する酵素を意味する 本明細書で企図される、厳格な基質要件のない代表的な非特異的プロテアーゼとして、ペプシン（及びその前駆体ペプシノーゲン）、キモトリプシン、エラスターゼ、パパイン、プロテアーゼＸＩＩＩ型、及びサーモリシンが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合により連結されている少なくとも５つの天然に存在しているか又は天然には存在していないアミノ酸の任意の鎖を意味している。本明細書で使用される場合、「単離された」及び「精製する」という用語は、互換的に使用され、目的のタンパク質を含むサンプル中に存在している可能性がある異種要素（例えば、タンパク質又はＤＮＡ等の生体高分子）の量を、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％、又はより多く減少させることを意味する。異種タンパク質の存在を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動及び染色、並びに／又はＥＬＩＳＡアッセイ等の任意の適切な方法によりアッセイし得る。
非修飾ポリペプチドを測定する方法
本明細書で説明されているように、本開示は、一実施形態において、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ポリペプチドの非修飾の遊離Ｎ末端の量を測定する方法であって、（ａ）このＧ－ＣＳＦポリペプチドを含むサンプルと、非特異的プロテアーゼとを、このＧ－ＣＳＦポリペプチド内の１箇所又は複数箇所の部位での開裂、及び１位でのＮ末端メチオニンと１７位でのリシンとの間での１回だけの開裂を可能にする条件下でインキュベートする工程；（ｂ）工程（ａ）で生成された開裂生成物を分離する工程；並びに（ｃ）コントロール標準と比較することにより、このＧ－ＣＳＦポリペプチドの非修飾の遊離Ｎ末端の量を測定する工程を含む方法を提供する。
様々な他の実施形態では、本明細書で説明されている方法は、任意のポリペプチド（例えば、抗体等の治療用組換えポリペプチド）の遊離Ｎ末端の量を測定するのに有用である。
ＰＥＧ化は、アプタマー、酵素、タンパク質、低分子量薬物、及び抗体との多様なコンジュゲーションをもたらすための普遍的な治療技術として使用されており、このＰＥＧ化により、バイオ医薬品業界の臨床応用が広がっている。ＰＥＧ化とは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖が、タンパク質（治療用タンパク質）、ペプチド、又は任意の分子にコンジュゲートするプロセスのことである。ＰＥＧ化プロセスにより、治療用タンパク質の分子量が増加し、（そのため）このＰＥＧ化プロセスにより、この治療用タンパク質は、タンパク質分解酵素及び分解から保護され得、薬物動態が改善され得る。
本開示の一実施形態では、フィルグラスチムに関して、Ｎ末端ＰＥＧ化の効率が決定される。他の実施形態では、（ＰＥＧ化以外の）様々な他のＮ末端修飾が企図されており、この他のＮ末端修飾として、デキストラン及びヘパロサン等の多糖類が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＧに加えて、他のポリマー部分も、Ｇ－ＣＳＦとの有用なコンジュゲーションパートナーである。例えば、特に国際公開第０２／０９７６６号パンフレットでは、生物学的に活性なタンパク質と生体適合性ポリマー誘導体とのコンジュゲーションにより製造された生体適合性のタンパク質－ポリマー化合物が開示されている。この生体適合性ポリマーは、高度に反応性の分枝ポリマーであり、得られたコンジュゲートは、このポリマーとポリペプチドとの間に長いリンカーを含む。国際公開第０２／０９７６６号パンフレットに係る生体適合性ポリマーの例は、下記である：ＰＥＧ、ＰＰＧ、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリトリメチレングリコール、ポリ乳酸及びその誘導体、ポリアクリル酸及びその誘導体、ポリアミノ酸、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリ（Ｌ－リシン）、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、水溶性ポリマー、例えば、多糖、デキストラン、並びに非免疫原性ポリマー、例えば、ポリビニルアルコール、及びポリアクリルアミド。
国際公開第９６／１１９５３号パンフレットでは、Ｎ末端が化学的に修飾されているタンパク質化合物、及びその製造方法が説明されている。具体的には、Ｇ－ＣＳＦのＮ末端に水溶性ポリマーが共役することにより得られるＧ－ＣＳＦ組成物が説明されている。国際公開第９６／１１９５３号パンフレットで列挙されている水溶性ポリマーの例は、下記である：エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー若しくはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ＰＰＧホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、又はポリオキシエチル化ポリオール。他の修飾は、米国特許第８，２０７，１１２号明細書で説明されており、この明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許第５，８２４，７８４号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）で説明されているように、Ｎ末端修飾Ｇ－ＣＳＦ（例えばフィルグラスチム）及び還元的アルキル化方法（誘導体化に利用可能な様々なタイプの一次アミノ基の異なる反応性（リシン対Ｎ末端）を利用する）の両方の方法により、モノポリマー／タンパク質コンジュゲートの実質的に均質な混合物が得られる。「実質的に均質な」は、本明細書で使用される場合、観察されるポリマー／タンパク質コンジュゲート分子は、１種のポリマー部分を有するもののみであることを意味する。調製物は、未反応の（即ち、ポリマー部分を欠いている）タンパク質を含み得る。ペプチドマッピング及びＮ末端配列決定により確認されるように、且つ米国特許第５，８２４，７８４号明細書で説明されているように、少なくとも９０％のモノポリマー／タンパク質コンジュゲート及び最大１０％の未反応タンパク質である、調製物の一例が提供される。好ましくは、Ｎ末端モノＰＥＧ化物質は、（下記の実施例のように）調製物の少なくとも９５％であり、最も好ましくは、Ｎ末端モノＰＥＧ化物質は、調製物の少なくとも９９％以上である。モノポリマー／タンパク質コンジュゲートは、生物学的活性を有している。本明細書で提供される本「実質的に均質な」Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ－ＣＳＦ調製物は、均質な調製物の利点（例えば、ロット間薬物動態の予測可能性における臨床応用の容易さ）を示すのに十分に均質なものである。
化学療法誘発性好中球減少症（ＣＩＮ）は、骨髄抑制性化学療法の一般的で重篤な合併症である。この合併症は、有意な罹患率及び死亡率と関連しており、癌治療のコストを増加させる可能性がある。この場合には、免疫機能に重要な細胞を回復させるために、コロニー刺激因子が必要である。２０年以上にわたり、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ；フィルグラスチム）は、ＣＩＮの処置及び予防の柱となっており、様々な患者環境において好中球減少症のリスクを低減させ、発熱性好中球減少症の発症率を低下させ、感染の発症を低減させ、抗生物質による処置の必要性を低減させ、且つ好中球の回復を促進させることが分かっている。
フィルグラスチムは、組換え非ペグ化ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）類似体である。フィルグラスチムは、Ａｍｇｅｎから商品名Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）として販売されており（１９９８年に初めて承認されている）、且つＰｆｉｚｅｒからバイオ後続品薬剤であるＮｉｖｅｓｔｙｍ（登録商標）として販売されている。Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）／フィルグラスチムは、様々な適応症に承認されている。Ｓｉｃｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈにより販売されており且つ２０１２年８月２９日にＦＤＡにより承認されているｔｂｏ－フィルグラスチムは、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）と同一の有効成分を含んでおり、生物学的に類似しているが、短時間作用型に製剤化されている。ＦＤＡはまた、バイオ後続品Ｚａｒｘｉｏ（登録商標）（フィルグラスチム－ｓｎｄｚ）も承認しており、Ｎｅｕｐｏｇｅｎと同一条件での使用を示している。Ｚａｒｘｉｏ（登録商標）は、Ｓａｎｄｏｚから販売されている。
ペグフィルグラスチムは、組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）類似体であるフィルグラスチムのＰＥＧ化形態である。ペグフィルグラスチムは、数ある理由の中でも特に、骨髄抑制性抗癌処置を受けている非骨髄性癌患者における、発熱性好中球減少症で見られるような感染の発症を減少させるために使用される。フィルグラスチムの比較的短い循環半減期に起因して、２０ｋＤａのペグ部分を、フィルグラスチムのＮ末端に（メチオニン残基で）共有結合的にコンジュゲートさせて、この薬物のより長い作用型が開発されている。フィルグラスチムと比べて長い半減期及び遅い排出速度に起因して、ペグフィルグラスチムは、フィルグラスチムと比べて、必要な投与頻度が少ない。しかしながら、ペグフィルグラスチムは、フィルグラスチムと同一の生物学的活性を保持しており、同一のＧ－ＣＳＦ受容体に結合して、好中球の増殖、分化、及び活性化を刺激する。
Ａｍｇｅｎにより最初に開発されたペグフィルグラスチムは、２００２年にＦＤＡにより初めて承認され、Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）として販売された。ペグフィルグラスチムのいくつかのバイオ後続品（Ｆｕｌｐｈｉｌａ（登録商標）、Ｐｅｌｇｒａｚ（登録商標）又はＬａｐｅｌｇａ（登録商標）、Ｐｅｌｍｅｇ（登録商標）、Ｕｄｅｎｙｃａ（登録商標）、Ｚｉｅｘｔｅｎｚｏ（登録商標）、及びＧｒａｓｕｓｔｅｋ（登録商標））が、Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｎａｄａ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ（ＥＵ）及びＦＤＡにより同一の治療適応症に関して承認されている。
フィルグラスチム及びペグフィルグラスチムのアミノ酸配列は、下記の通りである：
Figure 2023518412000001
フィルグラスチムのＮ末端の１７個の残基は、ＭＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫ（配列番号２）である。これらの残基はいずれも、トリプシン（Ｋ及びＲの後ろで切断）、Ｌｙｓ－Ｃ（Ｋの後ろで切断）、Ｇｌｕ－Ｃ（Ｅの後ろで切断）、Ａｓｐ－Ｎ（Ｄの前で切断）、及びＡｒｇ－Ｃ（Ｒの後ろで切断）等の一般に使用されるプロテアーゼでは容易に開裂され得ない。結果として、Ｎ末端から１つずつ残基を開裂するためのペグフィルグラスチムの放出アッセイとして、Ｅｄｍａｎ分解（自動型Ｎ末端シーケンサーで実施される）が歴史的に使用されていた。非ＰＥＧ化遊離Ｎ末端は、１回目のＥｄｍａｎ分解サイクルで回収されたメチオニン残基により決定された。
本開示は、様々な実施形態において、Ｎ末端残基を開裂するための非特異的プロテアーゼの最初の使用であって、Ｎ末端メチオニンとＬｙｓ－１７との間に単一のクリーンカット（ｃｌｅａｎ ｃｕｔ）が生成される、最初の使用を提供する。ペプシンは、非特異的プロテアーゼであることから、２つの残基の間の様々な部位で潜在的に切断し得る。本明細書で説明されているように、配列番号２の残基Ｌｅｕ－１５とＬｅｕ－１６との間にクリーンカットを生成する条件が特定されている。加えて、ペプシンは、タンパク質が変性する酸性条件で作用することから、還元／アルキル化は不要であり、サンプル調製がはるかに簡便になる。得られるタンパク質分解ペプチドを、ある特定の実施形態では、逆相ＨＰＬＣで分離し、ＵＶ吸光度によりモニタリングする。本明細書では「Ｍ１－Ｌ１５」と称されるＮ末端ペプチドは、他のピークから十分に分離されており、遊離Ｎ末端の正確で再現性がより定量に使用される。溶出が遅いＰＥＧ化Ｎ末端ペプチドを、同定目的に使用し得る。
当該技術分野で既知であるように、ペプシンは、タンパク質又はポリペプチドをより小さいペプチド又はアミノ酸へと分解するエンドペプチダーゼである。ペプシンは、胃の内膜の主細胞中で産生されており、且つヒト及び多くの他の動物の消化器系における主要な消化酵素の１つであり、食品中のタンパク質の消化を助ける。ペプシンは、アスパラギン酸プロテアーゼであり、活性部位で触媒のアスパラギン酸を使用する。ペプシンは、ヒト消化器系における２種の主要なプロテアーゼの内の１つであり、他の２つは、キモトリプシン及びトリプシンである。消化のプロセス中に、これらの酵素（それぞれが特定のタイプのアミン酸の間の連結を切断することに特化している）は、協力して、食事タンパク質をその成分（即ち、小腸により容易に吸収され得るペプチド及びアミノ酸）へと分解する。ペプシンは、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びロイシン等の疎水性アミノ酸の間のペプチド結合の開裂において最も効率的である。ペプシンの酵素前駆体であるペプシノーゲンは、胃の壁中の主細胞から放出され、胃液の塩酸と混合することにより、ペプシノーゲンは活性化してペプシンとなる。
消化生成物の分離を、本開示によれば、多くの方法で達成し得る。例として、一部の実施形態によれば、クロマトグラフィー及び電気泳動が企図される。例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、及びイオン交換クロマトグラフィー。
本発明をさらに説明する前に、本発明は、説明されている特定の実施形態に限定されず、従って、当然のことながら多様であり得ることを理解しなければならない。同様に、本明細書で使用されている用語法は、特定の実施形態を説明することを目的とするのみであり、限定することは意図されていないことも理解しなければならず、なぜならば、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。
値の範囲が記載されている場合には、この範囲の上限と下限との間の介在値（別途文脈が明確に示す場合を除き、下限の単位の１０分の１まで）、及びこの指定された範囲のあらゆる他の指定の又は介在する値は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、この小さい範囲に含まれ得、且つこの指定された範囲で具体的に排除された任意の制限を条件として、本発明にも包含される。指定された範囲が、限界の一方又は両方を含む場合には、含まれているこれらの限界の一方又は両方を除く範囲も、本発明に含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有している。本明細書で説明されているものと類似の又は同等のあらゆる方法及び材料もまた、本発明の実施又は試験で使用し得るが、好ましい方法及び材料を本明細書で説明する。本明細書で言及されている全ての刊行物は、この刊行物の引用に関連する方法及び／又は材料を開示して説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合には、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、別途文脈が明確に示さない限り複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。そのため、例えば、「コンフォメーションスイッチングプローブ」への言及は、複数のそのようなコンフォメーションスイッチングプローブを含み、「マイクロ流体デバイス」への言及は、１つ又は複数のマイクロ流体デバイス及び当業者に既知のその等価物への言及を含み、以下同様である。さらに、特許請求の範囲が、任意の任意選択的要素等の任意の要素を除くように書かれている可能性があることにも留意されたい。従って、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙又は「消極的」限定の使用に関連して、「だけ」、「のみ」等のそのような排他的用語法を使用するための先行詞として役立つことが意図されている。
本開示を読む際に当業者に明らかであるように、本明細書で説明されている及び例示されている個別の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく他の幾つかの実施形態の内のいずれかの特徴から容易に分離され得るか又はこの特徴と容易に組み合わされ得る別個の成分及び特徴を有している。任意の列挙された方法を、列挙された事象の順に実行し得るか、又は論理的に可能である任意の他の順で実行し得る。このことは、全てのそのような組合せを支持することが意図されている。
実施例１
ペプシン消化、及び生成物の分離
Ａ．プロテアーゼ選択
図１は、ペグフィルグラスチムの配列を示しており、潜在的なＰＥＧ化部位を、赤色で強調している。Ｎ末端とリシン－１７とを区別するためには、Ｍｅｔ－１とＬｙｓ－１７との間で開裂が起きなければならない。一般的な特異的プロテアーゼに関する開裂部位は存在しないことから、ペプシン又はキモトリプシン等の非特異的プロテアーゼを使用した。
ペプシン及びキモトリプシンの評価から、キモトリプシンと比べてペプシンが有望であることが示された。図２で見られるように、フィルグラスチム及びペグフィルグラスチムのキモトリプシン消化物は、遊離Ｎ末端メチオニンのピークと他のペプチドのピークとが十分に分離されていないことが示された。加えて、ペプシンは、タンパク質が変性される際に酸性ｐＨで作用することから、還元／アルキル化は不要であり、試料調製がはるかに容易で単純になる。
Ｂ．フィルグラスチムのペプシン消化
フィルグラスチム又はペグフィルグラスチムのペプシン消化を実施するために、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質サンプル１２０μＬを使用し、０．３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ２．２）６０μＬを添加し、０．４８ｍｇ／ｍＬのペプシン溶液１０μＬを添加し、続いて、５分にわたり５０℃でインキュベートしたか、又は１５分にわたり３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、この消化を、１ＮのＮａＯＨ１０μＬを添加することによりクエンチした。
フィルグラスチム参照標準（ＲＳ）で消化条件を試験して、遊離Ｎ末端ペプチドを最大化した。消化条件を、５分にわたる５０℃又は１５分にわたる３７℃で最適化し、同様の結果が得られた。１５分にわたる３７℃の最終条件を選択し、なぜならば、より長い消化時間と関連して相対誤差がより少なく且つよりロバストな条件になる可能性が高いからである。
Ｎ末端領域がペプシンによりどのように消化されるかを確認するために、フィルグラスチム（ＲＳ）を消化し、５０℃でＷａｔｅｒｓ ＣＳＨ １００×２．１ｍｍカラムを使用し、各移動相において０．０２％（ｖ／ｖ）のＴＦＡを含むアセトニトリル勾配により０．２ｍＬ／分で溶出させるＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣシステムで分析した。このＨＰＬＣは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐシステムに直接接続されており、質量及びＭＳ／ＭＳデータを収集して、溶出した各ペプチドを同定した。
図３は、ペプシンで消化されたフィルグラスチムＲＳのペプチドマッププロファイルを示す。フィルグラスチムのペプシン消化により、主要なＮ末端ペプチドＭ１－Ｌ１５が生成された。このペプチドは、クロマトグラム中において、他のペプチドからいかなる干渉も受けることなく十分に分離されており、このことから、遊離Ｎ末端メチオニンを定量するためにこのペプチドを使用する可能性が示唆される。他のＮ末端ペプチド（例えば、Ｍ１－Ｌ１０、Ｍ１－Ｓ１３、Ｍ１－Ｆ１４（ペプチドＦ１１４－Ｅ１２４と共溶出する）、及びＭ１－Ｌ１６（ペプチドＬ５１～Ｌ７６と共溶出する））も観察されるが、各ペプチドの質量分析強度で見られるように、これらは全て、Ｍ１－Ｌ１５ペプチドと比較して存在量が低い。これらの存在量が低い４種のペプチドは、定量精度に有意に影響を及ぼさないはずであることから、遊離Ｎ末端メチオニンの定量では考慮しなかった。
Ｃ．ペグフィルグラスチムのペプシン消化
ペグフィルグラスチムサンプルを、１５分わたり３７℃でペプシンにより消化し、ペプチドマッププロファイルを、フィルグラスチムのものと比較した（図４）。ペプチドを、オンライン質量分析検出により同定した。Ｎ末端遊離ペプチド（Ｍ１－Ｌ１５）の消失、及びＰＥＧ化Ｎ末端ペプチド（ＰＥＧ－Ｍ１－Ｌ１５）の出現を除いて、非常に類似しているプロファイルが得られており、このことから、ＰＥＧ化の存在はペプシン消化に影響を及ぼさないことが示された。ＰＥＧ化の不均一な性質に起因して、ペグフィルグラスチムでの非常に遅い溶出ピークに関する明確な質量を決定し得なかった。このピークを単離し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ及びＮ末端配列決定により分析した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより、質量約２３０００Ｄａで幅広いピークが得られ、Ｎ末端配列決定により、この配列がＮ末端Ｍ１－Ｌ１５であることを確認し、最初のサイクルでは、メチオニンの代わりにスレオニン（実際の２番目の残基）を観察した。
Ｄ．ペプシン消化のロバストネス
ペプシンの非特異的な性質に起因して、異なる供給源又はベンダーロットから得られたペプシン物質は、異なる活性を示す場合があり、従って、異なるペプチドマッププロファイルが作成されることが懸念される。ペプシン消化のロバストネスを試験するために、６種の異なる供給源から得られたペプシン物質を使用してフィルグラスチムサンプル（ロット１０３９５０２）を消化し、得られたクロマトグラムを比較した。６種のペプシン物質の説明を、表１に示す。
Figure 2023518412000002
クロマトグラムから、ペプシンを使用する消化は、ペプシン活性が２５００ユニット／ｍｇ以上である限りにおいて、ペプシンの供給源にかかわらず、ロバストであり、且つ再現性があることが示された。このデータセットで作成された様々なＮ末端ペプチドのＭＳ強度は、ペプシンの様々な供給源が使用される場合の消化の再現性及びＭ１－Ｌ１５の優位性を示す。
Ｅ．クロマトグラフィーによる分離
Ｎ末端ペプチドＭ１－Ｌ１５を使用して、ペグフィルグラスチム中の遊離Ｎ末端メチオニンを定量するためには、このペプチドを、他の全ての近くで溶出するペプチドから分離しなければならない。９５％のペグフィルグラスチム参照標準（ＲＳ）と５％のフィルグラスチムＲＳとを含むサンプルを調製し、このサンプルを使用して、クロマトグラフィーによる分離を最適化した。Ｗａｔｅｒｓ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）を使用した。ある程度の勾配の最適化後に、下記のクロマトグラフィー条件を選択した。
移動相Ａ：水中の０．０２５％のＴＦＡ
移動相Ｂ：アセトニトリル中の０．０２５％のＴＦＡ
カラム温度：５０℃
検出波長：２１４ｎｍ
流速：０．２ｍＬ／分
勾配：
Figure 2023518412000003
図５Ａ～５Ｃは、目的のペプチド付近のペプチドマッププロファイルを示しており、３種の異なるＴＦＡ濃度（０．０２、０．０２５、及び０．０３ｖ／ｖ％）での６種の異なるＵＰＬＣカラムロットを試験した。標識ピークのペプチド同定を、表２に示す。
Figure 2023518412000004
図５Ａ～５Ｃから、ペプチドＭ１－Ｌ１５と近傍のペプチド（Ｐ１－前及びＰ１－後）との分離は、使用されているカラムロットに依存することが明らかである。幸いなことに、移動相中のＴＦＡ濃度を変更することにより、これら３つのピークの分離を最適化し得る。特定のカラムロットにより２つのピークの共溶出が引き起こされる場合には、図５Ａ～５Ｃで例示されているように、ＴＦＡ濃度を０．０２％（ｖ／ｖ）から０．０３％（ｖ／ｖ）へと変更して分離を達成し得る。０．０２５％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ濃度を選択しており、なぜならば、６つ全てのカラムロットにおいて、他の２種の濃度と比較して、０．０２５％（ｖ／ｖ）のＴＦＡによりＰ１ピークの十分な分離が達成されたからである。
実施例２
方法の適格性
Ａ．特異性及びキャリーオーバー
特異性を確立するために、主要な参照ピーク（Ｐ２、Ｐ３、及びＰ４）、並びにいくつかの目的の近傍のピークを、オンライン質量分析（ＭＳ）検出により最初に同定した（図６）。おそらくｍＰＥＧ－アルデヒドの不均一な性質に起因して、ピークＰ４のマススペクトルから明確な質量を決定し得ない。セクション５．１．３で説明したように、Ｎ末端配列決定により、ピークＰ４はＰＥＧ－Ｍ１－Ｌ１５であることを確認した。
この試験方法が生成物関連の成分に特異的であることを確立するためには、ペプシンによる消化後のペグフィルグラスチム原薬（ＤＳ）に固有のクロマトグラフプロファイルを達成しなければならない。サイズが類似しているか又は同一箇所で製造された生成物（例えば、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（フィルグラスチム）、Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標）［エポエチンアルファ、（ＥＰＯ）］、及びＮｐｌａｔｅ（登録商標）（ロミプロスチム））を、ペグフィルグラスチムと並行して分析し、得られたクロマトグラムを図７に示す。これらのクロマトグラムは、明らかに異なっており、これらの生成物を区別するためのこのアッセイの特異性が確立されている。これらの生成物の中でも、Ｎｅｕｐｏｇｅｎは、Ｎ末端のＰＥＧ化のみがペグフィルグラスチムと異なっており、このことは、Ｎｅｕｐｏｇｅｎペプシン消化物中における参照ピークＰ４（ＰＥＧ化Ｎ末端ペプチド）の非存在及びピークＰ１（遊離Ｎ末端ペプチド）の出現により明確に区別され得る。
この方法のキャリーオーバーを評価するために、５％のフィルグラスチムＲＳが添加されている、消化されたペグフィルグラスチムＲＳの注入後に、酵素ブランクを注入した。添加されたペグフィルグラスチムＲＳサンプルと比較した、ブランク実行での各参照ピークに関して決定したピーク面積の相対パーセントに基づいて、キャリーオーバーを算出した。ブランク実行の前後両方での保持時間の領域では、ピークが検出されず、これらのピーク全てのキャリーオーバーは、０％である。
Ｂ．線形性
遊離Ｎ末端不純物のパーセントレベルに直接比例している試験結果を得るための（所与の範囲内での）アッセイ能力を決定するために、線形性実験を設計した。この方法の線形性を確立するために、表３で見られるように、０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、及び２．５％（それぞれ、最終的な遊離Ｎ末端メチオニンが約１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、及び３．０％となる）のレベルでフィルグラスチムＲＳが添加されているペグフィルグラスチムＲＳを、３重に消化して分析した（表４）。非添加ペグフィルグラスチムＲＳ分析（各線形性実行当たり２つの値）と併せて、線形性評価のために、合計６つのレベルが存在する。
Figure 2023518412000005
Figure 2023518412000006
図８において、遊離Ｎ末端メチオニンの％の決定されたレベルを、添加レベルに対してプロットした。線形回帰を実施して、傾き、ｙ切片、及びＲ２値を得る。同様に図９で示されているのは、残差プロットであり、これから、残差平方和及び残差標準偏差を算出する。表５は、調査した範囲内での測定の線形性に関するこれらの決定値を示す。
Figure 2023518412000007
Ｃ．精度（再現性／中間精度）
ペプチドマッププロファイル及び遊離Ｎ末端メチオニンの定量の両方に関して、再現性及び中間精度を評価した。ペプチドマッププロファイルの再現性及び中間精度を評価するために、各実行当たりの４種のサンプル注入及び４種のブランク注入による合計６回の実行を、２箇所の異なる検査室での２人の異なる分析者により、且つ３種の異なるカラムを使用して、４つの異なるＨＰＬＣシステムで実施した。各サンプル注入に関する曲線下総面積（ｔＡＵＣ）、ピーク面積（ｐＡＵＣ）、及び参照ピークの保持時間（ＲＴ）比（Ｐ２／Ｐ４及びＰ３／Ｐ４）、各酵素単独ブランク注入のピーク間ノイズ、並びにブラケティング（ｂｒａｃｋｅｔｉｎｇ）フィルグラスチムが添加された参照標準の保持時間の差違を記録しており、表６に示す。１回の実行当たりの保持時間及びピーク面積のパラメータの最高ＣＶ％は、それぞれ、０．３％及び７％未満である。これらの結果は、このペプチドマッププロファイルの良好な再現性を示す。
Figure 2023518412000008
遊離Ｎ末端メチオニン定量の再現性及び中間精度を評価するために、合計４回の実行を、２箇所の異なる検査室での２人の異なる分析者により、且つ３種の異なるカラムを使用して、４つの異なるＨＰＬＣシステムで、各実行において３重の分析にて、１．５％のフィルグラスチムが添加されているペグフィルグラスチムサンプルにより実施した。表７は、再現性標準偏差及び中間精度標準偏差に関するこれらの分析の結果を示す。
Figure 2023518412000009
Ｄ．精度
線形性実験で収集したデータを使用して、遊離Ｎ末端メチオニンの量の測定における本方法の精度を評価した。各サンプル中の遊離Ｎ末端メチオニンの正確な理論量を得るために、最初に、線形性評価中の６つのシステム適合性実行から非添加ペグフィルグラスチムＲＳにおける少量のＮ末端メチオニンを決定した（表８に示されているように、０．４７１％の平均であると決定した）。
Figure 2023518412000010
非添加ペグフィルグラスチムＲＳにおける低レベルの遊離Ｎ末端メチオニンに起因して、測定誤差は、添加サンプルの理論濃度の算出では無視してもよい。遊離Ｎ末端メチオニンの理論レベルを、下記式
（０．４７１％ ＶＰＦ＋１００％ ＶＦ）／（ＶＰＦ＋ＶＦ）
から、添加フィルグラスチムの量（ＶＦ）及び非添加ペグフィルグラスチムＲＳの量（ＶＰＦ）に基づいて算出し得る。
表９は、遊離Ｎ末端メチオニンの様々なレベルでの、サンプルの遊離Ｎ末端メチオニンの理論的な％と実験により決定された％とを比較する。精度を、３重の分析の平均の決定値から算出し、表９に百分率で表した。測定精度は、１．５％添加レベル及び全ての他の測定濃度に関して許容可能であることが分かった。
Figure 2023518412000011
Ｅ．範囲
１．０～３．０％の遊離Ｎ末端メチオニンレベルの範囲において、この報告で示されたデータは、許容可能な線形性、精度、及び精度を示しており、このことから、本方法は、この範囲において遊離Ｎ末端メチオニンの％を決定可能であることが示された。
Ｆ．検出限界（ＬＯＤ）及び定量限界（ＬＯＱ）
本明細書で説明されている一実施形態では、本方法のプロトコルは、各シークエンスにおいて、ペグフィルグラスチムＲＳの２回の注入、及び５％のフィルグラスチムＲＳが添加されているペグフィルグラスチムＲＳの２回の注入を実行することを必要とし、これにより、ペグフィルグラスチムＲＳ中のＮ末端メチオニンの％の決定が容易になる。この線形性評価は、３つのシークエンスで構成されており、ペグフィルグラスチムＲＳにおける遊離Ｎ末端メチオニンの％の６個の測定値が得られる。加えて、中間精度評価のための３回のさらなる実行により、６個のさらなる測定値が得られた。１２個の測定値の標準偏差を算出し、これらの標準偏差を使用して、下記方程式に従ってＬＯＤ及びＬＯＱを決定した。結果を、表１０に示す。
ＬＯＤ＝３．３σ
ＬＯＱ＝１０σ
Figure 2023518412000012
Ｇ．調製後のサンプルの安定性
分析前の冷却されたオートインジェクタ中の消化サンプルの安定性を実証するために、長いシークエンスの前後（１６時間間隔）及び２日目（４２時間間隔）に、２つの消化サンプルを注入した。得られたクロマトグラムには、有意差は見られない（図１０）。４℃で１６時間及び４℃で４２時間におけるサンプルの遊離Ｎ末端メチオニンの％の決定された差違は、０．４％未満であり（表１１）、このことから、サンプルは４℃で最大４２時間安定であることが示唆される。
Figure 2023518412000013
実施例３
ロバストネス
７因子設計実験（ｓｅｖｅｎ－ｆａｃｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）（ＤＯＥ）を実施して、本方法のロバストネスを評価した（表１２）。ＨＰＬＣカラム及び酵素のロット因子は、カテゴリカルであり、マトリックスを、Ｍｉｎｉｔａｂ（登録商標）１５．１．３０．０統計ソフトウェアで作成した。コントロールサンプル（１．５％のフィルグラスチムＲＳが添加されているペグフィルグラスチムＲＳ）の１回の実行当たり１つの分析を実施した。
Figure 2023518412000014
ペプチドマッププロファイルに関する本方法のロバストネスを評価するために、総ピーク面積、ピーク間ノイズ（ｐ間）、保持時間に関するＰ２／Ｐ４及びＰ３／Ｐ４比、並びに中心点実験（ｃｅｎｔｅｒ ｐｏｉｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）からのピーク面積の平均値を算出する。各パラメータに関する許容可能な範囲を、下記の方程式を使用して確立した。
許容可能な範囲＝中心点実験の平均±３＊（ＳｔｄＤｅｖ）＊（Ｍｎ）
ここで、Ｍｎ＝１．４０３は、中間精度測定値の乗数（ｎ＝２４）であり（Ｈａｈｎ ａｎｄ Ｍｅｅｋｅｒ，２０１１）、ＳｔｄＤｅｖは、中間精度実験から得られる標準偏差値である。図１１Ａ～１１Ｇで見られるように、４つの参照ピークの総ピーク面積、ノイズ（ｐ間）、ピーク面積、及び保持時間は全て、許容範囲内である。
遊離Ｎ末端メチオニンの決定に関する本方法のロバストネスを評価するために、中心点実験から決定された遊離Ｎ末端メチオニンの平均値を算出する。他の実験に関する許容可能な範囲を、下記の方程式から算出する。
許容可能な範囲＝中心点実験の平均±３＊（中間精度標準偏差）＊（Ｍｎ）
ここで、Ｍｎ＝１．６９８は、中間精度測定値の乗数（ｎ＝１２）である（Ｈａｈｎ，Ｇｅｒａｌｄ Ｊ．，ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｑ．Ｍｅｅｋｅｒ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ：ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒｓ．Ｖｏｌ．９２．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２０１１）。図１２で見られるように、決定された遊離Ｎ末端メチオニンの％は、全ての実験で許容可能な範囲内であり、Ｎ末端遊離メチオニンのレベルの決定での本方法のロバストネスが実証されている。
実施例４
代表的なプロトコル－材料及び方法
下記の材料及び方法は、上記の実施例でさらに開示されているように、ペグフィルグラスチムの同一性を確認するための、及び優れた特異性、精度、正確さ、線形性、ＬＯＤ、ＬＯＱ、範囲、及びロバストネスを有する遊離Ｎ末端メチオニンの％のレベルを決定するための代表的な方法を提供する。
ペグフィルグラスチムを、酸性条件下でペプシンにより消化させる。消化ペプチドを、逆相クロマトグラフィーで分離し、２１４ｎｍでのＵＶにより検出する。遊離Ｎ末端メチオニン（ＰＥＧなし）のパーセントを、ペグフィルグラスチムサンプル中で既知の量（５％）のフィルグラスチムを添加することにより決定する。サンプルのペプシンペプチドマッププロファイルを、ペグフィルグラスチム参照標準と比較して、同一性を確認する。
フィルグラスチム又はペグフィルグラスチム（添加サンプル及び通常のサンプル）のペプシン消化を実施するために、０．３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ２．２）６０μＬを含む１ｍｇ／ｍＬのタンパク質サンプル１２０μＬ、及び０．４８ｍｇ／ｍＬのペプシン溶液１０μＬを、十分に混合し、１５分にわたり３７℃インキュベートする。インキュベーション後、この消化を、１ＮのＮａＯＨ１０μＬを添加することによりクエンチした。
消化サンプルペプチド１５μｇを、０．０２５％のＴＦＡによる４０分間のアセトニトリル勾配（２～２５％を１９分間、続いて２５～３０％を１０分間、次いで３０～９９％を１０分間、続いてカラム洗浄及び再平衡化）により、５０℃にて、Ｗａｔｅｒｓ ＣＳＨ逆相カラム（２．１×１００ｍｍ）で分離した。流速を０．２ｍＬ／分で維持し、ＵＶ検出を２１４ｎｍで達成した。
下記式
Figure 2023518412000015
 を使用して、添加サンプル（５％）及び非添加サンプルの遊離Ｎ末端ペプチドのピーク面積を使用することにより、遊離Ｎ末端のパーセントの決定を行なった。
上記で説明されている様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供し得る。本明細書で言及されている及び／又は本出願データシートで列挙されている全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本実施形態の態様は、様々な特許、出願、及び刊行物の概念を採用するために、必要に応じて改変されて、さらなる実施形態を提供し得る。
これらの及び他の変更を、上記の詳細な説明を考慮して実施形態に行ない得る。一般的に、下記の特許請求の範囲において、使用される用語は、この特許請求の範囲を、本明細書及び特許請求の範囲で開示されている具体的な実施形態に限定するように解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する等価物の全ての範囲と共に全ての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。従って、本特許請求の範囲は、本開示により限定されるものではない。

Claims (20)

  1. ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ポリペプチドの非修飾Ｎ末端の量を測定する方法であって、
    （ａ）前記Ｇ－ＣＳＦポリペプチドを含むサンプルと、非特異的プロテアーゼとを、前記Ｇ－ＣＳＦポリペプチド内の１箇所又は複数箇所の部位での開裂、及び１位でのＮ末端メチオニンと１６位でのリシンとの間での１回だけの開裂を可能にする条件下でインキュベートする工程；
    （ｂ）工程（ａ）で生成された開裂生成物を分離する工程；
    並びに
    （ｃ）コントロール標準と比較することにより、前記Ｇ－ＣＳＦポリペプチドの非修飾の遊離Ｎ末端の量を測定する工程
    を含む方法。
  2. 前記Ｇ－ＣＳＦポリペプチドは、組換え体である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記サンプルは、修飾Ｇ－ＣＳＦポリペプチドと、非修飾Ｇ－ＣＳＦポリペプチドとの混合物を含み、前記修飾Ｇ－ＣＳＦポリペプチドは、少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記Ｇ－ＣＳＦポリペプチドは、ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））、ペグフィルグラスチム－ｊｍｄｂ（Ｆｕｌｐｈｉｌａ（登録商標））、ＩＮＮ－ペグフィルグラスチム（Ｐｅｌｇｒａｚ（登録商標））、Ｌａｐｅｌｇａ（登録商標）、Ｐｅｌｍｅｇ（登録商標）、ペグフィルグラスチム－ｃｂｑｖ（Ｕｄｅｎｙｃａ（登録商標））、ペグフィルグラスチム－ｂｍｅｚ（Ｚｉｅｘｔｅｎｚｏ（登録商標））、及びＧｒａｓｕｓｔｅｋ（登録商標）からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記Ｇ－ＣＳＦポリペプチドは、ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記非特異的プロテアーゼは、１５位でのロイシンと、１６位でのロイシンとの間を開裂し、１５個のアミノ酸長のペプチド（ペプチドＭ１－Ｌ１５）が生成される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記非特異的プロテアーゼは、ペプシンである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 工程（ａ）での前記条件は、（ａ）約１．５～約４．０のｐＨで、（ｂ）約２５℃～約６０℃の温度で、及び（ｃ）約５分～約６０分の時間にわたり、インキュベートすることを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記条件は、（ａ）約２．２のｐＨで、（ｂ）約３７℃の温度で、及び（ｃ）約１５分の時間にわたり、インキュベートすることを含む、請求項８に記載の方法。
  10. （ｂ）の前記分離を、ペプチドＭ１－Ｌ１５の他の開裂生成物からの分離を可能にする条件下で実行する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 工程（ｂ）の前記分離を、クロマトグラフィー及び電気泳動から選択される方法により実行する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ＨＰＬＣは、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）である、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記クロマトグラフィーは、カラムと、約０．０１ｖ／ｖ％～約０．２ｖ／ｖ％の濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 前記ＴＦＡの濃度は、約０．０２ｖ／ｖ％～約０．０３ｖ／ｖ％である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ＴＦＡの濃度は、約０．０２５ｖ／ｖ％である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記測定する工程（ｃ）を質量分析により実行する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記質量分析は、エレクトロスプレーＭＳ、及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記コントロール標準は、既知の量の修飾Ｇ－ＣＳＦポリペプチドと、既知の量の非修飾Ｇ－ＣＳＦポリペプチドとを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））の非ＰＥＧ化遊離Ｎ末端の量を測定する方法であって、
    （ａ）ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））を含むサンプルと、非特異的プロテアーゼとを、前記ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））内の１箇所又は複数箇所の部位での開裂、及び１位でのＮ末端メチオニンと１６位でのリシンとの間での１回だけの開裂を可能にする条件下でインキュベートする工程であり、前記条件は、（ａ）約２．２のｐＨで、（ｂ）約３７℃の温度で、及び（ｃ）約１５分の時間にわたり、インキュベートすることを含む、インキュベートする工程；
    （ｂ）工程（ａ）で生成された開裂生成物を、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）により分離する工程；
    並びに
    （ｃ）コントロール標準と比較することにより、前記ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））の非ＰＥＧ化遊離Ｎ末端の量を測定する工程
    を含む方法。
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