JP2001512325A

JP2001512325A - 改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質

Info

Publication number: JP2001512325A
Application number: JP53678898A
Authority: JP
Inventors: シュ，ホン−ジ; フ，シ−シュエ; ベネディクト，ウィリアム，エフ．; ゾウ，ユンリ
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 2001-08-21
Also published as: IL131496A0; KR20000075501A; CN1259998A; CA2281899A1; AU6657398A; EP0975750A2; WO1998037091A3; WO1998037091A2

Abstract

(57)【要約】対応する野生型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の生物学的活性に少なくとも等しい、ほとんどの場合はより高い、生物学的活性を有する改変型広域レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質を開示する。典型的な改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質は改変されたN末端領域、特に1以上の欠失および／または突然変異を含むN末端領域を有する。改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質を、特に細胞増殖の抑制が望まれる状況において、生産しかつ使用する方法も開示する。したがって、本開示は、異常な細胞増殖を特徴とする癌により例示されるがこれに限らない疾患の治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質発明の背景本発明は、1997年２月20日に出願した、同時係属中の米国仮特許出願第60/038 ,118号（この出願は、参照により放棄されることなく本明細書に含まれるものである）の優先権を主張するものである。政府は、国立衛生研究所からの助成金番号RO1-CA 67274およびRO1-EY 06195、ならびにテキサス高等教育調整委員会からの助成金番号ATP004949018に従って本発明において権利を有する。１．発明の分野本発明は、一般的に、分子および細胞生物学の分野に関する。より詳しくは、レチノブラストーマ腫瘍サプレッサーの改変に関する。本発明は、さらに、腫瘍サプレッサーまたは正常細胞増殖サプレッサーの供給が指摘されている状況における本発明の改変型レチノブラストーマ腫瘍サプレッサーの使用に関する。２．関連技術の説明癌および腫瘍は、合衆国の２番目に一般的な死亡原因であり、年間約450,000 人がこれにより死亡している。アメリカ人の３人に１人が癌にかかり、５人に１人が癌のために死亡している（1987年のScientific American Medicine，パート 12，I，1節）。癌の恐らく環境的且つ遺伝的要因のいくつかを同定することにおいては実質的な進歩がなされているが、癌死亡率についての統計は、癌および関連の疾患および障害に対する治療法の実質的な改善が必要であることを指摘するものである。いくつかの遺伝子が癌の病因に関係している。これらの遺伝子は、癌の遺伝的形態に関連して同定されており、十分に研究された多数の腫瘍細胞において同定されている。癌遺伝子の研究は、腫瘍発生のプロセスについての何らかの理解を得るのに役立った。癌遺伝子について学習しなければならないことがかなり残っているが、現在公知の癌遺伝子は腫瘍発生を理解するのに有用なモデルとして役立つ。癌遺伝子は、活性化された場合、腫瘍発生を促進する「癌遺伝子」に、損傷した場合、腫瘍発生を抑制することができない「腫瘍抑制遺伝子」に広く分類される。これらの分類は、腫瘍発生を概念化するのに有用な方法を提供するが、特定の遺伝子がその遺伝子の特定の対立遺伝子型、その調節エレメント、遺伝的背景およびそれが作用する組織環境に依存して異なる役割を果たし得ることも可能である。癌遺伝子は、それらの野生型対立遺伝子から一定の条件下で腫瘍発生を誘導することができる状態に突然変異される体細胞遺伝子である。現在、公知の癌遺伝子、推定癌遺伝子およびこれらの癌遺伝子の種々の対立遺伝子についてかなりの文献がある。例えば、癌遺伝子rasおよびmycは、一般に腫瘍形成プロセスを理解するためのモデルとみなされている。ras癌遺伝子は、細胞質タンパク質をコードすると考えられ、myc癌遺伝子は、核タンパク質をコードすると考えられる。r as癌遺伝子もmyc癌遺伝子も単独では正常細胞の腫瘍細胞への完全形質転換を誘導することはできないが、完全腫瘍発生は、通常、rasおよびmyc癌遺伝子の両方が同一細胞内に存在し、共に発現する場合に起きる（Weinberg，1989）。そのような協同作用は、いくつかのその他の研究された癌遺伝子間で観察されている。癌遺伝子腫瘍発生についての協同モデルは、正常細胞によって取り囲まれているras遺伝子を発現している細胞は完全形質転換されないという所見によって制限されなければならない。しかしながら、周囲の細胞の大部分もrasを発現している場合、ras癌遺伝子単独で十分ras発現細胞に腫瘍発生を誘導することができる。この所見は、癌遺伝子の宿主をつとめる細胞の組織環境における変化が第２のヒット(hit)とみなされ得るので、腫瘍発生についての多数のヒット論を確認するものである。代替の同様に妥当な仮説は、rasまたはmycのような癌遺伝子の活性化と協同する事象は一つのまたは複数の負の調節因子、すなわち、腫瘍抑制タンパク質の不活性化を含み得るということである（Weinberg，1989;Goodrich ら，1992a）。腫瘍抑制遺伝子は、それらの野生型対立遺伝子においては、異常細胞増殖を抑制するタンパク質を発現する遺伝子である。腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子が突然変異または欠失される場合、得られる突然変異タンパク質または腫瘍抑制タンパク質の完全欠如は、細胞増殖を正しく調節できない可能性がある。これによって、特に、細胞調節機構がすでに損なわれている場合、異常細胞増殖が生じ得る。細胞増殖の制御の欠如は、広範な種類のヒト癌の発生につながっている（Weinberg，1991）。いくつかの十分に研究されたヒト腫瘍および腫瘍細胞系は、失われた(missing)または非機能性腫瘍抑制遺伝子を有することが示されている。腫瘍抑制遺伝子および候補腫瘍抑制遺伝子としては、例えば、レチノブラストーマ（RB）遺伝子（Friendら，1986;Fungら，1987;Leeら，1987a）、野生型p53 遺伝子（Finlayら，1989;Bakerら，1990）、欠失結脳癌(deleted in colon carc inoma)（ＤＣＣ）遺伝子（Fearonら，1990a;1990b）、神経繊維腫症１型（ＮＦ −１）遺伝子（Wallaceら，1990;Viskochilら，1990;Cawthonら，1990）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ−１）遺伝子（Callら，1990;Gesslerら，1990;Pritchard-Jon esら，1990）、フォンヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）病腫瘍抑制遺伝子（Duanら，1995）、乳癌についてのマスピン(Maspin)遺伝子（Zouら，1994）、ブラッシュ−１(Brush-1)遺伝子（Schottら，1994）およびBRCA1遺伝子遺伝子（Mikiら， 1994;Futrealら，1994）、ならびに同義腫瘍サプレッサー(multiple tumor supp ressor)（ＭＴＳ）またはp16遺伝子（Serranoら，1993;Kambら，1994）が挙げられるが、これに限定されるものではない。推定腫瘍抑制遺伝子のリストは大きく、拡大しており、腫瘍抑制遺伝子の総数は50を優に超していると予想される（Kn udson，1993）。同定された最初の腫瘍抑制遺伝子は、レチノブラストーマ（RB）遺伝子であリ、これは遺伝性レチノブラストーマを引き起こす（Knudson，1971;MurphreeおよびBenedict，1984;Knudson，1985）。レチノブラストーマ（RB）遺伝子は、1980 年代中ごろにクローニングされており、最もよく研究された腫瘍抑制遺伝子の一つである。約4.7kbというRB遺伝子相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の大きさにより、遺伝子の迅速な操作が可能になり、いくつかの細胞系へのRB遺伝子の挿入に至った。RB遺伝子は、レチノブラストーマ、軟組織および骨の肉腫の大部分、ならびに乳癌、肺癌、前立腺癌および膀胱癌の約20〜40％において欠けているか、不完全であることがわかった（Leeら，WO 90/05180;Booksteinら，1991;Benedictら，1990）。クローニングされたRB遺伝子が実際に腫瘍抑制遺伝子であるという最も直接的な証拠は、RB遺伝子のクローニングされた無傷のコピーの導入によるRBマイナス腫瘍細胞における腫瘍抑制機能の回復の確認である。いくつかの報告により、異なる型のヒト癌由来のRB欠損腫瘍細胞において正常RB遺伝子を置換すると、ヌードマウスにおけるそれらの腫瘍発生活性を抑制することができるということが示されている（Huangら，1988;GoodrichおよびLee，1993;Zhouら，1994b）。研究された腫瘍細胞系は、レチノブラストーマ、骨肉腫、膀胱、前立腺、乳房および肺の癌腫などの広範な異種の型のヒト癌から誘導された。機能的な野生型全長レチノブラストーマ遺伝子(RB¹¹⁰)のRBマイナス腫瘍細胞への導入は細胞を「正常化」することが観察されたが、すでに正常RB¹¹⁰遺伝子発現（「RB⁺」）を有する腫瘍細胞がRB¹¹⁰遺伝子治療に応答することは予測されなかった。というのは、さらなるRB発現を加えることにより非RB遺伝子欠損を修正することはできないと思われたからである。このことは、実際、RB⁺骨肉腫細胞系U-2 OSの場合に関して示されており、余分なp110^RBコード遺伝子の導入により新生物性表現型は変化しなかった（Huangら，1988）。したがって、任意の型の遺伝子欠損を有する異常増殖性細胞を治療するための広域腫瘍抑制遺伝子が必要性とされている。 RB¹¹⁰ ｃＤＮＡオープンリーディングフレーム配列（McGeeら，1989）は、エキソン３のヌクレオチド355〜357に第２のフレーム内AUGコドンを含む。この第２のAUGコドンから開始されたタンパク質は、全長RBタンパク質のＮ末端の112個のアミノ酸残基が欠けており、pRB⁹⁴と呼ばれる（Xuら，1994b）。米国特許第5, 496,731号（参照により本明細書に含まれる）において、本発明者らは、外来pRB⁹⁴ を発現するRB欠損腫瘍細胞は、［³Ｈ］−チミジンのＤＮＡへの組み込みができないということにより証明したように、細胞周期を進行しないということを示した。それとは対照的に、ＤＮＡ複製を行っている腫瘍細胞の割合は、RB^-の細胞よりも外来pRB¹¹⁰（野生型pRBタンパク質）を産生する細胞のほうがほんのわずかに低かった。pRB⁹⁴発現は、試験された二つのRB⁺（正常RB対立遺伝子を有する）腫瘍細胞系、すなわち繊維肉腫細胞系HT1080および子宮頚癌細胞系HeLaのコロニー形成も有意に低下させるということがよりいっそう顕著であったが（Xuら，1994b）、追加のpRB¹¹⁰コード遺伝子を、プラスミドベクターを用いるトランスフェクション（Fungら，1993）または微小核体融合（Andersonら，1994）によって導入した場合、そのような効果は観察されなかった。しかしながら、当技術分野においては、病気、特に癌の治療におけるその使用を促進するのに必要な特性の全てを有する腫瘍抑制タンパク質が不足している。発明の概要本発明の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質は、当技術分野で記載されたものの欠点を克服するものであり、驚くべき有益な効果を有する広域腫瘍抑制タンパク質を提供するものである。本発明は、細胞増殖の抑制において、対応する野生形レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質と少なくとも同じくらい有効であり、ほとんどの場合それよりも有効である広域改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質を提供する。特定の実施態様においては、本発明は、改変されたＮ末端領域を含むレチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質を提供する。本発明は、さらに、改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質を、特に細胞増殖抑制が望まれる状況において、生産し、かつ使用する方法を提供する。したがって、本発明は、異常な細胞増殖を特徴とする癌により例示されるが、これに限らない疾患の治療方法を提供する。広域腫瘍抑制遺伝子は、異常に増殖している宿主細胞、例えば腫瘍細胞に挿入し、発現させた場合に、その細胞の異常増殖を異常増殖の原因に関係なく抑制するタンパク質をコードする遺伝子配列である。したがって、本発明は、pRB⁹⁴またはpRB⁵⁶以外の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする単離された遺伝子を含む単離されたＤＮＡセグメントであって、前記改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質がＮ末端の改変を含むものである、上記ＤＮＡセグメントを提供する。「pRB⁹⁴」および「pRB⁵⁶ 」という用語は、それぞれ、分子量94kDaおよび56kDaのレチノブラストーマタンパク質を意味するものである。当技術分野で理解されているように、pRB⁹⁴およびpRB⁵⁶レチノブラストーマタンパク質は、それぞれ、Ｎ末端から112個および 379個の連続アミノ酸が欠失されている全長野生型レチノブラストーマタンパク質の断片である。「Ｎ末端」または「Ｎ末端領域」という用語は、本明細書で用いられる場合、アミノ酸配列の最初の約40％と同程度の配列に対応するタンパク質の領域を意味するものと解釈される。したがって、これらの用語は、タンパク質のアミノ酸配列の、最初の約５％、最初の約10％、最初の約15％、最初の約20％、最初の約25 ％、最初の約30％または最初の約35％までを含むものと解釈される。しかしながら、これらの値は近似値であり、よって２％、３％、６％、７％、11％、13％、 17％、18％、22％、26％、33％、37％、38％、41％、42％などの中間値を含むものと解釈される。「改変型」という用語は、本明細書で用いられる場合、野生型タンパク質配列の欠失および／または突然変異を意味する。一定の実施態様においては、１個のまたは複数の異種アミノ酸の野生型タンパク質配列への挿入も意味するものであり得る。さらに別の局面においては、この用語は、野生型アミノ酸配列の翻訳後変化を意味するものであり得る。本発明のさらなる実施態様においては、遺伝子は、少なくとも１個のアミノ酸が欠失されている第１配列の領域を含むＮ末端領域を含む改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする。この欠失により、対応する野生型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の生物学的活性と等しいか、または一定の実施態様においてはそれもよりも大きい生物学的活性を有する改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質が産生され得る。本発明の特定の実施態様においては、遺伝子は、前記第１配列の領域から少なくとも２個のアミノ酸が欠失されている改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする。本発明のその他の実施態様においては、前記第１配列の領域から、少なくとも約５個のアミノ酸、少なくとも約10個のアミノ酸、少なくとも約25個のアミノ酸、少なくとも約50個のアミノ酸、少なくとも約75個のアミノ酸、または少なくとも約100個のアミノ酸が欠失されている。中間の欠失サイズには、限定するものではないが、３、４、６、７，８、９、11、12、13、14、15 、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34 、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、51、52、53 、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71 、72、73、74、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90 、91、92、93、94、95、96、97、98または99個のアミノ酸などが含まれるものと解釈される。本発明のその他の局面においては、遺伝子は、前記第１配列の領域から少なくとも約150個のアミノ酸、少なくとも約200個のアミノ酸、少なくとも約250個のアミノ酸、少なくとも約300個のアミノ酸または少なくとも約370個のアミノ酸が欠失されている改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする。しかしながら、101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,11 5,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,13 3,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,151,15 2,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,17 0,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,18 8,189,190,191,191,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,20 6,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,22 4,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,24 2,243,244,245,246,247,248,249,251,252、253,254,255,256,257,258,259,260,2 61,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,2 79,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,2 97,298,299,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,3 16,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,3 34,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,3 52,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,3 71,372,373,374,375,376,377または378個のアミノ酸欠失により例示されるが、これに限定されない中間サイズの欠失も提供される。その他の中間値は、本明細書の至る所に開示されている。本発明の一つの実施態様においては、遺伝子は、少なくとも１個のアミノ酸が欠失されている、少なくとも約アミノ酸１と約アミノ酸50の間にある第１配列の領域を含むＮ末端領域を含む改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする。「約アミノ酸１と約アミノ酸50の間」とは、アミノ酸１とアミノ酸 50を含むものであり、よって本明細書に記載されたその他の欠失を含むものであると解釈される。アミノ酸１は、Ｎ末端アミノ酸であり、番号はＣ末端に向かって増える。本発明のさらなる実施態様においては、第１配列の領域は、約アミノ酸51と約アミノ酸100の間、約アミノ酸101と約アミノ酸150の間、約アミノ酸151と約アミノ酸200の間、約アミノ酸201と約アミノ酸250の間または約アミノ酸251と約アミノ酸300の間にある。本発明のその他の実施態様においては、遺伝子は、第１配列の領域が、約アミノ酸１と約アミノ酸100の間、約アミノ酸51と約アミノ酸150の間、約アミノ酸10 1と約アミノ酸200の間、約アミノ酸151と約アミノ酸250の間または約アミノ酸20 1と約アミノ酸300の間にある改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする。本発明の特定の局面においては、遺伝子は、第１配列の領域が約アミノ酸１と約アミノ酸150の間にある改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする。本発明のさらなる局面においては、第１配列の領域は、約アミノ酸51と約アミノ酸200の間、約アミノ酸101と約アミノ酸250の間または約アミノ酸151と約アミノ酸300の間にある。本発明のさらなる実施態様においては、遺伝子は、第１配列の領域が約アミノ酸１と約アミノ酸200の間、約アミノ酸51と約アミノ酸250の間、約アミノ酸101 と約アミノ酸300の間、約アミノ酸１と約アミノ酸250の間、約アミノ酸51と約アミノ酸300の間、約アミノ酸１と約アミノ酸300の間または約アミノ酸１と約アミノ酸370の間にある改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする。本発明のさらに別の局面においては、改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質は、約アミノ酸２〜約アミノ酸34が第１配列の領域から欠失されている、改変型レチノブラストーマタンパク質である。これらの特定のアミノ酸の位置は、ヒト野生型レチノブラストーマタンパク質に関するものであるが、同種レチノブラストーマタンパク質の類似領域に一致するものと解釈される。本発明のさらに別の局面いおいては、約アミノ酸２〜約アミノ酸55が第１配列の領域から欠失されている。本発明のさらに別の局面いおいては、約アミノ酸２〜約アミノ酸78 が第１配列の領域から欠失されている。本発明の特定の局面においては、約アミノ酸２〜約アミノ酸97が第１配列の領域から欠失されている。本発明のさらなる局面においては、約アミノ酸２〜約アミノ酸148が第１配列の領域から欠失されている。本発明の別の実施態様においては、改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質は、約アミノ酸31〜約アミノ酸107が第１配列の領域から欠失されている改変型レチノブラストーマタンパク質である。本発明の別の実施態様においては、約アミノ酸77〜約アミノ酸107が第１配列の領域から欠失されている。本発明のさらなる実施態様においては、約アミノ酸111〜約アミノ酸181が第１配列の領域から欠失されている。本発明のさらに別の実施態様においては、約アミノ酸111 〜約アミノ酸241が第１配列の領域から欠失されている。本発明のさらに別の実施態様においては、約アミノ酸181〜約アミノ酸241が第１配列の領域から欠失されている。本発明の特定の実施態様いおいては、約アミノ酸242〜約アミノ酸300 が第１配列の領域から欠失されている。本発明の一つの局面においては、改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質のＮ末端領域は、少なくとも、少なくとも１個のアミノ酸が欠失されている第２配列の領域をさらに含む。本発明の特定の局面においては、約アミノ酸２〜約アミノ酸34、および約アミノ酸76〜約アミノ酸112が欠失されている。本発明のさらなる局面においては、約アミノ酸２〜約アミノ酸55、および約アミノ酸76〜約アミノ酸112が欠失されている。本発明の別の実施態様は、Ｎ末端の改変を含む、pRB⁹⁴以外の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする単離された遺伝子を含むＤＮＡセグメントであって、前記遺伝子は、少なくとも第１のＮ末端突然変異を含む改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードするものであり、前記改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質は、対応する野生型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の生物学的活性と比較して増大した生物学的活性を有する、上記ＤＮＡセグメントを提供する。本発明の一つの実施態様においては、遺伝子は、111位に突然変異を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする。本発明の別の実施態様においては、改変型レチノブラストーマタンパク質は、11 1位にアスパラギン酸の代わりにグリシンを含む。本発明のさらなる実施態様においては、改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質は、少なくとも第２のＮ末端突然変異を含む。本発明のさらに別の実施態様においては、遺伝子は、111位および112位に突然変異を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする。本発明のさらに別の実施態様においては、改変型レチノブラストーマタンパク質は、111位にアスパラギン酸の代わりにグリシンを含み、112位にグルタミン酸の代わりにアスパラギン酸を含む。本発明の特定の実施態様においては、遺伝子は、少なくとも１個のアミノ酸が欠失されており、少なくとも１個のアミノ酸突然変異を含むＮ末端領域を含む改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする。本発明の一つの局面においては、遺伝子は、少なくとも配列番号２の約370位〜約928位からの連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする。本発明の別の局面においては、遺伝子は、少なくとも配列番号２の約３位〜約928位からの連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする。この文脈で用いられる場合、「連続アミノ酸配列」は、少なくとも約８、約10、約12、約15、約20、約25、約50、約10 0個のアミノ酸などの全長アミノ酸配列までの連続アミノ酸配列であると解釈される。本発明のさらなる局面においては、遺伝子は、配列番号２９の連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする。本発明のさらに別の局面においては、遺伝子は、配列番号２８の７位〜2691位からの連続核酸配列を含む。本明細書においてこの文脈で用いられる場合、「連続核酸配列」は、少なくとも約８、約10、約12、約15、約17、約20、約25、約50、約100個のヌクレオチドなどの全長ヌクレオチド配列までの連続核酸配列であると解釈される。本発明のさらに別の局面においては、遺伝子は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする。本発明の特定の局面においては、遺伝子は、配列番号３０の７位〜2628位からの連続核酸配列を含む。本発明のさらなる局面においては、遺伝子は、配列番号３３の連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする。本発明の別の実施態様においては、遺伝子は、配列番号３２の７位〜2559位からの連続核酸配列を含む。本発明のさらなる実施態様においては、遺伝子は、配列番号３５の連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする。本発明のさらに別の実施態様においては、遺伝子は、配列番号３４の７位〜2502位からの連続核酸配列を含む。本発明のさらに別の実施態様においては、遺伝子は、配列番号３７の連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする。本発明の特定の実施態様においては、遺伝子は、配列番号３６の７位〜2349位からの連続核酸配列を含む。本発明のさらなる実施態様においては、遺伝子は、配列番号３９の連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする。本発明の一つの局面においては、遺伝子は、配列番号３８の７位〜2559位からの連続核酸配列を含む。本発明の別の局面においては、遺伝子は、配列番号４１の連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする。本発明のさらなる局面においては、遺伝子は、配列番号４０の７位〜2697位からの連続核酸配列を含む。本発明のさらに別の局面においては、遺伝子は、配列番号４３の連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする。本発明のさらに別の局面においては、遺伝子は、配列番号４２の７位〜25 83位からの連続核酸配列を含む。本発明の特定の局面においては、遺伝子は、配列番号４５の連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする。本発明のさらなる局面においては、遺伝子は、配列番号４４の７位〜 2397位からの連続核酸配列を含む。本発明の一つの実施態様においては、遺伝子は、配列番号４７の連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする。本発明の別の実施態様においては、遺伝子は、配列番号４６の７位〜2613位からの連続核酸配列を含む。本発明のさらなる実施態様においては、遺伝子は、配列番号４９の連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする。本発明のさらに別の実施態様においては、遺伝子は、配列番号４８の７位〜2619位からの連続核酸配列を含む。本発明のさらに別の実施態様においては、遺伝子は、配列番号５１の連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする。本発明の特定の実施態様においては、遺伝子は、配列番号５０の７位〜2790位からの連続核酸配列を含む。したがって、本発明は、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９または配列番号５１の連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマタンパク質をコードする遺伝子を提供する。本発明の一つの局面いおいては、遺伝子は、配列番号２８の７位〜2691位、配列番号３０の７位〜2628位、配列番号３２の７位〜2559位、配列番号３４の７位〜2502位、配列番号３６の７位〜2349位、配列番号３８の７位〜2559位、配列番号４０の７位〜2697位、配列番号４２の７位〜2583位、配列番号４４の７位〜2397位、配列番号４６の７位〜2613位、配列番号４８の７位〜2619位または配列番号５０の７位〜2790位からの連続核酸配列を含む。本発明の別の実施態様は、Ｎ末端の改変を含む、pRB⁹⁴またはpRB⁵⁶以外の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする単離された遺伝子を含むＤＮＡセグメントであって、プロモーターの制御下で機能的に位置付けられている、上記ＤＮＡセグメントを提供する。本発明の一つの実施態様においては、このＤＮＡセグメントは、組換えプロモーターの制御下で機能的に位置付けられている。本発明の別の実施態様においては、ＤＮＡセグメントは、組換えベクターとしてさらに特定される。本発明の特定の局面においては、組換えベクターは、アデノウイルスベクターである。別の局面においては、組換えベクターは、レトロウイルスベクターである。本発明のさらなる実施態様においては、ＤＮＡセグメントは、テトラサイクリン応答発現系の構成成分としてさらに特定される。本発明のさらに別の実施態様においては、ＤＮＡセグメントは、テトラサイクリンオペレーター核酸配列を含むプロモーターの下流に機能的に位置付けられており、テトラサイクリン応答発現系は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質に機能的に結合された転写トランス活性化ドメインを含む融合タンパク質をコードする単離された遺伝子を含む第２配列の領域をさらに含み、第２配列の領域は、最小プロモーターの下流に機能的に位置付けられている。本発明のさらに別の実施態様においては、テトラサイクリン応答発現系は、アデノウイルスベクター内に含まれる。本発明のさらに別の実施態様においては、アデノウイルスベクターは、組換えアデノウイルス内に含まれる。また、本発明は、Ｎ末端の改変を含む、pRB⁹⁴以外の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする単離された遺伝子を含むＤＮＡセグメントであって、宿主細胞内に含まれるものである上記ＤＮＡセグメントも提供する。本発明の一つの実施態様においては、宿主細胞は原核細胞である、本発明の別の実施態様においては、宿主細胞は真核細胞である。本発明のさらなる実施態様においては、宿主細胞はヒト細胞である。本発明のさらに別の実施態様においては、宿主細胞は腫瘍細胞である。本発明のさらに別の実施態様においては、宿主細胞は動物内に含まれる。本発明の特定の実施態様においては、動物はヒト被験者である。本発明の別の実施態様は、Ｎ末端の改変を含む、pRB⁹⁴以外の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする単離された遺伝子を含むＤＮＡセグメントであって、製薬上許容される賦形剤中に分散されている上記ＤＮＡセグメントを提供する。本発明のさらに別の実施態様は、Ｎ末端の改変を含む、pRB⁹⁴以外の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする単離された遺伝子を含む単離されたＤＮＡセグメントであって、前記改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質が、少なくとも１個のアミノ酸が欠失されている少なくとも第１配列の領域を含むＮ末端領域を含み、該改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質が対応する野生型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の生物学的活性に少なくともほぼ等しい生物学的活性を有することを特徴とするか；または前記改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質が少なくとも一つの突然変異を含む第ｌ配列の領域を含むＮ末端を含み、該改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質が対応する野生型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の生物学的活性と比較して増大した生物学的活性を有することを特徴とする、上記ＤＮＡセグメントを提供する。本発明の一定の局面においては、上記のＤＮＡセグメントは、例えば宿主細胞における、改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の発現に使用することが考えられている。その他の局面においては、ＤＮＡセグメントは、例えばヒト患者における、細胞増殖の抑制、または細胞増殖の抑制もしくは癌の治療のための薬剤の調製に使用することが考えられている。したがって、改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の調製、細胞増殖の抑制、および細胞増殖の抑制または癌の治療のための薬剤の調製における本発明のＤＮＡセグメントの使用が提供される。一定の用途においては、薬剤は、ヒト患者に投与されるものであり、または非経口投与用に処方される。本発明は、さらに、Ｎ末端の改変を含む、pRB⁹⁴以外の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質を提供する。また、本発明は、Ｎ末端の改変を含む、pRB⁹⁴以外の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする単離された遺伝子を含むＤＮＡセグメントを含有する組換え宿主細胞も提供する。本発明の一つの局面においては、宿主細胞は原核細胞である。本発明の別の局面においては、宿主細胞はE.coliである。本発明のさらなる局面においては、宿主細胞は真核宿主細胞である。本発明のさらに別の局面においては、宿主細胞は腫瘍細胞である。本発明のさらに別の局面においては、ＤＮＡセグメントは組換えベクターによって細胞に導入される。本発明は、さらに、Ｎ末端の改変を含む、pRB⁹⁴以外の第１の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の有効抑制量に細胞を接触させることを含んでなる、細胞増殖の抑制方法を提供する。本発明の一つの実施態様においては、第１の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質は、アミノ酸111〜241が欠失されている改変型レチノブラストーマタンパク質を含む。本発明の別の実施態様においては、第１の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質は、111位および112位に突然変異を含む改変型レチノブラストーマタンパク質を含む。本発明のさらなる実施態様においては、第１の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質は、組換え宿主細胞において改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを発現させ、該細胞によって発現された改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質を回収することによって調製される。本発明のさらに別の実施態様においては、細胞内で第１の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質を発現するＤＮＡセグメントを細胞に供給することにより、第１の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質に細胞を接触させる。本発明のさらに別の実施態様においては、細胞内で第１の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質を発現するテトラサイクリン応答発現ベクター系を有する細胞が提供される。本発明の特定の実施態様においては、ベクター系はアデノウイルスベクター系である。本発明の別の局面は、Ｎ末端の改変を含む、pRB⁹⁴以外の第１の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の有効抑制量に腫瘍細胞を接触させることを含んでなる、細胞増殖の抑制方法を提供する。本発明の一つの局面においては、細胞は動物内にあり、第１の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質、または改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子は製薬上許容されるビヒクルで前記動物に投与される。本明細書で用いられる場合、「遺伝子」という用語は、タンパク質のコード領域を含む単離されたＤＮＡセグメント、またはその一部と定義される。したがって、「遺伝子」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質をコードするＲＮＡを含む。本発明の別の局面においては、動物はヒト被験者である。本発明のさらなる局面においては、細胞を第２の腫瘍抑制タンパク質にさらに接触させる。本発明のさらに別の局面においては、細胞を改変型レチノブラストーマタンパク質および野生型レチノブラストーマp53またはその他の腫瘍抑制タンパク質に接触させる本発明は、さらに、細胞内で細胞増殖を抑制するのに有効な組合せ量のレチノブラストーマタンパク質およびp53タンパク質に細胞を接触させることを含んでなる、細胞増殖の抑制方法を提供する。また、本発明は、Ｎ末端の改変を含む、pRB⁹⁴以外の第１の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の生物学的に有効な抑制量を含有する医薬として許容される組成物を、癌にかかった動物に投与することを含んでなる、癌の治療方法も提供する。「癌」または「腫瘍」という用語は、抑制のない(unchecked)異常な細胞増殖を示す細胞が特徴的な無数の疾患を含む、臨床上説明的な用語である。「腫瘍」という用語は、組織に対して用いられる場合、一般的に何らかの異常な組織増殖、すなわち過剰且つ異常な細胞増殖を意味するものである。腫瘍は「陽性」であってその最初の病巣から広がることが不可能であり得るものであり、または「悪性」であってその解剖学的部位を超えて宿主体全体のその他の領域に広がることが可能であり得るものである。「癌」という用語は、悪性腫瘍またはそれから生じる病気の状態を記載するのに一般的に用いられている古い用語である。一方、新生物としての異常増殖、および悪性新生物としての悪性異常増殖を意味する。増殖が悪性に分類されるか陽性に分類されるかに関係無く、腫瘍または癌細胞の過剰または異常な細胞増殖の原因は完全に明らかであるわけではない。それにもかかわらず、異常な細胞増殖は、細胞の増殖および分裂を制御する機構の１以上の故障の結果であるという説得力のある証拠がある。また、細胞の増殖および分裂を制御する機構が、細胞の増殖、有糸分裂および分化の遺伝子および組織介在調節を含むということも現在考えられている。これらの機構は、細胞核、細胞質、細胞膜および各細胞の組織特異的環境で作用すると考えられる。正常な状態から過剰または異常な細胞増殖の状態への細胞の形質転換過程は、腫瘍発生と呼ばれる。腫瘍発生は、通常、正常な細胞の状態から、いくつかの場合には完全な悪性への多段進行であることが観察されている。したがって、細胞調節機構における多数の「ヒット」が完全悪性を発生させるのに必要であると考えられる。よって、大部分の場合、過剰増殖についての単独の原因はないが、これらの障害は一連の累積的な事象の最終結果であると考えられる。全身に抑制されずに急速に広がる能力を有する悪性腫瘍または癌は最も恐ろしく、通常最も致命的な型の腫瘍であるが、いわゆる陽性の腫瘍または増殖でさえその不適当な増殖によって重大な病的状態および死亡率を生じさせ得る。陽性腫瘍は、表面上の過敏な領域における不適当な増殖により、または中枢もしくは末梢神経組織、血管およびその他の重大な解剖学的構造に圧力をかけることによリ、重大な損傷を引き起こし、美観を損なわせ得る。図面の簡単な説明下記の図面は、本明細書の一部を構成するものであり、本発明のある一定の局面をさらに説明するために含まれるものである。本明細書に記載した特定の実施態様についての詳細な説明とともにこれらの図面の１以上を参照することにより、本発明はよりいっそう理解され得るものである。図１：改変型hCMVプロモーターの相対活性。5637膀胱癌細胞（レーン１〜５）およびSaos2骨癌細胞（レーン６〜１０）は、CAT遺伝子発現が種々の改変型（mh CMVp3、レーン２および７；mhCMVp2、レーン３および８；mhCMVpl、レーン４および９）または全長hCMVプロモーター（レーン５および１０）によって誘導されるレポータープラスミドでトランスフェクトされた。％CAT活性を縦軸に示す。全長hCMVプロモーターを有するプラスミドでトランスフェクトした細胞のCAT活性（レーン５および１０）は、100パーセントと規定される。図２：改変型mCMVp-tTAカセットからのtTAの発現は、5637細胞増殖に鎮圧効果を示さない。細胞をクリスタルバイオレットで染色し、OD₅₅₀を測定する方法を、相対細胞数の定量に用いた（OD₅₅₀は縦軸に示した；Gilliesら，1986）。テトラサイクリンを含む増殖親細胞（▲）およびテトラサイクリンを含まない増殖親細胞（□）、ならびにテトラサイクリンを含むmCMVp-tTAトランスフェクト細胞（◆）およびテトラサイクリンを含まないmCMVp-tTAトランスフェクト細胞（○ ）を示す。トランスフェクション後の日数を横軸に示す。図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃ：腫瘍細胞増殖におけるテトラサイクリンで調節可能なpRB発現の効果（OD₅₅₀：縦軸）。図３Ａ：RB再形成骨肉腫細胞系由来の代表的な長期クローン（Saos-2、クローン11）。図３Ｂ：RB再形成乳癌細胞系由来の代表的な長期クローン（MDA-MB-468、クローン19-4）。図３Ｃ：RB再形成膀胱癌細胞系由来の代表的な長期クローン（5637、クローン34-6）。細胞を0.5μg/m lのＴｃ存在下（□）、およびＴｃの不存在下（○）で増殖させた。pRB発現の１〜２日後に停止した腫瘍細胞の細胞増殖を、Ｔｃを含まない培地中で刺激した（日数は横軸に示す）。15％血清（Saos-2）、10％血清＋２μg/mlフィトヘマグルチニン（PHA；MDA-468）または10％血清＋４μg/mlコンカナバリンＡ（ConA；56 37）を含む新鮮培地による刺激の４日後（矢印）では増殖停止は不可逆的であった。図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃ：軟寒天コロニー形成におけるテトラサイクリンで調節可能なpRB発現の効果。図４Ａ：３つの別個のSaos2骨肉腫細胞系クローン (RB110 C14、レーン２；RB110 C111、レーン３；RB110 C113、レーン４）およびSaos2親株（レーン１）についてのコロニー形成の割合（縦軸）。図４Ｂ：２つの別個のMDA-MB-468乳癌細胞系クローン（Rb110 C119-4、レーン２；Rb110 C1 20-1、レーン３）およびMDA-MB-468親株（レーン１）についてのコロニー形成の割合（縦軸）。図４Ｃ：２つの別個の5637膀胱癌細胞系クローン（Rb110 C134-6 、レーン２；Rb110 C136-9、レーン３）および5637親株（レーン１）についてのコロニー形成の割合（縦軸）。テトラサイクリンで調節可能なpRB発現を有する腫瘍細胞の軟寒天コロニー形成は、テトラサイクリンを含まない培地におけるpR Bの誘導によって完全に排除された。テトラサイクリンの存在下（白いバー）および不存在下（ハッチングしたバー）のコロニー形成を示す。図５：³Ｈ−チミジン組み込みアッセイを用いた、Ｔｃを含まない培地中での代表的なＴｃで調節可能なSaos-2細胞クローンにおけるpRB⁹⁴およびpRB¹¹⁰発現およびＤＮＡ合成におけるその効果の経時分析。腫瘍細胞のチミジン組み込みの失敗によって測定されるようなＤＮＡ合成の欠如は、増殖停止を示すものである。非同調親Saos-2細胞集団（●）は一様なＤＮＡ合成を維持し、代表的なpRB¹¹⁰ 再形成（■）およびpRB⁹⁴再形成（▲）Saos-2クローンが示される。³Ｈ−標識細胞の割合を縦軸に示し、テトラサイクリンの除去後の時間を横軸に示す。具体的な態様の説明Ａ．腫瘍抑制タンパク質１．レチノブラストーマ単離されたRB cDNAクローンの研究によると、RB遺伝子の推定産物は928アミノ酸で、推定分子量は106kDaである(Leeら、1987a;1987b)。RB遺伝子の推定された発現産物に相当する天然の因子は、見かけ上の相対的分子量(M_r)が105から114kD aの核リンタンパク質であると同定されている(Leeら、1987b;Xuら、1989b、Yoko taら、1988、Whyteら、1988)。文献では、一般的に、RB遺伝子によってコードされているタンパク質をp110^RBと呼んでいる。SDS-PAGEでは、正常なヒト細胞は、 110kDのM_rをもつ低位のシャープなバンドと、このバンドの上の、M_rが110kDから 116kDの範囲にある、より幅の広い、多様な領域からなるRBタンパク質のパターンを示す。110kDのバンドは十分にリン酸化されていないＲＢタンパク質であり、より幅広い領域はリン酸化されたRBタンパク質を示している。分子量の不均一さは、リン酸化の程度がさまざまなことに起因する(Xu ら、1989b)。何年にもわたり広範に精査したところ、RB遺伝子の生物学的機能が分かり始めている(CooperとWhyte、1989、Hamelら、1993、Horowitz、1993、Rileyら、1994 、Wangら、1994、Weinberg、1995で概説されている）。RBタンパク質は、細胞周期中、リン酸化において周期的な変化を示す。G1期の間は、ほとんどのRBタンパク質はリン酸化されていないが、Ｓ期とＧ２期には、ほとんど（多分、すべて）のRB分子がリン酸化される(Xuら、1989b、DeCaprioら、1989、Buchkovichら、19 89、Chenら、1989、Miharaら、1989)。確認されているpRB経路の要素には、E2F 転写因子が含まれるが、これらの因子は、細胞周期を通じて細胞の増殖に関与する多数の細胞遺伝子の転写調節に関与している(Nevins、1992、La Thangue、199 4)。pRBは、G1期の一定のサイクリンとも相互作用する(Koffら、1992、Resnitzk yとReed、1995、Gengら、1996)。したがって、RB遺伝子は、細胞の増殖、休止および分化を支配する、細胞周期のG1期の間の主要な決定に関係する細胞増殖制御において、明らかに決定的な役割を演じている(Weinberg、1995)。さらに、十分にリン酸化されていないRBタンパク質だけが、SV40のラージＴ抗原に結合する。ラージＴ抗原が結合するRBタンパク質が、ラージＴ抗原の増殖促進効果にとって重要である可能性が高いとしたら、このことは、十分にリン酸化されていないRB タンパク質がRBタンパク質の活性型であり、Ｓ期とG2期のリン酸化されたRBタンパク質は不活性であることを示唆している(Ludlowら、1989)。対数増殖している正常な線維芽細胞と、G1期で分裂停止している線維芽細胞とでは、不完全リン酸化型とリン酸化型のpRBの比率に大きな違いがあることが報告された。G1分裂停止細胞において、より多くの不完全リン酸化pRBが観察され、リン酸化型と不完全リン酸化型RBタンパク質の比率の変化が、細胞周期の変動に関係していることを示していた(Xuら、1989b)。その後に発表された４つの論文では、細胞周期依存的なRBタンパク質のリン酸化について詳細に説明されている(DeCaprioら、1989、Buchkovichら、1989、Chenら、1989、Miharaら、1989)。今では、細胞周期制御においてRB遺伝子の産物が重要な役割をもつことが広く認められている。細胞増殖は、DNA合成の開始、および、細胞周期のG1期における、その他の重要な過程に関与する遺伝子の転写活性化に依存する。パーディー(Pardee)によって示されたように、血清マイトジェン依存状態から血清マイトジェン非依存状態への細胞の遷移は、S期が開始する数時間前の明確な時点、すなわちR(臨界)点によって区分される(Pardee、1989)。R点を通過することによって、細胞はM期までの細胞周期の残りを完了させようとすることになる。このように、細胞周期のG1 中期とG1後期の間のR点は、細胞の生活において、G1/S境界と同様に重要な変化を示している。 pRBのリン酸化状態は、細胞周期のＲ点における変化に近接した時点、また、おそらく同時に、簡単に区別できるような変化を遂げる(Weinberg、1995)。G1中期の間、検出されるpRB分子種は不完全リン酸化型のだけである。細胞の細胞周期が進行して行くうちに、pRB含量は次第に増加する。しかし、G1中期以後に合成されるpRBの大部分は過リン酸化されている。換言すれば、pRBの過リン酸化は、G1/S境界に先立つG1後期に起きる(Xuら、1991a、Mittnachtら、1994)。pRBは、細胞周期の残期を通じてこの過リン酸化状態を維持し、M期から初期G1に変化するときにだけ脱リン酸化されることになる(Ludlowら、1990、Xuら、1991a、Mi ttnachtら、1994)。不完全リン酸化型のpRBは、転写因子E2Fと複合体を形成するか、またはE2F部位と直接相互作用することができ、転写調節においてE2F部位を正の因子から負の因子に変換する。E2F部位は、c-myc、B-myb、cdc2、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、チミジンキナーゼ、ならびにRB遺伝子およびE2F-1遺伝子そのものなど、細胞が細胞周期を通じて増殖するのに関与するさまざまな細胞遺伝子のプロモーター中に存在する(Chellappanら、1991、Nevinsら、1992、Weintraubら、1992、La Thangue、1994、Shanら、1994、Sardetら、1995、Shanら、1996)。過リン酸化されたpRBは、E2Fと相互作用することができなくなるようなので、細胞増殖に対するpRBの阻害機能は、過リン酸化によって失われうる。 pRBのタイミングを調節することで、魅力的な機能モデルがもたらされた(Wein berg、1995)。このモデルは、pRBがR点を保護していることを示唆している。pRB は、その増殖阻害効果を、G1期の最初の３分の２で発揮する。G1初期と中期を通って進んできた細胞は、Ｒ点関門に突き当たる。残りの細胞周期に進んでゆく条件が整っていれば、pRBはリン酸化され、機能的に不活性化されて、それが関門を開くようにさせ、細胞がG1後期に進んで行くことを可能にする。さまざまな理由から正常なpRB機能を欠く細胞は、自由にG1後期に入って行くはずである。pRB なしでは、サイクリンＤ、サイクリンＥ、およびこれらに対応するサイクリン依存型キナーゼ(CDKs)(katoら、1993、Ewenら、1993)などの、pRBのリン酸化を調節する細胞周期時計の上流要素は、R点関門を通過させるかどうかの決定における影響力の大部分を失う。まとめると、pRBは、細胞周期時計にＲ点通過と同時になされる主要な決定に関与している、細胞増殖周期の重要な時期を通って細胞を増殖させる数多くの遺伝子の発現を調節させている。pRBの機能喪失は、細胞からこの時計を奪い、したがって、細胞増殖にブレーキをかける重要なしくみを奪うことになる。 RB遺伝子のさまざまな突然変異が知られているが、それらは一般的に不活性である。RBの変異はレチノブラストーマの実質的にすべての場合に見られ、さらに、ＲＢ遺伝子産物は過リン酸化、およびウイルス性癌遺伝子様細胞タンパク質の結合によって不活性化される可能性がある。RB遺伝子は、その遺伝子内の欠失または変異が子供の眼の稀な腫瘍であるレチノブラストーマの原因となるため、当初このように名前をつけられたが、pRBの機能の喪失はレチノブラストーマの原因に関連するだけでなく、多くの一般的な人間の癌の進行にも関連している。さらに、RBタンパク質の状態が、尿路上皮癌、非小細胞肺癌、および、おそらく別の型のヒト新生物においても診断用マーカーとなる可能性があるということを示唆する証拠が増えている(Xu、1995)。さらに、革命的な抗原捕捉技術、および利用可能な特異的抗pRB抗体によって、最近では免疫組織学が、通常の処理を施した病理検体におけるpRBの不活性化を検出するための、非常に感度が高く、信頼できる方法になっている(Xu、1995) 。免疫組織学的解析で測定すると、pRB発現の変化は、ヒトの悪性疾患の仲間における予後の悪さを表していると思われる。機能的なpRBの喪失が、高進性成人柔組織肉腫(high-grade adult soft tissue sarcoma)における統計的に重要な負の予後因子であることが最初に報告された(Canceら、1990)。その後、２つの別々の研究が同時に行われ、pRB発現の変化が、膀胱の遷移性細胞癌をもつ患者における予後因子であるとの結論が出された(Cordon-Cardoら、1992、Logothetisら、1992)。肺癌患者については初期の試験的研究も有望なものであり、RBおよびp53タンパク質の状態の変化が、非小細胞性肺癌の初期段階における協働的な予後因子であるかもしれないことを示していた(Xuら、1994a)。なお、末梢血白血球細胞中のpRBタンパク質レベルが低いか、ゼロの急性骨髄性白血病患者については、生存パターンが非常に悪いことも報告されている(Kornblauら、1994)。ヒトの癌におけるpRB状態と患者の臨床結果との関連性を調べるためにこれまでに行われた研究はすべて遡及的なもので、各コホートにおける症例が非常に少なかったため、統計計算を行うのに適当なサンプルサイズをもつ明確な遡及的および予測的な研究は、いまだに、pRB機能の喪失が臨床現場における予後因子と考えてよいか否かを決定する途上にある。クローニングされたRB遺伝子が、実際に腫瘍抑制遺伝子であることの最も直接的な証拠は、癌細胞の中に、クローニングされた完全な遺伝子コピーを導入することによって、腫瘍抑制機能が観察されることから得られる。数多くの報告は、非同一型のヒト癌のRB欠損腫瘍細胞中で、正常なRB遺伝子に置き換えることによって、ヌードマウスにおける腫瘍形成活性が抑制できたことを示している(Huang ら、1988、GoodrichとLee、1993、Zhouら、1994b)。研究された腫瘍細胞系は、レチノブラストーマ、骨肉腫、膀胱癌、前立腺癌、乳癌および肺癌など、広く異なるヒトの癌型に由来していた（表２）。注意すべきは、文献では、RB欠損腫瘍細胞におけるRB置換による細胞増殖の阻害と腫瘍抑制とを区別する傾向があるという点である(Takahashiら、1991、Chen ら、1992、Goodrichら、1992b、Zhouら、1994b)。いくつかの初期の研究で述べられているところによると、野生型pRBを発現するレトロウイルスまたはプラスミドによる一過的な形質導入の後、RB欠損のレチノブラストーマと骨肉腫の培養細胞は、細胞の拡張、老化表現型および増殖率の低下など、顕著な変化を示した(Huangら、1988、Templetonら、1991)。その後、RB再構築腫瘍細胞の長期的に安定なクローンで、親クローンまたはRB^-復帰変異体クローンとちょうど同じ速さで増殖するクローンを分離できることが分かった。しかし、得られたRB⁺ クローンの大部分は、ヌードマウスにおいては非腫瘍形成性であるか、または腫瘍形成性が有意に低下していた。RB置換による培養腫瘍細胞の増殖阻害から、ヌードマウスにおける腫瘍形成性の抑制が解離するメカニズムは明らかではない。ヌードマウスで腫瘍形成アッセイを行うと、RB置換によって細胞に提示され供給されるさまざまな生理学的増殖阻害シグナルに対する感受性が回復する可能性があることは確かである。通常の培養条件下では、このような外生的な増殖阻害因子がないため、迅速な細胞増殖がもたらされるのであろう(Chenら、1992)。 RB媒介腫瘍抑制の分子的メカニズムは不明なままであるが、野生型pRBの再発現によって、インビボでRB^-細胞の腫瘍形成が抑制されたことは、RB遺伝子がヒトの癌に対する治療目標となる可能性があることを示唆している。さらに、最近の報告では、RBは、腫瘍細胞の免疫原性(Luら、1994、Luら、1996)、抗脈管形成 (Dawsonら、1995)、および腫瘍侵襲性(Liら、1996)の誘発に関与することが示唆され、新しいRB遺伝子治療をより一層魅力的なものにしている。これについては、最近、前臨床実験において、野生型レチノブラストーマタンパク質、またはＮ末端側が欠失したレチノブラストーマタンパク質を発現する組換えアデノウイルスベクターによって、ヌードマウスで作出された異種移植性腫瘍を治療すると、治療した腫瘍の退縮がもたらされることが示された(Xuら、1996)。さらに、構成的に活性型のpRBタンパク質が、ラットの再狭窄動脈モデルで、バルーン血管形成後の血管増殖障害を阻害するかが調べられている(Changら、1995)。インフレームの一番目のAUGコドンから開始するRBタンパク質を発現するRB遺伝子も、本明細書では、完全なRB遺伝子であるRB¹¹⁰遺伝子またはp110^RBコーディング遺伝子と呼ばれている。さまざまな抗RB抗体と免疫反応する、起源未知の低分子量（<100kD、９８kDまたは98-104kD)のバンドを、免疫沈殿とウエスタンブロットにおいて検出することができる(Xuら、1991、Furukawaら、1990、 Steinら、1990)。 RB¹¹⁰ cDNAのオープンリーディングフレームの配列(McGeeら、1989)は、355位から357位のヌクレオチドにある、第３エクソン内の２番目のインフレームAUGコドンを含んでいる。２番目のAUGコドンから始まる推定RBタンパク質は98kDであるか、またはp110^RBタンパク質よりも12kD小さい。低分子量の方のバンドは、RB mRNAの２番目のAUGコドンから翻訳された不完全リン酸化型(98kD)およびリン酸化型(98-104kD)のRBタンパク質であり(Xuら、1989b)、これは後に確証された(Xu ら、米国特許第5,496,731号)。このタンパク質は、p94^RBタンパク質と呼ばれている。機能的なＲＢ¹¹⁰遺伝子をＲＢマイナス腫瘍細胞の中に導入すると、細胞を「正常化させる」可能性が高いことが主張されている。もちろん、正常なRB¹¹⁰遺伝子発現（「RB⁺」）をすでにもつ腫瘍細胞がRB¹¹⁰遺伝子治療に応答するとは思われない。なぜなら、さらにRB発現を加えても、非RB性の遺伝子欠損を補完することはできないと考えられるからである。実際、骨肉腫細胞系のU-2 OSなど、正常なp110^RBを発現するRB⁺腫瘍細胞系の場合には、余計なp110^RBをコードする遺伝子を導入しても、そのような腫瘍系の新生物を形成する表現型を変えることはなかった(Huangら、1988)。報告されている唯一の例外として、p110^RBをコードするベクターを、RBまたはその他の遺伝子欠損が知られていない正常なヒト線維芽細胞WS1に導入したところ、細胞増殖が停止する結果となった(Fungら、WO91/15580,1991)。しかし、これらの発見は、宿主に対して増殖促進効果をもつことがよく知られているSV40ラージＴ抗原を産生するプラスミドppVUO-Neoが不適切に用いられて、トランスフェクトされたWS1線維芽細胞の細胞増殖に対するRB110発現の効果が比較されたために誤って解釈されたものと考えられる(Fungら、WO91/15580,1991)。この見解は、野生型のRB¹¹⁰遺伝子による治療ではRB⁺腫瘍細胞を「改善することができない」と明確に特徴づけている広範な文献によって確認されている。さらに、WS1 細胞系そのものは、一般的に培養液中で制限的な分裂能をもつ非腫瘍形成性のヒト二倍体線維芽細胞系と認められていることは注目に値する。したがって、WO91 /15580,1991は、単にRB¹¹⁰遺伝子によるRB⁺型腫瘍を効果的に治療する方法を提供していないだけである。このように、あらゆる遺伝子欠損をもつ異常増殖細胞を治療するための、広いスペクトルをもつ腫瘍抑制遺伝子に対する需要が残っている。２．ｐ５３ヒトの癌においては、p53遺伝子の体細胞突然変異が最も頻繁に変異する遺伝子であるといわれている(Weinberg、1991)。正常または野生型のp53遺伝子は、損傷を受けると細胞の形質転換が有利になるという、細胞増殖の負の調節因子である(Weinberg、1991)。RBタンパク質について注記したように、p53の発現産物は核の中に見られ、そこで、p110^RBと平行に、または協同して作用する可能性がある。このことは、例えばp53タンパク質もp110^RBタンパク質も、SV40、アデノウイルスおよびヒトパピローマウイルスの癌タンパク質による結合または破壊の標的であるなど、多くの観察によって示唆されている。p53が欠失した腫瘍細胞系を野生型p53ベクターで治療して、腫瘍形成性を低減させることに成功している(Bakerら、1990)。しかし、p53とRB¹¹⁰のいずれかをこれらの遺伝子座に損傷のない細胞に導入しても、細胞増殖に影響を与えない(Marshall、1991、Bakerら、1990、Huangら、1988)。このような実験は、腫瘍抑制遺伝子による細胞増殖抑制に対する細胞の感受性が細胞の中で起きている遺伝子の変化に依存していることを示している。p53の腫瘍抑制または遺伝子座における変化が、ras癌遺伝子の突然変異による活性化の後に見られるような一定の癌で観察されていることから、このような依存性はさらに複雑なものになっている(Marshall、1991;Fearonら、1990a)。したがって、異常な細胞増殖の原因となる各突然変異遺伝子を特異的に同定することに依存しない、広いスペクトルをもつ腫瘍抑制遺伝子に対する需要が残っている。３．１型神経線維腫１型神経線維腫ないしフォンレックリングハウゼン神経線維腫は、突然変異対立遺伝子の素因を受け継ぐか、または新たな生殖系列の突然変異によって創出された対立遺伝子によって起こる(Marshall、1991)。１型神経線維腫の遺伝子は NF1遺伝子と呼ばれるが、約10^-4の突然変異率を示す比較的大きな遺伝子座である。NF1遺伝子の欠損は、皮膚のカフェオレ様の斑点から神経線維腫に至る範囲の、ならびに末梢神経から神経鞘腫および神経線維肉腫に至る範囲の臨床的な症状を引き起こす。NF1遺伝子は、ras癌原遺伝子産物と相互作用する３つのタンパク質と構造的に類似した約2485アミノ酸からなるタンパク質をコードしている(W einberg、1991)。例えば、NF1のアミノ酸配列は、p21 rasに関するGTPase活性化タンパク質であるras GAPの触媒ドメインと配列相同性を示す(Marshall、1991) 。細胞周期制御におけるNF1の役割はまだ完全には解明されていない複雑なもののようである。例えば、ＮＦ１は、酵母において癌遺伝子によって活性化された p21 rasの抑制因子であるとの仮説がある(Ballesterら、1990を引用しているMar shall、1990)。他方で、利用可能なデータによって、NF1が相互作用するために別の経路がある可能性が示唆されている(Marshall、1990、Weinberg、1991)。現在のところ、NF1遺伝子座の大きさと複雑さのせいで、野生型のNF1遺伝子を用いてNF1細胞を処理しようという計画は立てられていない。したがって、NF1、およびその他の型の癌または腫瘍を治療することのできる、スペクトルの広い腫瘍抑制遺伝子があることは非常に望ましい。４．ＤＣＣ結腸鏡検査によって詳しく調べることによって、結腸癌の腫瘍形成における複数の段階が容易にモニターされる。結腸鏡検査を、包み込まれた組織の生検と組み合わせることによって、悪性腫瘍という結果をもたらす多数の遺伝的な変性経路を明らかにしてきた。よく研究されている経路の一つは、細胞の60%が突然変異を起こして活性化されたK-ras対立遺伝子をもつ大きなポリープから始まる。これらの腫瘍の大部分は、次に、結腸癌における欠失遺伝子(DCC)と呼ばれる遺伝子の不活性化変異に進行し、その後p53腫瘍抑制遺伝子の不活性化が起きる。 DCC遺伝子は、レセプターと考えられる190kDの膜通過リンタンパク質(Weinber g、1991)をコードする、約100万塩基対よりも長い遺伝子であり、レセプターが欠失すると、その影響を受けた細胞の増殖を有利にする。DCCが、神経細胞接着分子に部分的な配列相同性をもつことも注目されているが(Marshall、1 991)、これは、細胞対細胞の相互作用の調節におけるDCC原遺伝子の役割を示唆しているのかもしれない。これで分かるように、DCC遺伝子のサイズが大きく複雑であることは、K-ras、p53、および結腸癌における腫瘍形成に関与する可能性のあるその他の遺伝子の複雑さとともに、スペクトルの広い腫瘍抑制遺伝子と、 DCC遺伝子操作にも結腸癌細胞中のその他の特定の損傷遺伝子の同定にも依存しない、結腸癌細胞を治療するための方法とが必要であることを示している。５．その他の腫瘍抑制タンパク質本発明の腫瘍抑制遺伝子と組み合わせて用いることが考えられている、さらに別の腫瘍抑制遺伝子と腫瘍抑制遺伝子候補の例には、ウィルムス腫瘍(WT-1)遺伝子(Callら、1990、Gesslerら、1990、Pritchard-Jonesら、1990)、フォンヒッペル−リンダウ(VHL)病腫瘍抑制遺伝子(Duanら、1995)、乳癌のMaspin遺伝子(Zou ら、1994)、Brush-1(Schottら、1994)、およびBRCA1遺伝子(Mikiら、1994、Futr ealら、1994)、ならびに複合抑制因子(MTS)またはp16遺伝子(Serranoら、1993、 Kambら、1994)などがあるが、これらに限定はされない。Ｂ．ウイルスベクター感染によるDNAの輸送本発明の一定の態様において、腫瘍抑制遺伝子は、細胞のゲノムの中に安定的に組み込むことができる。さらに別の態様において、この遺伝子を、分離した染色体外のDNAセグメントとして安定的に維持することができる。このような核酸のセグメントまたは「エピソーム」は、宿主の細胞周期とは独立して、またはそれに同調して、維持または複製するのに十分な配列をコードしている。どのようにして腫瘍抑制遺伝子が細胞に輸送され、細胞内のどこで、用いられる発現ベクターの種類に応じて核酸が維持されるのであろうか。１．アデノウイルスベクター本発明で使用するのに好ましいのは、アデノウイルスベクターであり、特に、テトラサイクリンで制御されるアデノウイルスベクターである。これらのベクターを用いて、レチノブラストーマ遺伝子およびp53遺伝子などの腫瘍抑制遺伝子、腫瘍壊死因子α、インターフェロン遺伝子ファミリー、およびインターロイキン遺伝子ファミリーなどのサイトカイン遺伝子の他、さまざまなな遺伝子を輸送および発現させることができる。発現構築物を輸送するための好ましい方法には、アデノウイルス発現ベクターを使用することが含まれる。アデノウイルスベクターは、ゲノムDNAに組み込まれる可能性が低いことが知られているが、この特徴は、このベクターのもたらす遺伝子移入効率が高いことによって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」とは、(a)相補的なパッケージング機能をもつ宿主細胞の中で構築物がパッケージされるのを補助するのに十分で、また、(b)その中にクローニングされている目的の異種遺伝子を最終的に発現させるのにも十分なアデノウイルス配列を含む構築物をも含む意味である。発現ベクターは、遺伝子工学的に工夫された形のアデノウイルスを含む。36kb の直鎖状の二本鎖DNAウイルスであるという、アデノウイルスの遺伝子構造に関する知識によって、アデノウイルスDNAの大きな断片を外来配列で置き換えることを可能した(GrunhausとHorwitz、1992)。レトロウイルスとは対照的に野生型のアデノウイルスDNAは、遺伝子毒性を及ぼす可能性なしに、染色体外方式で複製することができるため、アデノウイルスが宿主に感染しても、染色体への組み込みは起こらない。また、アデノウイルスは構造的に安定なため、何度増幅を繰り返した後でも、ゲノムが組換えを起こしたことは検出されていない。アデノウイルスは、中くらいの大きさのゲノムをもち、操作が容易で、高濃度、標的細胞の範囲が広く、感染性が高いため、遺伝子導入ベクターとして用いるのに特に適している。ウイルスゲノムの両末端は、100から200塩基対の逆方向反復配列(ITRs)を含んでおり、これらは、DNA複製とパッケージングに必要なシスエレメントである。ゲノムの初期(E)領域と後期(L)領域は、ウイルス複製の開始によって分けられる、別々の転写単位をもっている。E1領域(E1AとE1B)は、ウイルスゲノムと少数の細胞遺伝子の転写調節に関与するタンパク質をコードしている。E2領域(E2AとE2B)の発現は、ウイルスDNA複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞のシャットオフに関係する(Renan、1990)。ウイルスの大部分のキャプシドタンパク質などの後期遺伝子産物は、主要後期プロモーター(MLP)によって生み出された単一の一次転写産物がかなり加工されてはじめて発現される。MLP(16.8 m.u.の位置に存在する）は、感染後期の間に特に効果的であるため、このプロモーターから生じるすべてのmRNAは、それらのmRNAを選択的に翻訳するようにさせる、５’末端の３つの部分からなるリーダー配列(TPL)をもっている。現在のシステムでは、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターと、アデノウイルスゲノムの骨組みをもつマスタープラスミドとの間の相同的組換えによって作製される。アデノウイルスゲノムの骨組みと、ウイルスゲノムで失われている部分を含むヘルパー細胞の細胞ＤＮＡとの間で組換えが起こる可能性があると、野生型アデノウイルスが、この処理によって作出される可能性がある。したがって、各プラークから単一のウイルスクローンを単離して、そのゲノム構造を調べることが重要である。複製欠損株である、ほとんどのアデノウイルスベクターの作製と増殖は、ヒト腎臓胚細胞由来で、Ａｄ５のＤＮＡ断片によって形質転換された細胞系で、Ｅ１タンパク質（Ｅ１ＡとＥ１Ｂ；Grahamら、１９７７）を構成的に発現する、２９３と名付けられた唯一のヘルパー細胞系に依存する。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムから取り除くことができるため（JonesとShenk、1978）、最近のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の助けを借りて、外来ＤＮＡをＥ１とＥ３のどちらか、または両方の領域に持ち込む（GrahamとPrevec、1991）。自然では、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージすることができるため（Ghosh−Choudhuryら、1987）、約２ｋｂのＤＮＡを余計に収容する能力がある。Ｅ１およびＥ３領域において置換可能な約５ｋｂのＤＮＡを一緒にすると、ほとんどのアデノウイルスベクターの最大収容量は、少なくとも７．５ｋｂ、即ちベクターの全長の約１５％になる。８０％以上のアデノウイルスのウイルスゲノムがベクターの骨組みに残ることになる。組換えＥ１欠損アデノウイルスを用いた、in vivoでの遺伝子導入は、宿主の免疫反応を誘発しうる初期および後期の遺伝子発現をもたらすが、これによって、導入遺伝子の発現期間が制限され、遺伝子治療へのアデノウイルスの使用が制限される。これらの問題が起こる可能性を避けるために、免疫原性、および／または細胞傷害性のウイルスタンパク質が発現するのを最小限に抑える目的で、より長い欠失をもつ組換えアデノウイルスを作出するために、原核生物のＣｒｅ−ｌｏｘＰ組換えシステムが採用されてきた（Lieberら、1996）。ヘルパー細胞系は、ヒト胚の腎臓細胞、筋細胞、造血細胞、または、その他のヒト胚の間充織細胞もしくは上皮細胞などのヒト細胞に由来するものであってもよい。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスを受容する別の哺乳動物種の細胞に由来するものであってもよい。このような細胞には、例えば、ベロ細胞、またはその他のサル胚の間充織細胞もしくは上皮細胞などがある。前記したように、好ましいヘルパー細胞系は２９３である。最近、レイカー（Racher）ら（1995）は、２９３細胞を培養し、アデノウイルスを増殖させるための改良法を開示した。一つの方式において、天然の細胞集塊を、１００〜２００ｍｌの培地を入れた、１リットルのシリコン化スピナーフラスコ（イギリス国ケンブリッジにあるテクネ社（Techne）製）の中に各細胞を接種して増殖させる。４０ｒｐｍで撹拌した後、トリパンブルーで細胞の生存率を調べる。別の方式においては、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリヤー（イギリス国ストーン（Stone）、ビビースターリン社（Bibby Sterlin）製）（５ｇ／ｌ）を以下のようにして用いる。細胞接種源を５ｍｌの培地に再懸濁し、２５０ｍｌの三角フラスコの中の担体（５０ｍｌ）に加え、ときどき振とうしながら、１時間〜４時間、静置する。次に、培地を、５０ｍｌの新しい培地に置き換え、振とうを開始する。ウイルスを産生させるため、約８０％集密状態になるまで細胞を増殖させ、その後、培地を置き換えて（最終容量の２５％になるまで）、０．０５ＭＯＩでアデノウイルスを加える。培養液を一晩静置しておき、その後、容量を１００％に増やして、さらに７２時間の振とうを開始する。場合によっては、上皮由来の細胞に比べて、アデノウイルスによる多種の細胞型への遺伝子送達は、ずっと非効率的であることが分かっている。新しいアデノウイルスであるＡｄＰＫが、この非効率を克服するために構築されている（Wick hamら、1996）。ＡｄＰＫは、ウイルスを、多くの細胞型で広範に発現されているヘパラン含有細胞受容体に向かわせるヘパリン結合ドメインを含んでいる。したがって、ＡｄＰＫは、改変されていないアデノウイルスに比べて、高い効率で多くの細胞型に遺伝子を運搬するため、こうして、遺伝子導入効率が向上し、アデノウイルスによる効率的な遺伝子治療を受け入れる組織の範囲が広がる。アデノウイルスベクターが複製欠損株、または、少なくとも、条件的欠損株でなければならないという要件以外には、アデノウイルスベクターの性質が、本発明の実施に決定的な要件になるとは考えられない。アデノウイルスは、４２種の既知の血清型、またはＡ〜Ｆの亜属のいずれのものでもよい。Ｃ亜群の５型アデノウイルスが、本発明で使用するための条件的複製欠損アデノウイルスベクターを得るための好ましい出発材料である。これは、５型アデノウイルスが、生化学的および遺伝子情報の多くが知られているヒトアデノウイルスであり、歴史的に、アデノウイルスをベクターとして用いる構築のほとんどに用いられてきたからである。前記したように、本発明に係る典型的なベクターは、複製欠損株であり、アデノウイルスのＥ１領域をもっていない。したがって、Ｅ１コーディング配列が取り除かれている位置に、外来遺伝子の発現カセットを導入するのが最も好都合である。しかし、アデノウイルス配列中の構築物挿入位置は、本発明にとって重要ではない。また、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、カールソン（ Karlsson）ら（1986）が説明しているようにして、Ｅ３置換ベクターの欠失したＥ３領域のかわりに挿入することもでき、または、ヘルパー細胞系、またはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補完しているときには、Ｅ４領域に挿入することができる(Broughら、1996)。アデノウイルスの増殖および操作は、当業者に既知であり、in vitroおよびin vivoで、広範な宿主範囲を示す。このウイルスグループは、例えば、１ｍｌ当り１０⁹〜１０¹¹プラーク形成単位という高い濃度で得ることができ、また、それらは非常に高い感染力をもつ。アデノウイルスの生活環では、宿主細胞ゲノムへの組み込みは必要とされない。アデノウイルスベクターにより運搬される外来遺伝子は、染色体外（episomal）にあり、そのため、宿主細胞に対する遺伝子傷害性が低い。野生型アデノウイルスによる予防接種実験において、重篤な副作用は報告されたことがない（Couchら、1963；Topら、1971）が、このことは、 in vivoでの遺伝子導入ベクターとしての安全性と治療薬としての可能性を示している。アデノウイルスベクターは、真核生物の遺伝子発現（Levreroら、1991；Gomez −Foixら、1992）、およびワクチン開発（GrunhausとHorwitz、1992；GrahamとP revec、1992）に用いられてきた。最近、動物実験によって、組換えアデノウイルスを遺伝子治療に使用しうることが示唆された（Stratford−PerricaudetとPe rricaudet、1991、Stratford−Perricaudetら、1991：Richら、1993）。組換えアデノウイルスを異なった組織に投与する研究には、気管滴注(Rosenfeldら、19 91、1992)、筋肉注射（Ragotら、1993）、末梢静脈内注射（HerzとGerard、1993 ）、および脳の中への定位接種（Le Gal La Salleら、1993）などがある。組換えアデノウイルスとアデノ随伴ウイルス（下記参照）は、分裂しないヒトの初代細胞に感染して、かつ形質導入することができる。２．ＡＡＶベクターアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も、高頻度で組み込まれ、また、分裂しない細胞に感染することができ、そのために、例えば、組織培養中の（Muzyczka、1992 ）、またはin vivoで、哺乳動物の細胞に遺伝子を搬送するのに有用であるため、腫瘍抑制遺伝子の搬送と発現を行うためのベクターを構築するのに魅力的な系である。ＡＡＶは、広範な感染宿主範囲をもつ（Tratschinら、1984；Laughlin ら、1986；Lebkowskiら、1988；McLaughlinら、1988）。ｒＡＡＶベクターの作製と使用に関する詳細は、米国特許第5,139,941号と米国特許第4,797,368号に記載されており、これらは参照として本明細書に組み入れられる。遺伝子の搬送にＡＡＶを使用することを示した研究には、LaFaceら（1988）； Zhouら、（1993）；Flotteら、（1993）；およびWalshら（1994）がある。組換えＡＡＶベクターは、マーカー遺伝子（Kaplittら、1994；Lebkowskiら、1988； Samulskiら、1989；Yoderら、1994；Zhouら、1994ａ；HermonatとMuzyczka、198 4；Tratschinら、1985；McLaughlinら、1988）、およびヒトの病気に関連した遺伝子（Flotteら、1992；Luoら、1994；Ohiら、1990；Walshら、1994；Weiら、19 94）のin vitro、およびin vivoでの形質導入に用いるのに成功してきた。最近、ＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症を治療するためのヒトの第一相試験に用いることが認可された。ＡＡＶは、培養細胞において増殖的な感染を行うには、別のウイルス（アデノウイルス、または、ヘルペスウイルスファミリーのメンバーのいずれか）と共に感染する必要があるという点で、依存的なバルボウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２）。ヘルパーウイルスとの共感染がないと、野生型ＡＡＶゲノムは、プロウイルスとして潜伏状態で住みつく場所であるヒトの第１９番染色体の中に末端から入り込んでゆく（Kotinら、1990；Samulskiら、1991）。しかし、ｒＡＡＶは、ＡＡＶのＲｅｐタンパク質も発現されていないかぎり、組み込まれるのは第１９番染色体に限定されない（ShellingとSmith、1994）。ＡＡＶプロウイルスを保持する細胞が、ヘルパーウイルスに重複感染すると、染色体または組換えプラスミドからＡＡＶゲノムが「救済」されて、正常な増殖性感染が確立される（Samulskiら、1989；McLaughlinら、1988；Kotinら、1990；Muzyczka、1 992）。典型的には、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスは、ＡＡＶの２つの末端反復配列にはさまれた目的の遺伝子を含むプラスミド（McLaughlinら、1988；Samuls kiら、1989、これらは参照として本明細書に組み入れられる）と、末端反復配列をもたない野生型ＡＡＶコーディング配列を含む発現プラスミド、例えば、ｐＩＭ４５（McCartyら、1991；これは参照として本明細書に組み入れられる）と、を共感染させて作製する。この細胞は、アデノウイルス、または、ＡＡＶヘルパー機能に必要なアデノウイルス遺伝子をもつプラスミドによっても感染または形質転換する。このようにして作られたｒＡＡＶウイルスのストックにはアデノウイルスが混入しており、このアデノウイルスを熱ショックによって不活性化させるか、または、ｒＡＡＶウイルス粒子から物理的に（例えば、塩化セシウム密度勾配遠心によって）分離する必要がある。あるいは、ＡＡＶのコーディング領域を含むアデノウイルスベクター、または、ＡＡＶのコーディング領域とアデノウイルスのヘルパー遺伝子の一部または全部を含む細胞系を用いることもできるかもしれない（Yangら、1994；Clarkら、1995）。プロウイルスとして組み込まれたｒＡＡＶＤＮＡをもつ細胞系を用いることもできる（Flotteら、 1995）。３．レトロウイルスベクター本発明の特定の態様において、レトロウイルス感染を利用して、選択された遺伝子を標的細胞に搬送することが望ましい。レトロウイルスは、逆転写という方法によって、感染した細胞の中で、自らのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換することができるという特徴をもつ一本鎖ＲＮＡウイルスのグループである（Coffin、19 90）。そして、その結果できたＤＮＡは、プロウイルスとして、安定して細胞の染色体の中に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を行わせる。この組み込みによって、受容細胞とその子孫の中でウイルス遺伝子の配列が保持される結果となる。レトロウイルスゲノムは、それぞれ、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、エンベロープ成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖという３つの遺伝子をもつ。ｇａｇ遺伝子の上流に見られる配列は、ゲノムをウイルス粒子にパッケージングするためのシグナルを含んでいる。２つの長い末端反復配列（ＬＴＲ）が、ウイルスゲノムの５'末端と３'末端に存在する。これらは、強力なプロモーターとエンハンサーの配列をもち、また、宿主細胞のゲノムに組み込まれるときにも必要である（Coffin、1990）。レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸を、複製欠損ウイルスを産生するために、ウイルスゲノムの中の一定のウイルス配列の位置に挿入する。ウイルス粒子を産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲとパッケージング成分を含まないパッケージング細胞系を構築する（Mannら、1983）。レトロウイルスのＬＴＲおよびパッケージング配列とともにｃＤＮＡを含む組換えプラスミドがこの細胞系の中に（例えば、リン酸カルシウム沈殿法によって）導入されると、パッケージング配列によって、組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物がウイルス粒子にパッケージされて、培養培地の中に分泌される（NicolasとRubenstein、1988；Temin、1986；Mannら、1983）。次に、組換えレトロウイルスを含む培地を回収して、場合によっては、濃縮して、遺伝子導入に用いる。レトロウイルスベクターは、非常に多様な細胞型に感染することができる。しかし、組み込みと安定した発現には、宿主細胞の分裂が必要である（Paskindら、1975）。欠陥レトロウイルスベクターの使用に関する懸念は、パッケージング細胞の中に、複製能のある野生型ウイルスが出現する可能性である。これは、組換えウイルスの完全な配列が、宿主細胞ゲノムの中に組み込まれたｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの配列の上流に挿入されるという組換え現象によって生じうる。しかし、今では、組換えの確率を大幅に低下させる新しいパッケージング細胞系を利用することができる（Markowitzら、1988；Hersdorfferら、1990）。場合によっては、宿主細胞の範囲が限られることと、レトロウイルスベクターの濃度が低いことが、真核生物細胞での安定した遺伝子導入にそれらを用いることを制限するかもしれない。これらの潜在的な問題を克服するために、レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質が、水疱性口内炎ウイルスのＧ糖タンパク質によって完全に置き換えられている、マウス白血病ウイルスに由来するベクターが開発されている（Burnsら、1993）。これらのベクターを極端に高い濃度（１０⁹コロニー形成単位／ｍｌ）に濃縮して、レトロウイルスのエンベロープタンパク質を含むベクターによる感染に対して通常は抵抗力のある細胞に感染させることができる。これらのベクターは、遺伝子治療モデルの研究、およびin vivo でベクターを直接に搬送することを必要とする他の遺伝子導入研究を促進することができる。４．バキュロウイルスベクターバキュロウイルス発現ベクターは、さまざまな用途のためのタンパク質を生産するために有用な手段である（SummersとSmith、1987；O'Reillyら、1992；また、米国特許第4,745,051号（SmithとSummers）、第4,879,236号（SmithとSummers ）、第5,077,214号（GuarinoとJarvis）、第5,155,037号（Summers）、第5,162, 222号（GuarinoとJarvis）、第5,169,784号（SummersとOker−Blom）、および第 5,278,050号（Summers）；これらは参照として本明細書に組み入れられる）。本発明者らは、テトラサイクリンによって遺伝子発現が調節されるバキュロウイルス発現ベクターの構築を想定している。これらのベクターは、例えば、所望のタンパク質が昆虫細胞にとって毒性な場合に、特に有用かもしれない。これらの例においては、細胞が非常に高密度になるまでタンパク質の産生を停止させることができ、それによって、所望のタンパク質を大量に生産することが可能になる。バキュロウイルス発現ベクターは、必須でないバキュロウイルス遺伝子の代わりに、プロモーターの後ろに目的とする特定の遺伝子のコーディング領域を置いた、組換え昆虫ベクターである。組換えバキュロウイルス発現ベクターを単離するために用いられる古典的な方法は、目的とする外来遺伝子が、ポリヘドリンプロモーターの下流に置かれているプラスミドを構築することである。そして、相同的組換えによって、そのプラスミドを用い、野生型ポリヘドリン遺伝子の代わりに、新しい遺伝子をウイルスゲノムの中に導入することができる（SummersとS mith、1987；O'Reillyら、1992）。この結果できた組換えウイルスは、鱗翅目昆虫の培養細胞または幼虫に感染させることができ、強く、感染最後期における非常に高い転写レベルを提供するポリヘドリンプロモーターの制御下で、外来遺伝子を発現させることができる。ポリヘドリンプロモーターが強いことは、通常、感染している間に外来遺伝子産物の大量合成がもたらされるため、組換えバキュロウイルスを発現ベクターとして用いることの長所である。５．その他のウイルスベクター本発明において、発現ベクターを構築するために、この他のウイルスベクターを用いることができる。ワクシニアウイルス（Ridgeway、1988；BaichwalとSugd en、1986；Couparら、1988）、シンドビスウイルス、およびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターを使用してもよい。これらは、さまざまな哺乳動物細胞にとって、いくつかの魅力的な特徴を提供する（Friedmann、1989；Rid geway、1988；BaichwalとSugden、1986；Couparら、1988；Horwichら、1990）。最近、欠陥Ｂ型肝炎ウイルスが存在することが分かったことによって、さまざまななウイルスの配列の構造と機能の関係に対する新しい洞察が得られた。in v itroの実験によって、このウイルスは、そのゲノムの８０％までが欠失しているにも拘らず、ヘルパー依存的なパッケージングと逆転写に関する能力を保持できることが示された（Horwichら、1990）。このことは、ゲノムの大部分が、外来遺伝子材料によって置き換えられることを示唆した。チャン（Chang）ら（199 1）は、最近、アヒルのＢ型肝炎ウイルスゲノムの中に、ポリメラーゼ、表面、およびプレ表面のコーディング配列に代わって、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を導入した。これを、野生型ウイルスとともにトリ肝癌細胞系の中に感染させた。高濃度の組換えウイルスを含む培養培地を用いて、アヒルのひなの初代肝細胞に感染させた。安定したＣＡＴ遺伝子発現が、トランスフェクション後、少なくとも２４日間は検出された（Changら、199 1）。６．改変ウイルス本発明のさらなる態様において、特に、選択された遺伝子を特定の細胞型に運搬することが望ましいときには、運搬される発現構築物を、特異的な結合リガンドを発現するように遺伝子操作された感染性のあるウイルスの中に入れる。こうして、このウイルス粒子は、標的細胞のコグネイト受容体に特異的に結合して、その内容物を細胞に輸送する。最近、ウイルスのエンベロープにラクトース残基を化学的に付加して、レトロウイルスを化学的に改変することに基づいた、レトロウイルスベクターの特異的なターゲッティングを可能とするように設計された新規の方法が開発された。この改変によって、シアロ糖タンパク質受容体による肝細胞の特異的感染が可能になる。レトロウイルスのエンベロープタンパク質、および特異的な細胞受容体に対するビオチニル化抗体を用いる、組換えレトロウイルスを標的とする別の方法が設計された。この抗体は、ストレプトアビジンを用いると、ビオチン成分によって結合した（Rouxら、1989）。主要組織適合複合体のクラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いたところ、in vitroで、エコトロピックウイルスによって、これらの表面抗原をもつさまざまなヒト細胞に感染することが示された（Roux ら、1989）。Ｃ．ＤＮＡを搬送する別の方法上記のように、細胞への感染によってＤＮＡを搬送するウイルス媒介法と同じように、本発明の腫瘍抑制遺伝子を原核生物細胞と真核生物細胞の両方に導入する別法について考える。１．トランスフェクションとトランスフォーメーション遺伝子構築物の発現をもたらすためには、発現構築物を細胞の中に搬送しなければならない。本明細書で説明されているように、搬送のための好ましいメカニズムは、ウイルス感染によるもので、そこでは発現構築物が感染性ウイルス粒子に被包されている。しかし、ウイルスによらないで、真核生物または原核生物の細胞の中に発現構築物を導入するための幾つかの方法も、本発明で考察されている。本発明の一つの実施形態において、発現構築物は、剥き出しの組換えＤＮＡまたはプラスミドのみからできていてもよい。構築物の導入は、物理的または化学的に細胞膜を透過できるようにする説明されている方法のいずれかによって行うことができる。ａ．リポソームによるトランスフェクションとトランスフォーメーション本発明のさらなる態様において、発現構築物をリポソームの中に閉じ込めることができる。リポソームは、リン脂質の二層膜と、内部の水性培地によって特徴づけられる小胞性の構造物である。多層状のリポソームは、水性培地によって分けられる多重脂質層をもつ。それらは、リン脂質を過剰の水性溶液に懸濁すると自然に形成される。脂質成分は、閉鎖構造をとる前に自己再構成を起こして、脂質二重層の間に水と溶質を閉じ込める（GhoshとBachhawat、1991）。また、リポフェクタミン（Lipofectamine）（ギブコＢＲＬ社（Gibco BRL）製）と複合体を形成した発現構築物も考えられている。リポソームによる核酸の搬送と、外来ＤＮＡのin vitro発現には成功している（NicolauとSene、1982；Fraleyら、1979；Nicolauら、1987）。ウォン（Wong）ら（1980）は、ニワトリ胚、ＨｅＬａ、および肺癌の細胞培養において、外来ＤＮＡのリポソームによる搬送と発現の実施可能性を明らかにした。本発明の一定の実施形態において、リポソームは、血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と複合体を形成していてもよい。こうすると、細胞膜との融合が促進され、リポソームに被包されたＤＮＡが細胞の中に入りやすくなることが示されている（ Kanedaら、1989）。別の実施形態において、リポソームは、ヒストン以外の核の染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）とともに、複合体を形成させたり、用いることができる（Katoら、1991）。さらに別の態様において、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１とともに、複合体を形成させたり、用いることができる。ｂ．エレクトロポレーション本発明の一定の実施形態において、エレクトロポレーションによって、発現構築物を細胞の中に導入する。エレクトロポレーションは、細胞およびＤＮＡの懸濁液を、高電圧の放電に曝すことを含む。エレクトロポレーションを用いた、真核生物細胞のトランスフェクションは、十分な成功を収めている。ヒトのカッパ免疫グロブリン遺伝子によって、マウスの前Ｂリンパ球をトランスフェクトし（Potterら、1984）、また、この方法で、クロラムフェニコールアセチルトランフェラーゼ遺伝子によって、ラットの肝細胞をトランスフェクトしている（Tur−Kaspaら、1986）。ｃ．リン酸カルシウム沈殿法とＤＥＡＥ−デキストラン処理法本発明の別の実施形態において、リン酸カルシウム沈殿法を用いて、発現構築物を細胞に導入する。この技術を用いて、アデノウイルス５ＤＮＡ（Grahamと Van Der Eb、1973）によって、ヒトのＫＢ細胞をトランスフェクトしている。また、この方法で、ネオマイシンマーカー遺伝子によって、マウスＬ（Ａ９）細胞、マウスＣ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびＨｅＬａ細胞をトランスフェクトし（ChenとOkayama、1987）、また、さまざまななマーカー遺伝子によってラット肝細胞をトランスフェクトした（Rippeら、1990）。別の実施形態において、ＤＥＡＥ−デキストランを用いてから、ポリエチレングリコールを用いて、発現構築物を細胞の中に輸送する。この方法では、レポータープラスミドをマウスの骨髄腫細胞と赤白血病細胞の中に導入した（Gopal、1 985）。ｄ．パーティクルガン法剥き出しのＤＮＡ発現構築物を細胞の中に導入するための、本発明の別の実施形態は、パーティクルガン法を含むことができる。この方法は、ＤＮＡで被覆した微小発射物を加速して、細胞を殺すことなく、それらが細胞膜を貫通して細胞の中に入り込むことができるような高速度にすることができる能力に依存する（ Kleinら、1987）。小さな粒子を加速するための装置がいくつか開発されている。このような装置の一つは、電流を発生させるために高圧放電に頼り、そして、それが順次原動力となる（Yangら、1990）。用いられる微小発射物は、タングステンや金でできたビーズのように、生物学的に不活性な物質からできている。ｅ．直接マイクロインジェクション、または音波処理本発明のさらなる実施形態は、発現構築物の直接的なマイクロインジェクションまたは音波処理による導入が含まれる。直接的なマイクロインジェクションを用いて、核酸構築物をアフリカツメガエルの卵母細胞の中に導入し（HarlandとW eintraub、1985）、また、音波処理によりチミジンキナーゼ遺伝子でＬＴＫ^-線維芽細胞をトランスフェクトした（Fechheimerら、1987）。ｆ．アデノウイルス補助によるトランスフェクション本発明の一定の実施形態において、アデノウイルス補助によるトランスフェクションを用いて、細胞の中に発現構築物を導入する。アデノウイルス結合系を用いた細胞系において、形質転換効率が上昇することが報告されている（Kelleher とVos、1994；Cottonら、1992；Curiel、1994）。ｇ．受容体によるトランスフェクション構築物を標的細胞に送達するために用いられる、さらなる発現構築物は、受容体による送達ビヒクルである。これらは、標的細胞の中で起こる受容体依存型エンドサイトーシスによる、高分子の選択的取り込みを利用する。さまざまな受容体の細胞型特異的な分布を考慮すると、この送達法は、本発明に、ある程度の特異性を加える。別の哺乳動物の細胞型に関連する特異的な送達法については、Wu とWuによって説明されている（1993；参照として本明細書に組み入れられる）。一定の受容体依存型の遺伝子ターゲティングビヒクルは、受容体特異的なリガンド、およびＤＮＡ結合剤を含む。別の送達ビヒクルは、送達すべきＤＮＡ構築物が機能可能なように結合している、細胞受容体に特異的なリガンドを含む。いくつかのリガンドが、受容体依存型遺伝子導入に使用されており(WuとWu、1987 、Wagnerら、1990、Peralesら、1994、Myers、欧州特許第0273085号)、この技術の実施可能性が確認されている。本発明に関連して、リガンドは、神経内分泌標的細胞集団で特異的に発現される受容体に対応するように選ばれる。別の態様において、細胞特異的な遺伝子ターゲティングビヒクルのＤＮＡ送達ビヒクル成分は、リポソームに結合した特異的結合リガンドを含むことができる。送達される核酸は、リポソームの中に閉じ込められていて、特異的結合リガンドは、機能的に、リポソーム膜の中に取り込まれている。このように、リポソームは、標的細胞の受容体に特異的に結合して、その中身を細胞に運搬する。例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体のアップレギュレーションを示す細胞への核酸の受容体依存型送達に、ＥＧＦを用いるシステムを用いると、このようなシステムが機能することがわかっている。さらに別の態様において、ターゲティング送達ビヒクルのＤＮＡ送達ビヒクル成分は、リポソームそのものでもよく、好ましくは、細胞特異的結合を指令する一つ以上の脂質または糖タンパク質を含んでいる。例えば、Nicolauら(1987)は、ガラクトース末端側アシアロガングリオシドであるラクトシルセラミドを用いて、リポソームの中に取り込ませて、肝細胞によるインシュリン遺伝子の取り込みが上昇することを観察した。本発明の組織特異的形質転換構築物を、同じようにして、標的細胞の中に特異的に送達することができると考えられる。Ｄ．マーカー遺伝子本発明のある態様では、タグ付けされた細胞の運命について情報を提供するために、特異的な遺伝子マーカーで特異的な細胞をタグ付けする。このようにして、本発明は、全細胞アッセイに基づき、レポーター遺伝子の上流に置かれた一般的なＤＮＡプロモーターが機能する条件下でだけ現れ、容易に検出できる表現形質をその組換え宿主に付与するレポーター遺伝子を好ましくは用いる、組換え候補のスクリーニングおよび選択の方法も提供する。一般的に、レポーター遺伝子は、例えば、細胞培養物の蛍光測定、放射性同位元素、または分光光度測定で解析するなど、細胞培養物を解析して検出することができ、宿主細胞では産生されないポリペプチド（マーカータンパク質）をコードしている。本発明の別の態様では、ＤＮＡもしくはＲＮＡのPCR^TMによる増幅、または、蛍光測定的、放射性同位元素の、または分光光度測定的なプローブを用いたハイブリダイゼーションなどの標準的な遺伝子解析技術によって検出できる遺伝子マーカーが提供されている。１．スクリーニング当業者には公知のように、酵素の具体例としては、エステラーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ（組織プラスミノーゲン活性化因子またはウロキナーゼ）、および、それらの活性によって検出することができるその他の酵素が含まれる。本発明において用いることを考えると、導入遺伝子の発現マーカーとしては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である(Chalfieら、1994)。ＧＦＰを使用すれば、外から基質を加える必要はなく、近紫外光、または青色光によって照射するだけである。このため、生細胞での遺伝子発現をモニターするときに使用できる可能性がかなり高い。別の具体的な例は、放射性標識した基質とともに用いることのできるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、ホタルおよび細菌のルシフェラーゼ、および細菌の酵素であるβ−ガラクトシダーゼとβ−グルクロニダーゼである。同じ仲間に含まれる、この他のマーカー遺伝子は、当業者にとって周知であり、本発明で使用するのに適している。２．選択宿主細胞に検出可能な特徴を付与する、別の仲間のレポーター遺伝子とは、それらの形質転換体に毒素に対する耐性をもたらす、一般的には酵素であるポリペプチドをコードするレポーター遺伝子のことである。これに分類されるレポーター遺伝子の例には、抗生物質Ｇ４１８の毒性レベルに対して宿主細胞を守るｎｅｏ遺伝子(Colberre-Garapinら、1981)、ストレプトマイシン耐性を付与する遺伝子（米国特許第4,430,434号）、ハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子(Sant erreら、1984、米国特許第4,727,028号、第4,960,704号および第4,559,302号)、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキセートに対する耐性を付与する遺伝子(Altら、1978)、ＨＰＲＴ酵素、および当技術分野において周知のその他多くのものがある(Kaufman、1990)。Ｅ．生物学的に同等の活性があるもの本発明は、レチノブラストーマタンパク質で例示されている腫瘍抑制タンパク質で、そのＮ末端領域に、その結果できたタンパク質に同等、またはより大きな腫瘍抑制活性を付与する改変を含む腫瘍抑制タンパク質の使用を意図しているが、タンパク質の改変されていないＣ末端部位を、生物学的活性が維持されるように変更することも、本発明の範囲に含まれる。上記のように、例えば、レチノブラストーマタンパク質の構造に改変および変更を加えることができ、それでもなお、同等の、または望ましい特徴をもつ分子が得られる。例えば、腫瘍抑制活性を明らかに失うことなく、タンパク質構造においてあるアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることができる。タンパク質の生物学的機能活性を決めるのは、そのタンパク質の相互作用能力と性質であるから、タンパク質配列（または、もちろん、そのもととなるＤＮＡのコード配列でもよい）の中で一定のアミノ酸置換を作出し、それにもかかわらず、同様の（アゴニスト）特性を得ることができる。同様に、同じ考察を用いて、相殺する（例えばアンタゴニスト）特性をもつタンパク質またはポリペプチドを作出することができる。このように、本発明者らは、生物学的有用性または活性に明らかな損失を与えることなしに、腫瘍抑制タンパク質またはペプチド（そのもととなるＤＮＡ）の配列中にさまざまな変化を作出することを考えている。機能的に同等なものということに関して、当業者は、生物学的に機能が同等なタンパク質またはペプチドという定義に内在するのは、分子の一定の部位の中で作出することができ、それでも許容できる程度に同等の生物学的活性をもつ分子ができるような変更の数には限りがあるという概念であることを十分に理解しているはずである。したがって、生物学的な機能が同等なペプチドは、ここでは、大部分でも全部でもない、一定のアミノ酸を置換されているアミノ酸と定義される。もちろん、異なった置換をもつ複数の別のタンパク質／ペプチドを容易に作出し、本発明にしたがって使用することができる。例えば、活性部位にある残基のように、タンパク質またはペプチドの生物学的または構造的な特性にとって、一定の残基が特に重要であると分かっている場合には、一般的に、その残基を交換してはならないことも十分に理解されている。当技術分野において周知の保存的置換には、例えば、以下の変化が含まれる。すなわち、アラニンからセリン；アルギニンからリシン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リシンからアルギニン、グルタミンまたはグルタミン酸；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニン；セリンからスレオニン；スレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；および、バリンからイソロイシンまたはロイシン。このような変更を加えるときに、アミノ酸の疎水親水指数(hydropathic index )を考慮することができる。各アミノ酸は、疎水性と荷電特性に基づいて、疎水親水指数を付与されている。すなわち、イソロイシン(+4.5)；バリン(+4.2)；ロイシン(+3.8)；フェニルアラニン(+2.8)；システイン／シスチン(+2.5)；メチオニン(+1.9)；アラニン(+1.8)；グリシン(-0.4)；スレオニン(-0.7)；セリン(-0. 8)；トリプトファン(-0.9)；チロシン(-1.3)；プロリン(-1.6)；ヒスチジン(-3. 2)；グルタミン酸(-3.5)；グルタミン(-3.5)；アスパラギン酸(-3.5)；アスパラギン(-3.5)；リシン(-3.9)；およびアルギニン(-4.5)。相互作用的な生物学的機能をタンパク質に付与するときに、疎水親水アミノ酸指数が重要なことは、当技術分野においては一般的に理解されている(Kyte & Do olittle、1982、参照として本明細書に組み入れられる)。一定のアミノ酸を、同じような疎水親水アミノ酸指数またはスコアをもつ別のアミノ酸と置換することができ、同様の生物学的活性を保持することが知られている。疎水親水アミノ酸指数に基づいて変化を生じさせようとするときには、疎水親水指数が±２の範囲にあるアミノ酸と置換することが好ましいが、±１の範囲にあるものが、特に好ましく、±０．５の範囲にあるものが、さらに一層好ましい。疎水性に基づいて、効果的に、類似のアミノ酸置換を行うことができることも、当技術分野において理解されている。米国特許第4,554,101号が、参照として本明細書に組み入れられるが、これは、隣接するアミノ酸の疎水性によって支配される、タンパク質の局所的な疎水性の平均の最大値は、免疫原性と抗原性、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性と相関しているので、この短い部分を非免疫学的な材料として使用することを記述している。アミノ酸は、同じような疎水性値をもつ別のアミノ酸に置換することができ、なお、生物学的に同等で、特に、免疫学的に同等のタンパク質を得ることができると理解されている。米国特許第4,554,101号で詳述されているように、以下の親水性値は、アミノ酸残基に与えらたものである。アルギニン(+3.0)；リシン(+3.0)；アスパラギン酸(+3.0±1)；グルタミン酸酸(+3.0±1)；セリン(+0.3)；アスパラギン(+0.2)；グルタミン(+0.2)；グリシン(0)；スレオニン(-0.4)；プロリン(-0.5±1)；アラニン(-0.5)；ヒスチジン(-0.5)；システイン(-1.0)；メチオニン(-1.3)；バリン (-1.5)；ロイシン(-1.8)；イソロイシン(-1.8)；チロシン(-2.3)；フェニルアラニン(-2.5)；トリプトファン(-3.4)。類似の親水性値に基づいて変更を行うとき、親水性値が±２の範囲内にあるアミノ酸置換が好ましく、±１の範囲内にあるものが特に好ましく、±0.5の範囲内にあるものがさらに一層好ましい。アミノ酸置換によって生じる機能的に同等なポリペプチドを中心に考察したが、遺伝子暗号が縮重していること、および、２つ以上のコドンが同じアミノ酸をコードしていることもあることを考慮すれば、これらの変化は、コードＤＮＡを変化させることによって生じさせることもできると認めれらよう。アミノ酸と、それらのコドンとの２つの表を、このような実施形態において使用するため、また、プローブやプライマーなどを設計するなど、他の用途に使用するために下記に示す。コドンの使用度は左（最高の使用度）から右（最低の使用度）に向けて減少するものとして示してある。下線を引いたコドンは1000のコドンあたり5回より少ない使用度のものである。コドンの使用度は左（最高の使用度）から右（最低の使用度）に向けて減少するものとして示してある。下線を引いたコドンは1000のコドンあたり5回より少ない使用度のものである。Ｆ．突然変異誘発特定の腫瘍抑制タンパク質またはサイトカインタンパク質の配列の中に一つ以上の変異を有するオリゴヌクレオチドを合成することを含むが、これに限定されない、当技術分野において既知の技術のいずれかにしたがって、突然変異誘発を行うことができる。特に、部位特異的突然変異誘発は、もととなるＤＮＡの特異的な突然変異誘発によって、個々のペプチド、または生物学的な機能が同等のタンパク質またはペプチドを調製するときに有用な技術である。この技術によって、例えば、前述の考慮を一つ以上取り入れて、ＤＮＡに一つ以上の塩基配列の変化を導入することによって、さらに、変異配列を迅速に調製し、調べることができるようになる。部位特異的突然変異誘発によって、所望の変異をもつＤＮＡ配列をコードする特異的なオリゴヌクレオチドと、それに隣接する十分な数のヌクレオチドを使用することによって変異体を作製し、十分な長さのプライマー配列と、向かい合う欠失接合部の両側で安定した二本鎖を形成する配列の複雑性を提供することができる。典型的には、約17〜約75ヌクレオチド、またはそれ以上の長さのプライマーで、改変された配列の接合部の両側に約10〜約25ヌクレオチドをもつものが好ましい。一般的に、部位特異的突然変異誘発の技術は、さまざまな刊行物で例示されているように、当技術分野において周知である。正しく評価するならば、この技術は、典型的には、一本鎖と二本鎖の両方の形状で存在するファージベクターを用いる。部位特異的突然変異誘発において有用な、具体的なベクターには、Ｍ１３ファージなどのベクターが含まれる。これらのファージは、簡単に購入することができ、それらの使用法は、一般的に、当業者に周知である。二本鎖プラスミドも、部位特異的突然変異誘発において、日常的に用いられ、目的の遺伝子をプラスミドからファージに移す工程を省いてくれる。一般的に、本明細書による部位特異的突然変異誘発は、まず一本鎖ベクターを手に入れるか、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列の中に含む二本鎖ベクターの２つの鎖を融解分離する。所望の変異配列をもつオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的には合成によって調製する。そして、このプライマーを一本鎖ベクターとアニーリングさせて、変異を含む鎖の合成を完了させるために、大腸菌ポリメラーゼＩクレノウ断片などのＤＮＡ合成酵素と反応させる。このようにして、一方の鎖は変異を起こしていないもとの配列をコードし、もう一方の鎖は所望の変異をもっている、ヘテロ二本鎖が形成される。次に、このヘテロ二本鎖ベクターを用いて、大腸菌細胞などの適当な宿主を形質転換し、変異配列の構成をもつ組換えベクターを含むクローンを選択する。遺伝子選択の手順が、突然変異誘発オリゴヌクレオチドを取り込んだクローンを増幅するために、Ku nkelら(1987)によって考案された。または、Taqポリメラーゼなど、市販されている耐熱性酵素とともにPCR^TMを使用して、突然変異誘発オリゴヌクレオチドプライマーを、増幅したＤＮＡ断片の中に組み込んでもよい。そして、このＤＮＡ断片を、適当なクローニングベクターまたは発現ベクターの中にクローニングすることができる。Tomicら(1990)、およびUpenderら(1995)のPCR^TMによる変異誘発の手順は、このようなプロトコールの実例を２つ提供している。耐熱性ポリメラーゼ以外に、耐熱性リガーゼを用いるPCR^TMも、リン酸化された突然変異誘発オリゴヌクレオチドを増幅ＤＮＡ断片に組み込むために利用することができる。そして、このＤＮＡ断片を、適当なクローニングベクターまたは発現ベクターにクローニングする。Michaelら(1994 )が説明する、突然変異誘発の手順には、このようなプロトコールの例が提供されている。部位特異的突然変異誘発を用いて、選択されたペプチドをコードするＤＮＡセグメントの配列変異体の調製は、有用な種を作出する手段として提供されているが、ペプチドの配列変異体、および、それをコードするＤＮＡ配列を得る方法が他にないと限定する意味ではない。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターを、例えば、ヒドロキシルアミンなどの突然変異誘発剤で処理して、配列変異体を得てもよい。本明細書中、「オリゴヌクレオチドに対する突然変異誘発の手順」という語は、特定の核酸分子の濃度を、最初の濃度に比べて増加させるか、または増幅などの検出可能なシグナル濃度の増加をもたらす、鋳型依存的な処理と、ベクターによる増殖を意味する。本明細書中、オリゴヌクレオチドに対する突然変異誘発の手順」という語は、プライマー分子を鋳型依存的に伸長させることを含む処理を意図している。「鋳型依存的な処理」という語は、新しく合成された核酸の鎖が、周知の相補的塩基対の原則によって支配される、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の核酸合成を意味する（例えば、Watson、1987を参照）。典型的には、ベクターが介在する方法には、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに核酸断片を導入すること、ベクターをクローニングによって増幅すること、および、増幅された核酸断片を回収することが含まれる。このような方法の例が、米国特許第4,237,224号によって提供されており、その全体を引用により本明細書に組み入れる。Ｇ．製薬上許容される組成物および投与経路臨床適用を想定する場合、意図する適用に適した形態の、テトラサイクリン調節ベクター、組換えウイルスおよび細胞などのベクターを含めて、タンパク質、核酸の医薬組成物を調製する必要がある。一般にこれは、本質的に発熱物質ならびにヒトまたは動物に対して有害となりうる他の夾雑物を含まない組成物を製造することを必要とする。一般に、患者に導入するのに適した組成物とするために、適切な塩と緩衝剤を用いることが所望される。本発明の水性組成物は、製薬上許容される担体または水性媒質中に溶解または分散しており、好ましくはカプセル化されている治療薬を有効量含む。「製薬上または薬理学上許容される」の語は、動物またはヒトに投与したとき、有害反応、アレルギー反応または他の好ましくない反応を生じさせない分子単位および組成物を意味する。本明細書中、「製薬上許容される担体」は、任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤等を含む。医薬として活性な物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は当該技術において周知である。従来のいかなる媒質または物質も、本発明のベクターまたは細胞と不適合である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が想定される。他の抗癌剤のような補助有効成分も組成物に組み込むことができる。遊離塩基または製薬上許容される塩としての有効成分の溶液は、水中で、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合して調製することができる。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含む。静脈内ビヒクルは液体および栄養補給物を含む。防腐剤は、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスを含む。医薬組成物中の種々の成分のpHと厳密な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。ウイルスまたは細胞の有効量は意図する目標に基づいて決定される。「単位用量」の語は、被験者における使用に適した物理的に分離された単位を意味し、各々の単位は、その投与、すなわち適切な経路と治療レジメに関連して、所望の応答を生じるように計算された既定量の治療組成物を含有する。投与する量は、治療回数と単位用量の両方に従って、治療する被験者、被験者の状態、および所望する保護に依存する。治療組成物の厳密な量は開業医の判断にも依存し、各個体に固有である。１．非経口投与本発明の活性組成物はしばしば非経口投与用に、例えば静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、腫瘍周囲、さらには腹腔内経路を通しての注射用に製剤化される。有効成分として第２の薬剤を含む水性組成物の調製は、本発明の開示に照らして当業者には既知であろう。典型的には、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製することができ、注射前に液体を加えて溶液または懸濁液を調製するのに適した固体形態としても調製でき、また調製物を乳化することもできる。遊離塩基または製薬上許容される塩としての活性化合物の溶液は、水中でヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合して調製することができる。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含む。注射用に適した医薬形態は、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、落花生油または水性プロピレングリコールを含む剤形；ならびに滅菌注射溶液または分散液を即時調製するための滅菌粉末を含む。いずれの場合も、該形態は滅菌されていなければならず、また容易に注射できる程度に流動的でなければならない。製造および保存条件下で安定でなければならず、また細菌や真菌のような微生物の汚染作用に抗して保存されなければならない。活性化合物は、中性または塩形態の組成物に製剤化することもできる。製薬上許容される塩は酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）を含み、これらは例えば塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸と共に形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインのような有機塩基から誘導することもできる。担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、ならびに植物性油を含む溶媒または分散媒でもよい。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの保持によって、ならびに界面活性剤の使用によって保持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中で使用することにより、注射用組成物の持続吸収を実現することができる。滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を必要に応じて上に列挙した様々な他の成分と共に適当な溶媒中に組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般に分散液は、基本的な分散媒と上に列挙したものの中で必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に様々な滅菌有効成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、特殊な調製方法として、有効成分とあらかじめ濾過滅菌したその溶液からの追加の所望成分との粉末を生成する、真空乾燥および凍結乾燥手法がある。水溶液での非経口投与のためには、例えば、溶液は必要に応じて適切に緩衝化されていなければならず、また希釈液は最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張になっていなければならない。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、腫瘍周囲および腹腔内投与に特に適する。これに関して、使用しうる滅菌水性媒体は、本発明の開示に照らして当業者には既知であろう。例えば、１回投与量を等張NaCl溶液1mlに溶解し、皮下注入液1000mlに加えるか、もしくは指定注入部位に注射することができる（例えば、”Remlngton's Pharma ceutical Sciences”第15版、p.1035‐1038および1570‐1580参照）。投与量の多少の変動は、治療すべき被験者の症状に依存して必然的に起こるであろう。投与の責任を担う者が、いかなる場合も、個々の被験者に適した用量を決定する。２．他の投与経路静脈内又は筋肉内注射のような非経口投与用に製剤された化合物に加えて、他の薬学上許容される形態には、たとえば経口投与用の錠剤又はその他の固体；経時放出カプセル；及びクリーム、ローション、含そう薬、吸入剤等を含めて、現在使用されている他のあらゆる形態が包含される。本発明の発現ベクターおよび供給送達ビヒクルは、古典的な医薬製剤を含む。本発明によればこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を通して使用可能であるかぎり、いかなる一般的経路を通しても行われる。これは経口、経鼻、舌下、直腸、膣又は局所を含む。その代わりとして、投与は正所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈注射によって実施することもできる。注射は、全身、局部的、局所又は直接注射、たとえば腫瘍への注射でありうる。また切除した腫瘍床への注射やカテーテルによる持続注入も想定される。そのような組成物は通常、上述した薬学上許容される組成物として投与されるであろう。本発明のベクターは、流動性溶液又は懸濁液のいずれかとして注射用組成物の形態で好都合に投与される；注射の前に液体中に溶解又は懸濁するのに適した固体形態も調製できる。これらの製剤を乳化することもできる。そのような目的のための典型的な組成物は、リン酸緩衝生理食塩水１ミリリットル当りヒト血清アルブミン５０ｍｇ又は約１００ｍｇまでを含有する。他の薬学上許容される担体は、塩、防腐薬、緩衝剤等を含めて、水溶液、無毒性賦形剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油、ならびにｔｈｅｙｌｏｌｅａｔｅのような注射用有機エステルである。水性担体は、水、アルコール／水溶液、食塩水、塩化ナトリウム、リンガーデキストロース等のような非経口ビヒクルを含む。静脈内ビヒクルは液体栄養補給物を含む。防腐薬は、抗菌薬、抗酸化薬、キレート化剤および不活性ガスを含む。医薬組成物中の種々の成分のｐＨと厳密な濃度は周知のパラメータに従って調整される。追加製剤は経口投与に適する。経口製剤は、たとえば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような典型的賦形剤を含む。当該組成は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出性製剤又は粉末の形態をとる。経路が局所性であるときには、剤型はクリーム、外用薬、軟膏又はスプレーでありうる。治療物質の有効量は意図する目標に基づいて決定される。「単位用量」の語は、被験者における使用に適した物理的に分離された単位を意味し、各々の単位は、その投与、すなわち適切な経路と治療処方に関連して所望する応答を生じるように計算された、あらかじめ定められた量の治療組成物を含有する。投与する量は、治療回数と単位用量の両方に従って、治療する被験者、被験者の状態、および所望する保護に依存する。治療組成物の厳密な量は開業医の判断にも依存し、各個体に固有である。一部の場合、本発明の治療製剤は、クリームやローションのような局所投与に適した形態に調製することもできる。これらの形態は、様々な肉腫のような皮膚に関連する疾患を治療するために使用しうる。製剤されると、溶液は投与剤型に適合する方法により、治療上有効な量で投与される。製剤は、上述した注射溶液タイプのような様々な投与形態で、さらには薬剤放出カプセルやその他の使用可能な同様のものと共に、容易に投与される。Ｈ．化学療法剤本発明の方法は、患者が呈する個々の疾患又は障害の治療において一般に用いられる他の方法と組合わせることができる。たとえば固形腫瘍の治療に関して、本発明の方法は、手術、放射線治療等のような古典的アプローチと組合わせて使用することができる。個々の治療アプローチが本質的に有害である、又は腫瘍抑制遺伝子治療の効果を打ち消すことが知られていないかぎり、本発明との組合せが想定される。１つまたはそれ以上の作用物質をサイトカイン遺伝子療法および／または腫瘍抑制遺伝子療法と組合わせて使用するとき、明らかに望ましいことではあるが、組合わせた結果が各々の治療を個別に実施したときに認められる効果に付加的なものである必要はなく、また確かに可能であり、有利ではあるが、組合わせた治療が相乗効果を示すことは特に必要ない。手術の見地からは、いかなる外科的処置も本発明と組合わせて実施することができる。放射線治療に関しては、γ線照射、Ｘ線、紫外線照射、マイクロ波、さらには電子放出等のような、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘発する機構が想定される。腫瘍細胞へのラジオアイソトープの指向送達も想定され、これはターゲティング抗体又は他のターゲティング手段と結合して使用しうる。サイトカイン療法はまた、併用治療処方にとっての有効なパートナーであることが証明されている。種々のサイトカインがそのような併用アプローチにおいて使用できる。サイトカインの例は、ＩＬ‐１α、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐ ４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐８、ＩＬ‐９、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐ １１、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１３、ＴＧＦ‐β、ＧＭ‐ＣＳＦ、Ｍ‐ＣＳＦ、Ｇ‐ ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐β、ＩＦＮ‐γを含む。サイトカインは、患者の状態やサイトカインの相対的毒性のような臨床上の指標と一致した、標準的な処方に従って投与される。以下は、本発明の特定の具体例における使用に関して想定されるサイトカイン遺伝子を例示する表であるが、いかなる意味においてもこれに限定されるものではない。（本頁以下余白）本発明の組成物は、以下に例示するような化学療法剤である化合物(第２物質) の有効量と組合わせて、治療的投与のために設計されたウイルス又は細胞の有効量を有することができる。そのような組成物は一般に、薬学上許容される担体中又は水性媒質中に溶解又は分散される。広い範囲の化学療法剤を本発明の治療遺伝子と組合わせて使用できる。これらは、たとえば、直接ＤＮＡに架橋結合する物質、ＤＮＡに挿入する物質、ならびに核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体異常および有糸分裂異常を導く物質である。腫瘍破壊力が増強される機構に関わらず、本発明の組合せ治療の局面は疾患の有効な治療において明らかな有用性を持つ。化学療法剤の投与と組合わせて本発明の組成物を使用するには、動物内で組み合わされて抗腫瘍作用をもたらすのに有効な方法で、化学療法剤と組合わせて本明細書中で開示するような少なくとも第１の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制遺伝子を、単に、動物に投与する。それ故これらの薬剤は、腫瘍環境においてそれらが組み合わさって存在し、組み合わさって作用を生じるのに有効な量で、有効な期間提供される。この目標を達成するために、改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制遺伝子と化学療法剤を単一組成物として、又は異なる投与経路を用いる２つの別個の組成物として、動物に同時に投与することができる。その代わりに、改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制遺伝子治療を、数分間から数週間の範囲の間隔を置いて化学療法剤治療に先行させるか、又は化学療法剤治療のあとに実施することもできる。化学療法剤と改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制遺伝子を別途に動物に適用する具体例では、一般に、各々の供給送達の時間に重要な時間的開きはないので、化学療法剤と改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制遺伝子の組成物は、なおも腫瘍に対して好都合に組み合わさった作用を及ぼしうることが保証されるであろう。そのような場合、２つの薬剤を互いに約５分間から約１週間以内に、より好ましくは互いに約１２‐７２時間以内に腫瘍に接触させることが想定されており、約１２‐４８時間だけの遅延時間が最も好ましい。ある種の状況では、治療時間を有意に延長させることが望ましいと考えられ、そのような場合には各々の投与の間に数日間（２、３、４、５、６又は７日間）、さらには数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８週間）の間隔を置く。また、改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制遺伝子又は化学療法剤のいずれかの１回以上の投与が望ましいことも考えられる。腫瘍の後退を実現するためには、投与の回数に関わりなく、その増殖を抑制するのに有効な組合せ量で両方の薬剤を供給送達する。様々な化学療法剤が、本明細書中で開示する組合せ治療法において有用であると考えられる。例として想定される化学療法剤は、たとえば、エトポシド（ＶＰ ‐１６）、アドリアマイシン、５‐フルオロウラシル（５ＦＵ）、カンプトテシン、アクチノマイシン‐Ｄ、ミトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、さらには過酸化水素を含む。当業者には理解されるように、化学療法剤の適切な量は、一般に化学療法剤を単独で又は他の化学療法剤と組合わせて投与する臨床治療において既に用いられているのに近い量である。単なる例示として、シスプラチンのような薬剤および他のＤＮＡアルキル化剤が使用できる。シスプラチンは癌の治療に広く使用されており、臨床適用において使用される有効用量、２０ｍｇ／ｍ²を３週間ごとに５日間合計３回のコースで投与する。シスプラチンは経口では吸収されず、従って静脈内、皮下、腫瘍内又は腹腔内注射によって供給送達しなければならない。相乗的抗腫瘍作用の組合せに導くＤＮＡ損傷を生じさせるための、核酸、特にＤＮＡと直接架橋結合する物質を検討し、本明細書中に示す。シスプラチンのような物質および他のＤＮＡアルキル化剤が使用できる。さらなる有用な物質は、ＤＮＡの複製、有糸分裂および染色体の分離に干渉する化合物を含む。そのような化学療法化合物は、ドキソルビシンとしても知られるアドリアマイシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシン等を含む。新生物の治療のために臨床の場で広く使用されているこれらの化合物は、アドリアマイシンについては２１日間隔で２５‐７５ｍｇ／ｍ²の用量を静脈内ボーラス注射によって、エトポシドについては３５‐５０ｍｇ／ｍ²を静脈内注射によって又は静脈内用量の２倍を経口経路で投与する。ポリヌクレオチド前駆物質の合成と適合性を破壊する薬剤も使用できる。特に有用なのは、広汎な検査を受けており、直ちに使用できる物質である。５‐フルオロウラシル（５‐ＦＵ）のような薬剤は腫瘍性組織によって選択的に使用され、その結果この薬剤は腫瘍性細胞を標的する上で特に有用である。極めて毒性が高いにもかかわらず、５‐ＦＵは局所性のものを含めた広い範囲の担体において適用されるが、３‐１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量での静脈内投与が一般的に用いられる。タキソールのような植物アルカロイドも本発明の一部の局面における使用が想定される。タキソールは、イチイの木Ｔａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａの樹皮から単離した実験的抗有糸分裂薬である。チューブリンと結合し（ビンカアルカロイド類によって使用されるものとは異なる部位で）、微小管の構築を促進する。タキソールは現在臨床的に評価されている；悪性メラノーマおよび卵巣癌に対して活性を有する。最大用量は、３０ｍｇ／ｍ²／日を５日間又は２１０‐２５０ｍｇ／ｍ²を３週間ごとに１回である。もちろん、これらの用量はすべて例示であり、これらの範囲内のいかなる用量も本発明における使用が予想される。組合せ療法に関して有用な、例示としての化学療法剤を表４に列挙する。ここに列挙した各々の物質は例示であり、いかなる意味でもこれに限定されるものではない。当業者は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ”第１５版、第３３章、特に６２４‐６５２ページを参照されたい。投与量の多少の変動は、治療される被験者の条件に依存して必然的に起こるであろう。投与の責任を担う者が、いかなる場合も、個々の被験者に適した用量を決定する。さらに、ヒトでの投与のためには、製剤はＦＤＡＯｆｆｉｃｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃｓの基準によって要求される滅菌性、発熱原性、全般的安全性および純度の基準に適合していなければならない。Ｉ．タンパク質精製本発明の特定の態様は、コードしたタンパタ質またはペプチドの精製、特定の実施形態では実質的な精製に関与する。本明細書で使用する「精製タンパク質またはペプチド」という用語は、タンパク質またはペプチドが、それが自然に得られる状態と比較して任意の程度に精製される、他の成分から単離可能な組成物を指すことが意図されている。したがって、精製タンパク質またはペプチドは、さらにそれが、自然に生じる可能性のある環境にないタンパク質またはペプチドを指している。一般に、「精製」は、分画にかけられて、様々な他の成分を取除いたタンパク質またはペプチド組成物であって、さらに実質的にそれらの発現された生物学的活性を残している組成物を指している。用語「実質的に精製された」の用語が使用される場合、これは、そのタンパク質またはペプチドが、例えば組成物中の約５０％またはそれ以上のタンパク質を構成するような、その組成物の主要な成分を形成する組成物を指している。タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量するための種々の方法は、本発明の開示を考慮して当業者にとって既知である。例えば、これらには、活性画分の特定の活性を決定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により画分内のポリペプチドの数を評価することが含まれる。画分の純度を評価するための好ましい方法は、その画分の比活性を計算し、当初の抽出物の比活性と比較して、本明細書の「一倍の精製度」で評価される純度の程度を計算することである。もちろん、活性の量を表すのに使用される実際の単位は、精製後の選択される特定のアッセイ技術、そして発現タンパク質またはペプチドが、検出可能な活性を示すかどうかに依存する。タンパク質精製に使用するのに適切な種々の技術は、当業者にとって既知である。例えば、これらには、酢酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等を用いた、または熱変性、およびその後の遠心分離による沈澱；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびに上記およびその他の技術の組合せが挙げられる。当分野で一般的に知られているとおり、種々の精製工程を行う順序は、変えても、またはある種の工程を省略しても実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを製造する適切な方法であると信じられている。タンパク質またはペプチドが、必ずそれらの最も精製された状態で提供されなければならないという一般要件はない。実際、実質的にほとんど精製されていない産物でも、特定の実施形態で有用性を示すことが予期される。より少ない精製工程を組合せて使用することによって、または同じ一般的な精製スキームを様々な形態で活用することによって、部分的精製が達成される。例えば、ＨＰＬＣ装置を活用して行われるカチオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般に、低圧クロマトグラフィー系を利用した同じ技術の何倍もの精製を生じる。より低い程度の相対精製を示す方法は、タンパク質産物の総回収量に、または発現タンパク質の活性を維持する上で有利であり得る。ポリペプチドの移動は、様々なＳＤＳ／ＰＡＧＥの条件で、時に大きく変化しうる（Capaldiら、1977年）ことが知られている。したがって、様々な電気泳動条件下で、精製されたまたは部分的に精製された発現産物の見掛けの分子量は、変化しうることが理解される。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、ピークの並外れた鮮明度を示す非常に迅速な分離によって特徴付けられる。これは、非常に微細な粒子および高圧を使用して、適切な流速を維持することによって達成される。およそ数分、またはほとんど１時間で、分離を完了することができる。さらに、粒子が、非常に小さく、そしてぎっしり充填されているので、床容量の空隙容量の画分が非常に少量であるため、非常に少量のサンプルのみが、必要とされる。さらに、バンドが非常に狭くサンプルがほとんど希釈されていないため、サンプルの濃度は、非常に大きい必要はない。ゲルクロマトグラフィーまたは分子ふるいクロマトグラフィーは、分子サイズに基づいている特別な種類の分配クロマトグラフィーである。ゲルクロマトグラフィーの背後にある理論は、小さな細孔を含む不活性物質の微細な粒子で製造されたカラムにより、分子のサイズによって、細孔を通過またはその周辺にあるときに大きな分子が小さな分子から分離されるということである。粒子が製造される材料が、分子を吸着しない限り、流速を決定する唯一の因子は、サイズである。したがって、形状が比較的一定である限り、カラムから溶出される分子のサイズは小さくなっている。分離が、ｐＨ、イオン強度、温度等のような全ての他の因子から独立しているので、ゲルクロマトグラフィーは、様々のサイズの分子を分離するのに卓越している。実質的に吸着もなく、領域の拡散もほどんどなく、そして溶出量は単純に分子量に関連する。アフィニティークロマトグラフィーは、単離されるべき物質と、それが特異的に結合できる分子との間の特異的なアフィニティーに依るクロマトグラフィーの手段である。これは、受容体-リガンド型作用である。カラム材料は、不溶性マトリックスに結合相手の内の１つを共有結合的に結合させることによって合成される。その後、カラム材料は、その溶液から物質を特異的に吸着できる。溶出は、結合が生じないものに対する条件を変えること（ｐＨ、イオン強度、温度等を変える）によって生じる。炭化水素含有化合物の精製に有用な特定の型のアフィニティークロマトグラフィーは、レクチンアフィニティークロマトグラフィーである。レクチンは、多様な多糖類および糖タンパク質に結合する物質のクラスである。レクチンは、通常、臭化シアンによってアガロースに結合される。セファロースに結合されたコンコナバリンＡは、この種で最初に使用された材料であり、そしてヒラマメのレクチンを含めた多糖類および糖タンパク質の他のレクチン、Ｎ−アセチルグルコサミニル残基の精製に有用であった麦芽凝集素、およびヘリックスポマチア（Helix pomatia）のレクチンの単離に広く使用されてきた。レクチン自体は、炭化水素リガンドを有するアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製される。ラクトースは、ヒマの実および落花生からレクチンを精製するのに使用された。マルトースは、ヒラマメおよびタチナタマメからレクチンを抽出するのに有用であった。Ｎ−アセチル−Ｄガラクトサミンは、大豆からレクチンを精製するために有用である。Ｎ− アセチルグルコサミニルは、麦芽から得たレクチンと結合する。Ｄ−ガラクトサミンは、二枚貝から得られるレクチンを得る際に使用され、Ｌ−フコースが、ハスから得たレクチンと結合する。マトリックスは、それ自体では、任意のかなりの範囲まで分子を吸着せず、そして広範な化学的、物理的そして熱安定性を示す物質である。リガンドは、その結合特性に影響を及ぼさないような方法で結合される。リガンドは、さらに比較的密着した結合を提供する。そして、サンプルまたはリガンドを破壊することなく、物質を溶出することが可能である。アフィニティークロマトグラフィーの最も一般的な形態の内の１つは、免疫アフィニティークロマトグラフィーである。Ｌ．バイオリアクターでの細胞の使用生物学的に活性なポリペプチドを産生する能力は、製薬産業においてますます重要になっている。本発明は、例えば細胞中における腫瘍サプレッサー遺伝子の効率的な調節発現のための組成物および方法であって、それにより、それまで不応性であった細胞型からin vitroでこれらのタンパク質を産生させる組成物および方法を開示する。過去十年にわたって、バイオテクノロジーの進歩によって、細菌、酵母、昆虫細胞から、そして哺乳類細胞の培養物から重要なタンパク質および因子が産生された。哺乳類の培養物は、より高等でない生命形態から由来する培養物よりも、ジスルフィド依存性折りたたみおよびグリコシル化のような、翻訳後に複合体タンパク質構造を処理する能力において有利である。実際、哺乳類細胞培養物は、現在、ヒトおよび動物の薬品、特に比較的大きく、複雑で、グリコシル化されているものに使用するための多数の重要なタンパク質の好ましい源である。医薬品の生産のための哺乳類細胞培養物の開発は、哺乳類細胞培養物で非常に効率的なベクター系の設計および構築、一連の有用な選択マーカー、遺伝子増幅スキーム、および最終的なの生物学的に活性な分子を導入ベクターから産生させるのに関与した生化学および細胞の機構のさらに広範囲にわたる理解のための分子生物学の技術での開発によって大いに助けられた。しかし、異種タンパク質を発現するための細胞型の伝統的な選択は、一般に、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｃ１２７細胞および黒色腫細胞のようなより「一般的な」細胞型に限定された。これらの細胞型について多くの以前から存在する文献が存在した、またはペプチド産物を発現するために努力が払われたときにこれらの細胞が簡便に実験室で行われるものであったので、多くの場合においてこれらの細胞型が選択された。細胞系を発現系用の宿主として選択する以前は、下流（例えば、Ｔ−７５フラスコを越えて）側の製造の規模拡大に影響を及ぼす因子はよく考慮されなかった。本発明の態様は、最近利用可能なバイオリアクター技術と共に、哺乳類細胞の生化学的および細胞の許容量を利用する。バイオリアクターにおいて本発明による細胞を成長させることで、育成用培地への、完全な生物学的に活性なポリペプチドである複合体の大規模産生および分泌が得られる。特定の実施形態では、低い複合体タンパク質含有率の特定の培地を設計することにより、そして力価が増大されるための培地への分泌の時間刺激のスキームを使用することにより、精製法は、大いに簡便化され、それにより生成コストを低減させることができる。１．足場依存性および非足場依存性培養動物およびヒトの細胞は、２つの様式(つまり培養の全容量にわたり懸濁液中で自由に成長する非足場依存性細胞として、またはそれらの増殖のためには固形基質への付着（すなわち、単層型の細胞成長）を必要とする足場依存性細胞として)in vitroで増殖させることができる。連続した樹立細胞系から得られる非足場依存性培養物または懸濁培養物は、細胞および細胞産物の大規模産生の最も広範に使用される手段である。微生物（細菌および酵母）の発酵技術に基づいた大規模な懸濁培養は、哺乳類細胞産物の製造にとって明らかに有利である。そのプロセスは、操作および規模拡大することが比較的容易である。相同な条件を、温度、溶解酸素およびｐＨの正確な監視および制御を付与するリアクターで得ることができ、そしてその培養の代表的サンプルが採取できることを保証する。しかし、懸濁培養細胞は、生物の産生に常に使用されるわけではない。懸濁培養は、依然として腫瘍形成の潜在力を示すと考えられ、そしてその結果、産生用の基質としてそれらを使用を限定する、ヒトおよび獣医学用途で生じる産物の使用を限定する（Petricciani、1985年、LarssonおよびLitwin、1987年）。足場依存性培養と対照的に、懸濁培養で増殖されるウイルスは、時に、ウイルスマーカーで迅速な変化を引き起こし、それにより免疫原性を減少させる（Bahnemann、1 980年）。最終的に、しばしば、組換え細胞系でさえ足場依存性培養として増殖された場合には、懸濁液中の同じ細胞系と比較して相当に多量の産物を分泌することができる（NilssonおよびMosbach、1987年）。これらの理由により、様々な型の足場依存性細胞が、様々な生物学的産物の産生に広範に使用される。本発明は、足場依存性の性質を持つ細胞を包含する。懸濁液で成長した足場依存性細胞は、互いに付着し、そして凝集物として成長し、結局は、培養条件にコア細胞が支持されなくなってしまうサイズに達すると各凝集の内部コアにある細胞を窒息死させる。したがって、異種タンパク質を分泌する細胞の許容性を効率的に利用するために、足場依存性細胞の大規模培養の効率的な手段も提供される。２．懸濁のためのリアクターおよびプロセス攪拌槽で哺乳類培養物の大規模懸濁培養を意図する。バイオリアクターの機器使用および制御は、関連微生物用途から発酵槽の設計によって適合させた。しかし、成長の遅い哺乳類培養における汚染制御の要求が高まっているという認識のもと、これらのリアクターの依存性を改善して、改善された無菌設計が実行された。機器使用および制御には、攪拌、温度、溶解酸素、およびｐＨ制御が含まれる。さらに進歩したプローブ、および濁度（存在する粒子の関数）、静電容量（存在する生存細胞の関数）、グルコース／乳酸、炭酸塩／重炭酸塩および二酸化炭素のオンラインおよびオフライン測定のための自動分析器も、利用可能である。懸濁培養中で得ることができる最大細胞密度は、約２〜４×１０⁶細胞／ｍｌ（ｍｌ当たり１ｍｇ重量の乾燥細胞未満である）の培地で比較的低く、これは微生物発酵で達成される数より十分に低い。２つの懸濁培養リアクター設計は、それらの操作の簡便性および強靭さのため、産業で最も広範に使用される：攪拌リアクターおよび通気リアクター。攪拌リアクター設計は、インターフェロンの生成用に８０００リットル容量の規模で首尾よく使用された（Phillipsら、1985年、Mizrahi、1983年）。細胞は、１：１から３：１の高さ対直径の比を示すステンレス鋼槽で育成される。培養物は、通常、ブレードディスクまたは海洋プロペラパターンに基づいた１つまたはそれ以上の攪拌器で混合される。ブレードより剪断力が低い攪拌器系が記載されている。攪拌は、磁気的に連結した駆動装置によって直接的または間接的に駆動することができる。間接駆動装置は、攪拌シャフトの封を介した微生物汚染の危険を減少する。微生物発酵のために当初に記述され、そして後に哺乳類培養に適合された通気リアクターは、培養物の混合および酸素処理のために依存する。気流は、リアクターの切断区分に入り、そして循環駆動する。気体は、培養表面で解放し、それにより気泡を含まないより濃密な液体をリアクターの降水管部まで下向きに輸送させる。この設計の主要な利点は、単純性、および機械的混合の不必要性である。典型的に、高さ対直径比は、１０：１である。通気リアクターの規模拡大は、比較的容易に、気体の大量移動が良好であり、そして比較的低い剪断力を生じる。ほとんどの大規模懸濁培養は、操作および規模拡大が最も容易であるので、バッチまたは供給バッチプロセスとして処理される。しかし、ケモスタットまたは灌流原理に基づいた連続プロセスが利用可能である。バッチプロセスは、典型的な成長プロフィールが見られる閉鎖系である。誘導期は、指数、定常および衰退期に続く。このような系では、栄養が枯渇させられ、そして代謝物が蓄積するために、環境は連続的に変化する。これは、細胞成長および生産性に影響する因子の分析を行い、そしてしたがって、複雑な作業であるプロセスの最適化を行う。主要な栄養供給を制御して成長サイクルを延長することによって、バッチプロセスの生産性は増大されうる。このような補給バッチプロセスは、細胞、産物および廃棄物が除去されないので、依然として閉鎖系である。依然として閉鎖系であるものとして、培養への新鮮な培地の灌流が、微細メッシュ回転フィルターに細胞を維持し、そして回転させて、凝固を防止することによって達成できる。回転フィルター培養は、およそ５×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密度を生じうる。真の開放系および最も基本的な灌流プロセスは、培地の流入と細胞および産物の流出とがあるケモスタットである。培養用培地は、細胞の最大限の特定の成長速度より低い値に培養の希釈速度を維持するような所定の且つ一定の速度リアクターに供給する（リアクターから細胞塊が洗い流されるのを避けるために）。細胞、細胞産物および副産物を含有する培養液体を、同じ速度で除去する。これらの灌流系は、哺乳類細胞培養からの産生用の市販用途にはない。３．非灌流付着系伝統的に、足場依存性細胞培養は、小さなガラス製またはプラスチック製容器の底で増殖させる。古典的でかつ従来の技術によって得られた、実験室規模に適切な、制限的表面対容積比は、大規模な細胞および細胞産物の産生で行き詰まった。少量培養容積で、細胞成長についての大型の評価しうる表面を供する系を提供するために、多くの技術が提案された。すなわち、ローラボトル系、重層プレート増殖器、螺旋フィルムボトル、中空ファイバー系、充填床、プレート交換系、および膜管状リール。これらの系は、その特性において相同でなく、かつしばしば複数プロセスに基づいているので、それらは、しばしば、規模拡大能力の限界、細胞サンプルを採取する際の困難さ、計を測定および制御能力の限界、ならびに培養を通して相同な環境条件を維持する上での困難さを示す。これらの系の一般に使用されるプロセスは、ローラーボトルである。大型で、形が異なるＴ型フラスコのようなもので、この系は簡単なため非常に依存性があり、したがって魅力がある。１日当たり数千のローラーボトルを扱える完全に自動化されたロボットが利用可能であり、そうでなかった場合に要求される極度のヒトの操作に伴う汚染および不一致の危険を排除できる。頻繁な培地の交換で、ローラーボトル培養は、０．５×１０⁶細胞／ｃｍ²(１０⁹細胞／ボトルまたは１０⁷細胞／ｍｌの培養用培地に対応)に近い細胞密度に達することができる。４．微細担体での培養 Van Wezel（1967年）は、微細担体培養系の概念を発展させた。この系では、ゆっくりとした通気によって、育成用培地に懸濁された小さい固形粒子の表面に、細胞を増殖させた。細胞は、微細担体に付着し、そして微細担体の表面が密集するまで徐々に成長する。実際に、この大規模培養系は、単層および懸濁培養の両方が一緒に行われた単一ディスクプロセスからユニットプロセスまでの付着依存性培養を高める。したがって、成長する細胞に必要な表面を、均質な懸濁培養の利点と組合せると、産生が増大する。微細担体培養の利点は、他の足場依存性の大規模培養法のほとんどを数倍上回ることである。第一に、微細担体培養は、高い表面対容積比（担体濃度の変化によって変化する）を有し、高い細胞密度収量および高度に濃縮された細胞産物を得る能力を導く。培養が、灌流リアクター様式で増殖された場合に、細胞収量は、１〜２×１０⁷細胞／ｍｌまで達した。第二に、細胞は、多くの小さな低生産性容器（すなわち、フラスコまたは皿）を使用する代わりに、単一ユニットのプロセス容器で増殖することができる。これは、培養用培地のはるかによい活用および相当の節約になる。さらに、単一リアクターでの増殖は、装置空間の必要性に、そして細胞当たりに必要とされる操作段階の数に減少に至り、それにより労働力および汚染の危険を減少させる。第三に、十分に混合し、そして均質な微細担体懸濁培養は、環境条件（例えば、ｐＨ、ｐＯ₂、および培地成分の濃度）を監視し、そして制御することを可能にし、それにより、さらに再生可能な細胞増殖および産物回収に至る。第四に、顕微鏡観察、化学的試験または列挙用の代表的サンプルを採取することができる。第五に、微細担体は、容易に懸濁液から沈澱するので、補給バッチプロセスの使用または細胞の収穫は、比較的容易に行える。第六に、微細担体での足場依存性培養増殖の様式により、タンパク質分解酵素を使用しない細胞転移、細胞の共培養、動物への移植、および微細担体保持のための分留装置、カラム、流動床、または中空ファイバーを用いた培養物の灌流のような他の細胞増幅においてもこの系を使用することができる。第七に、微細担体培養は、懸濁液中で微生物および動物細胞の培養に使用される従来の装置を用いて比較的容易に規模拡大される。５．哺乳類細胞の微細封入哺乳類細胞を培養するのに特に有用であることが示された１つの方法は、微細封入である。哺乳類細胞は、半透過性ヒドロゲル膜の内側に残される。多孔性膜が、カプセルを取囲むバルク培地との栄養、気体および代謝産物の交換を許す細胞の周囲に形成される。穏やかで迅速そして無毒であり、そして生じた膜が、培養期間を通して成長細胞塊を維持するのに十分に多孔性であり、強力である場合の数種の方法が開発された。これらの方法は、すべて、カルシウム含有溶液と飛沫接触によってゲル化された可溶性アルギネートに基づいた。Lim(米国特許第4,321,883号)は、小さなオリフィスを強制的に通され、それによって飛沫を形成し、そしておおそ１％の塩化カルシウム溶液に自由に侵入できるアルギン酸ナトリウムのおよそ１％の溶液で濃縮された細胞を記述した。その後、飛沫は、表面アルギネートにイオン結合するポリアミノ酸の層に捕捉される。最後に、飛沫をキレート化剤で処理して、カルシウムイオンを除去することによって、アルギネートを再液体化する。他の方法は、アルギネート溶液に滴下されるべきカルシウム溶液中の細胞を使用し、それにより中空アルギネート球を作り出す。同様のアプローチ法は、アルギネートに滴下されたキトサン溶液中の細胞に関与し、それにより中空球を作り出す。微細封入細胞は、攪拌槽リアクターで容易に増殖され、そして直径１５０−１５００ｍｍの範囲内にあるビーズサイズで、微細メッシュスクリーンを用いた灌流リアクターに容易に保持される。総培地容積に対するカプセル容積の比は、１：２〜１：１０の密度で維持できる。１０⁸に達する封入体内細胞密度で、培養物内の有効な細胞密度は、１〜５×１０⁷である。他のプロセスを越えた微細封入の利点としては、散布および攪拌により生じる剪断圧の害ある影響からの保護、灌流系を使用する目的のビーズを容易に維持する能力が含まれ、規模拡大は、比較的容易であり、そして注入用のビーズを使用する能力が含まれる。６．灌流付着系灌流は、（生理学的栄養溶液の）細胞の集団の内部または上方における安定な速度での連続流を指している。それは、回収した培地で細胞を洗い出す連続フロー培養（例えば、ケモスタット）と対照的に細胞単位内に細胞を保持することを含む。灌流の概念は、今世紀の初頭以来知られており、そして組織の小片を広範な顕微鏡観察に目に見えたままにしておくために使用された。その技術は細胞が、血液、リンパ球、または他の体液で連続的に供給される生体内で細胞環境を模倣するために始められた。灌流なしでは、培養物中の細胞は、供給相と飢餓相の変化を通過し、それによりそれらの成長の十分な発現および代謝能力が制限される。灌流培養の最近の用途は、細胞を高い密度（すなわち、０．１−５×１０⁸ 細胞／ｍｌ）に育成することである。２−４×１０⁶細胞／ｍｌ（または２×１０⁵細胞／ｃｍ²）を越えて密度を増大させるために、培地は、栄養的欠損を埋め合わせ、そして毒性産物を除去するために一定して新たな供給に交換されなければならない。灌流は、培養環境（ｐＨ、ｐＯ₂、栄養レベルなど）のより良好な制御を可能とし、そして細胞付着のために培養内の表面領域の利用を顕著に増大させる手段である。微細担体および微細封入培養は、灌流リアクターに容易に適合されるが、上に特記されるとおり、これらの培養方法は、１０⁸細胞／ｍｌより上の細胞密度の需要を満たす能力を欠く。このような密度は、培地中で高い生産物力価（下流プロセシングを促進する）、より小さい培養系（施設の必要性を低下させる）、およびより良い培地の利用（血清および他の高価な添加剤で節約を生む）の利点を与える。高い密度での細胞を支持するには、非均一性の発生を避けるのに有効な灌流技術を必要とする。本発明の細胞は、選択された培養方法とかかわりなく、タンパク質生産に、そしてインビトロ細胞アッセイ用の細胞として、そして医薬開発プロトコールの一部としてスクリーニングに利用できる。Ｊ．キット本発明の様々の実施形態のために必要とされる基本的材料および試薬全ては、キットをまとめて組み立てられる。キットの成分が、１つまたはそれ以上の液体溶液に与えられる場合、液体溶液は、好ましくは水性溶液であり、それに無菌の水溶液が特に好ましい。インビボ用途に対しては、本発明の組成物は、単一のまたは別々の製薬上許容される注入可能な組成物に調製される。この場合に、容器手段は、それ自体、吸入剤、シリンジ、ピペット、点眼器、または他のそのような装置であり、それらからその組成物は、肺のような体の感染領域に適用され、動物に注射され、あるいは、キットに適用されるか又は他の成分と混合されうる。キットの成分は、さらに乾燥または凍結乾燥形態で提供することもできる。試薬または成分が、乾燥形態として提供される場合、再組成は、一般に、適切な溶媒を添加することによる。溶媒は、別の容器手段で提供されることもあると想像される。本発明のキットは、遺伝子療法および／または化学療法剤の投与を規定する指示シートを包含することもできる。本発明のキットは、典型的には、注射または、その中に望みのバイアルが保持される吹込み成形プラスチック製容器のような市販されている密閉なバイアルを含むための手段をも包含できる。容器の数または型にかかわりなく、本発明のキットは、注射／投与、または動物の体内に最終の複合体組成物を配することを助けるための装置を含むか、またはそれと一体化されうる。このような装置は、吸入剤、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器または他の任意のそのような医療上認可された送達ベヒクルでありうる。さらに、キット成分の用途についての指示が一般に含まれる。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するために含まれる。続く実施例で開示される技術は、本発明の実施に十分に機能を果たす、発明者に開示される技術を表し、それにより、それを実施するための好ましい状況を構成すると考えられることは当業者に予測される。しかし、本発明の開示に鑑みて、当業者は、多くの変更が、開示される特定の実施形態で行うことができ、そして依然として、本発明の概念および範囲から逸脱することなく、類似または同様の結果を得ることを認識する。実施例１ＲＢタンパク質の改変Ａ．Ｎ末端切断ｐＲＢタンパク質を発現するＲＢｃＤＮＡの構築種々のＮ末端欠失を有する改変型ＲＢｃＤＮＡの構築について、一連のＰＣＲ^TM プライマーを設計し、ＲＢｃＤＮＡの配列にしたがって合成した。センスプライマーを、欠失Ｎ末端配列の下流のＲＢｃＤＮＡ配列によって決定した。全てのプライマーは、５’−末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（下線付き）およびＡＴＧ（イタリック体）が後に続くコンセンサスＫｏｚａｋカセット（ＧＣＣＧＣＣ）を含有する。センスプライマーの完全なヌクレオチド配列は、以下のとおりである。５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＧＧＡＣ−３’(ＯＭＲｂＳｄ２−３４、配列番号１４)、５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＡＣＴＧＣＡＴＴＡＴＧＴＣＡＧ−３’(ＯＭＲｂＳｄ２−５５、配列番号１５)、５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＣＡＴＣＴＴＧＴＧＡＴ−３’(ＯＭＲｂＳｄ２−７８、配列番号１６)、５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＴＧＧＧＧＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＴＴ−３’(ＯＭＲｂＳｄ２−９７、配列番号１７)、５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＣＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧ−３’(ＯＭＲｂＳｄ１−１４７、配列番号１８)。アンチセンスプライマー５’−ＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＡＡＧＧ−３’ （ＯＭＲｂＡＳ３００、配列番号１３）は、ＲＢｃＤＮＡのヌクレオチド＋９００で（第一のフレーム内ＡＴＧのＡが、位置＋１と表される）ＥｃｏＲＩ部位（下線付き）と重なり合っている。アンチセンスプライマーは、テンプレートとしてプラスミドＦ７（全長ＲＢｃＤＮＡを含む）を用いて、様々な改変型５’−ＲＢｃＤＮＡフラグメントを増幅する上記の各センスプライマーと対をなした。各対のプライマーを用いたＰＣＲ^TMによる増幅の後、ＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして同じ酵素で切断されたプラスミドｐＣＭＶＲＢ¹¹⁰にサブクローニングした。アミノ酸２−３４（配列番号２８（核酸配列）および配列番号２９（アミノ酸配列））、２−５５（配列番号３０（核酸配列）および配列番号３１（アミノ酸配列））、２−７８（配列番号３２（核酸配列）および配列番号３３（アミノ酸配列））、２−９７（配列番号３４（核酸配列）および配列番号３５（アミノ酸配列））、および１−１４７（配列番号３６（核酸配列）および配列番号３７（アミノ酸配列））に対応するＮ末端欠失を有する改変型ＲＢｃＤＮＡを担持する生成した発現プラスミドは、それぞれ、ｐＣＭＶＲＢｄ_2-34（野生型ＲＢタンパク質のアミノ酸２から３４までの欠失）、ｐＣＭＶＲＢｄ_2-55（野生型ＲＢタンパク質のアミノ酸２から５５までの欠失）、ｐＣＭＶＲＢｄ_2-78（野生型ＲＢタンパク質のアミノ酸２から７８までの欠失）、ｐＣＭＶＲＢｄ_2-97（野生型ＲＢタンパク質のアミノ酸２から９７までの欠失）、およびｐＣＭＶＲＢｄ_1-147（野生型ＲＢタンパク質のアミノ酸１から１４７までの欠失、アミノ酸１４８は、メチオニンである）と名づけられた。Ｂ．内部欠失または突然変異を有するＲＢｃＤＮＡの構築異なる内部欠失または突然変異を有するＲＢｃＤＮＡを担持する全部で７つのｐＲＢ発現プラスミド、すなわちｐＣＭＶＲＢｄ_31-107（野生型ＲＢタンパク質のアミノ酸３１から１０７までの欠失）、ｐＣＭＶＲＢｄ_77-107（野生型ＲＢタンパク質のアミノ酸７７から１０７までの欠失）、ｐＣＭＶＲＢｄ_111/112（アスパラギン酸からグリシンへの、野生型ＲＢタンパク質のアミノ酸１１１の突然変異、およびグルタミン酸からアスパラギン酸へのアミノ酸１１２の突然変異）、ｐＣＭＶＲＢｄ_111-181（野生型ＲＢタンパク質のアミノ酸１１１から１８１までの欠失）、ｐＣＭＶＲＢｄ₁₁ _1-241 （野生型ＲＢタンパク質のアミノ酸１１１から２４１までの欠失）、ｐＣＭＶＲＢｄ_181-241（野生型ＲＢタンパク質のアミノ酸１８１から２４１までの欠失）およびｐＣＭＶＲＢｄ_242-300（野生型ＲＢタンパク質のアミノ酸２４２から３００までの欠失）を構築した。ｐＣＭＶＲＢｄ_31-107の構築に対しては、ヌクレオチド位置＋３２５から＋９１０から得たＲＢｃＤＮＡフラグメントを、プライマー５’−ＧＣＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＴＡＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＣＧＴＴＣ−３’(配列番号１９)およびＯＭＲｂＡＳ３００（配列番号１３）を用いてＰＣＲ^TMによってプラスミドＦ７から増幅した。このＲＢｃＤＮＡフラグメントを、Ｂｓｕ３６Ｉ（下線付き）およびＥｃｏＲＩ（ＯＭＲｂＡＳ３００）で消化し、そして同じ酵素で消化したプラスミドｐＣＭＶＲＢ¹¹⁰に挿入して、ヌクレオチド＋９１から＋９００までの元のＲＢｃＤＮＡフラグメントを置換した。ｐＲＢΔ３１−１０７の核酸配列は、配列番号３８であり、そして対応のアミノ酸配列は、配列番号３９である。ｐＣＭＶＲＢｄ_77-107の構築に対しては、ＲＢｃＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド＋３２８から＋９１０まで）を、オリゴヌクレオチド５'−ＧＣＧＧＴＴＡＡＣＣＣＴＡＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＣＧＴＴＣＡＣＴ−３'（配列番号２０）およびＯＭＲｂＡＳ３００（配列番号１３）を用いてＰＣＲ^TMによってプラスミドＦ７から増幅し、続いてＨｐａＩ（下線付き）およびＥｃｏＲＩで消化した。増幅した消化フラグメントを、同じ酵素で消化したプラスミドｐＣＭＶＲＢ¹¹⁰ に挿入して、ヌクレオチド＋２３０から＋９００までからＲＢｃＤＮＡフラグメントを置換した。ｐＲＢΔ７７−１０７の核酸配列は、配列番号４０であり、そして対応のアミノ酸配列は、配列番号４１である。ｐＣＭＶＲＢｍ_111/112の構築に対しては、２対のプライマーを用いて、アスパラギン酸（ＧＡＴ）のコドンをグリシン（ＧＧＴ）に変えるために、ヌクレオチドＡ（野生型ＲＢタンパク質の位置＋３３２）をＧに変え、それにより新たな制限酵素部位ＡｖｒＩＩを作り出し、そしてグルタミン酸（ＧＡＧ）のコドンをアスパラギン酸（ＧＡＴ）に変えるためにヌクレオチドＧ（野生型ＲＢＤＮＡの位置＋３３６）をＴに変えた。第一の対のプライマーは、５'−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＴＣＡＴＧＣＣＧＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＣＣＧＡ−３'（ＯＭＲＢＳＬ配列番号２１）および５'ＣＴＣＡＣＣＴＡＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＡＴ−３'（ＯＭＲｂＡＳ３３２、配列番号２２、突然変異塩基は太字である）である。第二の対のプライマーは、５'ＧＴＴＧＡＣＣＴＡＧＧＴＧＡＴＡＴＧＴＣＧＴＴＣ−３'（ＯＭＲｂＳ３３２、配列番号２３、突然変異塩基は太字である）およびＯＭＲｂＡＳ３００（配列番号１３）である。ＯＭＲＢＳＩとＯＭＲｂＡＳ３３２で増幅したＰＣＲ^TM産物を、ＨｉｎｄＩＩＩとＡｖｒＩＩ（下線付き）で消化し、そしてＯＭＲｂＳ３３２とＯＭＲｂＡＳ３００で増幅されたものを、ＡｖｒＩＩとＥｃｏＲＩで消化した。これらのフラグメントを一緒に、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＣＭＶＲＢ¹¹⁰にライゲートして、対応の野生型ＲＢｃＤＮＡ配列に置換した。ｐＲＢｍ１１１／１１２の核酸配列は、配列番号５０であり、そして対応のアミノ酸配列は、配列番号５１である。ｐＣＭＶＲＢｄ_111-181の構築に対しては、ＲＢｃＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド＋５４３から＋９１０まで）を、オリゴヌクレオチド５'ＧＣＧＣＣＴＡＧＧＡＴＣＴＡＣＴＧＡＡＡＴＡＡＡＴＴＣＴＧＣＡ−３'（配列番号２４）およびＯＭＲｂＡＳ３００（配列番号１３）を用いてＰＣＲ^TMによってプラスミドＦ７から増幅し、続いてＡｖｒＩＩ（下線付き）およびＥｃｏＲＩで消化した。その後、このフラグメントを、同じ酵素で消化したｐＣＭＶＲＢｍ_111/112にライゲートして、ヌクレオチド＋３３１から＋９００までから得たＲＢｃＤＮＡフラグメントに置換した。ｐＲＢΔ１１１−１８１の核酸配列は、配列番号４２であり、そして対応のアミノ酸配列は、配列番号４３である。ｐＣＭＶＲＢｄ_111-241の構築に対しては、ヌクレオチド＋１から＋３３１までを含む５’ＲＢｃＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩとＡｖｒＩＩによるｐＣＭＶＲＢｍ₁₁₁の消化によって得た。ヌクレオチド＋７２２から始まる３’ ＲＢｃＤＮＡフラグメントを、ＰｖｕＩＩとＢａｍＨＩで消化した同じプラスミドから単離した。その後、２つのＤＮＡフラグメント（フレーム内）を、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＶ−Ｇにライゲートした。ｐＲＢΔ１１１−２４１の核酸配列は、配列番号４４であり、そして対応のアミノ酸配列は、配列番号４５である。ｐＣＭＶＲＢｄ_181-241の構築に対しては、ヌクレオチド位置＋１から＋５３８を含む５’−ＲＢｃＤＮＡフラグメントを、プラスミドＦ７をテンプレートとして使用して、プライマーＯＭＲＳＢ１（配列番号２１）および５'−ＣＣＣＧＡＴＡＴＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＴＧＴＧＴＣＡＡＡＴＡ−３'（配列番号２５）を用いてＰＣＲ^TMによってプラスミドＦ７から増幅した。得られたＲＢｃＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶ（下線付き）で切断し、そしてｐＣＭＶＲＢ¹¹⁰に挿入して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕＩＩ部位の間の元の５’ＲＢｃＤＮＡフラグメントに置換した。ｐＲＢΔ１８１−２４１の核酸配列は、配列番号４６であり、そして対応のアミノ酸配列は、配列番号４７である。ｐＣＭＶＲＢｄ_242-300の構築に対しては、プライマーＯＭＲＢＳ１（配列番号２１）および５'−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＴＡＴＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡ−３'（配列番号２６）を使用して、プラスミドＦ７をテンプレートとして用いてヌクレオチド＋１から＋７２２を含む５’ＲＢｃＤＮＡフラグメントを増幅した。増幅産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ（下線付き）で消化し、そして同じ酵素で消化したｐＣＭＶＲＢ¹¹⁰ に挿入して、ヌクレオチド＋１から＋９００までから得た元の５’ＲＢｃＤＮＡフラグメントに置換した。ｐＲＢΔ２４２−３００の核酸配列は、配列番号４８であり、そして対応のアミノ酸配列は、配列番号４９である。Ｃ．Ｎ末端改変型ＲＢタンパク質の特徴づけＲＢ欠損膀胱癌腫セルライン５６３７を、ＣＭＶプロモーターによって起動される改変型ＲＢｃＤＮＡを担持する発現プラスミドでトランスフェクトした。変異体ｐＲＢの生物学的機能を、トランスフェクション後腫瘍細胞の免疫細胞化学的染色および［³Ｈ］−チミジンｉｎｓｉｔｕ標識に関する組合せた技術によって評価した（Ｘｕら、１９９４年ａ、１９９４年ｂ）。腫瘍細胞を、テトラサイクリンを含む培地にあるカバーガラスの上に種付けし、そしてｐＲＢ⁹⁴、ｐＲＢ¹¹⁰または他の変異体ＲＢタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。培養用培地からテトラサイクリンを除去した後の特定の時点で、その細胞を、２時間、３７℃で、１０μＣｉ［³Ｈ］メチレンチミジン（イリノイ州アーリントンハイツ（ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）のアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を含む１ｍｌの新鮮な培地でインキュベートし、その後、固定し、そして先に記述されたとおり（Ｘｕら、１９９１年ａ、１９９１年ｂ）ＲＢタンパク質の発現のために、免疫化学的に染色した。続いて、染色したスライドを、ゼラチンの薄層で被覆し、そして３７℃で一夜乾燥させた。その後、スライドを、オートラジオグラフィーエマルジョン（タイプＮＴＢ２、ニューヨーク州ローチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）のイーストマンコダック（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ））で上塗りし、そして２日間照射した。現像後、スライドを光学顕微鏡で試験した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、上に記述されるとおりＲＢタンパク質の免疫細胞化学的染色および［³Ｈ］チミジン取込みアッセイについて進行させた。結果は、表５に示される。５５アミノ酸残基までが、ｐＲＢのＮ末端から欠失されたとき、ＤＮＡ合成は、全長ＲＢタンパク質を発現する細胞に比較して変異体ｐＲＢ発現プラスミドでトランスフェクトされた細胞では明らかには減少しなかった。しかし、もう２３アミノ酸が、Ｎ末端から除去された場合、細胞のＤＮＡ合成は、切断ｐＲＢの発現によって劇的に抑制された。表５で示されるとおり、アミノ酸５５と１８１の間に任意の欠失を有するｐＲＢ変異体は、腫瘍細胞に導入された後ＤＮＡ合成を顕著に阻害する。特徴の中でも、全長ｐＲＢ発現プラスミドでトランスフェクトされた細胞よりいっそう効果的であったが、アミノ酸１８１と２４１との間のみに欠失を含むｐＲＢでトランスフェクトされた細胞は、アミノ酸５５と１８１との間に欠失を担持するｐＲＢを発現するプラスミドでトランスフェクトしたものより弱いＤＮＡ合成の阻害を示した。したがって、このデータに鑑みれば、特定の上述の欠失、例えばアミノ酸１とアミノ酸２４１との間の欠失を組合せる改変は、類似の顕著なＤＮＡ合成阻害活性を示すと予測される。さらに、各々、アミノ酸２および３４の間と、アミノ酸７６および１１２の間のいずれかに２つの欠失を有する２つのｐＲＢ変異体は、野生型ＲＢと比較してＤＮＡ合成を顕著に阻害した。結果は、推定Ｎ末端ドメインの境界が、おそらくはアミノ酸１８２および３００、よりおそらくはアミノ酸１８２および２４１の間にあることを示した。さらに、アスパラギン酸をグリシンに置換する、アミノ酸位置１１１に点突然変異を担持するｐＲＢは、ＤＮＡ合成を顕著に抑制し、さらにこの領域が、ｐＲＢ機能を調節するのに不可欠であることが示唆された。実施例２テトラサイクリン応答性遺伝子発現系でのＶＰ１６トランス作用活性ドメインの発現を制御するＣＭＶプロモーター／エンハンサーの改変上記の改変型レチノブラストーマ遺伝子およびタンパク質は、それに限定されるものではないが遺伝子療法を含めた、多くの実施利用性を有する。これらの実施形態について、発現系が必要とされる。上記のもののような系が、特定の実施形態に適切である一方で、それらは、細胞毒性構築物を用いた遺伝子療法に関してある種の欠点を示す。ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（１９９２年）の元のテトラサイクリン応答性遺伝子発現系は、魅力的な系であるが、細胞成長における抑圧効果（ＧｉｌｌおよびＰｔａｓｈｎｅ、１９８８年）のようなある種の障害を示す。これらおよび他の障害を克服するために、発明者らは、テトラサイクリン応答性遺伝子発現系を改善した。元のテトラサイクリンのレプレッサー／オペレーターに基づく調節系は、２つのプラスミドｐＵＨＤ１５−１およびｐＵＨＣ１３−３（米国特許第５，４６４，７５８号、ここに参照して組込まれる、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、１９９２年）から構成される。ｐＵＨＣ１３−３は、ｔｅｔオペレーター配列が、ＴＡＴＡボックスの上流に挿入されているハイブリッド最小ヒトＣＭＶプロモーターを含むテトラサイクリン（Ｔｃ、ｔｅｔ）感受性発現ベクターである。ｐＵＨＤ１５−１は、野生型ＣＭＶプロモーターによって駆動される発現を伴った、テトラサイクリン応答性トランスアクチベーター（ｔＴＡ）をコードする配列を含有する。この系を用いた一過性の実験では、発明者らは、効果的に可逆移入遺伝子発現が、研究された多くの腫瘍セルラインで観察されることが分かった。しかし、テトラサイクリン応答性手段でレポーター遺伝子を発現する長期のクローンを単離する試みは、成功しなかった。これは、ほとんど、その発現が、プラスミドｐＵＨＤ１５−１中の強力なＣＭＶプロモーター／エンハンサー配列によって駆動されるｔＴＡトランスアクチベーターの細胞内レベルが高いことによって引起こされるようであった。ｔＴＡトランスアクチベーターは、細胞成長において抑圧効果を示すことが知られているＶＰ−１６活性化ドメインを含む（ＧｉｌｌおよびＰｔａｓｈｎｅ、１９８８年）。したがって、この問題を解決し、そしてさらに系を改善するために、ｔＴＡ発現カセットは、元のｐＵＨＤ１５−１プラスミドにある強力なＣＭＶｐエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、１９８５年）を、１対の１９ｂｐの不完全直接反復配列（ＣＭＶｐエンハンサーの一部、配列番号５）に置換することによって最初に改変された。ｈＣＭＶプロモーター／エンハンサーの改変を、ｈＣＭＶプロモーターから得た５’エンハンサー配列の一部を除去することによって行った。３対のオリゴヌクレオチドプライマーを、ｈＣＭＶプロモーターの公表されている配列（Ｂｏｓｈａｒｔら、１９８５年）に基づいて設計した。ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位（下線付き）を、それぞれ、各々のセンスおよびアンチセンスオリゴの５’末端に加えた。センスオリゴは、それぞれ、５'−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＡＴＡＧＣＧＧ−３'（ＯＭＣＭＶｓｌ、配列番号６）、５'−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡ −３'（ＯＭＣＭＶｓ２、配列番号７）、および５'−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣ−３'（ＯＭＣＭＶｓ３、配列番号８）であり、そしてそれらは、同じアンチセンスプライマー５'−ＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣ−３'（ＯＭＣＭＶａｓ、配列番号９）を共有した。ＰＣＲ^TM増幅で使用されるテンプレートは、プラスミドｐＵＨＤ１５−１であった。ＯＭＣＭＶｓ１＋ＯＭＣＭＶａｓ、ＯＭＣＭＶｓ２＋ＯＭＣＭＶａｓおよびＯＭＣＭＶｓ３＋ＯＭＣＭＶａｓのプライマー対を用いたＰＣＲ^TM増幅は、それぞれ、２８２ｂｐ（すなわちｍｈＣＭＶｐ１）、２０３ｂｐ（ｍｈＣＭＶｐ２）および１６８ｂｐ(ｍｈＣＭＶｐ３)の長さを示す３つの短いバージョンのＣＭＶプロモーターを生じた。精製された短くなったＣＭＶプロモーター／エンハンサーフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで二重消化し、そしてｐＵＨＤ１５−１に挿入して、元のｈＣＭＶプロモーターを置換した。これは、３つの新規なｔＴＡ発現プラスミド、すなわちｐｍＣＭＶ１−ｔＴＡ、ｐｍＣＭＶ２−ｔＴＡおよびｐｍＣＭＶ３−ｔＴＡを生じた。このプロモーターの相対的強度を決定するために、プラスミドｐＵＨＤ１５− １と同様に、これらの新たに構築されたプラスミドにあるｔＴＡを、プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ−ＣＡＴ(Invitrogen，San Diego，CA)から得たクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ) に置換し、それによって４つのＣＡＴ発現プラスミド、ｐｍＣＭＶ１−ＣＡＴ、ｐｍＣＭＶ２−ＣＡＴ、ｐｍＣＭＶ３−ＣＡＴおよびｐＣＭＶ−ＣＡＴを生じた。これらのプラスミドで、ＣＡＴ発現は、それぞれ、ｍｈＣＭＶｐ１、ｍｈＣＭＶｐ２、ｍｈＣＭＶｐ３および全長のｍｈＣＭＶｐによって駆動される。改変ＣＭＶプロモーターの相対的活性を評価するために、ＣＡＴ発現プラスミドを、リポフェクチン法(メリーランド州ガイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）のライフテクノロジーズ(ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ))を介して３つのセルライン、腫瘍セルライン５６３７およびＳａｏｓ２、および胚の腎臓セルライン２９３に導入された。トランスフェクションの４８時間後、細胞溶解物を製造し、そしてＣＡＴ活性を、ストラタジーン（Stratagene）（カリフォルニア州ラホーラ（La Jolla、CA）のストラジーン（Stratagene））から得たＣＡＴのフラッシュアッセイキットによって測定した。図１に示されるとおり、エンハンサー配列が、部分的に除去された後に、プロモーターの活性は、３つのトランスフェクションセルライン全てで劇的に減少された。図１は、５６３７およびSaos−２セルラインでＣＡＴ活性のグラフ表現である。欠失されたエンハンサー配列が多ければ、残るプロモーターは弱くなる。最強から最も弱いほうへのプロモーターの活性の順番は、ｈＣＭＶ、ｍｈＣＭＶｐ１、ｍｈＣＭＶｐ２およびｍｈＣＭＶｐ３である。ｍｈＣＭＶｐ１の活性は、全長のｈＣＭＶプロモーターの１７．７％である一方で、ｍｈＣＭＶｐ３活性は、５６３７細胞にあるｈＣＭＶプロモーターのわずか３．３％である(図１)。改変プロモーターの相対的プロモーター活性を比較した後、ｍｈＣＭＶｐ１（配列番号５）が、改変テトラサイクリン調節可能な遺伝子発現系について選択された。ｍｈＣＭＶｐ１は、宿主細胞成長に抑圧効果を示さない、ヒト遺伝子療法で潜在的な用途として重要な特性である、最適なテトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｔＴＡ）発現を示した。実施例３単独プラスミド、テトラサイクリン調節ベクターの構築ＥＣ１２１４Ａと名づけられた単独のプラスミドベクターを構築した。このプラスミドは、１）宿主細胞成長においてテトラサイクリン応答性トランスアクチベーター（ｔＴＡ）の抑圧効果を排除する修飾ｔＴＡ発現カセット、２）プラスミドｐＵＨＣ１３−３から得たｔＴＡ依存性プロモーター、３）一般的イントロン配列、４）プロモーターおよびイントロンの下流にある複数のクローニング部位、および５）Ｇ４１８選択を可能にするｎｅｏ^R発現カセットを含む。この系での発現は、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体によって調節される。「テトラサイクリン類似体」とは、テトラサイクリンに密接に関連し、そして少なくとも１０⁶／Ｍの、好ましくは１０⁹／Ｍの、さらに好ましくは１０¹¹／Ｍの、少なくとも１つのアフィニティー（Ｋ_a）を有する、ｔｅｔリプレッサーに結合する多くの化合物のいずれかであると解釈される。限定するものではないが、そのようなテトラサイクリン類似体の例は、ＨｌａｖｋａおよびＢｏｏｔｈｅ（１９８５年）、Ｍｉｔｓｃｈｅｆ（１９７８年）、ザ・ノイー・デベロップメント・コーポレーション（the Noyee Development Corporation）（１９６９年）、Evans(１９６８年)およびDowling（１９５５年）に開示されたものであり、その各内容は、全て本明細書に組込まれる。プラスミドｐＭＬＳＩＳ．ＣＡＴ（Ｃｈｏｉら、１９９１年）は、ＩｇＧ成長可能領域から誘導された合成スプライスドナー／アクセプター配列だけでなく、三部分の最初のエキソンおよび第一の介在配列の一部を含む、アデノウイルス主要後期領域から得た５’未翻訳リーダーの一部から構成される一般的イントロン配列を含む。プラスミドｐＭＬＳＩＳ．ＣＡＴ中のイントロン配列を挟み、そしてそれぞれ（下線部分）ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位を含む、１対のオリゴヌクレオチド５'−ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧ−３'（配列番号１０）および５' −ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＧＣＡＧＴＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＡＧ−３'（配列番号１１）を合成した。ＰＣＲ^TMによる増幅の後、このイントロンフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、そしてプラスミドｐＵＨＤ１５−１中の対応の酵素部位に挿入した。続いて、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄIII、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位（プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫから得られた）を含む小さなＤＮＡ断片を、新規プラスミドのイントロン下流に挿入して、ｈＣＭＶプロモーター、一般的イントロン、複数クローニング部位およびＳＶ４０ウイルスから得られるポリアデニル化シグナルを含む発現ベクターを得た。この中間体ベクターは、ｐＣＭＶ−Ｇの名称が付与された。次いで、ｐＣＭＶ−ＧのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子ポリアデニル化シグナル配列に置換して、ｐＣＭＶ^*−Ｇ−ＴＫｐＡと称されるプラスミドを得た。プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）を、制限酵素ＮｒｕＩおよびＸｂａＩで二重消化させた。ＸｂａＩ消化から得た５’オーバーハングを、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント（メリーランド州ガイザースバーグのライフテクノロジーズ (ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)社）によって充填し、その平滑末端挿入物を、プラスミドｐｍＣＭＶ１−ｔＴＡ（実施例２）から得たｍｈＣＭＶ１−ｔＴＡを含むＤＮＡフラグメントにライゲートさせた。新規プラスミドを、ｐｍＣＭＶ１−ｔＴＡ．ｎｅｏと名づけた。最後に、ｔＴＡ依存性プロモーター、一般的イントロンおよびＴＫポリアデニル化シグナルを含有するＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＣＭＶ^*−Ｇ−ＴＫｐＡから単離し、そしてプラスミドｐｍＣＭＶ１−ｔＴＡ．ｎｅｏのＢｇｌII 部位に挿入して、ＥＣ１２１４Ａと称される、選択マーカー、ネオマイシン耐性遺伝子だけでなく、ｔＴＡ発現カセットおよびｔＴＡ依存性プロモーターの両方を担持するベクターを得た。実施例４単独のプラスミドテトラサイクリン陽性に誘導した（Ｔｅｔ−ｏｎ）ベクターの構築元のテトラサイクリンリプレッサー／オペレーター由来のｔｅｔ−ｏｎ系も、２つのプラスミド、ｐＵＨＤ１７−１ｎｅｏ（またはｐＵＨＤ１７２−１ｎｅｏ）およびｐＵＨＣ１３−３−３（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５年）から構成される。ｐＵＨＣ１３−３は、ｔｅｔオペレーター配列が、ＴＡＴＡボックスの上流に挿入されているハイブリッド最少ヒトＣＭＶプロモーターを含むテトラサイクリン感受性発現ベクターである。ｐＵＨＤ１７−１ｎｅｏまたはｐＵＨＤ１７２− １ｎｅｏは、野生型ＣＭＶプロモーターによって駆動される発現を伴った、逆相テトラサイクリン応答性トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）をコードする配列を含む。この系を用いた予備実験で、効果的な可逆移入遺伝子発現が、研究された多くの腫瘍細胞系で観察されることが分かった。元のテトラサイクリン系とは対照的に、発現は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンのようなテトラサイクリン類似体の存在下で始まる一方で、テトラサイクリンの不在下では停止される。しかし、ｒｔＴＡトランスアクチベーターは、細胞成長において抑圧効果を示すことが知られているＶＰ−１６活性化ドメインを含む（ＧｉｌｌおよびＰｔａｓｈｎｅ、１９８８年）。したがって、この問題を解決するため、そしてさらに系を改善するために、ｔｒＴＡ発現カセットをまず、ｐＵＨＤ１７−１ｎｅｏまたはｐＵＨＤ１７２−１ｎｅｏプラスミド中の強力なＣＭＶｐエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、１９８５年）を、１対の１９ｂｐの不完全直接反復配列（配列番号５）に変換することによって修飾した。ｈＣＭＶプロモーター／エンハンサーの修飾は、ｈＣＭＶプロモーター（実施例２）からの５’エンハンサー配列の一部を除去することによって行った。新たなｒｔＴＡ発現プラスミドは、ｐｍＣＭＶ１−ｒｔＴＡと名づけられた。ＥＣ１２１４Ｂと名づけられた単独プラスミドベクターを、ｐｍＣＭＶ１−ｒｔＴＡを用いて構築した。このプラスミドは、１）宿主細胞成長においてテトラサイクリン応答性トランスアクチベーター(ｒｔＴＡ)の抑圧効果を排除する修飾ｒｔＴＡ発現カセット、２）プラスミドｐＵＨＣ１３−３から得たｒｔＴＡ依存性プロモーター、３）一般的イントロン配列、４）プロモーターおよびイントロンの下流にある複数のクローニング部位、および５）Ｇ４１８選択を可能にするｎｅｏ^R発現カセットを含む。構築は、実施例３に概説されたように行った。実施例５レチノブラストーマ（ＲＢ）およびｐ５３テトラサイクリン制御ベクターの構築Ａ．誘導性ｐＲＢ¹¹⁰発現ベクターの構築誘導性ｐＲＢ¹¹⁰発現プラスミドを構築するために、プラスミドＦ７（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９１年）またはｐＲＢ¹¹⁰遺伝子ｃＤＮＡの全長を含むｐ４．９５ＢＴ（Ｆｒｉｅｎｄら、１９８７年）を、ヌクレオチド−３２２において制限酵素ＡｃｙＩ、＋３２３０においてＳｃａＩで消化した（第二のフレーム内ＡＴＧ開始コドンのＡを、ヌクレオチド＋１９とする）。ＡｃｙＩ消化によって生じた５’オーバーハングを、４つのｄＮＴＰ全ての存在下でＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩで処理して、平滑末端とした。ＢａｍＨＩリンカーを、この断片にライゲートさせ、その後、同断片をＢａｍＨＩで消化して、過剰なリンカーを除去し、そしてＢａｍＨＩ末端を生じさせた（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２年）。生じた３５５２ｂｐのＲＢｃＤＮＡ断片を、ＥＣ１２１４Ａの特異的なＢａｍＨＩに挿入して、ｐＣＭＶ^*−ｔＴＡ−ＲＢ¹¹⁰を得た。Ｂ．誘導性ｐＲＢ⁹⁴発現ベクターの構築ＡＵＧコドンを囲む一次配列ＧＣＣ（^A _G）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号２７）が、高等な真核細胞での翻訳開始に最適であることが知られている（Ｋｏｚａｋ、１９９１年）。ほとんど全ての脊椎動物のｍＲＮＡが、確実な開始忠実度特性を示すが、重大な調節タンパク質をコードするｍＲＮＡには、有効な翻訳ができるようになっていないものが少なくないようである（Ｋｏｚａｋ、１９９１年）。ＲＢｃＤＮＡ配列を検討する上で、全長ｐＲＢ¹¹⁰とＮ末端切断ｐＲＢ⁹⁴との両方のＡＵＧ開始コドンは、高等な真核細胞での翻訳開始にとって次善の状況にあることが分かった。例えば、ヌクレオチド−５位置にフレーム外ＡＵＧコドンがあり（ｐＲＢ⁹⁴ｃＤＮＡのためのＡＴＧ出発コドンのＡを、ヌクレオチド＋１とする）、ｐＲＢ⁹⁴のためのＡＴＧコドンのリーダー配列は、上記した共通イニシエーター状況と比較して劣る。ｐＲＢ⁹⁴ｃＤＮＡの翻訳効率を改善するために、部位特異的突然変異誘発を使用して、最適な翻訳開始のためのｐＲＢ⁹⁴の第二内部フレーム内ＡＴＧコドンの上流のＤＮＡ配列を最適化した。全長ＲＢ¹¹⁰ｃＤＮＡを担持するプラスミドＦ７をテンプレートとして使用し、修飾５’−ｐＲＢ⁹⁴ｃＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ^TMによって得た。ＰＣＲ^TM 反応のために使用したセンスプライマー（５'−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＡＣＴＴＴＴＡＣ−３'、配列番号１２）は、ＨｉｎｄI II制限部位（下線部分）およびＫｏｚａｋカセット（イタリック体、Ｋｏｚａｋ、１９８７年）を含んでいる。アンチセンスプライマー５'−ＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＡＡＧＧ−３'（ＯＭＲｂＡＳ３００、配列番号１３）は、ＲＢｃＤＮＡのヌクレオチド＋９００でＥｃｏＲＩ部位（下線部分）と重なり合った（第一のフレーム内ＡＴＧのＡを、位置＋１とする）。ＰＣＲ^TM産物を、ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩで消化し、その後、プラスミドＦ７から単離されたＥｃｏＲＩ（位置＋９００）およびＢａｍＨＩ（＋３５４８）の間の３’−ＲＢｃＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片でライゲートした。全ｐＲＢ⁹⁴ｃＤＮＡ断片を、ＥＣ１２１４ＡのＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩ部位に挿入して、誘導性ｐＲＢ⁹⁴発現プラスミド、ｐＣＭＶ^*−ｔＴＡ−ｐＲＢ⁹⁴を得た。Ｃ．誘導性ｐ５３発現ベクターの構築全長ｐ５３遺伝子ｃＤＮＡを含む、プラスミドｐＣ５３−ＳＮ３（Ｂａｋｅｒら、１９９０年）を、ＢａｍＨＩで消化させ、そして全長ｐ５３遺伝子を含む断片を、ＥＣ１２１４Ａの特異的ＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＣＭＶ^*−ｔＴＡ− ｐ５３を得た。実施例６テトラサイクリン調節ｐＲＢ１１０、ｐＲＢ９４またはｐ５３発現を有する長期腫瘍細胞クローンの製造修飾された単独プラスミドテトラサイクリン応答性哺乳類遺伝子発現系を使用して、野生型またはＮ末端切断レチノブラストーマ（ＲＢ）腫瘍抑制遺伝子、またはｐ５３腫瘍抑制遺伝子の発現が検出しうる確実に可逆的にスイッチを点滅できる種々の安定な腫瘍細胞系を得た。Ａ．細胞培養胸部癌細胞系ＭＤＡ−４６８（ＨＴＢ１３２）をＡＴＣＣから得て、１０％ＦＢＳ（メリーランド州ガイザースバーグのライフテクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５（メリーランド州ガイザースバーグのライフテクノロジーズ社）で培養した。骨肉腫細胞系Ｓａｏｓ２を、１５％ＦＢＳを含む培地ＭｃＣｏｙの５Ａ（メリーランド州ガイザースバーグのライフテクノロジーズ社）で培養した（Ｚｈｏｕら、１９９４年ｂ）。ＡＴＣＣから得られた膀胱癌細胞系５６３７（ＨＴＢ９）は、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（メリーランド州ガイザースバーグのライフテクノロジーズ社）で培養した。全ての細胞培養用培地に、０．５％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足した。Ｓａｏｓ２および５３６７細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターでインキュベートした一方で、ＭＤＡ−４６８細胞は、ＣＯ₂なしで３７℃で培養した。Ｂ．安定なトランスフェクション腫瘍細胞を、製造業者（メリーランド州ガイザースバーグのライフテクノロジーズ社）の指示マニュアルに従ったリポフェクチン法により、ｐＲＢ¹¹⁰およびｐＲＢ⁹⁴発現プラスミドでトランスフェクションした。特記事項を除き、トランスフェクションおよび後続手段の間、０．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（ミズーリー州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ）社）をトランスフェクションおよび培養の培地に添加した。トランスフェクションの４８時間後、Ｇ４１８（メリーランド州ガイザースバーグのライフテクノロジーズ社）を培養培地に３００ μｇ／ｌの濃度で添加した。２，３週間後、単独のコロニーをクローニングリングによって単離した。各単離コロニーについて２個の培養を行った。元のクローンを０．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む培地で維持しておき、転写したクローンをテトラサイクリンの不在下で培養した。後者を、特異的抗ＲＢ抗体、ＲＢ−ＷＬ−１で免疫化学的に染色した（Ｘｕら、１９８９年ａ）。続いて、適合したＲＢ陽性のクローンを、テトラサイクリンおよびＧ４１８を含む培地に維持させ、以後の分析のために延長させた。Ｃ．一過性トランスフェクション腫瘍細胞を、６０ｍｍ培養皿または無菌のカバーガラスの上に、翌日約４０％集密度に達するような濃度で種蒔きした。２４時間後、適切な量のプラスミドＤＮＡを、製造業者（メリーランド州ガイザースバーグのライフテクノロジーズ社）の指示マニュアルに従いＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中でリポフェクチン試薬と混合した。細胞に、ＤＮＡ−リポフェクチン複合体を重畳し、３７ ℃、５％ＣＯ₂インキュベーターで一夜インキュベートした。翌日、新鮮な培地を添加して、ＤＮＡ−リポフェクチンを置換えた。２４時間または４８時間後、細胞を、免疫化学的染色用に固定させるか、または細胞溶解物の製造のために溶解させた。Ｄ．ＲＢタンパク質の免疫化学的染色上述（Ｘｕら、１９８９年ａ）のとおり、免疫化学的染色を行った。ＲＢ発現を検出するために、カバーガラス上で生育した細胞を、４５％（容積／容積）アセトン／１０％（重量／容積）ホルムアルデヒド／０．１Ｍリン酸緩衝液で５分間固定した。６回、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、細胞を、リン酸緩衝液中の１％脱脂牛乳／１．５％ヤギ血清またはウマ血清で、４時間、室温で保護した。ＲＢ−ＷＬ−１抗ＲＢ抗体またはＣａｎｊｉのモノクローナル抗ＲＢ抗体（カリフォルニア州サンディエゴのＱＥＤ社）を、０．０２％トライトンＸ−１００を補足した同じ溶液中でそれぞれ２μｇ／ｍｌまたは０．５μｇ／ｍｌに希釈し、細胞と共に一夜インキュベートした。洗浄後、カバーガラスを、技術マニュアル（カリフォルニア州バーリンガムのベクターラボラトリーズ社）に従ってアビジンビオチン化ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）法で免疫染色を進行させた。Ｅ．ｐＲＢについての免疫ブロッティング上述（Ｘｕら、１９９１年ａ；１９９１年ｂ）のとおり、細胞溶解物を製造した。簡便に述べると、６０ｍｍ皿にある培養細胞を、１００ｍＭＮａＣｌ、０．２％ＮＰ−４０、０．２％ナトリウムデオキシコレート、０．１％ＳＤＳおよび５０μｇ／ｍｌアプロチニンと１ｍＭＰＭＳＦを有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む０．６ｍｌの氷冷溶解緩衝液で溶解させた。細胞溶解物を、２１ゲージの針を通して数回通過させ、そして遠心分離によって清澄化した。上述（Ｘｕら、１９９１年ａ；１９９１年ｂ）のとおり、直接的ウエスタン免疫ブロッティングを行った。ブラッドフォードのタンパク質アッセイ（カリフォルニア州リッチモンドのバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）社）によって測定した６０μｇの総細胞タンパク質を、８％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけ、イムノビロンポリビニリデン膜（ＰＶＤＦ）（マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポワ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社）に電気ブロッティングした。トリス緩衝生理食塩水中の４％ウシ血清アルブミン／１％正常ヤギ血清で保護した後、膜を、ＲＢ−ＷＬ−１抗体で、ＲＢ検出用に０．４μｇ／ｍｌの最終濃度で一夜インキュベートした。その後、ブロットを、プロトブロットのウエスタンブロットアルカリフォスファターゼ系（ウイスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）によって捕捉した。Ｆ．成長曲線測定結晶バイオレット染色法を使用して、テトラサイクリンの存在または不在下で細胞成長の変化を測定した（Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８６年）。簡便に述べると、細胞を、２個の２４穴プレートに蒔いた。一組のプレートで、細胞を０．５μ ｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む培地で育成し、他方では、同じ細胞を非テトラサイクリン培地で培養した。各時点で、細胞をＰＢＳ中の１％グルタアルデヒドで固定し、０．５％の結晶バイオレットを用いて染色した。所望の時点で細胞を収集した後に、結晶バイオレット染料を、０．９％クエン酸三ナトリウム、０．０２Ｎ塩素酸および４５％エタノール（容積／容積）を含むソレンソンの溶液を用いて細胞をインキュベートすることにより、染色細胞から抽出した。抽出染料をソレンソンの溶液で適宜希釈し、λ₅₅₀での光学吸光度を測定した。時間に対するＯＤ₅₅₀をプロットして成長曲線を得た。Ｇ．軟質寒天アッセイ軟質寒天アッセイにため、適当数の細胞を１５％ＦＢＳを含む完全培地中の０．３％アガロースと混合させ、３５ｍｍ組織培養皿上の０．７％塩基性寒天上に重畳した。各個別細胞クローンについて、２枚目の皿を製造した。一方の皿の細胞を、０．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む培地で培養し、他方は、非テトラサイクリン培地で培養した。培地を、３日毎に補給し、そしてコロニー（＞５０細胞）を、３週間後計数した。結果は、細胞クローン当たり３枚の皿の平均として計算した。Ｈ．ヌードマウスでの腫瘍原性試験腫瘍原性試験は、先に記述されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９１年）。２つの群の胸腺欠損ヌードマウスを、試験されるべき各細胞クローンについて準備した。１群のマウスには通常の水を与え、他方の群には、５ｍｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む水を与えた。各ＲＢ¹¹⁰およびＲＢ⁹⁴再構築クローンから得た総計５×１０⁶細胞を、０．２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中で、ヌードマウスの右腹側部に皮下注射した。Ｓａｏｓ２，５６３７およびＭＤＡ−４６８細胞を含むＲＢ陰性親の対照は、同じ濃度で同じマウスの左腹側部に注射した。腫瘍は、注射の４週後に判定した。Ｉ．［³Ｈ］−チミジン取込みの時間経過研究誘導性ＲＢ再構築クローンから得た細胞を、テトラサイクリンを含む培地のある無菌のカバーガラスで育成した。培養培地からテトラサイクリンを除去した後の特定の時点で、細胞を、１０μＣｉ［³Ｈ］−メチルチミジン（イリノイ州アーリントンハイツのアマシャム社）を含む１ｍｌの新鮮培地で、２時間３７℃でインキュベートし、固定し、上述のとおりＲＢタンパク質の発現について免疫化学的に染色した（Ｘｕら、１９９１年ａ；１９９１年ｂ）。染色スライドを、続いて薄層のゼラチンで被覆し、３７℃で一夜乾燥させた。スライドを、オートラジオグラフィーエマルジョン（型ＮＴＢ２、ニューヨーク州ローチェスターのイーストマンコダック社）で上塗りし、２日間照射した。現像後、スライドを光学顕微鏡下で検定した。Ｊ．一過的にトランスフェクトされた細胞培養の［³Ｈ］−チミジン取込み腫瘍細胞を、カバーガラスの上に蒔き、そしてプラスミド発現ｐＲＢ⁹⁴、ｐＲＢ¹¹⁰または他の突然変異ＲＢタンパク質でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、ＲＢタンパク質の免疫細胞化学的染色、そしてＸｕらに記述されるとおり（１９９１年ｂ；１９９１年ｃ）［³Ｈ］−チミジン取込みアッセイを行った。Ｋ．長期誘導性ＲＢ発現クローンの特徴付け文献に報告されているところでは、ＲＢ置換後における細胞増殖抑制と形態学的変化は一致していない。本発明者らおよび他の者によってなされた研究では、ＲＢ−欠損腫瘍細胞への正常ＲＢ遺伝子の置換がヌードマウスで生じ、その腫瘍形成性活性を抑制し得ることを示した（ＧｏｏｄｒｉｃｈおよびＬｅｅ１９９３、Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎら、１９９０ａ；１９９０ｂ、Ｃｈｅｎら、１９９２、Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、１９９２ｂ、Ｈｕａｎｇら、１９８８、Ｋｒａｔｚｋｅら、１９９３、Ｍａｄｒｅｐｅｒｌａら、１９９１、Ｍｕｎｃａｓｔｅｒら、１９９２、Ｏｏｋａｗａら、１９９３、Ｓｕｍｅｇｉら、１９９０、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９１、Ｗａｎｇら、１９９３、Ｘｕら、１９９６、Ｘｕら、１９９１ｃ、Ｚｈｏｕら、１９９４ｂ、Ｘｕ、１９９６、Ｘｕ、１９９５、Ｌｉら、１９９６、Ｘｕら、１９９４ｂ）。研究された腫瘍細胞系は、膀胱、前立腺、乳房および肺のレチノブラストーマ、オステオサルコーマ、カルシノーマのごときヒト癌の広く異なるタイプから誘導された（総説についてはＧｏｏｄｒｉｃｈおよびＬｅｅ、１９９３、Ｘｕ、１９９６、Ｘｕ、１９９５）。複数の遺伝的改変を担う腫瘍細胞におけるＲＢ遺伝子欠損だけの修正でもその悪性表現型を復帰させるのに十分であるとよく記載されているが、一見したところよりも謎が多いものであった（Ｋｌｅｉｎ、１９９０）。いくつかの初期の研究で示されたように、ｐＲＢ−発現プラスミドでの一過性トランスフェクション後に、培養中のＲＢ−欠損腫瘍細胞には、細胞拡大、老化様表現型および増殖停止を含めた顕著な変化を呈するものがいくつかあった（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら、１９９１、Ｑｉｎら、１９９２）。しかしながら、親系と丁度同程度の速さで増殖するＲＢ−再構成腫瘍細胞の長期安定クローンを単離できることが後に判明した。従って文献では、その腫瘍抑制機能とＲＢ−欠損腫瘍細胞でのＲＢ置換による細胞増殖阻害とを分けて考える傾向があった（Ｃｈｅｎら、１９９２、Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、１９９２ｂ、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９１、Ｘｕら、１９９１ｂ、Ｚｈｏｕら、１９９４ｂ、Ｌｉら、１９９６）。３つのＲＢ−欠損腫瘍細胞系を用いて、長期誘導性ＲＢ発現クローンを確立した。それらは、オステオサルコーマ細胞系、Ｓａｏｓ２、膀胱癌細胞系、５６３７および乳癌細胞系、ＭＤＡ−４６８であった。受容体としてＳａｏｓ２、５６３７およびＭＤＡ−４６８を選択した基準は、それらがＲＢ−置換研究で最も使用されるＲＢ−欠損腫瘍細胞であるということであった。該腫瘍細胞は、誘導性ＲＢ¹¹⁰発現プラスミド、ｐＣＭＶ^*−ｔＴＡ−ＲＢ¹¹⁰およびｐＲＢ⁹⁴発現プラスミド、テトラサイクリン存在下でのｐＣＭＶ^*−ｔＴＡ−ＲＢ⁹⁴でトランスフェクトした。ほぼ２ないし４週間の４００μｇ／ｍｌのＧ４１８での選択後、はっきり分離された単一コロニーを単離し、テトラサイクリン含有培地で維持した。単離されたクローンのうち小部分を、テトラサイクリン（Ｔｃ）不存在下で２４ないし４８時間別々に培養し、抗−ＲＢ抗体、ＲＢ −ＷＬ−１で染色した。Ｔｃ−応答性ＲＢ−再構成５６３７膀胱カルシノーマおよびＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞の安定なクローンで、ｐＲＢタンパク質発現の密接な制御が見られた。培地中、０．５μｇ／ｍｌのＴｃの存在下で増殖させたＲＢ再構成５６３７細胞は免疫細胞化学染色によるとＲＢ^-であり、他方、Ｔｃの除去後、Ｒｂ⁺免疫細胞化学染色によって示されるように、ＲＢ^-再構成５６３７細胞においてｐＲＢの発現にスイッチが入った。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌腫瘍細胞は、培地中、０．５μｇ／ｍｌのＴｃの存在下での免疫細胞化学染色によるとＲＢ^-であり、他方、Ｔｃの除去後では、ＲＢ⁺免疫細胞化学染色によって示されるようにＲＢ− 再構成ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞においてｐＲＢ発現にスイッチが入った。テトラサイクリンは、このテトラサイクリン応答性発現系ではインデューサーであるというよりも阻害剤であることに注意されたい。ＲＢ発現を停止させるのに必要なテトラサイクリンの最小濃度もテストした。免疫染色によって、０．１μｇ／ｍｌという少量のテトラサイクリンがＲＢ発現を検出できないほどまで阻害できることが判明し、これは、テトラサイクリン調節発現系がテトラサイクリンに対して非常に感受性であることを示す。加えて、驚くべきことに、以前に報告された調節不可能な長期ＲＢ−再構成腫瘍細胞系とは異なり、調べた全ての長期腫瘍細胞クローンは、無Ｔｃ培地でｐＲＢ発現にスイッチが入った後には、不可逆的に増殖を停止することが判明した（図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃ）。文献では、正常および腫瘍細胞におけるｐＲＢの半減期が４〜６時間に過ぎないことが知られており（Ｍｉｈａｒａら、１９８９；Ｘｕら、１９９４ｂ；Ｘｕら、１９８９ａ）、図２で示されるように、改変型テトラサイクリン−調節性系を用い、低濃度のＴｃの存在下または不存在下でのｔＴＡトランスアクチベーター自体の発現は細胞増殖に対して効果を有しなかった。Ｓａｏｓ２および５６３７クローンはＤＮＡを合成もできず、これに続いて認識可能な形態学的変化が起こり、最後に細胞が死滅した。無Ｔｃ培地でｐＲＢ発現が誘導された後、細胞拡大、偏平化および細胞周期がＧ１／Ｓの細胞(cycling G1/S cells)より低い核細胞質比を含めた細胞形態学が顕著に変化した。膀胱癌細胞系５６３７の場合、調節不可能系での一過性のまたは安定なＲＢ−置換の後における形態学および増殖速度の変化は文献では充分には記載されていなかった（Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、１９９２ｂ；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９１；Ｚｈｏｕら、１９９４ｂ）。一般に、無Ｔｃ培地中の確立されたＴｃ−調節性ＲＢ⁺腫瘍系の表現型は、ＲＢプラスミドでトランスフェクトされた（またはＲＢレトロウイルスベクターで感染させた）腫瘍細胞大量培養につき以前に記載されたものとかなり似ていた（Ｈｕａｎｇら、１９８８；Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら、１９９１；Ｑｉｎら、１９９２）。ｐＲＢ発現に対する許容条件下の全ての腫瘍細胞クローンは、軟寒天中でコロニーを形成することができず（図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃ）、ヌードマウスで腫瘍形成性ではなかった。ＲＢをもう１つの通常の腫瘍抑制遺伝子ｐ５３と比較するために、Ｔｃ−調節性野生型ｐ５３発現を持ついくつかの長期安定腫瘍細胞クローンをオステオサルコーマ細胞系Ｓａｏｓ２から確立した。前記したのと同様のアプローチを用いて、ｐ５３−再構成Ｓａｏｓ−２腫瘍細胞クローンを確立した。略言すれば、親Ｓａｏｓ−２腫瘍細胞を野生型ｐ５３−発現プラスミドｐＣＭＶ^*−ｔＴＡ−ｐ５３でトランスフェクトし（実施例５）、ゲネチシン含有培地中で選択した。初期Ｇ４１８−耐性大量培養を少なくとも２ラウンドのサブクローニングに付して、安定な野生型ｐ５３−再構成クローンを得た。ｐ５３遺伝子の完全な欠失のため、親Ｓａｏｓ−２細胞は内因性ｐ５３を有しない。このモデル系にて、ｐ５３−再構成Ｓａｏｓ−２クローンにおける野生型ｐ５３発現の誘導の結果、ＲＢ^-／ｐ５３^null腫瘍細胞の増殖阻止がもたらされたことが判明した。Ｔｃの不存在下でＴｃ−調節ｐ５３−再構成Ｓａｏｓ−２クローンを増殖させると、多くの腫瘍細胞は収縮し、脱着した。さらに、ＤＮＡ断片化アッセイにより測定されるごとく、豊富な低分子量ＤＮＡが、ｐ５３発現に対する許容条件下で、ｐ５３−再構成Ｓａｏｓ−２腫瘍細胞から抽出された試料でのみ検出された。これらの観察は、ＲＢ^-／ｐ５３^nullＳａｏｓ−２腫瘍細胞の野生型ｐ５３−誘導増殖阻止が複製老化よりもむしろアポトーシス細胞死の結果であることを示す。Ｄｉｍｒｉらは、最近、インビボにおいて、培養中のおよび老化している皮膚中の老化ヒト細胞を同定するバイオマーカーを報告した。いくつかのヒト老化細胞がｐＨ６で組織化学的に検出できるβ−ガラクトシダーゼを発現したことが示された（Ｄｉｍｒｉら，１９９５）。老化関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）と称されるこのマーカーは、老化しているが前老化(prenesescent)していない繊維芽細胞によって発現される。また、ＳＡ−β−ｇａｌは不死細胞(immortal cells)で存在しなかったが、不死を逆行させる遺伝子操作によって誘導された(Ｄｉｍｒｉら、１９９５)。注目すべきは、成体メラノサイトのごときいくつかの細胞が老化または年齢とは独立してＳＡ−β−ｇａｌ（ｐＨ６活性）を発現した。従って、ＳＡ−β−ｇａｌは複製老化の普遍的マーカーではなく、これは驚くべきことではない。それにも拘わらず、テトラサイクリンー調節性ｐＲＢまたはｐ５３発現と共に本発明の長期腫瘍細胞クローンを利用することによって、ＳＡ−β−ｇａｌ（ｐＨ６活性）は、ＲＢ−媒介腫瘍細胞増殖停止をさらに特徴付けることができる簡便なアッセイを提供する。大部分の（＞９９．９％）若い（初期継代）ヒトＷＩ −３８繊維芽細胞はＳＡ−β−ｇａｌ陰性である。対照的に、（５２より大の集団倍化レベルの）老化したＷＩ−３８細胞は強力にＳＡ−β−ｇａｌ陽性であった。これまでに調べた全てのテトラサイクリン−応答性腫瘍細胞クローンは、テトラサイクリンの存在下でＳＡ−β−ｇａｌ陰性であり（ＲＢ^-）、無テトラサイクリン培地中でＳＡ−β−ｇａｌ陽性であった（ＲＢ⁺）。しかしながら、ＲＢ⁺状態における腫瘍細胞のＳＡ−β−ｇａｌ染色の強度は腫瘍細胞のタイプに依存して変化する。注目すべきことに、非誘導性（Ｃｈｅｎら、１９９０；Ｌｉら、１９９６）または誘導性系でのＳａｏｓ−２（ＲＢ^-、ｐ５３^null）腫瘍細胞におけるｐ５３再構成はその腫瘍性表現型を抑制するが、テトラサイクリン調節性プロモーターを持つｐ５３再構成したＳａｏｓ−２クローンは、テトラサイクリンの存在下または不存在下いずれでもＳＡ−β−ｇａｌ陰性であった。非常に興味あることに、ｐ５３−再構成Ｓａｏｓ−２細胞を、無Ｔｃ培地中で野生型ｐＲＢ¹¹⁰を発現する組換えアデノウイルスベクターで感染させると、野生型ｐ５３およびｐＲＢ¹ ¹⁰ 発現双方を持つ腫瘍細胞は、ｐＲＢ¹¹⁰を発現するに過ぎない腫瘍細胞と比較して、より強いＳＡ−β−ｇａｌ陽性染色を呈した。該結果は、ｐＲＢおよびｐ５３による腫瘍抑制のメカニズムは相互に異なるが、ｐＲＢおよびｐ５３の共発現はＲＢ−媒介腫瘍細胞老化に対して相乗効果を有することを示す。その潜在的治療的使用を考慮すると、もう１つの重要な知見は、ｐＲＢ−媒介複製老化（不可逆的増殖停止）が腫瘍特異的であるという事実であった。１００の感染多重度（ＭＯＩ）における、組換えアデノウイルスベクターＡｄＣＭＶｐＲＢ１１０で感染された初期継代の若いＷＩ−３８はＳＡ−β−ｇａｌ陰性のままであり、それらは感染から約１週間後に正常な増殖パターンを回復した。従って、ｐＲＢは抗癌遺伝子治療用の比較的安全な試薬である。進行した悪性疾患の治療に加えて、出現するＲＢ遺伝子治療は手術後残存腫瘍、表面存在癌、またはプレ悪性疾患、ならびにある状況における非悪性、過剰増殖性疾患を治療するのにも有用であり得る（Ｃｈａｎｇら、１９９５；Ｘｕら、１９９６）。Ｌ．ＲＢ−媒介腫瘍抑制の広い生物学的基礎腫瘍細胞−特異的老化およびよく知られた抗増殖効果に加えて、ｐＲＢは血管形成の阻害においておよび腫瘍細胞の免疫原性の誘導においても役割を演じる。本発明者らは、テトラサイクリン−応答性のＲＢ−再構成オステオサルコーマおよび非小細胞肺癌細胞系から収集した無血清条件培地（ＣＭ）が細胞培養物からのＴｃの除去後に血管形成性から抗血管形成性にスイッチされたことを示した。このスイッチはウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学によって測定されるようにｐＲＢ発現の開始に対応した（Ｄａｗｓｏｎら、１９９６）。また、本発明者らは、ＲＢ−欠損非小細胞肺癌細胞系Ｈ２００９におけるＩＦＮ−γによるＨＬＡクラスＩＩ誘導が野生型ＲＢ遺伝子発現の再構成を要することも示した（Ｌｕら、１９９６）。クラスＩＩタンパク質は免疫応答の一部としてＣＤ４⁺Ｔリンパ球に対するタンパク質分解により加工された抗原由来のペプチドを表す。従って、ｐＲＢは同様に腫瘍免疫原性を媒介することにおいて役割を有するようである。レチノブラストーマ（ＲＢ）腫瘍抑制遺伝子の置換がＲＢ−欠損腫瘍細胞の侵入を阻害し得るかを判断するために、ボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバーアッセイ（Ｌｉら、１９９６）を用いて実験した。該実験は、膀胱、乳房および肺のオステオサルコーマおよびカルシノーマに由来するものを含めた、広い群の安定なＲＢ−再構成ヒト腫瘍細胞系で行った。これらの腫瘍細胞系における外因性野生型ＲＢタンパク質の発現は、構成的に活性なプロモーターまたは誘導性プロモーターいずれかによって駆動した。ＲＢ−再構成ＲＢ⁺細胞系からよりも親ＲＢ −欠損細胞系およびＲＢ^-復帰体からのかなり多くの腫瘍細胞がボイデンチャンバーアッセイにおいてマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）に浸透した（ｐ＜０．００１、両側ｔ−検定）。注意すべきは、ＲＢ置換による種々のＲＢ−欠損腫瘍細胞の侵入性の阻害は、明らかに、インビボにおけるそれらの腫瘍形成性の抑制とよく相関した。対照的に、機能的ＲＢまたはｐ５３再発現はＲＢ^-／ｐ５３^null オステオサルコーマ細胞系Ｓａｏｓ−２のヌードマウスにおいて腫瘍形成を抑制したが、野生型ｐ５３遺伝子の置換はＲＢ遺伝子と比較してそれらの侵入性に対してかなり小さいインパクトを有した。正常なヒト二倍体細胞は、限定された数の細胞分裂の後にインビトロおよびインビボで老化する。細胞老化として知られているこのプロセスは、老化の根底的原因およびヒト癌の発症に対する重大な障害である。また、改変型テトラサイクリンに調節された遺伝子発現系を介する機能的ｐＲＢのみを再発現するＲＢ／ｐ５３−欠損腫瘍細胞は細胞周期のＧ０／Ｇ１相で不可逆的に増殖阻止されたことも示された。これらの細胞は、細胞老化と合致する複数の形態学的変化を呈し、また、老化−関連β−ガラクトシダーゼバイオマーカーを発現した。さらなる実験は、恐らくは、腫瘍性細胞の拡大された増殖性ライフスパンに必須であるテロメラーゼ活性が、（ｐ５３ではなく）ｐＲＢ発現の誘導後に、腫瘍細胞系で抑制されることを示した。これらの観察は、ｐＲＢが本来の細胞老化プログラムにおいて非常に重要な役割を演じることを示唆する。現実的見地からは、知見は、ＲＢ（またはＲＢおよびｐ５３を一緒に）を用いる細胞増殖予期性遺伝子治療の結果、細胞老化および危機を介する腫瘍細胞の異なる排除がもたらされ得ることを意味する。同時に、インビボにおける正常細胞の複製ライフスパンは影響されないであろう。これは、腫瘍特異的腫瘍抑制遺伝子治療および抗−テロメラーゼ治療を設計するための潜在的基礎を供し得る。これらの知見は、一緒にすると、ＲＢ−媒介腫瘍抑制は広い生物学的基礎を有し、これは確かにヒト癌用の出現するＲＢ腫瘍抑制遺伝子治療をより魅力的にさえすることを示唆する。Ｍ．Ｎ−末端切断型ｐＲＢによる増強された腫瘍抑制ＲＢ−再構成腫瘍細胞の長期安定クローンは、非誘導性遺伝子発現系で単離することができ、これらのクローンのほとんどは親系と丁度同程度に迅速に増殖する。また、本発明者らは、ＲＢ−媒介腫瘍抑制が実質的であって、広い生物学的基礎を有するが、それはしばしば不完全であって、ＲＢ−再構成腫瘍細胞の一部は長期の潜伏期間後にヌードマウスにおいて生存することができ、ＲＢ⁺異種移植腫瘍を形成することも見いだした（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９１；Ｘｕら、１９９１ｂ；Ｚｈｏｕら、１９９４ｂ；Ｌｉら、１９９６）。同様の観察が他の研究者によって報告されている（Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎら、１９９０ｂ；Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、１９９２ｂ；Ｋｒａｔｚｋｅら、１９９３；Ｏｏｋａｗａら、１９９３；Ｗａｎｇら、１９９３）。この現象は腫瘍サプレッサー耐性（ＴＳＲ；Ｚｈｏｕら、１９９４ｂ）として発明者によって言及されており、これは化学療法における複数薬物耐性（ＭＤＲ）と同等である。後者の場合、低用量の化学療法は細胞障害性薬剤に対するそれらのしばしば固有に高い耐性のため、転移性腫瘍細胞を選択する危険を負う。本発明者らは、引き続いて、〜９４ｋＤａのＮ−末端切断型ＲＢタンパク質（ｐＲＢ⁹⁴）が、驚くべきことに、正常内因性ＲＢ遺伝子を有するものを含めた、調べた多様な腫瘍細胞系における全長ｐＲＢタンパク質と比較して、より優れた細胞増殖抑制を発揮することを報告した。ｐＲＢ⁹⁴発現プラスミドでトランスフェクトした腫瘍細胞は、細胞老化に頻繁に関連する複数の形態学的変化を呈した。それらはＳ期に入れず、迅速に死滅した（Ｘｕら、１９９４ｂ；ＲｅｓｎｉｔｚｋｙおよびＲｅｅｄ、１９９５）。異所性動物モデルにおける本発明者らの最近の研究は、ＡｄＣＭＶｐＲＢ９４、Ｎ−末端切断型ＲＢタンパク質を発現する複製欠損アデノウイルスベクターによるヌードマウスにおける確立されたヒトＲＢ^-およびＲＢ⁺膀胱異種移植癌の治療の結果、処理された腫瘍が後退したことを示した（Ｘｕら、１９９６）。注目すべきは、ＲＢタンパク質の全長および末端切断型形態は共に、アデノウイルスベクターを介して腫瘍細胞で過剰発現されると、腫瘍増殖を抑制できたが、ｐＲＢ⁹⁴は全長ＲＢタンパク質よりもかなり優れていた。Ｎ−末端切断型ＲＢタンパク質による増強された腫瘍抑制のメカニズムは未だ明らかでない。Ｎ−末端切断型ｐＲＢ⁹⁴および全長ｐＲＢ¹¹⁰間の機能的差異を良好に理解するために、本発明者らは、Ｔｃ−応答性ｐＲＢ⁹⁴発現を持つ安定な腫瘍細胞系を確立した。経時的分析により、細胞培地からのテトラサイクリンの除去から６時間程度で、ｐＲＢ⁹⁴−再構成腫瘍細胞は非リン酸化およびリン酸化ｐＲＢ⁹⁴双方の最大量を蓄積し、続いて、腫瘍細胞のかなり大部分が増殖停止のインジケーターである³Ｈ−チミジンを取り込むことができないことが判明した。ｐＲＢ⁹⁴タンパク質は、〜１８〜２４時間内に完全に脱リン酸化された。しかしながら、ｐＲＢ¹¹⁰−再構成腫瘍細胞の大部分は、６または８時間の時点で免疫組織化学的にＲＢ^-のままであり、正常なＤＮＡ合成を有した(図５)。ｐＲＢ¹¹⁰はウェスタンブロッティングによって判断して２４時間の時点で最高のレベルに到達し、テトラサイクリンの除去の２４〜４８時間後にほとんど脱リン酸化され、その期間にｐＲＢ¹¹⁰−再構成腫瘍細胞は最後にＤＮＡ合成を停止した（図５）。ヒト老化細胞用のＳＡ−β−ｇａｌバイオマーカーアッセイを用い、ｐＲＢ⁹⁴発現を有するＳａｏｓ−２細胞は、Ｔｃの除去の４８時間後のｐＲＢ¹¹⁰−発現細胞と比較して、より強いＳＡ−β−ｇａｌ陽性染色を示したことが示された。ｐＲＢ⁹⁴ はｐＲＢ¹¹⁰よりも長い半減期を有し、活性な非リン酸化形態のままである傾向があるので（米国特許第５，４９６，７３１号；Ｘｕら、１９９４ｂ）、腫瘍細胞中のＲＢタンパク質の活性形態（非リン酸化形態）のほとんどの迅速な蓄積はｐＲＢ⁹⁴による増強された腫瘍細胞増殖抑制を説明し得る。この点、アミノ酸３７９で始まるｐＲＢ⁵⁶と命名されたｐＲＢのもう１つの切断型バージョンもまた全長ｐＲＢと比較して細胞周期進行のより優れた阻害剤として報告されている（Ｗｉｌｌｓら、１９９５）。改変型系の利点は３つある：１）それは、ｔＴＡペプチドのより低い構成的発現のため、誘導性遺伝子発現を持つ長期安定細胞系を確立するのに適している、２）該系は１ラウンドのみのトランスフェクションおよび選択が必要なように単一プラスミドに今や含有されている、および３）重要なことには、単一−プラスミドテトラサイクリン−応答性哺乳動物遺伝子発現系はテトラサイクリン−制御ウイルスベクターに容易に変換できる（後記実施例７−１２）。実施例７テトラサイクリン−制御アデノウイルスベクターの構築目的とする遺伝子の所望のｃＤＮＡ断片をまず単一−プラスミドテトラサイクリン−調節性プラスミドベクターＥＣ１２１４Ａ（実施例３）またはＥＣ１２１４Ｂ（実施例４）に挿入する。次いで、対応するＥＣ１２１４ＡまたはＥＣ１２１４Ｂプラスミドベクターからのテトラサイクリン−応答性外来性遺伝子発現カセットおよび改変型ｔＴＡ（またはｒｔＴＡ）発現カセットを、ＤＮＡ操作についての当該分野における標準的方法を用いて回収し（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２）、シャトルプラスミドｐΔＥ１ｓｐ１Ａ（ＭｉｃｒｏｂｉｘＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）に挿入する。次いで、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、得られた組換えシャトルプラスミドを、アデノウイルスＡｄ５ｄ１３０９ゲノムおよびＥ１／Ｅ３欠失突然変異体（ＭｉｃｒｏｂｉｘＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）の骨格を含有するマスターアデノウイルスタイプ５（Ａｄ５）プラスミドｐＢＨＧ１１で２９３細胞に共トランスフェクトする。２９３細胞の共トランスフェクションは０．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下（ｔｅｔ−ｏｆｆ系）または不存在下（ｔｅｔ−ｏｎ系）で行う。別法として、注目する遺伝子を含有する断片をまず単一−プラスミドテトラサイクリン−調節性プラスミドベクターＥＣ１２１４ＡまたはＥＣ１２１４Ｂに挿入する。次いで、対応するＥＣ１２１４ＡまたはＥＣ１２１４Ｂプラスミドベクターからのテトラサイクリン−応答性外来性遺伝子発現カセットおよび改変型ｔＴＡ（またはｒｔＴＡ）発現カセットを回収し、各々、シャトルプラスミドｐΔ Ｅ１ｓｐ１ＡおよびマスターアデノウイルスプラスミドｐＢＨＧ１１に挿入する。得られた組換えシャトルプラスミドおよび組換えマスターアデノウイルスプラスミドを２９３細胞に共トランスフェクトする。組換えシャトルプラスミドおよび組換えマスターアデノウイルスプラスミドでの２９３細胞の共トランスフェクションはインビボ組換えによって感染性ビリオンを生成し、ここに、注目する遺伝子を発現するミニ遺伝子カセットおよび改変型ｔＴＡ（またはｒｔＴＡ）発現カセットを、各々、Ａｄ５ｄ１３０９ゲノムのΔＥ１領域またはΔＥ１およびΔＥ３と置換する。トランスフェクトした２９３細胞における組換えアデノウイルスの存在をまず細胞障害効果（ＣＰＥ）によって同定する。ＣＰＥが起こったトランスフェクトされた２９３細胞から細胞培養上清を収集する。次いで、ウイルス上清での感染後に２９３細胞単層からアデノウイルスプラークをスクリーニングすることによって、組換えウイルスを単離し、制限酵素消化マッピング、ＰＣＲ^TMによって、またはテトラサイクリン−調節様式にて、ウイルス感染宿主細胞における注目する遺伝子の発現によってさらに特徴付けする。所望の外来性遺伝子ならびに改変型ｔＴＡ（またはｒｔＴＡ）発現カセットを含有する組換えアデノウイルスを少なくとも３ラウンドのプラーク精製に付す。テトラサイクリン−制御組換えアデノウイルスの高力価ストックを、ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃからの修飾方法（１９９１）によって調製する。ＣｓＣｌ超遠心−精製アデノウイルスは、２６０ｎｍにおけるＯＤ（１ＯＤ２６０＝１×１０¹²ウイルス粒子／ｍｌ）によって測定して１ｍｌ当たり〜１０¹³ウイルス粒子を含有する。濃縮されたウイルス上清を、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０を通すゲル濾過によって脱塩して、ＰＢＳ中のｍｌ当たり約１０¹¹プラーク形成単位（ｐｆｕ）の最終精製ウイルスを得る。実施例８テトラサイクリン−応答性ＲＢアデノウイルスベクターの調製Ｎ−末端切断型ｐＲＢ⁹⁴タンパク質を発現する複製−欠損アデノウイルスベクター（米国特許第５，４９６，７３１号）が、ヒト癌遺伝子治療のインビボ動物モデルで使用された（Ｘｕら、１９９６）。生憎と、ＡｄＣＭＶｐＲＢ９４ウイルス上清のプラーク形成単位に対するウイルス粒子の比率は、継代と共に劇的に増加し、ヒト癌遺伝子治療臨床トライアル用のＡｄＣＭＶｐＲＢ９４の高力価ストックの大規模調製は困難である。これは、恐らくは、２９３ウイルス産生細胞系に対するｐＲＢ９４タンパク質の優れた細胞増殖抑制効果によって引き起こされる。改変型テトラサイクリン−応答性哺乳動物遺伝子発現系を前記と同様にして使用して、テトラサイクリン−制御ｐＲＢ⁹⁴含有アデノウイルスベクターＡｄＶｔＴａ.ＲＢ９４が作製されており、これは高用量のｐＲＢ⁹⁴遺伝子治療の送達のために設計されている。全テトラサイクリン調節カセットをアデノウイルスゲノムのＥ１領域に挿入できるか、あるいはｐＲＢ⁹⁴発現カセットをアデノウイルスゲノムのＥ１領域に挿入でき、他方、転写トランス活性化融合タンパク質発現カセットがアデノウイルスゲノムのＥ３領域に挿入される。腫瘍細胞におけるｐＲＢ⁹⁴の過剰発現は腫瘍細胞特異的老化および細胞死滅を引き起こす。ｐＲＢ⁹⁴ｃＤＮＡは改変型最適イニシエーターの意味での配列を有する。ＡｄＶｔＴａ.ＲＢ９４による導入ヒト腫瘍細胞におけるｐＲＢ⁹⁴タンパク質の発現は可逆的にオンおよびオフできる。新規ＡｄＶｔＴＡ．ＲＢ９４組換えアデノウイルスベクターは、増大した収率および量にて２９３細胞で効果的に増殖できる。実施例９テトラサイクリン−応答性ＲＢ／ｐ５３共発現ベクターの調製実施例６に記載されているごとく、非誘導系（Ｃｈｅｎら、１９９０、Ｌｉら、１９９６）または誘導系を持つＳａｏｓ−２（ＲＢ^-、ｐ５３^null）腫瘍細胞中のｐ５３再構成は、それらの腫瘍性表現型を抑制するが、テトラサイクリン− 調節性プロモーターを持つｐ５３再構成Ｓａｏｓ−２クローンは、テトラサイクリンの存在下または不存在下でＳＡ−β−ｇａｌ陰性であった。しかしながら、ｐ５３−再構成Ｓａｏｓ−２細胞に無Ｔｃ培地中で野生型ｐＲＢ¹¹⁰を発現する組換えアデノウイルスベクターを感染させると、野生型ｐ５３およびｐＲＢ¹¹⁰ を両方発現する腫瘍細胞は、ｐＲＢ¹¹⁰のみを発現する腫瘍細胞と比較してより強いＳＡ−β−ｇａｌ陽性染色を呈した。該結果は、ｐＲＢおよびｐ５３による腫瘍抑制についてのメカニズムは相互に異なるが、ｐＲＢおよびｐ５３の共発現はＲＢ−媒介腫瘍細胞老化に対して相乗効果を有することを意味する。ｐＲＢおよびｐ５３の共発現はｐＲＢ−媒介腫瘍特異的老化に対して相乗効果を有し（実施例６）、改変型ＲＢおよびｐ５３タンパク質状態は、非小細胞肺癌ならびに膀胱の一過性細胞癌を含めた他のヒト悪性疾患のサブセットにおける相乗的予後因子であることが提唱されているので（Ｘｕ、１９９５、Ｘｕら，１９９４ａ、Ｘｕら、１９９６）、組合せｐＲＢおよびｐ５３遺伝子治療は可能な腫瘍サプレッサー耐性を克服する代替戦略とも考えられる。改変型テトラサイクリン−応答性トランスアクチベーター（ｔＴＡ）発現カセットおよびｔＴＡ−依存性ｐＲＢ¹¹⁰発現カセット双方の、Ａｄ５ゲノムのＥ１領域への挿入は、ＡｄＶｔＴＡ．ＲＢ¹¹⁰／ｐ５３と命名された、２つの腫瘍抑制遺伝子を同時に発現するアデノウイルスベクターの構築を容易とする。このベクターにおいて、より小さいｐ５３発現カセットが、連結反応を介して、３４ｋｂマスタープラスミドｐＢＨＧ１１のＥ３領域に挿入される。同一細胞中のＲＢおよびｐ５３遺伝子を共に置換する試みは今まで成功していないので（Ｗａｎｇら、１９９３）、本発明者らは、２つの腫瘍抑制遺伝子を同時に発現するアデノウイルスベクターは調節可能な遺伝子発現系で構成されるべきであると理由付けた。実施例１０テトラサイクリン−制御レトロウイルスベクターの構築ｋａｔレトロウイルス産生系は、通常のレトロウイルス形質導入を受けつけない造血細胞型を効率よく形質導入できる高力価レトロウイルス上清をもたらす（Ｆｉｎｅｒら、１９９４）。ハイブリッドＬＴＲを持つｋａｔレトロウイルスプラスミドベクターをＥＣ１２１４Ａ（実施例３）と組み合わせると、Ｔｃ−調節性発現を持つレトロウイルスが得られるであろう。標準的なレトロウイルスベクターを用いるいくつかの成功が文献で報告されているので、Ｔｃ−制御レトロウイルスベクターは、造血幹細胞のごときある種の細胞型の形質導入のためのＴｃ−制御アデノウイルスベクターよりも良好に作動する可能性がある。実施例１１改変型ＲＢ構築物の治療的投与Ａ．ヒト膀胱癌のインビボでの治療ヒト膀胱癌は、本発明の改変型ＲＢタンパク質発現レトロウイルスベクターを膀胱に入れることによって、固形腫瘍の腫瘍抑制遺伝子治療を行うための理想的モデルを表す。ヒト膀胱癌の元の実験モデルはＪｏｎｅｓおよび同僚によって確立された（Ａｈｌｅｒｉｎｇら、１９８７）。通常は転移しない表在性乳頭腫瘍から確立されたＲＴ４細胞系のヒト膀胱腫瘍細胞は、雌ヌードマウスの膀胱に２２−ゲージのカテーテルによって注入すると局所的にのみ腫瘍を形成した。対照的に、元々より攻撃的なヒト膀胱癌から単離されたＥＪ膀胱癌細胞は、ヌードマウス膀胱において侵入的腫瘍を生じ、これは肺に自然発生的に転移した。従って、このモデルは、レトロウイルスベクターを用いたインビボ遺伝子導入による実験的膀胱癌の治療のために使用することができる。ＲＢ^-ヒト膀胱癌細胞系５６３７（ＡＴＣＣＨＴＢ９）およびＲＢ⁺ヒト膀胱癌細胞系ＳＣａＢＥＲ（ＡＴＣＣＨＴＢ３）からの腫瘍細胞は、Ｊｏｎｅｓおよび同僚によって最初に報告されたように、カテーテルによって、雌無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）ヌードマウス（６〜８週齢）の膀胱に直接的に注入されるであろう（Ａｈｌｅｒｉｎｇら、１９８７）。ヌードマウス膀胱腫瘍の発生および進行は、ＴＶモニターを取り付けたファイバー光学系を用いてモニターされるであろう。実験的腫瘍は、引き続いて、本発明の改変型ＲＢタンパク質を発現するレトロウイルスベクターで処理されるであろう。高ウイルス力価を持つ上清が高レベルのヒト改変型ＲＢタンパク質を発現する選択されたクローンの組織培養基から得られ、使用に先立って複製能力のあるウイルスがいないことが確認されるであろう。次いで４×１０⁴〜１×１０⁷を超えるコロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌの範囲の高力価の、より好ましくは、１× １０⁶ｃｆｕ／ｍｌを超える力価のレトロウイルスベクター懸濁液を、カテーテルを介してマウス膀胱に直接的に入れて、腫瘍を治療する。当業者であれば、かかる処理は、膀胱に挿入されたカテーテルを介して、必要に応じて何回も反復することができるのを理解するであろう。改変型ＲＢ遺伝子の導入後の腫瘍後退は前記したファイバー光学系を介して頻繁にモニターされるであろう。レトロウイルスベクター懸濁液を癌にかかったヒト膀胱に注入する以外は、前記したのと同一の手法を、ヒト膀胱癌を治療するのに使用することができる。Ｂ．正常位の（Orthotopic）肺癌モデルを用いるインビボ実験正常なｐＲＢ¹¹⁰発現を有するヒトの大細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０（ＡＴＣＣＨＴＢ１７７）細胞を、無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）ヌードマウスの右主気管支に注入する（マウス当たり１０⁵細胞）。３日後、該マウスに改変型ＲＢあるいは野生型ＲＢレトロウイルス産生細胞からの上清で気管支内に毎日３日間連続して接種する。野生型ＲＢレトロウイルス上清で処理された群とは対照的に、改変型ＲＢレトロウイルス上清で処理したマウスの群における腫瘍形成抑制によって、改変型ＲＢ発現レトロウイルスがＲＢ⁺非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞の増殖を阻害し、他方、野生型ＲＢ発現レトロウイルスはそうではないことが示される。Ｃ．ヒト非小細胞肺癌のインビボでの治療気管支鏡検査が可能な気管支内腫瘍を有し、気管支閉塞も有する非小細胞肺癌患者を、改変型ＲＢ遺伝子治療のために最初に選択する。治療は局所麻酔または一般麻酔下で気管支鏡を使用して投与する。該手法を開始する前に、出来る限り大きな腫瘍を内視鏡により切除する。経気管支吸引針（２１Ｇ）を気管支鏡のバイオプシーチャンネルを通す。次いで、適当な改変型ＲＢレトロウイルスベクター上清、改変型ＲＢアデノウイルス懸濁液または改変型ＲＢ発現プラスミドベクター−リポソーム複合体を５ｍｌないし１０ｍｌの容量にて残存する腫瘍部位に注入する。プロタミンを５μｇ／ｍｌの濃度まで添加してもよい。１以上のベクターを含む治療用ウイルスまたはプラスミド上清の注入は、１以上の腫瘍の周囲またはその中に、および腫瘍に隣接する粘膜下組織内に投与する。該注入は５日間連続して繰り返し、しかる後は毎月反復する。腫瘍の進行がない限り、該治療は継続し得る。１年後、患者は継続的治療が適当か否かが評価される。さらに、予防のために、患者はウイルス上清の注入後２４時間は外科用マスクを着用する。全ての医療従事者は気管支鏡検査およびウイルス上清の注入の間は定常的にマスクを着用する。必要に応じ、鎮咳薬を処方する。Ｄ．リポソーム−カプセル化精製改変型ＲＢタンパク質でのヒト肺癌の治療および予防さらにもう１つの別法において、いずれかの公知の方法によって、本発明の改変型ＲＢタンパク質を治療を必要とする細胞に導入することによって、標的腫瘍または癌細胞が治療される。例えば、リポソームは、薬物、タンパク質およびプラスミドベクターのインビトロまたはインビボ双方にての送達ビヒクルとしてのその有用性が広範に研究された人工膜小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏら、１９８８）。赤血球アニオン輸送体（Ｎｅｗｔｏｎら、１９８８）、スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼ（Ｔａｎｓｗｅｌｌら、１９９０）およびＵＶ−ＤＮＡ修復酵素（Ｃｅｃｃｏｌｉら、１９８９）のごときタンパク質が、リポソーム小胞に高率でカプセル化され、インビトロまたはインビボにて哺乳動物細胞に送達されている。さらに、小粒子エアロゾルは、呼吸器疾患の治療用に薬物を送達する方法を提供する。例えば、薬物はリポソームをビヒクルとして用いることによって小粒子エアロゾル中にて投与できることが報告されている。エアロゾルを介して投与された薬物は、鼻咽頭、気管気管支樹の表面に、および肺領域にかなり均一に到達する（Ｋｎｉｇｈｔら、１９８８）。肺癌を治療または予防するには、治療用改変型ＲＢタンパク質を、例えば免疫アフィニティークロマトグラフィーまたはいずれかの他の便利な方法によって、組換えバキュロウイルスＡｃＭＮＰＶ−改変型ＲＢ感染昆虫細胞から精製する。次いで、改変型ＲＢタンパク質をリポソームと混合し、高率にてリポソーム小胞中に取り込む。カプセル化改変型ＲＢは依然として活性である。エアロゾル送達方法は温和であって、正常なボランティアおよび患者によって十分に許容されるので、改変型ＲＢ含有リポソームを投与して、いずれかの段階の肺癌に罹った患者を治療し、および／または高リスク集団において肺癌を予防することができる。改変型ＲＢタンパク質含有リポソームは、異常な細胞増殖を抑制するのに十分な量で、鼻吸入によって、または小粒子エアロゾルを介する気管内チューブによって投与することができる。エアロゾル治療は２週間毎日３回、３０分間患者に投与され、必要に応じて反復する。改変型ＲＢタンパク質は、それにより、呼吸管および肺領域全体に送達される。治療は必要なだけの期間継続することができる。１年後、患者の全状態を評価して、継続的治療が適当か否かを判断する。実施例１２ＲＢの再発現による老化およびテロメラーゼ阻害の誘導正常なヒトの二倍体細胞は、限定された数の細胞分裂の後にインビトロおよびインビボで老化する。細胞老化として知られているこのプロセスは老化の根底的原因であり、ヒト癌の発生についての非常に重要な障害である。本実施例は、改変型テトラサイクリン−調節遺伝子発現系を介するＲＢ／ｐ５３−欠損腫瘍細胞における機能的ｐＲＢ単独の再発現の結果、細胞周期のＧ０／Ｇ１期において安定な増殖阻止がもたらされ、種々の分裂誘発刺激に応答して、腫瘍細胞がＳ期に入るのを妨げることを示す実験を提示する。これらの細胞は、細胞老化に合致する複数の形態学的変化を呈し、老化関連β−ガラクトシダーゼバイオマーカーを発現した。加えて、腫瘍性細胞の拡大された増殖ライフスパンに必須であると考えられるテロメラーゼ活性が、（ｐ５３ではなく）ｐＲＢの発現の誘導後に腫瘍細胞系で無くなり、または抑制された。驚くべきことに、ｐＲＢ発現用の非許容培地に戻すと、ｐＲＢ−誘導老化腫瘍細胞はＤＮＡ合成を回復し、分裂しようとした。しかしながら、ほとんどの細胞は該プロセスで死滅し、これは継代後期におけるＳＶ４０Ｔ−抗原−形質転換ヒト二倍体線維芽細胞の老化後の危機と同様の現象である。これらの観察は、ＲＢ／ｐ５３−欠損腫瘍細胞におけるｐＲＢ単独の過剰発現が、複製老化と区別できない全ての一般的に許容される危機によって、これらの不滅性を逆行させ、表現型を引き起こすのに十分であるという直接的証拠を提供する。該結果は、ｐＲＢが本来の細胞老化プログラムにおいて原因となる役割を演じることができることを示す。Ａ．材料および方法Ｔｃ−調節性ｐＲＢ発現を有する腫瘍細胞系の確立元の多重プラスミドテトラサイクリンリプレッサー／オペレーターをベースとする調節系を前記で詳説したごとくに改良した。本実施例で使用した全てのＲＢ −再構成腫瘍細胞系を最初のプラスミドトランスフェクション後に少なくとも２ラウンドのサブクローニングに付し、これを純粋なクローンと考える。これらのクローンの均一性はｐＲＢ核染色によって証明した。加えて、パネルアッセイ（Ｚｈｏｕら、１９９４）を用いて、許容される条件下での機能的ｐＲＢの安定な発現を確認した。ＲＢ−再構成腫瘍細胞は、培地中、０．５μｇ／ｍｌのＴｃの存在下で全てＲＢ^-であり、他方、かなり大部分（＞９９％）の細胞が、免疫細胞化学染色によって示されるように、Ｔｃの除去の２４時間後にＲＢ⁺となった。フローサイトメトリー分析各時点で収集した単細胞懸濁液を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）(Ｓｉｇｍａ）染色前にパラホルムアルデヒドおよびエタノールで固定した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用い、全てのプロファイルを生成させた。最初のピーク（Ｍ１）はＧ０／Ｇ１の二倍体ＤＮＡを有する細胞を含有し、２倍のＰＩ−蛍光強度を持つ第２のピーク（Ｍ３）は四倍体のＧ２／Ｍ細胞を含有し、２つのピークの間の領域（Ｍ２）は、Ｓ期の細胞の総数を表す（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉら、１９９１）。ＳＡ−β−ｇａｌアッセイ該アッセイは実質的に従前に記載されているように行った（Ｄｉｍｒｉら、１９９５）。略言すれば、細胞を２％ホルムアルデヒド／０．２％グルタルアルデヒド中で５分間固定し、ｐＨ６．０で５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）で６時間染色した。染色溶液は１ｍｇ／ｍｌＸ−Ｇａｌ、４０ｍＭクエン酸／リン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、５ｍＭフェロシアン化カリウム、５ｍＭフェリシアン化カリウム、１５０ｍＭＮａＣｌおよび２ｍＭＭｇＣｌ₂を含有するものであった、テロメア反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）アッセイ技術的マニュアルに従い、方法はＫｉｍら（Ｋｉｍら、１９９４）によって記載されている元のＴＲＡＰアッセイから修飾した。略言すれば、１００ｍｍペトリ皿中で増殖させた〜１０⁶個の細胞を回収し、氷上で、２００μｌの氷冷溶解緩衝液に３０分間再懸濁させ、続いて４℃にて１００，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を０．５μｇタンパク質／μｌに希釈し、そのうち２μｌを各ＴＲＡＰアッセイで用いた。テロメラーゼ反応を３０℃で３０分間行い、これに続いて［γ−³²Ｐ］標識ＴＳプライマーでの２工程ＰＣＲ（登録商標）増幅（９４℃、３０秒および６０℃、３０秒の３３サイクル）を行った。ＰＣＲ（登録商標）増幅テロメラーゼ伸長産物を１２．５％のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動に付した。Ｂ．結果腫瘍細胞のｐＲＢ−媒介不可逆的増殖停止前記にて詳説した改変型テトラサイクリン（Ｔｃ）−調節性遺伝子発現系を用い、数ダースの長期安定型腫瘍細胞クローンを確立し、ここで、野性型ｐＲＢの発現は有意な漏出なくしてスイッチがオン及びオフされ得る。ＲＢ−再構成腫瘍細胞クローンは、各々、乳癌細胞系、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、骨肉腫細胞系Ｓａｏｓ−２、および膀胱癌細胞系５６３７から得た。これらの腫瘍細胞系はＲＢおよびｐ５３遺伝子突然変異を共に含有することが知られているので、宿主細胞として選択した（Ｗａｎｇら、１９９３、Ｃｈｅｎら、１９９０、Ｂｅｒｒｙら、１９９６、Ｍａｓｕｄａら，１９８７）。ウェスタンブロッティングによって測定されるように、腫瘍細胞で誘導されたｐＲＢタンパク質は、細胞培地からテトラサイクリンを除去した約２４時間後に最高レベルに到達し、次いで２４ないし４０時間内に完全に脱リン酸化された。腫瘍細胞増殖に対するｐＲＢ発現の誘導の効果を、引き続いて、増殖曲線および（³Ｈ）チミジンの取り込み（Ｘｕら、１９９４ｂ）を測定することによって、あるいはフローサイトメトリー分析（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉら、１９９１）によって、代表的クローンで調べた。調べた全ての長期腫瘍細胞クローンの細胞増殖およびＤＮＡ合成は、ｐＲＢ発現が誘導された２４ないし４８時間後に停止した( 図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃ)。かなり大部分の腫瘍細胞は細胞周期のＧ０／Ｇ１期で阻止された。無Ｔｃ培地におけるｐＲＢ発現の４日間の誘導の後、腫瘍細胞の増殖停止は、血清成長因子、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）およびコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）のごとき種々のマイトジェンでの刺激によっても不可逆的であった。これは、図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃに示した連続的に平坦な増殖曲線および細胞分裂刺激に応答して（³Ｈ）チミジンを腫瘍細胞が取り込むことができないことによって判断した。一方、腫瘍細胞は、細胞拡大、偏平化および細胞周期よりも低い核細胞質比率のごとき、細胞老化と合致する驚くべき形態学的変化を呈した。さらに、ＤＮＡ断片化によって測定すると、少量の低分子量ＤＮＡが、非許容的であるがｐＲＢ発現にとっては許容的でない条件で増殖させたＲＢ−再構成Ｓａｏｓ−２腫瘍細胞から調製したＤＮＡ試料でしばしば観察された。この知見は、ｐＲＢ発現の誘導によって阻害された、ＲＢ−欠損腫瘍細胞培養の低レベルの自然発生的アポトーシスを示唆した。加えて、ＲＢ−再構成５６３７およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞系におけるｐＲＢ発現のスイッチングもまたＩＦＮ− γ−誘導アポトーシス細胞死滅を阻害した。老化−関連β−ガラクトシダーゼの発現培養中およびインビボで老化した皮膚中の老化ヒト細胞を同定するバイオマーカーが最近報告されている。老化−関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）と命名されたこのマーカーは、老化した線維芽細胞で発現し、老化していない線維芽細胞で発現しない。また、ＳＡ−β−ｇａｌは不滅化細胞には存在しないが、不滅性を逆行させる遺伝子操作によって誘導された（Ｄｉｍｒｉら、１９９５）。若い（初期継代）ヒトＷＩ−３８線維芽細胞はＳＡ−β−ｇａｌ陰性であり、他方、老化した（５２より大の倍化レベルの集団で）ＷＩ−３８細胞は強力なＳＡ−β−ｇａｌ陽性であり、これはＳＡ−β−ｇａｌアッセイのための有用な対照である。Ｔｃ−応答性ＲＢ−再構成腫瘍細胞クローンはＴｃの存在下（すなわち、ＲＢ−状態）で全くＳＡ−β−ｇａｌ陰性であり、この腫瘍細胞の大部分は、無Ｔｃ培地中の４ないし５日間のｐＲＢ発現の誘導後にＳＡ−β−ｇａｌ陽性となった。腫瘍細胞中のこの老化−関連バイオマーカーの検出は腫瘍細胞集団の不可逆的増殖停止と一致した（図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃ）。しかしながら、誘導したＲＢ⁺腫瘍細胞のＳＡ−β−ｇａｌ染色の強度は腫瘍細胞の型に応じて変化する。腫瘍細胞における（ｐ５３ではなく）ｐＲＢの再発現はテロメラーゼ活性を阻害した。テロメラーゼは細胞老化におけるレギュレーターの魅力的な候補として最近出現し（Ｌｉｎｓｋｅｎｓら、１９９５、Ｋｌｉｎｇｅｌｈｕｔｚら、１９９６）、ｐＲＢおよびｐ５３置換の、宿主腫瘍細胞のテロメラーゼ活性に対する効果を調べた。これに関連して、骨肉腫細胞系Ｓａｏｓ−２からのＴｃ−調節性野性型ｐ５３発現を有するいくつかの長期安定型腫瘍細胞クローンを確立した。最近記載された（Ｋｉｍら、１９９４）テロメア反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）アッセイを用いて、ｐＲＢ（またはｐ５３）発現の誘導前後における腫瘍細胞でのテロメラーゼ活性を測定した。ｐＲＢ発現の誘導に先立ち、調べた全ての３つのＲＢ／ｐ５３−欠損腫瘍型からのＲＢ−再構成腫瘍細胞クローンはテロメラーゼ活性につき陽性であり、他方、ｐＲＢ発現にスイッチが入った後に腫瘍細胞において、相対的テロメラーゼ活性は、デジタル化イメージのデンシトメトリーによって見積もって、〜１５ないし＞１００倍低かった。事実、テロメラーゼ活性は、ｐＲＢ−発現ＭＤＡ−ＭＢ −４６８およびＳａｏｓ−２腫瘍細胞においてほとんど検出できなかった。対照的に、Ｓａｏｓ−２における野性型ｐ５３発現の誘導の結果、ＲＢ^-／ｐ５３^nul ^l 腫瘍細胞の増殖阻止がもたらされたが、ｐ５３−再構成Ｓａｏｓ−２腫瘍クローンは、それらのｐ５３状態では影響されなかった陽性テロメラーゼ活性を執拗に呈した。かくして、テロメラーゼ活性の差異は細胞増殖の差異として単純には説明できない。ｐＲＢ除去後のｐＲＢ−誘導老化腫瘍細胞の老化後の危機ｐＲＢ−誘導腫瘍細胞の老化は、機能的ｐＲＢの継続した発現に厳密に依存した。前記で示したごとく、４日以上の間の無Ｔｃ培地におけるｐＲＢ発現の誘導の後、ＲＢ−再構成ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｓａｏｓ−２、および５６３７腫瘍細胞は老化した。しかしながら、これらの腫瘍細胞がｐＲＢ発現用の非許容培地に戻されると、細胞−細胞接着を失い、ペトリ皿から脱着し、死滅した非常に多数の腫瘍細胞が観察された。この現象をさらに特徴付けするために、腫瘍細胞のｐＲＢ免疫細胞化学染色および（³Ｈ）チミジンイン・ジツ標識を含めた組合せ方法を使用した。無Ｔｃ培地に４ないし５日間維持されたＲＢ−再構成Ｓａｏｓ−２腫瘍細胞培養に０．５μｇ／ｍｌのＴｃを添加した後、ほとんどの全ての腫瘍細胞が外因性ｐＲＢを枯渇させ、６日目においてＲＢ^-になることが分かった。引き続いて、９ないし１０日目において、腫瘍細胞はＤＮＡ合成を回復したが、その大部分は驚くほど異常な核を有した。これらは、分裂しようとしたが、ほとんどは該プロセス中に死滅した。これらの腫瘍細胞は、後期継代におけるＴ−抗原−形質転換ヒト細胞の老化後の危機との顕著な類似性を示す表現型を呈した(Ｓｔｅｉｎ、１９８５)。要約すれば、ＲＢ−欠損腫瘍細胞における機能的ｐＲＢの再発現はテロメラーゼ活性の阻害と同時に増殖停止を誘導した。腫瘍細胞はマイトジェン応答性を不可逆的に喪失し、生きたＧ１−停止状態に入る。また、それらは、ｐＲＢ−依存性ＳＡ−β−ｇａｌ陽性性（老化関連バイオマーカー）およびアポトーシス細胞死に対する耐性を呈した。注目すべきは、ＲＢ^-／ｐ５３^nullＳａｏｓ−２における野性型ｐＲＢまたはｐ５３いずれかの置換は、集団レベルで腫瘍細胞増殖をブロックすることができたが、ｐＲＢのみがテロメラーゼの阻害を誘導した。さらに、ｐＲＢ−誘導老化腫瘍細胞におけるｐＲＢの除去は、危機様の表現型につながった。これらの観察は、一緒にすると、ｐＲＢは細胞老化プログラムに原因的に関与することを示唆する。これらの結果は、種々のＲＢ−欠損腫瘍細胞におけるｐＲＢ単独の過剰発現がその不滅性を逆行させ、真実の（bona fide）複製老化を引き起こすのに十分であるという第一の直接的証拠である。また、調べた全ての３つのＲＢ−欠損腫瘍細胞系はｐ５３突然変異を有するので、ｐＲＢ−媒介腫瘍細胞老化は、明らかに、野性型ｐ５３の機能を要しない。かくして、ｐＲＢおよびテロメラーゼの新しい関係が示される。テロメア反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）アッセイによって、ＲＢ−欠損腫瘍細胞におけるｐＲＢの再発現はテロメラーゼ活性を阻害することが示された。非常に少数のテロメラーゼ陽性細胞において酵素活性を検出するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ( 登録商標)）をベースとしたＴＲＡＰアッセイの高感度、および絶対的に純粋なＲＢ−再構成細胞クローンを得る困難性のため、ＲＢ−欠損腫瘍細胞におけるテロメラーゼ活性の阻害に対するｐＲＢ再発現の効果は、インビトロアッセイによって検出されたものよりもずっと大きいと思われる。また、ｐＲＢ（またはｐ５３）発現用の非許容的条件で維持すると、ｐＲＢ− 再構成Ｓａｏｓ−２クローンは、明らかに、ｐ５３−再構成Ｓａｏｓ−２クローンよりもかなり低いテロメラーゼ活性を有することも注目に値する。該差異は、無Ｔｃ培地におけるｐＲＢ発現のスイッチオンの前であっても、Ｓａｏｓ−２細胞におけるＴｃ−応答性プロモーターからのｐＲＢ発現のベースラインは低くなければならないことを意味する（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、１９９５）。非許容的条件下でのｐＲＢ−再構成腫瘍細胞におけるｐＲＢの漏出性は、ｐＲＢタンパク質用の免疫検出閾値（Ｘｕら、１９９１ｂ）未満であるが、ほとんどのテロメラーゼ活性を阻害するのに十分であるかもしれない。テロメラーゼ活性を欠く腫瘍細胞はテロメア減衰を回復するようなので、これは結局は、腫瘍細胞で無傷のままであれば、固有の細胞老化プログラムを引き起こすであろう。＊−−−−−−＊−−−−−−＊本明細書に開示された全ての組成物および方法は本開示に徴して過度の実験なくして製造し実施することができる。本発明の組成物および方法を好ましい具体例により記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載された組成物および方法ならびに方法の工程または工程列に変形を適用することができるのは当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的および物理的双方にて関連するある薬剤は、同一または同様の結果が達成されつつ、本明細書に記載された薬剤に変えて置換することができる。全てのそのような同様の置換および修飾は当業者に明らかであり、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあるとみなされる。参考文献以下の参考文献は、それらが本明細書に記載したものを補足する例示的手順または他の細部を提供する程度に、参照により本明細書中に特に組み入れられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/19 15/00 ＺＮＡＡ 1/21 5/00 Ａ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者フ，シ−シュエアメリカ合衆国テキサス州，ウッドランズ (72)発明者ベネディクト，ウィリアム，エフ. アメリカ合衆国テキサス州，ウッドランズ (72)発明者ゾウ，ユンリアメリカ合衆国テキサス州，ウッドランズ

Claims

【特許請求の範囲】 1. pRB⁹⁴以外の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする単離された遺伝子を含むDNAセグメントであって、前記改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質がN末端の改変を含むものである、上記DNAセグメント。 2. 前記遺伝子は、少なくとも1個のアミノ酸が欠失されている第1配列の領域を含むN末端領域を含む改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする、請求項1に記載のDNAセグメント。 3. 前記第1配列の領域から少なくとも2個のアミノ酸が欠失されている、請求項 2に記載のDNAセグメント。 4. 前記第1配列の領域から少なくとも約25個のアミノ酸が欠失されている、請求項3に記載のDNAセグメント。 5. 前記第1配列の領域から少なくとも約100個のアミノ酸が欠失されている、請求項4に記載のDNAセグメント。 6. 前記第1配列の領域から少なくとも約150個のアミノ酸が欠失されている、請求項5に記載のDNAセグメント。 7. 前記第1配列の領域から少なくとも約300個のアミノ酸が欠失されている、請求項6に記載のDNAセグメント。 8. 前記第1配列の領域が次の位置： a)約アミノ酸1と約アミノ酸50の間、 b)約アミノ酸51と約アミノ酸100の間、 c)約アミノ酸101と約アミノ酸150の間、 d)約アミノ酸151と約アミノ酸200の間、 e)約アミノ酸201と約アミノ酸250の間、 f)約アミノ酸251と約アミノ酸300の間、 g)約アミノ酸1と約アミノ酸100の間、 h)約アミノ酸51と約アミノ酸150の間、 i)約アミノ酸101と約アミノ酸200の間、 j)約アミノ酸151と約アミノ酸250の間、 k)約アミノ酸201と約アミノ酸300の間、 l)約アミノ酸1と約アミノ酸150の間、 m)約アミノ酸51と約アミノ酸200の間、 n)約アミノ酸101と約アミノ酸250の間、 o)約アミノ酸151と約アミノ酸300の間、 p)約アミノ酸1と約アミノ酸200の間、 q)約アミノ酸51と約アミノ酸250の間、 r)約アミノ酸101と約アミノ酸300の間、 s)約アミノ酸1と約アミノ酸250の間、 t)約アミノ酸51と約アミノ酸300の間、または u)約アミノ酸1と約アミノ酸300の間、にある、請求項2に記載のDNAセグメント。 9. a)約アミノ酸2〜約アミノ酸34が前記第1配列の領域から欠失されている、 b)約アミノ酸2〜約アミノ酸55が前記第1配列の領域から欠失されている、 c)約アミノ酸2〜約アミノ酸78が前記第1配列の領域から欠失されている、 d)約アミノ酸2〜約アミノ酸97が前記第1配列の領域から欠失されている、 e)約アミノ酸2〜約アミノ酸148が前記第1配列の領域から欠失されている、 f)約アミノ酸31〜約アミノ酸107が前記第1配列の領域から欠失されている、 g)約アミノ酸77〜約アミノ酸107が前記第1配列の領域から欠失されている、 h)約アミノ酸111〜約アミノ酸181が前記第1配列の領域から欠失されている、 i)約アミノ酸111〜約アミノ酸241が前記第1配列の領域から欠失されている、 j)約アミノ酸181〜約アミノ酸241が前記第1配列の領域から欠失されている、または k)約アミノ酸242〜約アミノ酸300が前記第1配列の領域から欠失されている、請求項2に記載のDNAセグメント。 10．前記改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質は少なくとも1個のアミノ酸が欠失されている第２配列の領域をさらに含む、請求項2に記載のDNAセグメント。 11．約アミノ酸2〜約アミノ酸34および約アミノ酸76〜約アミノ酸112が欠失されている、請求項10に記載のDNAセグメント。 12．約アミノ酸2〜約アミノ酸55および約アミノ酸76〜約アミノ酸112が欠失されている、請求項10に記載のDNAセグメント。 13．前記遺伝子が少なくとも第1のN末端突然変異を含む改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードし、前記改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質が対応する野生型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の生物学的活性と比較して増大した生物学的活性を有する、請求項1に記載のDNAセグメント。 14．前記遺伝子が111位に突然変異を含む改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする、請求項13に記載のDNAセグメント。 15．前記改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質が111位にアスパラギン酸の代わりにグリシンを含む、請求項14に記載のDNAセグメント。 16．前記改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質が少なくとも第2のN末端突然変異を含む、請求項13に記載のDNAセグメント。 17．前記遺伝子が111位の突然変異および112位の突然変異を含む改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする、請求項16に記載のDNAセグメン載ト。 18．前記改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質が111位にアスパラギン酸の代わりにグリシンを、そして112位にグルタミン酸の代わりにアスパラギン酸を含む、請求項17に記載のDNAセグメント。 19．前記遺伝子は、少なくとも1個のアミノ酸が欠失されておりかつ少なくとも 1個のアミノ酸の突然変異をもつN末端領域を含む改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする、請求項1に記載のDNAセグメント。 20．前記遺伝子が少なくとも配列番号2の約370位〜約928位のC末端アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする、請求項2 に記載のDNAセグメント。 21．前記遺伝子が配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号 37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、または配列番号51の連続アミノ酸配列を含む改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする、請求項2に記載のDNAセグメント。 22．前記遺伝子が配列番号28の7位〜2691位、配列番号30の7位〜2628位、配列番号32の7位〜2559位、配列番号34の7位〜2502位、配列番号36の7位〜2349位、配列番号38の7位〜2559位、配列番号40の7位〜2697位、配列番号42の7位〜258 3位、配列番号44の7位〜2397位、配列番号46の7位〜2613位、配列番号48の7位〜2619位、または配列番号50の7位〜2790位、からの連続核酸配列を含む、請求項2に記載のDNAセグメント。 23．プロモーターの制御下で機能的に位置づけられた、請求項1に記載のDNAセグメント。 24．組換えベクターとしてさらに特定された、請求項23に記載のDNAセグメント。 25．前記組換えベクターがアデノウイルスベクター内に含まれる、請求項24に記載のDNAセグメント。 26．前記アデノウイルスベクターが組換え体アデノウイルス内に含まれる、請求項25に記載のDNAセグメント。 27．宿主細胞内に含まれている、請求項1に記載のDNAセグメント。 28．前記宿主細胞が真核細胞である、請求項27に記載のDNAセグメント。 29．前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項28に記載のDNAセグメント。 30．前記宿主細胞が腫瘍細胞である、請求項28に記載のDNAセグメント。 31．前記宿主細胞が動物内に含まれている、請求項28に記載のDNAセグメント。 32．前記動物がヒト被験者である、請求項31に記載のDNAセグメント。 33．製薬上許容される賦形剤中に分散されている、請求項1に記載のDNAセグメント。 34．前記改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質が、 a）少なくとも1個のアミノ酸が欠失されている少なくとも第1配列の領域を含むN末端領域を含み、該改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質が対応する野生型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の生物学的活性に少なくともほぼ等しい生物学的活性を有する、または b）少なくとも1つの突然変異をもつ第1配列の領域を含むN末端領域を含み、該改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質が対応する野生型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の生物学的活性と比較して増大した生物学的活性を有する、点に特徴がある、請求項1に記載のDNAセグメント。 35．改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の発現に使用するための請求項1〜34のいずれか1項に記載のDNAセグメント。 36．改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の発現における請求項1〜34 のいずれか1項に記載のDNAセグメントの使用。 37．細胞増殖の抑制に使用するための請求項1〜34のいずれか1項に記載のDNAセグメント。 38．細胞増殖の抑制における請求項1〜34のいずれか1項に記載のDNAセグメントの使用。 39．細胞増殖抑制用の医薬の製造に使用するための請求項1〜34のいずれか1項に記載のDNAセグメント。 40．細胞増殖抑制用の医薬の製造における請求項1〜34のいずれか1項に記載のDN Aセグメントの使用。 41．癌治療用の医薬の製造に使用するための請求項1〜34のいずれか1項に記載の DNAセグメント。 42．癌治療用の医薬の製造における請求項1〜34のいずれか1項に記載のDNAセグメントの使用。 43．N末端の改変を含む、pRB⁹⁴以外の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質であって、対応する野生型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の生物学的活性に少なくともほぼ等しい生物学的活性を有する、上記改変型レチノブブラストーマ腫瘍抑制タンパク質。 44．N末端の改変を含む、pRB⁹⁴以外の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする単離された遺伝子を含むDNAセグメントを含有する組換え宿主細胞。 45．前記宿主細胞が腫瘍細胞である、請求項44に記載の組換え宿主細胞。 46．N末端の改変を含む、pRB⁹⁴以外の第1の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の有効抑制量に細胞を接触させることを含んでなる、細胞増殖の抑制方法。 47．前記細胞内で第1の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質を発現するDNAセグメントを前記細胞に供給することにより、前記第1の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質に前記細胞を接触させる、請求項46に記載の方法。 48．前記細胞が動物内にあり、前記第1の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質または前記第1の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子を製薬上許容されるビヒクルで前記動物に投与する、請求項46 に記載の方法。 49．前記細胞内で細胞増殖を抑制するのに有効な組合せ量の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質およびp53腫瘍抑制タンパク質に前記細胞を接触させる、請求項46に記載の方法。 50．細胞における細胞増殖を抑制するのに有効な組合せ量のレチノブラストーマタンパク質およびp53タンパク質に前記細胞を接触させることを含んでなる、細胞増殖の抑制方法。 51．N末端の改変を含む、pRB⁹⁴以外の第1の改変型レチノブラストーマ腫瘍抑制タンパク質の生物学的に有効な抑制量を含有する医薬として許容される組成物を、癌にかかった動物に投与することを含んでなる、癌の治療方法。