JP5215290B2 - Sparcヒトプロモーターの単離されたdna断片及び腫瘍細胞において異種の遺伝子の発現を駆動するためのその使用 - Google Patents
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Description
本発明は遺伝子治療の分野に関する。詳細には、本発明は、詳細には腫瘍細胞において、問題の遺伝子の発現を駆動することができるプロモーター活性を有する単離されたDNA配列に関する。より詳細には、本発明は問題の遺伝子に関連するSPARCプロモーターから単離されたDNA断片を含むベクターに、医薬組成物及び癌治療におけるその使用に関する。
オステオネクチン又はBM40としても知られる、SPARCタンパク質(分泌タンパク質、酸性及びシステインリッチタンパク質)はヒト及び非ヒト組織中に高く分布される分泌糖タンパク質であり、その機能及び効果は広く及びさまざまである。それは細胞外マトリックス成分と、成長因子と、サイトカインと及びマトリックスメタロプロテイナーゼの発現と相互作用することが発見されている。
それゆえ、詳細には腫瘍細胞において、問題の遺伝子の発現を駆動することができる、プロモーター活性を有する、単離されたDNA配列を提供することが本発明の目的である。
本発明は詳細には腫瘍細胞において、問題の遺伝子の発現を駆動することができる、ヒトSPARC遺伝子プロモーターから、単離された断片を提供する。
上記に開示されるように、本発明は主な局面で、塩基対−513〜塩基対+35のヒトSPARC遺伝子プロモーターの領域に対応するポリヌクレオチド配列、配列ID番号1又は1以上のヌクレオチドの挿入、置換又は欠損により改変された及び実質的に同等の機能を有する前記ポリヌクレオチド配列の断片又は変形を含む単離されたDNA配列を提供する。
実施例1.−異なる腫瘍及び正常系におけるSPARC mRNAの発現の評価
SPARCタンパク質から生成されるメッセンジャーRNA(mRNA)の値を腫瘍細胞系及び正常細胞系においてリアルタイムPCRにより評価した。
ヒト系HeLa(頸部癌、ATCC番号CCL−2)、T−47D(乳癌、ATCC番号HTB−133)、WI−38(胎児肺線維芽細胞、ATCC番号CCL−75)、WI−38 VA(形質転換された胎児肺線維芽細胞、ATCC番号CCL−75.1)、HFL−1(線維芽細胞、ATCC番号CCL−153)、293(胚腎臓、ATCC番号CRL−1573)、LoVo(結腸癌、ATCC番号CCL−229)、HCT−116(結腸癌、ATCC番号CCL−247)、CaCO2(結腸癌、ATCC番号HTB−37)、HT−29(結腸癌、ATCC番号HTB−38)、T84(結腸癌、ATCC番号CCL−248)及び大動脈内皮細胞(ウシ大動脈内皮細胞、BAEC ATCC番号CRL1395)をATCC(American Tissue Culture Collection, Rockville, MD, USA)から得た。ヒト黒色腫細胞系IIB−MEL−LES及びIIB−MEL−J−NはLedda et. al., 1997により以前に示された;ヒト黒色腫系SB2、A375N及びMEL−888はDr. Estela Medrano(Houston, Texas)により親切に提供された。全ての細胞を(Natocor, Carlos Paz, Argentinaにより提供される)10%ウシ胎児血清、2.5U/ml de ペニシリン(Sigma−Aldrich Corp., St. Louis, MO)及び2.5μg/mlストレプトマイシン(Sigma−Aldrich Corp., St. Louis, MO)で補充された推奨される培地中で培養し、5%CO2の気体中で37℃で維持した。BAEC細胞を5%BFSで補充した。
本発明者により行われるヒトSPARCプロモーターの配列分析は塩基+29/+33の間に存在するDPE配列(Downstream Promoter Elements)及び既に示されている2の可能性のある転写開始部位、INR1及びINR2(上記に引用される図1を参照のこと)を明らかにした。DPE配列はDrosophilaプロモーター中で示され、及びTATA配列を含まないそれらのプロモーター中でトランスクリプトーム組立てにおいて役割を有すると考えられる(Kadonaga, J. T. The DPE, a core promoter element for transcription by RNA polymerase II. Exp Mol Med, 34: 259−264, 2002)。この分析の結果として、本発明者は上記プロモーターの方向づけられた突然変異を行った。その目的のために、彼らは5’末端:(完全なプロモーターをクローニングするために)−1175、(ウシプロモーターとの類推により)−513及び(GGA1配列を厳密に含む)−120について行った。3’末端突然変異は完全なエクソン1及びDPE配列を含む又は含まない多様な欠損(+24,+28,+35,+71)を含む。図3は異なる断片が由来するSPARCプロモーターの2のスキームを示す。GGAボックスの位置、可能性のある転写開始部位(INR)のTATA様配列及びDPE配列が示される。SPARCプロモーター断片を構築するために使用された異なる限界が示される。5’末端を塩基−1175、−513及び−120までクローニングした;一方で3’末端から塩基を+24、+28、+35及び+71までクローニングした。GGAボックス間の欠損領域もまた示され、この欠損は断片−1175/+71Δ10に起源を与える。
d−TOPO(−1175/+28)、(配列ID番号20)はDPE配列を除外する。
e−TOPO(−513/+71)、(配列ID番号21)は完全な第一エクソンを含む。
g−TOPO(−513/+28)、(配列ID番号22)はDPE配列を除外する。
h−TOPO(−513/+24)、(配列ID番号23)はINR2配列までを含む。
i−TOPO(−120/+71)、(配列ID番号24)は完全な第一エクソンを含む。
j−TOPO(−120/+35)、(配列ID番号25)はDPE配列を含む。
k−TOPO(−120/+28)、(配列ID番号26)はDPE配列を除外する。
実施例2にしたがって得られたプロモーターをルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流のpGL3−Basicプラスミド(Promega Corp., Madison, WI, USA)のMluI/BglII、MluI/XhoI又はNheI/XhoI部位にサブクローニングした。全ての上記クローニングを制限酵素プロファイルにより及びユニバーサルプライマーT7(TACGACTCACTATAGGG;配列ID番号27);Sp6(ATTTAGGTGACACTATAG;配列ID番号28)、T3(ATTAACCCTCACTAAAGGGA;配列ID番号29)又はP2(CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA;配列ID番号30)及びP3(CTAGCAAAATAGGCTGTCCCC;配列ID番号31)でベクター(pGEM、TOPO及び/又はpGL3)をシークエンシングすることにより確認した。
上記細胞を4×104細胞/ウェルの濃度で24−ウェルプレート中にまいた。24時間後、それらを製造業者により示される条件にしたがってLipofectamine2000(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)を用いてトランスフェクトした。それぞれの処理を抗生物質を伴わない50μlのDMEM培地で0.8μgの処理プラスミドを0.1μgのpRL−CMVプラスミドと共に5分間、及び同時に50μlの同じ培地で1μlのLipofectamine2000をインキュベートして、それぞれの細胞系について少なくとも二重で行った。これらの2の調製物を混合し、及び室温で20分間インキュベートした。細胞血清を含む上記培地を除去し、PBSで洗浄し、及び200μlの高グルコースDMEMを血清なし及び抗生物質なしで添加した;続いて、リポフェクション混合物を含む100μlの培地を添加し、及びBFSで補充されたそれぞれの細胞系に対応する800μlの培養培地を4時間後に添加した。使用された細胞を5%CO2で37℃で46時間温室中で維持した。Dual Luciferase Reporter Assay Systemキット(Promega Corp., Madison, WI)をルシフェラーゼ分析のために使用した。このシステムは同じ系における2の個々のレポーター酵素の同時発現を意味し、1のみの連続分析においてFireflyツチボタル(Photinus pyralis)及びRenilla腔腸動物(Renilla reniformis)からのルシフェラーゼ酵素により生成される活性の評価を許容する(Sherf, B. A. et al., Dual Luciferase Reporter Assay: An Advanced Co−Reporter Technology Integrating Firefly and Renilla Luciferase Assays. Promega Notes Magazine: 2−9, 1996)。上記データを以下のように正規化した:
同様のプロモーター活性を有する及び実施例3Aの方法により同定される上記2のプロモーターF512及びSpdelを異なる腫瘍及び正常細胞系において評価した(実施例1中の引用を参照のこと)。結果は図4B中に示される。
これらの結果はアデノベクターにおける問題の遺伝子の発現を駆動するためのF512プロモーターの選択を許容する。
問題の遺伝子を含むシャトルプラスミドの構築を、領域(その複製のために必要な)E1及びE3におけるその遺伝子が欠損しているヒトアデノウイルス5型を含む、pADPSYシャトルベクターからはじめて行った。それから、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター及びSV40のポリアデニル化シグナル(Mariano J. Alvarez, Federico Prada, Edgardo Salvatierra, Alicia I. Bravo, Viviana P. Lutzky, Cecilia Carbone, Fernando J. Pitossi, H. Eduardo Chuluyan and Osvaldo L. Podhajcer; Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine Produced by Human Melanoma Cells Modulates Polymorphonuclear Leukocyte Recruitment and Antitumor Cytotoxic Capacity; Cancer Research 65, 5123−5132, June 15, 2005)はΔE1領域中に挿入された。特有のクローニング部位の多様性を増大させるようこのベクターを改善するために、複数のクローニング部位(MCS)を設計し及び含め、RSVプロモーターを置換して、pAd−Xpプラスミド(配列ID番号32)を得た;このベクターを複数のクローニング部位の存在を立証するためにシークエンスした。
第一段階において、E1Aタンパク質遺伝子をpAd(I)−Xp及びpAd−Xpベクター中にクローニングした。その目的のために、E1Aタンパク質cDNAをBglII及びBamHI酵素でTOPO−pCR4−E1Aベクター(配列ID番号36)から抽出し、及びpAd(I)−Xp及びpAd−XpのBglII部位に挿入し、pAd(I)−Xp−E1A(配列ID番号38)及びpAd−Xp−E1A(配列ID番号39)を作出した。第二段階において、F512をMluI及びBglIIでpGL3(−513/+35)から抽出し、及びそれをpAd(I)−Xp−E1A及びpAd−Xp−E1AのMluI及びBglII部位中にクローニングし、F512の下流のE1Aタンパク質cDNAを残した。そのようにして、pAd(I)−F512(配列ID番号40)及びpAd−F512(配列ID番号41)ベクターを得た;両方のベクター配列はpAd−センス(TGTTTTTCTCAGGTGTTTTCCG;配列ID番号42)プライマーでシークエンシングにより確認した。
hsv−TKをコードするcDNAをpAGOプラスミド(Berenstein,M., Adris, S., Ledda, F., Wolfmann, C., Medina, J., Bravo, A., Mordoh, J., Chernajovsky, Y., and Podhajcer, O. L. Different efficacy of in vivo herpes simplex virus thymidine kinase gene transduction and ganciclovir treatment on the inhibition of tumor growth of murine and human melanoma cells and rat glioblastoma cells. Cancer Gene Ther, 6: 358−366, 1999)のDNAを鋳型として及びFTK/RTK(GCCCATGGCTTCGTACCCCGGCC;配列ID番号43/GCGTCGACTCAGCCTCCCCCATCTC;配列ID番号44)プライマーを用いてPCRにより増幅した。このPCR反応の産物をTOPO−pCR4ベクター中にクローニングした。得られたTK−TOPO−pCR4プラスミド(配列ID番号45)を制限酵素での消化により及びT3(ATTAACCCTCACTAAAGGGA;配列ID番号29)及びT7(TAATACGACTCACTATAGGG;配列ID番号27)ユニバーサルプライマーを用いてシークエンシングにより確認した。
その5’末端でIRES配列につなげられたEGFPタンパク質cDNAをEcoRI及びSalI酵素での消化によりpDC315−iGFPプラスミド(Microbix Biosystems Inc., Toronto, Ontario, CanadaからのpDC315市販プラスミドから改変されたプラスミド)から抽出した。上記EcoRI部位をKlenow酵素で埋め、及びIRES−EGFP−SalI断片を、事前にEcoRV及びSalI酵素で消化した実施例4中に開示されるものにしたがって得られたpAd(I)−F512ベクター中にサブクローニングした。このクローニングから生ずるベクター、pAd(I)−F512−EGFP(配列ID番号49及び配列ID番号50)の取得を制限酵素での消化及びpAd−センス(TGTTTTTCTCAGGTGTTTTCCG;配列ID番号42)及びpAd−アンチセンス(CACAAATTTCACAAATAAAGCATTT;配列ID番号48)プライマーでのシークエンシングにより確認した。
実施例4中に開示されるものにしたがって得られたpAd−F512プラスミド(配列ID番号41)をFspI酵素で直線化し、及びE3領域における欠損を伴うmu2.6〜mu100を含む、ClaI酵素で事前に制限酵素処理したアデノウイルス5型断片で共に共トランスフェクトした。共トランスフェクションはリン酸カルシウムの手段(Ferrari, C. C., Depino, A. M., Prada, F., Muraro, N., Campbell, S,, Podhajcer, O., Perry, V. H., Anthony, D. C., and Pitossi, F. J. Reversible demyelination, blood−brain barrier breakdown, and pronounced neutrophil recruitment induced by chronic IL−1 expression in the brain. Am J Pathol, 165: 1827−1837, 2004)により293細胞で及び293細胞においてNevins et al.プロトコル(Nevins, J. R. Definition and mapping of adenovirus 2 nuclear transcription. Methods Enzymol, 65: 768−785, 1980)にしたがって行った。上記2のトランスフェクトされた断片Ad−F512(配列ID番号51及び配列ID番号52)のアデノウイルス領域の間の相同組換えにより、上記組換えアデノウイルスが得られた。Ad−F512構築アデノウイルススキームは図5A中に示される。
実施例7中に示されるのと同様の方法で、実施例5中で得られたpAd(I)−F512−TK(配列ID番号46及び配列ID番号47)プラスミドをFspI酵素で直線化し、及び領域E3における欠損を伴うmu2.6〜mu100を含むClaI酵素で事前に制限酵素処理したAd5断片と共に共トランスフェクトした。共トランスフェクションをリン酸カルシウム法の手段(Ferrari, C. C. et al., 2004)により293細胞において及び293細胞においてNevinsのプロトコル(Nevins, J. R.,;1980)にしたがって行った。上記2の共トランスフェクトされた断片のアデノウイルス領域の間の相同組換えにより、Ad(I)−F512−TK(配列ID番号53及び配列ID番号54)組換えアデノウイルスを得た。そのスキームは図5A中に示される。
実施例6中で得られたpAd(I)−F512−EGFPプラスミド(配列ID番号49及び配列ID番号50)を実施例7及び8でのようにFspI酵素で直線化したが、この場合は、共トランスフェクションはE1領域を除いて、しかしE3領域を含むAd5ゲノム全体を含むもう一つのプラスミド、JM17(Microbix Biosystems Inc., Toronto, Ontario, Canada)と共に行った。共トランスフェクションをリン酸カルシウム法の手段(Ferrari, C. C. et al., 2004)により293細胞において及び293細胞においてNevinsのプロトコル(Nevins, J. R.,;1980)にしたがって行った。上記2の共トランスフェクトされた断片のアデノウイルス領域の間の相同組換えにより、Ad(I)−F512(E3)(配列ID番号55及び配列ID番号56)組換えアデノウイルスを得、そのスキームは図5A中に示され、及びそれは元のウイルス(Ad5)のE3領域を含む。
in vitro分析のために、実施例7、8及び9で得られたアデノウイルスを使用した。使用された細胞系は既に実施例1において開示されている。
本発明において使用されたウイルスはAd5に基づき、それを介するエントランスはCAR受容体(coxsackie−adenovirus receptor)及びインテグリン(Kanerva, A. and Hemminki, A. Adenoviruses for treatment of cancer. Ann Med, 37: 33−43, 2005)を通る。CAR発現は異種であるとすれば、翻訳分析はβ−ガラクトシダーゼ酵素を発現する非複製アデノウイルス(Ad−β−gal)を伴って異なる細胞系で行われた。
要約すると、試験された細胞系の感染能はSB2>T84>HeLa>WI−38VA>WI−38>LoVo>BAEC>A375Nであろう。
本発明にしたがって構築されたアデノウイルス(CRAds)の腫瘍崩壊能を試験するために、それらをin vitroで異なるSPARC発現レベルを有する細胞を感染するために使用した。詳細には、SB2黒色腫、A375N及びMelJ系;WI−38、WI−38VA及びHFL−1線維芽細胞系;T84及びLoVo結腸系;HeLa頸部系;BAEC内皮系;及び正常間充織細胞を使用した。Ad5−wt(野生型)をコントロールとして使用した。上記異なる腫瘍系をAd−F512(配列ID番号51及び配列ID番号52)、Ad(I)−F512−TK(配列ID番号53及び配列ID番号54)、Ad−(I)F512(E3)(配列ID番号55及び配列ID番号56)及びAd5−wtアデノウイルスで感染させた。アデノウイルス溶解効果を紫色結晶で実験後プレートに接着したままである細胞を染色することにより及びMTT分析の手段により代謝活性の定量化をとおして評価した。
異なる腫瘍系におけるCRAdsの複製能を評価するために、ウイルス収率についての分析を行った。その結果は図8中に示される。
異なる細胞系におけるウイルス生成についての一般的な進行は以下に開示される:
0日目、100000細胞を6ウェルプレートのそれぞれのウェル中にまいた。1日目、細胞をハイグルコースDMEM培地2%BFS中でウェル当たり300μlの体積中で50MOIで感染させた。感染は少なくとも2の攪拌操作で37℃で1時間行った。続いて、上記培地を除去し、PBSで2回洗浄し、及び1mlの10%BFS培地を添加した。3日後、細胞を室温で15分間維持し、及び培地と共に取り上げた。上清をエッペンドルフ管に移し、及び3の凍結/融解周期を液体窒素を用いて行った。続いて、それを4500rpmで遠心分離し、及び前記上清の1/10連続希釈をハイグルコースDMEM培地5%BFS及び0.01M HEPES中で行った。100μlのそれぞれの希釈物を20000細胞/ウェルの割合で293細胞を前日にまいた96ウェルプレートの1のウェル中にまいた(六重)。5日後、上記細胞を4%パラフォルムアルデヒドで固定し、及び紫色結晶溶液で染色した。
上記に示されるように、非複製アデノウイルスは複製を開始するために、トランスのE1Aタンパク質の供給を必要とする。非複製アデノウイルスが増幅されるとき、それらはE1Aタンパク質を構成的に発現するよう改変された293細胞で使用されたが、このタンパク質はまた複製アデノウイルスによっても供給されうる。Ad−F512及び非複製アデノウイルス(Ad−β−gal)の協同を研究するために、T84結腸細胞を一定量のAd−β−gal(MOI10)及び増大する量のAd−F512に感染させた。Ad−F512が増大するとき青色染色された細胞における増大が観察され、Ad−β−galウイルスにおける局所増大を表すので、Ad−F512は非複製アデノウイルスを補完することができ、その複製及び近隣の細胞をとおした分布を許容する。図9はT84結腸細胞における異なる分析されたMOIsについてのβgalの染色を示す。
(Veterinary College of the University of La Plataにより提供される)6−8週齢のAthymic雄N:NTH(S)−nuマウスを分析のために使用した。3の異なるin vivo分析を本発明にしたがって得られた組換えアデノウイルスを用いて行った:2の分析はAd−F512で、及び1はAd−(I)F512−TKで。
図10AはAd−F512−TK CRAdを用いた分析における腫瘍成長曲線を示し、ここで投与されたCRAd注入及びガンシクロビル投与もまた示される。図10BはAd−F512での分析において使用されたマウスにおける腫瘍成長曲線を示す。図10Cは(Ad−β−galを注入された)コントロールマウスにおける及びAd−F512 CRAdで処置されたマウスにおける腫瘍領域の写真である。図10Dは処置の開始から14日後にいくつかの動物になされた組織学的切断の写真を示す。最後に、図10E及び10FはAd−F512で実現された両方の分析についてのKaplan−Meier曲線(生存率%)である。
Ad−F512での両方の分析における生存曲線(図10E及び10F)は互いに非常に類似しており、及びそれらはコントロールとは顕著に異なる。
a)腫瘍系の分析
この段階では、実施例11中に示されるように行われた以前の分析は黒色腫、結腸、胸部及びすい臓癌の他の腫瘍系を試験することにより拡大された。上記細胞に対するウイルスの細胞病理学的効果をアデノウイルスでの感染後10日後にウェルに接着したままであった細胞を紫色結晶で染色することにより分析した。結果は図11中に示される。(Dr. Estela Medrano, Houston, TXにより親切に提供された)Mel888黒色腫細胞を上記実施例11中で試験されるSB2及びIIB−Mel−J細胞(前者はDr. Estela Medrano, Houston, TXにより、及び後者はLedda et al., Suppression of SPARC expression by antisense RNA abrogates the tumorigenicity of human melanoma cells. Nat Med. 1997 Feb; 3(2):171−6により親切に提供された)での分析のための濃度と同じウイルス濃度でアデノウイルスにより溶解した。これらの新規分析中に含まれた2の結腸系HT29(ATCC番号HTB−38)及びCaCO−2(ATCC番号HTB−37)もまた構築されたCRAdsに対する結腸細胞のかかりやすさを示す。MIA−PaCa−2すい臓癌系(ATCC番号CRL−1420)は5×107vp/mlアデノウイルス濃度に感受性であり、一方4の分析された578T胸部系(ATCC番号HTB−126)、T−47D(ATCC番号HTB−133)、MCF−7(ATCC番号HTB−22)及びMDA−231(ATCC番号HTB−26)はCRAdsにより影響されないことがわかった(図11を参照のこと)。全ての場合において、野生型ウイルス(Ad5−wt)は全ての腫瘍細胞を消去することができる。
臨床分析において腫瘍崩壊性アデノウイルスを用いる必要性の一つは、それが腫瘍細胞において活性であり、及び正常細胞において不活性であるはずであることである。3の構築された腫瘍崩壊性ウイルスの正常細胞における減衰レベルを確立するために、それらの活性を1パネルの前記細胞において分析した。正常メラニン形成細胞、結腸及び胸部細胞系並びに線維芽細胞、ケラチン生成細胞及びヒト微小内皮細胞を含めた。5×106ウイルス粒子/mlのAd−F512、Ad(I)−F512−TK又はAd(I)−F512(E3)での感染後10日後、メラニン形成細胞の生存力は95%超であり、一方100%の細胞はAd−wtにより溶解された(図12Aを参照のこと)。(図12Bを参照のこと)腫瘍崩壊性ウイルスはまた正常CCD841結腸細胞(ATCC番号CRL−1790)及び正常MCF−12A胸部細胞(ATCC番号CRL−10782)に対して影響を有しなかったことが示された(図12Cを参照のこと)。これらの系はSPARCを発現を有しない(以下の表3を参照のこと)。SPARC発現を有する(Isaiah Fidler, Houston, TXにより親切に提供された)hMEC−1ヒト微小内皮細胞もまた分析され、及びそれらは高いMOIのアデノウイルスにより溶解されることが留意された(図12Dを参照のこと)。続いて、ケラチン生成細胞又は線維芽細胞のような皮膚中に存在する他の細胞成分を分析した。前者はSPARCを生成せず、一方後者はA375N腫瘍細胞系に比較されるとき中程度のSPARC発現を有する(以下の表3を参照のこと)。ケラチン生成細胞(Craveri Laboratoryにより親切に提供されたHaCaT)に対する、CCD1140線維芽細胞(ATCC番号CRL−2714)に対する及びMalme−3(ATCC番号HTB−102)に対するウイルス効果は図12E中に示される。ケラチン生成細胞も線維芽細胞系もアデノウイルスによって溶解されなかったことが留意された。
腫瘍間質細胞(内皮及び線維芽細胞)でのin vitro分析は、高い又は中程度のSPARC発現でさえも上記アデノウイルスは腫瘍細胞におけるのと同じ活性を有しなかったことを示した。 本発明者の仮説にしたがって、正常細胞はウイルス複製に対してより抵抗性を有する。この場合、毒性遺伝子を添加することはSPARCプロモーターが活性であるそれらの細胞において特定の様式で溶解能を高めることを許容しうる。したがって、Ad(I)−F512−TKでのin vitro分析を行い、そこで、上記細胞をまたガンシクロビル(GCV)プロドラッグを添加することにより処理した。第一に、GCVを添加することはSB2黒色腫細胞におけるウイルス溶解を改善することが留意された(図13Aを参照のこと);この改善は、GCVの添加が腫瘍崩壊性ウイルス活性の開始72時間後に開始する場合、より有効である。内皮細胞について、それらはプロドラッグのみの存在に対して感受性である(図13B中の左側のはじめの3の棒を参照のこと)。750のMOIで及びGCV50μM又は100μMの存在下でウイルスを添加することはほとんど全ての細胞の消去を許容する(図13B中の最後の2のカラム)。他の分析された内皮細胞はウシ大動脈のものであった(BAEC, Helene Sage, Seattle, USAにより親切に提供された)。しかしながら、A375Nより高いSPARC値を発現する及びF512ヒトプロモーターが非常に活性である(上記実施例1及び3Bを参照のこと)これらの細胞はAd5キャップシッドで適切に感染されない。hMEC−1と同様に、上記細胞はプロドラッグに感受性であるが、ウイルスに加えてGCVプロドラッグの存在はウイルス単独では効果を有しないウイルス濃度で細胞の消去を許容する(図13Cを参照のこと)。
in vivo分析を動物(6−8週齢無胸腺症雄マウスN:NIH(S)−nu)で行い、それらに腫瘍及び間質細胞を含む混合された黒色腫腫瘍を注入した。続いて、これらの腫瘍を黒色腫細胞のみの腫瘍についてのものと同じプロトコルを用いて本発明にしたがって得られたCRAdsで処置した。
同じ結果は分析を繰り返すとき得られた(データは示されていない)。
Claims (16)
- 配列番号1の配列を持つ核酸プロモーターから成る単離DNA。
- 前記プロモーターの配列が、異種遺伝子に作用可能な状態で連結されている、請求項1に記載の単離DNA。
- 照射応答配列、低酸素症応答配列又はフリーラジカル応答配列から選ばれる調節配列をさらに含む、請求項1又は2に記載の単離DNA。
- 前記異種遺伝子は、治療用遺伝子である、請求項2に記載の単離DNA。
- 前記異種遺伝子は、E1A遺伝子、自殺遺伝子、アデノウイルスゲノムE3領域、及びインターロイキンをコードする遺伝子からなる群から選ばれる、請求項2に記載の単離DNA。
- 請求項1に記載の単離DNA、及び該単離DNAに作用可能な状態で連結さた異種遺伝子を含む発現ベクター。
- 前記ベクターは、プラスミド又はウイルスベクターである、請求項6に記載の発現ベクター。
- 上記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスである、請求項7に記載の発現ベクター。
- 上記ウイルスベクターは、条件付きで複製する腫瘍崩壊性アデノウイルスである、請求項7に記載の発現ベクター。
- 前記異種遺伝子は治療用遺伝子である、請求項6に記載の発現ベクター。
- 前記治療用異種遺伝子は、E1A蛋白遺伝子である、請求項10に記載の発現ベクター。
- 自殺遺伝子をさらに含む、請求項6に記載の発現ベクター。
- 上記自殺遺伝子は、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子(hsvTK)である、請求項12に記載の発現ベクター。
- アデノウイルスゲノムE3領域をさらに含む、請求項6に記載の発現ベクター。
- 医薬として好適な担体中に請求項6に記載の発現ベクターを含む医薬組成物。
- 有効量の請求項15に記載の医薬組成物を含む、腫瘍を患う患者において該腫瘍を治療するための医薬。
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