WO2005090574A1

WO2005090574A1 - 血管内皮増殖抑制遺伝子

Info

Publication number: WO2005090574A1
Application number: PCT/JP2005/004836
Authority: WO
Inventors: Atsushi Matsuki; Hironori Nakagami; Ryuichi Morishita; Yasufumi Kaneda
Original assignee: Genomidea Inc.
Priority date: 2004-03-19
Filing date: 2005-03-17
Publication date: 2005-09-29
Also published as: JPWO2005090574A1; JP4757194B2

Abstract

　本発明は、血管内皮細胞増殖抑制活性、ｃ−ｆｏｓプロモーターからの転写抑制活性、Ｅ２Ｆプロモーターからの転写抑制活性、ＡＰ１プロモーターからの転写抑制活性、ＶＥＧＦ活性抑制活性、ＮＦκＢプロモーターからの転写抑制活性および／または血管新生抑制活性を有する新規のポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することを課題とする。また、本発明は、これらポリペプチドおよび／またはポリペプチドを含む、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌からなる群から選択される疾患の処置のための薬学的組成物、ならびにこれら疾患の処置方法を提供することを課題とする。　上記活性を有する新規ペプチド、およびそのペプチドをコードするヌクレオチドを単離することによって、上記課題が解決した。

Description

明細書

血管内皮増殖抑制遺伝子

技術分野

[0001] 本発明は、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c fosプロモーター力の転写抑制活性、 VEGFプロモーターからの転写抑制活性、および Zまたは血管新生抑制活性を有する新規のポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。

背景技術

[0002] 血管新生を抑制することによって、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌 (例えば、固形癌)を処置し得る (非特許文献 1および 2)。

[0003] 血管新生を抑制するタンパク質としては、アンジォスタチンなど (特許文献 1および 2)が公知である。しかし、その血管新生抑制活性は、疾患の治療に用いるには十分とはいえない。また、一定の血中濃度を維持する必要があるため、タンパク質の大量調製あるいは遺伝子の高発現が求められる。

[0004] また、癌細胞と異なり血管内皮細胞は遺伝子の変異誘導は希であるため、内皮細胞を対象とした血管新生抑制因子による遺伝子治療などの治療は、持続的効果および繰り返し的効果が期待できる。しかし、その一方で、治療効果をもたらすためには、血管新生抑制因子の血中濃度を有効量以上に維持することが必要であることも解つてきている。

[0005] このような技術水準のもと、血管新生抑制因子による疾患 (例えば、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および Zまたは癌 (例えば、固形癌)）の治療を行うためには、従来公知であるアンジォスタチンとは異なる血管新生抑制活性を有するタンパク質をコードする新規遺伝子を単離することが必要である。

特許文献 1：特開 2000-325087

特許文献 2：特開 2003-250549

非特許文献 l : Cell, 1994 Oct21;79(2):315-28

非特許文献 2 : Nature Medicen,1995 Jan;l(l):27- 31 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明は、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c fosプロモーターからの転写抑制活性、 E2Fプロモーター力の転写抑制活性、 APIプロモーターからの転写抑制活性、 VEGF活性抑制活性、 NF κ Bプロモーターからの転写抑制活性および Zまたは血管新生抑制活性を有する新規のポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することを課題とする。また、本発明は、これらポリペプチドおよび Zまたはポリペプチドを含む、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌 (例えば、固形癌)からなる群力選択される疾患の処置のための薬学的組成物、ならびにこれら疾患の処置方法を提供することを課題とする。課題を解決するための手段

[0007] 本発明は、新規のスクリーニング方法を用いることによって、血管内皮増殖抑制因子をコードする核酸を単離することによって完成された。

[0008] したがって、本発明は、以下を提供する。

1.以下：

(a)配列番号 1または 3に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；

(b)配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド、

(c)配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸力置換、付加および欠失力なる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、；

(d) (a)一（c)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチド；および

(e) (a)一（c)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 70%である塩基配列からなるポリヌクレオチド、

力もなる群力も選択されるポリヌクレオチドであって、ここで、前記ポリヌクレオチドは、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c fosプロモーター力の転写抑制活性、 E2Fプロモ一ターからの転写抑制活性、 APIプロモーターからの転写抑制活性、 VEGF活性抑制活性、 NF κ Bプロモーターからの転写抑制活性および血管新生抑制活性からなる群力も選択される活性を有するペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。

2.配列番号 1または 3に記載の塩基配列を有する、請求項 1に記載のポリヌクレオチド。

3.配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列をコードする、請求項 1に記載のポリヌクレオチド。

4.以下：

(a)配列番号 5または 7に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；

(b)配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド、

(c)配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸力置換、付加および欠失力なる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、；

力もなる群力も選択されるポリヌクレオチドであって、ここで、前記ポリヌクレオチドは、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c f osプロモーター力の転写抑制活性、 E2Fプロモ一ターからの転写抑制活性、 APIプロモーターからの転写抑制活性、 VEGF活性抑制活性、 NF κ Bプロモーターからの転写抑制活性、および血管新生抑制活性からなる群力も選択される活性を有するペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。

5.配列番号 5または 7に記載の塩基配列を有する、請求項 4に記載のポリヌクレオチド。

6.配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列をコードする、請求項 4に記載のポリヌクレオチド。 7.血管新生抑制活性を有するペプチドをコードする、請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチド。

8.血管内皮細胞増殖抑制活性を有するペプチドをコードする、請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチド。

9.請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドを含有する、血管新生抑制のための薬学的組成物。

10.請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドを含有する、血管内皮細胞増殖抑制のための薬学的組成物。

11.請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドを含有する、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌カゝらなる群カゝら選択される疾患の処置のための薬学的組成物。

12.請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドを含有する、慢性炎症、糖尿病網膜症、および癌力なる群力選択される疾患の処置のための薬学的組成物。

13.組織の血管新生を抑制する方法であって、以下；

(1)血管新生を抑制する組織を提供する工程；および

(2)該血管内皮細胞に請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドを含む核酸を導入する工程、

を包含する、方法。

14.前記血管新生の抑制は、インビボまたはインビトロで行われる、請求項 13に記載の方法。

15.前記組織は、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌力もなる群力も選択される疾患を含む状態にある、請求項 13に記載の方法。

16.血管内皮細胞増殖を抑制する方法であって、以下；

( 1 )血管内皮細胞を提供する工程；および

を包含する、方法。

17.請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミド。 18.請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子導入ベクター。

19.血管内皮細胞増殖を抑制する方法であって、以下；

( 1 )血管内皮細胞を提供する工程；および

( 2)該血管内皮細胞に請求項 18に記載の遺伝子導入ベクターを接触させる工程、を包含する、方法。

20.請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。

21.以下：

(a)配列番号 1または 3に記載の塩基配列またはそのフラグメントによってコードされる、ポリペプチド；

(b)配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有する、ポリペプチド、

(c)配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸力置換、付加および欠失力なる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチド；および

(d) (a)一（c)のいずれ力 1つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも 70%であるアミノ酸配列力もなる、ポリペプチド、

力もなる群力も選択されるポリペプチドであって、ここで、前記ポリペプチドは、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c fosプロモーター力の転写抑制活性、 VEGFプロモータ一からの転写抑制活性、および血管新生抑制活性力なる群力選択される活性を有する、ポリペプチド。

22.配列番号 1または 3に記載の塩基配列によってコードされる、請求項 21に記載のポリペプチド。

23.配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列を有する、請求項 21に記載のポリぺプチド。

24.以下：

(a)配列番号 5または 7に記載の塩基配列またはそのフラグメントによってコードされる、ポリペプチド；

(b)配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有する、ポリペプチド、

(c)配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸力置換、付加および欠失力なる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチド；および

25.配列番号 5または 7に記載の塩基配列によってコードされる、請求項 24に記載のポリペプチド。

26.配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列を有する、請求項 24に記載のポリぺプチド。

27.血管新生抑制活性を有する、請求項 21または 24に記載のポリペプチド。

28.血管内皮細胞増殖抑制活性を有する、請求項 21または 24に記載のポリべプチド。

29.請求項 21または 24に記載のポリペプチドを含有する、血管新生抑制のための薬学的組成物。

30.請求項 21または 24に記載のポリペプチドを含有する、血管内皮細胞増殖抑制のための薬学的組成物。

31.請求項 21または 24に記載のポリペプチドを含有する、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌カゝらなる群カゝら選択される疾患の処置のための薬学的組成物。

32.請求項 21または 24に記載のポリペプチドを含有する、慢性炎症、糖尿病網膜症、および癌力なる群力選択される疾患の処置のための薬学的組成物。

33.組織の血管新生を抑制する方法であって、以下；

(1)血管新生する組織を提供する工程;および (2)該血管内皮細胞に請求項 21または 24に記載のポリペプチドを含む核酸を導入する工程、

を包含する、方法。

34.前記血管新生抑制は、インビボまたはインビトロで行われる、請求項 33に記載の方法。

35.前記組織は、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌力もなる群力も選択される疾患を含む状態にある、請求項 33に記載の方法。

36.血管内皮細胞増殖を抑制する方法であって、以下；

( 1 )血管内皮細胞を提供する工程；および

(2)該血管内皮細胞に請求項 21または 24にポリペプチドを接触させる工程、を包含する、方法。

発明の効果

[0009] 本発明によって、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c fosプロモーターからの転写抑制活性、 E2Fプロモーター力の転写抑制活性、 APIプロモーターからの転写抑制活性、 VEGF活性抑制活性、 NF κ Bプロモーターからの転写抑制活性および血管新生抑制活性の少なくとも 1つの活性を有するポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。

[0010] さらに、本発明によって、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬ィ匕、および癌 (例えば、固形癌)からなる群力選択される疾患の処置方法、ならびに処置のための薬学的組成物もまた、提供される。

図面の簡単な説明

[0011] [図 1]図 1は、本発明の核酸の単離のスキームである。

[図 2]図 2は、本発明において単離されたクローン pCMV9および pCMV15の MTS アツセィおよび c fosプロモーターアツセィの結果を示す図である。

[図 3]図 3は、本発明において単離されたクローン pCMV9および pCMV15のインサート、およびインビトロ翻訳アツセィの結果である。

[図 4]図 4は、 pCMV9に含まれる遺伝子の核酸配列（配列番号 1)およびアミノ酸配列（配列番号 2)である。 [図 5]図 5は、 pCMV15に含まれる遺伝子の核酸配列（配列番号 5)およびアミノ酸配列（配列番号 6)である。

[図 6]図 6は、 pCMV9および pCMVl 5に含まれる遺伝子のアミノ酸配列に含まれるモチーフを模式的に示したものである。

[図 7]図 7は、 pCMV9および pCMVl 5に含まれる遺伝子による E2Fプロモーターおよび APIプロモーター抑制活性を示す結果である。

[図 8]図 8は、本発明において単離されたクローン pCMV15、 pCMV15— 2、および p CMV15—3の MTSアツセィの結果を示す図である。

[図 9]図 9は、本発明において単離されたクローン pCMV15、 pCMV15— 2、および p CMV15—3の c fosプロモーターアツセィの結果を示す図である。

[図 10]図 10は、本発明において単離されたクローン pCMV15、 pCMV15— 2、および PCMV15—3の NF κ Βエレメントを介する転写活性化の抑制活性についてのアツセィの結果を示す図である。

[図 11]図 11は、本発明において単離されたクローン pCMVl 5、 pCMV15— 2、および pCMVl 5— 3の AP— 1ェンハンサーを介する転写活性化の抑制活性についてのアツセィの結果を示す図である。

配列表の説明

配列番号 1：血管新生抑制活性を有する新規ペプチドをコードする核酸配列（ pCMV9)

配列番号 2：血管新生抑制活性を有する新規ペプチドのアミノ酸配列

配列番号 3 : pCMV9に対応する EST配列（EST- BD095420)

配列番号 4 : pCMV9に対応する EST配列（EST-BD095420)がコードするアミノ酸配列

配列番号 5：血管新生抑制活性を有する新規ペプチドをコードする核酸配列（ PCMV15)

配列番号 6：血管新生抑制活性を有する新規ペプチド

配列番号 7 : pCMV15に対応する EST配列（EST- HSM805282)

配列番号 8 : pCMV15に対応する EST配列（EST- HSM805282)がコードするアミノ酸配列

配列番号 9 :pCMV15の上流を含む 3492bpの核酸配列（pCMV15— 2)

配列番号 10 :pCMV15— 2にコードされるペプチドのアミノ酸配列

配列番号 11 :pCMV15の上流を含む 4413bpの核酸配列（pCMV15— 3) 配列番号 12 : pCMVl 5— 3にコードされるペプチドのアミノ酸配列

発明を実施するための最良の形態

[0013] 以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞 (例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書 (定義を含めて)が優先する。

[0014] (用語の定義）

以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

[0015] 本明細書において遺伝子 (例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列 (核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、 2以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある 2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。 2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダィゼーシヨン法によって調べられ得る。 2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間で DNA配列が、代表的には少なくとも 50%同一である場合、好ましくは少なくとも 70%同一である場合、より好ましくは少なくとも 80%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%または 99%同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子 (例えば、核酸配列、ァミノ酸配列など)の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一

)とみなした場合の、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従つて、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。

[0016] 本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールである FASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。

[0017] 本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さが n)に対して、 1一 n— 1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 2 0、 25、 30、 40、 50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ (例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 20、 25、 30、 40、 50、 75、 100 およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙して!/、な!/、整数で表される長さ（例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなぐ同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下 10%)のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えなヽことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンノク質の機能のうち少なくとも 1つの機能が保持されているかどうかによつて決定され得る。

[0018] 本明細書において「単離された」生物学的因子 (例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子 (例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸;タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など)から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。

[0019] 本明細書において「精製された」生物学的因子 (例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い (すなわち濃縮されている)。

[0020] 本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも 75重量％、より好ましくは少なくとも 85重量％、よりさらに好ましくは少なくとも 95 重量％、そして最も好ましくは少なくとも 98重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。

[0021] 本明細書において「純化（された)」および「クローユング (された)」とは、互換可能に用いられる。「純化（された)」および「クローユング (された)」とは、ある物質または核酸の状態についていい、その核酸の存在頻度を高い状態にすることであって、好ましくは、その物質または核酸が、他の種類の物質または核酸が実質的に伴わない状態をいう。本明細書において「純化」および「クローユング」に関する文脈において使用される場合、他の種類の物質または核酸が「実質的に伴わない状態」とは、それら他の種類の物質または核酸が全く存在しない状態か、または存在するとしても、目的の物質または核酸に対して、何ら影響を与えない状態をいう。従って、より好ましい状態では、純化された核酸または核酸組成物は、ある特定の核酸のみを含む。

[0022] 本明細書で使用される場合、「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」は互換可能に使用される。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターを、う。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」としては、「ウィルスエンベロープベクター」および「リボソームベクター」が挙げられる力これらに限定されない。 [0023] 本明細書で使用される場合、「ウィルスエンベロープベクター」とは、ウィルスェンべロープ中に外来遺伝子を封入したベクター、またはウィルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を封入したベクターをヽぅ。遺伝子導入ベクターの調製のために使用されるウィルスとしては、野生型ウィルスであっても、組換え型ゥィルスであってもよい。

[0024] 本発明にお、て、ウィルスエンベロープまたはウィルスエンベロープ由来タンパク質の調製のために使用されるウィルスとしては、レトロウイルス科、トガウィルス科、コロナウィルス科、フラビウィルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ブ- ャゥイノレス科、ラブドウイノレス科、ボックスウイノレス科、へノレぺスゥイノレス科、ノキュロウィルス科、およびへパドナウィルス科カゝらなる群カゝら選択される科に属するウィルスが挙げられる力これらに限定されない。好ましくは、ノミクソウィルス科に属するウイルスが、より好ましくは、 HVJ (センダイウィルス）力用いられる。

[0025] ウィルスエンベロープ由来タンパク質としては、例えば、 HVJの Fタンパク質、 HNタンパク質、 NPタンパク質および Mタンパク質が挙げられる力これらに限定されない

[0026] 本明細書で使用される場合、「リボソームベクター」とは、リボソーム中に外来遺伝子を封入したベクターをいう。リボソームベクターの調製のために使用される脂質としては、例えば、 DOPE (ジォレオイルホスファチジルエタノラミン）およびホスファチジルコリンなどの中性リン脂質、コレステロール、ホスファチジルセリンおよびホスファチジン酸などの負電荷リン脂質、ならびに DC—コレステロール（ジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロール）および DOTAP (ジォレオイルトリメチルアンモ -ゥムプロパン)などの正電荷脂質が挙げられるが、これらに限定されない。

[0027] 本明細書で使用される場合、「リボソーム」とは、脂質二重膜の一種である。例えば、レシチンのようなリン脂質を 50% (重量比）以上の水に、そのリン脂質固有のゲル- 液晶相転移温度以上で懸濁すると脂質二重層からなる、内部に水相を有する閉鎖小胞が形成される。この小胞をリボソームという。二分子膜が何枚もタマネギ状に重なつた多重膜リボソーム (MLV)と、膜が 1枚のリボソームに大別される。後者はまた、ホスファチジルコリンのようなリン脂質のサスペンション (懸濁液)を、ミキサーで激しく攪拌して分散した後、超音波処理を行なうことによつても調製することが可能である。

[0028] 膜が 1枚のリボソームはさらに、その粒子径によって小さな単膜リボソーム（SUV)と大きな単膜リボソーム (LUV)とに分類される。 MLVは、脂質薄膜に水を加えて機械的振動を与えることにより調製される。 SUVは、 MLVを超音波するか、または脂質と界面活性剤の混合溶液カゝら界面活性剤を透析などで除去するなどによって調製される。また、これ以外にも、（l) SUVの凍結融解を繰り返して、 LUVを調製する方法、（2)酸性リン脂質でできた SUVを Ca²⁺の存在下で融合させ、そしてこの Ca²⁺を E DTA (エチレンジァミン四酢酸)で除去することにより調製する方法、（3)脂質のエーテル溶液と水のェマルジヨン力エーテルを留去しながら、相の転換を行って LUVなどを調製する方法 (逆相蒸発法リボソーム; REV)が周知である。

[0029] 本明細書で使用される場合、「不活性化」とは、ゲノムを不活性ィ匕したウィルスを、う。この不活性ィ匕ウィルスは、複製欠損である。好ましくは、この不活性ィ匕は、 UV処理またはアルキル化剤による処理によって、なされる。

[0030] 本明細書において、「HVJ」および「センダイウィルス」は、互換可能に用いられ得る。例えば、本明細書において「HVJのエンベロープ」と「センダイウィルスのェンベロープ」とは同一の意味を示す語句として用いられる。

[0031] 本明細書において「センダイウィルス」とは、パラミクソウィルス科パラミクソウィルス属に属し、細胞融合作用をもつウィルスをいう。ウィルス粒子は、エンベロープをもち、直径 150— 300nmの多形性を示す.ゲノムは、約 15500塩基長のマイナス鎖 RNAである。 RNAポリメラーゼを持ち、熱に不安定で、ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、また溶血性を示す。

[0032] 本明細書において、「HAU」とは、 -ヮトリ赤血球 0. 5%を凝集可能なウィルスの活性をいい、 1 HAUは、ほぼ 2400万ウィルス粒子に相当する（Okada, Y.ら、 Bike n Journal 4、 209— 213、 1961)。

[0033] 本明細書にぉ、て、「ストリンジェントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニ一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0. 7—1. OMの Na C1存在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1— 2倍濃度の SSC (salin e— sodium citrate)溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM 塩化ナトリウム、 15mM クェン酸ナトリウムである）を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダィゼーシヨンは、 Molecula r し lonmg 2nd ea. , Current Protocols in Molecular Biology, supple ment 1一 38、 DNA Cloning 1： Core Techniques, A Practical Approac h, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする配列からは、好ましくは、 A配列のみまたは T配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダィズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドを、う。ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAの塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは 80%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは 95%以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有する DNA鎖のハイブリダィゼーシヨンを可能にし、そしてミスマッチを有意に有する DNAのハイブリダィゼーシヨンを除外するように設計された条件を!、う。ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムァミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダィゼーシヨンおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、 0. 0015M塩ィ匕ナトリウム、 0. 0015Mタエン酸ナ卜!;ゥム、 65— 68°C、または 0. 015M塩ィ匕ナ HJゥム、 0. 001 5Mクェン酸ナトリウム、および 50%ホルムアミド、 42°Cである。このような高度にストリンジェントな条件については、 Sambrooket al. , Molecular Cloning : A Labor atory Manual^第 2|¾R、じ old Spring Harbor Laboratory (ColdSpring Ha rbor, N, Y. 1989)；および Anderson et al. 、 Nucleic Acid Hybridization ： a Practicalapproach、 IV、 IRL Press Limited (Oxford, England) . Limite d, Oxford, Englandを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダィゼーシヨンおよび zまたはバックグラウンドのハイブリダィゼーシヨンを減少する目的で、ハイブリダィゼーシヨン緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、 0. 1%ゥシ血清アルブミン、 0. 1%ポリビュルピロリドン、 0. 1%ピロリン酸ナトリウム、 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウム（NaDodSOまたは SDS)、 Ficoll、 Denhardt溶液、超音波処理され

4

たサケ精子 DNA (または別の非相補的 DNA)および硫酸デキストランである力他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダィゼーシヨン条件のストリンジエンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ノ、イブリダィゼーシヨン実験は、通常、 pH6. 8-7. 4で実施されるが；代表的なィオン強度条件において、ハイブリダィゼーシヨンの速度は、ほとんど pH独立である。 Anderson et al. 、 Nucleic Ac id Hybridization： a Practical Approach、第 4章、 IRL Press Limited (Oxford, England)を参照のこと。

[0035] DNA二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダィゼーシヨン条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性の DNAがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致した DNA二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。

T (°C) =81. 5 + 16. 6 (log[Na⁺]) +0. 41 (%G + C)-600/N-0. 72 (%ホルムアミド）

ここで、 Nは、形成される二重鎖の長さであり、 [Na+]は、ノ、イブリダィゼーシヨン溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％G + Cは、ノ、イブリツド中の（グァニン +シトシン)塩基のパーセンテージである。不完全に一致したノヽイブリッドに関して、融解温度は、各 1%不一致 (ミスマッチ）に対して約 1°Cずつ減少する。

[0036] 本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高、程度の塩基対不一致を有する DNA二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジヱントな条件」の例は、 0. 015M塩ィ匕ナ卜リクム、 0. 0015M クェン酸ナトリウム、 50— 65°C、または 0. 015M 塩ィ匕ナトリウム、 0. 0015M クェン酸ナトリウム、および 20%ホルムアミド、 37— 50。Cである。例として、 0. 015Mナトリウムイオン中、 50°Cの「中程度にストリンジェントな」条件は、約 21%の不一致を許容する。

[0037] 本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、 0. 015Mナトリウムイオン (ホルムアミドなし）において、完全に一致した長い DNAの融解温度は、約 71°Cである。 65°C (同じイオン強度）での洗浄において、これは、約 6%不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。

[0038] 約 20ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、 lMNaClにおける融解温度の適切な概算は、

Tm= (1つの A— T塩基につき 2°C) + (1つの G— C塩基対につき 4°C)

によって提供される。なお、 6 Xクェン酸ナトリウム塩 (SSC)におけるナトリウムイオン濃度は、 1Mである（Suggsら、 Developmental Biology Using Purified Gen es、 683頁、 Brownおよび Fox (編）（1981)を参照のこと）。

[0039] 配列番号 2、 4、 6または 8に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号 1、 3、 5または 7の核酸配列の一部またはその改変体を含む PCRプライマーおよびノヽイブリダィゼーシヨンプローブを有する cDNAライブラリ一力容易に分離される。配列番号 2、 4、 6または 8のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に 1%ゥシ血清アルブミン (BS A) ; 500mM リン酸ナトリウム（NaPO ) ; lmM EDTA;42°Cの温度で 7% SD

4

S を含むハイブリダィゼーシヨン緩衝液、および本質的に 2 X SSC (600mM NaC l; 60mM クェン酸ナトリウム）； 50°Cの 0. 1% SDSを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジヱント条件下、さらに好ましくは本質的に 50°Cの温度での 1%ゥシ血清アルブミン（BSA) ; 500mM リン酸ナトリウム（NaPO )； 15%ホルムアミド； 1 mM EDTA; 7% SDS を含むハイブリダィゼーシヨン緩衝液、および本質的に 50°Cの l X SSC (300mM NaCl; 30mM クェン酸ナトリウム）； 1% SDSを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に 50 °Cの温度での 1%ゥシ血清アルブミン（BSA) ; 200mM リン酸ナトリウム（NaPO )；

4

15%ホルムアミド； ImM EDTA; 7%SDSを含むハイブリダィゼーシヨン緩衝液、および本質的に 65。Cの 0. 5 X SSC (150mM NaCl; 15mM クェン酸ナトリウム）； 0. 1% SDSを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号 1、 3、 5または 7に示す配列の 1つまたはその一部とハイブリダィズし得る。

本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列 2つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、 2つの配列の最適なァライメントについての基準配列 (他の配列に付加が含まれてヽればギャップが生じることもある力ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする)と比較したときに、付加または欠失 (すなわちギヤップ)が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に 100を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術にお、て周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、 TBLAST N、： BLASTP、FASTA、 TFASTAおよび CLUSTALW (Pearson and Lipma n, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (8) : 2444— 2448、 Altschul et al. , 1990, J. Mol. Biol. 215 (3) :403— 410、 Thompson et al. , 1994, N ucleic Acids Res. 22 (2) :4673— 4680、 Higgins et al. , 1996, Methods Enzymol. 266 : 383— 402、 Altschul et al. , 1990, J. Mol. Biol. 215 (3) :4 03— 410、 Altschul et al. , 1993, Nature Genetics 3 : 266— 272)力あげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知の Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (たとえば、 Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 2267-226 8、 Altschul et al. , 1990, J. Mol. Biol. 215 : 403— 410、 Altschul et al. , 1993, Nature Genetics 3 : 266— 272、 Altschul et al. , 1997, Nuc. Acid s Res. 25 : 3389— 3402を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、 5つの専用 BLASTプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。

[0041] (1) BLASTPおよび BLAST3でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；

(2) BLASTNでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；

(3) BLASTXでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を 6つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；

(4) TBLASTNでタンパク質のクエリー配列を 6つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；

(5) TBLASTXでヌクレオチドのクエリ配列を 6つの読み枠で変換したものを、 6 つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。

[0042] BLASTプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベース力得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術にお V、て周知のスコアリングマトリックスによって同定 (すなわち整列化）されると好ま U、。

, 1992, Science 256： 1443— 1445、 Henikoff and Henikoff, 1993, Prote ins 17 : 49— 61)を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、 PAMまたは PAM250マトリックスも使用できる（たとえば、 Schwartz and Dayhoff, eds. , 1978, Matrices lor Detecting Distance Relationships : Atlas of Pr otein Sequence and Structure, Washington： National Biomedical Re search Foundationを参照のこと）。 BLASTプログラムは、同定されたすベてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する

。統計的な有意性を求める Karlinの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. S ci. USA 87 : 2267— 2268参照のこと）。

[0043] (遺伝子、タンパク質分子、核酸分子などの改変）

あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造にぉ、て他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従つて、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはその DNAコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応する DNAにおいて行われ得る。

[0044] 上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Kyte. Jおよび Doolittle, R. F. J. Mol. Bi ol. 157 (1) : 105-132, 1982)。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子 (例えば、酵素、基質、レセプター、 DNA、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは:イソロイシン（ +4. 5)；バリン（+4. 2)；ロイシン（ + 3. 8)；フエ-ルァラニン（ + 2. 8)；システィン Zシスチン（ + 2. 5)；メチォニン（ + 1. 9)；ァラニン（ + 1. 8)；グリシン (一 0. 4)；スレォニン (一 0. 7)；セリン (一 0. 8)；トリブトファン (一 0. 9)；チロシン (一 1. 3)；プロリン（一 1. 6)；ヒスチジン (一 3. 2)；グルタミン酸 (一 3. 5)；グルタミン（一3. 5)；ァスパラギン酸 (一 3. 5)；ァスパラギン (一 3. 5) ;リジン (一 3. 9)；およびアルギニン (一 4. 5) )である。

[0045] あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質 (例えば、酵素活性において等価なタンパク質)を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好ましぐおよび ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなァミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。

[0046] 当該分野にお!、て、親水性指数もまた、改変設計にお!、て考慮され得る。米国特許第 4, 554, 101号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（ + 3. 0)；リジン（ + 3. 0)；ァスパラギン酸（ + 3. 0± 1)；グルタミン酸（ + 3. 0± 1)；セリン（ + 0. 3)；ァスパラギン（ + 0. 2) ;グルタミン（ + 0. 2) ；グリシン（0)；スレオニン (一 0. 4)；プロリン（一 0. 5 ± 1)；ァラニン (一 0. 5)；ヒスチジン (一 0. 5)；システィン (一 1. 0)；メチォニン (一 1. 3)；バリン (一 1. 5)；ロイシン (一 1. 8)；イソロイシン (一 1. 8) ;チロシン (一 2. 3)；フエ-ルァラニン (一 2. 5) ;およびトリプトファン (一 3. 4)。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換にぉ、て、親水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好ましぐおよび ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。

[0047] 本明細書にぉ、て、「保存的置換」とは、アミノ酸置換にぉ、て、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または Zおよび疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数力 ± 2以内のもの同士、好ましくは ± 1以内のもの同士、より好ましくは ±0. 5以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換:アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびァスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびァスパラギン；ならびにパリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。

[0048] 本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮 (truncated)改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、 1または数個の置換、付加および Zまたは欠失、あるいは 1つ以上の置換、付加および Zまたは欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。対立遺伝子 (allele)とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ (h omolog)」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性 (好ましくは、 60%以上の相同性、より好ましくは、 80%以上、 85%以上、 90%以上、 95%以上の相同性)を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ortholog)」とは、オルソロガス遺伝子（orthologous gene)とも!/、、、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスの αヘモグロビン遺伝子はオルソログである力ヒトのひヘモグロビン遺伝子および βヘモグロビン遺伝子はパラログ (遺伝子重複で生じた遺伝子)である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。

本明細書にぉ、て「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がァミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドン GCA、 GCC、 GCG、および GCUはすべて、アミノ酸ァラニンをコードする。したがって、ァラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなぐ記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の 1つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチォニンのための唯一のコドンである AUG、および通常トリプトフアンのための唯一のコドンである TGGを除く） 1S 機能的に同一な分子を産生するため〖こ改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、 DNAポリメラーゼ、 Klenowフラグメント、 DNAリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法； Mark Zoller and Michael Smith, Me thods in Enzymology, 100, 468— 500 (1983) )力挙げ、られる力この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。

[0050] 本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを 1つ以上、例えば、 1一 10個、好ましくは 1一 5個、より好ましくは 1一 3個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に 1つ以上、例えば、 1一 10個、好ましくは 1一 5個、より好ましくは 1一 3個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから 1つ以上、例えば、 1一 10個、好ましくは 1一 5個、より好ましくは 1一 3個のアミノ酸を欠失させることをいう。ァミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、短縮化、脂質化 (lipi dation)、ホスホリル化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、ァシル化（例えば、ァセチル化)などを含む力これらに限定されない。置換、または付加されるァミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよぐ非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。

[0051] 本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物である力ペプチドと少なくとも 1つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、 1つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能力もとのペプチドの機能 (例えば、 pKa値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど)と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナ口グは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。

[0052] 本発明のポリペプチドがポリマーに結合している、化学修飾されたポリペプチド組成物は、本発明の範囲に包含される。このポリマーは、水溶性であり得、水溶性環境 (例えば、生理学的環境)でこのタンパク質の沈澱を防止し得る。適切な水性ポリマ一は、例えば、以下力もなる群より選択され得る：ポリエチレングリコール (PEG)、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ（N—ビュルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコ一ノレホモポリマー、ポリプロピレンォキシド/エチレンォキシドコポリマー、ポリオキシェチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビュルアルコール。この選択されたポリマーは、通常は改変され、単一の反応性基 (例えば、ァシル化のための活性エステルまたはアルキルィ匕のためのアルデヒド）を有し、その結果、重合度は制御され得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、そして、このポリマーは分枝状でも分枝状でなくてもよぐそしてこのようなポリマーの混合物はまた、使用され得る。この化学修飾された本発明のポリマーは、治療用途に決定付けられる場合、薬学的に受容可能なポリマーが使用するために選択される。

[0053] このポリマーがァシル化反応によって改変される場合、このポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。あるいは、このポリマーが還元アルキル化によつて改変される場合、このポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。好ましい反応性アルデヒドは、ポリエチレングリコール、プロピオンアルデヒド（このプロピオンアルデヒドは、水溶性である）または、そのモノ C1一 C10の、アルコキシ誘導体もしくはァリールォキシ誘導体である（例えば、米国特許第 5, 252, 714号 (これは、本明細書中で全体が参考として援用される）を参照のこと)。 [0054] 本発明のポリペプチドのぺグイ匕 (pegylation)は、例えば、以下の参考文献に記載されるような、当該分野で公知の、任意のぺグイ匕反応によって実施され得る： Focus on Growth Factors 3, 4— 10 (1992) ;EP 0 154 316 ；および EP 0 40 1 384 (これらの各々は、本明細書中で、全体が参考として援用される）。好ましくは、このべグイ匕は、反応性ポリエチレングリコール分子 (または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのァシルイ匕反応またはアルキルィ匕反応を介して実施される。本発明のポリペプチドのぺグ化のための好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（PE G)である。本明細書中で使用される場合、「ポリエチレングリコール」は、 PEGの任意の形態の包含することを意味し、ここで、この PEGは、他のタンパク質 (例えば、モノ（ C1一 C10)アルコキシポリエチレングリコールまたはモノ（C1一 C10)ァリールォキシポリエチレングリコール)を誘導体するために使用される。

[0055] 本発明のポリペプチドの化学誘導体ィ匕を、生物学的に活性な物質を活性化したポリマー分子と反応させるのに使用される適切な条件下で、実施され得る。ぺグ化した本発明のポリペプチドを調製するための方法は、一般に以下の工程を包含する： (a) ポリペプチドが 1以上の PEG基に結合するような条件下で、ポリエチレングリコール（例えば、 PEGの、反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とこのポリペプチドを反応させる工程および (b)この反応生成物を得る工程。公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはァシル化反応を選択することは当業者に容易である。

[0056] ぺグイ匕された本発明のポリペプチドは、一般に、本明細書中に記載のポリペプチドを投与することによって、緩和または調節され得る状態を処置するために使用され得るが、しかし、本明細書中で開示された、化学誘導体化された本発明のポリペプチド分子は、それらの非誘導体分子と比較して、さらなる活性、増大された生物活性もしくは減少した生物活性、または他の特徴 (例えば、増大された半減期または減少した半減期）を有し得る。本発明のポリペプチド、それらのフラグメント、改変体および誘導体は、単独で、併用して、または他の薬学的組成物を組み合わせて使用され得る。これらのサイト力イン、増殖因子、抗原、抗炎症剤および/または化学療法剤は、徴候を処置するのに適切である。 [0057] 同様に、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物である力ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも 1つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、 1つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。

[0058] 本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよぐあるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、 5'末端および Zまたは 3'末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明にお、て利用することができる。

[0059] このような核酸は、周知の PCR法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダィゼーシヨン法などを組み合わせてもよい。

[0060] 本明細書にぉ、て、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物力置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、 1つ以上であれば任意の数でよぐそのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能 (例えば、ホルモン、サイト力インの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる

。例えば、そのような数は、 1または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの 20 %以内、 10%以内、または 100個以下、 50個以下、 25個以下などであり得る。

[0061] (遺伝子工学）

本発明において用いられる配列番号 2、 4、 6または 8のアミノ酸配列を有するポリべプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。

[0062] 本発明において用いられ得る原核細胞に対する「組み換えベクター」としては、 pc DNA3 ( + )、 pBluescript-SK ( + /-)、 pGEM— T、 pEF— BOS、 pEGFP、 pHA T、 pUC18、 pFT— DEST^TM42GATEWAY (Invitrogen)などが例示される。

[0063] 本発明において用いられ得る動物細胞に対する「組み換えベクター」としては、 pc DNAI/Amp, pcDNAI、 pCDM8 (いずれもフナコシより巿販）、 pAGE107 [特開平 3— 229 (Invitrogen)、 pAGE103 Q[. Biochem. , 101, 1307 (1987) ]、 ρΑΜ o、pAMoAQ[. Biol. Chem. , 268, 22782— 22787 (1993) ]、マウス幹細胞ウイルス（Murine Stem Cell Virus) (MSCV)に基づいたレトロウイルス型発現べクター、 pEF— BOS、 pEGFPなどが例示される。

[0064] 哺乳動物細胞での発現のための強力なプロモーターとしては、例えば、種々の天然のプロモーター（例えば、 SV40の初期プロモーター、アデノウイルスの E1Aプロモーター、ヒトサイトメガロウィルス (CMV)のプロモーター、ヒト延長因子 1 (EF— 1 )プロモーター、 Drosophila 最小熱ショックタンパク質 70 (HSP)のプロモーター、ヒトメタ口チォネイン（MT)プロモーター、ラウス肉腫ウィルス（RSV)プロモーター、ヒトュビキチン C (UBC)プロモーター、ヒトァクチンプロモーター）、および人工のプロモーター（例えば、 SR aプロモーター（SV40初期プロモーターと HTLVの LTR プロモーターの融合）、 CAGプロモーター（CMV— IEェンハンサ一と-ヮトリァクチンプロモーターのハイブリッド）のような融合プロモーター）が周知であることから、これら周知のプロモーターまたはその改変体を用いることによって、糸且換え発現の発現量を容易〖こ上昇させることができる。

[0065] 大腸菌を宿主細胞として使用する場合、 trpプロモーター（Ptrp)、 lacプロモーター

(Plac)、 PLプロモーター、 PRプロモーター、 PSEプロモーター等の、大月昜菌およびファージ等に由来するプロモーター、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 pe npプロモーター等を挙げることができる。また Ptrpを 2つ直列させたプロモーター（P trp X 2)、 tacプロモーター、 lacT7プロモーター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。 [0066] 本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよぐ例えば、形質転換、形質導入、トランスフエクシヨンなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、 Ausubel F. A.ら編 (1988)、 Current Protocols in Molecular Biol ogy、 Wiley、 New York、 NY; Sambrook Jら（1987) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed.およびその第三版， Cold Spring

Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載される。遺伝子の導入は、ノ一ザンブロット、ウェスタンプロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。

[0067] また、ベクターの導入方法としては、細胞に DNAを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフエクシヨン、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DEAEデキストラン法、エレクトロボレーシヨン法、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。

[0068] 本発明におヽて遺伝子操作などにぉヽて原核生物細胞が使用される場合、原核生物糸田胞としては、 Escherichia属、 Serratia属、 Bacillus属、 Brevibacterium属、 Corynebacterium,禺、 Microbacterium晨、 Pseudomonas厲などに属す原核生物細胞、例えば、 Escherichia coli XL1— Blue、 Escherichia coli XL2—B1 ue、 Escherichia coli DH1が例示される。

[0069] 本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス'ミエローマ細胞、ラット.ミエローマ細胞、マウス'ノ、イブリドーマ細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞である CHO細胞、 BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、 HBT563 7 (特開昭 63— 299)、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス'ミエローマ細胞としては、 ps20、 NSOなど、ラット 'ミエローマ細胞としては YB2Z0など、ヒト胎児腎臓細胞としては HEK293 (ATCC : CRL— 1573)など、ヒト白血病細胞としては BALL— 1など、アフリカミドリザル腎臓細胞としては COS— 1、 COS— 7、ヒト結腸癌細胞株としては HCT— 15、ヒト神経芽細胞腫 SK— N—SH、 SK—N—SH—5Y、マウス神経芽細胞腫 Neuro2Aなどが例示される。 [0070] 本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、 DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレタトロポレーシヨン法 [Methods. Enzymol. , 194, 182 (1990) ]、リポフエクシヨン法、スフエロプラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978) ]、酢酸リチウム法 Q[. Bacteriol. , 153, 163 (1983) ]、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 5, 1929 (1978)記載の方法などが例示される。

[0071] 本明細書において、レトロウイルスの感染方法は、例えば、 Current Protocols i n Molecular Biology 前出（特に Units 9. 9—9. 14)などに記載されるように、当該分野において周知であり、例えば、トリプシナイズして胚性幹細胞を単一細胞懸淘物 ^single— cell suspension;にし後、ウイルス産生糸田胞 (virus— producing cells) (パッケージング細胞株 = packaging cell lines)の培養上清と一緒に 1一 2 時間共培養 (co-culture)することにより、十分量の感染細胞を得ることができる。

[0072] 本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において用いられる、 Cre酵素の一過的発現、染色体上での DNAマッピングなどは、細胞ェ学別冊実験プロトコールシリーズ「FISH実験プロトコールヒト 'ゲノム解析力染色体 ·遺伝子診断まで」松原謙一、吉川寛監修秀潤社 (東京)などに記載されるように、当該分野において周知である。

[0073] 本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬のような農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない:抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および Zまたは薬学的アジュバント。

[0074] 本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報 (例えば、疾患に関する情報)を元に、使用目的、対象疾患 (種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモ- タリング方法を被検体 (または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日数ケ月に 1回（例えば、 1週間に 1回 1ヶ月に 1回）のモニタリングが挙げられる。 1週間ー1ヶ月に 1回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。

[0075] 必要に応じて、本発明の治療では、 2種類以上の薬剤が使用され得る。 2種類以上の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよぐ異なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。このような 2種類以上の薬剤を投与する方法のための疾患レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。

[0076] (好ま、実施形態の説明）

以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。

[0077] (ポリペプチドの製造方法）

本発明のポリペプチドをコードする DNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、本発明の培養物より本発明のポリペプチドを採取することにより、本発明に係るポリペプチドを製造することができる。

[0078] 本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物ある、は酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地の!/、ずれを用いてもょ、。

[0079] 炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラタトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のァルコール類を用いることができる。 [0080] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の各種無機酸または有機酸のアンモ-ゥム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼィン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。

[0081] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。

[0082] 培養温度は 15— 40°Cがよぐ培養時間は、通常 5時間一 7日間である。培養中 pH は、 3. 0-9. 0に保持する。 pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

[0083] プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、 lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル β D チォガラタトピラノシド等を、 trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した細胞または器官は、ジャーフアーメンターを用いて大量培養することができる。

[0084] 例えば、動物細胞を用いる場合、本発明の細胞を培養する培地は、一般に使用されている RPMI 1640培地（The Journal of the American Medical Associ ation, 199, 519 (1967) )、 Eagleの MEM培地（Science, 122, 501 (1952) )、 DMEM培地（Virology, 8, 396 (1959) )、 199培地（Proceedings of the So ciety for the Biological Medicine, 73, 1 (1950) )またはこれら培地にゥシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。

[0085] 培養は、通常 pH6— 8、 25— 40°C、 5%CO存在下等の条件下で 1

2 一 7日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

[0086] 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリべプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジェチルアミノエチル（DEAE)— Sepharose、 DIAION HPA -75 (三菱化成)等榭脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S-Sepharose FF (Pharmacia)等の榭脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フエ-ルセファロース等の榭脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる

[0087] 本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジェチルアミノエチル (DEAE)-Sepharose、 DI AION HPA— 75 (三菱ィ匕成)等榭脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S -Sepharose FF (Pharmacia)等の榭脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フエ-ルセファロース等の榭脂を用いた疎水性クロマトグラフィ一法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。

[0088] 本発明のポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、そのポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。この可溶ィ匕液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しな、程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明のポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。

[0089] また、通常のタンパク質の精製方法 ϋ. Evan. Sadlerら： Methods in Enzymol ogy, 83, 458]に準じて精製できる。また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたァフィ-ティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる [山川彰夫，実験医学 ( Experimental Medicine) , 13, 469— 474 (1995) ]。例えば、 Loweらの方法 [Ρ roc. Natl. Acad. Sci. , USA, 86, 8227— 8231 (1989)、 GenesDevelop. , 4 , 1288 (1990) ]に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテイン Aとの融合タンパク質として生産し、ィムノグロブリン Gを用いるァフィユティークロマトグラフィ一により精製することができる。

[0090] また、本発明のポリペプチドを FLAGペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗 FLAG抗体を用いるァフィユティークロマトグラフィーにより精製することができる [Pro c. Natl. Acad. Sci. , USA, 86, 8227 (1989) , Genes Develop. , 4, 1288 ( 1990) ]。このような融合タンパク質では、発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位は、融合タンパク質の精製に続いて、融合部分力もの組換えタンパク質の分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入される。このような酵素およびこれらの同族の認識配列は、第 Xa因子、トロンビン、およびェンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、ダルタチオン S— トランスフェラーゼ（GST)、マルトース E結合タンパク質、またはプロテイン Aを標的組換えタンパク質に融合する、 pGEX (Pharmacia Biotech; Smithおよび Johnso n (1988) Gene 67, 31一 40)、 pMAL (New England Biolabs, Beverly, Ma ss. )および pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N. J. )が挙げられる。

[0091] さらに、本発明のポリペプチド自身に対する抗体を用いたァフィユティークロマトダラフィ一で精製することもできる。本発明のポリペプチドは、公知の方法 Q[. Biomolecu lar NMR, 6, 129— 134、 Science, 242, 1162— 1164、 Biochem. , 110, 16 6— 168 (1991) ]に準じて、 in vitro転写 ·翻訳系を用いてを生産することができる。

[0092] 本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸情報を基に、 Fmoc法（フルォレニルメチルォキシカルボ-ル法）、 tBoc法（t ブチルォキシカルボ-ル法）等の化学合成法によつても製造することができる。また、 Advanced ChemTech、 Applied Biosystem s、 Pharmacia Biotech、 Protein Technology Instrument^ Synthecell— Ve ga、 PerSeptive,島津製作所等のペプチド合成機を利用しィ匕学合成することもできる。

[0093] 精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、タンパク質ィ匕学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローユングのためのタンパク質構造解析 (平野久著、東京化学同人発行、 1993年）に記載の方法により実施可能である。本発明のポリペプチドの生理活性は、公知の測定法に準じて測定することができる。

[0094] 本発明において有用な可溶性ポリペプチドの産生もまた、当該分野で公知の種々の方法によって達成され得る。例えば、ポリペプチドは、ェキソぺプチダーゼ、エドマン分解またはその両方と組み合わせて特定のエンドべプチダーゼを使用することによるタンパク質分解によって、インタタトなポリペプチド分子力も誘導され得る。このィンタタトなポリペプチド分子は、従来の方法を使用して、その天然の供給源力精製され得る。あるいは、インタタトなポリペプチドは、 cDNA、発現ベクターおよび組換え遺伝子発現のための周知技術を利用する組換え DNA技術によって生成され得る。

[0095] 好ましくは、本発明において有用な可溶性ポリペプチドは、直接的に産生され、従つて、出発材料としてのポリペプチド全体の必要性を排除する。これは、従来の化学合成技術によって達成され得るカゝ、または周知の組換え DNA技術 (ここで、所望のペプチドをコードする DNA配列のみが形質転換された宿主で発現される）によって達成され得る。例えば、所望の可溶性ポリペプチドをコードする遺伝子は、オリゴヌクレオチド合成機を使用する化学的手段によって合成され得る。このようなオリゴヌタレォチドは、所望の可溶性ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される。所望のペプチドをコードする特定の DNA配列はまた、特定の制限エンドヌクレアーゼフラグメントの単離によって力、または cDNAからの特定の領域の PCR合成によって、全長 DNA配列から誘導され得る。

[0096] (変異型ポリペプチドの作製方法）

本発明のポリペプチドのアミノ酸の欠失、置換もしくは付加（融合を含む）は、周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。力かる 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加は、 Molecular Cloning, A Laboratory M anual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1一 38, John"Wil ey & Sons (1987-1997) , Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 P roc. Natl. Acad. Sci. , USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nu cleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82 , 488 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 81, 5662 (1984)、 Science, 2 24, 1431 (1984)、 PCT WO85/00817 (1985) , Nature, 316, 601 (1985) 等に記載の方法に準じて調製することができる。

[0097] (合成化学）

本明細書におけるペプチド、化学物質、低分子などの因子は、合成化学技術を用いて合成することができる。そのような合成化学技術は、当該分野において周知の技術を用いることができる。そのような周知技術としては、例えば、 Fiesers' Reagents for Organic synthesis (P leser s Reagents for Organic synthesis) Ts e-Lok Ho, John Wiley & Sons Inc (2002)などを参照することができる。

[0098] 本発明の因子が化合物として利用される場合、塩形態で用いることができる。「塩」としては、製薬上許容される塩が好ましぐ例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモ-ゥム塩などが挙げられる。有機塩基との塩としては、トリメチルァミン、トリェチノレァミン、ピリジン、ピコリン、エタノールァミン、ジエタノールァミン、トリエタノールァミン、ジシクロへキシルァミン、 N, N，ージベンジルエチレンジァミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩としては、塩酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、過塩素酸、ヨウ化水素酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩としては、ギ酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、フマル酸、シユウ酸、酒石酸、マレイン酸、クェン酸、コハク酸、リンゴ酸、マンデル酸、ァスコルビン酸、乳酸、ダルコン酸、メタンスルホン酸、 p—トルェンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩としては、アルギニン、リジン、オル-チンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩としては、ァスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。

[0099] 本発明の因子が化合物として利用される場合、水和物形態で用いることができる。「水和物」としては、薬理学的に許容される水和物が好ましぐまた、含水塩も含まれ。具体的には、一水和物、二水和物、六水和物等が挙げられる。

[0100] (免疫化学）

本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製もまた当該分野において周知である。例えば、ポリクローナル抗体の作製は、取得したポリペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは本発明のタンパク質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することにより行うことができる。

[0101] 抗体を生産する場合、投与する動物として、ゥサギ、ャギ、ラット、マウス、ハムスタ一等を用、ることができる。その抗原の投与量は動物 1匹当たり 50— 100 μ gが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイへモシァニン（keyhole limpe t haemocyanin)またはゥシチログロブリン等のキャリアタンパク質に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。その抗原の投与は、 1回目の投与の後 1一 2週間おきに 3— 10回行う。各投与後、 3— 7日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法 [酵素免疫測定法 (ELIS A法）：医学書院刊 1976年、 Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lavoratory ( 1988) ]等で確認する。

[0102] 免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、その血清より、周知技術を用いてポリクローナル抗体を分離、精製することができる。モノクローナル抗体の作製もまた当該分野において周知である。抗体産性細胞の調製のために、まず、免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として使用し、骨髄腫細胞との融合により、ハイプリドーマの作製を行う。その後、酵素免疫測定法になどより、本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。このようにして得たノヽイブリドーマ力産生されたモノクローナル抗体は種々の目的に使用することができる。

[0103] このような抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの免疫学的検出方法に使用することができ、本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの免疫学的検出法としては、マイクロタイタープレートを用いる ELISA法'蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等を挙げることができる。

[0104] また、本発明ポリペプチドの免疫学的定量方法にも使用することができる。本発明ポリペプチドの定量方法としては、液相中で本発明のポリペプチドと反応する抗体のうちェピトープが異なる 2種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ ELISA法、 1²⁵1等の放射性同位体で標識した本発明のタンパク質と本発明のタンパク質を認識する抗体とを用いるラジオィムノアツセィ法等を挙げることができる。

[0105] 本発明のポリペプチドの mRN Aの定量方法もまた、当該分野において周知である。例えば、本発明のポリヌクレオチドあるいは DNAより調製した上記オリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法または PCR法により、本発明のポリぺプチドをコードする DNAの発現量を mRNAレベルで定量することができる。このような技術は、当該分野において周知であり、本明細書において列挙した文献にも記載されている。

[0106] 当該分野で公知の任意の方法によって、これらのポリヌクレオチドが得られ、そしてこれらポリヌクレオチドのヌクレオチド配列力決定され得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされ得（例えば、 Kutmeierら、 BioTechniq ues 17 : 242 (1994)に記載されるように）、これは、手短に言えば、抗体をコードする配列の部分を含むオーバーラップするヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、ならびに次、で PCRによるこの連結されたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。 [0107] 抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源由来の核酸力作製することができる。ある抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源 (例えば、抗体 cDNAライブラリーまたは抗体を発現する任意の組織もしくは細胞 (例えば、本発明の抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞)から生成された cDNAライブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリ A+RNA) )から、例えば、抗体をコードする cDNAライブラリーからの cDNAクローンを同定するために、その配列の 3，末端および 5，末端にハイブリダィズ可能な合成プライマーを使用する PCR増幅によって、またはその特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得ることができる。 PCRによって作製された増幅された核酸は、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローユングベクターにクローユングされ得る。

[0108] ー且、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作にっ、て当該分野で周知の方法 (例えば、組換え DNA技術、部位指向性変異誘発、 PCRなど (例えば、 Sambrookら、 19 90, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2版、 Cold Spring Ha rbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYおよび Ausubelら編、 1998, Cur rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, NYに載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に参考として援用される。；)）を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および Zまたは挿入を生成するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製し得る。

[0109] 特定の実施形態において、重鎖可変ドメインおよび Zまたは軽鎖可変ドメインのァミノ酸配列は、相補性決定領域 (CDR)の配列の同定のために、当該分野において周知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列と比較することによって)調べられ得る。慣用的な組換え DN A技術を用いて、 1つ以上の CDRが、前述のようにフレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレームワーク領域中に)挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る力、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域については、 Chothiaら、 J. Mol. Biol. 278 : 457— 479 (1998)を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域および CDRの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、 1つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そのアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法は、 1つ以上の鎖内ジスルフイド結合が欠如した抗体分子を生成するように、鎖内ジスルフイド結合に関与する 1つ以上の可変領域のシスティン残基のアミノ酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本発明によって、および当該分野の技術にお!、て包含される。

[0110] さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Morrisonら、 Proc. Natl. Acad. Sci. 81 : 851 -855 (1984)； Neubergerら、 Nature 312 : 604—608 (1984)； Takedaら、 Nat ure 314 : 452— 454 (1985) )が使用され得る。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、このような分子は、マウス mAbおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体)。

[0111] 単鎖抗体を製造する場合、単鎖抗体の産生に関する記載された公知の技術 (米国特許第 4, 946, 778号； Bird、 Science 242 : 423— 42 (1988)； Hustonら、 Proc . Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5879—5883 (1988)；ぉよび Wardら、 Nature 3 34 : 544-54 (1989) )が、利用され得る。単鎖抗体は、 Fv領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されれることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。 E. coliにおける機能性 Fvフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Skerraら、 Science 242 : 1038—1041 (1988) )。

[0112] (抗体を産生する方法）

本発明の抗体は、抗体の合成のために当該分野で公知の任意の方法によって、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生され得る。 [0113] 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ (例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体)の組換え発現は、その抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。ー且、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部分 (好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を用いる組換え DNA 技術によって生成され得る。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法としては、例えば、インビトロの組換え DNA技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域 (例えば、 PCT公開 W08 6Z。5807 ;PCT公開 WO89Z01036 ;および米国特許第 5, 122, 464号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクターにクローユングされ得る。

[0114] この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、次いで、このトランスフェクトされた細胞は、本発明の抗体を産生するために、従来技術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレォチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につ！ヽての好まヽ実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるように、免疫グロプリン分子全体の発現のために宿主細胞中に同時発現され得る。

[0115] 本発明の関連した局面において、薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）力予防適用または治療適用のために提供される。このような組成物は、一般に、本発明の免疫原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび免疫刺激剤（例えば、アジュバント）を含む。

[0116] 本発明の抗体 (例えば、モノクローナル抗体）は、標準的な技術 (例えば、親和性ク口マトグラフィーまたは免疫沈降）によって、本発明のポリペプチドなどを単離するために用いられ得る。ある因子に特異的な抗体は、細胞力もの天然の因子、そして宿主細胞において発現される組換え的に産生された因子の精製を容易にし得る。さらに、そのような抗体が、（例えば、細胞の溶解液または細胞上清における）本発明のタンパク質を検出するために用いられ、本発明のタンパク質の発現の存在の量およびパターンを評価し得る。このような抗体は、例えば、所定の処置レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質に連結する (すなわち、物理的に連結する）ことにより容易になり得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ヮサビペルォキシダーゼ、アル力リホスファターゼ、 13 ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ピオチンおよびアビジン Zピオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ゥンベリフエロン、フルォレセイン、フルォレセインイソチオシァネート、ローダミン、ジクロロトリアジ-ルァミン (dichlorotriazinylamine)フルォレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびェクオリンが挙げられ;そして、適切な放射性物質の例としては¹²⁵I、 ¹³¹I、 ³⁵Sまたは³ Hが挙げられるがそれらに限定されない。

[0117] 本発明の別の局面は、哺乳動物において、免疫応答を誘導するに十分な量のポリペプチドをこの哺乳動物に投与することにより本発明のポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法に関する。この量は、動物種、動物の大きさなどに依存するが、当業者により決定され得る。

[0118] (スクリーニング）

本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作 Z評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子 (例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよぐインシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーユングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることち企図される。

[0119] 1実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質または本発明のポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分に結合する力、またはこれらの活性を調節する、候補ィ匕合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアツセィを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリ一法における多数のアプローチの任意のものを使用して得られ、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー;空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリ一；逆重畳を要する合成ライブラリ一法；「 1ビーズ 1化合物」ライブラリ一法；およびァフィ-ティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリ一法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の 4つのアプローチは、ぺプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12 : 145)。

[0120] 分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る： DeWittら（1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 6909 ;Erbら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 11422 ; Zuckermann¾ ( 1994) J. M ed. Chem 37 : 2678 ;Cho¾ (1993) Science 261 : 1303 ; Carrell¾ ( 1994) An gew Chem. Int. Ed. Engl. 33 : 2059 ;Carell¾ (1994) Angew Chem. Int. E d. Engl. 33 : 2061 ;および Gallopら（1994) Med. Chem 37 : 1233。

[0121] 化合物のライブラリ一は、溶液中で（例えば、 Houghten (1992) BioTechniques

13 :412— 421)、あるいはビーズ上（Lam (1991) Nature 354 : 82— 84)、チップ上（Fodor ( 1993) Nature 364 : 555— 556)、細菌（Ladner 米国特許第 5, 2 23, 409号）、胞子（Ladner、上記）、プラスミド（Cullら（1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 1865—1869)またはファージ上（3。01 ぉょび3111辻11 (1990) 3₍^ nce 249 : 386— 390 ; Devlin (1990) Science 249 : 404—406 ; Cwirla (199 0) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87 : 6378— 6382 ;Felici (1991)j Mol B iol 222： 301— 310 ;Ladner上記）にお!/、て示され得る。

[0122] (薬学的組成物）

本発明のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび遺伝子導入ベクター、アンチセンス核酸、ポリペプチド、ならびにポリペプチドに対する抗体は、血管内皮細胞増殖抑制のため、 c fosプロモーターからの転写抑制のため、 E2Fプ口モーターからの転写抑制のため、 APIプロモーターからの転写抑制のため、 VEG F活性抑制のため、および血管新生抑制のため、ならびに、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌の処置、予防、診断または予後のための薬学的組成物の成分としても使用することが可能である。

[0123] 本明細書にぉ、て薬剤の「有効量」とは、その薬剤が目的とする薬効が発揮することができる量をいう。本明細書において、そのような有効量のうち、最小の濃度を最小有効量ということがある。そのような最小有効量は、当該分野において周知であり、通常、薬剤の最小有効量は当業者によって決定されている力または当業者は適宜決定することができる。そのような有効量の決定には、実際の投与のほか、動物モデルなどを用いることも可能である。本発明はまた、このような有効量を決定する際に有用である。

[0124] 本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬のような農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない:抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および Zまたは農学的もしくは薬学的アジュバント。

[0125] 本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報 (例えば、疾患に関する情報)を元に、使用目的、対象疾患 (種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモ- タリング方法を被検体 (または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日数ケ月に 1回（例えば、 1週間に 1回 1ヶ月に 1回）のモニタリングが挙げられる。 1週間ー1ヶ月に 1回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。

[0126] 必要に応じて、本発明の治療では、 2種類以上の薬剤が使用され得る。 2種類以上の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよぐ異なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。このような 2種類以上の薬剤を投与する方法のための疾患レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。

[0127] 本発明では、いったん類似の種類 (例えば、ヒトに対するマウスなど）の生物、培養細胞、組織などに関し、ある特定の糖鎖構造の分析結果と、疾患レベルとが相関付けられた場合、対応する糖鎖構造の分析結果と、疾患レベルとが相関付けることができることは、当業者は容易に理解する。そのような事項は、例えば、動物培養細胞マ -ュアル、瀬野ら編著、共立出版、 1993年などに記載され支持されており、本明細書にぉ、てこのすべての記載を援用する。

[0128] (遺伝子治療）

遺伝子治療の方法の一般的な概説については、 Goldspielら， Clinical Pharma cy 12 :488— 505 (1993) ;Wuおよび Wu, Biotherapy 3 : 87— 95 (1991) ;Tols toshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 : 573—596 (1993)； Mulligan, S cience 260 : 926-932 (1993)；ならびに Morganおよび Anderson, Ann. Rev . Biochem. 62 : 191-217 (1993)； May, TIBTECH 11 (5) : 155— 215 (1993 )を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換え DNA技術は、 Ausubelら (編) , Current Protocols in Molecular Biology, John Wile y & Sons, NY (1993)；および Kriegler, Gene Transfer and Expression , A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載される。

[0129] 遺伝子治療に使用される核酸構築物は、周知の遺伝子導入ベクターを用いて局所的にまたは全身的にのいずれかで投与され得る。そのような核酸構築物がタンパク質のコード配列を包含する場合、そのタンパク質の発現は、内因性の哺乳類のプロモーターまたは異種のプロモーターの使用により誘導され得る。コード配列の発現は、構成的であり得る力、または調節され得る。

[0130] 種々の周知の遺伝子導入ベクターを遺伝子治療のための組成物として使用する場合、ベクターの投与は、 PBS (リン酸緩衝化生理食塩水）または生理食塩水などに懸濁したベクター懸濁液の局所 (例えば、癌組織内、肝臓内、筋肉内および脳内など）への直接注入か、または血管内（例えば、動脈内、静脈内および門脈内）への投与によりなされる。

[0131] 1つの実施態様において、遺伝子導入ベクターは、一般には、この遺伝子導入べクターを単位用量注入可能な形態 (溶液、懸濁液または乳濁液)で、薬学的に受容可能なキャリア (すなわち、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そして処方物の他の成分と適合性であるもの）とを混合することによつて処方され得る。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤および遺伝子導入ベクターにとつて有害であることが公知である他の化合物を含まない。

[0132] キャリアは、等張性およびィ匕学的安定性を増強する物質のような微量の添加物を適宜含む。このような物質は、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クェン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤；ァスコルビン酸のような抗酸化剤;低分子量 (約 10残基未満の）ポリペプチド (例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質 (例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはィムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸 (例えば、グリシン、グルタミン酸、ァスパラギン酸、またはアルギニン）；単糖、二糖および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、 EDTA)；糖ァルコール (例えば、マン-トールまたはソルビトール）；対イオン (例えば、ナトリウム）；および Zまたは非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー）、または PEGを含み得る。

[0133] 遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物は、代表的には、単位または多用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルにおいて、水溶液として貯蔵され得る。

[0134] 遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物は医療実施基準 (good medical prac tice)に一致した様式で、個々の患者の臨床状態 (例えば、予防または処置されるべき状態)、遺伝子導入ベクターを含む組成物の送達部位、標的組織、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮しつつ処方され、そして投与される。

[0135] 例えば、マウスに HVJ (センダイウィルス）エンベロープベクターを投与する場合、マウス一匹あたり、 20— 20, 000HAU相当の、好ましくは 60— 6, 000HAU相当の、より好ましくは 200— 2, 000HAU相当のエンベロープベクターが投与される。投与されるエンベロープベクター中に含有される外来遺伝子の量は、マウス一匹あたり、 0 . 1一 100 g、好ましくは 0. 3— 30 g、より好ましくは 1一 10 gである。

[0136] また、ヒトに HVJ (センダイウィルス）エンベロープベクターを投与する場合、被験体あたり、 400— 400, 000HAU相当の、好ましくは 1, 200— 120, 000HAU相当の、より好ましくは 4, 000— 40, 000HAU相当のエンベロープベクターが投与される。投与されるエンベロープベクター中に含有される外来遺伝子の量は、被験体あたり、 2-2, 000 μ g、好ましくは 6— 600 μ g、より好ましくは 20— 200 μ gである。

[0137] 本発明のポリペプチドを、上記の遺伝子治療において用いる方法と同様にして、遺伝子導入ベクター中に入れ、そしてそのポリペプチドを所望の部位に送達することも可能である。

[0138] (本明細書にぉ、て用いられる一般的技術）

本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、糖鎖科学、マイクロフルイデイクス、微細加工、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書にぉ、て他の場所お、て引用した文献にぉ、ても十分に説明されてヽる。

[0139] 微糸田カロェについては、伊えば、 Campbell, S. A. (1996) . The Science and

Engineering of Microelectronic Fabrication, Oxford University Pres s ;Zaut, P. V. (,1996) . Micromicroarray Fabrication： a Practical Guide to Semiconductor Processing, Semiconductor Services ; Madou, M. J. ( 1997) . Fundamentals of Microfabrication, CRC1 5 Press ;Rai—Choud hury, P. (1997) . Handbook of Microlithography, Micromachining , & Microfabrication: Microlithographyなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。

[0140] 本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、糖鎖科学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、 Maniatis, T. et al. (1989) . Molecular Cloning： A Laboratory Manual , Cold Spring Harborおよびその 3rd Ed. (2001)； Ausubel, F. M. , et al. eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. , NY, 10158 (2000) ;Innis, M. A. (1990) . PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Academic Press ;Innis, M. A. et al. ( 1995) . PCR Strategies, Academic Press ; Sninsky, J. J. et al. (1999) . P CR Applications： Protocols for Functional Genomics, Academic Press ； Gait, M. J. (1985) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach , IRL Press ; Gait, M. J. (1990) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical

Approach, IRL Press ; Eckstein, F. (1991) . Oligonucleotides and Ana logues : A Practical Approac , IRL Press ; Adams, R. L. et al. (1992) . The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarov a, Z. et al. (1994) . Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim ; Blackburn, G. M. et al. (1996) . Nucleic Acids in Chemistr y and Biology, Oxford University Press； Hermanson, G. T. (1996) . Bi oconjugate Techniques, Academic Press ; Method in

Enzymology 230、 242、 247、 Academic Press、 1994 ;別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載されており、これらは本明細書にお、て関連する部分 (全部であり得る）が参考として援用される。

[0141] (処方）

本発明はまた、有効量の治療剤の被験体への投与による、疾患または障害 (例えば、感染症)の処置および zまたは予防の方法を提供する。治療剤は、薬学的に受容可能なキャリア型 (例えば、滅菌キャリア）と組み合せた、本発明の組成物を意味する。

[0142] 治療剤を、個々の患者の臨床状態 (特に、治療剤単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（GMP = good medical practice)を遵守する方式で処方および投薬する。従つて、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される

[0143] 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与されるペプチド治療剤の合計薬学的有効量は、患者体重の、約 0. 1 μ g/kg/日一 lOmgZkgZ日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、本発明の細胞生理活性物質について、この用量は、少なくとも 1 g/kg/日、最も好ましくはヒトに対して約 0. Olmg/kg/日と約 lmgZkgZ日との間である。連続投与する場合、代表的には、治療剤を約 1 μ gZkgZ時間一約 50 gZkgZ時間の投薬速度で 1日に 1 一 4回の注射かまたは連続皮下注入 (例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。

[0144] 治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（intmcistemally)、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。

[0145] 本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内（intmcistemally)、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。

[0146] 本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、適切なポリマー物質 (例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル)の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性物質 (例えば、許容品質油中のェマルジヨンとして)またはイオン交換榭脂、および貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩)を包含する。

[0147] 徐放性マトリックスとしては、ボリラクチド（米国特許第 3, 773, 919号、 EP58, 481 )、 L グルタミン酸および γ—ェチルー L グルタメートのコポリマー（Sidmanら、 Biop olymers 22 : 547—556 (1983) )、ポリ（2—ヒドロキシェチルメタタリレート） (Langer ら、 J. Biomed. Mater. Res. 15 : 167—277 (1981)、および Langer, Chem. T ech. 12 : 98— 105 (1982) )、エチレンビュルアセテート（Langerら、同書）またはポリー D—(— )ー3—ヒドロキシ酪酸（EP133, 988)が挙げられる。

[0148] 徐放性治療剤はまた、リボソームに包括された本発明の治療剤を包含する（一般に , Langer, Science 249 : 1527— 1533 (1990) ;Treatら， Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez— Berestein and Fi dler (編）， Liss, New York, 317— 327頁および 353— 365 (1989)を参照のこと）。治療剤を含有するリボソームは、それ自体が公知である方法により調製され得る： D E3, 218, 121 ;Epsteinら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 3688-3692 (1 985)； Hwangら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 4030-4034 (1980)； EP5 2, 322 ;EP36, 676 ;EP88, 046 ;EP143, 949 ;EP142, 641 ;日本国特許出願第 83— 118008号；米国特許第 4, 485, 045号および同第 4, 544, 545号ならびに EP第 102, 324号。通常、リボソームは、小さな（約 200— 800 A)ュ-ラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約 30モル％コレステロールよりも多ぐ選択された割合が、最適治療剤のために調整される。

[0149] なおさらなる実施態様において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達される (Lan gerゝ前出； Sefton CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 : 201 (1987)； Buchwal dら、 Surgery 88 : 507 (1980) ; Saudekら、 N. Engl. J. Med. 321 : 574 (1989) を参照のこと)。

[0150] 他の制御放出系は、 Langer (Science 249 : 1527— 1533 (1990) )による総説において議餘される。

[0151] 非経口投与のために、 1つの実施態様において、一般に、治療剤は、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなぐかつ処方物の他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態 (溶液、懸濁液または乳濁液)で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化、および治療剤に対して有害であることが知られて、る他の化合物を含まな、。

[0152] 一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびォレイン酸ェチルのような非水性ビヒクルもまた、リボソームと同様に本明細書において有用である。

[0153] キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなぐこのような物質としては、リン酸塩、クェン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；ァスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約 10残基より少ない）ポリペプチド (例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビュルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、ァスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸;セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物; EDTAのようなキレート剤；マン-トールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および Zまたはポリソルベート、ポロキサマーもしくは PEGのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。

[0154] 治療剤は、代表的には約 0. lmgZml— lOOmgZml、好ましくは 1一 lOmgZml の濃度で、約 3— 8の pHで、このようなビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、塩が形成されることが理解される。

[0155] 治療的投与に用いられるべき任意の薬剤は、有効成分としてのウィルス以外の生物 ·ウィルスを含まない状態、すなわち、無菌状態であり得る。滅菌濾過膜 (例えば 0 . 2ミクロンメンブレン)で濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはノィアルに配置される。

[0156] 治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバィアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、 10mlのバイアルに、滅菌濾過した 1% (WZV)治療剤水溶液 5mlを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥した治療剤を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。

[0157] 本発明はまた、本発明の治療剤の 1つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。

[0158] 本発明の治療剤は、単独または他の治療剤と組合わせて投与され得る。組合わせは、例えば、混合物として同時に；同時にまたは並行してだが別々に；あるいは経時的のいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤力治療用混合物として共に投与されるという提示、およびまた、組み合わされた薬剤力別々にしかし同時に、例えば、同じ個体に別々の静脈ラインを通じて投与される手順を含む。「組み合わせて」の投与は、一番目、続いて二番目に与えられる化合物または薬剤のうち 1つの別々の投与をさらに含む。

[0159] 特定の実施態様にお!、て、本発明の薬学的組成物は、抗がん剤との組み合わせで投与される。 [0160] (pCMV9にコードされるタンパク質のポリペプチド形態）

1つの局面において、本発明は、 pCMV9にコードされるタンパク質のポリペプチドを含む慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌を処置するため、予防するためまたは予後のための組成物を提供する。ここで、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患 (種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。

[0161] 1つの実施形態において、本発明の pCMV9にコードされるタンパク質由来のポリペプチドは、（a)配列番号 1または 3に記載の核酸配列またはそのフラグメントによつてコードされる、ポリペプチド；（b)配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有する、ポリペプチド；（c)配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する、改変体ポリペプチド (d)配列番号 1または 3に記載の塩基配列のスプライス改変体もしくは対立遺伝子改変体によってコードされる、ポリペプチド；（e)配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列の種相同体ポリペプチド；または（f) (a)一 (e)のいずれか 1つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも 70%であるアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む。

[0162] 1つの好ましい実施形態において、上記 (c)における置換、付加および欠失の数は限定されていてもよぐ例えば、 30以下、 20以下、 15以下、 10以下、 9以下、 8以下、 7以下、 6以下、 5以下、 4以下、 3以下、 2以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、 pCM V9にコードされるタンパク質と類似するかまたは実質的に同一の活性、（例えば、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c f osプロモーター力の転写抑制活性、 E2Fプロモーター力ゝらの転写抑制活性、 APIプロモーターからの転写抑制活性、 VEGF活性抑制活性、 NF κ Bプロモーターからの転写抑制活性または血管新生抑制活性)を有する）限り、多い数であってもよい。 [0163] 別の好ま、実施形態にぉ、て、上記 (d)における対立遺伝子変異体は、配列番号 2または 4に示すアミノ酸配列と少なくとも 99%の相同性を有することが好ましい。

[0164] 別の好ましい実施形態において、上記種相同体は、本明細書中上述のように同定することができ、配列番号 2または 4に示すアミノ酸配列と少なくとも約 30%の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約 40 %、少なくとも約 50%、少なくとも約 60%、少なくとも約 70%、少なくとも約 80%、少なくとも約 90%、少なくとも約 95%、少なくとも約 98%、相同であり得る。

[0165] 上記種相同体は、その種の遺伝子配列データベースが存在する場合、そのデータベースに対して、本発明の pCMV9にコードされるペプチドのアミノ酸配列をクエリ配列として検索することによって同定することができる。あるいは、本発明の pCMV9にコードされる遺伝子の全部または一部をプローブまたはプライマーとして、その種の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、配列番号 1または 3に示す核酸配列または配列番号 2または 4に示すアミノ酸配列と少なくとも約 30%の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約 40%、少なくとも約 50 %、少なくとも約 60%、少なくとも約 70%、少なくとも約 80%、少なくとも約 90%、少なくとも約 95%、少なくとも約 98%、相同であり得る。

[0166] 別の好ましい実施形態において、上記改変体ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c fosプロモーター力の転写抑制活性、 E2Fプロモーターからの転写抑制活性、 APIプロモーター力もの転写抑制活性、 VEGF活性抑制活性、 NF κ Βプロモ一ターからの転写抑制活性、血管新生抑制活性などが挙げられるがそれらに限定されない。これらは例えば、免疫学的アツセィ、リン酸化定量、細胞増殖アツセィ、プロモーターアツセィ、血管新生アツセィなどによって測定することができる。

[0167] 好ましい実施形態において、上記（a)—（d)のいずれか 1つのポリペプチドに対する相同性は、少なくとも約 80%であり得、より好ましくは少なくとも約 90%であり得、さらに好ましくは少なくとも約 98%であり得、もっとも好ましくは少なくとも約 99%であり得る。

[0168] 本発明のポリペプチドは、通常、少なくとも 3の連続するアミノ酸配列を有する。本発明のポリペプチドが有するアミノ酸長は、目的とする用途に適合する限り、どれだけ短くてもよいが、好ましくは、より長い配列が使用され得る。従って、好ましくは、少なくとも 4アミノ酸長、より好ましくは少なくとも 5アミノ酸長、少なくとも 6アミノ酸長、少なくとも 7アミノ酸長、少なくとも 8アミノ酸長、少なくとも 9アミノ酸長、少なくとも 10アミノ酸長であってもよい。さらに好ましくは少なくとも 15アミノ酸長であり得、なお好ましくは少なくとも 20アミノ酸長であり得る。これらのアミノ酸長の下限は、具体的に挙げた数字のほ力に、それらの間の数（例えば、 11、 12、 13、 14、 16など）あるいは、それ以上の数（例えば、 21、 22、 . . . 30、など）であってもよい。本発明のポリペプチドは、配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c f osプロモーターからの転写抑制活性、 E2Fプロモーター力の転写抑制活性、 APIプロモーターからの転写抑制活性、 VEGF活性抑制活性、 NF κ Bプロモーターからの転写抑制活性または血管新生抑制活性の中の少なくとも 1つの活性を有する限り、その上限の長さは、配列番号 2または 4に示す配列の全長と同一であってもよぐそれを超える長さであってもよい。

[0169] 1つの実施形態において、処置されるべき疾患、障害または状態は、本明細書において他の場所において記載されており、例えば、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌などを含む。好ましくは、本発明の組成物が対象とする疾患、障害または状態は、癌であり得る。

[0170] 別の実施形態において、本発明の pCMV9にコードされるタンパク質由来のぺプチドは、可溶性であることが好ましい。

[0171] (pCMV9にコードされる遺伝子の核酸形態）

1つの局面において、本発明は、 pCMV9にコードされるタンパク質をコードする核酸分子を含む慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌の、処置、予防、または予後のための組成物を提供する。ここで、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患 (種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。

[0172] 1つの実施形態において、本発明において用いられる pCMV9にコードされるタンパク質をコードする核酸分子、またはそのフラグメントもしくは改変体は、（a)配列番号 1または 3に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド； (b)配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド、（c)配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のァミノ酸が、置換、付加および欠失力なる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（d)配列番号 1または 3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；（e)配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列力もなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド； (f) (a )一 (e)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または (g) (a)一 (e)のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 70%である塩基配列力なり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、力なる群より選択される、ポリヌクレオチド、を含む。

[0173] 1つの好ましい実施形態において、上記 (c)における置換、付加および欠失の数は、限定され、例えば、 30以下、 20以下、 15以下、 10以下、 9以下、 8以下、 7以下、 6 以下、 5以下、 4以下、 3以下、 2以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、 pCMV9にコードされるタンパク質と類似する力または実質的に同一の活性、（例えば、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c fosプロモーター力の転写抑制活性、 E2Fプロモーターからの転写抑制活性、 APIプロモーターからの転写抑制活性、 VEGF活性抑制活性、 NF κ Bプロモーターからの転写抑制活性または血管新生抑制活性)を有する）限り、多い数であってもよい。 [0174] 別の好ましい実施形態において、上記改変体ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列力もなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c - f osプロモーターからの転写抑制活性、 E2Fプロモーター力の転写抑制活性、 APIプロモーターからの転写抑制活性、 VEGF活性抑制活性、 NF κ Bプロモーターからの転写抑制活性、血管新生抑制活性などが挙げられるがそれらに限定されない。これらは例えば、免疫学的アツセィ、リン酸化定量、細胞増殖アツセィ、プロモーターアツセィ、血管新生アツセィなどによって柳』定することができる。

[0175] 別の好ま、実施形態にぉ、て、 (d)に記載の対立遺伝子変異体は、配列番号 1 または 3に示す核酸配列と少なくとも 99%の相同性を有することが有利である。

[0176] 上記種相同体は、その種の遺伝子配列データベースが存在する場合、そのデータベースに対して、本発明の pCMV9にコードされる遺伝子の核酸配列をクエリ配列として検索することによって同定することができる。あるいは、本発明の pCMV9にコードされる遺伝子の核酸配列の全部または一部をプローブまたはプライマーとして、その種の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、配列番号 1または 3に示す核酸配列と少なくとも約 30%の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約 40%、少なくとも約 50%、少なくとも約 60%、少なくとも約 7 0%、少なくとも約 80%、少なくとも約 90%、少なくとも約 95%、少なくとも約 98%、相同であり得る。

[0177] 好ましい実施形態において、上記（a)—（e)のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約 80%であり得、より好ましくは少なくとも約 90%であり得、さらに好ましくは少なくとも約 98%であり得、もっとも好ましくは少なくとも約 99%であり得る。

[0178] 好ましい実施形態において、本発明の pCMV9にコードされるポリペプチドをコードする核酸分子またはそのフラグメントおよび改変体は、少なくとも 8の連続するヌクレォチド長であり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも 10の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも 15の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも 20の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数 (例え ίま、、 9、 11、 12、 13、 14、 16など）ある!/、 ίま、それ以上の数（ί列え ίま、、 21、 22、 . . . 3 0、など)であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途 (例えば、アンチセンス、 RNAi、マーカー、プライマー、プローブ、所定の因子と相互作用し得ること）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号 1または 3に示す配列の全長であってもよぐそれを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約 8のヌクレオチド長であり得、好ましくは約 10ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約 15ヌクレオチド長であり得、好ましくは約 17ヌクレオチド長であり得る。

[0179] 1つの実施形態において、 pCMV9にコードされるポリペプチドをコードする核酸分子、またはそのフラグメントもしくは改変体は、配列番号 1または 3の核酸配列の全範囲を含む。より好ましくは、 pCMV9にコードされるポリペプチドをコードする核酸分子、またはそのフラグメントもしくは改変体は、配列番号 1または 3の核酸配列の全範囲からなる。

[0180] 1つの実施形態において、処置されるべき疾患、障害または状態は、本明細書において他の場所において記載されており、例えば、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌などを含む。好ましくは、本発明の組成物が対象とする疾患、障害または状態は、癌であり得る。

[0181] (pCMV15にコードされるタンパク質のポリペプチド形態）

1つの局面において、本発明は、 pCMV15にコードされるタンパク質のポリべプチを含む関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌を処置するため、予防するためまたは予後のための組成物を提供する。ここで、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のノメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患 (種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。

[0182] 1つの実施形態において、本発明の pCMV15にコードされるタンパク質由来のポリペプチドは、（a)配列番号 5または 7に記載の核酸配列またはそのフラグメントによつてコードされる、ポリペプチド；（b)配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有する、ポリペプチド；（c)配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する、改変体ポリペプチド (d)配列番号 5または 7に記載の塩基配列のスプライス改変体もしくは対立遺伝子改変体によってコードされる、ポリペプチド；（e)配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列の種相同体ポリペプチド；または（f) (a)一 (e)のいずれか 1つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも 70%であるアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む。

[0183] 1つの好ましい実施形態において、上記 (c)における置換、付加および欠失の数は限定されていてもよぐ例えば、 50以下、 40以下、 30以下、 20以下、 15以下、 10以下、 9以下、 8以下、 7以下、 6以下、 5以下、 4以下、 3以下、 2以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、 pCMVl 5にコードされるタンパク質と類似する力または実質的に同一の活性、（例えば、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c fosプロモーターからの転写抑制活性、 E2Fプロモーター力の転写抑制活性、 APIプロモーターからの転写抑制活性、 VEGF活性抑制活性、 NF κ Bプロモーターからの転写抑制活性または血管新生抑制活性)を有する）限り、多い数であってもよい。

[0184] 別の好ま、実施形態にぉ、て、上記 (d)における対立遺伝子変異体は、配列番号 6または 8に示すアミノ酸配列と少なくとも 99%の相同性を有することが好ましい。

[0185] 別の好ましい実施形態において、上記種相同体は、本明細書中上述のように同定することができ、配列番号 6または 8に示すアミノ酸配列と少なくとも約 30%の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約 40 %、少なくとも約 50%、少なくとも約 60%、少なくとも約 70%、少なくとも約 80%、少なくとも約 90%、少なくとも約 95%、少なくとも約 98%、相同であり得る。

[0186] 上記種相同体は、その種の遺伝子配列データベースが存在する場合、そのデータベースに対して、本発明の pCMV15にコードされるペプチドのアミノ酸配列をクエリ配列として検索することによって同定することができる。あるいは、本発明の pCMVl 5にコードされる遺伝子の全部または一部をプローブまたはプライマーとして、その種の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、配列番号 5または 7に示す核酸配列または配列番号 6または 8に示すアミノ酸配列と少なくとも約 30%の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約 40%、少なくとも約 50%、少なくとも約 60%、少なくとも約 70%、少なくとも約 80%、少なくとも約 90% 、少なくとも約 95%、少なくとも約 98%、相同であり得る。

[0187] 別の好ましい実施形態において、上記改変体ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c fosプロモーター力の転写抑制活性、 E2Fプロモーターからの転写抑制活性、 APIプロモーター力もの転写抑制活性、 VEGF活性抑制活性、 NF κ Βプロモ一ターからの転写抑制活性、血管新生抑制活性などが挙げられるがそれらに限定されない。これらは例えば、免疫学的アツセィ、リン酸化定量、細胞増殖アツセィ、プロモーターアツセィ、血管新生アツセィなどによって測定することができる。

[0188] 好ましい実施形態において、上記（a)—（d)のいずれか 1つのポリペプチドに対する相同性は、少なくとも約 80%であり得、より好ましくは少なくとも約 90%であり得、さらに好ましくは少なくとも約 98%であり得、もっとも好ましくは少なくとも約 99%であり得る。

[0189] 本発明のポリペプチドは、通常、少なくとも 3の連続するアミノ酸配列を有する。本発明のポリペプチドが有するアミノ酸長は、目的とする用途に適合する限り、どれだけ短くてもよいが、好ましくは、より長い配列が使用され得る。従って、好ましくは、少なくとも 4アミノ酸長、より好ましくは少なくとも 5アミノ酸長、少なくとも 6アミノ酸長、少なくとも 7アミノ酸長、少なくとも 8アミノ酸長、少なくとも 9アミノ酸長、少なくとも 10アミノ酸長であってもよい。さらに好ましくは少なくとも 15アミノ酸長であり得、なお好ましくは少なくとも 20アミノ酸長であり得る。これらのアミノ酸長の下限は、具体的に挙げた数字のほ力に、それらの間の数（例えば、 11、 12、 13、 14、 16など）あるいは、それ以上の数（例えば、 21、 22、 . . . 30、など）であってもよい。本発明のポリペプチドは、配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c f osプロモーターからの転写抑制活性、 E2Fプロモーター力の転写抑制活性、 APIプロモーターからの転写抑制活性、 VEGF活性抑制活性、 NF κ Bプロモーターからの転写抑制活性または血管新生抑制活性の中の少なくとも 1つの活性を有する限り、その上限の長さは、配列番号 6または 8に示す配列の全長と同一であってもよぐそれを超える長さであってもよい。

[0190] 1つの実施形態において、処置されるべき疾患、障害または状態は、本明細書において他の場所において記載されており、例えば、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌などを含む。好ましくは、本発明の組成物が対象とする疾患、障害または状態は、癌であり得る。

[0191] 別の実施形態において、本発明の pCMV15にコードされるタンパク質由来のぺプチドは、可溶性であることが好ましい。

[0192] (pCMV15にコードされる遺伝子の核酸形態）

1つの局面において、本発明は、 pCMV15にコードされるタンパク質をコードする核酸分子を含む関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌の、処置、予防、または予後のための組成物を提供する。ここで、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患 (種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。

[0193] 1つの実施形態において、本発明において用いられる pCMV15にコードされるタンパク質をコードする核酸分子、またはそのフラグメントもしくは改変体は、（a)配列番号 5または 7に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド； (b)配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド、（c)配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列において、 1以上のァミノ酸が、置換、付加および欠失力なる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（d)配列番号 5または 7に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；（e)配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列力もなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド； (f) (a )一 (e)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または (g) (a)一 (e)のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 70%である塩基配列力なり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、力なる群より選択される、ポリヌクレオチド、を含む。

[0194] 1つの好ましい実施形態において、上記 (c)における置換、付加および欠失の数は、限定され、例えば、 50以下、 40以下、 30以下、 20以下、 15以下、 10以下、 9以下、 8以下、 7以下、 6以下、 5以下、 4以下、 3以下、 2以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する (好ましくは、 pCMV15にコードされるタンパク質と類似するかまたは実質的に同一の活性、（例えば、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c f osプロモーターからの転写抑制活性、 E2F プロモーターからの転写抑制活性、 APIプロモーター力の転写抑制活性、 VEGF 活性抑制活性、 NF κ Bプロモーターからの転写抑制活性または血管新生抑制活性 )を有する）限り、多い数であってもよい。

[0195] 別の好ましい実施形態において、上記改変体ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列力もなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c - f osプロモーターからの転写抑制活性、 E2Fプロモーター力の転写抑制活性、 APIプロモーターからの転写抑制活性、 VEGF活性抑制活性、 NF κ Bプロモーターからの転写抑制活性、血管新生抑制活性などが挙げられるがそれらに限定されない。これらは例えば、免疫学的アツセィ、リン酸化定量、細胞増殖アツセィ、プロモーターアツセィ、血管新生アツセィなどによって柳』定することができる。

[0196] 別の好ま、実施形態にぉ、て、 (d)に記載の対立遺伝子変異体は、配列番号 5 または 7に示す核酸配列と少なくとも 99%の相同性を有することが有利である。

[0197] 上記種相同体は、その種の遺伝子配列データベースが存在する場合、そのデータベースに対して、本発明の pCMV15にコードされる遺伝子の核酸配列をクエリ配列として検索することによって同定することができる。あるいは、本発明の pCMV15にコードされる遺伝子の核酸配列の全部または一部をプローブまたはプライマーとして、その種の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、配列番号 5または 7に示す核酸配列と少なくとも約 30%の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約 40%、少なくとも約 50%、少なくとも約 60%、少なくとも約 70%、少なくとも約 80%、少なくとも約 90%、少なくとも約 95%、少なくとも約 98% 、相同であり得る。

[0198] 好ましい実施形態において、上記（a)—（e)のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約 80%であり得、より好ましくは少なくとも約 90%であり得、さらに好ましくは少なくとも約 98%であり得、もっとも好ましくは少なくとも約 99%であり得る。

[0199] 好ましい実施形態において、本発明の pCMV15にコードされるポリペプチドをコードする核酸分子またはそのフラグメントおよび改変体は、少なくとも 8の連続するヌクレォチド長であり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも 10の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも 15の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも 20の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数 (例え ίま、、 9、 11、 12、 13、 14、 16など）ある!/、 ίま、それ以上の数（ί列え ίま、、 21、 22、 . . . 3

0、など)であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途 (例えば、アンチセンス、 RNAi、マーカー、プライマー、プローブ、所定の因子と相互作用し得ること）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号 5または 7に示す配列の全長であってもよぐそれを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約 8のヌクレオチド長であり得、好ましくは約 10ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約 15ヌクレオチド長であり得、好ましくは約 17ヌクレオチド長であり得る。

[0200] 1つの実施形態において、 pCMV15にコードされるポリペプチドをコードする核酸分子、またはそのフラグメントもしくは改変体は、配列番号 5または 7の核酸配列の全範囲を含む。より好ましくは、 pCMV15にコードされるポリペプチドをコードする核酸分子、またはそのフラグメントもしくは改変体は、配列番号 5または 7の核酸配列の全範囲からなる。

[0201] 1つの実施形態において、処置されるべき疾患、障害または状態は、本明細書において他の場所において記載されており、例えば、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌などを含む。好ましくは、本発明の組成物が対象とする疾患、障害または状態は、癌であり得る。

[0202] さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、他の治療レジメまたは予防レジメ（例えば、放射線治療）と組合わせて投与される。

[0203] 以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例

[0204] (実施例 1：ウィルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を封入した遺伝子導入ベクターの調製および使用）

(ウィルスの調製）

HVJ、 Z株を、先に記載のように（Kaneda、 Cell Biology: A Laboratory Ha ndbook, J. E. Celis (Ed. ) , Academic Press, Orlando, Florida, vol. 3, pp. 50-57 (1994) )差示的遠心分離により精製した。精製 HVJを平衡化塩溶液 (BSS： 137mM NaCl、 5. 4mM KC1、 lOmM Tris— HC1、 pH7. 5)中に再懸濁し、そしてウィルス力価を、 540nmにおける吸光度を測定することにより決定した。 540nm における光学的密度は、 15, 000血球凝集単位 (HAU)に対応し、融合活性と相関する。

[0205] (遺伝子導入ベクターの調製）

3. 56mgホスファチジルコリンおよび 0. 44mgコレステロールの脂質混合物を、クロ口ホルム中に溶解し、そしてこの脂質溶液を、ロータリーエバポレーター中で蒸発させた（Uchidaら、 J. Cell. Biol. 80 : 10—20 (1979) )。乾燥脂質混合物を、 0. 85% NP— 40を含む 2. Omlの上記素通り画分からのタンパク質溶液（1. 6mg)中にボルテックスにより完全に溶解した。次いで、この溶液を 0. 3M スクロースおよび ImM KC1を含む 10 mMリン酸緩衝液 (pH7. 2)に対して透析し、 NP— 40を除去した。透析は、毎日緩衝液を交換して 6日間実施した。この透析された溶液を、 0. 3M スクロースおよび ImM KC1を含む 10mMリン酸緩衝液（pH5. 2)で平衡化したァガロースビーズ（Bio— Gel A— 50m) (Bio— Rad Laboratories, Hercules, CA, U SA)にアプライした。 540nmにおける光学的密度が 1. 5を超える画分を再構成融合粒子として集め、そして以下に記載のように 10mg脂質力も調製された核酸充填リポノームと融合し、遺伝子導入ベクターを調製した。

[0206] (ヒト HEK293株由来のトランスフエタト細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現）上記の方法で調製した遺伝子導入ベクターの遺伝子導入活性を確認するために、ヒト HEK293株およびルシフェラーゼ遺伝子を、以下のように用いた。

[0207] pCMV—ルシフェラーゼ（7. 4kb)を、 pGEM— luc (Promega Corp.、 Madison 、 WI、 USA)からのルシフェラーゼ遺伝子を、 pcDNA3 (5. 4kb) (Invitrogen、 Sa n Diego, CA、 USA)中に、 Hindlllおよび BamHI部位でクロー-ングすることにより構築した。約 40 gの pCMV—ルシフェラーゼを含む遺伝子導入ベクターを、先に記載のように構築し、そしてこの遺伝子導入ベクター (約 1. 5 X 10¹¹粒子 Zml、 D NA濃度は約 40 μ g/ml)の 1Z10量（ 100 1)を、ヒト 293細胞株 (ヒト胎児腎臓： Η ΕΚ)由来の 2 X 10⁵細胞とインキュベートした。 HVJリボソームを用いて、また同量のルシフェラーゼ DNAを 2 X 10⁵HEK293細胞に導入した。導入 24時間後、細胞を回収し、そして他に記載のように（Saekiら、 Hum. Gene Ther. , 8 : 1965— 1972 ( 1997) )、ルシフェラーゼ活性アツセィを確認した。

[0208] (実施例 2：界面活性剤を用いる不活性ィ匕 HVJエンベロープベクターの調製および使用）

(1 :HVJの増殖）

HVJは鶏の受精卵への種ウィルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織へのウィルスの持続感染系（トリプシンなどの加水分解酵素を培養液中に添加）を利用して増殖させたもの、クローユングされたウィルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたもの、全てが利用可能である。

[0209] 本実施例において、 HVJの増殖を以下のようにおこなった。

[0210] HVJの種ウィルスを、 SPF (Specific pathogen free)の受精卵を使って増殖させ分離'精製した HVJ (Z種)を細胞保存用チューブに分注し、 10% DMSOを加えて液体窒素中に保存し、調製した。

[0211] 受精直後の-ヮトリ卵を入荷し、インキュベーター（SHOWA— FURANKI P— 03 型;約 300鶏卵収容）にいれ、 36. 5°C、湿度 40%以上の条件で 10— 14日飼育した。暗室中で、検卵器 (電球の光が口径約 1. 5cmの窓を通して出るようになつているもの）を用いて、胚の生存及び気室と漿尿膜を確認し、漿尿膜の約 5mm上方に鉛筆でウィルス注入箇所の記しをつけた (太、、血管を除、た場所を選定する)。ポリぺプトン溶液（1%ポリペプトン、 0. 2% NaClを混合し、 1M NaOHで pH7. 2に調整してオートクレープ滅菌し、 4°C保存したもの）で種ウィルス (液体窒素からとりだしたもの）を 500倍に希釈し、 4°Cにおいた。卵をイソジン及びアルコールで消毒し、ウィルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希釈した種ウィルス 0. 1mlを 26ゲージの針付き lmlシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入した。溶力したパラフィン (融点 5 0— 52°C)をパスツールピペットを用いて孔の上に置きこれをふさいだ。卵をインキュベータ一にいれ、 36. 5°C、湿度 40%以上の条件で 3日飼育した。次に、接種卵を一晩 4°Cにおいた。翌日、卵の気室部分をピンセットで割り、 18ゲージの針を付けた 10mlシリンジを漿尿膜の中にいれて、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、 4°Cに保存した。

[0212] (2 :HVJの精製）

HVJは、遠心分離による精製方法、カラムによる精製方法、または当該分野において公知のその他の精製方法によって、精製され得る。

(2. 1 :遠心分離による精製方法）

手短には、増殖させたウィルス液を回収し低速遠心で培養液や漿尿液中の組織. 細胞片を除去した。その上清を高速遠心（27, 500 X g、 30分間）とショ糖密度勾配（ 30— 60%wZv)を利用した超遠心（62, 800 X g、 90分間）により精製した。精製の間にウィルスをできるだけ穏和に扱い、 4°Cで保存することに注意すべきである。

[0213] 本実施例において、具体的には、以下の方法によって HVJを精製した。

[0214] HVJ含有漿尿液 (HVJ含有の-ヮトリ卵の漿尿液を集め 4°Cにて保存)の約 100m 1を広口の駒込ピペットで 50mlの遠心チューブ 2本に入れ（Saeki, Y. ,および Kan eda, Y： Protein modinea liposomes (HVJ— liposomes) for the delivery of genes, oligonucleotides and proteins. Cell Biology ; A laboratory handbook (第 2版) J. E. Celis編（Academic Press Inc. , SanDiego)第 4卷、 1 27— 135、 1998を参照のこと）、低速遠心機で 3000rpm、 10分、 4。Cで遠心し（ブレーキはオフ）、卵の組織片を除去した。

[0215] 遠心後、上清を 35ml遠心チューブ 4本（高速遠心用）に分注し、アングルローターで 27, 000g, 30分遠心した（アクセル、ブレーキはオン)。上清を除き、沈殿に BSS (10mM Tris— HCl(pH7. 5)、 137mM NaCl、 5. 4mM KC1 ;オートクレーブし、 4°C保存）（BSSのかわりに PBSでも可能）をチューブ当たり約 5mlカ卩え、そのまま 4°Cでー晚静置した。広口の駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし 1本のチューブに集め、同様にアングルローターで 27, 000g、 30分遠心した。上清をのぞき沈殿に BSS約 10mlをカ卩え、同様に 4°Cでー晚静置した。広口の駒込ピぺットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし、低速遠心機で 3000rpm, 10分、 4°Cで遠心し (ブレーキはオフ）、除ききれな力つた組織片ゃウィルスの凝集塊をのぞ V、た。上清を新、滅菌済みチューブに入れ精製ウィルスとして 4°Cで保存する。 [0216] このウィルス液 0. 1ml〖こ BSSを 0. 9ml加え、分光光度計で 540nmの吸収を測定し、ウィルス力価を赤血球凝集活性 (HAU)に換算した。 540nmの吸収値 1がほぼ 15 , OOOHAUに相当した。 HAUは融合活性とほぼ比例すると考えられる。また実際に -ヮトリ赤血球液 (0. 5%)を用いて、赤血球凝集活性を測定してもよ!/ヽ（動物細胞利用実用化マニュアル、 REALIZE INC. (内田、大石、古沢編集） P259— 268、 19 84を参照のこと)。

[0217] さらにショ糖密度勾配を用いた HVJの精製も必要に応じて行い得る。具体的には、ウィルス懸濁液を 60%、 30%のショ糖溶液 (オートクレーブ滅菌）を重層した遠心チユーブにのせ、 62, 800 X gで 120分間密度勾配遠心を行う。遠心後、 60%ショ糖溶液層上にみられるバンドを回収する。回収したウィルス懸濁液を BSSもしくは PBS を外液として 4°Cで透析を一晩行い、ショ糖を除去する。すぐに使用しない場合は、ゥィルス懸濁液にグリセロール（オートクレーブ滅菌）と 0. 5M EDTA液（オートクレーブ滅菌）をそれぞれ最終濃度が 10%と 2— 10mMになるように加えて- 80°Cで穏ゃかに凍結し、最終的に液体窒素中で保存する（凍結保存はグリセロールと 0. 5M E DTA液の代わりに 10mM DMSOでも可能）。

(2. 2 :カラムおよび限外濾過による精製方法）

遠心分離による精製方法に代えて、カラムによる HVJの精製も本発明に適用可能である。

[0218] 手短には、分子量カットオフが 50, 000のフィルターによる限外濾過による濃縮 (約 10倍）とイオン交換クロマトグラフィー（0. 3M— 1M NaCl)による溶出を用いて精製した。

[0219] 具体的には、本実施例において、以下の方法を使用して、 HVJをカラムによって精製した。

[0220] 漿尿液を採集した後、 80 m— 10 mのメンブランフィルターにてろ過した。 0. 0 06-0. 008% BPL (最終濃度）を漿尿液に加え (4°C、 1時間）、 HVJを不活性ィ匕した。漿尿液を 37°C、 2時間インキュベートすることによって、 BPLを不活性ィ匕した。

[0221] 500KMWCO (A/G Technology、 Needham、 Massachusetts)を用、たタンジェンシャルフロー限外ろ過法により約 10倍濃縮した。緩衝液として、 50mM Na Cl、 ImM MgCl、 2%マン-トール、 20mM Tris (pH 7. 5)を用いた。 HAUァ

2

ッセィにより、ほぼ 100%の HVJ回収率であり優れた結果がえられた。

[0222] QSepharoseFF (アマシャムファノレマシアバイオテク KK、 Tokyo)によるカラムクロマトグラフィ一法（緩衝液： 20mM TrisHCl (pH7. 5)、0. 2— 1M NaCl)で HVJ を精製した。 40— 50%の回収率であり、純度は 99%以上であった。

[0223] 500KMWCO (A/G Technology)を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法により HVJの画分を濃縮した。

[0224] (3 :HVJの不活性化）

HVJの不活性ィ匕が必要な場合、以下に記載するように、紫外線照射またはアルキル化剤処理により行った。

[0225] (3. 1 :紫外線照射法）

HVJ懸濁液 lmlを 30mm径のシャーレにとり、 99または 198ミリジュール Zcm²を照射した。ガンマ一線照射も利用可能である（5— 20グレイ）が完全な不活性ィ匕がおこらない。

[0226] (3. 2 :アルキル化剤による処理）

使用直前に、 10mM KH PO中に 0. 01% j8—プロピオラタトンの調製をした。

2

作業中は低温下に保ち素早く作業を行った。

[0227] 精製直後の HVJの懸濁液に最終 0. 01%になるように β プロピオラタトンを添カロし、氷上で 60分間でインキュベートした。その後 2時間、 37°Cでインキュベートした。ェッペンドルフチューブにチューブあたり 10, 000HAU分ずつ分注し、 15, 000rpm、 15分遠心し、沈殿を - 20°Cで保存する。上記の不活性化法によらず、沈殿を - 20°C で保存せず、そのまま界面活性剤処理により DNAを取り込ませ、ベクターを作成することち可會である。

[0228] (4 :HVJエンベロープベクターの作成）

保存してあった HVJに外来 DNA200— 800 μ gを含む溶液 92 μ 1を加えてピぺッティングでよく懸濁した。この溶液は、 20°Cで、少なくとも、 3ヶ月保存可能である。 HVJとの混合前に DNAに硫酸プロタミンを添加すると、発現効率が 2倍以上増強し [0229] この混合液を氷上に 1分間置き、ォクチルダルコシド（10%)を 8 μ 1加えて 15秒氷上でチューブを振盪し、 45秒氷上に静置した。界面活性剤での処理時間は、 1一 5 分間が好ましい。ォクチルダルコシド以外に、 Triton— X100 (t—ォクチルフエノキシポリエトキシエタノール）、 CHAPS (3— [ (3—コラミドプロピル) ジメチルアンモ-ォ] —1 プロパンスルホン酸）、 NP— 40 (ノユルフェノキシポリエトキシエタノール）などの界面活性剤も使用し得る。 Triton— X100、 NP— 40および CHAPSの好ましい最終濃度は、それぞれ、 0. 24—0. 80%, 0. 04—0. 12%および 1. 2—2. 0%である。

[0230] 冷 BSSを lml添カ卩し、すぐ〖こ 15, OOOrpmで 15分遠心した。生じた沈殿に PBSまたは生理食塩水などを 300 1カ卩えて、ボルテックス、ピペッティングで懸濁した。懸濁液は直接遺伝子導入に使用することも、 20°Cで保存後に遺伝子導入に使用することも可能である。この HVJエンベロープベクターは、少なくとも 2ヶ月間の保存後、同程度の遺伝子導入効率を維持した。

[0231] (5 :HVJエンベロープベクターによる細胞内への遺伝子導入）

(遺伝子導入方法）

1, 000HAU分をエツペンドルフチューブにとり（30 μ 1)、硫酸プロタミン（lmgZm 1) 5 1を加えた。 BHK— 21細胞（前曰に、ゥエルあたり 200, 000個で、 6つのゥエルにまいたもの）の培地を交換し、 1ゥエルあたり 0. 5mlの培地（10%FCS— DMEM) を添カ卩した。各ゥエルに、上記のベクター（1, 000HAU相当）と硫酸プロタミンの混合液を加え、プレートを前後左右にふってベクターと細胞を良く混ぜ合わせ、 37°Cで、 5%COインキュベータ一中に 10分間放置した。

2

[0232] 培地交換し、 37°Cで、 5%COインキュベータ一中でオーバーナイト（16hr— 24hr

2

)放置し、遺伝子発現を調べた。ルシフェラーゼ (pcLuci;CMVプロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子）の場合は、 Cell Lysis Buffer (Promega) O. 5mlで細胞を溶解し、その 20 μ 1溶液中の活性をルシフェラーゼアツセィキット（Promega)を用いて測定した。グリーン蛍光タンパク質 (pCMV— GFPE ;Promega)の場合は、そのまま蛍光顕微鏡で観察し、 400倍率で 5— 8視野を観察し、蛍光を発する細胞の割合を算出した。

[0233] (実施例 3 :ヒト心臓 cDNAライブラリーからの血管内皮増殖抑制活性を有するタンノク質をコードする遺伝子の単離および解析）

本発明を用いることによって、血管内皮増殖抑制活性を有するタンパク質をコードする目的遺伝子を分離することが可能である。その分離方法の実施形態の 1っを模式的に図 1に示す。

[0234] 実際に、本明細書の実施例 2で調製した遺伝子導入ベクターを使用して、血管内皮増殖抑制因子をコードする遺伝子を単離した。なお、本実施例に例示される遺伝子の単離法には、本明細書の実施例 2で調製した遺伝子導入ベクターのみならず、任意の「ウィルスエンベロープベクター」および「リボソームベクター」が使用可能である。

[0235] ヒト心臓 cDNAライブラリー（GIBCO BRL社；ヒト心臓由来 cDNAを、 CMVプロモ一ターを有するプラスミド pSPORTに連結したプラスミド）を E. coli DH12Sに導入し、その E. col も、プラスミドを調製した。プラスミド 200 μ gを、 10000HAUの HV J E遺伝子導入ベクター (本発明の実施例 2で調製した遺伝子導入ベクター、 3 X 1 0⁹particle)に封入した。宿主細胞として、ヒト大動脈内皮細胞 HEAC (三光純薬)約 5 000細胞を、 96ウェルマクロタイタープレートの各ゥエルに培地とともに添カ卩して、一晚培養した細胞を用いた。宿主細胞を含んだ各ゥエルに対して、上記 HVJ— Eの 100 分の 1量を添加し、 37°C 30分間放置した後、培地交換をした。

[0236] 使用した培地は、血清濃度を 1%とした低栄養状態のもので、この状態下で、 1週間培養を行う。この条件下では、 HEACの増殖は確認されなカゝつた。 2週間後、細胞を増殖因子添加の増殖促進培地で培養することによって、細胞増殖アツセィを行つた。試薬として、 Cell Titer96 (Promega社)を用い、ミトコンドリアの酸化還元状態を試薬の色調の変化として捉えて、細胞増殖の指標とした (MTTアツセィ)。

[0237] 最も色の濃いゥエルは、最も活発に細胞増殖が行われた細胞が存在するゥエルである。その反対に、最も色の薄いゥエルは、最も細胞増殖能が低い細胞が存在する。そこで、マイクロタイタープレート全体をプレートリーダーで読み取り、その細胞増殖を、コンピュータによりグラフ化した。このグラフから、低い増殖活性、すなわち、ヒト血管内皮細胞増殖抑制活性を指標に遺伝子分離を行った。

[0238] 遺伝子分離は、ゥエル内の細胞から、 Qiagen社の DNeasv Tissue Kitを用いて、核酸を調製することによって行った。調製した核酸には、プラスミド DNAが含まれるので、これをコンビテントな E. coli(DH5 o;；宝酒造）に熱ショック法を用いて導入した。

[0239] この E. coliをアンピシリン含有プレート培地に播種し、コロニーを形成させた。各コ口-一力もプラスミド DNA(pDNA)を抽出し、制限酵素処理によって、プラスミド内の遺伝子フラグメントの存在を確認した。

[0240] 次に、 Qiagen社の Endo Free Plasmid Maxi Kitを用いて、プラスミド DNA を精製し、その精製したプラスミドを HVJ— Eに封入して、再度 HAEC細胞に導入し、同様の細胞増殖実験を行った。この細胞増殖実験において、有意に低い細胞増殖を示したプラスミドが、血管内皮増殖抑制因子をコードする核酸を含むことが予想される候ネ ΐプラスミドである。上記の結果、 2次スクリーニングで 2つの遺伝子 pCMV9,pCMV15を分離した。

[0241] 次に VEGFによって細胞増殖が促進される環境下において、これら遺伝子が細胞増殖に与える影響を調べるために、 MTSアツセィ及び c-fosプロモーターアツセィを HAECを用いて行った。

[0242] (MTSアツセィ）

MTSアツセィを以下のとおりに行った。

(1. HVJエンベロープベクターへのプラスミドの封入）

1) HVJのロットより分注し、 BSSで希釈して 1 X 10⁴HAU/mlとした。

2) 3. 5 X 10⁴HAU/3. 5mlZl0cmディッシュとして、 99mjZcm²の UV処理をした。（電源 ON、 ENERGY, 990、 STARTZディッシュのフタをあけて照射した）

3) 1ml (1 X 10⁴HAU)づっ 1. 5mlチューブに分注し、遠心分離（15000rpm 15 分 4°C)後、上清除去した。

4)ペレットを lmgZml硫酸プロタミン ZTE溶液（lOmgZml硫酸プロタミン溶液を T Eで 10倍希釈したもの） 15 1で溶解した。

5) 200 μ g相当のプラスミド DN A溶液をカ卩えた。

6)すぐに、 4) + 5)の総量の 1Z10量の 3% TritonX— 10ZTE溶液をカ卩えた。

7)軽く混合し、遠心分離（15000rpm 15分 4°C)した。 8) BSS 1mlを加え、軽く混合し、遠心分離（15000rpm 15分 4°C)した。

9)上清除去後、 BSS 300 μ 1に再懸濁した。

(2. HVJエンベロープベクターを用いる細胞への遺伝子導入）

1)前日に HAEC細胞を 5000Ζゥエルまいた 96ゥエルプレートを使用した。

2)以下の濃度で調整し軽く混合してお!ヽた。

[表 1]

(注意)培地は、 EBM (Cloneteck) + 5%FBS +抗生剤'抗真菌剤 +増殖因子 (E GFおよび Zまたは VEGF)である。

3)順次培地を交換した。 (50 μ 1Zゥエル）

4)プレートを遠心（3500rpm 1時間 35°C)した。

5)培地を吸引'除去し、新しい培地に交換した。（100 1Zゥエル）

6)インキュベートした。

•1ゥエルあたり、 CellTiter96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)を 20 1添カ卩し、 100 1の内皮細胞用培地と混合し、古い培地を吸引して除き、 CellTiter96混合溶液を 1ゥエルあたり 120 1入れて COインキュ

2 ベータ一で 1一 5時間インキュベートした。

'プレートリーダーにて 490nmの吸光度を測定した。

[0244] サンプル群（各 8ゥエルずつ）は、以下のとおりである。

•増殖促進のポジティブコントロール (PC) =HGF (肝細胞増殖因子)遺伝子； •増殖抑制のポジティブコントロール（PC) =アンジォスタチン遺伝子；および •ネガティブコントロール（NC) = CMVプロモーターを有する pVAXl。

[0245] MTSアツセィの結果を図 2の左欄に示す。 Y軸は、 CMVプロモーターを有する pV AX1を「1」とした場合の相対値である。単離されたクローン pCMV9および pCMVl 5は、内皮細胞増殖抑制活性を示した。また pCMV15は、アンジォスタチン遺伝子と同程度の内皮細胞増殖抑制能を示した。また、 pCMV9は、アンジォスタチン遺伝子よりも強力に内皮細胞増殖を抑制した。

[0246] (c fosプロモーターアツセィ）

次に、単離されたクローン pCMV9および pCMV15の内皮細胞増殖抑制活性が、 c f osプロモーターからの増殖シグナル経路を抑制することを示すために、 c f osプ口モーターアツセィを行った。具体的には、じ f_osプロモーター下にノレシフェラーゼを連結した遺伝子 c - fos - Luciと候補遺伝子を 1： 1の重量比でゥシ血管内皮細胞にリポフエクシヨンによって導入し 24— 48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。ブラスミド c fos— Luciは、 c fosの 5，調節ェンハンサー領域 (一 357—— 276)を 2コピー、そして単純へルぺスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター（一 200— 7 0)、およびルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドである（Arterioscler Thromb Vase Biol. 2002 : 22 : 238— 242)。その結果を図 2の右に示す。図 2の Y軸では、 pVAXlを用いた場合のルシフェラーゼ活性を「1」として、その相対値をグラフに示した。クローン pCMV9および pCMV15の両者は、 c fosプロモーターからの転写を抑制し、その抑制能は、アンジォスタチン遺伝子よりも強力であった（図 2右)。

[0247] (pCMV9および pCMV15に含まれるインサートの特徴付け）

次に各クローンのインサートを確認した。その結果、図 3左に示されるように、 pCM V9および pCMV15の両クローンのインサートは、約 2kbであった。配列決定をしたところ、それぞれ、 19. 96kDおよび 51. 39kDの推定分子量を有するタンパク質をコードする読み枠が見出された。その核酸配列、およびアミノ酸配列を図 4および図 5 に示す。

[0248] 次に、遺伝子産物の確認のために、 pCMV' SPORTl発現ベクターの EcoRlZX hoi部位に、 pCMV9および pCMV15のインサートをそれぞれ連結し、インビトロ翻訳を行った。その結果、図 3右に示されるように、 pCMV9および pCMV15はそれぞれ約 20kD、および 50kDのタンパク質が同定された。 pCMV9がコードするタンパク質の構造を図 6Aに、 pCMV15がコードするタンパク質の構造を図 6Bに示す。遺伝子のシーケンスを解析したところ、 2つとも全く新規の遺伝子であるがゲノムプロジェクトではその存在が登録されて、るものであった（図 6Aおよび B)。 pCMV9は EST— B D095420で登録されておりヒト第 18染色体の短腕に位置する（図 6A)。本発明者らはさらにその全長遺伝子を単離した。本発明者らの単離した _PCMV9のヌクレオチド配列は、配列番号 1に示したとおりである。これに対して、 pCMV9に対応する EST— BD095420の配列は、配列番号 1の 544番目のヌクレオチド残基 T (チミン）が C (シトシン）に変わっていた。 EST— BD095420のヌクレオチド配列を配列番号 3、ァミノ酸配列を配列番号 4として配列表に示す。 pCMV15は EST— HSM805282で登録されておりヒト第 15染色体上に位置する（図 6B)。今回、本発明者らは、第 3ェキソン以下の遺伝子を単離した。第 3ェキソン力でも読み枠はメチォニンから開始しており、その近傍の配列はコザック配列を有していた。従って、第 3ェキソン力転写が開始している可能性もある。本発明者らの単離した pCMV15のヌクレオチド配列は、配列番号 5に示したとおりである。これに対して、 pCMV15〖こ対応する EST— HSM80 5282の配列は、配列番号 5の 705番目のヌクレオチド残基 A (アデニン）が C (シトシン）に、 788番目のヌクレオチド残基 A (アデニン）が G (グァニン）に、 934番目のヌクレオチド残基 A (アデニン）が G (グァニン）に、 991番目のヌクレオチド残基 G (グァ二ン）が A (アデニン）に変わっていた。 EST— HSM805282のヌクレオチド配列を配列番号 7、アミノ酸配列を配列番号 8として配列表に示す。

図 6は、本発明によって単離されたクローンのゲノム上での位置を示した模式図である。横線は、染色体を示し、線上の網掛け四角は、ェキソンの位置を示す。 pCMV 9は 18番染色体の p腕の位置し（図 6A)、 pCMV15は 5番染色体に位置した（図 6B )。配列相同性を検索したところ、 PCMV9は酵母の分泌蛋白の細胞内輸送系に関与する SNF7と相同性を示した。そのため、 pCMV9は、細胞内輸送に関与する遺伝子フアミリーに属するタンパク質である可能性が示された。 _PCMV15には、いくつかのドメインが同定された。例えば、残基 1205— 1327は、 SPRYドメイン（SPIaおよびリアノジンレセプター）との相同性を示した。また、残基 967— 1058、および残基 1067— 1151は、 FN3ドメイン (フイブロネクチン 3型ドメイン）との相同性を示した。残基 325— 445は、 SPRYドメイン（SPIaおよびリアノジンレセプター）との相同性を示した。また、残基 102 一 159、および残基 187— 278は、 FN3ドメイン（フイブロネクチン 3型ドメイン）との相同性を示した（図 6B)。なお、本発明者らが得たクローン pCMV15のゲノム上でのサイズは、 55kDaであった力対応する公知の EST配列では、 64kDaのサイズであった。本発明のクローンのェキソンの位置を濃い網掛け四角で示し、対応する公知の ES T配列由来のェキソンの位置を薄、網掛け四角で示した。

[0250] 次に、増殖抑制の機構を調べる手が力りとして、増殖に関わる転写因子である E2F および AP— 1のプロモーターを用いたルシフェラーゼアツセィを VEGF存在下で行つた。具体的には、 E2Fプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を連結したレポーター遺伝子を含むベクター、または AP— 1プロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を連結したレポーター遺伝子を含むベクター（APIプロモータ^ ~~ /レシフェラーゼ、 E2Fプロモー ~~ /レシフェラーゼ、または NF κ Bプロモータ^ ルシフェラーゼ） 1 μ gを、図 7 にそれぞれ示した発現ベクター（CMV9、 CMV15、 HA— CMV9、 HA— CMV15、 VEGF、または pcDNA3. 1 (コントロール）） 0. 3 ;z gとともに、リポフエクシヨンによつてゥシ大動脈由来内皮細胞に導入して、ルシフラーゼ活性 (RLUで示される）を測定した。図 7の「コントロール」は、発現ベクターを用いることなぐレポーター遺伝子を含むベクターのみをトランスフエクシヨンした結果を示す。「VEGF」、「pCMV15」および「pCMV9」では、各クローンの読み枠を、 pCMV' SPORTl発現ベクターに連結したプラスミドを用いた。「HA- CMV9」および「HA- CMV15Jは、 pCMV9および pCMV15 遺伝子の 5，側 (N端)にインフルエンザの HAタグの塩基配列をつけた遺伝子である。

[0251] 図 7に示されるように、 pCMV9は両方のプロモーターに抑制的にはたらいた。

PCMV15は E2Fプロモーターには抑制的に働く力 AP- 1プロモーターを用いた場合は、 VEGFの効果を抑制することができなかった。また、 HA-CMV9および

HA-CMV15を用いた場合、抑制効果は減弱し、 APIプロモーターに対する抑制効果は消失した。しかし、 E2Fプロモーターに対する VEGF活性抑制効果は、依然として検出可能であった。

[0252] (実施例 4： pCMV9および pCMV15の血管新生抑制活性）

クラボウの血管新生キット（Angiogenesis Kit, KZ— 1000,倉敷紡績株式会社 )を用いて、 VEGFによる管腔形成活性力組換え pCMV9および組換え pCMV15によって抑制される力否かを調べる。 VEGFとして、組換え VEGF (血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子を含むプラスミド)を用い、コントロールとして、対照として、ブランクを用いる。

[0253] 血管新生専用培地 (倉敷紡績 (株) KZ— 1400)中に VEGF— E (NZ— 7) 10ng/ml を添カ卩した培地へ、さらに抗ヒト VEGF— A中和抗体を 0、 250、 500、 lOOOng/ml の各濃度となるように添加して培養する。

[0254] 抗ヒト VEGF— A中和抗体としては、 Anti— VEGF、 Human, Mouse-Mono (265 03. I l l) (R&D社製カタログ No. MAB293)を用いることができる。培養は 37°C 、 5%COインキュベータ一にて行う。培地は、毎日同じ添加物を含有するものと交換

2

する。培養開始 4日目、 7日目、あるいは 11日目に培地を除き、管腔染色キット (CD 31抗体染色用：倉敷紡績 (株) KZ-1225)を用いて以下の手順に従ヽ染色する。

[0255] CD3KPECAM- 1)染色 1次抗体（マウス抗ヒト CD31抗体）をブロッキング液（1%— B SAを含むダルベッコリン酸緩衝液 (PBS (一) )で 4,000倍希釈する。各ゥエルにこの 1次抗体溶液 0.5mlを添カ卩し、 60分間 37°Cでインキュベートする。インキュベート終了後、 1mlのブロッキング液で各ゥエルを計 3回洗浄する。

[0256] 次、でブロッキング液で 500倍希釈した 2次抗体溶液 (ャギ抗マウス IgGアルカリホスファターゼ複合体） 0.5mlを各ゥエルに添カ卩し、 60分間 37°Cでインキュベートした後、 1mlの蒸留水で 3回洗浄する。その間に、 BCIPZNBTの錠剤 2錠を蒸留水 20 mlに溶解し、ポアサイズ 0.2 mのフィルターで濾過して基質溶液を準備する。調製した BCIP/NBT基質溶液 0.5mlを各ゥエルに添加し、管腔が深紫色になるまで（通常 5— 10分間） 37°Cでインキュベートする。インキュベート終了後、蒸留水 lmlで、各ゥエルを 3回洗净した後洗净液を吸引除去し、自然乾燥するため静置する。乾燥後、顕微鏡下で各ゥエルを観察する。

[0257] 各ゥエルを 40倍の顕微鏡で観察し、各ゥエルの写真を撮影する。 HAECに組換え VEGF導入をして、管腔形成が起こること、および組換え VEGFともに pCMV9および /または PCMV15を用いる場合には、組換え VEGFによる管腔形成が抑制されることを確認する。

[0258] さらに、結果を数値ィ匕するために、得られた各画像を、以下の方法に従い血管新生定量ソフトウェア (KSW-5000U,倉敷紡績株式会社)を用いることができる。 [0259] (実施例 5 :pCMV15の上流域の単離）

実施例 4に示されるように、 pCMV15は、血管新生抑制活性を有するペプチドをコードすることが実証された。また、 pCMV15は終結コドンを含むため、 pCMV15は血管新生抑制活性を有するタンパク質のカルボキシ末端に対応する核酸配列を含む力そのタンパク質のァミノ末端に対応する核酸配列を含まない。そこで、 pCMVl 5の上流域の単離および解析を行った。

[0260] 定法に従って、 pCMVl 5を標識核酸プローブとして用い、ヒト心臓 cDNAライブラリー力、 pCMVl 5の上流域を含むクローンを単離した。その結果、 3492bpおよび 4413bpを含むクローンが単離できた。このクローンの各々を pCMVl 5—2 (配列番号 9)および pCMV15—3 (配列番号 11)と命名した。 pCMV15—2に含まれる核酸は、 1163アミノ酸残基長のポリペプチド（配列番号 10)をコードし、 pCMV15— 3に含まれる核酸は、 1470アミノ酸残基長のポリペプチド (配列番号 12)をコードする。

[0261] (実施例 6 :pCMV15— 2および pCMV15— 3の解析）

(1.内皮細胞増殖抑制活性の解析）

以下の方法によって、 pCMV15、 pCMV15— 2、および pCMV15—3の内皮細胞増殖抑制活性を解析した。

[0262] pCMV15、 pCMV15— 2、および pCMV15—3の配列を、発現ベクターである pcD NA3. 1に連結して、 pcDNA—CMV15、 pcDNA—CMV15— 2、および pcDNA— CMV15— 3を作製した。これら 3つの発現プラスミドと pCMVl 5由来のインサートを含まないプラスミドである pcDNA3. 1について、ゥシ大動脈由来内皮細胞（BAEC) を用いて、実施例 3に記載される MTSアツセィを行った。

[0263] MTSアツセィの結果を図 8に示す。 Y軸は、吸光度（OD )の値を表している。 pC

490

MV15は、明確な内皮細胞増殖抑制活性を有した。しかし、 pCMV15のさらに上流を含む PCMV15—2および pCMV15—3では、内皮細胞増殖抑制活性が見られなかった。

[0264] (2. c fosプロモーターアツセィ）

単離されたクローンの内皮細胞増殖抑制活性力 c f osプロモーターからの増殖シグナル経路を抑制することを示すために、 c fosプロモーターアツセィを行った。具体的には、 c fosプロモーター下にルシフェラーゼ遺伝子を連結した c fos— Luciと候補遺伝子の発現ベクターを 1： 1の重量比でゥシ血管内皮細胞にリポフエクシヨンによつて導入し 24— 48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。プラスミド c fos— Luci は、 c fosの 5，調節ェンハンサー領域 (一 357—— 276)を 2コピー、そして単純ヘルぺスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター（一 200— 70)、およびルシフエラーゼ遺伝子を含むプラスミドである（Arterioscler Thromb Vase Biol. 200 2 : 22 : 238— 242)。その結果を図 9に示す。図 9の Y軸は、ルシフェラーゼ活性を示す。クローン pCMV15は、 c fosプロモーターからの転写を強力に抑制した。これに対して、 pCMV15の上流配列を含む pCMV15—2および pCMV15—3においては、 c fosプロモーターの抑制活性が見られなかった。

[0265] (3. NF κ Bエレメントを介する転写活性ィ匕の抑制活性）

単離されたクローンの c fosプロモーターからの増殖シグナル経路の抑制力 c-fo sプロモーター中に含まれる _κ Βエレメントを介するものであることを実証するために、 κ Βエレメントを介する転写活性ィ匕の抑制活性をアツセィした。アツセィには、 BD Bi osciences (フランクリンレーク、 NJ)社の pNF κ Β— Lucを用いた。 pNF κ Β— Lucは、 NF κ Bシグナル伝達経路の活性化をモニタリングするためのベクターであり、ホタル（Photinus pyralis)のルシフェラーゼ遺伝子を含む。このベクターはさらに、単純へルぺスウィルスチミジンキナーゼ（HSV— TK)プロモーター由来の TAT様プロモーター）、および P に連結した 4つのタンデムに連続する NF K Bコンセン

TAL TAL

サス配列を含む。 pNF κ B— Lucと候補遺伝子の発現ベクターを 1： 1の重量比でゥシ血管内皮細胞（BAEC)にリポフエクシヨンによって導入し 24— 48時間後にルシフエラーゼ活性を測定した。その結果を、図 10に示す。図 10の Y軸は、ルシフェラーゼ活性を示す。

[0266] クローン pCMV15は、 κ Bエレメントからの転写を強力に抑制した。これに対して、 pCMVl 5の上流配列を含む pCMVl 5—2および pCMVl 5—3にお!/、ては、抑制活性は、見られなかった。この結果から、 pCMVl 5による c fosプロモーター活性の抑制は、 κ Bエレメントを介する転写活性ィ匕を抑制することによって生じると考えられる。

[0267] (4. AP— 1ェンノヽンサ一を介する転写活性ィ匕の抑制活性）単離されたクローンの c fosプロモーターからの増殖シグナル経路の抑制力 c-fo sプロモーター中に含まれる AP— 1エレメントを介するものであることを実証するために、 AP— 1エレメントを介する転写活性ィ匕の抑制活性をアツセィした。アツセィには、 BD Biosciences 社（フランクリンレーク、 NJ)の pAPl— Lucを用いた。 pAPl— Lu cは、 AP— 1、およびストレス活性ィ匕プロテインキナーゼ Zjun N末端キナーゼ（SA PK/JNK)シグナル伝達経路の誘導をモニタリングするためのベクターであり、ホタル（Photinus pyralis)のルシフェラーゼ遺伝子を含む。このベクターはさらに、単純へルぺスウィルスチミジンキナーゼ（HSV— TK)プロモーター由来の TAT様プロモーター）、および P に連結した 4つのタンデムに連続する APIェンハンサ

TAL TAL

一配列を含む。 pAPl— Lucと候補遺伝子の発現ベクターを 1： 1の重量比でゥシ血管内皮細胞（BAEC)にリポフエクシヨンによって導入し 24— 48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を、図 11に示す。図 11の Y軸は、ルシフェラーゼ活性を示す。

[0268] クローン pCMV15は、 APIェンハンサ一からの転写を強力に抑制した。これに対して、 pCMV15の上流配列を含む pCMV15— 2においては、抑制活性は、 pCMVl 5よりも低力つた。 pCMV15— 3には抑制活性が見られな力つた。

[0269] この結果から、 pCMV15および pCMV15— 2による c fosプロモーター活性の抑制は、 κ Bエレメントのみならず APIェンノヽンサ一を介する転写活性ィ匕を抑制することによっても生じると考えられる。

[0270] (実施例 7：単離したポリペプチド、ポリヌクレオチドを用いる疾患の処置）

血管新生抑制活性を有するタンパク質であるアンジォスタチンを全身投与することによって、 Lewis肺癌腫の転移を抑制することが報告されている（Cell, 1994年 10 月 21 ; 79 (2) : 315— 28)。従って、アンジォスタチンの場合と同様に、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドを投与することによって、癌の転移を抑制することができる

[0271] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきた力本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

産業上の利用可能性

血管新生活性を有する新規のペプチド、およびそのペプチドをコードする遺伝子を単離することによって、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌力なる群力選択される疾患の処置、予防、および予後のための新規の薬学的組成物が提供される

Claims

請求の範囲

[1] 以下：

力もなる群力も選択されるポリヌクレオチドであって、ここで、前記ポリヌクレオチドは、血管内皮細胞増殖抑制活性、 c f osプロモーター力の転写抑制活性、 E2Fプロモ一ターからの転写抑制活性、 APIプロモーターからの転写抑制活性、 VEGF活性抑制活性、 NF κ Bプロモーターからの転写抑制活性および血管新生抑制活性からなる群力も選択される活性を有するペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。

[2] 配列番号 1または 3に記載の塩基配列を有する、請求項 1に記載のポリヌクレオチド。

[3] 配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列をコードする、請求項 1に記載のポリヌクレォチド。

[4] 以下：

[5] 配列番号 5または 7に記載の塩基配列を有する、請求項 4に記載のポリヌクレオチド。

[6] 配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列をコードする、請求項 4に記載のポリヌクレォチド。

[7] 血管新生抑制活性を有するペプチドをコードする、請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチド。

[8] 血管内皮細胞増殖抑制活性を有するペプチドをコードする、請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチド。

[9] 請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドを含有する、血管新生抑制のための薬学的組成物。

[10] 請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドを含有する、血管内皮細胞増殖抑制のための薬学的組成物。

[11] 請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドを含有する、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌力なる群力選択される疾患の処置のための薬学的組成物。

[12] 請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドを含有する、慢性炎症、糖尿病網膜症、および癌力なる群力選択される疾患の処置のための薬学的組成物。

[13] 組織の血管新生を抑制する方法であって、以下；

( 1)血管新生を抑制する組織を提供する工程；および (2)該血管内皮細胞に請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドを含む核酸を導入する工程、

を包含する、方法。

[14] 前記血管新生の抑制は、インビボまたはインビトロで行われる、請求項 13に記載の方法。

[15] 前記組織は、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌力もなる群力も選択される疾患を含む状態にある、請求項 13に記載の方法。

[16] 血管内皮細胞増殖を抑制する方法であって、以下；

( 1 )血管内皮細胞を提供する工程；および

を包含する、方法。

[17] 請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミド。

[18] 請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子導入ベクター。

[19] 血管内皮細胞増殖を抑制する方法であって、以下；

( 1 )血管内皮細胞を提供する工程；および

[20] 請求項 1または 4に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。

[21] 以下：

[22] 配列番号 1または 3に記載の塩基配列によってコードされる、請求項 21に記載のポリペプチド。

[23] 配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列を有する、請求項 21に記載のポリペプチド

[24] 以下：

[25] 配列番号 5または 7に記載の塩基配列によってコードされる、請求項 24に記載のポリペプチド。

[26] 配列番号 6または 8に記載のアミノ酸配列を有する、請求項 24に記載のポリペプチド

[27] 血管新生抑制活性を有する、請求項 21または 24に記載のポリペプチド。

[28] 血管内皮細胞増殖抑制活性を有する、請求項 21または 24に記載のポリペプチド。

[29] 請求項 21または 24に記載のポリペプチドを含有する、血管新生抑制のための薬学的組成物。

[30] 請求項 21または 24に記載のポリペプチドを含有する、血管内皮細胞増殖抑制のための薬学的組成物。

[31] 請求項 21または 24に記載のポリペプチドを含有する、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌力なる群力選択される疾患の処置のための薬学的組成物。

[32] 請求項 21または 24に記載のポリペプチドを含有する、慢性炎症、糖尿病網膜症、および癌力なる群力選択される疾患の処置のための薬学的組成物。

[33] 組織の血管新生を抑制する方法であって、以下；

(1)血管新生する組織を提供する工程;および

(2)該血管内皮細胞に請求項 21または 24に記載のポリペプチドを含む核酸を導入する工程、

を包含する、方法。

[34] 前記血管新生抑制は、インビボまたはインビトロで行われる、請求項 33に記載の方法。

[35] 前記組織は、関節リウマチ、慢性炎症、糖尿病網膜症、粥状性動脈硬化、および癌力もなる群力も選択される疾患を含む状態にある、請求項 33に記載の方法。

[36] 血管内皮細胞増殖を抑制する方法であって、以下；

( 1 )血管内皮細胞を提供する工程；および