KR20000075501A

KR20000075501A - 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질

Info

Publication number: KR20000075501A
Application number: KR1019997007560A
Authority: KR
Inventors: 홍지 슈; 쉬-수이 휴; 윌리암 에프 베네딕트; 운리 즈후
Original assignee: 더 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템; 사무엘 에스. 크로커; 베이롤 칼리지 오브 메드신
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 2000-12-15
Also published as: WO1998037091A2; IL131496A0; CN1259998A; EP0975750A2; WO1998037091A3; JP2001512325A; CA2281899A1; AU6657398A

Abstract

본 발명은 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질에 대해 설명하는데, 이 단백질은 이에 상응하는 야생형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질의 생물학적 활성과 적어도 등가의 생물학적 활성을 가지고, 대부분의 경우에는 휠씬 활성이 증가된 것으로, 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질로는 예를 들면, N-말단에 적어도 한가지 아미노산 결손 또는 한가지 돌연변이를 가지는 N-말단이 변형된 것이다. 또한, 세포 생장을 저해하고자 하는 환경에서 이와 같은 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질을 만들고 이용하는 방법에 대해 설명한다. 따라서, 본 발명은 비정상적인 세포 증식을 특징으로 하는 암과 같은 질병을 치료하는 방법을 제공하나, 암에 국한되지는 않는다.

Description

변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질{MODIFIED RETINOBLASTOMA TUMOR SUPPRESSOR PROTEINS}

미국에서 암과 종양은 두 번째 사망원인으로서 매년 약 450,000명의 사망의 원인이 된다. 미국인 3명중 한 명이 암이 발병하며 5명중 한 명이 암으로 사망한다(Scientific American Medicine, part 12, I. 1, 1987). 암의 환경적 및 유전적 원인을 식별하는데 상당한 진보가 있었을지라도 암사망률에 대한 통계는 암과 관련 질병 및 장애의 치료에 상당한 개선이 필요함을 보여준다.

수많은 유전자가 암의 원인에 관련된다. 이들 유전자는 암의 유전적 형태와 관련하여 수많은 잘 연구된 종양 세포에서 확인된다. 암 유전자의 연구는 종양형성과정에 대한 이해를 돕는다. 암 유전자에 대해 연구될 부분이 많이 남아있지만 현재 알려진 암 유전자도 종양형성과정을 이해하는데 유용한 모델 역할을 한다. 암 유전자는 활성화될 때 종양형성을 촉진시키는 "종양 유전자"와 손상될 때 종양형성을 억제할 수 없는 "종양 억제 유전자"로 분류된다. 이러한 분류는 종양형성 과정을 개념화하는데 유용한 방법이지만 유전자의 대립형질 형태와 조절요소, 작동하는 조직 환경 및 유전적 배경에 따라서 특정 유전자는 상이한 역할을 수행할 수 있다.

종양 유전자는 야생형 대립유전자(원시종양유전자로 칭하는)로 부터 특정 조건하에서 종양형성을 유도할 수 있는 형태로 돌연변이 되는 체세포 유전자이다. 공지된 그리고 추정되는 종양 유전자와 이의 다양한 대립유전자에 대해 상당한 문헌이 존재한다. 예컨대 종양 유전자 ras와 myc는 종양형성 과정을 이해하는 모델로서 고려된다. ras 종양 유전자는 세포질 단백질을 암호화하며 myc 종양 유전자는 핵단백질을 암호화한다. ras 종양 유전자도 myc 종양 유전자도 단독으로는 정상 세포의 종양 세포로의 완전 변환을 유도할 수 없지만 ras 및 myc 종양 유전자가 동일한 세포에서 둘다 존재하여 함께 표현될 때 완전 종양형성과정이 일어난다(Weinberg, 1989). 이러한 협동 효과가 기타 연구된 종양 유전자에서도 관찰된다.

종양 유전자 종양형성과정의 협동 모델은 정상 세포로 둘러싸인 ras 종양 유전자를 표현하는 세포가 완전 변형을 겪지 않는다는 관찰에 의해 입증된다. 그러나, 에워싸는 대부분의 세포가 역시 ras-표현형이면 ras 종양 유전자 단독으로도 ras-표현형 세포에서 종양형성을 유도하기에 충분하다. 이러한 관찰은 종양형성의 다중 원인 이론을 확인시켜 주는데, 그 이유는 종양 유전자를 가진 세포의 조직 환경 변화가 제 2 원인으로 간주될 수 있기 때문이다. 또다른 가설은 ras 또는 myc와 같은 종양 유전자의 활성화와 함께 작동하는 사건은 음의 조절 인자, 예컨대 종양 억제 단백질의 불활성화를 포함할 수 있다는 것이다(Weinberg, 1989; Goodrich, 1992a).

종양 억제 유전자는 야생형 대립 유전자에서 비정상적인 세포 증식을 억제하는 단백질을 표현하는 유전자이다. 종양 억제 단백질을 암호화하는 유전자가 돌연변이 되거나 결손될 때 결과의 돌연변이 단백질이나 결핍된 종양 억제 단백질은 세포 증식을 제대로 조절할 수 없다. 이것은 특히 세포 조절 메카니즘에서 기존의 손상이 있을 경우에 비정상적인 세포증식을 가져올 수 있다. 세포 증식 조절의 실패는 다양한 인체 암의 발병과 관련된다(Weinberg, 1991). 수많은 잘 연구된 인체 종양 및 종양 세포 라인이 기능을 발휘 못하는 종양 억제 유전자를 갖는 것으로 보여진다.

종양 억제 유전자의 예로는 망막모세포종(RB) 유전자(Friend et al., 1986; Fung et al., 1987; Lee et al., 1987a), 야생형 p53 유전자((Finlay et al., 1989; Baker et al., 1990), 결손된 결장암(DCC) 유전자(Fearon et al., 1990a; 1990b), 다발성 신경섬유종 타입 1(NF-1) 유전자(Wallace et al., 1990; Viskochil et al., 1990; Cawthon et al., 1990), 빌름스 종양(WT-1) 유전자(Call et al., 1990; Gessler et al., 1990; Pritchard-Jones et al., 1990), von Hippel-Lindau (VHL) 질병 종양 억제 유전자(Duan et al., 1995), Maspin(Zou et al., 1994), Brush-1(Schott et al., 1994), 유방암 BRCA 1 유전자(Miki et al., 1994; Futreal et al., 1994), 다중 종양 억제 유전자(MTS) 또는 p16 유전자(Serrano et al., 1993; Kamb et al., 1994)가 있다. 추정되는 종양 억제 유전자 리스트는 광대하며 종양 억제 유전자의 총수는 50개 이상으로 추정된다(Knudson, 1993).

확인된 제 1 종양 억제 유전자는 유전적 망막모세포종을 초래하는 망막모세포종(RB) 유전자이다(Knudson, 1971; Murphree and Benedict, 1984; Knudson, 1985). 1980년대 중반에 복제된 망막모세포종(RB) 유전자는 가장 잘 연구된 종양 억제 유전자중 하나이다. 약 4.7kb의 RB 유전자 상보성 DNA(cDNA)의 크기는 유전자 조작을 쉽게 하여서 RB 유전자를 여러 세포라인에 삽입할 수 있게 한다. 대부분의 망막모세포종, 유연 조직 및 뼈의 육종, 및 20 내지 40%의 가슴, 폐, 전립선 및 방광 암종(Lee et al., WO 90/05180; Bookstein et al., 1991; Benedict et al., 1990)에서 RB 유전자가 손실 또는 결핍된 것으로 보여진다.

배양된 RB 유전자가 종양 억제 유전자이다는 가장 직접적인 증거는 배양된 RB 유전자의 도입으로 RB-마이너스 종양 세포의 종양 억제 기능이 회복된다는 것이다. 상이한 형태의 암으로 부터 RB-결함 종양 세포에서 RB 유전자의 대체는 누드 마우스의 종양형성 활동을 억제할 수 있다는 수많은 보고서가 있다(Huang et al., 1988; Goodrich and Lee, 1993; Zhou et al., 1994b). 연구된 종양세포 라인은 망막모세포종, 골수육종, 방광, 전립선, 가슴 및 폐의 육종과 같은 다양한 형태의 인체 암으로 부터 유도되었다.

RB-결핍 종양 세포에 기능성 야생형 완전한 망막모세포종 유전자(RB¹¹⁰)를 도입하면 세포를 "정상화"하지만 이미 정상 RB¹¹⁰유전자 표현형("RB⁺")을 가진 종양 세포는 RB¹¹⁰유전자 치료에 반응하지 못한다. 왜냐하면 추가 RB 표현형을 첨가하면 비-RB 유전자 결함을 치유할 수 없기 때문이다. 이것은 RB⁺골수육종 세포 라인 U-2 OS에서 나타나는데, 여기서 추가 p110^RB의 도입은 종양 표현형을 변화시키지 못한다(Huang, 1988). 따라서 임의의 유전자 결함을 가지며 비정상적으로 증식하는 세포를 치료하는 광범위한 종양 억제 유전자가 필요하다.

RB¹¹⁰cDNA 오픈 판독 프레임 서열(McGee, 1989)은 누클레오티드 355-357에서 엑손 3 에 위치된 제 2 인-프레임 AUG 코돈을 포함한다. AUG 코돈에서 개시된 단백질은 전체 길이 RB 단백질의 N-말단 112 아미노산 잔기가 부족하며 pRB⁹⁴로 칭한다(Xu, 1994b). 미국특허 5,496,731 에서 외인성 pRB⁹⁴를 표현하는 RB-결함 종양세포가 [³H]-티미딘을 DNA에 포함시킬 수 없다는 사실에 의해 입증되듯이 세포 싸이클을 통해 발현되지 못함이 발견되었다. 대조적으로 DNA 복제를 겪는 종양세포의 비율은 RB^-인 세포에서 보다 외인성 pRB¹¹⁰(야생형 pRB 단백질)을 생성하는 세포에서 약간 더 낮다. 훨씬 놀라운 사실은 pRB⁹⁴표현형이 조사된 두 개의 RB⁺(정상 RB 대립유전자를 갖는) 종양 세포라인, 즉 섬유육종 세포라인 HT 1080과 경부 육종 세포라인 HeLa의 군체형성을 감소시키지만(Xu, 1994b), 추가 pRB¹¹⁰코드화 유전자가 플라스미드 벡터를 사용한 트랜스펙션(Fung, 1993) 또는 마이크로셀 융합(Anderson, 1994)에 의해 도입될 때 이러한 효과는 관찰되지 않는다는 것이다.

그러나, 질병, 특히 암 치료시 필요한 모든 성질을 가지는 종양 억제 단백질은 당해분야에서 소수이다.

발명의 요약

본 발명의 변성된 망막모세포종 종양 억제 유전자는 당해분야의 문제를 극복하여서 놀라운 유익한 효과를 갖는 광범위한 종양 억제 유전자를 제공한다.

본 발명은 세포 성장을 억제하는데 야생형 망막모세포종 종양 억제 단백질보다 효과적인 광범위한 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 제공한다. 특히, 본 발명은 변성된 N-말단 지대를 갖는 망막모세포종 종양 억제 단백질을 제공한다. 또한 본 발명은 특히 세포 성장 억제가 필요한 상황에서 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 제조 및 사용하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 비정상적인 세포 증식을 특징으로 하는 암과 같은 질병의 치료 방법을 제공한다.

광범위한 종양 억제 유전자는 종양세포와 같이 비정상적으로 증식하는 호스트 세포에 삽입되어 표현될 때 비정상적인 증식의 원인과 관계없는 세포의 비정상적인 증식을 억제하는 단백질을 코드화하는 유전자 서열이다.

따라서, 본 발명은 pRB⁹⁴또는 pRB⁵⁶이외에 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화하는 고립된 유전자를 포함하는 고립된 DNA 세그멘트를 제공하며, 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질은 N-말단 변성을 포함한다. "pRB⁹⁴" 및 "pRB⁵⁶"은 각각 94kDa 및 56kDa의 분자량을 갖는 망막모세포종 단백질이다. pRB⁹⁴및 pRB⁵⁶망막모세포종 단백질은 전체 길이의 야생형 망막모세포종 단백질중 각각 N-말단에서 112 및 379 인접 아미노산이 결손된 프래그먼트이다.

"N-말단" 또는 "N-말단 지대"는 아미노산 서열의 40%에 해당하는 단백질 지대를 말한다. 따라서 이들 용어는 단백질의 아미노산 서열중 최대 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 35%를 포함한다. 그러나 이들 값은 근사값이므로 2%, 3%, 6%, 7%, 11%, 13%, 17%, 18%, 22%, 26%, 33%, 37%, 38%, 41%, 42% 와 같은 중간값을 포함할 수 있다.

"변성된"이란 용어는 야생형 단백질 서열의 결손 또는 돌연변이를 의미한다. 또한 이종 아미노산을 야생형 단백질 서열에 삽입함을 의미할 수도 있다. 또 다른 측면에서 야생형 아미노산 서열의 전좌를 의미할 수도 있다.

또 다른 구체예에서 유전자는 하나 이상의 아미노산이 결손된 제 1 서열지대를 포함하는 N-말단 지대를 포함한 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화한다. 이러한 결손은 야생형 망막모세포종 종양 억제 단백질의 생물학적 활성이상의 생물학적 활성도를 갖는 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 생성할 수 있다.

한 구체예에서 유전자는 제 1 서열 지대에서 두 개 이상의 아미노산이 결손된 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화한다. 다른 구체예에서 5개 이상, 10개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 또는 100개 이상의 아미노산이 제 1 서열지대로 부터 결손된다. 다음과 같은 중간 결손크기도 고려될 수 있다: 3, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 아미노산.

또 다른 측면에서 유전자는 제 1 서열지대로 부터 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 또는 370개 이상의 아미노산이 결손된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화한다. 다음과 같은 중간 결손크기도 고려될 수 있다: 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378 아미노산.

또 다른 구체예에서 유전자는 아미노산 1과 아미노산 50 사이에 위치되며 1개 이상의 아미노산이 결손된 제 1 서열지대를 포함하는 N-말단지대를 갖는 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화한다. "아미노산 1과 아미노산 50 사이에"는 아미노산 1과 아미노산 50을 포함한다. 아미노산 1은 N-말단 아미노산이고 수치는 C-말단을 향해 증가한다.

또 다른 구체예에서, 제 1 서열은 아미노산 51과 아미노산 100 사이, 아미노산 101과 아미노산 150 사이, 아미노산 151과 아미노산 200 사이, 아미노산 201과 아미노산 250 사이 또는 아미노산 251과 아미노산 300 사이에 위치된다.

또 다른 구체예에서 유전자는 제 1 서열 지대가 아미노산 1과 아미노산 100 사이, 아미노산 51과 아미노산 150 사이, 아미노산 101과 아미노산 200 사이, 아미노산 151과 아미노산 250 사이 또는 아미노산 201과 아미노산 300 사이에 위치되는 변성된 망막모세포종 종양 단백질을 코드화한다.

또 다른 구체예에서 유전자는 제 1 서열 지대가 아미노산 1과 아미노산 150 사이, 아미노산 51과 아미노산 200 사이, 아미노산 101과 아미노산 250 사이 또는 아미노산 151과 아미노산 300 사이에 위치되는 변성된 망막모세포종 종양 단백질을 코드화한다.

또 다른 구체예에서 유전자는 제 1 서열 지대가 아미노산 1과 아미노산 200 사이, 아미노산 51과 아미노산 250 사이, 아미노산 101과 아미노산 300 사이, 아미노산 1과 아미노산 250 사이, 아미노산 51과 아미노산 300 사이, 아미노산 1과 아미노산 300 사이, 또는 아미노산 1과 아미노산 370 사이에 위치되는 변성된 망막모세포종 종양 단백질을 코드화한다.

본 발명의 또 다른 측면에서 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질은 제 1 서열지대로 부터 아미노산 2에서 아미노산 34 까지가 결손된 단백질이다. 특정 아미노산의 위치는 인체 야생형 망막모세포종 단백질에 대한 것이나 상동 망막모세포종 단백질의 상동 지대에 대응한다. 또 다른 경우에 아미노산 2에서 아미노산 55까지가 제 1 서열 지대로 부터 결손되거나 아미노산 2 내지 아미노산 78 까지가 제 1 서열지대로 부터 결손된다. 특히 아미노산 2 내지 아미노산 97 까지가, 또는 아미노산 2 내지 아미노산 148 까지가 제 1 서열지대로 부터 결손된다.

본 발명의 또 다른 측면에서 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질은 제 1 서열지대로 부터 아미노산 31에서 아미노산 107 까지가 결손된 단백질이다. 또 다른 구체예에서 아미노산 77 내지 아미노산 107, 아미노산 111 내지 아미노산 181, 아미노산 111 내지 아미노산 241, 아미노산 181 내지 아미노산 241, 아미노산 242 내지 아미노산 300 까지가 제 1 서열지대로 부터 결손된다.

본 발명의 한 측면에서 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질의 N-말단 지역은 하나 이상의 아미노산이 결손된 적어도 하나의 제 2 서열지대를 포함한다. 한 측면에서 아미노산 2 내지 아미노산 34, 아미노산 76 내지 아미노산 112, 아미노산 2 내지 아미노산 55, 아미노산 76 내지 아미노산 112가 결손된다.

본 발명의 또다른 구체예는 pRB⁹⁴이외에 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화하는 고립된 유전자를 포함한 DNA 세그멘트를 제공한다. 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질은 N-말단 변성이 되고, 유전자는 적어도 제 1 N-말단지대를 포함한 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화하고 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질은 야생형 망막모세포종 종양 억제 단백질에 비해서 증가된 생물학적 활성도를 가진다. 한 구체예에서 유전자는 111번 위치에서 돌연변이를 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화한다. 또 다른 구체예에서 변성된 망막모세포종 단백질은 111번 위치에서 아스파르트산 대신에 글리신을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질은 적어도 제 2 N-말단 돌연변이를 포함한다. 또 다른 구체예에서 유전자는 111번 및 112번 위치에서 돌연변이를 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화한다. 또 다른 구체예에서 변성된 망막모세포종 단백질은 111번 위치에서 아스파르트산 대신에 글리신, 112번 위치에서 글루탐산 대신에 아스파르트산을 포함한다. 특히 유전자는 적어도 하나의 아미노산이 결손되고 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 N-말단 지대를 포함한 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화한다.

본 발명의 한 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:2의 위치 370부터 위치 928까지 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화한다. 또 다른 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:2의 위치 3에서 위치 928 까지 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화한다. "인접 아미노산 서열"은 8 이상, 10 이상, 12 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 50 이상 또는 100 이상의 아미노산으로된 인접 아미노산 서열과 전체 길이의 아미노산 서열이다.

본 발명의 또 다른 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:29의 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화한다. 또 다른 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:28의 7번 위치 내지 2691 위치까지의 인접 핵산서열을 포함한다. "인접 핵산 서열"은 8 이상, 10 이상, 12 이상, 15 이상, 17 이상, 20 이상, 25 이상, 50 이상 또는 100개 이상의 누클레오티드로된 인접핵산 서열과 전체 길이의 누클레오티드 서열이다.

또 다른 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:31의 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화한다. 본 발명의 한 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:30의 위치 7에서 위치 2628까지의 인접 핵산 서열을 포함한다. 또다른 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:33의 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화한다.

본 발명의 한 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:32의 위치 7부터 위치 2559까지 인접 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:35의 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화한다. 또 다른 구체예에서 유전자는 SEQ ID NO:37의 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화한다. 한 구체예에서 유전자는 SEQ ID NO:36의 위치 7과 위치 2349 사이에 인접 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서 유전자는 SEQ ID NO:39의 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화한다.

본 발명의 또다른 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:38의 인접 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:41의 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화한다. 또 다른 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:41의 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화한다. 본 발명의 한 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:43의 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화한다. 또 다른 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:42의 위치 7과 위치 2583 사이에 인접 핵산서열을 포함한다. 특히 유전자는 SEQ ID NO:45의 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화한다. 또한 유전자는 SEQ ID NO:44의 위치 7과 위치 2397 사이에 인접 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 한 구체예에서 유전자는 SEQ ID NO:47의 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화한다. 또 다른 구체예에서 유전자는 SEQ ID NO:46의 위치 7과 위치 2613 사이에 인접 핵산서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서 유전자는 SEQ ID NO:49의 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화한다. 또한 유전자는 SEQ ID NO:48의 위치 7과 위치 2619 사이에 인접 핵산 서열을 포함한다. 또한 유전자는 SEQ ID NO:51의 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화한다. 또한 유전자는 SEQ ID NO:50의 위치 7과 위치 2790 사이에 인접 핵산 서열을 포함한다.

따라서 본 발명은 SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51 의 인접 아미노산 서열을 포함하는 변성된 망막모세포종 단백질을 코드화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 한 측면에서 유전자는 SEQ ID NO:28의 위치 7과 위치 2691, SEQ ID NO:30의 위치 7과 위치 2628, SEQ ID NO:32의 위치 7과 위치 2559, SEQ ID NO:34의 위치 7과 위치 2502, SEQ ID NO:36의 위치 7과 위치 2349, SEQ ID NO:38의 위치 7과 2559, SEQ ID NO:40의 위치 7과 위치 2697, SEQ ID NO:42의 위치 7과 위치 2583, SEQ ID NO:44의 위치 7과 위치 2397, SEQ ID NO:46의 위치 7과 위치 2613, SEQ ID NO:48의 위치 7과 위치 2619, 또는 SEQ ID NO:50의 위치 7과 위치 2790 사이에 인접 핵산서열을 포함한다.

본 발명의 또다른 구체예는 pRB⁹⁴또는 pRB⁵⁶이외에 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화하는 고립된 유전자를 포함한 DNA 세그멘트를 제공하며, 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질은 N-말단 변성을 포함하며, DNA 세그멘트는 프로모터의 제어하에 위치된다. 한 구체예에서 DNA 세그멘트는 재조합 프로모터의 제어하에 위치되며, 또한 DNA 세그멘트는 재조합 벡터로 정의된다. 특히 재조합 벡터는 아데노바이러스 벡터이거나 리트로바이러스 벡터이다.

본 발명의 또다른 구체예에서 DNA 세그멘트는 테트라사이클린 반응성 표현 시스템의 성분으로서 정의된다. 또한 DNA 세그멘트는 테트라사이클린 오퍼레이터 핵산서열을 포함한 프로모터의 하류에 위치되며, 테트라사이클린 반응성 표현 시스템은 테트라사이클린 리프레서 단백질에 부착된 트랜스크립션 트랜스액티베이션 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코드화하는 유전자를 포함한 제 2 서열지대를 더욱 포함하고, 제 2 서열지대는 최소 프로모터의 하류에 위치된다.

또다른 구체예에서 테트라사이클린 반응성 표현 시스템이 아데노바이러스 벡터내에 포함된다. 또한 아데노바이러스 벡터가 재조합 아데노바이러스내에 포함된다.

본 발명은 pRB⁹⁴이외에 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화하는 유전자를 포함한 DNA 세그멘트를 제공하며, 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질은 N-말단 변성을 포함하고, 숙주 세포내에 포함된다. 한 구체예에서 숙주세포는 원핵세포이고 또다른 구체예에서 숙주세포는 진핵세포이다. 또다른 구체예에서 숙주세포는 인간 세포이다. 또다른 예에서 숙주세포는 종양세포이다. 또다른 구체예에서 숙주세포는 동물내에 포함된다. 또한 동물이 인간일 수 있다.

본 발명의 또다른 구체예는 pRB⁹⁴이외에 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화하는 유전자를 포함한 DNA 세그멘트를 제공하며, 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질은 제약학적으로 허용가능한 부형제에 분산된 N-말단 변성을 포함한다.

본 발명의 DNA 세그멘트는 pRB⁹⁴이외에 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화하는 유전자를 포함하며, 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질은 N-말단 변성을 포함하고, N-말단 지대는 적어도 하나의 아미노산이 결손된 적어도 제 1 서열지대를 포함하고, 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질은 야생형 망막모세포종 종양 억제 단백질 이상의 생물학적 활성도를 가지며, 혹은 N-말단지대가 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 제 1 서열지대를 포함하고, 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질이 야생형 망막모세포종 종양 억제 단백질보다 증가된 생물학적 활성도를 가짐을 특징으로 한다.

위에서 기술된 DNA 세그멘트는 예컨대 숙주세포에서 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 표현하는데 사용된다. 다른 측면에서 DNA 세그멘트는 세포증식 억제나 암치료 또는 세포 증식 억제용 제약 제조에 사용된다. 따라서 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질 제조, 세포증식 억제, 암치료 또는 세포증식 억제용 제약 제조에 DNA 세그멘트가 사용된다. 이러한 제약은 환자에게 투약되거나 비경구 투여용으로 제조된다.

본 발명은 pRB⁹⁴이외에 N-말단 변성을 포함하는 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한 pRB⁹⁴이외에 N-말단 변성을 포함한 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화하는 유전자를 포함한 DNA 세그멘트 함유 재조합 숙주 세포를 제공한다. 한 측면에서 숙주세포는 원핵 세포이고 또다른 측면에서 숙주세포는 E. coli 이다. 또다른 측면에서 숙주세포는 진핵 숙주 세포이고 종양 세포일 수 있다. 또다른 측면에서 DNA 세그멘트는 재조합 벡터를 수단으로 세포에 도입된다.

본 발명은 또한 pRB⁹⁴이외에 N-말단 변성을 포함한 제 1 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질 유효량으로 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포증식 억제방법을 제공한다. 한 구체예에서 제 1 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질은 아미노산 111 내지 241이 결손된 변성된 망막모세포종 단백질이다. 또다른 구체예에서 제 1 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질은 아미노산 111과 112에서 돌연변이를 포함한 변성된 망막모세포종 단백질이다. 또다른 구체예에서 제 1 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질은 재조합 숙주세포에서 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 코드화하는 DNA 세그멘트를 발현시키고 세포에 의해 표현된 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 수집함으로써 제조된다. 또다른 구체예에서 세포에서 제 1 변성된 망막모세포종 종양 억제단백질을 표현하는 DNA 세그멘트를 세포에 제공함으로써 세포가 제 1 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질과 접촉된다. 또다른 구체예에서 세포에서 제 1 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질을 표현하는 테트라사이클린 반응성 표현 벡터 시스템이 세포에 제공된다. 특히, 벡터 시스템은 아데노바이러스 벡터 시스템이다.

본 발명의 또다른 측면은 pRB⁹⁴이외에 N-말단 변성을 포함하는 제 1 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질 유효량으로 종양 세포를 접촉하는 단계를 포함하는 세포증식 억제 방법을 제공한다. 한 측면에서 세포가 동물내에 위치되고 제 1 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질이나 이를 코드화하는 유전자가 제약학적으로 허용가능한 담체를 써서 동물에 투여된다. "유전자"는 단백질 코드화 부분 또는 일부를 포함하는 DNA 세그멘트이다. 따라서 유전자는 유전자 DNA, cDNA 또는 단백질 코드화 RNA를 포함한다.

또다른 측면에서 동물은 인간이다. 또한 세포가 제 2 종양 억제 단백질과 추가 접촉된다. 또다른 측면에서 세포가 변성된 망막모세포종 단백질 및 야생형 망막모세포종 p53 또는 기타 종양 억제 단백질과 접촉된다.

본 발명은 세포에서 세포증식을 억제시키는 유효량으로 망막모세포종 단백질 및 p53 단백질을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포증식억제방법을 제공한다.

본 발명은 또한 pRB⁹⁴이외에 N-말단 변성을 포함하는 제 1 변성된 망막모세포종 종양 억제 단백질 유효량을 포함하는 조성물을 암에 걸린 동물에 투여하는 단계를 포함하는 암치료 방법을 제공한다.

"암" 또는 "종양"은 비정상적인 세포증식을 보이는 세포를 특징으로 하는 무수한 질병을 포함하는 임상적 용어이다. 조직에서 "종양"은 비정상적인 조직 성장, 즉 과도하고 비정상적인 세포증식을 의미한다. 종양은 근원지로 부터 확산할 수 없는 "양성"이거나 숙주 몸체의 다른 영역으로 전이할 수 있는 "악성"이 있다. "암"은 악성 종양이나 이로 인한 질병상태를 기술하는데 사용되는 용어이다. 혹은, 당해 분야에서 비정상적인 성장을 종양으로, 악성 비정상적 성장을 악성 종양으로 부른다.

악성이든 양성이든 종양 또는 암세포의 과도한 비정상적 세포증식의 원인은 명백하지 않다. 그럼에도 불구하고 비정상적 세포 증식이 세포 성장 및 분할을 조절하는 하나 이상의 메카니즘 고장의 결과이다는 증거가 있다. 세포성장 및 분할을 조절하는 메카니즘은 세포증식, 유사분열 및 분화의 유전적 및 조직매개 조절을 포함한다. 이들 메카니즘은 세포핵, 세포질, 세포막 및 각 세포의 조직 특이성 환경에 작용한다. 정상 상태로 부터 비정상적인 세포증식으로의 세포변환과정을 종양형성과정이라 부른다.

종양형성과정은 정상 세포상태로 부터 완전 악성으로의 다단계 진행과정이다. 그러므로 세포 조절 메카니즘에 대한 다중 "원인"이 완전 악성이 되는데 필요하다. 따라서 과도한 증식의 단일 원인은 없고 이들 장애는 일련의 축적된 사건의 결과이다.

신체에 급속히 확산할 수 있는 악성 종양 또는 암이 가장 두렵고 치명적인 종양이지만 소위 양성 종양 또는 성장도 부적절한 성장에 의해 큰 질병을 가져올 수 있다. 양성 종양은 민감한 부위에서 부적절한 성장을 하거나 중심 또는 주변 신경조직, 혈관 및 기타 중요한 해부학적 구조에 압력을 발휘함으로써 상당한 손상을 초래할 수 있다.

본 출원은 1997년 2월 20일자 출원된 미국 특허출원 제 60/038,118 에 대해 우선권을 주장한다. 정부는 국립보건원으로 부터 승인번호 R01-CA 67274 및 R01-EY 06195 와 텍사스 고등교육 조종국으로 부터 승인번호 ATP004949018 에 따라서 본 발명의 권리를 소유한다.

본 발명은 분자 및 세포 생물학 분야에 관계한다. 특히, 본 발명은 망막모세포종 종양 억제 유전자의 변성에 관계한다. 본 발명은 또한 종양 억제유전자나 정상 세포 성장 억제유전자가 필요한 상황에서 변성된 망막모세포종 종양 억제 유전자를 즉각 사용하는 것에 관계한다.

도 1 은 변성된 hCMV 프로모터의 상대적 활성을 보여주는 것으로서, 5637 방광종양 세포(레인 1-5)와 Saos2 골수종양세포(레인 6-10)가 리포터 플라스미드로 감염되고, 여기서 CAT 유전자 표현은 다양한 변성된 프로모터(mhCMVp3, 레인 2, 7; mhCMVp2, 레인 3, 8; mhCMVp1, 레인 4, 9) 또는 전체길이의 hCMV 프로모터(레인 5, 10)에 의해 유도된다. %CAT 활성도가 수직축에 도시되며 전체 길이의 hCMV 프로모터를 갖는 플라스미드로 감염된 세포(레인 5, 10)의 CAT 활성도를 100%로 정의한다.

도 2 는 변성된 mCMVp-tTA로 부터 tTA의 표현이 5637 세포성장에 대한 진압효과가 없음을 보여주며, 크리스탈 바이올렛으로 세포를 염색하고 OD₅₅₀를 측정하는 방법이 상대적 세포 개수의 정량에 사용되며(OD₅₅₀이 수직축에 도시된다. Gillies, 1986), 테트라사이클린이 있고(▲) 없는(□) 성장 모세포와 테트라사이클린이 있고(◆) 없는(○) mCMVp-tTA 감염 세포가 도시되며 감염후 경과일이 수평축상에 도시된다.

도 3a 는 RB-재구성된 골수종양 세포라인(Saos-2, 클론 11), 도 3b 는 RB-재구성된 가슴 종양 세포라인(MDA-MB-468, 클론 19-4), 도 3c 는 RB-재구성된 방광종양 세포라인(5637, 클론 34-6)으로 부터 나오는 장기간 클론이며, 도 3a, 3b 및 3c 는 종양세포 성장에 테트라사이클린-조절가능한 pRB 표현이 미치는 효과를 보여주고, 세포는 0.5㎍/㎖ Tc(□)와 Tc 없이(○) 성장되고, pRB 표현이 무 Tc 매체에서 행해진 1 내지 2일후 종양세포의 성장이 중단되고 (일수는 수평축상에 도시), 15% 혈청(Saos-2), 10% 혈청 + 2㎍/㎖ 피토헴어글루틴(PHA; MDA-468), 또는 10% 혈청 + 4㎍/㎖ 콘카나발린 A (ConA; 5637)을 함유한 새로운 매체를 사용한 자극 4일후 성장 중단은 비가역적이다.

도 4a, 4b, 4c 는 테트라사이클린-조절가능한 pRB 표현이 아가 군체 형성에 미치는 효과를 보여주는 것으로서, 도 4a 는 3개의 Saos 2 골수종양 세포라인 클론(RB110 C14, 레인 2; RB110 C111, 레인 3; RB110 C113, 레인 4)과 Saos 2 부혈통(레인 1), 도 4b 는 2개의 MDA-MB-468 가슴 종양 세포 라인 클론(Rb 110 C11904, 레인 2; Rb 110 C120-1, 레인 3)과 MDA-MB-468 부혈통(레인 1), 도 4c 는 두 개의 5637 방광 종양 세포라인 클론(Rb 110 C134-6, 레인 2; Rb110 C136-9, 레인 3) 및 5637 부혈통(레인 1)에 대한 군체형성 비율을 나타내고 테트라사이클린-조절가능한 pRB 표현을 갖는 종양 세포의 아가 군체 형성이 무테트라사이클린 매체에서 pRB를 도입함으로써 완전 폐기되고 테트라사이클린 존재(개방된 막대) 및 부재(빗금친 막대)에서 군체형성이 도시된다.

도 5 는 무-Tc 매체에서 Tc-조절가능한 Saos-2 세포 클론에서 pRB⁹⁴및 pRB¹¹⁰표현의 시간과정 분석과³H-티미딘 포함 분석을 사용하여 DNA 합성에 미치는 효과가 도시된다. 종양 세포가 티미딘을 포함시키지 못하면 DNA 합성이 안되어 성장이 중단된다. pRB¹¹⁰-재구성된(■) 그리고 pRB⁹⁴-재구성된(◆) Saos-2 클론; 꾸준한 DNA 합성이 유지되는 비-동기화 부 Saos-2 세포 분포(●)가 도시된다.³H-표지 세포 비율이 수직축에 테트라사이클린 제거후 시간이 수평축에 도시된다.

A. 종양 억제 단백질

1. 망막모세포종

고립된 RB cDNA 클론에 대한 연구에 기초하여 예견되는 RB 유전자 생성물은 928 아미노산이며 예견되는 분자량은 106kDa이다(Lee et al., 1987a; 1987b). Rb 유전자 표현 생성물의 인자는 105 내지 114 kDa의 겉보기 상대 분자량(M_r)을 가진 핵의 인단백질로서 확인되었다(Lee et al., 1987b; Xu et al., 1989b; Yokota et al., 1988; Whyte et al., 1988). 이 문헌은 RB 유전자에 의해 코드화된 단백질을 p110^RB이라 칭한다. SDS-PAGE상에서 정상적 인간 세포는 110kD의 M_r을 갖는 예리한 밴드와 110 내지 116kD의 M_r을 가지며 더 넓고 가변적인 지대로 구성된 RB 단백질 패턴을 보여준다. 110kD 밴드는 인산화 안된 RB 단백질이며 더 넓은 지대는 인산화된 RB 단백질이다. 분자량의 이질성은 가변적인 인산화의 결과이다(Xu et al., 1989b).

RB 유전자의 생물학적 기능이 이해되기 시작했다(reviewed in Cooper and Whyte, 1989; Hamel et al., 1993; Horowitz, 1993; Riley et al., 1994; Wang et al., 1994; Weinberg, 1995). RB 단백질은 세포 주기동안 인산화 반응에 주기적 변화를 보인다. 대개의 RB 단백질은 G1 단계에서 인산화되지 않고 S 및 G2 단계에서 대개의 RB 분자가 인산화된다(Xu et al., 1989b; DeCaprio et al., 1989; Buchkovich et al., 1989; Chen et al., 1989; Mihara et al., 1989). pRB 경로의 성분은 세포주기동안 세포의 발단에 책임있는 수많은 세포 유전자의 전사 제어에 관여하는 E2F 전사 팩터를 포함한다(Nevins, 1992; La Thangue, 1994). pRB는 또한 G1 단계 사이클린과 상호작용한다(Koff et al., 1992; Resnitzky and Reed, 1995; Geng et al., 1996). 그러므로, RB 유전자는 세포증식, 정지 및 분화를 지배하는 세포주기의 G1 단계동안 세포 성장 조절에 핵심역할을 한다(Weinberg, 1995). 게다가 인산화 안된 RB 단백질만이 SV40의 T 항원에 결합한다. T 항원에 의한 RB 단백질의 결합은 T 항원의 성장 촉진 효과에 중요하며 인산화 안된 RB 단백질은 RB 단백질의 활성 형태이고 인산화된 RB 단백질은 S 및 G2 단계에서 비활동성이다(Ludlow et al., 1989).

G1 단계에서 지수함수적으로 성장하는 정상적 섬유아세포와 정지된 섬유아세포간에는 인산화된 pRB에 대한 인산화 안된 pRB의 비율에서 큰 차이가 있음이 보고된다. G1 정지된 세포에서 인산화 안된 pRB가 더 많이 관찰된다는 것은 인산화 안된 RB 단백질에 대한 인산화된 단백질의 비율의 변화가 세포주기의 교란에 관계됨을 나타낸다(Xu et al., 1989b). RB 단백질의 세포주기 종속성 인산화에 대해 상술된 논문이 있다(DeCaprio et al., 1989; Buchkovich et al., 1989; Chen et al., 1989; Mihara et al., 1989). RB 유전자의 생성물이 세포주기 조절에 핵심 역할을 한다는 것은 이제 널리 퍼져있다.

세포증식은 세포주기의 G1 단계의 사건 및 DNA 합성 개시에 책임있는 유전자의 전사 활성화에 달려있다. Pardee에 의해 설명된 바와 같이 혈청 유사분열물질 종속 상태에서 독립 상태로의 세포의 전이는 S단계 개시 수시간전 구별된 시점, 즉 R(제한)점에 의해 분리된다(Pardee, 1989). R점을 통과함으로써 세포는 M단계를 통해 나머지 세포주기를 완결시킨다. 그러므로, 세포주기의 중심 G1 및 나중 G1 단계간의 R점은 G1/S 경계만큼 중요한 세포 수명의 전이를 나타낸다.

pRB의 인산화 상태는 세포주기의 R점 전이 근처 또는 동시에 구별가능한 변경을 겪는다. 중심 G1 단계동안 탐지된 pRB 종은 비인산화 형태이다. 세포가 세포주기를 통해 진행할 때 pRB 함량은 점차 증가한다. 그러나 중심 G1 단계후 합성된 pRB의 대부분은 과도하게 인산화된다. 즉, pRB의 과도한 인산화는 후 G1에서 일어나며 G1/S 경계를 발생시킨다(Xu et al., 1991a; Mittnacht et al., 1994). 나머지 세포주기 내내 pRB는 과인산화된 상태를 유지하고 M/초기 G1으로 부터 전개할 때만 탈인산화 된다(Ludlow et al., 1990; Xu et al., 1991a; Mittnacht et al., 1994).

비인산화 형태의 pRB는 전사 팩터 E2F와 착물을 형성하거나 E2F 사이트와 직접 상호작용하여서 전사 제어시 E2F 사이트를 포지티브에서 네가티브 요소로 전환시킨다. E2F 사이트는 세포주기동안 세포의 발단에 책임있는 다양한 세포 유전자의 프로모터에 존재하며 c-myc, B-myb, cdc2, 디히드로플레이트 환원효소, 티미딘 카나이제, RB 및 E2F-1 유전자 자체를 포함한다(Chellappan et al., 1991; Nevins, 1992; Weintraub et al., 1992; La Thangue, 1994; Shan et al., 1994; Sardet et al., 1995; Shan et al., 1996). 과인산화된 pRB는 E2F와 상호작용할 능력을 손실했으므로 세포성장에 대한 pRB의 억제 기능이 과인산화에 의해 상쇄될 수 있다.

pRB 인산화 시기는 매력적인 기능모델을 가져온다(Weinberg, 1995). 이 모델은 pRB가 R점 보호자임을 제시한다. pRB는 G1 단계의 첫 번째 ⅔에서 성장 억제 효과의 대부분을 발휘한다. 초기 및 중기 G1을 거친 세포는 R점 게이트를 만난다. 나머지 세포주기로 진행할 준비가 되면 pRB는 인산화 및 기능적 비활성화를 겪어서 게이트를 개방하여 세포가 후기 G1으로 진행하게 만든다. 다양한 이유로 정상적 pRB 기능이 부족한 세포는 자유롭게 후기 G1 단계로 진행한다. pRB가 없다면 사이클린 D, 사이클린 E 및 사이클린 종속성 키나아제(CDK)와 같은 pRB 인산화를 조절하는 세포주기 클록의 상류 성분은 R점 게이트를 통과하는 판단에 대한 영향력을 손실한다(Kato et al., 1993; Ewen et al., 1993). pRB는 세포주기 클록이 수많은 유전자의 표현을 조절하게 하며, R점 전이와 같은 판단에 관련된 성장 사이클의 중요한 단계를 세포가 진행하는 것을 중재한다. pRB의 기능손실은 세포에게서 이러한 클록과 세포증식을 억제하는 메카니즘을 박탈한다.

RB 유전자의 다양한 돌연변이가 알려지며 이들은 일반적으로 비활성이다. RB에서 돌연변이는 모든 망막모세포종에서 관찰되며 RB 유전자 생성물은 과인산화와 비루스 종양단백질형 세포단백질 결합에 의해 비활성화될 수 있다. RB 유전자는 희귀한 어린이 안구 종양인 망막모세포종을 야기하는 유전자내 돌연변이 또는 결손 때문에 초기에 명명되었을지라도 pRB 기능의 손실은 망막모세포종 뿐만 아니라 수많은 암의 진행과 관련된다. 추가로, RB 단백질 상태가 요로상피 종양, 거대 세포 폐종양 및 기타 다양한 형태의 종양에서 전근 마커이다는 증거가 있다(Xu, 1995).

추가로 혁명적 항원 검색 기술과 특수 안티-pRB 항체를 사용하여 면역조직화학은 최근에 일상적으로 처리되는 병원 표본에서 pRB 비활성화 탐지를 위한 가장 민감하고 신뢰성있는 방법의 하나가 되었다. 면역조직화학 분석으로 측정된 변경된 pRB 표현은 인간 악성종양에 대해 빈약한 예후 신호를 보낸다. 기능성 pRB 의 손실은 성인 조직 종양에서 부정적인 전근 인자이다(Cance et al., 1990). 변경된 pRB 표현은 방광 종양을 갖는 환자들에게 전근 인자이다(Cordon-Cardo et al., 1992; Logothetis et al., 1992).

폐암 환장의 경우에 초창기 연구에서 변경된 RB 및 p53 단백질 상태가 초기 세포 폐종양에 상승적인 전조일 수 있다(Xu, et al., 1994a). 백혈구 세포에서 pRB 단백질 수준이 낮거나 없는 악성 백혈병 환자에 대해서 훨씬 악화된 생존 패턴이 보고되었다. 인간의 암의 pRB 상태와 환자의 임상적 결과간의 관계를 탐구하기 위해서 지금까지 수행된 모든 연구가 회고적이며 각 경우의 숫자가 매우 적으므로 통계적 계산을 위한 적절한 샘플 크기의 연구가 pRB 기능 손실이 임상에서 진단 인자로서 고려될 수 있는지 여부를 판단하기 위해서 진행중이다.

배양된 RB 유전자가 종양 억제 유전자이라는 직접적인 증거는 종양억제기능을 갖는 암세포에 유전자의 배양된 복제물을 도입하는 것에서 나온다. 수많은 보고서에서 상이한 종류의 암에서 나오는 RB-결함 종양 세포에서 정상 RB 유전자의 대체는 누드 마우스의 종양형성 활성을 억제할 수 있음을 보여준다(Huang et al., 1988; Goodrich and Lee, 1993; Zhou et al., 1994b). 연구된 종양 세포 라인은 망막모세포종, 골수종양, 방광 종양, 전립선, 가슴 및 폐와 같은 다양한 암으로부터 유도되었다(표 2).

종양억제기능과 RB-결함 종양세포에서 RB 대체에 의한 세포성장의 억제를 분리할려는 경향이 있었다(Takahashi et al., 1991; Chen et al., 1992; Goodrich et al., 1992b; Zhou et al., 1994b). 초창기 연구에서 야생형 pRB-표현 리트로바이러스나 플라스미드를 사용한 유전자 도입후 배양중인 RB-결함 망막모세포종 및 골수종양 세포는 세포 확장, 노화 표현형 및 느린 성장속도를 포함한 놀라운 변화를 보였다(Huang et al., 1988; Templeton et al., 1991). 부모 또는 일치된 RB-복귀돌연변이체 클론만큼 빠르게 성장하는 RB-재구성된 종양세포의 장기간 안정한 클론이 분리될 수 있음이 발견되었다. 그러나 수득된 RB⁺클론의 대부분은 종양 형성을 않거나 누드 마우스에서 종양형성기능이 크게 감소된다. 누드 마우스에서 종양형성 억제와 RB 대체에 의한 종양세포 성장의 억제를 분리하는 메카니즘은 명백하지 않다. 아마 RB 대체가 누드 마우스에서 종양 형성 분석이 행해질 때 세포에 존재 또는 제공된 다양한 생리적 성장 억제 신호에 대한 민감성을 회복시킨다. 이러한 외부 성장 억제제는 정상적 세포 배양 조건하에서는 존재하지 않으므로 세포의 빠른 성장을 가져온다(Chen et al., 1992).

RB 매개 종양 억제의 분자적 메카니즘이 명백하지 않을지라도 야생형 pRB를 재-표현함으로써 생체내에서 RB^-종양 세포의 종양형성 억제는 RB 유전자가 암에 대한 잠재적 치료 목표가 될 수 있음을 내포한다. 추가로 최근 보고서에서 RB 는 종양 세포의 면역유전학(Lu et al., 1994; Lu et al., 1996), 안티-맥관형성(Dawson et al., 1995) 및 종양 공격의 억제(Li et al., 1996)를 밝히는데 기여할 수 있으며 RB 유전자 치료를 더욱 매력적이게 만든다. 이러한 측면에서 야생형 또는 N-말단 절단된 망막모세포종 단백질을 표현하는 재조합 아데노바이러스 벡터에 의해 인간 이식편 종양의 치료는 종양의 퇴화를 가져온다(Xu et al., 1996). 추가로 pRB 단백질의 활성형태가 쥐의 동맥에서 테스트되어 맥관 증식장애를 억제함을 보여주었다(Chang et al., 1995).

제 1 인-프레임 AUG 코돈-개시된 RB 단백질을 표현하는 RB 유전자는 완전한 RB 유전자, RB¹¹⁰유전자 또는 p110^RB코드화 유전자로 칭한다. 다양한 안티-RB 항체에 대해 면역반응하는 미지 원인의 저분자량(<100 kD, 98 kD 또는 98-104 kD) 밴드가 면역침전 및 웨스턴 블롯에서 탐지됨이 관찰되었다(Xu et al., 1989b; Furukawa et al., 1990; Stein et al., 1990).

RB¹¹⁰cDNA 오픈 판독 프레임 서열(McGee et al., 1989)은 누클레오티드 355-357에서 엑손 3에 위치된 제 2 인-프레임 AUG 코돈을 포함한다. 제 2 AUG 코돈-개시된 RB 단백질은 98 kD이거나 p110^RB단백질보다 12kD 적다. 더 낮은 분자량 밴드는 인산화 안된 것(98kD)과 인산화된 것(98-104kD)으로서 RB 단백질은 RB mRNA의 제 2 AUG 코돈으로 부터 해독된다(Xu et al., U.S. Patent 5,496,731). 이 단백질은 p94^RB단백질로 칭한다.

RB-마이너스 종양세포에 기능성 RB¹¹⁰유전자의 도입은 세포를 "정상화"시킬 것이다. 물론 이미 정상 RB¹¹⁰유전자 표현형("RB⁺")을 가진 종양세포는 RB¹¹⁰유전자 치료에 반응하지 않는데, 그 이유는 추가 RB 표현형 첨가가 비-RB 유전적 결함을 수정할 수 없기 때문이다. 사실상 정상적 p110^RB를 표현하는 골수종양 세포라인 U-2 OS와 같은 RB⁺종양세포 라인의 경우에 추가 p110^RB코드화 유전자의 도입은 이러한 종양 라인의 종양 표현형을 변화시키지 못한다(Huang et al., 1988).

예외적인 경우에만 RB 또는 기타 유전적 결함을 갖지 않는 정상적인 인간의 섬유아세포 WSI에 p110^RB코드화 벡터의 도입이 세포성장의 중단을 가져온다(Fung et al.,WO 91/15580, 1991). 그러나, 숙주 세포상에서 잘 알려진 성장-촉진 효과를 갖는 SV40 T 항원을 생성하는 플라스미드 ppVUO-Neo가 부적절하게 사용되어 감염된 WSI 섬유아세포의 세포성장에 RB¹¹⁰표현형이 미치는 효과를 비교하므로 이러한 발견은 잘못 해석된 것이다(Fung et al., WO 91/15580, 1991). 이러한 견해는 야생형 RB¹¹⁰유전자를 사용한 치료에 의해서 "치료불가능한" RB⁺종양 세포를 발표하는 문헌에 의해 확인된다. 추가로 WSI 세포라인은 배양시 제한된 세포 분할력을 갖는 비-종양형성 인간 배수 섬유아세포 세포라인으로 인식된다. 그러므로 WO 91/15580은 RB⁺종양을 RB¹¹⁰유전자를 써서 효과적으로 치료하는 방법을 제공하지 못한다. 따라서 임의의 유전적 결함을 갖는 비정상 증식 세포를 처리하기 위한 광범위한 종양 억제 유전자가 여전히 필요하다.

2. p53

p53 유전자의 체세포 돌연변이가 인간의 암에서 가장 빈번히 돌연변이되는 유전자이다(Weinberg, 1991). 정상적 또는 야생형 p53 유전자는 손상될 때 세포 변환이 잘 되는 세포성장의 네가티브 조절 유전자이다(Weinberg, 1991). RB 단백질에서 처럼 p53 표현 생성물은 핵에서 발견되며 p110^RB와 함께 또는 독립적으로 작용한다. 예컨대 p53 및 p110^RB단백질 둘다가 SV40, 아데노바이러스 및 인간의 유두종 바이러스의 종양단백질에 의해 파괴 또는 결합된다. p53 의 경우에 결손된 종양세포라인은 야생형 p53 벡터로 성공적으로 처리되어서 종양형성이 감소된다(Baker et al., 1990). 그러나, 이들 자리에서 아직 손상되지 않은 세포에 p53 또는 RB¹¹⁰을 도입하면 세포 증식에 효과를 주지 못한다(Marshall, 1991; Baker et al., 1990; Huang et al., 1988). 이러한 실험에서 종양억제 유전자에 의한 성장 억제에 대한 세포의 민감성은 세포에서 발생하는 유전적 변경에 달려있음을 보여준다. 이러한 종속성은 특정 암에서 ras 종양유전자의 돌연변이적 활성화 이후에 p53 종양 억제 유전자 자리에서 변경이 일어난다는 관찰에 의해 더욱 복잡해진다(Marshall, 1991; Fearon et al., 1990a). 그러므로 비정상적 세포증식을 초래하는 돌연변이된 유전자의 종류에 의존하지 않는 광범위한 종양 억제 유전자가 필요하다.

3. 신경섬유종증 타입 1

신경섬유종증 타입 1 또는 레클링하우젠병은 새로운 돌연변이를 통해 생성된 대립유전자나 돌연변이 대립유전자의 유전을 통해 생긴다. NF1 유전자라 칭하는 신경섬유종증 타입 1 유전자는 10^-4정도의 돌연변이율을 보이는 비교적 큰 좌이다. NF1 유전자의 결함은 담갈색 반점에서 피부의 신경섬유종, 신경초종 및 신경섬유종양에 이르는 넓은 임상적 징후를 가져온다. NF1 유전자는 ras 원시 종양유전자의 생성물과 작용하는 3개의 단백질과 구조적 유사성을 보이는 2485 아미노산으로된 단백질을 코드화한다(Weinberg, 1991). 예컨대, NF1 아미노산 서열은 ras GAP의 촉매 도메인, p21 ras의 경우에 GTP아제 활성화 단백질과 서열 상동성을 보인다(Marshall, 1991).

세포주기 조절에서 NF1의 역할은 매우 복잡하여 아직 밝혀지지 않았다. 예컨대, NF1은 효모에서 종양유전자에 의해 활성화되는 p21의 억제유전자라는 가설이 있다(Marshall, 1991, citing Ballester et al., 1990). NF1 작용의 다른 가능한 경로가 제시된다(Marshall, 1991; Weinberg, 1991). 현재 NF1 좌의 크기 및 복잡성 때문에 NF1 세포를 야생형 NF1 유전자로 처리할려는 시도가 되지 않는다. 그러므로 NF1과 모든 암 또는 종양을 처리할 수 있는 광범위한 종양 억제 유전자가 대단히 필요하다.

4. DCC

결장암 형성단계가 전개동안 결장경에 대해 모니터링 된다. 관련조직의 생체검사와 결장경의 조합은 악성종양을 가져오는 수많은 퇴행성 유전적 경로를 밝혀준다. 잘 연구된 경로는 60% 세포가 돌연변이되고 활성화된 K-ras 대립유전자를 가진 폴립으로 시작된다. 이러한 종양의 대부분은 결손된 결장 종양(DCC) 유전자로 칭하는 유전자의 비활성화-돌연변이로 진행되고 p53 종양 억제 유전자의 비활성화가 뒤따른다.

DCC 유전자는 리셉터로 추정되는 190kD 막투과 인단백질을 코팅하는 일백만 이상의 염기쌍을 갖는 유전자로서(Weinberg, 1991) 이의 손실은 세포의 성장을 촉진한다. 또한 DCC는 세포간 상호작용을 조절할 때 DCC 원시 유전자 역할을 하는 신경세포 접착 분자와 부분적 서열 상동성을 가진다(Marshall, 1991). 결장암 종양 형성과 관련된 유전자, K-ras 및 p53 의 복잡성과 DCC 유전자의 큰 크기 및 복잡성은 DCC 유전자의 조작이나 결장 종양 세포에서 손상된 유전자의 종류에 종속되지 않은 광범위한 종양 억제 유전자와 결장 종양세포 치료방법의 필요성을 보여준다.

5. 기타 종양 억제 단백질

본 발명의 종양 억제 유전자와 조합으로 사용가능한 추가 종양 억제 유전자는 다음과 같다: 빌름스 종양(WT-1) 유전자(Call et al., 1990; Gessler et al., 1990; Pritchard-Jones et al., 1990), 힙펠병(VHL) 종양 억제 유전자(Duan et al., 1995), Maspin(Zou et al., 1994), Brush-1(Schott et al., 1994), 유방암의 BRCA 1 유전자(Miki et al., 1994; Futreal et al., 1994) 및 다중 종양억제 유전자(MTS) 또는 p16 유전자(Serrano et al., 1993; Kamb et al., 1994).

B. 바이러스 벡터 감염을 통한 DNA 전달

종양 억제 유전자는 세포의 게놈에 안정적으로 도입될 수 있다. 또다른 구체예에서 유전자는 분리된 DNA 에피솜 세그멘트로서 세포내에 안정적으로 유지될 수 있다. 이러한 핵산 세그멘트 또는 "에피솜"은 숙주세포 주기와 독립적으로 또는 동기적으로 복제 또는 유지를 허용하기에 충분한 서열을 코드화한다. 종양 억제 유전자가 세포에 전달되는 방식과 세포내에서 핵산이 유지되는 장소는 사용된 표현 벡터의 타입에 달려있다.

1. 아데노바이러스 벡터

본 발명에서는 아데노바이러스 벡터, 특히 테트라사이클린-조절되는 아데노바이러스 벡터가 선호된다. 이러한 벡터가 사용되어 종양 괴사 팩터 α, 인터페론 유전자 및 인터루킨 유전자와 같은 사이토카인 유전자에 추가적으로 망막모세포종 및 p53 유전자와 같은 종양억제 유전자를 포함한 다양한 유전자를 전달 및 표현한다.

선호되는 표현형 전달방법은 아데노바이러스 표현형 벡터 사용이 관련된다. 아데노바이러스 벡터가 게놈 DNA에 도입이 잘 안 되는 것으로 알려질지라도 이러한 특징은 벡터에 의해 제공되는 유전자의 높은 전달효율에 의해 보완된다. "아데노바이러스 표현 벡터"는 상보성 패키지 기능을 갖는 숙주 세포에서 구조의 패키지를 지원하고 배양된 이종 유전자를 표현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유한 구조를 포함한다.

표현 벡터는 유전공학 처리된 형태의 아데노바이러스를 포함한다. 36kb 선형 이중쇄 DNA 바이러스인 아데노바이러스에 대한 유전 조직의 지식은 큰 아데노바이러스 DNA를 외부 서열로 치환하는 것을 허용한다(Grunhaus and Horwitz, 1992). 리트로바이러스와 대조적으로 숙주세포의 아데노바이러스 감염은 염색체 집적을 가져오지 않는데, 그 이유는 야생형 아데노바이러스 DNA가 잠재적 유전자 독성없이 에피솜 방식으로 복제할 수 있기 때문이다. 또한 아데노바이러스는 구조적으로 안정적이며 과도한 증폭후 게놈 재배열이 탐지되지 않는다.

아데노바이러스는 중간크기의 게놈, 조작의 용이성, 높은 역가, 넓은 타겟-셀 범위 및 고감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 특히 적합하다. 바이러스 게놈의 양 단부는 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필요한 시스 요소인 100-200 염기쌍 역전 반복서열(ITR)을 포함한다. 게놈의 초기(E) 및 후기(L) 지역은 DNA 복제 개시에 의해 분할되는 상이한 전사단위를 포함한다. E1 지역(E1A 및 E1B)은 바이러스 게놈 및 소수의 세포 유전자의 전사 조절에 책임있는 단백질을 코드화한다. E2 지역(E2A 및 E2B)의 표현은 바이러스 DNA 복제를 위한 단백질 합성을 가져온다. 이들 단백질은 DNA 복제, 후기 유전자 표현 및 숙주 세포 차단에 관여한다(Renan, 1990). 바이러스 캡시드 단백질을 포함한 후기 유전자의 생성물은 주요 후기 프로모터(MLP)에 의한 단일 주 전사물의 상당한 처리 후에만 표현된다. MLP(16.8 m.u.에 위치)는 감염의 후기 단계동안 특히 효과적이며 이 프로모터로 발생된 모든 mRNA는 해독에 선호되는 mRNA가 되게 하는 5'-트리파타이트 리더(TPL) 서열을 가진다.

최근 시스템에서 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 게놈 골격을 함유한 마스터 플라스미드와 셔틀 벡터간의 상동 재조합으로 부터 발생된다. 아데노바이러스 게놈의 골격과 바이러스 게놈의 손실 부분을 함유한 헬퍼 세포의 세포 DNA간의 재조합 가능성 때문에 야생형 아데노바이러스가 발생될 수 있다. 그러므로 개별 플라크로 부터 단일 바이러스 클론을 분리시켜 게놈 구조를 조사하는 것이 중요하다.

복제결함이 있는 아데노바이러스 벡터의 발생 및 전파는 Ad5 DNA 프래그먼트에 의해 태아 신장세포로 부터 변형되며 계속 더 단백질을 표현하는 고유 헬퍼 세포라인 293에 달려있다(EIA and EIB; Graham et al., 1977). E3 지역은 아데노바이러스 게놈에 없어도 되므로(Jones and Shenk, 1978) 293 세포의 도움으로 최근 아데노바이러스 벡터는 E1, E3 또는 둘다에서 외부 DNA를 가진다(Graham and Prevec, 1991). 아데노바이러스는 105%의 야생형 게놈을 패키징할 수 있고(Ghosh-Choudhury et al., 1987) 2kb의 추가 DNA를 제공한다. E1 및 E3 지역에서 대체가능한 5.5kb의 DNA와 조합되면 아데노바이러스의 최대 용량은 7.5kb 이상 또는 전체 벡터길이의 약 15%이다. 아데노바이러스 게놈의 80% 이상이 벡터 골격에 남아있다.

재조합 E1-결핍 아데노바이러스를 사용한 생체내 유전자 전달은 숙주 면역반응을 유도할 수 있는 초기 및 후기 바이러스 유전자 표현을 가져와서 전달유전자 표현기간 및 유전자 치료용 아데노바이러스의 용도를 제한한다. 이러한 문제를 극복하기 위해서 원핵 Cre-loxP 재조합 시스템이 개조되어 바이러스 게놈에서 연장된 결손을 갖는 재조합 아데노바이러스를 발생시켜 면역유전자 또는 세포파괴 바이러스 단백질의 발현을 최소화한다(Lieber et al., 1996).

태아 신장세포, 근육세포, 조혈세포, 태야 간충조직 또는 상피세포와 같은 인체 세포로 부터 헬퍼 세포라인이 유도될 수 있다. 혹은 인간 아데노바이러스에 허용적인 기타 포유동물의 세포로 부터 헬퍼 세포가 유도될 수 있다. 이러한 세포로는 Vero 세포 또는 원숭이 태아 간충조직 또는 상피세포가 있다. 선호되는 헬퍼 세포라인은 293이다.

최근에 Racher 등(1995)은 293 세포를 배양해서 아데노바이러스를 전파하는 개선된 방법을 발표한다. 일례로 100-200㎖ 매체를 함유한 1리터 실리콘화 스피너 플라스크에 각 세포를 접종시켜 자연 세포 응집체가 성장된다(Techne, Cambridge, UK). 40rpm에서 교반후 트리판 블루를 써서 세포 생존률이 평가된다. 또다른 예에서 Fibra-Cel 마이크로캐리어(Bibby Sterlin, Stone, UK)(5g/ℓ)가 다음과 같이 사용된다. 5㎖ 매체에 재현탁된 세포 접종물이 250㎖ 삼각 플라스크에서 캐리어(50㎖)에 첨가되고 1 내지 4h동안 가끔 교반하면서 방치된다. 이후에 50㎖ 새로운 매체로 매체를 대체하고 교반한다. 바이러스 생장동안 세포가 80% 합류점까지 성장하고 이후에 매체가 대체되고(최종 부피의 최대 25%) 0.05의 MOI로 아데노바이러스가 첨가된다. 배양액을 하룻밤 방치하고 이후에 부피를 100%까지 증가시키고 72h동안 교반한다.

어떤 경우에 다중 세포라인에 아데노바이러스 중재 유전자 전달이 상피유도세포에 비해 덜 효율적이다. 새로운 아데노바이러스 AdPK는 이러한 비효율성을 극복하기 위해서 구축되었다(Wickham et al., 1996). AdPK는 바이러스를 헤파린 함유 세포 리셉터에 향하게 하는 헤파린 결합 도메인을 가지며 많은 세포에서 광범위하게 표현된다. 그러므로 AdPK는 다중 세포에 비변성 아데노바이러스보다 높은 효율로 유전자를 전달함으로써 유전자 전달효율을 개선하고 아데노바이러스 중재 유전자 치료로가 가능한 조직을 확대한다.

아데노바이러스 벡터가 복제 결함이 있어야 한다는 조건 이외에 아데노바이러스 벡터의 성질은 본 발명의 실시에 중요하지 않다. 아데노바이러스는 42개의 상이한 항원형 또는 서브그룹 A-F중 하나이다. 서브그룹 C의 아데노바이러스 타입 5가 본 발명에서 사용하는 조건부 복제 결함 아데노바이러스 벡터 수득에 선호되는 출발물질이다. 그 이유는 아데노바이러스 타입 5가 생화학적, 유전적 정보가 많이 알려져 있으며 역사적으로 아데노바이러스 벡터로서 가장 많이 사용된 인간 아데노바이러스이기 때문이다.

본 발명에 따른 전형적인 벡터는 복제 결함이 있으며 아데노바이러스 더 지역을 갖지 않는다. 따라서 E1 코드화 서열이 제거된 위치에 외부 유전자 표현 카세트를 도입하는데 가장 편리하다. 그러나 아데노바이러스 서열내 구조의 삽입 위치는 본 발명에서 중요하지 않다. 관심 유전자를 코드화하는 폴리누클레오티드 결손된 E3 지역 대신에 E3 대체 벡터에 삽입되거나(Karlsson, 1986) 헬퍼 세포라인 또는 헬퍼 바이러스가 E4 결함을 보충하는 E4 지역에 삽입될 수 있다(Brough et al., 1996).

아데노바이러스 성장 및 조작은 당해분야에 알려져 있으며 생체내 및 생체밖에서 다양한 숙주범위를 보인다. 이러한 바이러스는 고역가, 예컨대 ㎖당 10⁹내지 10¹¹플라크 형성 단위로 수득될 수 있으며, 이것은 고감염성이다. 아데노바이러스의 수명 주기는 숙주세포 게놈에 포함될 필요가 없다. 아데노바이러스 벡터에 의해 전달된 외부 유전자는 에피솜이고 숙주세포에 독성이 낮다. 야생형 아데노바이러스를 사용한 백신접종 연구에서 심각한 부작용이 보고되지 않으며(Couch et al., 1963; Top et al., 1971) 생체내 유전자 전달 벡터로서 안전하다.

아데노바이러스 벡터는 진핵 유전자 표현(Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) 및 백신 개발(Grunhaus and Horwitz, 1992; Graham and Prevec, 1992)에 사용되었다. 최근 동물 연구에 따르면 재조합 아데노바이러스가 유전자 치료에 사용될 수 있다(Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1991; Rich et al., 1993). 상이한 조직에 재조합 아데노바이러스 투여 연구로는 기관점적(Rosenfeld et al., 1991; 1992), 근육주사(Ragot et al., 1993), 정맥주사(Herz and Gerard, 1993) 및 뇌에 접종(Le Gal La Salle et al., 1993)이 있다. 재조합 아데노바이러스와 아데노-조합 바이러스는 비-분할 인간 일차 세포를 감염 및 형질 도입할 수 있다.

2. AAV 벡터

아데노-조합 바이러스(AAV) 또한 높은 집적 빈도를 가지며 비분할 세포를 감염시킬 수 있어서 조직배양(Muzyczka, 1992) 또는 생체내에서 포유동물 세포에 유전자를 전달하는데 유용하므로 종양 억제 유전자의 전달 및 표현을 위한 벡터 구축에 사용하는 매력적인 시스템이다. AAV는 광범위한 숙주 감염범위를 가진다(Tratschin et al., 1984; Laughlin et al., 1986; Lebkowski et al., 1988; McLaughlin et al., 1988). rAAV 벡터의 발생 및 용도에 대한 세부사항은 미국특허 5,139,941, 4,797,368 에 기술된다.

유전자 전달에 AAV 사용을 보여주는 연구는 다음과 같다: LaFace et al. (1988); Zhou et al. (1993); Flotte et al. (1993); and Walsh et al. (1994). 재조합 AAV 벡터가 마커 유전자의 생체내 및 생체밖 형질 도입에 성공적으로 사용되었으며(Kaplitt et al., 1994; Lebkowski et al., 1988; Samulski et al., 1989; Yoder et al., 1994; Zhou et al., 1994a; Hermonat and Muzyczka, 1984; Tratschin et al., 1985; McLaughlin et al., 1988) 인간 질병에 관련된 유전자 도입에 사용되었다(Flotte et al., 1992; Luo et al., 1994; Ohi et al., 1990; Walsh et al., 1994; Wei et al., 1994). 최근에 AAV 벡터가 방광 섬유증 치료용 단계 I 시도에 승인되었다.

AAV는 배양된 세포에서 생산적 감염을 겪는데 또다른 바이러스(아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스 계열)와 공동 감염을 필요로 한다는 점에서 종속 파보바이러스이다(Muzyczka, 1992). 헬퍼 바이러스와 공동으로 감염되지 않으면 야생형 AAV 게놈은 단부를 통해 인간의 염색체 19에 집적되어 프로 바이러스로서 잠재상태로 체류한다(Kotin et al., 1990; Samulski et al., 1991). 그러나 rAAV는 AAV Rep 단백질이 또한 표현되지 않으면 집적을 위해 염색체 19에 한정되지 않는다(Shelling and Smith, 1994). AAV 프로바이러스를 가진 세포가 헬퍼 바이러스와 함께 감염되면 AAV 게놈은 염색체 또는 재조합 플라스미드로 부터 "탈출"하여 정산적 감염이 이루어진다(Samulski et al., 1989; McLaughlin et al., 1988; Kotin et al., 1990; Muzyczka, 1992).

대체적으로 재조합 AAV(rAAV) 바이러스는 두 개의 AAV 말단 반복서열에 의해 위치되는 관심 유전자를 함유하는 플라스미드(McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989; each incorporated herein by reference)와 pIM45 와 같이 말단 반복서열이 없는 야생형 AAV 코팅 서열을 함유한 표현 플라스미드(McCarty et al., 1991)를 공동 감염시켜 제조된다. 이 세포는 AAV 헬퍼 기능을 위해 필요한 아데노바이러스 유전자를 가지는 플라스미드 또는 아데노바이러스로 감염된다. 이러한 방식으로 제조된 rAAV 바이러스는 열충격에 의해 비활성화되거나 rAAV 입자로 부터 물리적으로 분리되어야 하는(예컨대 염화세슘 밀도차로) 아데노바이러스로 오염된다. 혹은 AAV 코딩 지역을 포함한 아데노바이러스 벡터나 AAV 코딩지역 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자를 포함한 세포라인이 사용될 수 있다(Yang et al., 1994; Clark et al., 1995). rAAV DNA를 갖는 세포라인이 집적된 프로바이러스로서 사용될 수 있다(Flotte et al., 1995).

3. 리트로바이러스 벡터

리트로바이러스 감염을 사용하여 선택된 유전자를 타겟 세포에 전달하는 것이 필요하다. 리트로바이러스는 역-전사 과정에 의해 감염된 세포에서 RNA를 이중쇄 DNA로 전환하는 능력을 특징으로 하는 단일쇄 RNA 바이러스이다(Coffin, 1990). 결과의 DNA는 프로바이러스로서 세포 염색체에 안정적으로 집적되어 바이러스 단백질 합성을 안내한다. 이러한 집적은 수령 세포 및 자손에서 바이러스 유전자 서열을 유지하게 한다. 리트로바이러스 게놈은 캡시드 단백질, 폴리메라제 효소 및 외피 성분을 코딩하는 3개의 유전자 gag, pol 및 env를 포함한다. gag 유전자로 부터 상류에서 발견되는 서열은 게놈을 비리온(virion)에 패키징하는 신호를 포함한다. 두 개의 긴 말단 반복서열(LTR)이 바이러스 게놈의 5' 및 3' 단부에 존재한다. 이들은 강력한 프로모터 및 인핸서 서열을 포함하고 숙주세포 게놈에서 집적에 필요하다(Coffin, 1990).

리트로바이러스 벡터 구축을 위해서 관심 유전자를 코드화하는 핵산이 바이러스 서열대신에 바이러스 게놈에 삽입되어 복제결함이 있는 바이러스를 생산한다. 비리온 생성을 위해서 gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR 및 패키징 성분이 없는 패키징 세포라인이 구축된다(Mann et al., 1983). 리트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 cDNA를 포함하는 재조합 플라스미드가 세포라인에 도입될 때(인산칼슘 침전에 의해) 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사물이 바이러스 입자에 패키징될 수 있게 하며, 이후에 배양 매체에 분비된다(Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). 재조합 리트로바이러스를 포함한 매체가 수집 및 농축되어 유전자전달에 사용된다. 리트로바이러스 벡터는 다양한 세포라인을 감염할 수 있다. 그러나 집적 및 안정적인 표현은 숙주세포의 분할을 필요로 한다(Paskind et al., 1975).

결함있는 리트로바이러스 벡터에 대한 관심은 패키징 세포에서 야생형 복제가능한 바이러스의 발현이다. 이것은 숙주세포 게놈에 집적된 gag, pol, env로 부터 상류에 재조합 바이러스의 완전한 서열이 삽입되는 재조합 사건의 결과일 수 있다. 그러나, 새로운 패키징 세포라인이 이용가능하므로 재조합 가능성을 크게 감소시켜야 한다(Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990).

어떤 경우에 제한된 숙주세포 범위와 저역가 리트로바이러스 벡터는 진핵세포에서 안정적인 유전자 전달을 제한시킨다. 이러한 문제를 극복하기 위해서 리트로바이러스 외피 당단백질이 소포성 구내염 바이러스의 G 당단백질로 완전 대체된 쥐과 백혈병 바이러스 유도 벡터가 개발되었다(Burns et al., 1993). 이 벡터는 고역가(㎖당 10⁹군체형성단위)로 농축될 수 있으며 리트로바이러스 외피단백질을 포함한 벡터를 사용한 감염에 대해 내성적인 세포를 감염시킬 수 있다. 이 벡터는 유전자 치료 모델 연구와 생체내 벡터의 직접 전달을 요하는 기타 유전자 전달 연구를 촉진시킬 수 있다.

4. 간상체 바이러스 벡터

간상체 바이러스 표현형 벡터가 다양한 분야의 단백질 제조에 유용한 도구이다(Summers and Smith, 1987; O'Reilly et al., 1992; also U.S. Patent Nos., 4,745,051 (Smith and Summers), 4,879,236 (Smith and Summers), 5,077,214 (Guarino and Jarvis), 5,155,037 (Summers), 5,162,222 (Guarino and Jarvis), 5,169,784 (Summers and Oker-Blom) and 5,278,050 (Summers)). 본 발명자는 유전자 표현이 테트라사이클린에 의해 조절되는 간상체 바이러스 표현 벡터의 구축을 고려하였다. 이들 벡터는 필요한 단백질이 곤충 세포에 독성인 경우에 특히 유용하다. 이 경우에 세포가 고밀도에 도달하여 다량의 필요한 단백질 제조를 허용할때까지 단백질 생성이 정지된다.

간상체 표현 벡터는 특정 유전자의 코딩 지역이 필수적이지 않은 간상체 바이러스 유전자 대신에 프로모터 뒤에 위치되는 재조합 곤충 벡터이다. 재조합 간상체 바이러스 표현 벡터를 분리하는데 사용되는 고전적인 방법은 외부 유전자가 폴리헤드린 프로모터 하류에 위치되는 플라스미드를 구축하는 것이다. 이후에 상동 재조합을 통해 플라스미드가 야생형 폴리헤드린 유전자 대신에 새로운 유전자를 바이러스 게놈에 전달하는데 사용된다(Summers and Smith, 1987; O'Reilly et al., 1992).

결과의 재조합 바이러스는 배양된 인시류 곤충 세포나 유충을 감염시켜 강력한 폴리헤드린 프로모터 제어하에 외부 유전자를 표현하고 후기 감염 단계동안 높은 감염수준을 제공할 수 있다. 폴리헤드린 프로모터의 세기는 표현 벡터로서 재조합 간상체 바이러스의 사용의 장점인데, 그 이유는 감염동안 외부 유전자 생성물을 다량 합성시키기 때문이다.

5. 기타 바이러스 벡터

기타 바이러스 벡터가 본 발명에서 표현 벡터 구축에 사용될 수 있다. 종두종 바이러스와 같은 바이러스에서 유도된 벡터(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), 신드비스 바이러스 및 헤르페스 바이러스에서 유도된 벡터가 사용될 수 있다. 이들은 다양한 포유동물 세포에 몇 가지 특징을 제공한다(Friendmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).

결함있는 헤르파티스 B 바이러스에 대한 최근의 인식으로 다양한 바이러스 서열의 구조-기능 관계에 대한 새로운 통찰력이 수득되었다. 생체밖 연구에서 바이러스는 게놈의 최대 80%의 결손에도 불구하고 헬퍼-종속성 패키징 및 역 전사능력을 유지할 수 있다(Horwich et al., 1990). 따라서 상당 부분의 게놈이 외부 유전물질로 대체될 수 있다. Chang(1991)은 최근에 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼아제(CAT) 유전자를 폴리머라제, 표면 및 전-표면 코딩서열 대신에 오리 헤파티스 B 바이러스 게놈에 도입하였다. 이것은 조류 간암 세포라인에 야생형 바이러스와 함께 감염되었다. 고역가 재조합 바이러스를 포함한 배양매체가 오리새끼 간세포를 감염시키는데 사용되었다. 감염 24일후 안정적인 CAT 유전자 표현형이 탐지되었다(Chang et al., 1991).

6. 변형 바이러스

특정 세포에 선택된 유전자 전달이 필요한 경우에 전달될 표현형 구조가 특정 결합 리간드를 발현하도록 설계된 감염 바이러스내에 수용된다. 바이러스 입자는 타겟 세포의 동종 리셉터에 특이 결합되며 내용물을 세포에 전달한다. 리트로 바이러스 벡터의 특이적 타겟팅을 허용하도록 설계된 신규한 방법이 락토스 잔기를 바이러스 외피에 화학적 첨가함으로써 리트로바이러스의 화학적 변형에 기초하여 최근에 개발되었다.

재조합 리트로바이러스의 또다른 타겟팅 방법에서 리트로바이러스 외피단백질 및 특수 세포 리셉터에 대한 비오틴화 항체가 사용되었다. 이 항체는 스트렙타비딘을 사용함으로써 비오틴 성분을 통해 결합된다(Roux et al., 1989). 주 생체적합성 착물 클래스 I 및 클래스 Ⅱ 항원에 대한 항체를 사용하여 생체밖에서 에코트로픽 바이러스로 표면 항원의 구멍을 뚫는 다양한 인간 세포의 감염을 보여준다(Roux et al., 1989).

C. 기타 DNA 전달방법

위에서 기술된 세포의 감염을 통한 바이러스 중재 DNA 전달방법 뿐만 아니라 본 발명의 종양억제 유전자를 원핵 및 진핵세포에 도입하는 다른 방법도 고려된다.

1. 감염 및 변환

유전자 구조를 발현시키기 위해서 표현형 구조가 세포에 전달되어야 한다. 선호되는 전달방법은 바이러스 감염으로서 표현형 구조가 감염성 바이러스 입자에 싸인다. 그러나 진핵 및 원핵 세포에 표현형 구조의 비-바이러스 전달 방법도 본 발명에서 고려된다. 한 구체예에서 표현형 구조가 나체 재조합 DNA 또는 플라스미드로만 구성될 수 있다. 이 구조의 전달은 세포막을 물리적 또는 화학적으로 투과하게 하는 방법에 의해 수행된다.

a. 리포좀-중재 감염 및 변환

본 발명의 또다른 구체예에서 표현형 구조가 리포좀에 포획될 수 있다. 리포좀은 인지질 이중막과 내부 수성매체를 특징으로 하는 소포 구조이다. 다중 라멜라 리포좀은 수성매체에 의해 분리된 다중 지질층을 가진다. 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 다중 라멜라가 자발적으로 형성된다. 지질성분은 폐쇄구조 형성전에 자체-재배열을 하며 지질 이중층 사이에 물과 용매를 포획한다(Ghosh and Bachhawat, 1991). 또한 리포펙타민과 착물이 된 표현형 구조도 고려된다(Gibco BRL).

생체밖에서 외부 DNA의 리포좀-중재 핵산 전달 및 표현은 대단히 성공적이었다(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). Wong(1980)은 배양된 병아리 태아, HeLa 및 간암 세포에서 외부 DNA의 리포좀-중재 전달 및 표현 가능성을 설명한다.

한 구체예에서 리포좀은 혈구응집 바이러스(HVJ)와 착물이 될 수 있다. 이것은 세포막과 융합을 촉진시켜서 리포좀 캡슐화된 DNA의 세포 입력을 촉진한다(Kaneda et al., 1989). 다른 구체예에서 리포좀은 핵의 비-히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과 조합으로 사용되거나 착물이 된다(Kato et al., 1991). 또다른 구체예에서 리포좀은 HVJ 및 HMG-1과 조합으로 사용된다.

b. 일렉트로포레이션

한 구체예에서 표현형 구조는 일렉트로포레이션을 통해 세포에 도입된다. 일렉트로포레이션은 세포와 DNA 현탁액을 고전압 전기방전에 노출하는 것이다.

일렉트로포레이션을 사용한 진핵 세포의 감염은 꽤 성공적이다. 생쥐 전-B 임파구가 인간의 카파-면역 글로블린 유전자로 감염되고(Potter et al., 1984) 쥐의 간세포가 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼아제 유전자로 감염된다(Tur-Kaspa et al., 1986).

c. 인산칼슘 침전 또는 DEAE-덱스트란 처리

한 구체예에서 표현형 구조는 인산 칼슘 침전을 사용하여 세포에 도입된다. 인간의 KB 세포는 이 기술을 써서 아데노바이러스 5 DNA(Graham and Van Der Ed, 1973)로 감염된다. 또한, 생쥐 L(A9), 생쥐 C127, CHO, CV-1, BHK, NIH3T3 및 HeLa 세포가 네오마이신 마커 유전자로 감염되고(Chen and Okayama, 1987) 쥐의 간세포가 다양한 유전자로 감염된다(Rippe et al., 1990).

또다른 구체예에서 표현형 구조가 DEAE-덱스트란과 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 세포에 도입된다. 이 방식에서 리포터 플라스미드는 생쥐 골수종 및 진핵 세포에 도입된다(Gopal, 1985).

d. 입자 폭격

나체 DNA 표현형 구조를 세포에 도입하는 또다른 방법은 입자 폭격이다. 이 방법은 DNA 코팅된 미소입자를 고속으로 가속시켜 세포를 죽이지 않고 세포막을 투과 세포에 들어가게 하는 것이다(Klein et al., 1987). 소형 입자 가속 장치는 기동력을 제공하는 전류를 발생할 고전압 방전에 종속적이다(Yang et al., 1990). 사용된 미소입자는 텅스텐 또는 금 비이드와 같은 생물학적 불활성 물질로 구성된다.

e. 마이크로 주사 또는 초음파 충진

또다른 방법은 직접적 마이크로 주사 또는 초음파 충진에 의해 표현형 구조를 도입하는 것이다. 직접적 마이크로 주사는 핵산 구조를 케노푸스 난모세포에 도입하는데 사용되며(Harland and Weintraub, 1985) LTK^-섬유아세포는 초음파 충진에 의해 티미딘 키나아제 유전자로 감염된다(Fechheimer et al., 1987).

f. 아데노바이러스 보조 감염

또다른 구체예에서 표현형 구조는 아데노바이러스 보조 감염을 사용하여 세포에 도입된다. 증가된 감염효율이 아데노바이러스 결합 시스템을 사용한 세포 시스템에서 보고된다(Kelleher and Vos, 1994; Cotten et al., 1992; Curiel, 1994).

g. 리셉터 중재 감염

타겟 세포에 표현형 구조를 전달하는 또다른 방법은 리셉터-중재 전달 방법이다. 이것은 타겟 세포에서 일어나는 리셉터-중재 엔도사이토시스에 의해 거대분자의 선택적 흡수의 장점을 이용한다.

다양한 리셉터의 세포타입-특이성 분배에 기초하여 이 전달방법은 본 발명에 특이성을 제공한다. 포유동물 세포에 특이성 전달이 발표된다(Wu, 1993).

리셉터-중재 유전자 타겟팅 비클은 세포 리셉터-특이 리간드와 DNA-결합제이다. 또한 전달될 DNA 구조가 부착되는 세포 리셉터-특이 리간드도 해당된다. 리셉터-중재 유전자 전달에 몇 가지 리간드가 사용된다(Wu and Wu, 1987; Wagner et al., 1990; Perales et al., 1994; Myers, EPO 0273085). 본 발명에서 리간드는 신경 내분비 타겟 세포에 특이하게 표현된 리셉터에 해당되도록 선택된다.

다음 구체예에서 세포-특이 유전자 타겟팅 물체의 DNA 전달체 성분은 리포좀과 조합으로 특이결합 리간드이다. 전달될 핵산은 리포좀내에 수용되고 특이결합 리간드는 리포좀막에 기능적으로 포함된다. 따라서 리포좀은 타겟 세포의 리셉터에 특이 결합하여 내용물을 세포에 전달한다. 이러한 시스템은 상피 성장 팩터(EGF)가 EGF 리셉터의 과다조절을 보이는 세포에 핵산을 리셉터-중재 전달하는데 사용되는 시스템을 사용하여 기능성이 된다.

또다른 구체예에서, 타겟 전달체의 DNA 전달체 성분은 셀-특이 결합을 안내하는 하나 이상의 지질 또는 당단백질을 포함한다. 예컨대 Nicolau(1987)는 락토실-세라미드, 갈락토스-말단 아시알로간글리오사이드를 사용하여 리포좀에 포함시켜서 간세포에 의한 인슐린 유전자의 흡수 증가를 관찰하였다. 본 발명의 조직-특이성 변환 구조는 유사 방식으로 타겟 세포에 특이하게 전달될 수 있다.

D. 마커 유전자

본 발명의 한 측면에서 특수 유전 마커를 써서 특수 세포가 표지되어서 세포의 운명에 대한 정보를 제공한다. 그러므로, 본 발명은 전체 세포 분석에 기초하여 리포터 유전자의 상류에 위치된 DNA 프로모터가 기능성이 되는 조건하에서만 나타나는 표현형을 재조합 호스트에 부여하는 리포터 유전자를 사용하는 재조합 후보 선별 및 선택방법을 제공한다. 일반적으로 리포터 유전자는 형광측정, 방사능 동위원소, 세포 배양액의 분광학적 분석에 의해 탐지가능한 폴리펩티드(마커 단백질)를 코딩한다.

본 발명의 다른 측면에서 PCR에 의한 DNA 또는 RNA 증폭이나 형광측정, 방사능 동위원소 또는 분광학적 측정 프로브를 사용하는 교잡방법과 같은 유전자 분석기술에 의해 탐지가능한 유전자 마커가 제공된다.

1. 스크린잉

예시적인 효소는 에스테르아제, 포스페이트아제, 프로테아제(조직 플라스미노젠 활성제 또는 유로키나아제)와 활성도에 의해 탐지될 수 있는 기타 효소를 포함한다. 트랜스 유전자의 마커로서 초록 형광성 단백질(GFP)이 사용된다(Chalfie et al., 1994). GFP는 외부에서 첨가된 물질일 필요는 없으며 근 UV 또는 청색광에 의해서만 조사되므로 살아있는 세포의 유전자 표현을 모니터링 하는데 사용가능하다.

방사능 표지된 물질과 함께 사용될 수 있는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼아제(CAT), 나방 및 박테리아 루시퍼아제, 및 박테리아 효소 β-갈락토시드아제와 β-글루쿠로니드아제도 또다른 예이다.

2. 선택

숙주세포에 탐지가능한 특성을 부여하는 또다른 리포터 유전자는 독소에 내성을 갖게 하는 폴리펩티드(효소)를 코딩하는 것이다. 이러한 부류의 리포터 유전자는 독성 항세 G418에 대해 숙주세포를 보호하는 neo 유전자(Colberre-Garapin et al., 1981), 스트렙토마이신 내성을 보이는 유전자(U.S. Patent 4,430,434), 하이그로마이신 B 내성을 부여하는 유전자(Santerre et al., 1984; U.S. Patents 4,727,028, 4,960,704 and 4,559,302), 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 디히드로플레이트 환원효소를 코드화하는 유전자(Alt et al., 1978), 효소 HPRT(Kaufman, 1990)이다.

E. 생물학적 기능 등가물

본 발명이 망막모세포종 단백질로 예시되는 종양 억제 단백질을 고려하며, 관련 단백질에 더 큰 종양 억제능을 부여하는 N-말단 지역내에 변성을 포함하는 단백질을 대상으로 하였지만 생물학적 활성이 유지되도록 단백질의 비-변성된 C-말단 지역을 변경하는 것도 본 발명의 범위에 속한다.

위에서 언급된 바와 같이 변성 및 변경은 망막모세포종 단백질의 구조에서 행해진다. 예컨대 일부 아미노산이 종양 억제능력의 큰 손실없이 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 생물학적 활성을 좌우하는 것은 단백질의 성질과 상호작용능력이므로 단백질 서열(또는 DNA 코딩서열)에서 특정 아미노산 서열의 치환이 행해질 수 있으며 그럼에도 불구하고 유사 성질을 갖는 단백질이 수득된다. 또한 상쇄성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 그러므로 생물학적 활용도 또는 활성도에서 큰 손실없이 종양 억제 단백질 또는 펩티드(또는 DNA) 서열에 다양한 변화가 가능하다.

분자의 한정된 부위내에서 변화가 있으며 등가의 생물학적 활성을 보이는 분자를 가져오는 것은 기능에서 등가물이고 정의한다. 생물학적 기능이 등가인 펩티드는 아미노산 일부가 치환된 펩티드를 말한다. 물론 상이하게 치환된 복수의 단백질/펩티드도 가능하다.

또한 특정 잔기는 단백질 또는 펩티드의 생물학적 또는 구조적 성질에 특히 중요하므로 활성자리에 있는 잔기는 일반적으로 교환되서는 안 된다.

보존성 치환은 다음과 같은 변화를 포함한다: 알라닌 →세린; 아르기닌 →리신; 아스파라긴 →글루타민 또는 히스티딘; 아스파테이트 →글루타메이트; 시스테인 →세린; 글루타민 →아스파라긴; 글루타메이트 →아스파테이트; 글리신 →프롤린; 히스티딘 →아스파라긴 또는 글루타민; 이소루신 →루신 또는 발린; 루신 →발린 또는 이소루신; 리신 →아르기닌, 글루타민 또는 글루타메이트; 메티오닌 →루신 또는 이소루신; 페닐아민 →티로신, 루신 또는 메티오닌; 세린 →트레오닌; 트레오닌 →세린; 트리프토판 →티로신; 티로신 →트리프토판 또는 페닐아민; 발린 →이소루신 또는 루신.

이러한 변화시 아미노산의 히드로패틱 지수가 고려될 수 있다. 각 아미노산에 대해 소수성 및 전하 특성을 기초로 히드로패틱 지수가 할당된다: 이소루신(+4.5); 발린(+4.2); 루신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인 1 시스템(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트리프토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 아르기닌(-4.5).

단백질에 생물학적 기능을 부여하는데 아미노산의 히드로패틱 지수의 중요성이 발표된다(Kyte & Doolittle, 1982). 유사한 히드로패틱 지수를 갖는 다른 아미노산으로 특정 아미노산이 치환될 수 있다. 히드로패틱 지수에 기초한 변화시 히드로패틱 지수가 ±2내에 있는 아미노산의 치환이 선호되며, ±1, 특히 ±0.5내에서 아미노산이 치환된다.

또한 친수성을 기초로 유사 아미노산의 치환이 효과적으로 수행될 수 있다. 미국특허 4,554,101에서 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 단백질의 평균 친수성은 면역성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 성질과 상관된다. 아미노산은 유사한 친수성 값을 가지는 다른 아미노산으로 치환되어 생물학적, 특히 면역학적으로 등가성인 단백질을 수득한다.

미국특허 4,554,101에 상술된 바와 같이 다음 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당된다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파테이트(+3.0 ±1); 글루타메이트(+3.0 ±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루신(-1.8); 이소루신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트리프토판(-3.4).

유사한 친수성 값에 기초한 변화시 친수성 값이 ±2, 특히 ±1, 더더욱 ±0.5 내에 있는 아미노산 치환이 선호된다.

아미노산 변화로 인한 기능적 등가성 폴리펩티드에 대해 촛점이 맞추어져 있지만 코딩 DNA의 변경에 의해서도 변화가 가능하며, 유전자 코드 역시 축퇴되어 두 개 이상의 코돈이 동일 아미노산을 코드화 할 수 있다. 아미노산 및 코돈에 대한 두 개의 표가 프로브 및 프라이머 디자인과 같은 용도를 위해 제시된다.

코돈은 좌에서 우로 우세성이 감소한다.

밑줄친 코돈은 1000개 코돈당 5회 미만 사용된다.

코돈은 좌에서 우로 우세성이 감소한다.

밑줄친 코돈은 1000개 코돈당 5회 미만 사용된다.

F. 돌연변이 형성

돌연변이 형성은 특정 종양 억제 단백질 또는 시토킨 단백질 서열내에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 올리고누클레오티드 합성과 같은 당해분야에서 공지된 기술에 따라 이루어진다. 특히 사이트-특이성 돌연변이 형성이 DNA의 특이성 돌연변이를 통한 펩티드 또는 단백질 제조에 유용한 기술이다. 이 기술은 DNA에 하나 이상의 누클레오티드 서열 변화를 도입하여 생신 서열 변종을 제조 및 테스트하는 능력을 제공한다.

사이트-특이성 돌연변이 유발은 필요한 돌연변이의 DNA 서열을 코딩하는 특수 올리고누클레오티드 서열의 사용과 결손 접합의 양면상에 안정한 이중나선을 형성하는 충분한 크기 및 서열 복잡성을 갖는 프라이머를 제공하는 충분한 갯수의 인접 누클레오티드를 사용하여 돌연변이체 생성을 허용한다. 대체로 17 내지 75개의 누클레오티드 또는 그 이상의 프라이머가 선호된다. 서열 접합부의 양면상에 10 내지 25개의 잔기가 변경된다.

일반적으로, 사이트-특이성 돌연변이 유발 기술은 공지이다. 이 기술은 단일쇄 및 이중쇄 형태로 존재하는 파아지 벡터를 보통 사용한다. 사이트-특이성 돌연변이 유발에 유용한 벡터는 M13 파아지와 같은 벡터이다. 이들 파아지는 구매가능하며 용도도 잘 알려져 있다. 또한 이중쇄 플라스미드가 사이트 특이성 돌연변이 유발에 사용되어 플라스미드로 부터 파아지로의 유전자 전달단계를 생략할 수 있게 한다.

일반적으로 사이트-지향 돌연변이 유발은 필요한 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 서열내에 포함하는 이중쇄 벡터의 용융 분리나 단일쇄 벡터를 수득함으로써 수행된다. 필요한 돌연변이 서열을 갖는 올리고누클레오티드 프라이머가 제조된다. 이 프라이머는 단일쇄 벡터와 어닐링되고 E. coli 폴리머라제 I Klenow 프래그먼트와 같은 DNA 중합 효소의 작용을 받아 돌연변이 함유쇄의 합성을 종결한다. 따라서 하나의 쇄는 최초의 돌연변이 안된 서열을 코딩하고 또하나의 쇄는 필요한 돌연변이를 갖는 이종 이중나선이 형성된다. 이종 이중나선 벡터가 E. coli. 세포와 같은 세포 변형 또는 감염에 사용되고 돌연변이된 서열을 갖는 재조합 벡터를 포함하는 클론이 선택된다. 유전 선택 스킴은 Kunkel(1987)에 의해 고안되었고 돌연변이 올리고누클레오티드를 포함한 클론이 선호된다.

혹은 Tag 폴리머라제와 같은 열안정성 효소를 갖는 PCR의 사용으로 돌연변이 올리고누클레오티드 프라이머가 증폭된 DNA 프래그먼트에 포함되고 이후에 적절한 표현 벡터에 삽입된다. Tomic(1990) 및 Upender(1995)의 PCR-중재 돌연변이 유발절차는 두 가지 프로토콜을 제공한다. 열안정성 폴리머라제에 추가적으로 열안정성 리가아제를 사용하는 PCR이 인산화된 돌연변이 올리고누클레오티드를 증폭된 DNA 프래그먼트에 포함시키는데 사용되고 적절한 표현벡터에 포함된다. Michael(1994)에 의해 발표된 돌연변이 유발 과정은 이러한 프로토콜의 일례이다.

사이트-지향 돌연변이 유발을 사용한 선택된 펩티드-코드화 DNA 세그멘트의 서열 변종 제조는 유용한 종 생성 수단으로서 제공되며, 펩티드 및 이의 DNA 서열의 변종을 수득시키는 다른 방법도 있다. 예컨대, 필요한 펩티드 서열을 코딩하는 재조합 벡터가 히드록실아민과 같은 돌연변이 유발제로 처리되어 서열변종을 얻을 수 있다.

"올리고누클레오티드 지향 돌연변이 유발 절차"는 템플레이트 종속 과정 및 벡터-중재 진행 과정을 말하며, 초기농도에 대한 특정 핵산 분자의 농도 증가 또는 증폭과 같은 탐지가능신호의 농도 증가를 가져온다. "올리고누클레오티드 지향 돌연변이 유발 절차"는 프라이머 분자의 템플레이트 종속적 연장 과정을 말한다. 템플레이트 종속 과정은 새로 합성된 핵산쇄가 잘 알려진 상보적 염기 짝짓기에 의해 지배되는 RNA 또는 DNA 분자의 핵산 합성을 말한다(Watson, 1987). 벡터중재 방법은 핵산 프래그먼트를 DNA 또는 RNA 벡터에 도입, 벡터의 증폭 및 증폭된 핵산 프래그먼트의 회수 단계를 포함한다. 이러한 방법은 미국특허 4,237,224 에 발표된다.

G. 제약학적으로 허용가능한 조성물 및 투여 루트

임상적 적용이 고려되는 경우에 테트라시클린-조절된 벡터, 재조합 바이러스 및 적절한 형태의 세포, 단백질, 핵산을 포함한 제약 조성물 제조가 필요하다. 이러한 조성물은 인간 또는 동물에 유해한 불순물과 발열원이 없다.

환자에게 도입하기에 적합하도록 조성물에 염과 버퍼를 사용하는 것이 필요하다. 본 발명의 수성조성물은 제약학적으로 수용가능한 담체 또는 수성매체에 용해 또는 분산 또는 캡슐화된 유효량의 치료제를 포함한다. "제약학적으로 수용가능한"이란 용어는 인간 또는 동물에 투여된 때 역효과나 알레르기 반응을 일으키지 않은 조성물을 말한다. "제약학적으로 수용가능한 담체"는 용매, 분산매체, 코팅, 항균제, 등장액 및 흡수 지연제등을 포함한다. 이러한 매체 및 작용제의 사용은 당해분야에 공지된다. 전통적인 매체 또는 작용제가 본 발명의 벡터 또는 세포와 비상용성인 경우를 제외하고는 이들은 치료 조성물에 사용가능하다. 기타 항암제와 같은 보충 활성 성분이 조성물에 포함될 수 있다.

무염기 또는 염으로서 활성성분 용액이 히드록시프로필 셀룰로오스와 같은 계면활성제와 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 오일 또는 혼합물에서 분산물이 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건하에서 이들 제조물은 미생물 성장을 막기 위해 방부제를 포함한다. 정맥주사용은 유체와 영양 보충물을 포함한다. 방부제는 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스를 포함한다. 다양한 성분의 pH와 농도는 잘 알려진 변수에 따라 조절된다.

바이러스 또는 세포의 유효량은 의도된 목표에 기초하여 결정된다. "단위 투여량"은 사용에 적합한 물리적으로 구별된 단위로서 각 단위는 투여와 조합으로 필요한 반응을 일으키도록 계속된 치료 조성물의 예정된 양을 포함한다. 치료 횟수 및 단위 투여량에 따라 투여될 양은 치료될 대상, 대상의 상태 및 필요한 보호정도에 달려있다. 정확한 치료 조성물의 양은 의사의 판단에 달려있다.

1. 비경구 투여

본 발명의 조성물은 종종 비경구 투여용으로 배합된다. 즉, 정맥주사, 근육내, 피하, 종양내, 종양주변 또는 복막내 루트를 통한 주사용으로 제조된다. 활성 성분으로서 제 2 작용제를 포함한 수성 조성물의 제조도 공지된다. 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로; 주사에 앞서 액체 첨가로 용액 또는 현탁액을 제조하는 고체 형태로; 또는 유화된 형태로 존재한다.

무염기 또는 염으로서 활성 화합물 용액이 히드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 혼합된 물에서 제조된다. 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 또는 오일에서 분산물이 제조될 수 있다. 보통 저장 및 사용 조건하에서 이들 제조물은 미생물 성장을 방지할 방부제를 포함한다.

주사용 제약 형태는 무균 수용액 또는 분산물; 참기름, 땅콩기름 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함한 제형; 무균 주사용 용액 또는 분산물 제조용 무균 분말 형태이다. 모든 경우에 무균이어야 하고 주사 놓기가 쉽게 유체이어야 한다. 또한 제조 및 저장 조건에서 안정하며 박테리아 및 균과 같은 미생물의 오염 작용이 방지되어야 한다.

활성화합물은 중성 또는 염형태로 조성물에 포함된다. 제약학적으로 수용가능한 염은 산부가염(단백질의 자유 아미노기로 형성된)과 염화수소 또는 염산과 같은 무기산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 맨델산과 같은 유기산으로 형성된다. 유리 카르복실기로 형성된 염은 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철과 같은 무기염기와 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인과 같은 유기 염기로 부터 유도된다.

담체는 물, 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산매이다. 레시틴과 같은 코팅 사용, 분산물의 경우 입자크기 유지 및 계면활성제 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살과 같은 항박테리아 및 항균제가 포함될 수 있다. 많은 경우에 당 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 포함시키는 것이 좋다. 주사용 조성물의 오랜 흡수는 흡수 지연제(알루미늄 모노스테아레이트, 겔라틴)를 사용하여 이루어진다.

무균 주사용 용액은 위에서 열거된 다양한 성분과 함께 적절한 용매에서 필요한 양만큼 활성 화합물을 포함시키고 여과 무균처리에 의해 제조된다. 염기성 분산매와 기타 성분을 포함하는 무균체에 다양한 무균 성분을 포함시켜 분산물이 제조된다. 무균 주사용 용액 제조용 무균 분말의 경우에 진공건조와 동결 건조방법은 무균 여과된 용액으로 부터 활성성분과 필요한 추가 성분의 분말을 생성한다.

수용액에서 장관외 투여를 위해서는 용액은 필요한 경우에 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석액은 우선 적절한 염 또는 포도당을 가진 등장액으로 제공된다. 이와 같은 특정 수용액은 특히 정맥, 근육내, 피하, 종양으로, 종양 사이에, 복막 투여에 적합하다. 이와 연계하여, 이용되는 적절한 수용성 배지는 본 명세서에 있는 부분에 숙지의 지식을 가진 자에게 공지된 것을 이용한다. 예를 들면, 1회 약량은 1㎖ 등장성 NaCl 용액에 용해시키고, 1000㎖ hypodermolysis 용액에 첨가하거나 주입하고자 하는 위치에서 주사한다("Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580). 치료받을 개체의 조건에 따라 약량에 약간의 변화가 필수적일 수 있다. 투여하는 사람은 개체에 적합한 약량을 결정해야 한다.

2. 다른 투여 경로

정맥 또는 근육내 주사와 같은 장관외 투여용으로 제조된 화합물에 추가하요, 다른 제약학적 수용 가능한 형에는 경구 투여를 위한 정제, 또는 다른 고체; 시간에 따른 서방형제제 및 크림, 로션, 구강세척액, 흡입제등을 포함하는 현재 이용되는 임의 다른 형태를 포함한다.

본 발명의 발현 벡터 및 운반 비이클에는 전통적인 제약학적 제조물이 포함된다. 본 발명에 따른 이와 같은 조성물을 투여하는 것은 이와 같은 경로를 통하여 표적 조직에 닿을 수 있기만 하다면, 임의 통상적인 경로를 이용할 수 있다. 여기에는 구강, 비강, 볼, 직장, 질 또는 국소 경로를 포함한다. 또한, 직접, 경피, 피하, 근육, 복막 또는 정맥으로 주사할 수 있다. 주사는 전신, 부분, 국소 또는 종양으로 직접 주사하는 것을 포함한다. 또한, 잘라낸 종양 베드에 주사하는 것과 카테테르를 경유하여 연속적으로 관주하는 것이 포함된다. 이와 같은 조성물은 상기에서 설명한 것과 같은 제약학적 수용 가능한 조성물로 투여된다.

본 발명의 벡터는 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사용 조성물 형태로 투여되거나 주사하기 전에 용액 또는 현탁액으로 만들 수 있도록 된 고형으로 준비될 수 있다. 이와 같은 조제물은 에멸젼화될 수 있다. 이와 같은 목적에 적합한 일반적인 조성물은 인산염 완충액 ㎖당 사람 혈청 알부민이 50㎎ 또는 최고 100㎎까지 포함한다. 다른 제약학적 수용 가능한 담체에는 수용액, 비독성 부형제, 예를 들면, 염, 보존제, 완충액등을 포함한다. 비-수용성 용매에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 주사용 유기 에스테르(티올레이트와 같은)등을 포함한다. 수용성 담체에는 물, 알코올/수용액, 염 용액, 염화 나트륨, 링거 덱스트로즈등과 같은 장관외 비이클등이 포함된다. 정맥 비이클에는 유체 및 영양소 보충제등을 포함한다. 보존제에는 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 및 비활성 기체등을 포함한다. 제약학적 조성물에서 다양한 성분의 농도 및 pH는 공지된 변수에 따라 조절한다.

추가 조제물은 경구 투여에 적합한 것으로 조제한다. 경구 조제물에는 제약학적으로 이용할 수 있는 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아레이트 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오즈, 탄산 마그네슘등과 같은 전형적인 부형제등이 포함된다. 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 지연 방출 제형 또는 분말형으로 취해딘다. 국소 경로를 이용하는 경우에는 크림, 연고, 고약, 스프레이등의 형태가 이용될 수 있다.

치료요법제의 효과양은 원하는 목적에 따라 결정한다. "단위 약량"은 개체에게 이용하기 위해 물리적으로 별개의 단위로 제조된 것을 말하는 것으로 각 단위에는 예정된 양의 치료요법제 조성물을 포함하여, 적절한 경로 및 치료 섭생등의 투여에 따라 원하는 반응을 나타내게 된다. 치료 횟수 및 단위 약량에 따라 투여되는 양은 치료를 받을 개체, 개체의 상태, 원하는 보호범위등에 기준하여 달라진다. 치료 조성물의 정확한 양은 치료자의 판단에 따라서도 달라지지만, 이는 개체마다 독특한 것이다.

특정 경우에, 본 발명의 치료제는 국소 투여를 위한 제형 가령, 크림 및 로션과 같은 형태로 만들어져야 한다. 이와 같은 형태는 다양한 암종과 같은 피부-관련된 질병을 치료하는데 이용된다.

조제시에, 용액은 약량 조제물이 적응 할 수 있는 방식으로 투여되어야 하고, 이 양은 치료요법적으로 효과가 있어야 한다. 조제물은 다양한 약령으로 용이하게 투여할 수 있는 것으로, 상기에서 언급한 것과 같은 주사용 용액의 형태가 될 수 있으며, 약물 방출 캡슐등이 이용될 수도 있다.

H. 화학치료제

본 발명의 방법은 환자에서 나타나는 특정 질병 또는 질환을 치료하는데 이용되는 임의 다른 방법과 복합할 수 있다. 예를 들면, 충실성 종양을 치료하는 것과 연계하여, 본 발명의 방법은 전통적인 방법, 예를 들면, 외과술, 방사능 요법등과 같은 것과 복합할 수 있다. 특정 치료 방법이 그 자체로 치명적이지 않는 한, 또는 종양 억제물질 효법의 효과와 상충하지 않는한, 본 발명과 복합하는 것을 고려할 수 있다. 한 가지 이상의 물질이 사이토킨 유전자 요법 또는 종양 억제물질 유전자 요법과 복합하여 이용되는 경우에, 복합된 결과가 각 치료를 별도로 시행하였을 경우에 관찰되는 효과에 부가될 필요는 없고, 복합 치료가 상승 효과를 나타내어야 하는 것도 아니다.

외과술의 경우에, 임의 외솨적인 중재는 본 발명과 연계하여 실행할 수 있다. 방사능요법과 연계하여, 종양 세포안에서 국소적으로 DNA 손상을 유도하는 임의 기작을 고려할 수 있는데, 예를 들면, γ-방사, X-선, UV-방사, 마이크로웨이브, 전자 방출등이 있다. 종양 세포로 방사능 동위원소를 직접 제공하는 것도 고려할 수 있고, 표적 항체 또는 다른 표적 수단을 함께 이용할 수도 있다. 사이토킨 요법은 복합 치료 방법에서 효과적인 파트너라는 것이 증명되었다. 이와 같은 복합 방법에 다양한 사이토킨을 이용할 수 있다. 사이토킨으로는 IL-1αIL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TGF-β, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNFα, TNFβ, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ등을 이용할 수 있다. 표준 섭생 과정에 따라 사이토킨이 투여되고, 이는 환자의 상태 및 사이토킨의 관련 독성등에 따라 달라진다. 하기에는 사이토킨의 예를 든 것으로 본 발명의 특정 구체예에 이용할 수 있는 것들이다.

본 발명의 조성물은 하기에서 예시하는 것과 같은 화학요법제인 화합물(제 2 물질)의 효과량과 복합하여 치료요법적으로 투여할 수 있는 조작된 바이러스 또는 세포의 효과량으로 구성된다. 이와 같은 조성물은 일반적으로 제약학적 수용 가능한 담체 또는 수용성 매체에 용해 또는 분산시킨다. 다양한 화합치료제가 본 발명의 치료요법적 유전자와 복합하여 이용될 수 있다. 예를 들면, DNA로 직접 끼워들어갈 수 있는 물질, DNA와 교차 결합할 수 있는 물질, 핵산 합성에 영향을 주어 염색체 및 유사분열에 이상을 유도할 수 있는 물질이 될 수 있다.

종양 파괴를 강화시키는 기작과는 무관하게, 본 발명의 복합 치료는 질병을 치료하는데 효과적인 용도를 가진다. 본 발명의 조성물을 화학요법제와 복합하여 이용하기 위해서, 여기에서 언급하는 것과 같이 제 1 변형된 망막모세포종 종양 억제물질을 동물에세 간단하게 투여하고, 이때 동물내에서 복합된 항-종양 작용을 일으키는데 효과적인 방식으로 화학요법제를 복합할 수 있다. 따라서, 이와 같은 물질은 효과량으로 제공되고, 종양 환경에서 이와 같은 복합된 작용을 가질 수 있도록 효과적인 시간동안 제공된다. 이와 같은 목적을 이루기 위해, 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 및 화학치료제는 동물에 단일 조성물로 동시에 투여되거나 또는 다른 투여 경로를 이용하여 두 개 별도의 조성물로 투여될 수 있다.

또는, 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 치료를 선행하거나 수분 내지 몇주간의 시간 간격을 두고 화학치료제로 치료를 한 후에 실시한다. 화학치료제 인자 및 변형된 망막모세포종 종양 억제물질을 동물에 별도로 제공하는 구체예에서는, 특정 시간 간격이 각 물질의 수송 시간을 초과하지 않도록 하는데, 화학치료제 및 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 조성물이 종양에서 유익하게 복합된 효과를 발휘할 수 있도록 한다. 이와 같은 경우에, 종양은 두 가지 물질과 적어도 5분 내지 1주일, 적절하게는 서로 약 12-72시간동안 접족하도록 하고, 또한, 약 12-48시간의 지연 시간을 가지는 것이 적합하다. 일부 경우에서, 치료 시간을 연장하는 것이 바람직한데, 각 투여 시간사이에 몇 일(2, 3, 4, 5, 6, 7) 또는 몇 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8)가 경과하게 된다. 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 또는 화학요법제를 1회 이상 투여하는 경우가 바람직할 수도 있다. 종양을 퇴행시키기 위해서는, 두 가지 물질은 투여하는 시간과는 무관하게 종양의 생장을 저해시키는데 효과적인 복합 양을 제공한다.

다양한 화학요법제를 여기세어 설명하는 복합 치료 방법에 이용할 수 있다. 예를 들면, 에토포시드(VP-16), 아드리아미아신, 5-플로오르우라실(5FU), 캄포테신, 악티노마이신-D, 미토마이신 C, 시스플라틴(CDDP), 과산화수소등을 포함한다.

당업자가 인지할 수 있는 것과 같이, 화학치료제의 적절한 약량은 임상적인 요법에 이용되는 것에 준하는데, 이때 화학요법제는 단독으로 투여되거나 또는 다른 화학요법제와 복합하여 투여할 수 있다. 예를 들면, 시스플라틴과 같은 물질 및 다른 DNA 알킬화 물질을 이용할 수 있다. 시스플라틴이 암을 치료하는데 널리 이용되었고, 임상적으로는 총 3회 과정으로 매일 3주간 20㎎/㎡을 이용하였다. 시스플라틴은 구강으로 흡수되지 않기 때문에, 정맥, 피하, 종양 또는 복막으로 투여해야 한다.

핵산 특히 DNA와 교차 결합하는 물질을 DNA 손상하여, 항-신조직형성 복합물의 공조효과를 유도하는지를 관찰한다. 시스플라틴 및 다른 DNA 알킬화제와 같은 물질을 이용한다.

또한, 유용한 화합물에는 DNA 복제, 유사분명 및 염색체 분리와 간섭하는 화합물이 포함된다. 이와 같은 화학요법제 화합물에는 독소루비딘으로 공지된 아드리아마이신, 에토포시드, 베라파밀, 포도필로톡신등을 포함한다. 신조직형성을 치료하는데 임상적으로 널리 이용되는 이와 같은 화합물은 아드리아마이신의 경우에 21일간 25-75㎎/㎡의 약량 범위에서 볼에 주사하여 정맥으로 투여하거나, 에토포시드의 경우에는 35-50㎎/㎡의 약량 범위로 정맥으로 또는 경구로 정액 약량의 2배를 투여한다.

폴리뉴클레오티드의 합성 및 전구물질의 충실성을 파괴하는 물질을 이용할 수 있다. 특히 유용한 물질은 광범위한 테스트를 거친 것을 이용할 수 있다. 5-플로오르우라실(5-FU)과 같은 물질이 신조직에 이용하는데 적합한데, 이는 신조직 세포를 표적으로 하는데 유용하다. 독성이 매우 크기는 하나, 5-FU는 국소등에 이용할 수 있는 광범위한 담체이나, 정맥으로 투여하는 경우에는 3 내지 15㎎/㎏/day의 약량이 통상적으로 이용된다.

탁솔과 같은 식물의 알칼로이드를 본 발명의 특정 부분에서 이용할 수도 있다. 탁솔은 풀무레나무, Taxus brevifolia 의 껍질에서 분리한 항-유사분열제이다. 이는 튜블린(빈카 알칼로이드가 이용하는 것과 별개의 부위)에 결합하여, 마이크로튜블의 합체를 촉진한다. 탁솔은 현재 임상적으로 평가를 받고 있으며, 악성 흑색종 및 난소의 암종에 대해 활성이 있다. 최대 약량은 5일한 하루에 30㎎/㎡를 제공하거나 매 3주에 한번 210 내지 250㎎/㎡의 약량으로 제공된다. 물론, 모든 약량은 예시적인 것으로 본 발명에 이용되는 약량의 이 범위의 것이 된다.

표 4에는 복합 치료법에 관여하여 이용되는 예시적인 화학요법제를 나열한 것이다. 각 물질은 예를 든 것으로 이에 국한 시킨다는 의미는 아니다. 당업자는 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, chapter 33, in particular pages 624-652"를 참고로 해도 된다. 치료받을 개체의 상태에 따라 약량에 어느 정도 변화가 있을 수 있다. 투여를 담당하는 사람은 개체에 적합한 약량을 결정해야 한다. 또한, 사람에게 투여하는 경우에는 FDA Office of Biologies standards의 멸균성, 발열성, 일반적인 안정성 및 순도 기준에 맞도록 조제물을 조제해야 한다.

1. 단백질 정제

본 발명은 인코드된 단백질 또는 펩티드의 정제에 관계한다. 여기에서 사용된 것과 같이 " 정제된 단백질 또는 펩티드"는 다른 성분으로부터 분리된 조성물을 말하는 것으로 이때 단백질 또는 펩티드는 자연상태에서 얻을 수 있는 것에 비해 어느 정도 순수하다는 것을 의미한다. 따라서, 정제된 단백질 또는 펩티드는 자연에서 발생되는 것이 없는 단백질 또는 펩티드를 말한다.

일반적으로 "정제된"이란 다양한 다른 성분을 제거하기 위해 분류과정을 거친 펩티드 또는 단백질 조성물을 말하는 것으로 조성물은 실제 발현된 생물학적 활성을 가진다. "실제 정제된"이란 용어가 이용되는 경우에, 이는 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주요 성분을 이루는 경우, 가령, 조성물에서 단백질이 50%이상되는 경우의 조성물을 말하는 것이다.

단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 확인하는 다영한 방법은 당업자에 공지되어 있다. 여기에는 활성 부분의 특이활성을 결정하는 방법, SDS/PAGE 분석에 의해 분취물내에 폴리펩티드의 수를 측정하는 것등이 포함된다. 분취물의 순도를 측정하는 적절한 방법은 분취물의 특이 활성을 계산하고, 초기 추출물의 것과 계산된 것을 비교하여, 순도를 계산하는데, 이는 몇 배 순도로 나타낸다. 활성의 양을 나타내는 실제 이용되는 단위는 순수분리에 이용되는 특정 기술에 따라 달라지고, 발현된 단백질 또는 펩티드가 감지가능한 활성을 가지는지에 따라서도 달라진다.

단백질 정제에 적합한 다양한 기술이 본 분야에 공지되어 있다. 여기에는 암모니움 설페이트, PEG, 항체등으로 침전시키는 방법, 열에 의해 비활성화시키고, 원심분리하는 방법, 크로마토그래피 단계 가령, 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록시아피타이트 및 친화력 크로마토그래피 방법, 등전점 포커스; 겔 전기영동 및 이들을 복합한 기술등이 포함된다. 당분야에 일반적으로 공지된 것과 같이, 다양한 정제과정을 실행하는 단계 순서는 바뀔 수도 있고, 특정 단계가 생략될 수도 있어, 실제 정제된 단백질 또는 펩티드를 제조하는데 적절한 방법으로 만든다.

단백질 또는 펩티드가 가장 순수한 형테로 제공되어야 하는 일반적인 규정은 없다. 또한, 다소 순수성이 떨어진 정제된 생성물도 특정 구체예에서 이용될 수 있다. 정제단계를 적게 거치거나 또는 동일한 과정을 다른 형태로 이용하여 부분적으로 순수분리를 할 수 있다. 예를 들면, HPLC 장치를 이용하여 실행하는 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피는 저압 크로마토그래피 시스템을 이용하는 동일한 기술보다 몇 배 순도가 큰 생성물을 얻게 한다. 상대적으로 순수분리 과정을 나타내는 방법은 총 회수되는 단백질에 유익하거나 또는 발현된 단백질의 활성을 유지하게 한다.

폴리펩티드의 이동은 상이한 SDS/PAGE 조건에 따라 달라진다는 것은 알려진 사실이다(Capaldi et al., 1977). 따라서, 상이한 전기영동 조건하에서, 순수분리된 또는 부분적으로 순수부닐된 발현 생성물의 분자량은 다양하다.

HPLC는 매우 신속하게 상당한 해리 피크를 가지면서 분리할 수 있는 기술이 된다. 매우 미세한 입자 및 고압을 이용하여 유속을 적절하게 유지시켜 실행한다. 수분 또는 한 시간안에 분리가 이루어진다. 또한, 매우 소량의 샘플을 이용하는데, 그 이유는 입자가 작아서, 매우 밀착되어 있어, 빈 공간(void volume)이 베드 볼륨의 매우 작은 부분을 차지한다. 또한, 샘플 농도고 높지 않아도 되는데, 그 이유는 밴드가 매우 좁아서, 샘플을 매우 적게 희석해야 한다.

분자량에 기초하여 분리 크로마토그래피를 하는 것은 겔 크로마토그래피 또는 분자량 거름 크로마토그래피가 된다. 겔 크로마토그래피에 대한 이론은 매우 작은 구멍을 가지는 비활성 물질로 된 매우 작은 입자로 된 컬럼에서 크기에 따라, 구멍을 통과할 수 있는 작은 분자는 큰 분자에서 분리되는 것이다. 입자를 이루는 물질이 분자를 흡수하지 않는 한, 유동의 속도를 결정하는 유일한 인자는 분자의 크기가 된다. 여기에서, 분자는 분자의 모양이 상대적으로 균질한 경우에 크기가 감소되는 순으로 컬럼으로부터 용출된다. 겔 크로마토그래피는 분자의 크기에Ekfk 분리하고, 모든 다른 인자 가령, pH, 이온 강도 및 온도와는 무관하게 분리하는 방법이기 때문에, 크기가 다른 분자를 분리하는 그리 우수한 방법은 아니다. 또한, 흡수가 없고, 지역의 퍼짐이 적고, 용출되는 용적은 분자량에 관계한다.

친화력 크로마토그래피는 분리되는 물질과 이에 특이적으로 결합하는 분자간에 특이적인 친화력에 따라 분리되는 크로마토그래피 과정이다. 이는 수용체-리간드 형태의 상호작용이 된다. 컬럼 물질은 불용성 매트릭스에 이의 결합 짝을 공유 결합시켜 합성된다. 컬럼 물질은 용액으로부터 물질을 특이적으로 흡수하게 된다. 조건을 결합이 일어나지 않는 방향으로 변화(pH, 이온 강도, 온도등을 변경)시키면 용출된다.

탄수화물을 포함하는 화합물을 정제하는데 이용되는 특정 타입의 친화력 크로마토그래피는 렉틴 친화력 크로마토그래피이다. 렉틴은 다양한 폴리사카라이드 및 당단백질에 결합하는 물질에 속한다. 렉틴은 통상 시아노겐 브로마이드에 의해 아가로즈에 결합된다. 세파로즈에 결합된 콘카노발린 A가 이용된 처음 물질이고, 이는 폴리사카라이드 및 당단백질을 분리하는데 널리 이용되었고, 다른 렉틴에는 렌틸 렉틴이 포함되는데, 밀 맥아 아글루티닌는 N-아세틸 글루코자미닐 잔기 및 Helix pomatia 렉틴을 정제하는데 이용된다. 렉틴 자체도 탄수화물 리간드를 이용한 친화력 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 락토오즈를 이용하여 카스트로 콩 및 땅콩으로부터 렉틴을 정제하고; 말토즈는 인도 빵나무 콩(jack bean)으로부터 렉틴을 추출하는데 유용하고; N-아세틸-D-갈락토자민은 콩으로부터 렉틴을 정제하는데 이용하고; N-아세틸 글루코자미닐은 밀 맥아로부터 렉틴에 결합하고; D-알락코자민을 이용하여 대합조개로부터 랙티을 얻고, L-퓨코즈는 로터스의 렉틴에 결합할 수 있다.

매트릭스는 상당한 정도로 분자를 흡수하지 않는 물질로 화학적, 물리적, 열적으로 안정해야 한다. 리간드는 결합 성질에 영향을 주지 않을 정도로 결합될 수 있다. 리간드는 상대적으로 단단한 결합을 제공할 수도 있다. 샘플 또는 리간드를 파괴하지 않고 물질을 용출해야 한다. 가장 흔한 친화력 크로마토그래피는 면역친화력 크로마토그래피이다.

L. 바이오리엑터에서 세포의 이용

제약 업계에서는 생물학적으로 활성을 가진 폴리펩티드를 생산하는 능력이 점차 중요해지고 있다. 본 발명은 세포에서 종양 억제 유전자를 효과적으로 조절된 발현시켜, 난치성 세포로?? 이와 같은 단백질을 발현할 수 있는 조성물 및 그 방법에 대해 설명한다.

지난 수년간, 생명공학 기술이 진보하여, 박테리아, 이스트, 곤충 세포 및 포유류 세포 배영물로부터 중요한 단백질 및 인자를 생산하는 것이 가능해졌다. 포유류 배양물은 이황화물에 따른 폴딩 및 글리코실화반응과 같은 해독후 발생되는 복잡한 단백질 구조 프로세싱 능력에 있어서, 다소 하등 생명체에 비해 장점을 가지고 있다. 또한, 포유류 세포 배양물은 사람 및 동물 의약에 이용할 수 있는 여러 가지 많은 단백질의 원료가 되고, 특히, 상대적으로 크고, 복합한 또는 글리코실화된 단백질의 원료가 된다.

포유류 세포 배양물에 매우 효과적인 벡터 시스템의 고안 및 작제, 유용한 선택 표식용 전지, 유전자 증폭 과정, 도입된 벡터로부터 최종적으로 생물학적으로 활성을 가지는 분자를 얻는데 관련된 생화학적 그리고 세포 기작의 좀더 폭넓은 이해등을 위한 분자 생물학의 기술이 발달되어 제약을 생산하기 위한 포유류 세포 배양물의 발전에 도움이 되었다.

그러나, 이형 단백질을 발현시키는데 전통적으로 선택되는 세포형은 일반적으로 CHO 세포, BHK 세포, C127 세포, 골수종 세포와 같은 좀더 "통상적인" 세포 형에 한정되었다. 대부분의 경우에, 이와 같은 세포 타입이 선택되는 이유는 펩티드 생성물을 발현시키려는 노력이 있는 동안에 실험실에서 이들 세포형에서 실시하였기 때문이다. 흔히, 발현 시스템에 대한 숙주로 세포주를 선택하기 전에 제조과정의 규모 상형의 하류 측면(가령, T-75 플라스크 이상)에 영향을 주는 인자는 고려를 하지 않았다.

본 발명은 포유류 세포의 생화학적 그리고 세포적 능력 및 최근에 이용할 수 있는 바이오리엑터 기술의 유리한 점을 가진다. 바이오리엑터에서 본 발명에 따른 세포를 생장시키는 경우에, 생장 배지로 복잡한 생물학적으로 활성을 가진 폴리펩티드를 분비하고, 대규모 생산할 수도 있다. 특정 구체예에서, 함량이 적은 복합 단백질을 가지는 한정 배지를 고안하고, 역가의 증가를 위해 배지로 시간에 따른 분비 자극을 하는 과정을 이용하여, 정제 과정을 더 간단하게 함으로써, 생산 비용을 줄일 수 있다.

1. 고정 의존성 및 비-고정 의존성 배양물

동물 및 사람 세포는 두 가지 방식으로 in vitro에서 증식될 수 있다; 대량 배양을 통하여, 현탁액에서 자유로이 생장하는 비-고정 의존성 세포; 이들의 증식을 위해 고형 기질에 부착을 해야하는 고정-의존성 세포(가령, 단층 형태의 세포 생장)가 있다.

세포 및 세포 생성물을 대규모로 생산하기 위해 널리 이용되는 수단으로 연속적으로 정립된 세포주로부터 비-고정 의존성 또는 현탁 배양을 이용한다. 포유류 세포 생성물을 제조하는데, 미생물 발효 기술(세균 및 이스트)에 기초한 현탁 배양이 유익하다. 이 과정은 상대적으로 작동 및 규모 상향이 간단하다. 온도, 용존 산소, pH등의 조절 및 정확한 모니터를 위해, 반응기에 균질한 조건을 제공하는데, 배양물의 샘플에서 이를 확인하다.

그러나, 생물학적 물질을 생산하는데, 항상 현탁 배양된 세포가 이용되는 것은 아니다. 현탁 배양물은 발암 성질을 가지는 것으로 보기 때문에, 생산 기질로 이들을 이용하는 경우에는 사람 및 동물에서 생성된 산물을 이용하는 것으로 한정한다(Petricciani, 1985; Larsson and Litwin, 1987). 고정-의존성 배양물에서와는 반대로 현탁 배양에서 증식된 바이러스는 어떤 경우에는 바이러스성 표식에 급격한 변화가 있어, 면역원성이 감소되기도 한다(Bahnemann, 1980). 마지막으로, 간혹, 현탁액에 있는 동일한 세포주와 비교하였을 때 고정-읜존성 배양물로 증식되었을 때 재조합 세포주는 상당량의 생성물을 분비한다(Nilsson and Mosbach, 1987). 이와 같은 이유로, 상이한 생물학적 생성물을 생산하는데 상이한 형태의 고정-의존성 세포를 이용한다.

본 발명은 고정-의존성 성질을 가지는 세포를 포함한다. 현택액에서 생존하였을 경우에, 고정-의존성 세포는 서로 결합되어, 덩어리로 생장하고, 배양 조건에 의해 세포의 중심이 유지할 수 없을 정도가 되는 크기에 다다르면, 각 덩어리의 안쪽 중심은 숨을 못쉬게 된다. 따라서, 이형 단백질을 분비하는 세포의 능력을 효과적으로 이용하기 위해, 고정-의존성 세포를 효과적으로 대량 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

2, 현탁 배양을 위한 반응기 및 과정

교반되는 탱크에서 대규모로 포유류 배양물의 현탁배양하는 것을 고려할 수 있다. 바이오리엑터의 기구 및 제어는 관련 미생물에 이용되는 발효기의 것에 준한다. 포유류 배양물이 서서히 생장하는 경우에, 오염 조절을 요구가 증가되어, 멸균 디자인으로 개선되었고, 이들 반응기의 의존성이 개선되었다. 기구 및 조절에는 교반, 온도, 용존 산소, pH 조절등이 포함된다. 탁도(존재하는 입자에 대한 함수), 용량(존재하는 생존 세포에 대한 함수), 포도당/락테이트, 탄산염/중탄산염/ 이산화탄소의 온-라인 및 오프-라인 특정을 위한 좀더 진보된 프로브 및 자동분석기를 이용할 수 있다. 현탁 배양에서 수득할 수 있는 최대 세포 밀도는 미생물 발효에 의해 얻을 수 있는 것보다 아래인 2-4 ×10⁶cells/㎖로써 상대적으로 낮다(이는 ㎖당 1㎎미만의 건조세포 중량을 말한다).

두 가지 동류의 현탁 배양물 반응기가 산업부분에서 이용되는데, 이들은 간단하고 작동하기에 튼튼하기 때문인데, 교반된 반응기 및 공수 보급 반응기가 된다. 교반된 반응기는 인터페론 생산의 경우에 8000ℓ규모까지 성공적으로 이용되었다(Phillips et al., 1985; Mizrahi, 1983). 세포는 스테인레스 강 탱크(높이대 직경이율이 1:1 내지 3:1)에서 생장시켰다. 배양물은 날로된 디스크 또는 해수 프로펠레와 같은 모양의 한 가지 이상의 교반기로 혼합한다. 날보다는 전단력이 다소 적은 교반 시스템에 대해서도 설명되었다. 교반은 자석에 의해 구동시켜 직간접적으로 구동할 수 있다. 간접적으로 구동하는 경우에는 교반기 축의 밀봉부를 통한 미생물 오염 위험을 줄일 수 있다.

초기에 미생물 발효에 이용되고, 나중에는 포유류 배양물에서 이용된 공수 반응기는 배양물을 혼합하고, 배양물에 산소를 제공하는 기류에 의존하는 것이다. 기류는 반응기의 수직판으로 들어와 순환하게 된다. 배양 표면에는 기체가 해방되어, 기포가 없는 조밀한 액체를 만들어 반응기의 하류 부분으로 이동하게 된다. 이와 같은 디자인의 주요 장점은 간단하고, 기계적인 혼합을 필료로 하지 않는다는 것이다. 일반적으로 높이에 대한 직경 비율은 10:1이 된다. 공수 반응기능 상대적으로 규모 향상을 바로 할 수 있어, 상당량의 기체를 전달할 수 있고, 상대적으로 낮은 전단력을 생성한다.

대부분 대규모 현탁 배양은 베취 또는 피드-베취 과정으로 작동되는데, 그 이유는 작동 및 규모 상향을 하는데 있어서, 가장 간단하기 때문이다. 그러나, 물질 환경 조절 장치 또는 관주 원리를 이용한 연속 과정도 이용할 수 있다.

베취 과정은 전형적인 생장 프로파일을 볼 수 있는 닫힌 시스템이다. 유도상, 지수 상, 정체상, 감소상으로 이어진다. 이와 같은 시스템에서, 영양소가 결손되고, 대사물질이 축적되기 때문에 환경은 지속적으로 변화된다. 이로써 세포 생장 및 생산에 영향을 주는 인자를 분석해야 하고, 과정의 최적화 및 복잡한 작업이 된다. 베취 과정의 생산성은 생장 과정을 연장시키기 위해 주요 영양소 공급을 조절하면 증가될 수 있다. 이와 같은 공급-베취 과정도 세포, 생성물, 및 폐기물이 제거되지 않기 때문에 닫힌 시스템이 된다.

닫힌 시스템의 경우에, 세포를 미세한 메쉬 스핀 필터에 유지시키고, 막히지 않도록 회전하면, 배양하는 동안에 새로운 배지를 관주하게 된다. 스핀 필터 배양의 경우 세포 밀도는 5 ×10⁷cells/㎖가 된다. 진정으로 개방된 시스템이고, 가장 기본적인 관주 과정은 물질 환경 조절 장치로써, 배지의 유입 및 세포 및 생성물의 유출이 있는 시스템을 말한다. 배양 배지는 반응기로 예정된 일정한 속도로 공급되는데, 이때 공급 속도는 세포의 최대 특정 생장율보다 낮은 값으로 배양물의 희석 비율을 유지하는 것이 된다(반응기로부터 세포 물질이 씻겨져 나가는 것을 방지하기 위함이다). 세포, 세포 생성물, 부산물을 포함하는 배양물 유체도 동일한 속도로 제거된다. 이와 같은 관주 시스템은 포유류 세포 배양에는 상업적으로 이용되지 않는다.

3. 비-관주 부착 시스템

전통적으로, 고정-의존성 세포 배양물은 작은 유리 또는 플라스틱 용기의 바닥에서 증식된다. 실험실 규모에서 이용하기에 적합한 고유 전통적인 기술에 의해 제공되는 표면-용적 비율이 제한되는 경우에 대규모에서 세포 및 세포 생성물을 생산하는 경우에는 병목현상이 일어난다. 작은 배양 용적에 세포 생장을 위한 접근가능한 표면적을 많이 제공하는 세스템을 제공하기 위해서, 상당히 많은 기술에 제시되었다; 회전 병 시스템(roller bottle system); 스택 플레이트 증식기(stack plates propagator); 나선형 필름 병(spiral film bottle); 공동 섬유 시스템(hollow fiber system); 팩 베드(pack bed); 플레이트 교환 시스템(plate exchanger system); 막 튜브 릴(membrane tubing reeel). 이와 같은 시스템은 특징이 비-균질성이고, 다중 과정에 기초하기 때문에, 규모 상향에 제한을 받고, 샘플을 얻는데 어렵고, 스스템을 측정하고 조절하는데 제한되고; 배양물을 통하여 균질한 환경을 유지하는데 어려움이 있다.

이와 같은 시스템에서 가장 흔히 이용되는 것은 롤러 병이다. 큰 상이한 모양의 T- 플라스크이기 때문에, 이 시스템은 간단한 것이 매력이다. 하루에 수천개의 롤러 병을 조절하는데 전자동 로봇을 이용할 수 있어, 오염 위험을 없애고, 상당한 사람의 손이 필요한 불편한 요소가 제거된다. 빈번하게 배지를 교환하기 때문에, 롤러 병 배양물의 밀도는 0.5 ×10⁶cells/㎠정도가 된다(이는 10⁹cells/병 또는 10⁷cells/배양배지 ㎖에 상응하는 밀도).

4. 마이크로캐리어에서 배양

Van Wezel(1967)는 마이크로캐리어 배양 시스템의 개념을 개발하였다. 이와 같은 시스템에서, 서서히 교반하면서 생장 배지에서 현탁된 작은 고체 입자 표면에서 증식된다. 세포는 마이크로캐리어에 부착되고, 점진적으로 생장하여, 마이크로캐리어 표면에서 합류된다. 사실, 이와 같은 대규모 배양 시스템은 단일 디스크 과정에서 단위 과정으로 부착 의존성 배양물을 업그레이드하는데, 이때 단층 및 현탁 배지 모두 가져오게 된다. 따라서, 세포 생장에 필수적인 표면적이 복합되어, 균질 현탁배지의 장점을 가지고 생산이 증가된다.

대부분 다른 고정-의존성, 대규모 배양 방법보다 마이크로캐리어 배양의 장점은 몇 배가 된다. 우선, 마이크로캐리어 배양은 표면적에 대한 용적 비율이 높아(캐리어 농도를 변화시키면서 다양하게 함), 세포 밀도를 높이고, 상당히 농축된 세포 생성물을 얻을 가능성이 높다. 세포 생산량은 관주 반응기 방식에서 배양물이 증식되었을 경우에 최고 1-2 ×10⁷cells/㎖가 된다. 둘째, 작은 많은 저생산성 용기(가령, 플라스키 또는 접시)를 이용하는 대신에, 한 개 단위 공정 용기에서 세포를 증식시킨다. 이렇게 하면, 이용성이 더 좋고, 상당량의 배양 배지를 절약할 수 있다. 또한, 단일 반응기에서 증식시키면, 필요한 설비 공간이 줄고, 세포당 요구되는 취급 단계 수도 감소되고, 따라서, 노동 비용이 줄고, 오염 위험이 줄어든다.

셋째, 잘 혼합된 균질한 마이크로캐리어 현탁 배양은 환경 조건(가령, pH, pO₂, 배지 성분의 농도)을 모니터하고, 조절하는 것이 가능하여, 좀더 생산성 있는 세포 증식을 유도하고, 생산물 회수도 잘된다. 넷째, 현미경 관찰, 화학 테스트, 계산등을 위해 샘플을 취하는 것이 가능하다. 다섯째, 마이크로캐리어는 현탁액으로부터 용이하게 침전되기 때문에, 페드-베취 공정 또는 세포 수득 공정을 상대적으로 용이하게 할 수 있다. 여섯째, 마이크로캐리어에서 고정-의존성 배양 증식 방식으로 단백질 분해 효소, 세포의 공동 배쟝, 동물에 이식, 마개있는 병, 컬럼, 유동상 베드, 마이크로매리어를 유지시키기 위한 동공 섬유등을 이용하지 않고, 세포를 전달하는 등의 다른 세포 조작에 이 시스템을 이용하는 것이 가능하다. 일곱 번째, 현탁액에서 미생물 및 동물 세포를 배양하는데 이용되는 통상적인 장비를 이용하여 마이크로캐리어 배양물을 상대적으로 용이하게 규모 상향을 할 수 있다.

5. 포유류 세포의 소규모 포집화

포유류 세포를 배양하는데 특별하게 유용한 한 가지 방법은 소규모 포집화 방법이다. 포유류 세포를 반투성 하이드로겔 막 안에 유지시킨다. 다공성 막을 세포 주변에 형성하여, 영양소, 기체, 대사 생성물을 교환하고, 캡슐주변에는 다량의 배지를 제공한다. 부드럽고, 신속하고, 독성이 없는 몇 가지 방법이 개발되었는데, 생성된 막은 충분한 다공성을 가지고, 배양하는 동안에 생장하는 세포 물질을 유지하기에 충분한 강도를 가진다. 이와 같은 방법은 칼슘을 포함하는 용액과 방출이 접촉하여 형성된 가용성 알긴산에 기초한다. Lim(U.S. Patent 4,321,883)은 작은 구멍을 통하여 약 1% 알긴산나트륨 용액에 농축된 세포를 밀어내고, 방물을 형성시켜, 약 1% 염화칼슘 용액안에서 파괴하는 것에 대해 설명하고 있다. 방울은 표면 알긴산에 이온에 의해 결합된 폴라아미노산 충에 던져진다. 최종적으로, 방울은 킬레이트제로 처리하여, 칼슘 이온을 제거하여 알긴산을 다시 액화시킨다. 다른 방법은 칼슘 용액에 있는 세포를 알긴산 용액에 떨어지도록 하여, 공동 알긴산 구를 만든다. 유사한 방식으로 키토산 용액에 있는 세포를 알긴산염에 떨어뜨려, 동공 구를 만든다.

미소구포집된 세포는 직경이 150-1500㎜인 비드를 가지는 교반되는 탱크 반응기에서 용이하게 증식되고, 미세한 메쉬 스크린을 이용하여 관주 반응기에 용이하게 유지시킨다. 캡슐 용적에 대한 전체 배지 용적 비율은 1:2 내지 1:10로 유지시킨다. 캡슐내 세포 밀도는 최고 10⁸가 되고, 배양물에서 효과적인 세포 밀도는 1-5 ×10⁷이다.

다른 과정에 비해 미소구포딥화 방법의 장점은 살포 및 교반으로 인하여 발생할 수 있는 유해한 전단 효과로부터 보호할 수 있고, 관주된 시스템에서 이용하 목적으로 비드를 용이하게 유지할 수 있고, 규모 상향도 상대적으로 간단하고, 이식을 위해 비드를 이용할 수 있다.

6. 관주된 부착 시스템

관주는 세포 집단을 통하여 일정한 속도로 지속적인 흐름을 제공하는 것을 말한다. 이는 세포를 배양 단위에 유지시키는 것을 의미하는 것으로 배지를 빼내고, 세포를 씻겨내는 연속-유동 배양과는 상반되는 것이다(chemostat). 관주 개념은 이십세기 시작시에 소개된 것으로 이미 공지의 것이고, 현미경 관찰을 위해 보는 조직의 작은 조각을 유지하는데에도 이용된다. 이 기술의 in vivo에서 세포 환경을 모방하기 위해 시작된 것으로, 이때 세포 환경이란, 세포에 혈액 임파, 또는 다른 체액이 지속적으로 공급되는 것을 말한다. 관주없이, 배양물에서 세포는 공급되고, 죽어가는 또 다른 과정을 거치게 되어, 이들이 생장하고 대사적으로 능력을 발휘하는데 제한을 받는다. 현재 이용되는 관주 배양은 세포를 최대 밀도 0.1-5 ×10⁸cells/㎖로 생장시킨다. 2-4 ×10⁶cells/㎖(또는 2 ×10⁵cells/㎠)이상으로 밀도를 증가시키기 위해서는 배지는 새롭게 공급되는 배지로 지속적으로 교환하여, 영양소 결핍을 보충시키고, 독성 생성물을 제거한다. 관주로 배양 환경(pH, pO₂, 영양소 수준)을 더 잘 조절할 수 있고, 세포 흡착을 위해 배양물내에 표면적을 이용할 수 있는 것이 증가된다는 것을 의미한다.

마이크로캐리어 및 미소구포집 배양이 관주 배양기에 이용되나, 이 배양 방법은 10⁸cells/㎖이상으로 세포 밀도를 증가시키고자 하는 요구에 부응하지 못한다. 이와 같은 밀도는 배지에서 높은 생산물 역가(하류 과정을 이용), 더 작은 배양 시스템(설비 요구가 줄어듬), 더 나은 배지 이용성(혈청 및 다른 고비용 첨가제를 절약)등의 장점을 제공한다. 높은 밀도의 세포를 지원하기 위해서는 비균질성이 발생되지 않도록 관주 기술을 요한다.

본 발명의 세포는 선택된 배양 방법에 관계없이, 단백질을 생산하는데 이용될 수 있고, in vitro 세포 검사를 위한 세포로 이용되고, 의약 개발 과정의 일부분으로 스크린에 이용된다.

J. 키트

본 발명의 다양한 측면에서 요구되는 모든 필수 물질 및 시약을 키트에서 제공할 수 있다. 키트의 성분이 한 가지 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우에, 액체 용액은 수용액이 적절하고, 특히 멸균 수용액이 적합하다.

in vivo에 이용하기 위해서는, 본 조성물은 단일 또는 별도의 제약학적 수용 가능한 주사가능한 조성물로 조제될 수 있다. 이와 같은 경우에, 용기는 흡입제, 주사기, 피펫, 안약, 또는 신체의 감염된 부위 가령, 폐에 또는 동물의 감염된 부위로 주사할 수 있도록 조제물을 제공할 수 있는 임의 장치가 되거나 다른 키트의 성분과 혼합하여 제공될 수 있다.

키트의 성분은 건조된 또는 냉동건조된 형으로 제공된다. 시약 또는 성분이 건조된 형으로 제공되는 경우에는, 적절한 용매를 첨가하여 재구성한다. 일반적으로 용매는 또 다른 용기에 제공된다. 본 발명의 키트는 유전자 치료법 또는 화학요법제를 투여하기 위한 지시서를 포함한다.

본 발명의 키트는 시판하기 위해 바이알을 포함하는 수단이 포함되는데, 가령, 주사 또는 송풍-주형된 플라스틱 용기에 원하는 바이알을 보관한다. 용기의 수와 형태에 상관없이, 본 발명의 키트는 동물의 신체로 최종 복합 조성물을 주사 또는, 정치시키기 위한 보조 기구로 구성되거나 이를 포함한다. 이와 같은 기구에는 흡입기, 주사기, 피펫, 핀셋, 계량 스푼, 안약, 또는 임의 의학적으로 인정되는 운반 수단등이 된다. 또한, 키트 성분을 이용하기 위한 지시도 포함된다.

다음의 실시예는 본 발명의 구체예를 설명하는 것이다. 당업자는 본 발명을 잘 실행하기 위해 개발된 기술이 포함되어, 이는 본 발명을 실행하기 위한 적절한 방식이라는 것을 인지할 것이다. 그러나, 당업자는 여기에서 설명하는 특정 구체예에서 많은 변화가 있을 수 있고, 이와 같은 변화가 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 유사한 결과를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.

실시예 1

RB Protein의 변형

A. N-말단이 절두된 pRB 단백질을 발현시키는 RB cDNAs 작제

다양하게 N-말단이 결손된 변형된 RB cDNAs를 작제하기 위해, 일련의 PCR^TM프라이머를 고안하고, RB cDNA 서열에 따라 합성하였다. 센스 프라이머는 결손된 N-말단 서열의 하류 RB cDNA에 의해 결정된다. 모든 프라이머에는 5' 말단에 HindIII 제한 효소 위치(밑줄)를 포함하고, 콘센서스 Kozak cassette(GCCGCC)에 이어서 ATG(이탈리체)가 이어진다. 센스 프라이머의 완전한 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다;

항-안티센스 프라이머 5'-GTCCAAGAGAATTCATAAAAGG-3'(OMRbAS300; 서열:13)는 RB cDNA의 뉴클레오티드 +900dptj EcoRI 부위(밑줄)와 겹쳐진다(ATG 프레임의 처음 A를 +1을 한다). 항-안티센스 프라이머는 상기에서 설명하는 각 센스 프라이머와 쌍을 이루고, 주형으로 플라스미드 F7(전체 길이의 RB cDNA를 포함하는)를 이용하여 다양하게 변형된 5'-RB cDNA 단편을 증폭시킨다.

각 프라이머 쌍으로 PCR^TM을 이용하여 증폭시킨 후에, DNA 단편은 HindIII 및 EcoRI으로 절단하고, 동일한 효소로 미리 처리한 플라스미드 pCMVRB¹¹⁰에 서브클론시킨다. N-말단 부분이 결손된 변형 RB cDNAs를 가지는 생성된 발현 플라스미드는 다음과 같이 명명하였다(N-말단 부분의 결손된 부분과 이에 해당되는 플라스미드 이름으로 나타낸다);

아미노산 2-34(서열 28(핵산서열) 및 서열 29(아미노산 서열)) 결손- pCMVRBd_2-34(야생형 RB 단백질의 아미노산 2 내지 34가 결손);

아미노산 2-55(서열 30(핵산서열) 및 서열 31(아미노산서열)) 결손- pCMVRBd_2-55(야생형 RB 단백질의 아미노산 2 내지 55가 결손);

아미노산 2-78(서열 32(핵산서열) 및 서열 33(아미노산서열)) 결손- pCMVRBd_2-78(야생형 RB 단백질의 아미노산 2 내지 78이 결손);

아미노산 2-97(서열34(핵산서열) 및 서열35(아미노산서열))결손-pCMVRBd_2-97(야생형 RB 단백질의 아미노산 2 내지 97이 결손);

아미노산 1-147(서열36(핵산서열) 및 서열37(아미노산서열)) 결손- pCMVRBd_1-147(야생형 RB 단백질의 아미노산 1 내지 147이 결손; 아미노산 148은 메티오닌이다).

B. 내부 결손 또는 돌연변이를 가지는 RB cDNAs의 작제

다양한 내부 결손 또는 돌연변이를 가지는 RB cDNAs를 가지는 총 7개 pRB 발현 플라스미드를 작제하였다; pCMVRBd_31-107(야생형 RB 단백질의 아미노산 31 내지 107이 결손); pCMVRBd_77-107(야생형 RB 단백질의 아미노산 77 내지 107이 결손); pCMVRBm_111/112(야생형 RB 단백질의 아미노산 111이 아스파르트산에서 글리신으로 돌연변이, 아미노산 112가 글루타민산에서 아스파르트산으로 돌연변이); pCMVRBd_111-181(야생형 RB 단백질의 아미노산 111 내지 181이 결손); pCMVRBd_111-241(야생형 RB 단백질의 아미노산 111 내지 241이 결손); pCMVRBd_181-241(야생형 RB 단백질의 아미노산 181 내지 241이 결손); pCMVRBd_242-300(야생형 RB 단백질의 아미노산 242 내지 300이 결손).

pCMVRBd_31-107을 작제하기 위해서, 뉴클레오티드 +325 내지 +910의 RB cDNA을 플라스미드 F7로부터 PCR^TM을 이용하여 증폭시키는데, 이때 이용된 프라이머는 5'-GCGCCTGAGGACCTAGATGAGATGTCGTTC-3'(서열 19), OMRbAS300(서열 13)가 된다. 이와 같은 RB cDNA는 Bsu36I 및 EcoRI(OMRbAS300)으로 절단하고, 동일한 효소로 처리된 플라스미드 pCMVRB¹¹⁰에 삽입하여 뉴클레오티드 +91 내지 +900의 고유 RB cDNA 단편을 대체한다. pRB△31-107의 핵산 서열은 서열 38이 되고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열 39이다.

pCMVRBd_77-107를 작제하기 위해서는, RB cDNA 단편(뉴클레오티드 +328 내지 +910)를 플라스미드 F7로부터 PCR^TM을 이용하여 증폭시키는데, 올리고뉴클레오티드 5'-GCGGTTAACCCTAGATGAGATGTCGTTCACT-3'(서열 20) 및 OMRbAS300(서열13)을 이용하고, 이어서, HpaI(밑줄) 및 EcoRI을 이용하여 처리한다. 증폭되고, 절단된 단편은 동일한 효소로 처리된 플라스미드 pCMVRB¹¹⁰에 삽입하여, 뉴클레오티드 +230 내지 +900의 RB cDNA 단편에 대체한다. pRB△77-107의 뉴클레오티드 서열은 서열 40이고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열 41이다.

pCMVRBm_111/112를 작제하기 위해, 두 쌍의 프라이머를 이용하여, 뉴클레오티드 A(야생형 RB cDNA의 +332위치)를 G로 교환하여, 아스파르트산의 코돈(GAT)을 글리신(GGT)으로 바꾸어, 새로운 제한 효소 위치 AvrII를 만들고, 뉴클레오티드 G(RB cDNA의 +336위치)를 T로 바꾸어, 글루타민산의 코돈(GAG)을 아스파르트산의 코돈(GAT)으로 바꾼다. 첫 번째 쌍 프라이머는 5'-CCCAAGCTTGCCGTCATGCCGCCCAAAACCCCCCGA-3'(OMRBS1; 서열21) 및 5'-CTCACCTAGGTCAACTGCTGCAAT-3' (OMRbAS332; 서열22; 돌연변이된 것은 굵게 표시함). 두 번째 쌍 프라이머는 5'-GTTGACCTAGGTGATATGTCGTTC-3'(OMRbS332; 서열:23; 돌연변이된 염기는 굵게 표시) 및 OMRbAS300(서열13)이다. PCR^TM생성물은 OMRBS1로 증폭시키고, OMRbAS332는 Hind Ⅲ 및 AvrⅡ(밑줄)로 절단하고, OMRbS332와 함께 증폭된 것과 OMRbAS300는 AvrⅡ 및 EcoRI으로 절단한다. 이와 같은 단편은 함께 HindⅢ 및 EcoRI으로 처리된 플라스미드 pCMVRB¹¹⁰에 결찰시켜, 이에 상응하는 야생형 RB cDNA 서열에 대체한다. pRBm_111/112의 핵산 서열은 서열50이고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열51이다.

pCMVRBd_111-181를 작제하기 위해, RB cDNA 단편(+543 내지 +910)은 플라스미드 F7로부터 PCR^TM을 이용하여 증폭시키는데, 이때 올리고뉴클레오티드 5'-GCGCCTAGGATCTACTGAAATAAATTCTGCA-3'(서열24) 및 OMRbAS300(서열13)을 이용하고, AvrⅡ(밑줄) 및 EcoRI로 절단한다. 이 단편은 동일한 효소로 처리된 pCMVRBm_111/112에 결찰시켜, 뉴클레오티드 +331 내지 +900에 해당하는 RB cDNAdp 대체한다. pRB△111-181의 핵산 서열은 서열42이고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열43이다.

pCMVRBd_111-241를 작제하기 위해, 뉴클레오티드 +1 내지 +331을 포함하는 5' RB cDNA는 pCMVRBm₁₁₁를 HindⅢ 및 AvrⅡ로 절단하여 얻는다. 뉴클레오티드 +722에서 시작하는 3' RB cDNA을 동일한 플라스미드로부터 PvuⅡ 및 BamHI로 절단하여 수득한다. 그 다음 두 개 DNA 단편(인프레임)을 pCMV-G(HindⅢ 및 BamHI로 절단함)에 결찰시킨다. pRB△111-241의 핵산 서열은 서열44이고, 아미노산 서열은 서열45이다.

pCMVRBd_181-241를 작제하기 위해, 뉴클레오티드 +1 내지 +538를 포함하는 5'RB cDNA 단편은 플라스미드 F7로부터 PCR^TM을 이용하여 증폭시키는데, 이때 프라이머는 OMRBS1(서열21) 및 5'-CCCGATATCAACTGCTGGGTTGTGTCAAATA-3'(서열25)을 이용하고, 주형으로는 플라스미드 F7을 이용한다. 수득된 RB cDNA 단편은 HindⅢ 및 EcoRI (밑줄)으로 절단하고, pCMVRB¹¹⁰에 삽입하여, HindⅢ 및 PvuII사이에 있는 고유 5' RB cDNA 단편에 대체한다. pRB△181-241의 핵산 서열은 서열46이고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열47이다.

pCMVRBd_242-300를 작제하기 위해, 프라이머 OMRBS1(서열21) 및 5'-CCCGAATTCGTTTTATATGGTTCTTTGAGCAA-3'(서열26)를 이용하여, 뉴클레오티드 +1 내지 +722를 포함하는 5'RB cDNAdmf 증폭시키는데, 주형으로는 F7을 이용한다. 증폭된 생성물은 HindⅢ 및 EcoRI(밑줄)으로 절단하고, 동일한 효소로 처리된 pCMVRB¹¹⁰에 삽입하여, 뉴클레오티드 +1 내지 +900의 고유 5' RB cDNA 서열에 대체한다. pRB△242-300의 핵산 서열은 서열48이고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열49이다.

C. N-말단 변형된 RB 단백질의 특징

RB-결손된 방광 암종 세포 주 5637에 CMV 프로모터를 이용하여 구동되는 변형된 RB cDNAs를 가지는 발현 플라스미드를 트랜스펙트시킨다. 돌연변이 pRBs의 생물학적 기능은 면역세포화학적 착색 및 트랜스 펙션 후에 종양 세포의 [³H]-티미딘 in situ 라벨링등이 관련된 복합 기술을 이용하여 평가한다(Xu et al., 1994a; 1994b).

종양 세포는 테트라사이클린이 포함된 배지에 커브슬립에 접종하고, pRB⁹⁴, pRB¹¹⁰및 다른 돌연변이 RB 단백질을 발현시키는 플라스미드로 트랜스펙션시킨다. 배양 배지로부터 테트라사이클린을 제거한 후에, 배지는 10μCi[³H]-메틸 티미딘을 포함하는 새로운 배지 1㎖에 2시간동안, 37℃에서 배양시키고(Amersham, Arlington Heights, IL), 상기에서 설명하는 것과 같이 RB 단백질 발현을 위한 면역화학적으로 착색시킨다(Xu et al., 1991a; 1991b). 착색된 슬라이드는 실제 얇은 젤라틴 층으로 피복하고, 37℃에서 하룻밤동안 건조시킨다. 슬라이드는 그 다음 자가방사 방출(Type NTB2, Eastman Kodak, Rochester, NY)로 덮고, 2일간 노출시킨다. 발생 후에, 슬라이드는 광 현미경하에서 검사한다. 트랜스펙션후 24시간 뒤에, 세포는 RB 단백질의 면역학적인 착색 및 [³H]-티미딘 결합 검사를 위해 프로세싱한다.

그 결과는 표 5에 나타내었다. pRB의 N-말단이 최고 55개 아미노산 잔기가 결손되는 경우에, 전체 길이의 RB 단백질을 발현시키는 세포와 비교하였을 경우에, 돌연변이된 pRB 발현 플라스미드에 트랜스펙트된 세포에서 DNA 합성이 많이 감소되지는 않았다. 그러나, N-말단으로부터 또 다른 23개 아미노산이 제거되는 경우에는, 절두된 pRB의 발현에 의해 세포 DNA 합성이 상당히 억제되었다.

표 5에서 설명하는 것과 같이, 아미노산 55 내지 181사이에 임의 결손을 가지는 pRB 돌연변이체를 종양 세포로 도입하면 DNA 합성을 상당히 저해한다. 아미노산 181 내지 241만이 결손된 pRBs로 트랜스펙트된 세포는 아미노산 55 내지 181사이가 결손된 pRBs를 발현시크는 플라스미드에 트랜스펙트된 것과 비교하였을 때, DNA 합성을 저해하는 정도가 약하지만, 전체 길이의 pRB 발현 플라스미드에 트랜스펙트된 것보다는 효과가 크다. 따라서, 이와 같은 관점에서, 상기 특정 결손이 복합된 예를 들면, 아미노산 1 내지 241사이가 결손된 경우에는 유사한 DNA 합성 저해 활성을 나타내는 것으로 보인다.

따라서, 아미노산 2 내지 34 및 아미노산 76 내지 112가 각 결손된 두 개 결손을 가지는 두 개 pRB 돌연변이 또는 아미노산 2 내지 55와 아미노산 76 내지 112가 결손된 두 개 pRB 돌연변이는 야생형 pRB와 비교하였을 때 상당한 DNA 저해를 나타낸다. 결과에 따르면, 가상 N-말단 도메인의 경계는 아미노산 182 내지 300 가장 적절하게는 아미노산 182 내지 241가 된다는 것이다. 또한, 아미노산 111이 아스파르트산에서 글리신으로 전환된 점 돌연변이를 가지는 pRB는 상당히 DNA 합성을 저해하는데, 이는 이 부분이 pRB 기능을 조절하는데 중요하다는 것을 의미한다.

실시예 2

테트라사이클린-반응성 유전자 발현 시스템에서 VP16 트랜스활성 도메인의 발현을 조절하는 CMV 프로모터/인헨서의 변형

상기에서 설명하는 변형된 망막모세포종 유전자 및 단백질은 유전자 요법등을 포함하는 실제 다양한 용도를 가진다. 이에 대해, 발현 시스템이 필요하다. 상기에서 설명하는 것과 같은 시스템은 특정 구체예에 적합한 것이지만, 세포독성 구조를 이용한 유전자 치료법에서는 특정한 단점을 가진다. Gossen and Bujard (1992)의 고유 테트라사이클린-반응성 유전자 발현 시스템은 매우 흥미로운 시스템이나, 세포 생장에 억제 효과를 가지는 특정 단점이 있다(Gill and Ptashne, 1988). 이와 같은 단점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 테트라사이클린-반응성 유전자 발현 시스템을 개선하였다.

고유 테트라사이클린 억제물질/조절물질에 기초한 조절 시스템은 두 개 플라스미드 pUHD15-1 및 pUHC13-3(미국 특허 5,464,758; Gossen and Bujard 1992)로 구성된다. pUHC13-3는 하이브리드 최소 사람 CMV 프로모터를 포함하는 테트라사이클린(Tc; tet) 감응성 발현 벡터로써, tet 작동 서열은 TATA 박스의 상류에 삽입되어있다. pUHD15-1는 테트라사이클린 반응성 트랜스홀성물질(tTA)을 인코드하는 서열을 포함하고, 야생형 CMV 프로모터에 의해 발현이 된다. 이와 같은 시스템을 이용하여 일시적인 발현을 시키는 경우에, 발명자는 연구한 많은 종양 세포주에서 효과적으로 가역되는 트랜스진(transgene)이 발현된다는 것을 관찰하였다. 그러나, 테트라사이클린-반응성 방식으로 리포터 유전자를 발현시키는 긴 클론을 분리하는 시도는 성공을 하지 못하였다. 이는 tTA 트랜스활성물질이 세포내 상당 수준이 되었기 때문인데, 이의 발현은 pUHD15-1 플라스미드의 강한 CMV 프로모터/인헨서에 의해 구동된다. tTA 트랜스활성물질에는 VP-16 활성화 도메인이 포함되는데, 이는 세포 생장시에 억제 효과를 가진다는 것으로 알려져 있다(Gill and Ptashne, 1988).

따라서, 이 문제를 해결하고, 시스템을 개선시키기 위해서는, tTA 발현 카세트를 변형시키는데, 우선, pUHD15-1에 dLT는 강한 CMVp 프로모터(Boshart et al., 1985)를 19bp 불완전한 반복 서열 쌍(CMVp 인헨서의 일부, 서열5)로 대체한다. hCMV 프로모터/인헨서는 hCMV 프로모터의 5'서열의 일부를 제거하여 변형시킨다.

hCMV 프로머터의 공지 서열에 기초하여(Boshart et al., 1985), 세 가지 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 고안하였다. XhoI 및 EcoRI 제한효소 부위(밑줄)를 각 센스 및 안티-센스 올리고뉴클레오티드에 첨가한다. 센스 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다;

5'-CCGCTCGAGCAATGGGCGTGATAGCGG-3'(OMCMVs1; 서열6);

5'-CCGCTCGAGCACCAAAATCAACGGGA-3'(OMCMVs2; 서열7);

5'-CCGCTCGAGCAACTCCGCCCCATTGAC-3' (OMCMVs3; 서열8); 이들은 동일한 안티-센스 프라이머 5'-TAGACATATGAATTCGCGGCC-3'(OMCMVas; 서열9)를 공유한다.

PCR^TM증폭에 이용된 주형은 플라스미드 pUHD15-1이다. 프라이머 쌍 OMCMVs1 + OMCMVas; OMCMVs2 + OMCMVas ; OMCMVs3 + OMCMVas를 이용하여 PCR^TM증폭하면, 각각 길이가 282bp(즉 mhCMVp1), 203bp(mhCMVp2), 168bp(mhCMVp3)의 짧은 CMV 프로모터가 생성된다. 순수분리된 짧은 CMV 프로모터/인헨서 단편은 XhoI 및 EcoRI으로 이중 절단하고, pUHD15-1에 삽입하여 고유 hCMV 프로모터에 대체한다. 이로써 세 가지 신규한 tTA 발현 플라스미드 즉, CMV1-tTA, pmCMV2-tTA, pmCMV3-tTA가 생성된다.

이와 같은 프로모터의 상대적인 강도를 결정하기 위해, 이들 새로 작제된 플라스미드에서 tTA 및 pUHD15-1에서 tTA를 플라스미드 pRc/CMV-CAT(Invitrogen, San Diego, CA)의 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT) 유전자로 대체하여, 네가지 CAT 발현 플라스미드, pmCMV1-CAT, pmCMV2-CAT, pmCMV3-CAT, pCMV-CAT를 만든다. 이와 같은 플라스미드에서, CAT 발현은 mhCMVp1, mhCMVp2, mhCMVp3, 전체 길이 hCMVp에 의해 구동된다. 변형된 CMV 프로모터의 상대적인 활성을 평가하기 위해, CAT 발현 플라스미드를 이들 세가지 세포주, 종양 세포주 5637, Saos2, 배 신장 세포 주 293으로 Lipofectin 방법(Life Technologies, Gaithersburg, MD)을 통하여 주입한다. 트랜스펙션후 48시간 뒤에, 세포 용해물질을 얻고, CAT 활성은 Stratagene(Stratagene, La Jolla, CA)의 CAT FLASH 검사 키트로 측정한다.

도 1에서 볼 수 있는 것과 같이, 인헨서 서열을 부분적으로 제거한 후에, 프로모터의 활성이 세가지 트랜스펙트된 세포주 모두에서 급격히 감소되었다. 도 1은 5637 및 Saos-2 세포주에서 CAT 활성을 도면으로 나타낸 것이다. 인헨서 서열이 더 많이 결손될수록, 남아 있는 프로모터는 약해진다. 강한 프로모터부터 약한 프로모터 순서는 다음과 같다; hCMV, mhCMVp1, mhCMVp2 mhCMVp3. mhCMVp1의 활성은 전제 길이 hCMV 프로모터의 17.7%이고, mhCMVp3 활성은 5637세포에서 hCMV 프로모터의 3.3%에 불과하다(도 1). 변형된 프로모터의 상대적인 프로모터 활성을 비교한 후에, 테트라사이클린 조절가능한 유전자 발현 시스템을 변형시키기 위해 mhCMVp1(서열5)을 선택하였다. mhCMVp1는 숙주 세포 생장을 억누르지 않는 최적의 테트라사이클린-조절된 트랜스활성물질(tTA) 발현을 나타내는데, 세포 생장을 억누르지 않는 성질은 사람 유전자 치료에 이용가능성을 가지는 중요한 것이다(도 2).

실시예 3

단일 플라스미드, 테트라사이클린-조절된 벡터의 작제

단일 플라스미드 벡터 즉 EC1214A을 작제하였다. 이 플라스미드에는 1) 숙주 세포 생장에 tTA의 억제 효과를 제거하기 위한 변형된 테트라사이클린-반응성 트랜스활성물질(tTA) 발현 카세트; 2) 플라스미드 pUHC13-3로부터 tTA-의존성 프로모터; 3) 일반적인 인트론 서열; 4) 프로모터 및 인트론 하류에 다중 클로닝 부위; 5) G418 선택을 위한 neo^R발현 카세트를 포함한다. 이 시스템에서 발현은 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유사체에 의해 조절된다. "테트라사이클린 유사체"는 테트라사이클린과 밀접한 관계가 있는 여러 화합물중에 하나로 친화력(K_a)이 10⁶/M, 적절하게는 K_a이 10⁹/M, 가장 적절하게는 K_a가 10¹¹/M인 tet 억제물질에 결합하는 화합물을 의미한다. 예를 들면, 이와 같은 테트라사이클린 유사체에는 Hlavka and Boothe(1985), Mitschef(1978), Noyee Development Corporation (1969), Evans (1968) and Dowling (1955)에서 설명하는 것을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.

플라스미드 pMLSIS.CAT(Choi et al., 1991)는 아데노바이러스-주요 후기 부분의 5'-해독안된 리더의 일부분으로 구성된 일반적인 인트론 서열, 삼중부분의 처음 엑손의 일부분을 포함하고, 처음 간섭 서열 및 IgG 가변 부분에서 유도된 합성 접합 제공자/수용자 서열을 포함한다. pMLSIS.CAT의 인트론 서열에 인접한 서열로, EcoRI 및 XbaI 부위(밑줄)를 포함하는 한쌍의 올리고뉴클레오티드 5'-CTAGAATTCGCTGTCTGCG-3'(서열10) 및 5'-GCTCTAGATGCAGTTGGACCTGGGAG-3'(서열11)를 합성하였다. PCR^TM에 의해 증폭한 후에, 인트론 단편은 EcoRI 및 XbaI로 절단하고, 플라스미드 pUHD15-1에 상응하는 효소 부위에 도입한다.

결국, ClaI, HindⅢ, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI 클로닝 부위(플라스미드 pBluescriptSK에서 구함)를 포함하는 작은 DNA 단편을인트론 하류 새로운 플라스미드에 도입시켜, hCMV 프로모터, 일반적인 인트론, 다중 클로닝 부위, SV40 바이러스의 폴리아데닐화 부위를 포함하는 발현 벡터를 만든다. 중간 단계 벡터는 pCMV-G라고 하였다. pCMV-G의 SV40 폴리아데닐화부위 시그날은 HSV 티미딘 카이나제(TK) 유전자 폴리아데닐화 시그날 서열로 대체하여, 플라스미드를 만들었는데, 이는 pCMV*-G-TKpA라고 하였다.

플라스미드 pRc/CMV(Invitrogen, San Diego, CA)는 제한 효소 NruI 및 XbaI으로 이중 처리한다. XbaI 처리된 5' 오버행(overhang)은 DNA 중합효소의 Klenow 단편(Life Technologies, Gaithersburg, MD)으로 채우고, 절두형 말단 삽입체는 플라스미드 pmCMV1-tTA(실시예 2)에서 얻은 mhCMV1-tTA를 포함하는 DNA 단편에 결찰시킨다. 새로운 플라스미드는 pmCMV1-tTA.neo이라 한다.

마지막으로, tTA-의존성 프로모터를 포함하는 DNA 단편, 일반적인 인트론, TK 폴리아데닐화 시그날을 pCMV*-G-TKpA로부터 분리하고, 플라스미드 pmCMV1-tTA.neo의 BglⅡ에 삽입하여, EC1214A라는 벡터를 만드는데, 이 벡터는 tTA 발현 카세트 및 tTA-의존성 프로모터 및 선택 표식인 네오마이신 저항성 유전자를 포함한다.

실시예 4

단일 플라스미드 테트라사이클린 양성적으로 유도된(Tet-on) 벡터의 작제

고유 테트라사이클린 억제물질/작동물질기초한 tet-on 시스템은 두 개 플라스미드 pUHD17-1neo(또는 pUHD172-1neo) 및 pUHC13-3(Gossen et al., 1995)으로 구성된다. pUHC13-3는 하이브리드 최소 사람 CMV 프로모터를 포함하는 테트라사이클린 감응성 발현 벡터인데, tet 작동 서열을 TATA 박스의 상류에 삽입된다. pUHD17-1neo 또는 pUHD172-1neo은 역 테트라사이클린 반응성 트랜스활성물질(rtTA)을 인코드하는 서열을 포함하는데, 야생형 CMV 프로모터에 의해 발현이 구동된다. 이와 같은 시스템을 이용한 일시적인 실험에서, 연구되는 많은 종양 세포주에서 일시적으로 가역적인 트랜스진 발현이 관찰된다. 고유 테트라사이클린 세스템과 반대로, 테트라사이클린 또는 독시사이클린과 같은 테트라사이클린 유사체 존재하에 발현되는데, 이때 발현은 테트라사이클린 없는 경우에 중단된다. 그러나, rtTA 트랜스활성물질에는 VP-16 활성화 도메인을 포함하는데, 이 도메인은 세포 생장시에 억제 효과를 가지는 것으로 알려져 있다(Gill and Ptashne, 1988).

따라서, 이 문제를 해결하고, 시스템을 개선시키기 위해서는, rtTA 발현 카세트를 변형시키는데, pUHD17-1neo 또는 pUHD172-1neo에 있는 강한 CMVp 인헨스(Boshart et al., 1985)를 19bp 불완전한 반복 서열 한쌍(서열5)으로 데체한다. hCMV 프로모터/인헨서를 변형시키는 것은 hCMV 프로모터의 5' 인헨서 서열의 일부를 제거하면 된다(실시예 2). 새로운 rtTA 발현 플라스미드는 pmCMV1-rtTA라고 하였다.

pmCMV1-rtTA를 이용하여 단일 플라스미드 벡터 즉 EC1214B을 작제하였다. 이 플라스미드에는 1) 숙주 세포 생장에 rtTA의 억제 효과를 제거하기 위한 변형된 테트라사이클린-반응성 트랜스활성물질(rtTA) 발현 카세트; 2) 플라스미드 pUHC13-3로부터 rtTA-의존성 프로모터; 3) 일반적인 인트론 서열; 4) 프로모터 및 인트론 하류에 다중 클로닝 부위; 5) G418 선택을 위한 neo^R발현 카세트를 포함한다. 작제는 실시예 3에 대략적으로 설명하였다.

실시예 5

망막모세포종(RB) 및 p53 테트라사이클린-조절된 벡터의 작제

A. 유도성 pRB¹¹⁰발현 벡터의 작제

유도성 pRB¹¹⁰발현 벡터를 작제하기 위해, 전체 길이 RB¹¹⁰유전자 cDNA를 포함하는 플라스미드 F7(Takahashi et al., 1991) 또는 p4.95BT(Friend et al.,1987)를 제한효소 AcyI를 이용하여, 뉴클레오티드 -322에서 절단하고, ScaI를 이용하여, 뉴클레오티드 +3230를 절단한다(ATG 개시 코돈의 제 2 인프레임의 A를 뉴클레오티드 +19로 하였다). AcyI 절단에 의해 생성된 5' 오버행은 네가지 모든 dNTP가 존재하는 상태에서 대장균(E. coli) DNA 중합효소 I으로 처리하여, 절두형 단부를 만든다. BamHI 링커로 단편에 결찰시키고, 단편은 BamHI으로 처리하여, 과량의 링커를 제거하고, BamHI 말단을 형성한다(Maniatis et al., 1989; Ausubel et al., 1992). 생성된 RB cDNA 단편 3552bp을 EC1214A의 유일한 BamHI에 삽입하여, pCMV*-tTA-RB¹¹⁰를 만든다.

B. 유도성 pRB⁹⁴발현 벡터의 작제

AUG 코돈 주변의 주요 서열 GCC(^A _G)CCAUGG(서열27)은 고등 진핵세포에서 해독을 개시하는데 적합한 것으로 알려져 있다(Kozak 1991). 거의 모든 척추동물의 mRNAs가 개시 충실성을 가지지만, 중요한 조절 단백질을 인코드하는 많은 mRNAs는 효과적인 해독을 위해 고안된 것으로는 보이지 않는다는 것이다(Kozak 1991). RB cDNA 서열을 점검하면, 전체 길이의 pRB¹¹⁰및 N-말단이 절두된 pRB⁹⁴에서 AUG 개시 코돈은 고등 진핵세포에서 해독을 개시하는데 부적절하다는 것을 알았다. 예를 들면, -5위치(pRB⁹⁴cDNA의 ATG 시작 코돈의 A를 +1로 하였다) 뉴클레오티드에서 AUG 코돈이 프레임 밖에 있었고, pRB⁹⁴의 ATG 코돈의 리딩 서열은 상기의 콘센선스 개시물질과 비교하였을 때, 최적은 아니다. pRB⁹⁴cDNA을 효과적으로 해독할 수 있도록 개선시키기 위해, 부위-직접적인 돌연변이를 이용하여, 최적으로 해독 개시를 위해, RB⁹⁴의 ATG 코돈의 제 2 인프레임의 상류 DNA 서열을 최적화시킨다.

변형된 5'-RB⁹⁴cDNA 단편은 PCR^TM에 의해, 주형으로 전체 길이 RB¹¹⁰cDNA를 가지는 플라스미드 F7을 이용한다. PCR^TM반응에 이용되는 센스 프라이머(5'-CCCAAGCTTGCCGCCATGTCGTTCACTTTTAC-3'; 서열12)에는 HindⅢ 제한효소 부위 및 Kozak cassette(italics; Kozak, 1987)를 포함한다. 안티센스 프라이머 5'-GTCCAAGAGAATTCATAAAAGG-3'(OMRbAS300; 서열13)는 RB cDNAdml +900 뉴클레오티드에서 EcoRI 부위와 겹친다(제 1 인프레임 ATG의 A를 +1로 한다). PCR^TM생성물은 HindⅢ 및 EcoRI으로 절단하고, 그 다음 플라스미드 F7에서 분리한 EcoRI(위치 +900) 및 BamHI(위치 +3548)사이에 3'-RB cDNA단편을 포함하는 DNA 단편으로 결찰시킨다. 전체 RB⁹⁴cDNA 단편은 EC1214A의 HindⅢ 및 BamHI에 삽입하여, 유도성 pRB⁹⁴발현 플라스미드인 pCMV*-tTA-RB⁹⁴를 만든다.

C. 유도성 p53 발현 벡터의 작제

전체 길이 p55 유전자 cDNA을 포함하는 플라스미드 pC53-SN3(Baker et al., 1990)는 BamHI으로 절단하고, 전체 길이 p53 유전자를 포함하는 단편을 EC1214A의 유일한 부위인 BamHI 부위에 삽입하여, pCMV*-tTA-p53을 얻는다.

실시예 6

테트라사이클린 조절된 pRB110, pRB94, p53 발현을 위한 Long-Term 종양 세포 클론 준비

변형된 단일-플라스미드 테트라사이클린-반응성 포유류 발현 시스템을 이용하여, 다양한 안정된 종양 세포주를 얻는데, 이때, 야생형 또는 N-말단 절두된 망막모세포종 종양 억제물질(RB) 종양 억제물질 유전자 또는 p53 종양 억제물질 유전자의 발현은 감지가능한 정도의 누출없이 가역적으로 개시 또는 종료될 수 있다.

A. 세포 배양물

유방 암종 세포주, MDA-468(HTB132)는 ATCC에서 구하고, 10% FBS(Life Technologies, Gaithersburg, MD)가 보충된 Leibovitz L-15(Life Technologies, Gaithersburg, MD)에서 배양한다. 골암종 세포 주, Saos2는 15% FBS(Zhou et al., 1994b)가 보충된 배지 McCoy's 5A(Life Technologies, Gaithersburg, MD)에서 배양하였다. 방광 암종 세포 주, 5637(HTB9)는 ATCC에서 구하고, 10% FBS가 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다. 모든 세포 배양 배지에는 0.5% 페니실린/스트렙토마이신을 보충한다. Saos2 및 5367 세포는 5% CO₂배양기에서 37℃로 배양하고, MDA-468 세포는 CO₂없이 37℃에서 배양한다.

B. 안정된 트랜스펙션

종양 세포는 제조업자의 지시에 따라 Lipofectin 방법을 통하여(Life Technologies, Gaithersburg, MD), pRB¹¹⁰및 pRB⁹⁴발현 플라스미드인 pCMV*-tTA-RB¹¹⁰및 pCMV*-tTA-RB⁹⁴로 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션동안 그리고 다른 말이 없는한 연속하는 과정 동안에, 0.5㎍/㎖ 테트라사이클린(Sigma, St. Louis, MO)을 트랜스펙션 및 배양 배지에 첨가한다. 트랜스펙션 후 48시간 후에, G418(Life Technologies, Gaithersburg, MD.)을 배양 배지에 300㎍/ℓ농도로 첨가한다. 2-3주후에, 단일 콜로니는 클로닝 링으로 분리하였다. 각 분리된 콜로니에 대해 이중 배양물을 준비한다. 고유 클론은 0.5㎍/㎖ 테트라사이클린을 포함하는 배지에 유지시키고, 이중 클론은 테트라사이클린없이 배양한다. 후자는 특이적인 항-RB 항체인, RB-WL-1(Xu et al., 1989a)로 면역화학적으로 착색한다. 매취된 RB-양성 클론은 테트라사이클린 및 G418을 포함하는 배지에서 유지시키고, 추가 분석을 위해 유지시킨다.

C. 일시적인 트랜스펙션

종양 세포는 60㎜ 배양 접시 또는 커브슬립에 접종하는데, 그 다음날 약 40%가 합류된다. 24시간 후에, 적절한 양의 플라스미드 DNA는 제조업자의 지시에 따라 Opti-MEM(Life Technologies, Gaithersburg, MD) 배지에 있는 Lipofectin 시약과 혼합한다. 세포는 DNA-Lipofectin 복합체로 덮고, 37℃에서 하룻밤동안 CO₂배양기에서 배양한다. 그 다음 날, DNA-Lipofectin을 대체 하기 위해 새로 만든 배지를 첨가한다. 24 또는 48시간 후에, 세포는 면역착색을 위해 고정시키거나 또는 세포 용해물질을 준비하기 위해 용해시킨다.

D. RB단백질의 면역화학적 착색

전술한 것과 같이(Xu et al., 1989a), 면역세포화하 착색을 실시한다. RB 발현을 감지하기 위해, 커버슬립에 생장된 세포는 45%(vol/vol) 아세톤/10%(wt/vol) 포름알데히드/0.1M 인산완충액으로 5분간 고정시킨다. 인산완충염으로 6회 세척한 후에, 세포는 1% 비-지방 우유/1.5% 염소 혈청 또는 말혈청/인산완충염으로 실온에서 4시간동안 차단한다. RB-WL-1 항-RB 항체 또는 Canji's 단클론 항-RB 항체(QED, San Diego, CA)는 0.02% Triton X-100가 보충된 동일한 용액으로 희석하여 각 농도가 2㎍/㎖ 및 0.5㎍/㎖이 되도록 하고, 세포를 하룻밤동안 배양한다. 세척한 후에, 커버슬립은 기술적인 매뉴얼에 따라(Vector Laboratories, Burlingame, CA), 아비딘 바이오티닐화된 과산화효소 복합체(ABC) 방법으로 면역착색하는 과정을 거치게 된다.

E. pRB의 면역블랏팅

세포 용해물질은 전술한 것과 같이 준비한다(Xu et al., 1991a; 1991b). 간략하게 하면, 60㎜ 접시에서 배양된 세포를 0.6㎖ 냉각 완충액(100mM NaCl, 0.2% NP-40, 0.2% 데옥시콜레이트 나트륨, 0.1% SDS, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 50㎍/㎖ 아프로티닌, 1mM PMSF을 포함)으로 용해시킨다. 세포 용해물질은 21-가우지 바늘을 통하여 여러 차례 통과시켜, 원심분리에 의해 맑게 한다.

직접적인 웨스턴 면역블랏팅은 전술한 것과 같이 실시한다(Xu et al., 1991a; 1991b). Bradford 단백질 검사(BioRad, Richmond, CA)에 의해 결정된 것과 같이, 총 세포 단백질 60㎎은 8% SDS/폴리아크릴아미드에서 전기영동하고, 이모빌론 폴리비닐리덴 디플로라이드 막(PVDF)(Millipore, Bedford, MA)에 전기블랏팅한다.

트리스-완충된 염에서 4% 소 혈청 알부민/1% 정상 염소 혈청으로 차단시킨 후에, 막은 RB를 감지하기 위해 RB-WL-1 항체(최종 농도가 0.4㎍/㎖)와 하룻밤동안 배양한다. 블랏은 ProtoBlot Western 블랏 알칼리 포스포타제 시스템에 의해 프로브한다(Promega, Madison, WI).

F. 생장 곡선 측정

결정 바이올렛 착색 방법을 이용하여, 테트라사이클린 유무하에 세포 생장 변화를 측정한다(Gillies et al., 1986). 간략하게 설명하면, 세포는 24-웰 플레이트에 이중으로 접종한다. 한 개 세프 틀레이트에서, 세포는 0.5㎍/㎖ 테트라사이클린을 포함하는 배지에서 생장되고, 이중 플레이트에서, 동일 세포는 비-테트라사이클린 배지에서 배양하였다. 각 시간대에, 세포는 PBS에서 1% 글루타알데히드로 고정시키고, 0.5% 결정 바이올렛으로 착색한다. 원하는 시간대에 세포를 수득한 후에, Sorenson 용액(0.9% 삼구연산 나트륨염, 0.02N 클로린산, 45% 에탄올(vol/vol)을 포함)으로 세포를 배양하여, 착색된 세포로부터 결정 바이올렛 염료를 제거한다. 추출된 염료는 Sorenson 용액으로 적절하게 희석하고, λ₅₅₀에서 광학적 흡수도를 측정하였다. 시간에 대해 OD₅₅₀을 플롯팅하여 생장 곡선을 얻는다.

G. 연성 한천 검사

연성 한천 검사를 위해, 적절한 세포 수를 완전배지(15% FBS)에서 0.3% 아가로즈와 혼합한 다음, 35㎜ 배양 접기에서 0.7% 베이스 한천을 덮는다. 각 세포 클론에 이중 접시를 준비한다. 한 개 접시에 세포는 0.5㎍/㎖ 테트라사이클린을 포함하는 배지에서 배양하고, 다른 하나는 테트라사이클린이 포함되지 않는 배지에서 배양한다. 배지는 매 3일마다 교환하고, 3주후에 콜로니(>50 cells)를 헤아린다. 결과는 세포 클론당 세 개 접시 평균으로 계산한다.

H. Nude 생쥐에서 종양발생가능성 테스트

종양 발생 가능성 테스트는 기존에 설명한 것과 같다(Takahashi et al., 1991). 흉선이 없는 누드 생쥐 두 집단을 설정하여 테스트할 각 세포 클론을 얻는다. 한 개 집단 생쥐는 정규적으로 물을 제공하고, 다른 집단은 테트라사이클린 5㎎/㎖을 포함하는 물을 제공한다. 각 RB¹¹⁰- 또는 RB⁹⁴-재구성된 클론으로부터 총 5 ×10⁶세포를 인산완충염 0.2㎖을 이용하여, 누드 생쥐의 우측 옆구리에 주사한다. Saos2, 5637, MDA-468 세포를 포함하는 RB-음성 모 기준도 동일한 농도로 동일한 생쥐의 좌측 옆구리에 주사한다. 주사한 후 4주째에 종양을 헤아린다.

I. 시간에 따른 [³H]-티미딘 결합 연구

유도성 RB-재구성된 클론으로부터 세포는 테트라사이클린을 포함하는 배지로 멸균 커버슬립에서 생장시킨다. 특정 시간대에 배지로부터 테트라사이클린을 제거하고, 세포는 10μCi[³H]-메틸 티미딘을 포함하는 새로운 배지 1㎖로 37℃에서 2시간동안 배양한다음(Amersham, Arlington Heights, IL), 고정시키고, 전술한 것과 같이 RB 단백질 발현을 위해 면역화학적으로 착색시킨다(Xu et al., 1991a; 1991b). 착색된 슬라이드는 박층 젤라틴으로 피복하고, 37℃에서 하룻밤동안 건조한다. 슬라이드는 그 다음 자가방사 에멸젼(Type NTB2, Eastman Kodak, Rochester, NY)으로 덮고, 2일간 노출시킨다. 발생 후에, 광 현미경하에서 슬라이드를 검사한다.

J. 일시적으로 트랜스펙트된 세포 배양물에서 [³H]-티미딘 결합

종양 세포는 커버슬립에 접종시키고, pRB⁹⁴, pRB¹¹⁰또는 다른 돌연변이 RB 단백질을 발현시키는 플라스미드로 트랜스펙트시킨다. 트랜스펙션후 24시간에 세포는 RB단백질의 면역세포화학적 착색을 위한 처리를 하고, [³H]-티미딘 결합 검사는 Xu et al(1991b; 1991c)에서 설명한 것과 같이 실행한다.

K. Long-Term 유도성 RB 발현 클론의 특징

문헌에서 보고하고 있는 RB 치환후에 세포 생장 억제 및 형태학적 변화가 일치한다. 발명자 및 다른 연구자가 실행한 연구에 따르면, 정상적인 RB 유전자를 RB-결손 종양 세포에 치환시키면 누드 생쥐에서 종양발생능이 억제된다는 것이다(Goodrich and Lee 1993, Bookstein et al., 1990a; 1990b; Chen et al., 1992; Goodrich et al., 1992b; Huang et al., 1988; Kratzke et al., 1993; Madreperla et al., 1991; Muncaster et al., 1992; Ookawa et al., 1993; Sumegi et al., 1990; Takahashi et al., 1991; Wang et al., 1993; Xu et al., 1996; Xu et al., 1991c; Zhou et al., 1994b; Xu, 1996; Xu, 1995; Li et al., 1996; Xu et al., 1994b). 연구한 종양 세포주는 망막모세포종, 골수암종, 방광 암종, 전립선, 유방 및 폐 암종과 같은 사람의 다양한 별개 암에서 유도한 것이다(Goodrich and Lee, 1993; Xu, 1996; Xu, 1995 for review). 여러 가지 유전자 변경을 가지는 종양 세포에서 RB 유전자 결손을 교정하면 이들의 악성 표현형이 복귀되고, 이는 처음 나타난 것보다 더 이해가 안되는 것이다(Klein, 1990).

초기 몇 가지 연구에서 볼 수 있었던 것과 같이, pRB-발현 플라스미드로 트랜스펙션후에, 배양물에서 일부 RB-결손 종양 세포는 세포가 커지고, 노화와 비슷한 표현형, 생장 중단등을 포함하는 큰 변화를 나타내었다(Templeton et al., 1991; Qin et al., 1992). 연속하여, RB-재구성된 종양 세포의 장 시간 안정된 클론을 분리하였는데, 모세포주와 ??은 빠른 생장을 한다는 것을 알았다. 따라서, 종양 억제 기능으로부터 RB-결손 종양 세포에서 RB 치환에 의해 세포 생장 저해를 분리한다는 경향이 있다(Chen et al., 1992; Goodrich et al., 1992b; Takahashi et al., 1991; Xu et al., 1991b; Zhou et al., 1994b; Li et al., 1996).

RB-결손 종양 세포주를 이용하여 장 시간 유도성 RB 발현 클론을 분리하였다. 이는 골수암종 세포 주, Saos2; 방광 암 세포주, 5637 및 유방암 세포주, MDA-468이다. 수용 세포로 Saos2, 5637, MDA-468를 선택한 이유는 이들이 RB-치환 연구에서 이용되는 대부분의 RB-결손 종양 세포라는 것이다. 종양 세포는 테트라사이클린 존재하에 RB¹¹⁰발현 플라스미드인 pCMV*-tTA-RB¹¹⁰; pRB⁹⁴발현 플라스미드인 pCMV*-tTA-RB⁹⁴으로 트랜스펙션시킨다. 약 2 내지 4주후에 400㎍/㎖ G418으로 선택한 후에, 잘 분리된 단일 콜로니를 분리하고, 테트라사이클린을 포함하는 배지에서 유지시킨다. 분리된 클론 일부분은 별로로 테트라사이클린(Tc) 없이, 24 내지 48시간동안 배양하고, 항-RB 항체 RB-WL-1로 착색한다. Tc-반응성 RB-재구성된 5637 방광암종 및 MDA-MB-468 유방 암종 세포주의 안정된 클론에서 pRB 단백질 발현이 엄중하게 조절되는 것을 볼 수 있다.

배양물에 0.5㎍/㎖ Tc 존재하에 생장된 RB-재구성된 5637 세포는 면역세포화학착색에서 RB^-이었고, Tc를 제거한 후에, RB-재구성된 5637 세포에서 pRB 발현이 개시되었는데, 면역세포화학착색에 의하면, RB⁺로 나타났다. MDA-MB-468 유방 암종 종양 세포는 배양 배지에 0.5㎍/㎖ Tc 존재하에, 면역화학착색하면, RB^-로 나타나고, 반면에 Tc를 제거한 후에, RB-재구성된 MDA-MB-468 유방 암종 세포주에서는 pRB 발현이 재개되었는데, 면역화학착색에 의하면, RB⁺로 나타났다. 테트라사이클린-반응성 발현 시스템에서, 테트라사이클린은 유도물질이라기 보다는 저해물질이 된다.

RB 발현을 차단시키는데 필요한 테트라사이클린의 최저 농도를 조사하였다. 0.1 ㎍/㎖ 정도의 낮은 테트라사이클린도 RB 발현을 저해하여, 면역화학착색에 의해 거의 감지되지 못하도록 하고, 이는 테트라사이클린-조절된 발현 시스템이 테트라사이클린에 매우 감응성이 크다는 것을 의미한다.

또한, 기존에 보고된 조절불가능한, 장시간 RB-재구성된 종양 세포주와는 달리, 검사된 모든 장시간 종양 세포주는 pRB 발현이 Tc-없는 배지에서 개시된 후에, 비가역적으로 생장이 중단되었다는 것이다(도 3A, 3B, 3C). 문헌에서 공지된 바에 따르면, 정상 세포 및 종양 세포에서 pRB의 반감기는 단지 4 내지 6시간 정도라는 것이다(Mihara et al., 1989; Xu et al., 1994b; Xu et al., 1989a). 그리고 도 2에서 설명된 것과 같이, 변형된 테트라사이클린-조절가능한 시스템을 이용하면, 낮은 Tc 농도 존재하에 또는 없이 tTA 트랜스활성물질의 발현이 세포 생장에 효과가 없다는 것이다.

Saos2 및 5637 클론은 DNA 합성을 하지 못하였고, 눈에 띄는 형태학적 변화가 있었고, 최종적으로 세포가 죽었다. 세포의 형태학적 변화는 pRB 발현이 Tc-없는 배지에서 유도된 후에 급격하게 변화되었는데, 세포 확대, 평편해짐, 사이클링 G1/S 세포보다 핵세포질 비율이 낮다는 것등이 포함된다. 방광 암종 세포주, 5637의 경우에, 조절불가능한 시스템으로 일시적인 또는 안정한 RB-치환후에 형태학적 그리고 생장속도의 변화에 대해서는 문헌에서 잘 나타나 있지 않다(Goodrich et al., 1992b; Takahashi et al., 1991; Zhou et al., 1994b).

일반적으로, Tc-없는 배지에서 정립된 Tc-조절가능한 RB⁺종양 세포주의 표현형은 RB 플라스미드-트랜스펙트된(또는 RB 레트로바이러스-감염된) 종양 세포 배양물에 대해 정립된 것과 유사하다(Huang et al., 1988; Templeton et al., 1991; Qin et al., 1992). pRB 발현에 대한 허용 조건하에 모든 종양 세포 클론은 연성 한천에서 콜로니를 형성할 수 없고(도 4A, 4B, 4C), 누드 생쥐에서는 종양형성능이 없다.

또 다른 통상의 종양 억제 유전자, p53 와 RB를 비교하기 위해, Tc-조절가능한 야생형 p53 발현을 하는 몇 가지 장시간 안정한 종양 세포 클론을 골수암종 세포주 Saos-2로부터 정립되었다. 상기에서 설명한 것과 유사한 방식을 이용하여, p53-재구성된 Saos-2 종양 세포 클론을 정립하였다. 간략하게 설명하면, 모 Saos-2 종양 세포는 야생형 p53-발현 플라스미드인 pCMV*-tTA-p53(실시예 5)로 트랜스펙트시키고, 제네티신을 포함하는 배지에서 선택될 수 있다. 초기 G418-저항성 배양물은 적어도 2 라운드 서브클로닝을 시켜, 안정한 야생형 p53-재구성 클론을 얻는다. p53 유전자가 완전하게 결손되었기 때문에, 모 Saos-2 세포는 내생 p53을 가지지 않는다.

이와 같은 모델 시스템에서, p53-재구성된 Saos-2 클론에서, 야생형 p53 발현을 유도하면, RB^-/p53^null종양 세포의 생장을 중지시키지는 않았다. Tc-조절된 p53-재구성된 Saos-2 클론은 Tc가 없이 생장되었을 경우에, 많은 종양 세포가 줄어들고, 떨어진다. 또한, DNA 단편화 검사에서 측정된 바와 같이, p55-발현 허용 조건하에, p53-재구성된 Saos-2 종양 세포로부터 추출된 샘플에서만 분자량이 낮은 DNA가 풍부하다. 이와 같은 관찰에 따르면, RB^-/p53^nullSaos-2 종양 세포의 야생형 p55-유도된 생장 중단은 증식성 노화라기 보다는 아포프토시스 세포 죽음으로 인한 결과이다.

Dimri et al.이 최근에 배양물에서 사람 세포의 노화 및 in vivo에서 피부 노화를 확인하는 생체 표식에 대해 보고하였다. 몇 가지 사람 노화 세포는 pH6에서 조직화학적으로 감지할 수 있는 β-갈락토시다제를 발현하는 것으로 나타났다(Dimri et al., 1995). 노환-관련된 β-갈락토시다제(SA-β-gal)는 노화전 섬유아세포가 아닌 노화에 의해 발현된다. SA-β-gal은 불멸 세포에는 없고, 불명로 역전되는 유전적 조작에 의해 유도되는 것이다(Dimri et al., 1995). 이와 같은 일부 흑색종세포는 노화 또는 나이와는 무관하게 SA-β-gal (pH 6 활성)을 발현한다. 따라서, SA-β-gal은 놀라운 사실은 아니지만, 증식성 노화의 보편적인 표식은 아니다.

그럼에도 불구하고, 테트라사이클린 조절가능한 pRB 또는 p53 발현을 하는 장시간 종양 세포 클론을 이용하여, SA-β-gal(pH 6 활성)은 간단한 검사를 제공하여, RB-중개된 종양 세포 생장 중단의 특징을 조사한다. 어린(초기 계대) 사람 WI-38 섬유아세포의 대부분(>99.9%)은 SA-β-gal 음성이다. 대조적으로, 노화(52이상의 배가되는 수준의 집단에서) WI-38 세포는 강한 SA-β-gal 양성이다. 검사된 모든 테트라사이클린-반응성 종양 세포는 테트라사이클린(RB^-) 존재하에 SA-β-gal 음성이고, 테트라사이클린이 없는 배지(RB⁺)에서는 SA-β-gal 양성이었다. RB⁺상태에서 종양세포의 SA-β-gal 착색 강도는 종양세포 타입에 따라 다양하다.

비-유도성(Chen et al., 1990; Li et al., 1996) 또는 유도성 시스템으로 Saos-2(RB^-, p53^null) 종양 세포에서 p53 재구성이 이들의 신조직표현형을 억제하고, 테트라사이클린-조절가능한 프로모터를 가지는 p53 재구성된 Saos-2 클론은 테트라사이클린 유무에 관계없이 SA-β-gal 음성이라는 것이다. 흥미로운 것은, p53-재구성된 Saos-2 세포에 테트라사이클린 없는 배지에서 야생형 pRB¹¹⁰을 발현시키는 재조합 아데노바이러스 벡터로 감염시켰다. 야생형 p53 및 pRB¹¹⁰발현하는 종양 세포는 pRB¹¹⁰만을 발현시키는 종양 세포와 비교하였을 때, SA-β-gal 양성 착색이 더 강하게 나타났다. 이 결과는 pRB 및 p53에 의한 종양 억제 기작이 서로 다르지만, pRB 및 p53이 함께 발현되면 RB-중개된 종양 세포 노화에 공조효과를 가진다는 것을 의미한다.

이의 치료요법적으로 이용가능성을 고려하면, 또 다른 중요한 발견은 pRB-주액된 증식성 노화(비가역적으로 생장을 중단)가 종양 특이적이라는 것이다. 초기 계대 단계에서 어린 WI-38 섬유아세포에 재조합 아데노바이러스 벡터 AdCMVpRB110로 감염시키는데, MOI는 100으로, SA-β-gal 음성이 유지되도록 하고, 감염후 1주일정도에는 정상적인 생장 패턴을 가진다. 따라서, 항암 유전자 요법에서는 pRB가 상대적으로 안전한 물질이하는 것이다. 진행된 악성종양의 치료에 추가하여, RB 유전자 치료의 출현은 외과술 후에 잔류 종양, 피상적인 암, 악성종양 전단계 뿐만 아니라 비-악성, 과증식성 질환을 치료하는데 유익할 것이다(Chang et al., 1995; Xu et al., 1996).

L. RB-중개된 종양 억제의 광범위한 생물학적 기초

종양-세포 특이적인 노화 및 공지의 항-증식 효과에 추가하여, pRB는 맥관형성을 저해하는데, 그리고 종양세포의 면역원성을 밝히는데 중요한 역할을 한다. 발명자는 테트라사이클린-반응성, RB- 재구성된 골수암종 및 비-소세포 폐 암종 세포주에서 수득한 무혈청 조건화 배지(CM)는 세포 배양물에서 Tc를 제거하면, 맥관형성에서 항-맥관형성으로 전환된다는 것을 보여주었다. 이와 같은 전환은 Western Blotting 및 면역화학착색에 의해 측정하였을 경우에, pRB 발현 개시에 상응하는 것이다(Dawson et al., 1996). 발명자는 RB-결손 비-소세포 폐암종 세포주, H2009에서 IFN-γ에 의해 HLA II 유도하기 위해서는 야생형 RB 유전자 발현이 필요하다고 보고하였다(Lu et al., 1996). 클래스 II 단백질은 면역 반응의 일부로 CD4⁺T 임파세포에 단백질분해에 의해 처리된 항원으로부터 유도된 펩티드를 제공한다. 따라서, pRB는 종양 면역원성을 조절하는 역할을 한다.

망막모세포종(RB) 종양 억제물질 유전자의 치환으로 RB-결손된 종양 세포의 침투를 저해할 수 있는지를 결정하기 위해, Boyden 챔버 검사를 이용하여 연구하였다(Li et al., 1996). 이 연구는 방광, 유방, 폐의 암종 및 골수암종에서 유도된 것을 포함하는 안정안 RB-재구성된 사람 종양 세포주 집단에서 실시하였다. 구성 활성 프로모터 또는 유도성 프로모터에 의해 이와 같은 종양 세포주에서 외생 야생형 RB 단백질이 발현된다. RB-재구성된 RB⁺세포주에서 구한 종양 세포보다는 모 RB-결손된 세포주 및 RB^-복귀돌연변이체의 종양 세포가 Boyden 챔버 검사에서 마트리겔을 더 많이 침투한다는 것을 알았다(p < 0.001, two-tailed t-test). RB 치환에 의한 다양한 RB-결손 종양 세포의 침투성 저해는 in vivo에서 종양형성능이 억제되는 것과 관련이 있다. 대조적으로, 기능적으로 RB 또는 p53 발현으로 누드 생쥐의 RB^-/p53^null골수암종 세포주, Saos-2에서 종양 형성이 억제되었지만, 야생형 p55-db를 대체하여도 RB-유전자와 비교하였을 때, 이들의 침투성에 큰 충격은 주지 않았다.

정상적인 사람 배수체 세포는 제한된 횟수의 세포 분열후에 in vivo 및 in vitro에서 노화된다. 세포 노화로 알려진 이와 같은 공정은 사람 암 발생의 중요한 장벽 및 기본적인 노화의 원인이다. 변형된 테트라사이클린-조절된 유전자 발현 시스템을 통하여, 기능상으로 pRB를 다시 발현시키는 RB/p53-결손 종양 세포는 세포 사이클중 G0/G1 상에서 비가역적으로 생장을 중단시킨다는 것은 설명되었다. 이와 같은 세포는 세포 노화와 일치하는 다중 형태학적 변화를 나타내고, 노화-연합된 β-갈락토시다제 생체 표식을 발현한다.

추가 연구에 따르면, 신형성 세포의 상당한 증식성 생명 연장에 필수적??니 것으로 보이는 텔로메라제 활성이 pRB(p55이 아닌) 발현을 유도한 후에, 종양 세포주에서 억제되었다고 한다. 이와 같은 관찰은 pRB가 고유 세포 노화 프로그램에 중요한 역할을 한다는 것을 말해주는 것이다. 실제, 관점에서, RB(또는 RB, p53 함께)를 이용하여, 세포를 죽이는 유전자 요법으로 세포 노화 및 붕괴를 통하여 종양세포를 차등적으로 제거한다. 동시에, in vivo에서 정상 세포의 증식성 생명연장에는 영향을 받지 않는다. 이는 종양-특이적인 억제물질 유전자 요법 및 항-테로메라제 유전자 요법을 고안하는데 기본이 된다.

이와 같은 발견으로 RB- 중개된 종양 억제는 광역의 생물학적 기초를 가지고, 이는 좀더 효과적으로 사람의 암에 대한 RB 종양 억제물질 유전자 요법을 출현시킨다.

M. N-말단이 절두된 pRB에 의한 종양 억제의 강화

비-유도성 유전자 발현 시스템으로 RB-재구성된 종양 세포의 장-기간 안정된 클론을 분리하고, 대부분 이들 클론은 모세포주와 같이 신속하게 생장한다. 발명자는 RB-중개된 종양 억제가 실질적이고, 광범위한 생물학적 기초를 가지기는 하지만, 이것은 종종 불완전하여, RB-재구성된 종양 세포의 일부는 생존할 수 있고, 장시간 잠복기를 거친 후에, 누드 생쥐에서 RB⁺이종이식편 종양을 형성한다(Takahashi et al., 1991; Xu et al., 1991b; Zhou et al., 1994b; Li et al., 1996). 또 다른 연구자들에 의해서도 유사한 내용이 관찰되었다(Bookstein et al., 1990b; Goodrich et al., 1992b; Kratzke et al., 1993; Ookawa et al., 1993; Wang et al., 1993). 이와 같은 현상을 발명자들은 종양 억제물질 저항성(tumor suppressor resistance)(TSR; Zhou et al., 1994b)이라고 하는데, 이는 화학요법에서 다중 약물 저항성(MDR)과 등가의 것이다. 후자의 경우는 저약량의 화학요법은 세포독성 물질에 원래 저항성이 높기 때문에 전이성 종양 세포를 선택할 위험이 있다.

발명자들은 또한, N-말단이 절두된 RB 단백질 ∼94kDa(pRB⁹⁴)은 검사된 다양한 세포주에서 전체 길이 pRB 단백질과 비교하였을 때, 정상적인 내생 RB 유전자를 포함하는 상당히 강력한 세포 생장 억제를 나타내었다. pRB⁹⁴-발현 플라스미드로 트랜스펙트된 종양 세포는 세포 노화와 연관된 다중 형태학적 변화를 나타내었다. 이들은 S상으로 들러가지 못하였고, 빨리 죽었다(Xu et al., 1994b; Resnitzky and Reed, 1995).

최근에 발명자는 정규 장소 밖의 동물 모델에서, N-말단이 절두된 RB 단백질을 발현시키는 복제-결함 아데노바이러스 벡터인 AdCMVpRB94에 의해 누드 생쥐에서 사람 RB^-및 RB⁺방광 이형이식편 암을 치료하면, 치료된 종양이 퇴행하게 된다는 것을 설명하였다(Xu et al., 1996). 아데노바이러스 벡터에 의해 종양 세포에서 전체 길이 및 절두형 RB 단백질이 과다 발현되었을 경우에, pRB⁹⁴는 전체 길이 RB 단백질보다는 더 강력하였다. N-말단이 절두된 RB 단백질이 종양 억제를 강화시키는 기작에 대해서는 아직 분명하게 밝혀지지 않았다.

N-말단 절두된 pRB⁹⁴및 전체 길이 pRB¹¹⁰사이에 기능적인 차이를 잘 이해하기 위해, 발명자는 Tc-반응성 pRB⁹⁴발현을 하는 안정한 종양 세포주를 정립하였다. 시간에 따른 분석에 의하면, 세포 배양 배양물로부터 테트라사이클린을 제거하고 빠르면 6시간까지, pRB⁹⁴-재구성된 종양 세포는 포스포릴화중인 그리고 포스포릴화된 pRB⁹⁴를 최개로 축적하게 되고, 대부분의 종양 세포는³H-티미딘 결합을 하지 못한다(이는 생존 중단을 나타내는 지시물질이다). pRB⁹⁴단백질은 ∼18 내지 24 시간내에 완전하게 탈포스포릴화된다. 그러나, 대부분 pRB¹¹⁰-재구성된 종양 세포는 6 또는 8시간대에서 면역-조직화학적으로 RB^-로 남아있게 되고, 정상적인 DNA 합성을 가진다(도 5). 웨스턴 블랏팅에 의해 결정된 것과 같이, 24시간대에 pRB¹¹⁰는 최대 수준에 다다르고, 테트라사이클린을 제거한 후에 24 내지 48시간대에 대부분 탈포스포릴화되는데, 이 기간내에 pRB¹¹⁰-재구성된 종양 세포는 최종적으로는 DNA 합성이 중단된다(도5). 사람 노화 세포에 대한 SA-β-gal 생체 표식을 이용하면 pRB⁹⁴발현하는 Saos-2 세포는 Tc를 제거한 후 48시간대에 pRB¹¹⁰를 발현시키는 세포와 비교하였을 때, 좀더 강한 SA-β-gal 양성 착색을 나타낸다. pRB⁹⁴가 pRB¹¹⁰보다는 반감기가 더 길고, 활성을 가지는 포스포릴화가 적게된 형태로 남아 있는 경향이 있기 때문에(U.S. Patent 5,496,731; Xu et al., 1994b), 종양 세포에서 대부분 활성 형태(포스포릴화가 적게 된 형태)의 RB 단백질이 빠르게 축적되어, pRB⁹⁴에 의한 종양 세포 생장 억제를 강화하게 된다. 이에 대해, 또다른 절두형 pRB인 pRB⁵⁶은 아미노산 379에서 시작되는 것으로, 전체 길이 RB와 비교하였을 때 세포 사이클 진행과정의 강력한 저해물질이하는 것이다(Wills et al., 1995).

변형된 시스템의 장점은 3가지인데; (1) tTA 펩티드 발현이 낮기 때문에 유도성 유전자 발현을 하는 장 기간 안정한 세포 주를 정립하는데 적합하고; (2) 시스템이 단일 플라스미드내에 포함되어 있기 때문에, 단지 1회의 트랜스펙션 및 선택만 하면 되고; (3) 중요한 특징으로, 단일-플라스미드 테트라사이클린-반응성 포유류 유전자 발현 시스템은 테트라사이클린-조절된 바이러스성 벡터로 바로 전환할 수 있다는 것이다(하기 실시예 7-12).

실시예 7

테트라사이클린-조절된 아데노바이러스 벡터의 작제

원하는 유전자의 cDNA 단편을 단일-플라스미드 테트라사이클린-조절가능한 플라스미드 벡터, EC1214A(실시예 3) 또는 EC1214B(실시예 4)으로 우선 삽입한다. EC1214A 및 EC1214B 플라스미드 벡터에 상응하는 테트라사이클린-반응성 외부 유전자 발현 카세트 및 변형된 tTA(또는 rtTA) 발현 카세트를 DNA 조작에 대한 표준 방법을 이용하여 회수하고(Maniatis et al., 1989; Ausubel et al., 1992), tu틀 플라스미드, p△E1sp1A(Microbix Biosystems, Inc.)로 삽입한다. 생성된 재조합 tu틀 플라스미드를 우수한 아데노바이러스 타입 5(Ad5) 플라스미드, pBHG11(이는 아데노바이러스 Ad5D1309 게놈의 기본구조 및 E1/E3 결손 돌연변이(Microbix Biosystems, Inc.)를 포함함)와 함께 293 세포로 LIPOFECTIN 시약(GIBCO/BRL Life Technologies)을 이용하여 공동-트랜스펙트한다. 293 세포의 공동 트랜스펙션은 0.5㎍/㎖ 테트라사이클린 존재(tet-off 시스템) 또는 없이(tet-on 시스템)하에 실시한다.

또는, 원하는 유전자를 포함하는 단편을 단일 플라스미드 테트라사이클린-조절가능한 플라스미드 벡터, EC1214A 또는 EC1214B로 우선 십입한다. 테트라사이클린-반응성 외부 유전자 발현 카세트 및 변형된 tTA(또는 rtTA) 발현 카세트는 이에 상응하는 EC1214A 또는 EC1214B 플라스미드 벡터에서 회수하여, 각각 셔틀 플라스미드, p△E1sp1A 및 마스터 아데노바이러스 플라스미드 pBHG11로 십입한다. 생성된 재조합 셔틀 플라스미드 및 재조합 마스터 아데노바이러스 플라스미드를 293 세포로 공동 트랜스펙트시킨다.

재조합 셔틀 플라스미드 및 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 공동 트랜스펙션한 293세포는 in vivo 재조합에 의해 감염성 비리온을 생산하는데, 원하는 유전자를 발현시키는 소규오 유전자 카세트 및 변형된 tTA(또는 rtTA) 발현 카세트를 각각 Ad5d1309의 △E1 또는 △E1 및 △E3에 치환한다. 트랜스펙트된 293세포에서 재조합 아데노바이러스가 존재하는지는 세포병인 효과(CPE)를 이용하여 확인하였다. 세포 배양 상청액은 CPE가 발생하는 트랜스펙트된 293 세포에서 수득한다. 바이러스 상청액으로 감염시킨 후에, 293 세포 단층으로부터 아데노바이러스 플락을 스크린하고, 제한 효소 절단 지도 작성, PCR^TM에 의한 특징 조사, 또는 테트라사이클린-조절가능한 방식으로 바이러스-감염된 숙주 세포에서 원하는 유전자의 발현으로 재조합 바이러스를 분리할 수 있다. 워하는 외부 유전자 및 변형된 tTA(또는 rtTA) 발현 카세트를 포함하는 재조합 아데노바이러스는 적어도 3회 플럭 정제과정을 거친다.

Graham and Prevec,(1991)의 방법을 변형하여, 고역가 테트라사이클린-조절된 재조합 아데노바이러스 원액을 준비한다. CsCl 한외원심분리에 의해 정제되는 아데노바이러스에는 260㎚에서 OD를 측정하였을 때(1 OD₂₆₀는 1㎖당 1 ×10¹²를 포함한다), ㎖당 ∼10¹³바이러스 입자를 포함한다는 것을 알 수 있다. Sephadex G50을 통한 겔 여과에 의해 농축된 바이러스 현탁액에서 염을 제거하여, PBS에서 ㎖당 약 10¹¹플락 형성 단위(pfu)를 가지는 최종 정제된 바이러스 원액을 얻는다.

실시예 8

테트라사이클린-반응성 RB 아데노바이러스 벡터의 준비

N-말단 절두된 pRB⁹⁴(미국 특허 5,496,731)를 발현시키는 복제-결함 아데노바이러스 벡터를 사람 암 유전자 요법의 in vivo 동물 연구에 이용하였다(Xu et al., 1996). 불행하게도, AdCMVpRB94 바이러스 현탁액의 바이러스 입자에 대한 플락-형성 단위의 비율이 계대하면서 급격리 증가되어, 사람 암 유전자 요법의 임상적인 실험을 위한 AdCMVpRB94 바이러스의 고역가 원액을 대규모로 준비하는 것을 어렵게 한다. 이는 293 바이러스를 생산하는 세포주에서 pRB94 단백질의 세포 생장을 초억제하는 효과에 의한 것이다.

변형된 테트라사이클린-반응성 포유류 유전자 발현 시스템을 상기에서 설명한 것과 유사한 방법으로 이용하여, 테트라사이클린-조절된 pRB⁹⁴을 포함하는 아데노바이러스 벡터, AdVtTA.RB94를 만드는데, 이는 높은 약량의 pRB⁹⁴유전자 요법을 운반하기 위한 것이다. 전제 테트라사이클린 조절 카세트를 아데노바이러스 게놈의 E1 부분 또는 RB⁹⁴발현 카세트를 아데노바이러스 게놈의 E1 부분에 삽입하고, 전사 트랜스활성 융합 단백질 발현 카세트는 아데노바이러스 게놈의 E3 부분으로 삽입하였다. 종양 세포에서 pRB⁹⁴이 과다 발현되어 종양-세포 노화 및 세포 죽음을 일으키게 된다. pRB⁹⁴cDNA는 변형된 최적 개시물질 환경 서열을 가진다. AdVtTA.RB94 에 의해 트랜스듀스된 사람 종양 세포에서 pRB94 단백질이 발현하는 것을 가역적으로 개시 및 중단시킬 수 있다. 293 세포에서 신규한 AdVtTA.RB94 재조합 아데노바이러스 벡터를 효과적으로, 수득율 및 그 질을 높여서 증식시킬 수 있다.

실시예 9

테트라사이클린-반응성 RB/p53 공동 발현 벡터 준비

상기 실시예 6에서 설명한 것과 같이, 비-유도성 시스템(Chen et al., 1990; Li et al., 1996) 또는 유도성 시스템으로 Saos-2(RB^-, p53^null) 종양 세포에서 p53 재구성하면, 이들의 신형성 표현형이 억제되고, 테트라사이클린 조절가능한 프로모터를 가지는 p53 재구성된 Saos-2 클론은 테트라사이클린 유무하에서 SA-β-gal 음성이 된다. 그러나, p53-재구성된 Saos-2 세포를 Tc-없는 배지에서 야생형 pRB¹¹⁰를 발현시키는 재조합 아데노바이러스 벡터로 감염시키면, 야생형 p53 및 pRB¹¹⁰발현시키는 종양 세포는 pRB¹¹⁰만을 발현시키는 종양 세포와 비교하였을 경우에, 좀더 강력한 SA-β-gal 양성 착색을 나타낸다. 결과를 보면, pRB 및 p53에 의한 종양 세포 억제 기작은 서로 상이하나, pRB 및 p53이 함께 하면, RB-중개된 종양 세포 노화에 공조 효과를 가진다.

pRB 및 p53가 pRB-중개된 종양 특이적인 서열에서 공조 효과를 가지기 때문에(실시예 6), 변경된 RB 및 p53 단백질은 비-소세포 폐 암종 및 방광의 과도기적인 세포 암종을 포함하는 다른 사람 악성종양에서 공조 예후 인자가 될 것이고(Xu, 1995; Xu et al., 1994a; Xu et al., 1996), pRB 및 p53 유전자 요법을 복합하면, 가능한 종양 억제물질 저항성을 극복하는 또 다른 전략이 될 것이다.

변형된 테트라사이클린-반응성 트랜스활성물질(tTA) 발현 카세트 및 tTA-의존성 pRB¹¹⁰발현 카세트를 Ad5의 E1 부분으로 삽입시켜, 두 개 종양 억제물질 유전자를 동시에 발현시키는 아데노바이러스 벡터, 즉 AdVtTA.RB110/p53를 작제한다. 이 벡터에서, 더 작은 p53 발현 카세트는 34kb 마스터 플라스미드, pBHG11의 E3 부분에 결찰 반응을 통하여 삽입한다. 동일 세포에 RB 및 p53 유전자를 치환하는 시도가 성공을 한 적이 없기 때문에(Wang et al., 1993), 발명자는 두 개 종양 억제물질 유전자를 동시에 발현하는 아데노바이러스 벡터를 조절가능한 유전자 발현 시스템으로 만들어야 한다는 것이다.

실시예 10

테트라사이클린-조절된 레트로바이러스 벡터의 작제

kat 레트로바이러스 생산 시스템은 통상적인 레트로바이러스 형질도입이 힘든 조혈세포 형태를 효과적으로 형질도입시킬 수 있는 고역가 레트로바이러스 상청액을 만든다(Finer et al., 1994). 하이브리드 LTR을 가지는 kat 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 EC1214A(실시예 3)와 복합하여, Tc-조절가능한 발현을 하는 레트로바이러스를 만든다. 표준 레트로바이러스 벡터를 이용한 Tc-조절이 성공되었다고 문헌에 보고된바 있는데, Tc-조절된 레트로바이러스 벡터는 조혈 간세포와 같은 특정 세포형을 형질도입시키는데에는 Tc-조절된 아데노바이러스 벡터보다 더 잘된다.

실시예 11

변형된 RB 구조체의 치료요법적 투여

A. in vivo에서 사람 방광 암을 치료

사람 방광 암은 변형된 RB 단백질을 발현하는 레트로바이러스 벡터를 방광으로 주입하여 충실성 종양의 종양 적제 물질 유전자 치료를 실행하는 이상적인 모델이다. Jone and colleagues(Ahlering et al., 1987)는 사람의 방광 암의 실험 모델을 정리하였다. 약한 유도 종양에서 정립된 사람 방광 암 세포인 RT4는 전이되지 않는 것으로, 암컷 누드 생쥐의 방광으로 22-가우지 케테테르를 통하여 주입하였을 경우에, 국소적으로 종양을 생성한다. 대조적으로, 좀더 공격성이 강한 사람 방광 암에서 분리한 EJ 방광 암종 세포는 누드 생쥐의 방광에 침투성 종양을 만들고, 이는 자발적으로 폐로 전이된다. 따라서, 이와 같은 모델을 이용하여, 레트로바이러스 벡터로 in vivo로 유전자를 전달하여, 실험적인 방광 암을 치료한다.

RB^-사람 방광 암종 세포주, 5637(ATCC HTB9) 및 RB⁺사람 방광 암 세포주 SCaBER(ATCC HTB3)의 종양 세포를 카테테르를 통하여 암컷 무-흉선(nu/nu) 누드 생쥐(주령이 6-8)의 방광으로 직접주사한다(Ahlering et al., 1987). 누드 생쥐 방광 종양의 발생 및 진행은 TV 모니터가 부착된 광섬유 시스템으로 모니터한다. 시럼 종양은 변형된 RB 단백질을 발현시키는 레트로바이러스 벡터로 처리한다.

사람의 변형된 RB 단백질을 많이 발현시키는 선택된 클론의 조직 배양 배지에서 고역가의 상청액을 수득하고, 사용하기 전에 복체 컴피턴스 바이러스가 없는 것을 확인한다. 1 ×10⁷(cfu)/㎖이상의 4 ×10⁴범위, 적절하게는 1 ×10⁶cfu/㎖ 역가를 가지는 레트로바이러스 벡터 현탁액을 카테테르를 통하여 생쥐 방광으로 직접 주입하여 종양을 치료한다. 당업자는 이와 같은 치료는 방광으로 카테테르를 삽입하여 필요한 만큼 실시할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 상기 언급한 광섬유 모니터를 통하여, 변형된 RB 유전자를 전달한 후에 종양 퇴행이 관찰된다. 상기에서 설명한 동일한 과정을 이용하여 사람 방광 암을 치료하는데, 단 레트로바이러스 벡터 현탁액은 암을 가지는 사람 방광으로 주입된다.

B. 직교이방성 폐 암 모델을 이용한 in vivo 연구

정상적인 pRB¹¹⁰발현을 하는 사람의 큰 세포 폐암종 NCI-H460(ATCC HTB177) 세포를 무-흉선(nu/nu) 생쥐의 우측 기관지에 주사한다(생쥐 한 마리에 10⁵세포). 3일 후에, 생쥐의 기관지내로 변형된 RB 또는 야생형 RB 레트로바이러스를 생한하는 세포의 상청액을 연속 3일간 주입한다. 야생형 RB 레트로바이러스 상청액으로 처리한 생쥐 집단과는 대조적으로 변형된 RB 레트로바이러스 상청액으로 처리한 집단에서는 종양 형성이 억제되었는데, 이는 변형된 RB-발현 레트로바이러스는 RB⁺비-소세포 폐암종(NSCLC) 세포의 생장을 저해하지만, 야생형 RB-발현 레트로바이러스는 저해하지 못한다는 것을 의미한다.

C. in vivo에서 사람의 비-소세포 폐 암의 치료

기관지경으로 근접할 수 있는 기관지내 종양을 가지고, 기관지가 차단된 비-소세포 폐암 환자를 변형된 RB 유전자 치료를 위해 선별하였다. 국소 또는 전신 마취하에 기관지경으로 치료를 하였다. 과정을 시작하기 위해, 가능한 많은 양의 종양을 절개하였다. 기관지를 경유하는 멸균 바늘(21G)을 기관지경의 생검 통로를 통하여 통과시킨다. 남아 있는 종양 부위에 적절한 변형된 RB 레트로바이러스 벡터 상청액, 변형된 RB 아데노바이러스 현탁액 또는 변형된 RB를 발현시키는 플라스미드 벡터-리포좀 복합체를 5㎖ 내지 10㎖양으로 주사한다. 프로타민은 5㎍/㎖ 농도로 첨가한다. 한가지 이상의 벡터를 포함하는 치료요법적 바이러스 또는 플라스미드 현탁액을 종양내에 또는 종양 주변에 주사하고, 종양 주변의 점막아래에도 주입한다. 연속 5일간 주사를 하고, 그 다음은 한달에 한번씩 주사를 반복한다. 종양이 진행되지 않을 때가지 주사를 계속 놓는다. 1년 후에, 환자에서 치료를 지속할 것인지를 판단한다.

또한, 주의하는 것으로, 환자는 바이러스 상청액 wtkgn 24시간동안 외과 마스크를 착용한다. 모든 의료진은 바이러스 상청액의 주입 및 기관지경을 실시하는 과정에서 마스크를 착용한다. 필요에 따라서는 항-기침제를 처방한다.

D. 리포좀에 포집된 정제된 변형 RB 단백질로 사람 폐 암종의 치료 또는 예방

공지된 방법을 이용하여, 이와 같은 치료를 요하는 세포로 변형된 RB 단백질을 도입하여 표적 종양 또는 암세포를 치료한다. 예를 들면, 리포좀은 약물, 단백질, 플라스미드 벡터등을 in vivo 및 in vitro상에서 운반하는 수단으로 광범위하게 연구된 인공 막 소포이다(Mannino et al., 1988). 적혈구 음이손 전달물질(Newton et al., 1988), 슈퍼옥시드 디스푸타제 및 카탈라제(Tanswell et al., 1990), UV-DNA 복구 효소(Ceccoli et al., 1989)와 같은 단백질은 리포좀 소포에 매우 효과적으로 포집되어, in vivo 또는 in vitro상에서 포유류 세포로 전달된다. 또한, 작은 입자 에어로졸은 호흡기 질환을 치료하기 위한 약물을 운반하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 운반체로 리포좀을 이용하여, 소-입자 에어로졸에 약물을 투여하는 것에 대해 보고된 바 있다. 에어로졸을 통하여 투여하면, 약물은 비강 표면, 기관지 및 폐에 상대적으로 균일하게 침착된다(Knight et al., 1988).

폐 암을 치료하거나 예방하기 위해, 치료요법적 변형된 RB 단백질은 면역친화력에 의한 크로마토그래피 또는 임의 다른 방법을 통하여 재조합 베큘로바이러스 AcMNPV-변형된 RB 감염된 곤충 세포로부터 정제한다. 변형된 RB 단백질은 리포좀과 혼합하고, 리포좀 소포에 고효율로 결합된다. 포집된 변형 RB 단백질은 활성이 있다. 어어로졸 운반 방법은 정상적인 지원자 및 환자가 잘 적응할 수 있는 방법이기 때문에, 변형된 RB를 포함하는 리포좀을 임의 단계의 폐암 환자에세 투여하여 치료하거나 암 발병율이 높은 집단에서 발암을 예방하기 위해 투여한다. 변형된 RB- 단백질을 포함하는 리포좀을 비강을 통하여 흡입할 수 있도록 투여하거나 비정사적인 세포 증식을 억제하는데 충분한 약량으로 소립자 에어로졸을 통하여 튜브로 투여된다. 환자에게 30분간 에어로졸 치료를 하고, 그 다음 2주에 3일씩, 그리고 필요할 때 반복한다. 변형된 RB 단백질은 호흡기관 및 폐를 통하여 운반된다. q년 뒤에,환자의 전반적인 상태를 평가하여, 치료를 지속할 것인지를 결정한다.

실시예 12

RB를 재발현시켜 노화 유도 및 테로메라제 저해

정상적인 사람 배수체 세포는 제한된 횟수의 세포 분열후에 in vivo 및 in vitro에서 노화된다. 세포 노화로 알려진 이와 같은 공정은 사람 암 발생의 중요한 장벽 및 기본적인 노화의 원인이다. 이 실시예에서는 RB/p53-결손 종양 세포에서 변형된 테트라사이클린-조절된 유전자 발현 시스템을 통하여 기능을 하는 pRB를 재발현시키면, 세포 사이클의 G0/G1 상에서 생장을 안정적으로 중단시키게 되어, 다양한 유사분열 자극에 반응하여 S 상으로 종양 세포가 들어가는 것을 방지한다. 이와 같은 세포는 세포 노화와 일치하는 다중 형태학적 변화를 나타내고, 노화와 연관된 β-갈락토시다제 생체 표식을 발현한다.

또한, 신형성 세포의 증식성을 연장하는데 기본이 되는 것으로 보인는 테로메라제 활성은 pRB(p53이 아님)의 발현을 유도한 후에, 종양 세포에서 제거되었다. 놀라운 것은, pRB 발현을 위해 비-허용성 배지로 복귀하였을 경우에, pRB-유도된 노화 종양 세포는 DNA 합성을 다시 시작하고, 세포 분열을 한다. 그러나, 공정에서 대부분의 세포가 죽는데, 후기 계대에서 SV40 T-항원-형질변형된 사람 배수체 섬유아세포의 노화후 붕괴와 유사한 현상이다. 이와 같은 관찰로 RB/p53-결손 종양 세포에서 pRB가 과다발현되면 종양세포의 불멸성을 역전시켜, 증식성 노화와는 구별이 되는 표현형을 가진다는 것이다. 이 결과는 pRB가 고유 세포 노화 프로그램에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

A. 재료 및 방법

Tc-조절가능한 pRB 발현을 하는 종양 세포주의 정립

상기에서 설명하는 것과 같이, 고유 다중 플라스미드 테트라사이클린 억제물질/작동물질 기초한 조절 시스템을 개선하였다. 이 실시예에 이용된 모든 RB-재구성된 종양 세포주는 처음 플라스미드 트랜스펙션후에 적어도 2회 서브클로닝을 시키는데, 이는 순수한 클론으로 간주한다. 이와 같은 클론의 상동성은 pRB 핵 착색에 의해 증명된다. 또한, 패널 검사(Zhou et al., 1994)를 이용하여 허용성 조건하에 기능을 하는 pRB가 안정적으로 발현되는지를 확인한다. RB-재구성된 조양 세포는 배양 배지에 0.5㎍/㎖ 테트라사이클린 존재하에 모두 RB^-이고; 세포의 대부분(>99%)은 면역화학착색에 의해 나타나는 것과 같이 Tc를 제거한 후 24시간경에 RB⁺가 된다.

유동 세포측정 분석

각 시간대에 수집된 단일 세포 현탁액은 파라포름알데히드 및 에탄올로 구성시키고, 프로피디윰 요오드(PI)(Sigma)로 착색한다. FACScan 유동 세포측정기(Becton-Dickinson)를 이용하여 모든 프로파일을 생성한다. 처음 피크(M1)에는 G0/G1에 배수체 DNA를 가진 세포를 포함하고, PI-형광 강도가 2배인 제 2 피크(M3)는 사수체 G2/M 세포를 포함하고, 두 개 피크사이(M2)에 면적은 S 상에 있는 총 세포 수를 나타낸다(Nicoletti et al., 1991).

SA-β-gal 검사

이 검사는 전술한 것과 같이 실행한다(Dimri et al., 1995). 간락하게 설명하면, 세포는 5분간 2% 포름알데히드/0.2% 글루타알데히드에 고정시키고, 6시간동안 pH6.0에서 5-브로모-4-클로로-3-인돌일 β-D-갈락토시다제(X-Gal)로 착색한다. 착색 용액에는 1㎎/㎖ X-Gal, 40mM 시트르산/인산나트륨 pH 6.0, 5mM 페로시아니드 칼륨, 5mM 페리시아니드 칼륨, 150mM NaCl, 2mM MgCl₂을 포함한다.

테로메린 반복 증식 프로토콜 (TRAP) 검사

매뉴얼에 따른 방법은 Kim et al.(Kim et al., 1994)이 설명하는 원래 TRAP 검사를 변형한 것이다. 100㎜ 배양 접시에서 생장된 ∼10⁶세포를 수득하고, 200㎕ 찬(얼음) 용해 완충액에서 30분간 현탁시키고, 4℃에서 100,000 ×g 30분간 원심분리시킨다. 현탁액은 0.5㎍ 단백질/㎕로 희석하여, 이중 2㎕는 각 TRAP 검사에 이용한다. 테로메라제 반응은 30℃에서 30분간 실시하고, [γ-³²P]-라벨된 TS 프라이머로 2-단계 PCR^TM(94℃, 30초; 60℃, 30초; 33회) 실시한다. PCR^TM증폭된 테로메라제 연장 생성물은 12.5% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한다.

B. 결과

종양 세포의 생장을 pRB-에 의해 비가역적으로 중단

상기에서 설명하는 것과 같이 변형된 테트라사이클린(Tc) 조절가능한 유전자 발현 시스템을 이용하여, 12가지 장시간 안정한 종양 세포 클론을 정립하였는데, 이때 야생형 pRB 발현은 상당한 누출없이 가역적으로 개시 또는 중단된다. RB-재구성된 종양 세포 클론은 유방 암종 세포주, MDA-MB-468, 골수 암종 세포 주 Saos-2, 방광 암종 세포주 5637에서 수득한다. 이와 같은 종양 세포주는 RB 및 p53 유전자 돌연변이을 모두 가지고 있기 때문에, 숙주 세포로 선택하였다(Wang et al., 1993; Chen et al., 1990; Berry et al., 1996; Masuda et al., 1987).

웨서턴 블랏팅에 의해 측정한 것과 같이, 종양 세포에서 유도된 pRB 단백질은 세포 배양 배지에서 테트라사이클린을 제거한 후 약 24시간에 최대 수준에 도달하고, 24 내지 40시간내에 완전하게 탈포스포릴화된다. 종양 세포 생장에서 pRB 발현 유도 효과는 생장 곡선 및 (³H) 티미딘 결합으로 평가하고(Xu et al., 1994b), 유동 세포측정 분석(Nicoletti et al., 1991)으로도 평가한다. 연구된 모든 장 시간 종양 세포 클론에서 세포 생장 및 DNA 합성이 pRB 발현이 유도된 후 24 내지 48시간에 중단되었다(도 3A, 3B, 3C). 대부분의 종양 세포는 세포 사이클의 G0/G1 상에 묶여 있다.

Tc없는 배지에서 pRB를 발현시킨 후 4일 뒤에, 혈청 생장 인자, 피토헤마글루티닌(PHA), 콘카나발린 A(Con A)와 같은 다양한 미토겐으로 자극하면, 종양 세포의 생장이 비가역적으로 중단된다. 이는 도 3A, 3B, 3C에서 볼 수 있는 것과 같이, 연속적인 생장 곡선으로 결정되는데, 미토겐 자극에 의해 종양 세포가 (³H)를 결합시키지 못한다. 종양 세포는 세포 확대, 평편해지거나, 사이클링 세포보다 핵세포질 비율이 낮은 것을 포함하는 세포 노화와 일치하는 형태학적 변화를 나타낸다.

또한, DNA 분절화 검사에서 측정한 것과 같이, pRB 발현에 대해 비-허용성 조건에서 생장된 RB-재구성된 Saos-2 종양 세포로부터 준비된 DNA 샘플에서 분자량이 적은 DNA가 소량 관찰되었다. 이와 같은 발견은 RB-결손된 종양 세포 배양물의 자발적인 아포프토시스 수준이 낮다는 것을 말하는데, 이는 pRB 발현 유도에 의해 저해된다. 또한, RB-재구성된 5637 및 MDA-MB-468 종양 세포에서 pRB 발현을 개시하면, IFN-γ-유도된 아포프토시스 세포죽음이 방해를 받는다.

노화가 연합된 β-갈락토시다제의 발현

배양물에서 노화 사람 세포 및 피부 노화를 확인하는 생체 표식이 최근에 보고되었다. 이 표식은 노화-연합된 β-갈락토시다제(SA-β-gal)로써 노화 섬유아세포에 의해 발현된다. SA-β-gal은 불멸세포에는 없고. 불멸성을 역전시키는 유전자 조작에 의해 유도된다(Dimri et al., 1995). 어린(초기 계대) 사람 WI-38 섬유아세포는 SA-β음성이고, 반면에 노화(52이상의 배가 수준 집단에서) WI-38 세포는 강한 SA-β-gal 양성으로, SA-β-gal 검사의 유효한 기준이 된다. Tc반응성 RB- 재구성된 종양 세포주는 Tc존재하에서는 전적으로 SA-β-gal 음성이다(i.e., RB^-). 대부분의 종양 세포는 Tc를 제거한 배지에서 4-5일 동안 pRB 발현 유도후에 SA-β-gal 양성이 된다. 종양 세포에서 노화-연합된 생체 표식이 종양 세포 집단의 비가역적인 세포 생장 중단돠 일치한다(도 3A, 3B, 3C). 유도된 RB⁺종양 세포의 SA-β-gal 착색 강도는 이용된 종양 세포 타입에 따라 달라진다.

종양 세포에서 pRB(p53가 아닌)을 재발현시키면 테로메라제 활성이 저해됨

테로메라제는 최근에 밝혀진 세포 노화를 조절하는 흥미로운 물질로(Linskens et al., 1995; Klingelhutz et al., 1996), 숙주 종양 세포의 테로메라제 활성에 pRB 및 p53 치환 효과를 측정하였다. 이와 연관하여, 골수암종 세포주 Saos-2에서 Tc-조절가능한 야생형 p53 발현을 하는 몇 r지 장시간 안정한 종양 세포 클론을 정립하였다. 최근에 설명된 것과 같이(Kim et al., 1994), 테로메린 반복 증폭 프로토콜(TRAP)을 이용하여 pRB(또는 p53) 발현 유도전후에 종양 세포에서 테로메라제 활성을 특정하였다.

pRB 발현을 유도하기 전에, 검사된 세 가지 RB/p53-결손 종양에서 RB-재구성된 종양 세포주는 테로메라제 활성에 대해 양성인데 반하여, 상대적인 테로메라제 활성은 pRB 발현이 개시된 후에 종양에서 ∼15 내지 >100배 낮았다. 사실 테로메라제 활성은 pRB-발현하는 MDA-MB-468 및 Saos-2 종양 세포에서 거의 감지할 수 없다. 대조적으로, Saos-2세포에서 야생형 p53 발현으로 RB^-/p53^null종양 세포의 생장이 중단되지만, p53-재구성된 Saos-2 종양 클론은 양성의 테로메라제 활성을 지속적으로 나타내고, 이는 p53에 의해 영향을 받지 않는다. 따라서, 테로메라제 활성 차이는 세포 증식에서 차이로 간단하게 설명되지는 않는다.

pRB 회수후에 pRB-유도된 노화 종양 세포의 노화후 붕괴

pRB-유도된 종양 세포 노화는 기능을 하는 pRB의 지속적인 발현에 엄격하게 의존한다. 상기에서 볼 수 있는 것과 같이, 4일 이상 Tc-없는 배지에서 pRB 발현을 유도한 후에, RB-재구성된 MDA-MB-468, Saos-2, 5637 종양 세포는 노화된다. 이와 같은 종양 세포를 pRB 발현을 위한 비-허용성 배지로 복귀시키면, 상당수의 종양 세포는 세포-세포 흡착을 상실하여, 페트리 접시에서 떨어지고, 죽게된다. 이와 같은 현상을 추가 조사하기 위해, 복합 방법을 이용하는데, 이는 pRB 면역화학착색 및 (³H)티미딘을 종양 세포 라벨링이 된다.

0.5 ㎍/㎖ Tc를 RB-재구성된 Saos-2 종양 세포 배양물에 다시 첨가한 후, 4-5일간 Tc-없는 배지에 유지시키면, 거의 모든 종양 세포는 외생 pRB를 가지지 않으며, 6일 경에는 RB^-가 된다. 연속하여, 9일 내지 10일에는, 종양 세포는 DNA 합성을 개시하고, 이들 대부분은 이상 핵을 가진다. 세포는 분열을 시도하나 이과정에서 대부분이 죽는다. 이와 같은 종양 세포는 후기 계대에서 T- 항원 형질변환된 사람 세포의 노화후 붕괴와 상당히 유사한 표현형을 나타낸다(Stein, 1985).

요약하면, RB-결손 종양 세포에서 기능을 하는 pRB를 다시 발현시키면, 테로메라제 활성의 중단과 함께 세포 생장이 중단된다. 종양 세포는 비가역적으로 미토겐 반응성을 상실하여 G1-상태에 묶여 있게 된다. 이들은 pRB-의존성 SA-β-gal 활성(노화-연합된 생체 표식)을 나타내고, 아포프토시스성 세포 죽음에 저항성을 나타낸다. RB^-/p53^nullSaos-2에 야생형 pRB 또는 p53를 치환하면 집단 수준에서 종양 세포 생장을 차단시키고, pRB 유도된 테로메라제 저해가 일어난다. 또한, pRB-유도된 노화 세포에서 pRB을 회수하면, 분리-형 표현형이 나타난다. 이와 같은 관찰로 인하여, pRB는 세포 노화 프로그램에 관련된 것으로 보인다. 이와 같은 결과는 다양한 RB-결손 종양 세포에서 pRB를 과다발현시키면 이들의 불멸성을 역전시키고, 증식성 노화의 원인이 된다. 검사된 세 가지 RB-결손 종양 세포는 p53 돌연변이를 가지고 있기 때문에, pRB 중개된 종양 세포는 실제 야생형 p53 기능을 요구하지 않는다.

pRB와 테로메라제간에 새로운 줄이 연결된 것이다. TRAP 검사에 따르면, RB- 결손 종양 세포에서 pRB를 재발현시키면, 테로메라제 활성이 저해된다는 것이다. 중합효소 연쇄 반응(PCR^TM)-TRAP 검사에 감응성이 높기 때문에, 매우 소수의 테로메라제 양성 세포에서도 효소 활성을 감지할 수 있어서, 절대적으로 순수한 RB-재구성된 세포 클론을 얻는 것이 어렵고, RB-결손 종양 세포에서 테로메라제 활성 저해시에 pRB재발현의 효과는 in vitro 검사에서 감지되는 것보다는 높다.

pRB(또는 p53) 발현에 비-허용성 조건하에 유지되는 경우에, pRB-재구성된 Saos-2 클론은 p53-재구성된 Saos-2 클론보다는 휠씬 낮은 테로메라제 활성을 가진다는 것이다. 그 차이는 Tc-없는 배지에서 pRB 발현을 개시하기 전에도 Saos-2 세포에서 Tc-반응성 프로모터로부터 낮은 기본수준의 pRB 발현있어야 한다는 것이다(Gossen and Bujard, 1995). 비허용성 조건에서 pRB-재구성된 종양 세포에서 pRB 누출은 pRB 단백질의 경우에 면역감지 기저수준이하의 것이나(Xu et al., 1991b), 대부분 테??로메라제 활성을 저해하는데에는 충분하다. 테로메라제 활성을 누출하는 종양 세포는 테로메라제 감소가 시작되기 때문에, 종양 세포에서 고유 상태로 유지되는 경우 고유 세포 노화 프로그램을 촉진하게 된다.

여기에서 설명하는 모든 조성물 및 방법은 본 발명의 내용으로 실험없이 실행해도 된다. 본 발명의 조성물 및 방법은 적절한 구체예를 통하여 설명한 것이나 당업자는 조성물, 방법, 여기에서 설명하는 방법의 단계에 본 발명의 개념을 벗어나지 않고 다양하게 변화를 줄 수 있다는 것을 인지할 것이다. 좀더 구체적으로는, 화학적 생리학적으로 관련된 특정 물질은 여기에서 설명된 것과 대체하여 동일한 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다. 이와 같은 유사한 치환 및 변형은 당업자에게 분명한 것으로 다음의 청구범위를 본 발명의 범위로 한정한다.

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서열표 리스트

(1)일반정보

(i)출원인;

(A) 이름; Board of Reagent, The University of Texas System

(B) 거리; 201 W. 7th Street

(C) 도시; Austin

(D) 주; 텍사스

(E) 나라; 미국

(F) 우편코드; 78701

(ii) 발명의 명칭; 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질

(iii) 서열의 수; 51

(iv) 컴퓨터 판독 형태

(A)매체형태; 플로피 디스크

(B)컴퓨터;IBM PC 호환성

(C)작동시스템; PC-DOS/MS-DOS

(D)소프트웨어; PatentIn Release#1.0, Version #1.30(EPO)

(vi) 현재 출원 자료

(A) 출원번호; US60/038,118

(B) 출원일; 97.2.2

(2)서열 1에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3555 bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일 가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; CDS

(B) 위치; 7..2790

(xi)서열 1

(2)서열 2에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 928 아미노산

(B)형태; 아미노산

(D)위상; 선형

(ii)분자형대; 단백질

(xi)서열 2

(2)서열 3에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3218bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일 가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; CDS

(B) 위치; 7..2454

(xi)서열 3

(2)서열 4에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 816개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(D)위상; 선형

(ii)분자형태; 단백질

(xi)서열 4

(2)서열 5에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 285bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 5

(2)서열 6에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 28bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 6

(2)서열 7에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 26bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 7

(2)서열 8에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 27bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 8

(2)서열 9에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 21bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 9

(2)서열 10에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 19bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 10

(2)서열 11에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 26bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 11

(2)서열 12에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 32bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 12

(2)서열 13에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 22bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 13

(2)서열 14에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 39bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 14

(2)서열 15에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 39bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 15

(2)서열 16에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 39bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 16

(2)서열 17에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 39bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 17

(2)서열 18에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 36bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 18

(2)서열 19에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 30bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 19

(2)서열 20에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 31bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 20

(2)서열 21에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 36bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 21

(2)서열 22에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 24bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 22

(2)서열 23에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 24bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 23

(2)서열 24에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 31bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 24

(2)서열 25에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 31bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 25

(2)서열 26에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 32bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 26

(2)서열 27에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; 변형된 염기

(B) 위치; 4..5

(C) 다른 정보/노트; "R=A 또는 G"

(xi)서열 27

(2)서열 28에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3455bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; CDS

(B) 위치; 7..2691

(xi)서열 28

(2)서열 29에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 895개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(D)위상; 선형

(ii)분자형태; 단백질

(xi)서열 29

(2)서열 30에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3392bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; CDS

(B) 위치; 7..2628

(xi)서열 30

(2)서열 31에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 874개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(D)위상; 선형

(ii)분자형태; 단백질

(xi)서열 31

(2)서열 32에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3323bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; CDS

(B) 위치; 7..2559

(xi)서열 32

(2)서열 33에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 851개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(D)위상; 선형

(ii)분자형태; 단백질

(xi)서열 33

(2)서열 34에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3266bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; CDS

(B) 위치; 7..2502

(xi)서열 34

]

(2)서열 35에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 832개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(D)위상; 선형

(ii)분자형태; 단백질

(xi)서열 35

(2)서열 36에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3113bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; CDS

(B) 위치; 7..2349

(xi)서열 36

(2)서열 37에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 781개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(D)위상; 선형

(ii)분자형태; 단백질

(xi)서열 37

(2)서열 38에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3323bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; CDS

(B) 위치; 7..2559

(xi)서열 38

(2)서열 39에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 851개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(D)위상; 선형

(ii)분자형태; 단백질

(xi)서열 39

(2)서열 40에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3461bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; CDS

(B) 위치; 7..2697

(xi)서열 40

(2)서열 41에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 897개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 아미노산

(D)위상; 선형

(ii)분자형태; 단백질

(xi)서열 41

(2)서열 42에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3347bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; CDS

(B) 위치; 7..2583

(xi)서열 42

(2)서열 43에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 859개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(D)위상; 선형

(ii)분자형태; 단백질

(xi)서열 43

(2)서열 44에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3161bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; CDS

(B) 위치; 7..2397

(xi)서열 44

(2)서열 45에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 797개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(D)위상; 선형

(ii)분자형태; 단백질

(xi)서열 45

(2)서열 46에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3377bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; CDS

(B) 위치; 7..2613

(xi)서열 46

(2)서열 47에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 869개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(D)위상; 선형

(ii)분자형태; 단백질

(xi)서열 47

(2)서열 48에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3383bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; CDS

(B) 위치; 7..2619

(xi)서열 48

(2)서열 49에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 871개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(D)위상; 선형

(ii)분자형태; 단백질

(xi)서열 49

(2)서열 50에 대한 정보

(i)서열의특징

(A)길이; 3554bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ix) 특징

(A) 이름; CDS

(B) 위치; 7..2790

(xi)서열 50

(2)서열 51에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 928개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(D)위상; 선형

(ii)분자형태; 단백질

(xi)서열 51

Claims

pRB⁹⁴이외의 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질을 인코드하는 분리된 유전자로 구성된 DNA 단편에 있어서, 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질은 N- 말단이 변형된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 1 항에 있어서, 유전자는 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질로을 인코드하는데, 이 단백질은 적어도 한 개 아미노산이 결손된 제 1 서열 부분으로 구성된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 2 항에 있어서, 제 1 서열 부분에서 적어도 2개 아미노산이 결손된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 3 항에 있어서, 제 1 서열 부분에서 적어도 25개 아미노산이 결손된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 4 항에 있어서, 제 1 서열 부분에서 적어도 100개 아미노산이 결손된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 5 항에 있어서, 제 1 서열 부분에서 적어도 150개 아미노산이 결손된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 6 항에 있어서, 제 1 서열 부분에서 적어도 300개 아미노산이 결손된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 2 항에 있어서, 제 1 서열은

a) 아미노산 1 내지 아미노산 50 사이;

b) 아미노산 51 내지 아미노산 100 사이;

c) 아미노산 101 내지 아미노산 150 사이;

d) 아미노산 151 내지 아미노산 200 사이;

e) 아미노산 201 내지 아미노산 250 사이;

f) 아미노산 251 내지 아미노산 300 사이;

g) 아미노산 1 내지 아미노산 100 사이;

h) 아미노산 51 내지 아미노산 150 사이;

i) 아미노산 101 내지 아미노산 200 사이;

j) 아미노산 151 내지 아미노산 250 사이;

k) 아미노산 201 내지 아미노산 300 사이;

l) 아미노산 1 내지 아미노산 150 사이;

m) 아미노산 51 내지 아미노산 200 사이;

n) 아미노산 101 내지 아미노산 250 사이;

o) 아미노산 151 내지 아미노산 300 사이;

p) 아미노산 1 내지 아미노산 200 사이;

q) 아미노산 51 내지 아미노산 250 사이;

r) 아미노산 101 내지 아미노산 300 사이;

s) 아미노산 1 내지 아미노산 250 사이;

t) 아미노산 51 내지 아미노산 300 사이;

u) 아미노산 1 내지 아미노산 300 사이;에 위치하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 2 항에 있어서,

a) 제 1 서열 부분에서 약 아미노산 2 내지 아미노산 34가 결손;

b) 제 1 서열 부분에서 약 아미노산 2 내지 아미노산 55가 결손;

c) 제 1 서열 부분에서 약 아미노산 2 내지 아미노산 78이 결손;

d) 제 1 서열 부분에서 약 아미노산 2 내지 아미노산 97이 결손;

e) 제 1 서열 부분에서 약 아미노산 2 내지 아미노산 148이 결손;

f) 제 1 서열 부분에서 약 아미노산 31 내지 아미노산 107이 결손;

g) 제 1 서열 부분에서 약 아미노산 77 내지 아미노산 107이 결손;

h) 제 1 서열 부분에서 약 아미노산 111 내지 아미노산 181이 결손;

I) 제 1 서열 부분에서 약 아미노산 111 내지 아미노산 241이 결손;

j) 제 1 서열 부분에서 약 아미노산 181 내지 아미노산 241이 결손;

k) 제 1 서열 부분에서 약 아미노산 242 내지 아미노산 300이 결손;된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 2 항에 있어서, 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질의 N- 부분은 적어도 한 개 아미노산이 결손된 제 2 서열이 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 10 항에 있어서, 약 아미노산 2 내지 아미노산 34, 그리고 아미노산 76 내지 아미노산 112가 결손된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 10 항에 있어서, 약 아미노산 2 내지 아미노산 55, 그리고 아미노산 76 내지 아미노산 112가 결손된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 1 항에 있어서, 유전자는 적어도 처음 N-말단 돌연변이로 구성된 변형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질을 인코드하고, 이때 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질은 이에 상응하는 야생형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질의 생물학적 활성과 비교하였을 때 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 13 항에 있어서, 유전자는 111위치에 돌연변이를 가지는 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질을 인코드하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 14 항에 있어서, 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질은 111위치에 아스파르트산 대신에 글리신이 있는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 13 항에 있어서, 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질은 적어도 제 1 N-말단 돌연변이로 구성된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 16 항에 있어서, 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질은 111위치 및 112 위치에 돌연변이가 있는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 17 항에 있어서, 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질은 111위치에 아스파르트산 대신에 글리신이 있고, 112위치에는 글루타민 대신에 아스프라트산이 있는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 1 항에 있어서, 유전자는 적어도 한 개의 아미노산이 결손되고, 적어도 한 개의 아미노산이 돌연변이된 것으로 구성된 변형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질을 인코드하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 2 항에 있어서, 유전자는 서열 2의 370 내지 928의 C-말단 아미노산 서열로 구성된 변형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질을 인코드하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 2 항에 있어서, 유전자는 서열 31; 서열 33; 서열 35; 서열 37; 서열 39; 서열 41; 서열 43; 서열 45; 서열 47; 서열 49; 서열 51의 인접하는 아미노산 서열로 구성된 변형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질을 인코드하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 2 항에 있어서, 유전자는 서열 28의 7 내지 2691의 핵산 서열; 서열 30의 7 내지 2628의 핵산서열; 서열 32의 7 내지 2559의 핵산 서열; 서열 34의 7 내지 2502의 핵산 서열; 서열 36의 7 내지 2349의 핵산 서열; 서열 38의 7 내지 2559의 핵산 서열; 서열 40의 7 내지 2697의 핵산 서열; 서열 42의 7 내지 2583의 핵산 서열; 서열 44의 7 내지 2397의 핵산 서열; 서열 46의 7 내지 2613의 핵산 서열; 서열 48의 7 내지 2619의 핵산 서열; 서열 50의 7 내지 2790의 핵산 서열의 인접 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 1 항에 있어서, 프로모터 조절하에 위치하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 23 항에 있어서, 이는 재조합 벡터가 되는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 24 항에 있어서, 재조합 벡터는 아데노바이러스 벡터안에 포함된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 25 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스안에 포함된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 1 항에 있어서, 숙주세포안에 포함된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 27 항에 있어서, 숙주 세포는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 28 항에 있어서, 숙주 세포는 사람세포인 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 28 항에 있어서, 숙주 세포는 종양세포인 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 28 항에 있어서, 숙주세포는 동물내에 포함된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 31 항에 있어서, 동물은 사람인 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 1 항에 있어서, 제약학적 수용 가능한 부형제에 분산되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제 1 항에 있어서, 변형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질은

a) 적어도 한가지 아미노산이 결손된 적어도 제 1 서열 부분으로 구성된 N-말단 부분을 포함하고, 이때 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질은 이에 상응하는 야생형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질의 생물학적 활성과 적어도 등가의 생물학적 활성을 가지고;

b) 적어도 한가지 돌연변이를 포함하는 적어도 제 1 서열 부분으로 구성된 N-말단 부분을 포함하고, 이때 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질은 이에 상응하는 야생형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질의 생물학적 활성과 비교하였을 때 생물학적 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
전술한 어느 한 항에 있어서, 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질을 발현시키는데 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질을 발현시키는데 제 1-34항중 어느 한 항에 따른 DNA 단편을 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편의 용도.
제1-34항중 어느 한 항에 있어서, 세포 증식을 저해하는데 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
세포 증식을 저해하는데 제1-34항에 따른 DNA 단편을 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편의 용도.
제1-34항중 어느 한 항에 있어서, 세포 증식을 저해하는데 약물을 제조하는데 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
세포 증식을 저해하는 약물을 제조하는데 제1-34항에 따른 DNA 단편을 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편의 용도.
제1-34항중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료하는 약물을 제조하는데 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
암을 치료하는 약물을 제조하는데 제1-34항에 따른 DNA 단편을 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA 단편의 용도.
pRB⁹⁴이외의 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질에 있어서, 변형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질은 N-말단이 변형된 것으로 구성되고, 이때 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질은 이에 상응하는 야생형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질의 생물학적 활성과 적어도 등가의 생물학적 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질.
pRB⁹⁴이외의 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질을 인코드하는 분리된 유전자로 구성된 재조합 숙주 세포에 있어서, 변형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질은 N-말단이 변형된 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 세포.
제 44 항에 있어서, 숙주세포는 종양 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
세포 증식을 저해하는 방법에 있어서, pRB⁹⁴이외의 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질의 저해 효과량을 세포와 접촉시키고, 이때 변형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질은 N-말단이 변형된 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 46 항에 있어서, 세포에 제 1 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질을 발한시키는 DNA 단편을 세포에 제공하여 제 1 변형된 망막모세포종 종양 억제물질 단백질을 세포에 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 46 항에 있어서, 세포는 동물안에 있고, 제 1 변형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질 또는 이를 인코드하는 유전자를 제약학적 수용 가능한 운반체를 이용하여 동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 46 항에 있어서, 세포는 변형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질 및 p53 종양 억제물질 단백질을 복합하여 세포에서 세포 증식을 저해할 수 있는 효과량으로 세포와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
세포 증식을 저해하는 방법에 있어서, 세포는 변형 망막모세포종 종양 억제물질 단백질 및 p53 단백질을 복합하여 세포에서 세포 증식을 저해할 수 있는 효과량으로 세포와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
암을 치료하는 방법에 있어서, N-말단 변형된 pRB⁹⁴이외의 제 1 망막모세포종 종양 억제물질 단백질의 생물학적 저해 량으로 구성된 제약학적 수용 가능한 조성물을 암이 있는 동물에 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.