KR101292740B1 - 인터루킨-11 유사체를 포함하는 생체중합체 결합체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인터루킨-11(IL-11) 유사체(mIL-11) 및 생체적합성 중합체로 구성된 생체중합체 결합체를 제공한다. 본 발명의 mIL-11은 산분해에 대한 향상된 내성을 나타내고 성숙 재조합 인간 IL-11(rhIL-11)에 비해 증가된 안정성을 보인다. 본 발명의 결합체는 보다 긴 혈청 반감기를 특징으로 하고 상응하는 비-결합된 mIL-11과 비교할 때 본질적으로 활성 손실을 나타내지 않는다.

Description

인터루킨-11 유사체를 포함하는 생체중합체 결합체{BIOPOLYMER CONJUGATES COMPRISING AN INTERLEUKIN-11 ANALOG}

본 발명은 생물학적 치료제 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 인간 인터루킨-11의 유사체 또는 변이체(mIL-11)를 포함하는 생체중합체 결합체에 관한 것으로서, 이때 상기 mIL-11은 성숙 재조합 인간 IL-11(rhIL-11)에 비해 향상된 안정성을 나타내고, 상기 생체중합체 결합체는 mIL-11의 활성 수준과 실질적으로 동일한 활성 수준을 보유한다.

호중구 감소증 및 혈소판 감소증으로 발현되는 혈액학적 독성은 암 화학요법과 관련된 원치 않는 부작용이고, 이 부작용은 종종 환자에게 투여될 항-종양 약물의 투여량을 제한한다. 다양한 종류의 조혈 세포 및 비-조혈 세포와 상호작용하는, 간질세포로부터 유래된 사이토카인인 인터루킨 11(IL-11)의 생체내 투여는 혈소판 수치를 증가시키고 유리한 혈소판 생성 효과를 나타내는 것으로 밝혀져 있다. IL-11은 거핵세포(megakaryocyte)로의 줄기세포의 분화, 거핵세포의 증식 및 성숙, 및 혈소판의 생성에 있어서 주된 역할을 수행한다.

재조합 인간 IL-11(rhIL-11)은 암 화학요법과 관련된 부작용의 치료에 있어서 잠재적으로 유용하다. rhIL-11이 동물에게 투여된 경우, rhIL-11은 거핵세포 생성을 향상시키고 정상 동물 및 면역억제된 동물 둘다에서 혈소판 수치를 증가시킨다. rhIL-11 생성물은 와이어쓰-아이어스트(Wyeth-Ayerst)에 의해 뉴메가(NEUMEGA)(등록상표)(일반명: 옵렐베킨(oprelvekin))로서 시판되고 중증 혈소판 감소증의 예방용으로 승인받았을 뿐만 아니라, 중증 혈소판 감소증의 위험이 높은 비-골수 악성 종양을 가진 성인 환자에서 골수억제 화학요법 후 혈소판 수혈의 필요성 감소용으로도 승인받았다. 뉴메가(등록상표)는 동결건조된 산제로서 5 ㎎ IL-11을 함유하는 1회-사용 바이알 형태로 공급된다. 상기 산제를 1 ㎖의 멸균된 주사용수인 USP로 재구성하여 50 ㎍/㎏/일의 투여량으로 투여되는 5 ㎎/㎖의 IL-11을 포함하는 용액을 생성한다. 뉴메가(등록상표)와 관련된 가장 흔한 부작용은 심방 부정맥, 실신, 호흡곤란, 울혈성 심부전 및 폐부종을 포함한다.

rhIL-11의 생체내 투여가 암 화학요법을 받은 환자에서 혈소판 수치의 감소를 예방하는 명백한 약리 효과를 나타내는 것으로 밝혀져 있다 하더라도, 요구되는 투여 빈도(종종 2주 이상의 기간 동안 1일 1회)가 바람직한 빈도보다 더 높다. 뿐만 아니라, IL-11과 같은 사이토카인은 흥미로운 치료제이지만, 사이토카인이 소변 배출, 간 흡수 및/또는 효소 분해를 통해 신속히 제거되기 때문에 사이토카인의 사용은 종종 제한된다. 주로 신장 및 간이 rhIL-11을 동물의 순환계로부터 신속히 제거하는 듯하다. 이 신속한 제거는 아마도 rhIL-11의 낮은 분자량(약 19 kDa) 및 높은 양이온 특성 때문일 것이다. 거대분자에 대한 사구체 모세혈관 벽의 투과선별성(permselectivity)은 주로 분자 크기를 기초로 하기 때문에, 수용성 중합체를 사용한 rhIL-11의 화학적 변경은 단백질의 사구체 여과를 제한할 수 있다.

폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자와 같은 생체중합체를 사용한 재조합 단백질의 변경은 짧은 순환 시간을 해결하는 수단으로서 연구되어 왔다. PEG 중합체와 단백질의 결합(PEG화)은 단백질의 수력학적 반경을 증가시켜 신장에 의한 신속한 제거로부터 보호함으로써 생체이용가능성을 개선시키고 용해도를 증가시키는 것으로 밝혀져 있다. 게다가, PEG 중합체의 큰 부피로 인해 PEG-결합된 단백질은 감소된 단백질분해 및 감소된 면역 인식을 나타내고, 이러한 성질은 PEG화된 단백질의 실질적인 이점을 부여한다(Veronese FM and Pasut G., Drug Discovery Today 70:1451-8 (2005)). 다른 한편으로, 단백질분해 효소 또는 항체에 대한 PEG-결합된 단백질의 저항 능력은 상기 단백질이 그의 수용체에 결합하는 능력을 제한할 수도 있다. 그 결과, 수용체에 대한 PEG-결합된 단백질의 결합 친화성은 특히, 결합 부위가 수용체 결합 부위에 포함되어 있거나 수용체 결합 부위와 매우 가깝게 위치하고 있는 경우에 감소될 것이다.

순환계에 rhIL-11을 보유할 필요성을 해결하기 위해, 연구원들은 수용성 중합체 PEG를 사용한 rhIL-11의 화학적 변경 가능성을 조사하였다(문헌(Takagi et al., Journal of Controlled Release 119: 271-278 (2007) 참조). 그러나, 전술한 바와 같이, PEG를 사용한 rhIL-11의 화학적 변경은 많은 단점을 가진다. 부착된 PEG의 큰 부피와 입체장애로 인해, PEG-rhIL-11 결합체는 IL-11 수용체에 결합할 수 없거나 최소한으로 결합할 수 있다. 뿐만 아니라, rhIL-11 분자의 생물학적 활성이 감소될 수 있다. 실제로, 다카기(Takagi)와 그의 동료들은 PEG-rhIL-11 결합체가 비-결합된 rhIL-11보다 더 오랜 시간 동안 혈장 내에 보유되므로 혈소판 수치의 증가에 대한 측정가능한 효과를 나타내었지만, PEG화된-rhIL-11의 남은 생물학적 활성이 PEG와의 결합에 의해 감소되었음을 입증하였다(Takagi et al., Journal of Controlled Release 119: 271-278 (2007)). 따라서, 원하는 효능을 얻기 위해, 증가된 양의 PEG-rhIL-11 결합체를 투여할 필요가 있었다.

본 발명은 환자에게 투여된 경우 보다 오랜 시간 동안 혈장 내에 보유되어 있을 뿐만 아니라 생물학적 활성도 보유하고 있어서 혈소판 감소증 및 암 화학요법과 관련된 다른 혈액학적 독성의 치료 및 예방 효능이 증가된 IL-11 분자에 대한 필요성을 해결한다.

본 발명은 IL-11 유사체와 생체적합성 중합체의 결합체를 제공한다. 본 발명의 IL-11 유사체(mIL-11)는 산분해(acidolysis)에 대한 향상된 내성을 나타내고 rhIL-11에 비해 증가된 안정성을 보인다. 또한, 본 발명의 결합체는 보다 긴 혈청 반감기를 특징으로 하고 상응하는 비-결합된 mIL-11에 비해 활성 손실을 전혀 나타내지 않는다는 사실을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 mIL-11 및 생체적합성 중합체를 포함하는 결합체에 관한 것으로서, 상기 mIL-11의 아미노산 서열은 5개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 서열번호 2를 포함하되, 서열번호 2의 위치 1에 상응하는 아미노산 잔기는 알라닌이고, 서열번호 2의 위치 125에 상응하는 아미노산 잔기는 아스파라긴이고, 상기 결합체의 시험관내 세포 증식 활성의 수준은 비-결합된 기준 mIL-11의 세포 증식 활성의 수준에 비해 5% 이하로 감소되고, 결합된 mIL-11의 mIL-11 아미노산 서열과 비-결합된 기준 mIL-11의 mIL-11 아미노산 서열은 동일하고, 상기 세포 증식 활성은 상기 결합체 또는 비-결합된 기준 mIL-11을 IL-11 수용체 α-쇄 및 당단백질 130(gp130)의 발현에 의해 IL-11에 반응하는 세포와 접촉시키고 상기 세포를 시험관 내에서 배양하고 발생된 세포 증식을 측정함으로써 결정한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 인간 IL-11(mIL-11) 및 생체적합성 중합체를 포함하는 결합체에 관한 것으로서, 상기 mIL-11의 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하되, 서열번호 2의 위치 1에 상응하는 아미노산 잔기는 알라닌이고, 서열번호 2의 위치 125에 상응하는 아미노산 잔기는 아스파라긴이고, 세포 증식 어세이(assay)에서 상기 결합체의 시험관내 세포 증식 활성의 수준은 비-결합된 기준 mIL-11의 세포 증식 활성의 수준에 비해 5% 이하로 감소되고, 결합된 mIL-11의 mIL-11 아미노산 서열은 비-결합된 기준 mIL-11의 mIL-11 아미노산 서열과 동일하고, 상기 세포 증식 활성은 상기 결합체 또는 비-결합된 기준 mIL-11을 IL-11 수용체 α-쇄 및 당단백질 130(gp130)의 발현에 의해 IL-11에 반응하는 세포와 접촉시키고 상기 세포를 시험관 내에서 배양하고 발생된 세포 증식을 측정함으로써 결정한다.

추가 실시양태에서, 생체적합성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리트리메틸렌 글리콜, 폴리락트산, 폴리아크릴산, 폴리아미노산, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠(polyphosphazene), 폴리(L-라이신), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리아크릴 아미드로 구성된 군으로부터 선택된다. 구체적인 실시양태에서, 생체적합성 중합체는 PEG이다. 다른 특정 실시양태에서, PEG는 직쇄 또는 분지쇄 PEG이다. 추가 실시양태에서, PEG의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa, 약 10 kDa 내지 약 60 kDa, 약 2 kDa 내지 약 50 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 20 kDa이다.

구체적인 실시양태에서, 생체중합체 결합체의 mIL-11은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 생체중합체 결합체의 mIL-11은 위치 31에 존재하는 발린이 알라닌으로 치환되어 있고 위치 155에 존재하는 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환되어 있다는 점을 제외하고 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 생체중합체 결합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 본 발명의 생체중합체 결합체 또는 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 IL-11에 반응하는 질환 또는 장애, 예컨대, 혈소판 감소증을 치료하거나, 완화시키거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 생체중합체 결합체 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 혈소판 수치를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 구체적인 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

본 발명의 상기 목적 및 특징뿐만 아니라 다른 목적 및 특징도 본 발명의 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 자명해질 것이고, 도면의 설명은 다음과 같다:
도 1은 아민-특이적 PEG화 방법을 통해 PEG화된, 정제된 일-PEG화된(mono-PEGylated) IL-11 돌연변이체(PEG-mIL-11-SC, 레인 1) 및 정제된 IL-11 돌연변이체(레인 2)를 사용한 SDS-PAGE 겔을 보여준다.
도 2는 재조합 인간 IL-11(rhIL-11)과 비교된 mIL-11의 구조적(A) 및 기능적(B) 어세이로부터 얻은 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 50℃에서 pH 3.5의 용액에서 0, 1, 2, 3 및 4일 동안 스트레스를 받은 rhIL-11과 mIL-11의 역상 HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 4는 사선으로 표시된, rhIL-11 및 mIL-11의 산 가수분해 부위를 보여주는 그래프이다.
도 5는 IL-11 돌연변이체에 존재하는 PEG화 부위에 대한 가능한 아민 기를 보여주는 도표이다. N-말단 1차 아민은 진한 회색으로 표시되어 있는 반면, 라이신의 ε-아민(위치 63, 120 및 196)은 엷은 회색으로 표시되어 있다. 넘버링은 야생형 인간 IL-11(NCBI AAA59132.1)을 기초로 한 것이다.
도 6은 실시예 3에 나타낸 정제된 PEG-mIL-11-SC의 크기 배제 HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 7은 실시예 4에 나타낸 정제된 PEG-mIL-11-AD의 SDS-PAGE 겔 및 크기 배제 HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 8은 비-결합된 mIL-11을 기준으로 한, PEG화된 mIL-11(PEG-mIL-11-AD 또는 PEG-mIL-11-SC)의 시험관내 증식 활성의 결과를 보여주는 그래프이다(N = 3). 오차 막대는 데이터의 표준편차를 표시한다.
도 9는 PEG-mIL-11-SC(400 ㎍/㎏)(A) 및 PEG-mIL-11-AD(400 ㎍/㎏)를 1회 피하 투여한 후 래트(N = 5)에서 혈소판 수치의 수준을 비-결합된 mIL-11(400 ㎍/㎏의 1회 투여)로 처리된 군과 비교하여 보여주는 그래프이다. 오차 막대는 데이터의 표준편차를 표시한다.
도 10은 PEG-mIL-11-SC(400 ㎍/㎏)(A) 및 PEG-mIL-11-AD(400 ㎍/㎏)를 1회 피하 투여한 후 래트(N = 5)에서 혈소판 수치의 수준을, 비-결합된 mIL-11(400 ㎍/㎏/일)을 7일 동안 매일 피하 투여한 래트와 비교하여 보여주는 그래프이다. 오차 막대는 데이터의 표준편차를 표시한다.
도 11은 래트(N = 4 내지 6)에서 PEG-mIL-11-SC(400 ㎍/㎏)(A) 또는 PEG-mIL-11-AD(400 ㎍/㎏)를 1회 피하 투여한 후 생체내 IL-11 농도의 수준을, 비-결합된 mIL-11(400 ㎍/㎏)의 1회 투여와 비교하여 보여주는 그래프이다.

본 발명은 IL-11 유사체 및 생체적합성 중합체로 구성된 결합체; 및 암 화학요법과 관련된 혈소판 감소증 및 호중구 감소증을 포함하는, IL-11에 반응하는 질환 또는 장애의 치료, 완화 또는 예방에 있어서 상기 결합체의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 결합된 IL-11 유사체(mIL-11) 폴리펩티드는 인간 IL-11 또는 재조합 인간 IL-11(rhIL-11)보다 더 오랜 시간 동안 혈장 내에 보유되고 비-결합된 mIL-11의 생물학적 활성과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 보유한다.

인간 IL-11 및 재조합 인간 IL-11의 아미노산 서열은 이하에 기재되어 있다. 인간 IL-11의 아미노산 서열은 다음과 같다:

재조합 인간 IL-11의 아미노산 서열은 다음과 같다:

mIL-11 폴리펩티드

mIL-11 폴리펩티드(서열번호 2)는, 서열번호 1의 IL-11 폴리펩티드의 처음 30개 N-말단 아미노산을 결실시킨 후, 형성된 위치 1에 존재하는 발린(Val)을 알라닌(Ala)으로 치환시키고, 형성된 위치 125에 존재하는 아스파르트산(Asp)을 아스파라긴(Asn)으로 치환시킴으로써 발생시킨 인간 IL-11(서열번호 1)의 유사체이다.

mIL-11의 아미노산 서열은 다음과 같다:

mIL-11 폴리펩티드는 그 내용이 본 명세서에 참고로 도입되는 중국특허 제11677호에 이미 기재되어 있다.

용어 "mIL-11"은 "IL-11 유사체", "mIL-11 폴리펩티드" 또는 "IL-11 돌연변이체"와 상호교환적으로 사용되고, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.

본 발명은 예를 들어, 서열번호 2에 기재된 폴리펩티드 서열 및/또는 서열번호 2의 폴리펩티드 단편과 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 포함하되, 서열번호 2의 임의의 폴리펩티드 및/또는 단편은 서열번호 2의 위치 1에 상응하는 아미노산에서 알라닌을 보유하고 서열번호 2의 위치 125에 상응하는 아미노산에서 아스파라긴을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 비교 대상 아미노산 서열과 예를 들어, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드라 함은 이 폴리펩티드가 서열번호 2의 위치 1에 상응하는 아미노산에서 알라닌을 보유하고 서열번호 2의 위치 125에 상응하는 아미노산에서 아스파라긴을 보유한다는 점, 및 상기 폴리펩티드의 서열이 비교 대상 아미노산 서열의 100개 아미노산 당 5개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 점을 제외하고 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열이 비교 대상 아미노산 서열과 동일함을 의미한다. 즉, 비교 대상 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 수득하기 위해, 서열번호 2의 위치 1 및 위치 125에 존재하는 아미노산에 상응하는 아미노산을 제외하고 상기 폴리펩티드의 서열에서 5% 이하의 아미노산 잔기가 삽입될 수 있거나, 결실될 수 있거나 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 기준 서열의 이러한 변경은 기준 아미노산 서열의 아미노 말단 위치 또는 카르복시 말단 위치에서 일어날 수 있거나, 기준 서열 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 인접한 기에서 잔기들 사이에 개별적으로 산재되어 있는, 상기 말단 위치들 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있다.

실질적인 문제로서, 임의의 특정 폴리펩티드가 서열번호 2의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 지는 공지되어 있는 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, BLASTP 알고리즘을 사용하는 BLAST 2.0을 이용하여 통상적으로 확인할 수 있다(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991). 당분야에 공지되어 있는 바와 같이, 2종의 폴리펩티드들 사이의 "유사성"은 아미노산 서열, 및 폴리펩티드의 보존된 아미노산 치환을 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 측정한다. 본원에서 이러한 서열들에 대한 동일성 또는 상동성(homology)은 서열들을 정렬하고 필요하다면 갭(gap)을 도입하여 최대 상동성(%)을 달성하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후, 공지되어 있는 펩티드와 동일한, 후보 서열 내의 아미노산 잔기들의 백분율로서 정의된다. 펩티드 서열에서의 N-말단, C-말단 또는 내부 연장, 결실 또는 삽입은 상동성에 영향을 미치는 것으로서 해석되지 않을 것이다.

추가로, 본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열, 또는 5개 이하(5개, 4개, 3개, 2개, 1개 또는 0개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 구성되되, 서열번호 2의 위치 1에 상응하는 아미노산에서 알라닌을 보유하고, 서열번호 2의 위치 125에 상응하는 아미노산에서 아스파라긴을 보유하는 폴리펩티드를 포함한다.

mIL-11 폴리펩티드에 적용되는 용어 "이의 유도체" 또는 "이의 변이체"는 서열번호 2의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성되거나 서열번호 2에 비해 5개 이하(5개, 4개, 3개, 2개, 1개 또는 0개를 포함함)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열로 구성되되, 서열번호 2의 위치 1에 상응하는 아미노산에서 알라닌을 보유하고, 서열번호 2의 위치 125에 상응하는 아미노산에서 아스파라긴을 보유하는 폴리펩티드로서, mIL-11의 실질적으로 모든 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드가 mIL-11의 실질적으로 모든 생물학적 활성을 보유하는 한, 부가 또는 치환은 비-천연 발생 아미노산의 사용을 포함하고 임의의 내부 위치, N-말단 및/또는 C-말단에서 일어날 수 있다.

mIL-11의 변이체 또는 유도체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존된 또는 비-보존된 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되어 있고 이러한 치환된 아미노산 잔기가 유전 코드에 의해 코딩된 아미노산 잔기 또는 유전 코드에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기일 수 있는 변이체 또는 유도체, (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 변이체 또는 유도체, (iii) 성숙 폴리펩티드가 또 다른 화합물, 예컨대, 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되어 있는 변이체 또는 유도체, (iv) 추가 아미노산이 폴리펩티드의 정제를 위해 성숙 폴리펩티드에 융합되어 있는 변이체 또는 유도체, 또는 (v) 폴리펩티드의 단편이 용해가능하여, 즉 막에 결합되어 있지 않아 여전히 리간드를 막 결합된 수용체에 결합시키는 변이체 또는 유도체일 수 있다. 이러한 변이체 또는 유도체는 본 명세서의 개시내용에 비추어 당분야에서 숙련된 기술을 가진 자의 기술지식 내에 있는 것으로 간주된다.

폴리펩티드의 "변이체"는 보존적 변이체 또는 대립유전자 변이체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 보존적 변이체는 단백질의 생물학적 기능에 불리한 영향을 미치지 않는 서열 변경을 가진 아미노산 서열을 의미한다. 변경된 서열이 단백질과 관련된 생물학적 기능을 방해하거나 파괴하는 경우, 치환, 삽입 또는 결실이 단백질에 불리한 영향을 미친다고 기재된다. 예를 들어, 단백질의 총 전하, 구조 또는 소수성-친수성은 생물학적 활성에 불리한 영향을 미치지 않으면서 변경될 수 있다. 따라서, 아미노산 서열은 예를 들어, 단백질의 생물학적 활성에 불리한 영향을 미치지 않으면서 펩티드가 보다 높은 소수성 또는 친수성을 나타내도록 변경될 수 있다.

"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하를 가진 측쇄를 보유하는 아미노산 잔기로 치환되는 아미노산 치환이다. 유사한 전하를 가진 측쇄를 보유하는 아미노산 잔기의 패밀리(family)는 당분야에 정의되어 있다. 이 패밀리는 염기성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비-하전된 극성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 쓰레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 대안적으로, 돌연변이는 예를 들어, 포화 돌연변이유발에 의해 코딩 서열의 전부 또는 일부에 무작위로 도입될 수 있고, 생성된 돌연변이체의 생물학적 활성을 스크리닝하여 활성(예를 들어, IL-11 활성)을 보유하는 돌연변이체를 확인할 수 있다.

"대립유전자 변이체"는 유기체의 염색체 상에서 소정의 좌위를 차지하는 유전자의 택일적 형태를 의미한다(Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). 비-천연 발생 변이체는 당분야에 공지되어 있는 돌연변이유발 기법을 이용하여 생성할 수 있다. 대립유전자 변이체는 앞서 언급된 변이체들과는 다소 상이한 아미노산 서열을 갖을지라도 mIL-11 단백질과 관련된 동일한 또는 유사한 생물학적 기능을 여전히 보유할 것이다.

예를 들어, 다양한 문헌, 예컨대, 문헌(Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y, 1989), 문헌(DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985)), 문헌(Ausubel, et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994), 문헌(Sidhu et al., Methods Enzymol 328:333-363, 2000) 및 문헌(Kunkel et al., Methods Enzymol 204: 1991)에 기재된 바와 같이 아미노산 치환을 발생시키는 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발을 포함하는 당분야에서 숙련된 기술을 가진 자에게 공지되어 있는 표준 기법들을 이용하여 본 발명의 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 돌연변이를 도입할 수 있다.

따라서, 본 발명의 단백질 및 펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 분자, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 포함한다. 고려되는 변이체는 단백질이 치환, 화학적 수단, 효소적 수단 또는 다른 적절한 수단을 통해 천연 발생 아미노산 이외의 물질(예를 들어, 검출가능한 물질, 예컨대, 효소 또는 방사성동위원소)에 의해 공유결합적으로 변경되어 있는 유도체를 함유하는 변이체도 포함한다.

공지되어 있는 단백질 조작 방법 및 재조합 DNA 기법을 이용하여 mIL-11 폴리펩티드의 특성이 개선되거나 변경되도록 변이체를 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 생물학적 기능의 실질적인 손실 없이 mIL-11 폴리펩티드로부터 하나 이상의 아미노산을 결실시켜 특정 위치, 예컨대, 상기 폴리펩티드의 N-말단 근처에 위치한 Lys 잔기에서 생체중합체의 공유결합을 촉진시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 실질적인 생물학적 활성을 보이는 mIL-11 폴리펩티드 변이체 또한 포함한다. 이러한 변이체는 활성에 대해 거의 영향을 미치지 않도록 당분야에 공지되어 있는 일반적인 규칙에 따라 선택된 결실, 삽입, 역위, 반복 및 치환을 포함한다.

당분야에서 숙련된 기술을 가진 자는 이하에 더 상세히 기재되어 있는 바와 같이 단백질 기능에 다소 덜 유의하게 영향을 미치거나 유의하게 영향을 미치지 않을 가능성이 높은 아미노산 치환(예를 들어, 지방족 아미노산을 제2 지방족 아미노산으로 치환시키는 것)을 충분히 인식하고 있다.

본 발명의 "유도체"는 치환, 화학적 수단, 효소적 수단 또는 다른 적절한 수단을 통해 천연 발생 아미노산 이외의 물질(예를 들어, 검출가능한 물질, 예컨대, 효소 또는 방사성동위원소)에 의해 공유결합적으로 변경될 수 있다. 유도체의 예로는 융합 단백질을 들 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드, 바람직하게는 재조합 폴리펩티드일 수 있다.

인간 IL-11의 구조 및 기능은 광범위하게 연구되고 있고, 당분야에서 숙련된 기술을 가진 자는 단백질의 실질적으로 모든 생물학적 활성을 보유하는 데 있어서 중요할 뿐만 아니라 바람직하게는 mIL-11의 임의의 변이체 또는 유도체에서 변경되지 않거나 보존적으로만 변경되는 IL-11 서열의 아미노산을 인식하고 있다. 생물학적 활성에 중요하지 않은 다른 아미노산은 보다 자유롭게 결실될 수 있고/있거나 치환될 수 있다. 생물학적 활성에 중요한 아미노산으로 공지되어 있는 아미노산의 예로는 Lys⁴¹, Met⁵⁸, Lys⁹⁸, Lys¹⁷⁴, Thr¹⁷⁵, Arg¹⁷⁶ 및 Leu¹⁷⁷(Czupryn et al., J. Biol. Chem. 270:978 (1995)); Pro¹³, Glu¹⁶, Leu¹⁷, Leu²², Arg²⁵, Leu²⁸, Thr³¹, Arg³², Leu³⁴, Arg³⁹, Arg¹⁵⁰, Ala¹⁵², His¹⁵³, Ile¹⁵⁵, Gly¹⁵⁸, Leu¹⁵⁹, Thr¹⁶², Leu¹⁶³, Asp¹⁶⁴, Trp¹⁶⁵, Arg¹⁶⁸ 및 Leu¹⁷⁰(Czupryn et al., Ann. NY Acad. Sci. 762:152 (1995)); 및 Leu⁶³, Ile¹⁴⁹, Arg¹⁶⁸ 및 Leu¹⁷²(Tacken et al., Eur. J. Biochem. 265:645 (1999))를 들 수 있으나 이들로 한정되지 않고, 이때 아미노산 번호는 rhIL-11 폴리펩티드의 아미노산 번호에 상응한다. 당분야에서 숙련된 기술을 가진 자는 관용적인 돌연변이유발 기법, 예컨대, 상기 인용된 문헌에 기재된 돌연변이유발 기법을 이용하여 mIL-11의 유도체를 제조할 수 있고 mIL-11 폴리펩티드의 실질적으로 모든 생물학적 활성을 보유하는 유도체를 확인할 수 있다.

본 명세서에서 mIL-11, 비-결합된 mIL-11 또는 천연 mIL-11이 mIL-11과 관련하여 사용되는 표현 "실질적으로 동일한 생물학적 활성", "실질적인 생물학적 활성", "유사한 생물학적 활성" 또는 "활성의 손실을 본질적으로 나타내지 않는"은 생물학적 활성 중 1종 이상의 임의의 생물학적 활성(예를 들어, 혈소판생성 또는 mIL-11의 다른 인식된 생물학적 활성, 예컨대, 산 가수분해에 대한 mIL-11의 내성을 자극하는 능력)의 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상을 의미한다. mIL-11의 생물학적 활성은 문헌(Lebeau B et al., Lebeau B et al., FEBS Letters 407: 141-147 (1997))에 기재된 방법과 유사한 어세이인, gp130 및 IL-11 수용체 α-쇄를 발현하는 Ba/F3 세포를 사용한 시험관내 세포 증식 어세이에서 측정되는 세포 증식을 유도하는 mIL-11의 능력을 포함한다. 이러한 세포 증식 어세이를 이용하는 경우, 표현 "mIL-11 폴리펩티드의 생물학적 활성"을 수식하는 데 사용되는 용어 "실질적으로 모든", "유사한" 또는 "동일한"은 상기 어세이에 의해 측정된 활성 수준에 상응하고, 이때 상기 수준은 mIL-11 폴리펩티드의 세포 증식 활성의 수준에 비해 5% 이하로 감소된다.

mIL-11을 포함하는 결합체의 생물학적 활성 수준은 전술한 바와 같은 1종 이상의 생물학적 활성의 수준을 측정함에 의해 결정될 수 있다. 이러한 결정은 본 발명의 결합체를 비-결합된 기준 mIL-11과 비교함으로써 달성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "기준"은 비교 대상으로 언급된 물질 또는 항목을 의미하고 대조군으로서 사용될 수 있다. 본 발명과 관련하여, "기준" mIL-11은 결합체의 생체중합체가 그 자신에 부착되어 있는 mIL-11의 생물학적 활성에 어떤 영향을 미치는 지를 확인하기 위해 시험되는 결합체 내의 mIL-11과 동일한 서열을 가진 비-결합된 mIL-11일 것이다. 따라서, mIL-11 또는 이의 변이체 또는 유도체를 포함하는 결합체의 생물학적 활성을 상응하는 비-결합된 "기준" mIL-1과 비교함으로써, 결합된 형태의 mIL-11이 비-결합된 형태의 mIL-11과 비교할 때 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 나타내는 지를 확인할 수 있다.

예를 들어, mIL-11 폴리펩티드의 실질적으로 모든 생물학적 활성을 나타내는 생체중합체 결합체는 상기 시험관내 세포 증식 어세이에 의해 측정되었을 때 비-결합된 mIL-11 폴리펩티드의 세포 증식 활성의 수준에 비해 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이하의 활성 수준 감소를 보일 것이다. 예를 들어, mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 특정 생체중합체 결합체의 생물학적 활성을 비교하는 경우, 상기 결합체의 mIL-11과 비교되는 비-결합된 mIL-11은 동일한 서열을 가진다. mIL-11 활성은 당분야에 잘 공지되어 있는 다른 관용적인 시험관내 어세이 및 생체내 어세이(예를 들어, 거핵세포 증식 어세이, 혈소판 혈중 농도의 자극)에 의해 측정될 수도 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 단리된 또는 정제된 mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체가 본 발명의 방법에서 사용된다. mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체의 "단리된" 또는 "정제된" 단백질은 mIL-11 단백질, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체의 기원이 되는 세포 또는 조직 공급원으로부터 유래된 세포 물질 또는 다른 오염 단백질을 실질적으로 함유하지 않거나, 화학적으로 합성된 경우에는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는다. 표현 "세포 물질을 실질적으로 함유하지 않는"은 mIL-11 단백질, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 재조합적으로 생성하는 세포의 세포 성분들로부터 분리되어 있는 mIL-11 단백질, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체의 제제를 포함한다. 한 실시양태에서, 표현 "세포 물질을 실질적으로 함유하지 않는"은 (건조 중량을 기준으로) 약 30% 미만, 예를 들어, 약 20% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만의 비-mIL-11 단백질(본 명세서에서 "오염 단백질"로도 지칭됨)을 함유하는, mIL-11 단백질, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체의 제제를 포함한다. mIL-11 단백질, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체가 재조합적으로 생성되는 경우, mIL-11 단백질, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체는 바람직하게는 배양 배지 또한 실질적으로 함유하지 않는다. 즉, 배양 배지는 단백질 제제의 약 20% 미만, 예를 들어, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만을 차지한다.

표현 "화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는"은 mIL-11 단백질, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리되어 있는 mIL-11 단백질, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체의 제제를 포함한다. 한 실시양태에서, 표현 "화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는"은 (건조 중량을 기준으로) 약 30% 미만, 예를 들어, 약 20% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만의 화학적 전구체 또는 비-mIL-11 화학물질을 함유하는, mIL-11 단백질, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체의 제제를 포함한다.

mIL-11 폴리펩티드, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체는 당분야에 공지되어 있는 임의의 방법, 예를 들어, 재조합 발현 또는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, mIL-11 폴리펩티드, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체는 예를 들어, 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포 배양물에서 재조합적으로 발현된다. 재조합 발현은 mIL-11 폴리펩티드, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계, 상기 벡터를 숙주 세포 내로 전달하는 단계, 상기 숙주 세포를 mIL-11 폴리펩티드, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계, 및 mIL-11 폴리펩티드, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 분리하는 단계를 수반한다. 재조합 벡터를 제조하고 이 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키고, 상기 벡터를 숙주 세포 내에서 복제시키고 생물학적 활성 외래 폴리펩티드 및 단백질을 발현하는 방법 및 재료는 본 명세서에 참고로 각각 도입되는 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning, 3^rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001) 및 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 3^rd edition, (2000))에 기재되어 있다.

mIL-11 폴리펩티드, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체의 아미노산 서열 정보를 이용하여 mIL-11 폴리펩티드, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생성할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 화학적으로 합성될 수 있거나, 야생형 IL-11 또는 재조합 IL-11을 코딩하는 유전자 또는 cDNA로부터 유도될 수 있다. mIL-11을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 이용가능성은 당분야에 잘 공지되어 있고 관용적으로 실시되고 있는 기법에 의한 코딩된 폴리펩티드의 대규모 발현을 가능하게 한다.

생체적합성 중합체 및 생체적합성 중합체 결합체

본 발명의 생체적합성 중합체 또는 생체중합체는 1종 이상의 폴리알킬렌 글리콜(1종 이상의 폴리(에틸렌 글리콜), 1종 이상의 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 및 1종 이상의 모노하이드록시폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하나 이들로 한정되지 않음), 1종 이상의 폴리알킬렌 옥사이드, 1종 이상의 폴리옥시란, 1종 이상의 폴리올레핀계 알코올, 예를 들어, 폴리비닐 알코올, 1종 이상의 폴리카복실레이트, 1종 이상의 폴리(비닐피롤리돈), 1종 이상의 폴리(옥시에틸렌옥시메틸렌), 1종 이상의 폴리(아미노산), 1종 이상의 폴리아크릴오일모르폴린, 1종 이상의 아미드와 1종 이상의 알킬렌 옥사이드의 1종 이상의 공중합체, 1종 이상의 덱스트란 및 1종 이상의 히알루론산을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

구체적으로, 본 발명의 생체중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리트라이메틸렌 글리콜, 폴리락트산, 폴리아크릴산, 폴리아미노산, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리(L-라이신), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈 또는 폴리아크릴아미드를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본 발명의 생체중합체는 당분야에 공지되어 있는, 일작용기에 의해 활성화된 임의의 직쇄 또는 분지쇄 형태의 중합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분자량(활성화 기의 질량을 제외함)이 약 1 kDa 내지 약 100 kDa인 중합체가 포함된다. 분자량의 적절한 범위는 약 2 kDa 내지 약 100 kDa, 약 2 kDa 내지 약 20 kDa, 약 5 kDa 내지 약 20 kDa, 약 5 kDa 내지 약 30 kDa, 약 10 kDa 내지 약 20 kDa, 약 약 10 kDa 내지 약 60 kDa, 약 18 kDa 내지 약 60 kDa, 약 12 kDa 내지 약 30 kDa, 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 20 kDa 또는 약 30 kDa을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 직쇄 PEG의 경우, 약 10 kDa, 약 20 kDa 또는 약 30 kDa의 분자량은 각각 약 230개, 약 450개 또는 약 680개의 에틸렌 옥사이드 단량체 유니트(unit)의 중합도(n)에 상응한다.

본 명세서에서 사용되는 "PEG"는 직쇄이든, 분지쇄이든 아니면 다수의 아암(arm)을 가진 형태이든 관계없이 그리고 말단 캡핑된 것이든 아니면 하이드록실로 종결된 것이든 관계없이 에틸렌 옥사이드의 모든 중합체를 포함한다. "PEG"는 에틸렌 옥사이드의 중합체에 대해 당분야에서 사용되는 다른 명칭들 중에서 폴리(에틸렌 글리콜), 메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 또는 mPEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)-모노메틸 에테르, 알콕시폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드) 또는 PEO, α-메틸-Ω-하이드록시-폴리(옥시-1,2-에틸렌디일) 및 폴리옥시란으로서 당분야에 공지되어 있는 중합체를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "PEG화"는 PEG를 생체활성 표적 분자, 특히 수용체-결합 단백질에 공유커플링시키는 임의의 과정을 의미한다. PEG화에 의해 생성된 결합체는 "PEG화된" 것으로서 지칭된다. PEG화는 아민-특이적 PEG화, N-말단 지정 PEG화 및/또는 부위-특이적 변경을 포함하는 1종 이상의 화학적 변경 방법을 이용하여 달성할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "결합체"는 생체중합체, 예를 들어, PEG가 표적 분자, 예를 들어, rhIL-11 또는 mIL-11에 공유부착되어 있는 생성물을 의미한다. 용어 "결합"은 전술한 바와 같은 결합체의 형성을 의미한다. 생체중합체를 표적 분자에 결합시키는 분야에서 숙련된 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이용되는 임의의 방법이 본 발명에서 이용될 수 있다.

rhIL-11 분자는 아민-특이적 결합 방법이 적용되는 경우 PEG와 같은 생체중합체의 공유부착에 이용될 수 있는 총 4개의 부위를 함유한다. 상기 4개의 가능한 부위는 3개의 라이신 잔기(Lys⁴¹, Lys⁹⁸ 및 Lys¹⁷⁴) 및 N-말단을 포함한다. rhIL-11의 3차원 구조 예측과 관련하여, 상기 3개의 1차 아민 기들은 rhIL-11의 외면 상에 존재한다. rhIL-11의 Lys⁴¹, Lys⁹⁸ 및 Lys¹⁷⁴는 각각 mIL-11(서열번호 2)의 Lys³³, Lys⁹⁰ 및 Lys¹⁶⁶에 상응한다.

생체중합체 결합체, 예컨대, PEG 결합체의 전형적인 제제에서, PEG에 결합되는 관심있는 분자(예를 들어, rhIL-11 또는 mIL-11)는 몰 과량의 PEG와 함께 완충제에서 항온처리된다. 이 반응은 원하는 반응 시간, 온도 및 PEG 변경제/IL-11 분자의 몰비를 이용하여 수행한다. PEG화에 이용되는 반응 조건에 대한 정보는 당분야에 공지되어 있고 예를 들어, 문헌(Zalipsky et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 15:100-114 (1992)) 및 문헌(Kinstler et al., Pharm. Res. 75:996-1002 (1996))에서 찾을 수 있다. 이러한 결합 반응을 수행함에 있어서, 다카기와 그의 동료들은 rhIL-11 분자의 생물학적 활성을 유지하는 것이 어렵다는 것을 발견하였다(문헌(Takagi et al., Journal of Controlled Release 119: 271-278 (2007)) 참조).

벡터 및 숙주 세포

벡터는 본원에서 mIL-11, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 코딩하는 DNA 또는 RNA를 증폭시키고/시키거나 mIL-11, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 코딩하는 DNA를 발현하는 데 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 그 자신에 연결되어 있는 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 1종이 "플라스미드"이고, 플라스미드는 추가 DNA 분절(segment)과 라이게이션(ligation)될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 벡터의 또 다른 종류는 바이러스 벡터이고, 이때 추가 DNA 분절은 바이러스 게놈과 라이게이션될 수 있다. 일부 벡터들(예를 들어, 박테리아의 복제 기점을 가진 박테리아 벡터 및 에피좀(episome) 포유동물 벡터)은 이들이 도입되는 숙주 세포 내에서 자가복제할 수 있다. 다른 벡터들(예를 들어, 비-에포좀 포유동물 벡터)은 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어, 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 일부 벡터들은 이들에 작동가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터들은 본 명세서에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 사용될 수 있는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있는데, 이는 플라스미드가 벡터의 가장 흔히 사용되는 형태이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터들(예를 들어, 복제 불능 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)을 포함한다.

원핵세포에서의 단백질 발현은 융합 단백질 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 기본구성(constitutive) 프로모터 또는 유도성(inducible) 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 이. 콜라이(E. coli)에서 가장 빈번하게 수행된다. 융합 벡터는 그 내부에 코딩된 단백질, 통상적으로 재조합 단백질의 아미노 말단에 다수의 아미노산을 부가한다. 이러한 융합 벡터는 전형적으로 (1) 재조합 단백질의 발현을 증가시키고, (2) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키고, (3) 친화성 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질의 정제를 보조하는 데 기여한다. 종종, 융합 발현 벡터에서, 단백질분해 절단 부위를 융합 물질과 재조합 단백질의 연접 부위에 도입하여 융합 단백질의 정제 후 상기 재조합 단백질을 상기 융합 부분으로부터 분리할 수 있다. 이러한 효소들 및 이들의 동족 인식 서열들은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로카이네이즈(enterokinase)를 포함한다. 전형적인 융합 발현 벡터는 글루타티온-S-트랜스퍼레이즈(GST)를 표적 단백질에 융합시키는 pGEX(아머샴(Amersham); Smith et al., Gene 67:31-40 (1988)), 말토스 E 결합 단백질을 표적 단백질에 융합시키는 pMAL(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 미국 매사추세츠주 비벌리 소재) 또는 단백질 A를 표적 단백질에 융합시키는 pRIT5(파마샤(Pharmacia), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 포함한다.

적절한 유도성 비-융합 이. 콜라이 발현 벡터의 예로는 pTrc(Amrann et al., Gene 69:301-315 (1988)) 및 pET 1 Id(Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)를 들 수 있다. 이. 콜라이에서 재조합 단백질 발현을 최대화하는 한 방법은 재조합 단백질을 단백질분해적으로 절단하는 능력이 손상된 숙주 박테리아에서 단백질을 발현시키는 것이다(문헌(Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128) 참조). 또 다른 방법은 아미노산 각각에 대한 개개의 코돈이 이. 콜라이에서 우세하게 사용되는 코돈이 되도록 발현 벡터 내로 삽입될 핵산의 핵산 서열을 변경시키는 것이다(Wada et al., Nuc. Acids Res. 20:2111-2118 (1992)). 본 발명의 핵산 서열의 이러한 변경은 표준 DNA 합성 기법에 의해 수행될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이세스 세레비지애(S. Cerevisiae)에서의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터의 예로는 pYepSec1(Baldari et al., EMBO J. 6:229-234 (1987)), pMFa(Kurjan et al., Cell 50:933-943 (1982)), pJRY88(Schultz et al., Gene 54:113-123 (1987)), pYES2(인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재) 및 picZ(인비트로겐 코포레이션)를 들 수 있다.

대안적으로, mIL-11, 또는 이의 변이체 또는 유도체는 바큘로바이러스(baculovirus) 발현 벡터를 사용하여 곤충 세포 내에서 발현시킬 수 있다. 배양된 곤충 세포(예를 들어, SF9 세포)에서 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있는 바큘로바이러스 벡터는 pAc 계열(Smith et al., Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165 (1983)) 및 pVL 계열(Lucklow et al., Virology 170:31-39 (1989))을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포 내에서 발현시킨다. 포유동물 발현 벡터의 예로는 pCDM8(Seed, Nature 329:840 (1987)) 및 pMT2PC(Kaufman et al., EMBO J. 6: 187-195 (1987))를 들 수 있다. 포유동물 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 종종 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마(polyoma), 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 원숭이(Simian) 바이러스 40으로부터 유래된다. 원핵세포 및 진핵세포 둘다에 적합한 다른 발현 시스템에 대해서는 예를 들어, 문헌(Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989)의 제16장 및 제17장을 참조한다.

바람직한 발현 벡터는 mIL-11, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 코딩하는 DNA 서열이 적절한 숙주 내에서 mIL-11, 또는 이의 변이체 또는 유도체의 발현을 수행할 수 있는 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있거나 결합되어 있는 복제가능한 DNA 구축물(construct)이다. DNA 영역들은 이들이 서로에 대해 기능적으로 관련되어 있을 때 작동가능하게 연결되어 있거나 결합되어 있다. 예를 들어, 프로모터는 이 프로모터가 그 자신에 연결되어 있거나 결합되어 있는 코딩 서열의 전사를 조절하는 경우 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있거나 결합되어 있다. 당분야에서 숙련된 기술을 가진 자는 발현 벡터의 디자인이 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 의해 좌우될 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어, 본 명세서에 기재된 핵산에 의해 코딩된 단백질 또는 펩티드(융합 단백질 또는 펩티드를 포함함)를 생성할 수 있다. 바람직한 벡터는 바람직하게는 숙주 유기체에 의해 인식되는 프로모터를 함유한다. 본 발명의 프로모터 서열은 원핵세포, 진핵세포 또는 바이러스의 프로모터 서열일 수 있다. 적절한 원핵세포의 프로모터 서열의 예로는 이. 콜라이의 trp 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터, recA 프로모터, 열충격(heat shock) 프로모터 및 lacZ 프로모터를 들 수 있다. 추가 프로모터는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 람다의 PR 프로모터 및 PL 프로모터, 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 프로모터를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

나아가, 적절한 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 스크리닝을 가능하게 하는 적절한 마커를 포함할 수 있다. 선택된 숙주의 형질전환은 당분야에서 숙련된 기술을 가진 자에게 잘 공지되어 있고 상기 샘브룩(Sambrook)의 문헌에 기재되어 있는 다양한 기법들 중 임의의 기법을 이용하여 수행한다.

복제 기점은 외래 복제 기점을 포함하도록 벡터를 구축함에 의해 제공될 수 있거나 숙주 세포 염색체 복제 기작에 의해 제공될 수도 있다. 벡터가 숙주 세포 염색체 내로 통합되는 경우, 숙주 세포 염색체 복제 기작에 의한 복제 기점의 제공만으로도 충분할 수 있다.

라이게이션용 블런트(blunt)-말단 또는 스태거드(staggered)-말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한효소 분해, 적절한 경우 코헤시브(cohesive) 말단의 충전(filling in), 바람직하지 않은 연결을 피하기 위한 알칼리성 포스파테이즈(alkaline phosphatase) 처리, 및 적절한 라이게이즈(ligase)를 사용한 라이게이션을 포함하는 보편적인 기법들을 이용하여 mIL-11, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 벡터 DNA와 재조합시킬 수 있다. 이러한 조작에 대한 기법은 상기 샘브룩의 문헌에 개시되어 있고 당분야에 잘 공지되어 있다. 포유동물 발현 벡터의 구축 방법은 예를 들어, 본 명세서에 전체로서 참고로 각각 도입되는 문헌(Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)), 문헌(Cosman et al., Mol. Immunol. 23:935 (1986)), 문헌(Cosman et al., Nature 312:768 (1984)), 유럽특허출원 공개 제0367566호 및 국제특허출원 공개 제WO 91/18982호에 개시되어 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 코딩된 mIL-11, 또는 이의 변이체 또는 유도체 폴리펩티드의 발현을 허용하는 방식으로 mIL-11, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포(원핵세포 및 진핵세포를 포함함)가 제공된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 원형 플라스미드의 일부로서 숙주 세포 내로 도입될 수 있거나, 단리된 단백질 코딩 영역을 포함하는 선형 DNA 또는 바이러스 벡터로서 도입될 수 있다. 당분야에 잘 공지되어 있고 관용적으로 실시되고 있는, 숙주 세포 내로의 DNA의 도입 방법은 형질전환, 형질감염, 전기천공, 핵 주입, 또는 운반체, 예컨대, 리포좀, 마이셀(micelle), 유령 세포 및 원형질체(protoplast)와의 융합을 포함한다. 본 발명의 발현 시스템은 박테리아, 효모, 진균, 식물, 곤충, 무척추동물, 척추동물 및 포유동물 세포 시스템을 포함한다.

본 발명의 숙주 세포는 mIL-11, 또는 이의 변이체 또는 유도체 폴리펩티드를 대규모로 제조하는 방법에서 유용하고, 이때 상기 세포는 적절한 배양 배지에서 생장하고, 원하는 폴리펩티드 생성물은 당분야에 공지되어 있는 정제 방법, 예를 들어, 면역친화성 크로마토그래피, 수용체 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 여과, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 역상 HPLC 등을 포함하는 보편적인 크로마토그래피 방법에 의해 상기 세포 또는 이 세포가 생장된 배지로부터 단리된다. 다른 정제 방법은 원하는 단백질이 특이적 결합 파트너 또는 물질에 의해 인식되는 특이적 태그, 표지 또는 킬레이팅 물질을 가진 융합 단백질로서 발현되고 정제되는 방법들을 포함한다. 정제된 단백질은 원하는 단백질을 제공하도록 절단될 수 있거나 온전한 융합 단백질로서 남겨질 수 있다. 융합 성분의 절단은 절단 과정의 결과로서 추가 아미노산 잔기를 가진 원하는 단백질의 형태를 생성할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모 및 진핵세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 원핵 발현 벡터가 사용되는 경우, 적절한 숙주 세포는 클로닝된 서열을 발현할 수 있는 임의의 원핵세포일 것이다. 적절한 진핵세포는 에스케리치아(Escherichia) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 및 스타필로코커스(Staphylococcus) 속의 박테리아를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

진핵 발현 벡터가 사용되는 경우, 적절한 숙주 세포는 클로닝된 서열을 발현할 수 있는 임의의 진핵세포일 것이다. 바람직하게는, 진핵세포는 고등 진핵동물의 세포이다. 적절한 진핵세포는 비-인간 포유동물 조직 배양 세포 및 인간 조직 배양 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 바람직한 숙주 세포는 곤충 세포, HeLa 세포, 차이니스 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(COS 세포), 인간 293 세포, 및 뮤린 3T3 섬유모세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 세포 배양물에서 이러한 세포들을 증식시키는 것은 관용적인 기법이 되었다(전체로서 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌(Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Eds. (1973)) 참조).

또한, 효모 숙주가 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 바람직한 효모 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 피치아(Pichia) 속 및 클루베로마이세스(Kluveromyces) 속을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 바람직한 효모 숙주는 사카로마이세스 세레비지애 및 피치아 파스토리스(P. pastoris)이다. 바람직한 효모 벡터는 2T 효모 플라스미드로부터 유래된 복제 기점 서열, 자가복제 서열(ARS), 프로모터 영역, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 및 선별가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다. 효모 및 이. 콜라이 둘다에서 복제될 수 있는 셔클(shuttle) 벡터도 바람직한 벡터에 포함된다.

대안적으로, 곤충 세포가 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 바큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 발현시킨다(전체로서 본 명세서에 참고로 각각 도입되는 문헌(Luckow et al., Bio/Technology, 6:47 (1988), BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL), 문헌(O'Rielly et al. (Eds.), W.H. Freeman and Company, New York, 1992) 및 미국특허 제4,879,236호 참조). 또한, 예를 들어, MAXBACTM 완전 바큘로바이러스 발현 시스템(인비트로겐)이 곤충 세포 내에서 발현을 위해 사용될 수 있다. 적절한 숙주 세포는 문헌(Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))에 더 기재되어 있다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소의 사용을 통해 시험관 내에서 전사되고 번역될 수 있다.

본 발명의 숙주 세포, 예컨대, 배양물 중의 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 사용하여 mIL-11 폴리펩티드, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 생성할(즉, 발현시킬) 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 mIL-11, 또는 이의 변이체 또는 유도체가 생성되도록 본 발명의 숙주 세포(mIL-11, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입되어 있음)를 적절한 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 mIL-11, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 배지 또는 숙주 세포로부터 단리하는 단계를 추가로 포함한다.

mIL-11, 또는 이의 변이체 또는 유도체 폴리펩티드가 주로 세포 내에서 발견되는 경우, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있는 임의의 표준 기법을 이용하여 세포내 물질(그람-음성 박테리아의 경우 봉입체(inclusion body)를 포함함)을 숙주 세포로부터 추출할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 숙주 세포를 프렌치 프레스(French press)로 용해시켜 원형질/세포질의 내용물을 방출시키는 것, 균질화, 및/또는 초음파처리 후 원심분리를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

mIL-폴리펩티드, 또는 이의 변이체 또는 유도체가 세포질 내에서 봉입체를 형성하는 경우, 이러한 봉입체는 종종 세포 내막 및/또는 세포 외막에 결합할 수 있다. 원심분리 시, 봉입체는 주로 펠렛 물질의 형태로 발견될 것이다. 펠렛 물질을 pH 극한에서 처리하거나 알칼리 pH에서 디티오쓰레이톨(dithiothreitol) 또는 산 pH에서 트리스-카르복시에틸 포스핀(tris-carboxyethyl phosphine)과 같은 환원제의 존재 하에 세제, 구아니딘, 구아니딘 유도체, 우레아 또는 우레아 유도체와 같은 1종 이상의 무질서 유발제로 처리하여 봉입체를 방출하고 분해하고 용해시킬 수 있다. 일단 mIL-11 폴리펩티드, 또는 이의 변이체 또는 유도체가 용해되면, 상기 mIL-11 폴리펩티드, 이의 변이체 또는 유도체는 겔 전기영동, 면역침전 등을 이용하여 분석할 수 있다. mIL-11 폴리펩티드, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 단리하는 다양한 방법이 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 자명할 것이고, 예를 들어, 이하에 기재된 방법 및 문헌(Marston et al., Meth. Enzymol. 182:264-275 (1990))(전체로서 본 명세서에 참고로 도입됨)에 기재된 방법과 같은 표준 방법을 이용하여 단리를 달성할 수 있다.

단리된 mIL-11 폴리펩티드, 또는 이의 변이체 또는 유도체가 이용된 단리 방법의 수행 후 생물학적 활성을 나타내지 않는 경우, 상기 폴리펩티드를 그의 3차원 구조로 "리폴딩(refolding)"시키거나 전환시키고 이황화 결합을 발생시키는 다양한 방법들을 이용하여 생물학적 활성을 회복시킬 수 있다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있는 방법은 용해되는 폴리펩티드의 pH를 특정 농도의 무질서 유발제의 존재 하에 통상적으로 7보다 높은 pH로 조절하는 것을 포함한다. 무질서 유발제의 선택은 봉입체 용해를 위해 통상적으로 저농도로 사용되는 무질서 유발제의 선택과 매우 유사하지만 용해를 위해 사용되는 무질서 유발제와 반드시 동일할 필요는 없다. 단백질의 시스테인 가교(들)의 형성에서 이황화 셔플링(shuffling)이 일어나게 하는 특정 산화환원력을 발생시키기 위해 환원제를 사용하거나 환원제 및 그의 산화된 형태를 특정 비율로 사용할 필요가 있을 수 있다. 통상적으로 사용되는 산화환원 커플 중 몇몇 커플은 시스테인/시스타민, 글루타티온(GSH)/디티오비스 GSH, 염화구리, 디티오쓰레이톨(DTT)/디티안 DTT, 2-머캡토에탄올(bME)/디티오-b(ME)를 포함한다. 리폴딩의 효율을 증가시키기 위해, 보조용매, 예컨대, 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 및 아르기닌을 사용할 필요가 있을 수 있다.

치료 방법

본 발명은 IL-11에 반응하는 질환 또는 장애의 치료, 완화 또는 예방 방법을 포함한다. IL-11 투여에 반응할 수 있는 질환 또는 장애의 예로는 혈소판 감소증(예를 들어, 골수억제 화학요법에 의해 유도된 혈소판 감소증), 면역-매개 장애(예를 들어, 세포독성 T 세포-매개 및 보체-매개 세포독성, 이식편-대-숙주 질환), 점막염(예를 들어, 구강 점막염, 위장 점막염, 비강 점막염, 직장염), 염증성 장 질환(예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염, 부정형 대장염, 감염성 대장염), 염증성 피부 장애(예를 들어, 건선, 아토피성 피부염, 접촉성 과민반응), 패혈증, 치은염, 치주염, 염증성 안 질환(예를 들어, 결막염, 망막염, 포도막염), 위장 운동 장애(예를 들어, 위식도 역류 질환, 섭식 과민증, 수술 후 무력 장폐쇄증), 췌장염, 괴사 장염, 아프타 궤양, 인두염, 식도염, 소화 궤양, AIDS, 류마티스 관절염, 골관절염, 척추관절병증, 항생제에 의해 유도된 설사병, 다발성 경화증, 당뇨병, 골다공증, 재관류 손상, 천식, 비염, 전자간증, 폰 빌레브란트병(Von Willebrand disease), A형 혈우병, 비-호지킨스 림프종 및 조혈 전구세포 또는 줄기세포 결핍증을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료 유효량"은 장애의 1종 이상의 증상을 완화시키거나, 장애의 발달을 예방하거나 장애의 퇴행을 유발하기에 충분한 치료제의 양을 의미한다. 예를 들어, 혈소판 감소증의 치료와 관련하여, 치료 유효량은 바람직하게는 혈소판의 혈중 농도를 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 이상까지 증가시키는 치료제의 양을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "예방한다", "예방하는" 및 "예방"은 동물에서의 병적 세포의 발생 감소 또는 원하는 세포(예를 들어, 혈소판)의 감소 방지를 의미한다. 예방은 대상체(subject)에서 원하는 세포의 감소를 완전히, 예를 들어, 전체적으로 방지하는 것일 수 있다. 예방은 대상체에서 원하는 세포의 감소가 본 발명을 이용하지 않은 경우에 일어나는 원하는 세포의 감소보다 적게 일어나게 하는 부분적인 예방일 수도 있다.

mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체는 질환 또는 장애의 증상 발병 후 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체는 질환 또는 장애가 일어날 가능성이 높은 조건 하에 상기 질환 또는 장애의 발병 전에 투여되어 질환 또는 장애의 중증도를 예방하거나 감소시킬 수 있다. 예를 들어, mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체의 PEG 결합된 형태는 혈소판 감소증을 야기하는 것으로 공지되어 있는 화학요법 치료를 받은 환자에게 투여될 수 있다.

mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체는 질환 또는 장애의 치료, 완화 또는 예방에 효과적인 것으로 공지되어 있는 1종 이상의 다른 치료제 또는 치료와 함께 투여될 수 있다. 다른 치료제 또는 치료의 예로는 다른 성장 인자(예를 들어, 인터루킨, 인터페론, 콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자, 에리쓰로포이에틴), 면역억제제, 소염제, 항암제, 항체 및 방사선치료를 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체, 및 1종 이상의 다른 치료제는 단일 조성물 또는 별개의 조성물로서 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체, 및 1종 이상의 다른 치료제는 하기 조건 중 1종 이상의 조건 하에 동물에게 투여된다: 상이한 주기, 상이한 기간, 상이한 농도, 상이한 투여 경로 등. 일부 실시양태에서, mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체는 다른 치료제의 투여 전, 예를 들어, 다른 치료제를 투여하기 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 10시간, 12시간 또는 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일, 또는 1주, 2주, 3주 또는 4주 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체는 치료제의 투여 후, 예를 들어, 치료제의 투여로부터 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 10시간, 12시간 또는 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일, 또는 1주, 2주, 3주 또는 4주 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체 및 다른 치료제는 동시에 투여되되 상이한 스케쥴로 투여된다. mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체는 매일, 주 당 2회 또는 주 당 1회 투여되고, 다른 치료제 또는 항암제는 주 당 1회, 2주 당 1회, 3주 당 1회 또는 4주 당 1회 투여된다.

조성물

본 발명의 범위 내에 포함되는 조성물은 본 발명의 mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체가 원하는 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 함유되어 있는 모든 조성물들을 포함한다. 개체에 따라 달라질 수 있지만, 성분 각각의 유효량의 최적 범위의 결정은 당분야의 기술 내에 있다. 전형적으로, mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체는 체중 1 ㎏ 당 약 1 ㎍ 내지 약 5000 ㎍의 투여량으로 동물, 예를 들어, 인간에게 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 투여량은 체중 1 ㎏ 당 약 2 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍ 또는 약 5 ㎍ 내지 약 250 ㎍이다(화학적 변경이 없는 단백질만의 질량을 계산함).

일부 실시양태에서, mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체를 포함하는 조성물은 단위 투여 제형, 예를 들어, 1회-사용 용기, 조제 주사용액, 환제, 캡슐제 또는 국소 조성물의 형태이다. 한 실시양태에서, 단위 투여 제형은 mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체를 약 500 ㎎ 미만, 예를 들어, 약 0.1 ㎎ 내지 약 500 ㎎, 약 0.2 ㎎ 내지 약 100 ㎎ 또는 약 0.5 ㎎ 내지 약 50 ㎎의 양으로 포함한다.

mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체는 단리된 폴리펩티드로서 투여될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 폴리펩티드는 약학적으로 사용될 수 있는 제제 형태로의 본 발명의 폴리펩티드의 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적절한 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 제제의 일부로서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제제는 약 0.01% 내지 99%, 바람직하게는 약 0.25% 내지 75%의 활성 폴리펩티드를 부형제와 함께 함유한다.

한 실시양태에서, 약학 조성물은 mIL-11 폴리펩티드, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체를 안정화시켜 저장 시 분해를 방지하는 부형제를 포함한다. 한 실시양태에서, 약학 조성물은 생체적합성 중합체에 결합된 폴리펩티드의 안정성을 보존하기 위해 건조된 형태, 예를 들어, 동결건조된 형태로 존재한다. 건조된 형태의 조성물은 동물에게 투여되기 직전에 적절한 액체, 예를 들어, 물 또는 식염수에 용해된다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 액체 형태이다. mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체에 적합한 약학 조성물의 예로는 mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체적합성 중합체 결합체, 글리신 및 냉동보호제, 및 경우에 따라 폴리소르베이트, 메티오닌 및 완충제를 포함하는 조성물을 들 수 있다(미국특허 제6,270,757호 및 제7,033,992호 참조).

본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 화합물의 유리한 효과를 경험할 수 있는 임의의 동물에게 투여될 수 있다. 이러한 동물들 중에서 포유동물, 예컨대, 인간이 바람직하지만, 본 발명은 이들로 한정되지 않는다. 다른 동물은 가축(소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이 등)을 포함한다. 한 실시양태에서, 동물은 인간 또는 원숭이이다.

약학 조성물은 그의 원하는 목적을 달성하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피, 협측, 수막강내, 두개내, 비강내 또는 국소 경로에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 병행적으로, 투여는 경구 경로에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 치료되거나, 완화되거나 예방될 질환 또는 장애에 의해 좌우된다. 예를 들어, 혈소판 감소증의 자극에 바람직한 투여 경로는 피하 경로이다. 위장 염증 장애의 치료, 완화 또는 예방에 바람직한 투여 경로는 국소 경로이다. 투여되는 투여량은 수용자의 성별, 건강 및 체중, 존재하는 경우 병행 치료의 종류, 치료 빈도 및 원하는 효과의 성질에 의해 좌우될 것이다.

본 발명의 약학 제제는 그 자체로 공지되어 있는 방법, 예를 들어, 보편적인 혼합, 과립화, 당의정-제조, 용해 또는 동결건조 방법에 의해 제조된다. 따라서, 경구 사용을 위한 약학 제제는 활성 화합물을 고체 부형제와 혼합하고 생성된 혼합물을 경우에 따라 분쇄하고 원하는 경우 또는 필요한 경우 적절한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어(core)를 수득함으로써 제조할 수 있다.

적절한 부형제는 특히, 사카라이드와 같은 충전제, 예를 들어, 락토스 또는 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨, 셀룰로스 제제 및/또는 인산칼슘, 예를 들어, 삼염기성 인산칼슘 또는 인산수소칼슘일 뿐만 아니라 전분 페이스트와 같은 결합제, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 벼 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸쓰, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐 피롤리돈을 사용하는 결합제이다. 필요한 경우, 붕해제, 예컨대, 상기 언급된 전분뿐만 아니라 카복시메틸-전분, 가교-결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 이의 염, 예컨대, 알긴산나트륨을 첨가할 수 있다. 보조제는 특히, 유동-조절제 및 윤활제, 예를 들어, 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 염, 예컨대, 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산칼슘, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜이다. 당의정 코어는 원하는 경우 위액에 대한 내성을 나타내는 적절한 코팅제로 코팅되어 있다. 이를 위해, 경우에 따라 아라비아 껌, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 락커 용액 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축된 사카라이드 용액을 사용할 수 있다. 위액에 대한 내성을 나타내는 코팅제를 제조하기 위해, 적절한 셀룰로스 제제, 예컨대, 아세틸셀룰로스 프탈레이트 또는 하이드록시프로필메틸-셀룰로스 프탈레이트의 용액이 사용된다. 예를 들어, 활성 화합물 투여량의 조합을 확인하거나 특징규명하기 위해 안료 또는 색소를 정제 또는 당의정 코팅제에 첨가할 수 있다.

경구 투여될 수 있는 다른 약학 제제는 젤라틴으로 만들어진 푸쉬-피트(push-fit) 캡슐제뿐만 아니라, 젤라틴 및 가소제, 예컨대, 글리세롤 또는 소르비톨로 만들어진 밀봉된 연질 캡슐제를 포함한다. 상기 푸쉬-피트 캡슐제는 충전제, 예컨대, 락토스, 결합제, 예컨대, 전분, 및/또는 윤활제, 예컨대, 탈크 또는 스테아르산마그네슘 및 경우에 따라 안정화제와 혼합될 수 있는 과립 형태의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 연질 캡슐제에서, 활성 화합물은 바람직하게는 적절한 액채, 예컨대, 지방유 또는 액체 파라핀에 용해되거나 현탁된다. 안정화제도 첨가될 수 있다.

또한, 본 발명은 약학 키트를 포함하는 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체중합체 결합체뿐만 아니라 적절한 대조군, 예컨대, 양성 대조군 및/또는 음성 대조군을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 mIL-11, 또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체를 포함하는 생체중합체 결합체를 포함하는 약학 조성물을 포함할 수 있다. 상기 키트는 바람직하게는 추가 성분, 예를 들어, 설명서, 고체 지지체, 정량화 보조 시약 등을 포함한다. 화합물 또는 약제는 적절한 용기 내에 포장될 수 있다.

[실시예]

실시예 1: 인간 인터루킨-11( IL -11) 돌연변이체

A. 인간 IL -11 돌연변이체의 제조

인간 IL-11 돌연변이체(mIL-11)는 화학적 스트레스 및 단백질분해 스트레스를 견디도록 재디자인된 인간 인터루킨-11(IL-11)이다. 인간 IL-11(NCBI AAA59132.1 서열번호 1)의 N-말단 영역(1 내지 30개 잔기)이 결실되었고, 새로운 N-말단(인간 IL-11의 위치 31에 존재하는 발린에 상응함) 및 새로 형성된 위치 125(인간 IL-11의 위치 155에 상응하는 위치)의 아스파르트산이 각각 알라닌 및 아스파라긴으로 치환되었다. mIL-11의 아미노산 서열은 서열번호 2로서 앞서 기재된 바와 같다. pGEX4T 발현 벡터를 사용하여 mIL-11을 글루타티온-S-트랜스퍼레이즈 융합 단백질(GST-mIL-11)로서 발현시켰다. 상세한 제조 과정은 국제특허출원 공개 제WO 2006/126102(A2)호에 기재된 과정과 유사하다. 요약하면, 부위-지정 돌연변이유발을 통해 mIL-11을 코딩하는 cDNA를 발생시키고 pGEX4T의 앰피실린 내성 유전자가 카나마이신 내성 유전자로 치환되어 있는 pGEX4T-kan 발현 벡터 내로 도입하여 GST-mIL-11을 생성하였다. 생성된 발현 벡터 pGEX4T-GST-mIL-11을 이. 콜라이 KRX(프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 형질전환시켰다. 단일 형질전환체를 카나마이신(10 ㎍/㎖)으로 보충된 LB 브로쓰에 접종하고 생장이 적절한 수준(OD₆₀₀=0.5)에 도달할 때까지 30℃에서 항온처리하였다. 이어서, 아이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)(0.4 mM)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 세포를 30℃에서 3시간 내지 4시간 동안 더 생장시켰다.

GST-mIL-11의 발현은 SDS-PAGE로 확인하였다. 세포를 원심분리하여 모으고, 모은 세포를 2 mM EDTA가 함유된 pH 7.5의 50 mM 인산나트륨에 재현탁하고, 상기 세포를 초음파처리 또는 고압 균질화기를 이용하여 4℃에서 용해시켰다. 달리 명시되어 있지 않은 한, 하기 단계들은 4℃에서 수행되었다. 용해된 세포 잔해(debris)를 원심분리로 제거하고, 상청액을 GST-친화성 크로마토그래피(지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 미국 펜실배니아주 피츠버그 소재)에 적재하였다. 컬럼을 pH 7.5의 50 mM 인산나트륨으로 세척한 후, 10 mM의 환원된 글루타티온이 함유된 pH 7.5의 50 mM 인산나트륨으로 용출하였다. 용출된 GST-mIL-11 분획을 모으고 트롬빈 단백질분해를 위해 20℃에서 항온처리하였다. GST-mIL-11 1 ㎎ 당 0.75 U의 트롬빈을 첨가한 후, 약하게 교반하면서 20℃에서 1.5시간 동안 항온처리하였다. 단백질의 농도는 흡광 계수를 이용하여 UV-분광법으로 분석하였다. 단백질 분해는 1 내지 4℃로의 즉시 냉각을 통해 종결시켰다. 그 다음, 반응 용액을 양이온 교환 크로마토그래피(SP 세파로스 급속 유동 수지, 지이 헬쓰케어, 미국 펜실배니아주 피츠버그 소재)에 적재하였다. 컬럼을 pH 7.5의 50 mM 인산나트륨으로 광범위하게 세척하였다. 이 조건 하에, 글루타티온-S-트랜스퍼레이즈 및 글루타티온을 이동상에서 용출하고, 결합된 상태로 남아 있는 mIL-11을 절단하였다. mIL-11 분획을 pH 7.5의 50 mM 인산나트륨 중의 0 mM 내지 40 mM NaCl 선형 구배를 통해 모은 후, 벤즈아미딘 컬럼(지이 헬쓰케어, 미국 펜실배니아주 피츠버그 소재)에 적재하여 임의의 잔류 트롬빈을 제거하였다. 유동-관통 분획을 모으고, 상기 분획을 세파덱스 75 컬럼(지이 헬쓰케어, 미국 펜실배니아주 피츠버그 소재)에 적재하여 완충제를 0.1% 폴리소르베이트 20 및 5% 소르비톨이 함유된 pH 5.0의 50 mM 아세트산나트륨으로 교환하였다. mIL-11 분획을 모아 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다(도 1, 레인 2).

B. 인간 IL-11 돌연변이체의 특징규명

IL-11에 대한 돌연변이의 효과를 조사하기 위해, 원형 이색성(CD) 분광법 및 세포 증식 어세이를 통해 각각 2차 구조 어세이 및 생물학적 활성 어세이를 수행하였다. 인간 인터루킨-11은 4개 나선 다발 폴딩을 채택하는 것으로 추정된다(Czupryn et al., JBC 270:978-985 (1995)). 상기 문헌(Czupryn et al.)에 기재된 모델과 유사하되 약간 변경된 JASCO J-810 모델(일본 도쿄 소재)을 이용하여 mIL-11의 원거리-UV CD 스펙트럼을 기록하였다. CD 스펙트럼 기록은 0.1 cm의 경로 길이를 이용하여 25±1℃에서 pH 8.0의 10 mM 트리스-HCl에서 수행하였다. 샘플 농도는 0.5 ㎎/㎖이었다. 대조군으로서 재조합 인간 IL-11(rhIL-11, 와이어쓰, 미국 뉴저지주 소재, 서열번호 3)도 분석하였다. mIL-11의 CD 스펙트럼은 전형적인 알파-나선 신호를 나타내었고 rhIL-11의 CD 스펙트럼과 유사하였다(도 2A). 나아가, IL-11 수용체를 발현하는 Ba/F3 세포를 사용하여 mIL-11의 세포 증식 활성을 시험하였을 때(상세한 과정에 대해서는 실시예 5 참조), mIL-11의 생물학적 활성 곡선은 rhIL-11의 생물학적 활성 곡선과 유사하였다(도 2B). 이 결과는 IL-11에 도입된 돌연변이가 IL-11이 그의 수용체와 결합하는 능력에 영향을 미치지 않고 분자의 전체 구조에도 영향을 미치지 않음을 입증한다. 세포주에 대한 상세한 정보 및 어세이 프로토콜은 실시예 5에 설명되어 있다.

실시예 2: 산성 조건 하에 mIL -11의 안정성 어세이

실시예 1에 기재된 바와 같이, mIL-11은 화학적 스트레스 하에 IL-11보다 더 안정하도록 디자인되었다. mIL-11의 안정성과 IL-11의 안정성을 비교하기 위해, 강제 분해 실험을 수행하였다. 요약하면, 실시예 1에서 제조된 mIL-11 및 와이어쓰(미국 뉴저지주 소재)로부터 구입한 rhIL-11을 50℃에서 pH 3.5의 2 mM 시트르산 완충제에서 0일 내지 4일 동안 항온처리하였다. 처리된 샘플을 일정한 시점(0일, 1일, 2일, 3일 및 4일)에서 모아 즉시 동결시킴으로써 분석할 때까지 반응을 정지시켰다. 분해된 생성물을 SDS-PAGE 및 역상 HPLC(RP-HPLC, C4, 5 X 4.6 mm, 바이닥(Vydac), 미국 일리노이주 디어필드 소재)로 분석하였다. RP-HPLC로부터 수득된 피크 각각(도 3)을 모아 에드만(Edman) 서열분석 및 질량 분광법으로 확인하였다.

SDS-PAGE(데이터는 나타내지 않음) 및 RP-HPLC(도 3)에 의한 분석 시, 처리한 지 24시간 이내에 약 60%의 rhIL-11이 분해되어 3개의 단편을 생성하였다. 이 결과는 문헌(Kenley and Warne, Pharma. Res. 11:72-76 (1994))에 이미 기재되어 있는 결과와 유사하다. RP-HPLC에 의한 분석 시, 산성 조건 하에 4일이 경과된 후 단지 3%의 온전한 rhIL-11이 관찰되었다. 이 결과도 상기 문헌(Kenley and Warne)에 이미 기재된 결과와 동일하다. 공통된 산-가수분해 부위는 rhIL-11에서 두 번 나타나고 mIL-11에서 한 번 나타나는, 프롤린(P)과 아스파르트산(D) 사이의 펩티드 결합이다(사선으로 표시됨, 도 4). 그러나, mIL-11의 경우, mIL-11의 대다수(약 85%)가 처리 전체에 걸쳐 온전한 상태로 남아 있었다(도 3). mIL-11의 관찰된 분해 부위는 프롤린 3과 아스파르트산 4 사이의 펩티드 결합이었다. rhIL-11과 달리, 위치 154와 위치 155 사이의 펩티드 결합(도 4)은 단백질 분해로부터 보호되었는데, 이러한 결과는 서열번호 2의 위치 124 및 125(서열번호 1의 위치 154(P) 및 위치 155(D)에 상응함)에서 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된 돌연변이 때문인 것으로 추정된다. 이 결과는 mIL-11이 산성 조건 하에 rhIL-11보다 현저하게 더 안정함을 입증한다. mIL-11의 이러한 특징은 PEG화에 있어서 유리한데, 이는 몇몇 경우 PEG화 조건이 매우 가혹한 조건이기 때문이다.

실시예 3: 아민-특이적 PEG 화를 이용한 일- PEG화된 IL -11 돌연변이체 제조

A. 일- PEG화된 IL -11 돌연변이체( PEG - mIL -11- SC )의 제조

IL-11 돌연변이체에는 4개의 표면-노출된 아민이 존재한다(N-말단의 일차 아민 1개, 및 라이신 잔기의 엡실론 아민 3개, 도 5). 아민-특이적 PEG화 방법은 이하에 기재된 바와 같이 수행되었다.

먼저, 실시예 1에 기재된 정제된 mIL-11을 pH 7.4의 인산염-완충 식염수(PBS)에 대해 투석하여 임의의 원치 않는 아민 기를 제거하였다. 그 후, 투석된 mIL-11 용액을 한외여과막(비바스핀2(Vivaspin2), 10K MWCO, 비바사이언스(Vivascience), 독일 소재)을 이용하여 1 ㎎/㎖의 농도로 농축하였다. mIL-11의 농도는 280 nm에서의 흡광도 측정(Pace et al., Prot. Sci. 4: 2411 (1995)) 또는 로우리(Lowry) 방법(Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265 (1951))으로 측정하였다. 투석된 mIL-11 용액을 약하게 교반하면서 실온(20℃ 내지 25℃)에서 5몰 과량의 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 석신이미딜 카르보네이트(mPEG-SC, IDB, 한국)와 함께 1시간 내지 2시간 동안 반응시켰다. 시험된 PEG 중합체의 길이는 5 kDa, 20 kDa 또는 30 kDa이었다. 부착된 PEG 중합체 길이와 관계없이 동일한 반응 및 정제 절차를 적용하였다. 그 다음, 반응 용액을 10K 막(비바스핀2, 30K MWCO, 비바사이언스, 독일 소재)을 이용하여 pH 5.0의 50 mM 아세트산나트륨에 대해 정용여과함으로써 비-반응된 PEG 중합체를 제거하였다.

그 다음, 보유물을 양이온 교환 크로마토그래피(SP-세파로스, 지이 헬쓰케어, 미국 펜실배니아주 피츠버그 소재)에 적재하고 pH 5.0의 50 mM 아세트산나트륨으로 평형화시켰다. 컬럼을 상기 완충제 중의 0 mM 내지 400 mM의 선형 염 구배로 용출하여 이-PEG화된(di-PEGylated) mIL-11, 일-PEG화된 mIL-11(PEG-mIL-11-SC) 및 비-PEG화된 mIL-11을 분리하였다. 이어서, 수득된 일-PEG화된 mIL-11 분획을 세파덱스 25 컬럼을 이용하여 제제화 완충제(0.1% 트윈 20 및 5% 소르비톨을 함유하는 pH 5.0의 50 mM 아세트산나트륨) 내로 탈염시켰다. PEG-mIL-11-SC의 농도는 280 nm에서의 흡광도 측정 및 로우리 방법으로 측정하였다. 최종 농도를 1 ㎎/㎖로 조정하고 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.

B. 특징규명

PEG-mIL-11-SC로 지칭되는 정제된 일-PEG화된 mIL-11은 SDS-PAGE(4% 내지 12% NuPAGE 노벡스(Novex) 비스-트리스 아크릴아미드 겔, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 및 크기-배제 HPLC(바이오-실(Bio-Sil) SEC 250, 바이오-라드(Bio-Rad), 미국 캘리포니아주 리치몬드 소재)로 분석하였다. 20 kDa mPEG-SC로 PEG화된 mIL-11에 대한 뚜렷한 50 kDa 밴드가 SDS-PAGE 겔 상에서 관찰되었는데(도 1, 레인 1), 이것은 정제 후 수득된 mIL-11의 대다수가 일-PEG화된 mIL-11임을 입증한다. 5% 미만의 75 kDa 밴드(이-PEG화된 mIL-11을 나타냄) 및 1% 미만의 비-반응된 mIL-11(18 kDa)이 검출되었다. 크기-배제 HPLC 분석을 이용하였을 때, 다소 더 높은 함량의 이-PEG화된 mIL-11(8%, 보유 시간 약 14분)이 검출된 반면, 비-반응된 mIL-11(1%)의 함량은 변동되지 않았다(도 6). 일-PEG화된 mIL-11(PEG-mIL-11-SC)의 총 순도는 어떤 정제 배치가 시험되었는 지와 관계없이 80%보다 더 높았다.

실시예 4: N-말단 특이적 PEG화를 이용한 일-PEG화된 mIL-11 돌연변이체 제조

A. N-말단 특이적 PEG 화 방법을 이용한 일- PEG화된 mIL -11 돌연변이체( PEG -mIL-11-AD)의 제조

PEG 생체중합체를 단백질의 N-말단에 선별적으로 도입하기 위해, 4몰 과량의 메톡시 PEG 프로피오닐알데하이드(20 kDa)(넥타 쎄라페틱스(Nektar Therapeutics), 미국 캘리포니아주 산 칼로스 소재)를 pH 5.0의 50 mM 아세트산나트륨에서 정제된 mIL-11 돌연변이체와 혼합하였다. 이어서, 나트륨 시아노보로하이드라이드(최종 농도 5 mM)를 환원제로서 첨가하였다. 반응 혼합물을 약하게 교반하면서 실온(20℃ 내지 25℃)에 24시간 동안 항온처리하였다. 정제 단계를 즉시 수행하거나 즉시 -20℃에서 저장함으로써 반응을 정지시켰다. 1개의 PEG 중합체가 N-말단에 부착되어 있는 mIL-11(PEG-mIL-11-AD)의 정제 방법은 실시예 3에 기재된 방법과 동일하였다.

B. 특징 규명

분석 방법은 실시예 3의 분석 방법과 동일하였다. 75 kDa, 50 kDa 및 18 kDa 근처에서 이동하는 3개의 밴드 또한 실시예 3의 경우에서와 같이 검출되었는데, 상기 3개의 밴드는 각각 이-PEG화된 mIL-11, 일-PEG화된 mIL-11 및 천연(비-결합된) mIL-11을 나타낸다. 단지 1% 미만의 이-PEG화된 mIL-11(75 kDa) 및 1% 미만의 비-반응된 mIL-11(18 kDa)이 검출되었다(도 7A). 크기-배제 HPLC 분석을 이용하였을 때, 일-PEG화된 mIL-11(보유 시간 약 15분)의 총 순도는 약 92%이었고, 이-PEG화된 mIL-11(보유 시간 약 14분)의 총 순도는 8%이었고, 비-반응된 또는 비-결합된 mIL-11의 총 순도는 1% 미만이었다(도 7B).

실시예 5: PEG화된 mIL -11의 시험관내 생물학적 활성

A. 인간 IL -11 수용체를 발현하는 Ba /F3 세포( Ba11G )의 구축

문헌(Lebeau et al., FEBS Letters 407: 141-147 (1997))에 기재된 방법과 유사한, gp130 및 IL-11 수용체 α-쇄를 발현하는 Ba/F3 세포를 사용하는 시험관내 세포 증식 어세이를 이용하여 PEG화된 mIL-11의 생물학적 활성을 측정하였다.

요약하면, Ba/F3 세포를 2종의 레트로바이러스 벡터, 즉 IL-11 수용체 α-쇄(NCBI NM 004512.3)를 발현하는 MIN-IL-11R 및 gp130(NCBI NM 602184)을 발현하는 MIH-gp130으로 형질도입시켜, IL-11 수용체, gp130 및 IL-11 수용체 α-쇄(IL-11R)를 안정하게 발현하는 Ba/F3 세포주(DSMZ, 독일 소재)를 제조하였다. 레트로바이러스 플라스미드 pMIN-IL-11R은 IL-11R 유전자를 pMIN 벡터(Yu et al., Gene Therapy 10: 706-711 (2003)) 내로 삽입하여 제조하였다. pMIH-gp130은 pMIN의 네오마이신 내성 유전자를 하이그로마이신 내성 유전자로 치환시킨 후 gp130 유전자를 삽입하여 제조하였다. 레트로바이러스 벡터 MIN-IL-11R을 제조하기 위해, 문헌(Yu et al., Gene Therapy 10: 706-711 (2003))에 기재된 바와 같이, gag-pol을 발현하는 pVM-GP 및 양생 외피(amphotropic envelope)를 발현하는 pVM-AE를 사용하여 pMIN-IL-11R을 HEK293T 세포 내로 형질감염시켰다. 레트로바이러스 벡터 MIH-gp130은 pMIH-gp130이 pMIN-IL-11R 대신에 형질감염되었다는 점을 제외하고 MIN-IL-11R의 제조 방법과 동일한 방법으로 제조하였다. 형질감염된 세포를 10% 태아소 혈청이 함유된 DMEM 배지에서 2일 동안 생장시켰다. 배양 후, 배양물 상청액을 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하여 세포-무함유 바이러스를 수득하였다. IL-11 수용체 α-쇄를 발현하는 Ba/F3 세포를 제조하기 위해, Ba/F3 세포를 레트로바이러스 벡터 MIN-IL-11R로 형질도입시키고 2 ㎎/㎖ G418의 존재 하에 선별하였다. IL-11 수용체 α-쇄의 발현은 FITC-항-IL-11R(써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국 일리노이주 록포드 소재)을 사용하여 유세포분류기(flow cytometry)로 확인하였다. 그 다음, IL-11R을 안정하게 발현하는 세포를 레트로바이러스 벡터 MIH-gp130으로 형질도입시키고 2 ㎎/㎖ G418 및 0.5 ㎎/㎖ 하이그로마이신의 존재 하에 선별하였다. IL-11R 및 gp130의 발현은 각각 FITC-항-IL-11R 및 PE-항-hgp130(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)을 사용하여 유세포분류기로 확인하였다. IL-11R 및 gp130 둘다를 발현하는 단일 클론은 2 ㎎/㎖ G418 및 0.5 ㎎/㎖ 하이그로마이신의 존재 하에 제한된 희석으로 수득하였다. 세포로부터의 IL-11 수용체 α-쇄 및 gp130 mRNA의 생성은 하기 프라이머 쌍을 사용하여 RT-PCR로 확인하였다.

IL-11 수용체 α-쇄에 대한 프라이머 쌍:

서열번호 4: 5'-CGACGCGTATGAGCAGCAGCTGCTCAGGG-3'(전방향)

서열번호 5: 5'-GAAGATCTCTACAGGTTTGGAGCTCCTGG-3'(역방향)

gp130에 대한 프라이머 쌍:

서열번호 6: 5'-ACGCGTATGTTGACGTTGCAGACT-3'(전방향)

서열번호 7: 5'-GGATCCTCACTGAGGCATGTAGCC-3'(역방향)

B. 일-PEG화된 mIL-11의 시험관내 생물학적 활성 어세이

상기 실시예 3 및 4에 기재된 아민-특이적 방법 또는 N-말단 특이적 방법을 이용하여 제조한 일-PEG화된 mIL-11(PEG-mIL-11-SC 또는 PEG-mIL-11-AD) 및 실시예 1에서 제조된 비-결합된 mIL-11을 10배 연속 희석을 통해 1 pg/㎖부터 1 ㎍/㎖까지 희석하고 96-웰 플레이트 내에 넣었다. 100 ㎕의 Ba11G 세포(3 X 10⁴개 세포/㎖)를 상기 희석된 샘플에 첨가하고 37℃에서 5% CO₂ 하에 96-웰 플레이트 내에서 72시간 동안 생장시켰다. 배양 말기에 세포를 37℃에서 5% CO₂ 하에 XTT 시약(세포 증식 키트 II, 로슈, 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)으로 4시간 동안 처리하였다. 492 nm에서의 샘플의 광학 밀도는 마이크로플레이트 판독기(베르사 맥스(VERSA max), 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)로 측정하였다. 690 nm에서의 광학 밀도를 샘플 각각으로부터 차감하여 세포의 산란 신호를 제거하였다. 모든 어세이를 3회 반복 수행하였다.

아민-특이적 PEG화에 의해 일-PEG화된 mIL-11(PEG-mIL-11-SC)의 제제 및 N-말단 특이적 PEG화에 의해 PEG화된 mIL-11(PEG-mIL-11-AD)의 제제는 비-결합된 mIL-11과 유사한 세포 증식 활성을 보였는데, 이러한 결과는 PEG의 부가가 IL-11과 IL-11 수용체 사이의 상호작용을 방해하지 않음을 입증한다(도 8). PEG화된 mIL-11의 투여량 반응 곡선은 x-축 상의 샘플 농도에 대한 y-축 상의 흡광도에 의해 작도되었다. S자형 투여량-의존 곡선이 로그 방정식에 대해 작도되었다.

실시예 6: 래트에서 PEG화된 mIL-11 돌연변이체의 생체내 생물학적 활성

1회 피하 주사를 이용하여 400 ㎍/㎏의 PEG-mIL-11-AD, PEG-mIL-11-SC 또는 비-결합된 mIL-11을 10주령의 암컷 스프라그-다울리(Sprague-Dawley) 래트(SLC, 일본 소재)에게 투여함으로써 PEG화된 mIL-11의 생체내 시험을 수행하였다. 식염수를 비히클 대조군으로서 사용하였다. 군 당 5마리의 동물을 배정하였다. 투여 후 다양한 시점(0일, 3일, 6일, 8일, 10일 및 12일)에서 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 자동 혈액 분석기(애보트 랩(Abbott Lab), 미국 일리노이주 애보트 파크 소재)를 제조자의 설명서에 따라 이용하여 혈소판 수치를 측정하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이, PEG-mIL-11-SC(A) 또는 PEG-mIL-11-AD(B)로 처리된 동물의 혈소판 수치는 3일째 날부터 증가하여 6일째 되는 날 최대치에 도달하였다. 상기 2종의 PEG화된 mIL-11 단백질들의 혈소판 수치는 6일째 되는 날 천연 mIL-11의 혈소판 수치보다 유의하게 더 높았고(^*; P<0.001) 6일째 되는 날 및 8일째 되는 날 비히클 대조군의 혈소판 수치보다 유의하게 더 높았다(^**; P<0.05). 다양한 시점에서 비-결합된 mIL-11과 비히클 대조군 사이의 혈소판 수치에서 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 이 결과는 상기 2종의 PEG화된 mIL-11 단백질들의 생물학적 활성이 래트에서 비-결합된 mIL-11의 생물학적 활성보다 더 높음을 입증한다.

투여 빈도를 감소시키는 능력은 래트에서 PEG-mIL-11-SC 또는 PEG-mIL-11-AD의 1회 투여를 비-결합된 mIL-11의 다회 투여와 비교함으로써 시험하였다. 체중이 약 250 g인 10주령의 암컷 스프라그-다울리 래트(군 당 5마리)에게 400 ㎍/㎏의 PEG화된 mIL-11(PEG-mIL-11-SC 또는 PEG-mIL-11-AD)을 1회 피하 주사하였다. 400 ㎍/㎏의 비-결합된 mIL-11을 대조군으로서 7일 동안 매일 주사로 투여하였다. 투여 후 다양한 시점(0일, 3일, 6일, 8일, 10일 및 12일)에서 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 자동 혈액 분석기를 이용하여 혈소판 수치를 측정하였다.

도 10에 나타낸 바와 같이, PEG-mIL-11-SC(A) 또는 PEG-mIL-11-AD(B)로 처리된 동물들의 혈소판 수치는 3일째 날부터 증가하여 6일째 되는 날 최대치에 도달한 반면, 비-결합된 mIL-11로 처리된 동물들의 혈소판 수치는 8일째 날 최대치에 도달하였다. 상기 2종의 PEG화된 mIL-11로 처리된 군들의 혈소판 수치의 최대 수준은 비-결합된 mIL-11의 7회 연속 주사 후 측정된 혈소판 수치와 유사하였다. 이 결과는 PEG화된 mIL-11의 1회 투여된 투여량이 비-결합된 mIL-11의 7회 매일 투여된 투여량을 효과적으로 대체할 수 있고 래트에서 동일한 효능 또는 증가된 효능을 나타냄을 입증한다.

실시예 7: 래트에서 PEG화된 mIL-11 돌연변이체의 약물동력학

래트에서 PEG-mIL-11-SC 및 PEG-mIL-11-AD의 약물동력학을 측정하기 위해, 1회 피하 주사를 이용하여 400 ㎍/㎏의 PEG-mIL-11-SC 또는 PEG-mIL-11-AD를 10주령의 암컷 스프라그-다울리 래트(SLC, 일본 소재)에게 투여하였다. 식염수 또는 400 ㎍/㎏의 비-결합된 mIL-11을 대조군으로서 사용하였다. 군 당 4마리 내지 6마리의 래트를 배정하였다. 요약하면, 투여 후 다양한 시점(0.08시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간)에서 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 그 다음, 혈장 샘플을 원심분리(2,500 g, 10분)로 분리하고, 상업적으로 입수가능한 인간 IL-11 ELISA 키트(알앤디 시스템(R&D system), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 PEG-mIL-11-SC, PEG-mIL-11-AD 또는 천연 mIL-11의 혈장 농도를 측정하였다. PEG-mIL-11-SC, PEG-mIL-11-AD 또는 비-결합된 mIL-11을 표준 단백질로서 사용하였다. 약물동력학적 파라미터를, 비-구획 방법을 이용하여 윈놀린(WinNonlin) 소프트웨어 버전 5.2(파사이트 코포레이션(Pharsight Corp.), 미국 노쓰 캐롤라이나주 캐리 소재)로 분석하였다.

도 11에 나타낸 바와 같이, PEG-mIL-11-SC(A) 또는 PEG-mIL-11-AD(B)의 혈장 농도는 8시간에서 최대치에 도달하였고 투여 후 72시간까지 지속되었다. 비-결합된 mIL-11의 혈장 농도는 1시간에서 최대치에 도달하였고 투여 후 12시간까지 지속되었다. PEG-mIL-11-SC, PEG-mIL-11-AD 또는 비-결합된 mIL-11의 약물동력학적 파라미터는 하기 표 1에 요약되어 있다. PEG-mIL-11-SC 또는 PEG-mIL-11-AD의 반감기는 비-결합된 mIL-11의 반감기보다 약 5배 더 길었다. PEG-mIL-11-AD 또는 PEG-mIL-11-SC에 대한 곡선-하-면적(AUC)은 동일한 투여량을 사용하였을 때 비-결합된 mIL-11의 AUC보다 약 8배 또는 5배 더 높았다. 이 결과는 상기 2종의 PEG화된 mIL-11 단백질들이 래트에서 비-결합된 mIL-11에 비해 연장된 지속성을 특징으로 함을 입증한다.

하기 표 1은 1회 피하 투여 후 래트에서 PEG-mIL-11 및 mIL-11의 상세한 약물동력학적 특징을 보여준다.

	mIL-11	PEG-mIL-11-SC	PEG-mIL-11-AD
AUC(마지막) (ng·h/㎖)	2539.8±555.69	10627±335.89	19270±1931.0
C최대 (ng/㎖)	826.89±156.61	746.50±66.00	1168.5±206.60
T최대(시간)	1.10±0.55	6.25±1.18	8.40±0.89
t1/2(시간)	1.76±0.20	7.48±0.11	8.49±0.91

상기 실험들은 본 발명의 가능한 실시양태들을 예시한다. 본 발명이 그의 일부 실시양태들과 관련하여 구체적으로 표현되고 기재되어 있지만, 당분야에서 숙련된 기술을 가진 자는 이러한 실시양태들이 예로써 제공된 것일 뿐, 본 발명을 한정하기 위해 제공된 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항에 있어서의 다양한 변경을 상기 실시양태들에 부가할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위 및 범주는 상기 예시적 실시양태들 중 어떠한 실시양태에 의해서도 한정되어서는 안 되고 하기 특허청구범위 및 이의 등가물들에 의해서만 정의되어야 한다.

논문 또는 초록, 공개된 또는 이에 상응하는 미국 또는 외국 특허출원, 발행된 특허, 외국 특허 및 임의의 다른 문헌들을 포함하는, 본 명세서에서 인용된 모든 문헌들(이 인용된 문헌들에 개시된 모든 데이터, 표, 도면 및 내용을 포함함)은 전체로서 본 명세서에 참고로 각각 도입된다.

SEQUENCE LISTING <110> VIROMED CO., LTD BIOPOLYMED INC. <120> BIOPOLYMER CONJUGATES COMPRISING AN INTERLEUKIN-11 ANALOG <130> PCA906043VML <150> KR 2008-83070 <151> 2008-08-25 <160> 7 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro 1 5 10 15 Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser 20 25 30 Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe 50 55 60 Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met 65 70 75 80 Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg 85 90 95 Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg 100 105 110 Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr 115 120 125 Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met 130 135 140 Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro 145 150 155 160 Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala 165 170 175 Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu 180 185 190 Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu 195 <210> 2 <211> 169 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr 1 5 10 15 Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp 20 25 30 Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu 35 40 45 Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu 50 55 60 Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp 65 70 75 80 Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu 85 90 95 Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu 100 105 110 Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asn Pro Pro Ala 115 120 125 Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala 130 135 140 His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg 145 150 155 160 Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu 165 <210> 3 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu 1 5 10 15 Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg 20 25 30 Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His 35 40 45 Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly 50 55 60 Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu 65 70 75 80 Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser 85 90 95 Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp 100 105 110 Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro 115 120 125 Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser 130 135 140 Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His 145 150 155 160 Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg 165 170 175 Leu <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IL-11 receptor alpha chain primer <400> 4 cgacgcgtat gagcagcagc tgctcaggg 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IL-11 receptor alpha chain primer <400> 5 gaagatctct acaggtttgg agctcctgg 29 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic gp130 mRNA primer <400> 6 acgcgtatgt tgacgttgca gact 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic gp130 mRNA primer <400> 7 ggatcctcac tgaggcatgt agcc 24

Claims (32)

1. 돌연변이체 인간 IL-11(mIL-11) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 결합체(conjugate)로서, 상기 mIL-11의 아미노산 서열이 서열번호 2로 표시되고, 상기 결합체의 IL-11 수용체 α-쇄 및 당단백질 130(gp130)을 발현하도록 재조합된 Ba/F3 세포주를 이용한 시험관내 세포 증식 활성의 수준이 비-결합된 기준 mIL-11의 세포 증식 활성의 수준에 비해 5% 이하로 감소되고, 이때 결합된 mIL-11의 mIL-11 아미노산 서열과 비-결합된 기준 mIL-11의 mIL-11 아미노산 서열이 동일하고, 상기 세포 증식 활성이 상기 결합체 또는 상기 비-결합된 기준 mIL-11을 상기 재조합된 Ba/F3 세포주와 접촉시키고, 상기 세포를 시험관 내에서 배양하고, 발생된 세포 증식을 측정함으로써 결정되는, 결합체.
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5. 제1항에 있어서,
   상기 결합체가 일-PEG화된(mono-PEGylated) mIL-11인, 결합체.
6. 제1항에 있어서,
   상기 PEG의 분자량이 2 kDa 내지 100 kDa인, 결합체.
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25. 제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 결합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 혈소판 감소증, 세포독성 T세포-매개 및 보체-매개 세포독성, 이식편-대-숙주 질환, 점막염, 염증성 장 질환, 염증성 피부 장애, 패혈증, 치은염, 치주염, 염증성 안 질환, 위장 운동 장애, 췌장염, 괴사 장염, 아프타 궤양, 인두염, 식도염, 소화 궤양, AIDS, 류마티스 관절염, 골관절염, 척추관절병증, 항생제에 의해 유도된 설사병, 다발성 경화증, 당뇨병, 골다공증, 재관류 손상, 천식, 비염, 전자간증, 폰 빌레브란트병(Von Willebrand disease), A형 혈우병, 비-호지킨스 림프종, 및 조혈 전구세포 및 줄기세포 결핍증으로 이루어진 군에서 선택되는 IL-11에 반응하는 질환 또는 장애의 치료, 완화 또는 예방용 약학 조성물.
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