JPH0320239B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はヒトの肺癌等の診断及び治療に有用な
モノクローナル抗体に関する。 （従来の技術） Kohler等の方法に基づき、癌に対するモノク
ローナル抗体について種々の研究が行なわれてお
り、ヒトの癌の診断に利用しようとする試みが多
くなされている。 （発明が解決しようとする問題点） 現在のところ、ヒトの肺癌の診断用のモノクロ
ーナル抗体の作成は多く試みられているが、その
特異性において実用的価値のあるモノクローナル
抗体はまだ見出されていない。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、ヒトの癌特に肺癌の組織診断等
に有用な実用化可能なモノクローナル抗体につい
て鋭意研究を行なつた結果、本発明を完成した。 即ち本発明は、 「(1) ヒト肺小細胞癌に存在する25×103ダル
トンの分子量のタンパク質抗原と抗原抗体反応
をし、次の性質を有するIgG1アイソタイプに
属するモノクローナル抗体NE−25。 １ ヒトの肺小細胞癌、神経膠腫及び神経芽細
胞腫と反応する。 ２ ヒトの神経、甲状腺及び副腎の正常組織と
反応する。 ３ ヒトの肺、食道、胃、小腸、大腸、腎臓の
正常組織と反応しない。 (2) ヒトの正常上皮細胞及び上皮由来癌細胞に
存在する35×103ダルトンの分子量のタンパク
質抗原と抗原抗体反応をし、次の性質を有する
IgG1アイソタイプに属するモノクローナル抗
体PE−35。 １ ヒトの肺癌、胃癌、大腸癌、乳癌、肝胆道
癌と反応する。 ２ ヒトの神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、リ
ンパ腫と反応しない。 ３ ヒトの肺、甲状腺、食道、胃、小腸、大腸
の正常上皮組織と反応する。」 に関するものである。 なお、以下の説明において述べる細胞、組織等
は特にことわりのない限りヒトの細胞、組織等を
示す。 本発明のNE−25抗体及びPE−35抗体のイムノ
グロブリン（Ig）のアイソタイプはIgG1である。
又、NE−25抗体が反応する抗原（NE−25抗原）
は肺小細胞癌に存在し、NE−25抗原は25×103ダ
ルトンの分子量のタンパク質抗原である。一方、
PE−35抗体が反応する抗原（PE−35抗原）は正
常上皮細胞及び上皮由来癌細胞に存在し、PE−
35抗原は35×103ダルトンの分子量のタンパク質
抗原である。 NE−25抗体の各種培養細胞株に対する反応性
については、肺小細胞癌に関しては大部分の細胞
株で陽性を示し、神経性腫瘍（神経膠腫及び神経
芽細胞腫）に関してはほとんど全ての細胞株で陽
性を示す。又、NE−25抗体の各種腫瘍組織に対
する反応性については、肺小細胞癌に関しては大
部分の症例で陽性を示し、神経性腫瘍（神経膠腫
及び神経芽細胞腫）に関してはほとんど全ての症
例で陽性を示し、肺扁平上皮癌、肺腺癌、肺大細
胞癌に関してはほとんどの症例で陰性を示す。
NE−25抗体の正常組織に対する反応性について
は神経、甲状腺及び副腎等と反応性がみられ、
肺、食道、胃、小腸、大腸、腎臓等とは反応性が
認められない。 一方、PE−35抗体の各種培養細胞株に対する
反応性については、肺小細胞癌、肺扁平上皮癌、
肺腺癌に関しては大部分の細胞株で陽性を示し、
胃癌、大腸癌、膵臓癌、肝胆道癌、乳癌、腎癌に
関してはほとんどの細胞株で陽性を示すが、神経
性腫瘍（神経膠腫及び神経芽細胞腫）、肉腫、リ
ンパ種に関してはほとんど全ての細胞株で陰性を
示す。又、PE−35抗体の各種腫瘍組織に対する
反応性については、肺癌、胃癌、大腸癌、膵臓
癌、肝胆道癌、乳癌に関してはほとんどの症例で
陽性を示し、神経性腫瘍（神経膠腫及び神経芽細
胞腫）肉腫、リンパ腫に関してはほとんど全ての
症例で陰性を示す。PE−35抗体の正常組織に対
する反応性については、気管支、食道、胃、小
腸、大腸等の上皮や甲状腺と反応がみられた。 NE−25抗体はその正常組織及び腫瘍組織にお
ける反応性より神経細胞及び神経内分泌細胞への
分化に伴つて表現される分化抗原を確認している
と考えられ、一方、PE−35抗体は汎上皮性抗原
とでも言うべき抗原に反応性を示し、神経内分泌
細胞への分化を示した肺癌とされる肺小細胞癌の
大部分には両抗原が認められた。NE−25抗体及
びPE−35抗体は肺癌の免疫組織学的検査に有用
な抗体である。 本発明のモノクローナル抗体は公知の方法例え
ばKohlerとMilsteinの方法［Nature256、495−
497（1975）］やUedaらの方法［Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 78、5122−5126（1981）］に従つて作製
することができる。 例えば本発明のモノクローナル抗体は次のよう
にして製造することができる。本発明のモノクロ
ーナル抗体が認識する抗原（例えば肺癌細胞、神
経性腫瘍細胞等）でマウス又はラツト等の動物を
免疫し、免疫された動物から抗体産生細胞を得、
これとミエローマ細胞とを融合し、得られたハイ
ブリドーマから本発明のモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマを選択し、これを培養し抗
体を回収する。免疫法、融合法、ハイブリドーマ
の選択、抗体の回収等は公知の常法により行なう
ことができる。 更に詳しくは、例えば次のようにして本発明の
モノクローナル抗体を製造することができる。 まず、マウスを肺癌細胞、神経性腫瘍細胞等で
免疫する。免疫する動物はマウスに限らず、ラツ
ト等のネズミ科の動物又はその他の動物を使用し
てもよいが、通常はマウスを用いることが好まし
い。この免疫用マウスとしては、BALB／Ｃ系
マウス、BALB／Ｃ系マウスと他系マウスとの
F1マウス等が用いられる。 マウスに対して肺癌細胞等を数日〜数週間おき
に数回接種する。その後マウスより脾臓を摘出
し、常法により脾細胞（抗体産生細胞を含む）を
採取する。 ミエローマ細胞としては同種の動物のものを用
いることが好ましく、マウス脾細胞を融合の相手
とする場合には、マウスミエローマ細胞を用い
る。具体的にはMOPC−21、NS／１［Nature.
256．495−497（1975）］、SP2／Ｏ−Ag14
［Nature、277．131−133［（1979）］、S194／５、
XXO.BU.1［J.Exp.Med.148．313−328（1978）］
などが用いられる。 脾細胞とミエローマ細胞は１対１〜10対１の割
合で混合し、融合は例えばNaCl（約0.85％）、ジ
メチルスルホキシド［10〜20％（Ｖ／Ｖ）］およ
び分子量1000〜6000のポリエチレングリコールを
含むリン酸緩衝液（PH7.2〜7.4）中で行う。 融合は例えば、両細胞を35〜37℃で１〜３分間
インキユベートすることによつて行う。 ハイブリドーマの選択は、例えばヒポキサンチ
ン（1.3〜1.4mg／dl）、アミノプテリン（18〜20μ
ｇ／dl）、チミジン（375〜400μｇ／dl）、ストレ
プトマイシン（50〜100μｇ／dl）、ペニシリン
（50〜100単位／ml）、グルタミン（3.5〜4.0ｇ／
）、牛胎児血清（10〜20％）を含む基礎培地を
用い、成育してくる細胞として選択する。 基礎培地としては、動物細胞の培養に一般に使
用されているRPMI1640倍地、EagleのMEM倍
地などが用いられる。 ハイブリドーマのクローン化は限界希釈法にて
少なくとも３回繰返して行うのが好ましい。 本発明の抗体を産生するハイブリドーマの選択
は、分泌される抗体の反応性を調べ前記と同じ反
応性を有する抗体を産生するハイブリドーマを選
択し、その認識する抗原分子が前記分子量を示す
ことを確認することにより行なわれうる。 ハイブリドーマを通常の動物細胞の培養と同様
にして培養すれば、培地中に本発明の抗体が生産
される。例えば、２〜５×106のハイブリドーマ
細胞をストレプトマイシン（50〜100μｇ／ml）、
ペニシリン（50〜100単位／ml）、グルタミン
（3.5〜4.0ｇ／）、牛胎児血清（10〜20％）を含
むRPMI1640培地10〜20mlを用い、フラスコ内で
95％CO2−５％O2存在下、35〜37℃、３〜７日間
培養することによつて培養液中に抗体が分泌、蓄
積される。 またハイブリドーマ細胞をプリスタン
（Pristane）処理のヌードマウスまたはBALB／
ｃマウスの腹腔内に移植して増殖することにより
腹水中に本発明の抗体を蓄積させることができ
る。即ち、これらマウス腹腔内にプリスタン
（Pristane、２、６、10、14tetramethyl
pentadecane、米国アルドリツチ社製）0.5〜１ml
を注射し、その後、２〜３週目に腹腔に５〜10×
106個のハイブリドーマ細胞を移植する。通常７
〜10日後に腹水が貯溜し、これを採取する。 本発明のモノクローナル抗体の 125I標識した
肺小細胞癌SCLC−SAを用いた免疫沈降反応に
よる分子量測定では、NE−25抗原は25×103ダル
トンを呈し、又、PE−35抗原は35×103ダルトン
を呈した。 免疫沈降反応： 標的細胞として肺小細胞癌培養株SCLC−SA2
×107個を200μｇのアイオドゲン存在下で0.5ｍCi
のNa 125Iで標識する。 これら標識した細胞を0.1〜１％（Ｖ／Ｖ）NP
−40を用いて可溶化し、その細胞抽出物（１〜10
×105cpm）をモノクローナル抗体（１〜10μ）
と４℃にて６〜12時間反応させ、第２次抗体とし
て５〜20μの家兎抗マウスイムノグロブリン
（Cappel社、米国）と４℃で30分間反応させ、さ
らに４℃で１時間スタフイロコツカス・アウレウ
ス（Cowan Ｉ株）と反応させ免疫沈降物を作製
し、SDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に
より解析する。 本発明モノクローナル抗体の生物学的活性は実
子例に示した。実施例中に用いたマウス混合血球
吸着試験［Mouse−mixed hemadsorption
assay、Ｍ−MHA］法は下記の方法に従い、マ
イクロプレート［Falcon社、3040］に単層細胞
培養または浮遊細胞を付着させた標的細胞への指
示細胞の付着の有無で観察する。指示細胞として
は、ヒツジ赤血球とマウス抗ヒツジ赤血球抗体を
反応させた後、さらに家兎抗マウスイムノグロブ
リン血清を反応させたものを用いる。 マウス混合血球吸着試験［Ｍ−MHA］： Ｍ−MHAはEspmarkとFagreusの原法
（Acta.Pathol.Microbiol.Scand.Suppl.154 258
−262、1962）を改良して行う。 指示赤血球の作製法は以下の通りである。 先滌羊赤血球２％浮遊液と等量の1000倍希釈マ
ウス抗羊赤血球抗体（BALB／ｃマウスに羊赤
血球を過免疫して作製）とを24℃にて45分間反応
させ先滌後再び２％浮遊液として等量の200倍希
釈家兎抗マウスイムノグロブリン（cappel社、米
国）を24℃にて45分間反応させた後、２回先滌後
再び２％浮遊液としたものをいわゆるＭ−MHA
の指示赤血球として用いる。 Ｍ−MHA検査法の手法としては、被検索細胞
は、ハイブリドーマ細胞培養上清またはハイブリ
ドーマ細胞接種BALB／ｃマウスもしくは
BALE／ｃ由来ヌードマウス腹水と24℃にて45分
間反応させ、抗体を先滌後除去後、0.2％指示羊
赤血球と24℃にて45分間反応させ、軽く一度リン
酸緩衝液生理食塩水（PBS）で先滌後光学的顕
微鏡下、指示赤血球のロゼツト形成の有無にて判
定する。 又、実施例中、本発明のモノクローナル抗体選
定のための各種組織の染色及び本発明のモノクロ
ーナル抗体による各種組織の染色は、Hsu、S.
M.等の方法（J.Histochem.Cytochem.29、577〜
580、1981）に準じてアビジン−ビオチン−ペル
オキシダ−ゼ複合体法（ABC法）によるアセト
ン固定、凍結切片の染色により行なつた。即ち肺
癌組織等の凍結切片を10％正常豚血清を含む
PBSにて30分間処理した後、抗体を含む液体と
室温で２時間反応させ、更に４℃で一夜反応させ
た。そしてPBSで15分間洗滌した後、ビオチン
化抗マウス免疫グロブリン（7.5μｇ／ml）にて30
分間処理した。これをPBSで15分間洗滌した後、
アビジンDH−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合
体と室温で30分間処理した。これをPBSで15分
間洗滌した後ジアミノベンチジン溶液（50mgジア
ミノベンチジン、0.006％H2O2、トリスバツフア
ーPH7.6）にて５〜10分間反応させた。細胞核を
ヘマトキシリンにて染色後、通常の方法で封入し
検鏡した。 （実施例） 実施例 １ （PE−35抗体の製造） ８週令の雌BALB／ｃマウスを初回５×106個
の肺小細胞癌培養株（肺小細胞癌培養株細胞
SCLC−SAとSCLC−SMを１：１に混合した細
胞集団）で皮下に免疫し、その１ケ月後より２週
間の間隔で２回腹腔内に各々１×107個の細胞を
注入し免疫を行つた。なお、肺小細胞癌培養株
SCLC−SA及びSCLC−SMはいずれも愛知県が
んセンターで樹立した株である。 最終免疫より３日後に脾臓を取り出し、ステン
レスメツシユを通すことにより細胞懸濁液を作製
した。この1.0×108個の脾細胞と2.0×107個の８
−アザグアニン耐性ミエローマ細胞P3−NS1−
Ag4／１（NS／１）を混合し、遠沈後沈渣に１ml
の47.5％ポリエチレングリコール（平均分子量
4000）を加え、２分間ゆるやかに撹拌した。洗浄
後、細胞混合液を10％牛胎児血清を含むRPMI培
地（完全RPMI培地）に懸濁し、96ウエルマイク
ロ培養プレートに１ウエル当り106個の割合で0.1
mlずつ分注した。24時間後、ヒポキサンチン
100μM、アミノプテリン0.4μM、チミジン16μM
を含む完全RPMI培地（HAT培地）を0.1ml加え
た。 培養開始後週２回培養上清0.1mlを捨て、HAT
培地0.1mlを加えた。14日後よりウエルに融合細
胞の出現が観察されはじめた。 その後各ウエルの培養上清を取り出し、前述の
Ｍ−MHA法により肺小細胞癌と反応する抗体が
産生されているか否かを確かめ、抗体産生が陽性
を示したウエル中のハイブリドーマを限界希釈法
により３回クローニングを繰り返した。即ち、細
胞を50個／mlあるいは10個／mlに希釈し、あらか
じめフイダー細胞がまかれた96ウエルマイクロ培
養プレートに0.1mlずつ分注し、HT培地
（100μMヒポキサンチンと16μMチミジンを含む
完全RPMI培地）により２週間培養した。１ウエ
ルに１個のハイブリドーマコロニーが形成された
場合をクローンとして取り出した。これらクロー
ンから、前述のＭ−MHA法及びABC法により、
前記PE−35抗体の欄に示した各細胞及び組織に
対する反応性を有する抗体を分泌しているハイブ
リドーマクローンを選択した。このようにした得
られたハイブリドーマを産生する抗体をPE−35
抗体と命名した。 このハイブリドーマをマウスの腹腔内に投与す
る次の方法で増殖させPE−35抗体を量産した。
即ち、マウス腹腔内にプリスタン0.5ml注射し、
その後２週目の腹腔に５×106個のハイブリドー
マ細胞を移植し、10日後に腹水を採取した。 実施例 ２ （NE−25抗体の製造） ８週令の雌BALB／ｃマウスに手術材料より
得られた神経芽細胞腫細胞（＃1134）５×106個
を皮下に注入し、１ケ月後より２週間の間隔で２
回腹腔内に各々１×107個の細胞を注入し免疫を
行つた。 最終免疫より３日後に脾臓を取り出し、ステン
レスメツシユを通すことにより細胞懸濁液を作製
した。この５×107個の脾細胞と１×107個の
NS／１を混合し、実施例１と同様にして細胞融
合、クローン化を行ない、前述のＭ−MHA法及
びABC法により、前記NE−25抗体の欄に示した
各細胞及び組織に対する反応性を有する抗体を分
泌しているハイブリドーマクローンを選択した。
このようにして得られたハイブリドーマの産生す
る抗体をNE−25抗体と命名した。このハイブリ
ドーマを実施例１と同様にして培養し、抗体を量
産した。 実施例 ３ 各癌及び正常組織又は細胞とNE−25抗体、PE
−35抗体との反応を調べるために、前記Ｍ−
MHA法及びABC法により試験を行つた。結果を
表１、表２及び表３に示した。 【表】 【表】 【表】 【表】 実施例 ４ 本発明のモノクローナル抗体のイムノグロブリ
ンのアイソタイプを知るため、本発明のモノクロ
ーナル抗体を寒天ゲル内で、マウスIgの各アイソ
タイプ（IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、
IgG3）に対するウサギ抗血清に対して沈降反応
を行なつた。 その結果、本発明のモノクローナル抗体NE−
25及びPE−35はいずれもIgG1と判明した。 実施例 ５ 実施例１で用いた肺小細胞癌培養株に対する反
応性をＭ−MHA法により検討したところNE−
25抗体及びPE−35抗体の反応性は、いずれの場
合も、ヌラミニダーゼ（neuraminidase）で処理
したものでは変化がなく、又、100℃、５分処理
により反応性が失活した。 以上の結果よりNE−25抗体及びPE−35抗体は
いずれもタンパク質抗原を認識する抗体であるこ
とがわかる。 実施例 ６ 前記の免疫沈降反応によりNE−25抗原とPE−
35抗原の分子量を測定した所、NE−25抗原は25
×103ダルトンを呈し、又、PE−35抗原は35×
103ダルトンを呈した。 （発明の効果） 本発明のモノクローナル抗体は肺癌の小細胞癌
と非小細胞癌の免疫組織学的鑑別に特に有用であ
る。又、肺小細胞癌治療への応用可能な抗体であ
る。
モノクローナル抗体に関する。 （従来の技術） Kohler等の方法に基づき、癌に対するモノク
ローナル抗体について種々の研究が行なわれてお
り、ヒトの癌の診断に利用しようとする試みが多
くなされている。 （発明が解決しようとする問題点） 現在のところ、ヒトの肺癌の診断用のモノクロ
ーナル抗体の作成は多く試みられているが、その
特異性において実用的価値のあるモノクローナル
抗体はまだ見出されていない。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、ヒトの癌特に肺癌の組織診断等
に有用な実用化可能なモノクローナル抗体につい
て鋭意研究を行なつた結果、本発明を完成した。 即ち本発明は、 「(1) ヒト肺小細胞癌に存在する25×103ダル
トンの分子量のタンパク質抗原と抗原抗体反応
をし、次の性質を有するIgG1アイソタイプに
属するモノクローナル抗体NE−25。 １ ヒトの肺小細胞癌、神経膠腫及び神経芽細
胞腫と反応する。 ２ ヒトの神経、甲状腺及び副腎の正常組織と
反応する。 ３ ヒトの肺、食道、胃、小腸、大腸、腎臓の
正常組織と反応しない。 (2) ヒトの正常上皮細胞及び上皮由来癌細胞に
存在する35×103ダルトンの分子量のタンパク
質抗原と抗原抗体反応をし、次の性質を有する
IgG1アイソタイプに属するモノクローナル抗
体PE−35。 １ ヒトの肺癌、胃癌、大腸癌、乳癌、肝胆道
癌と反応する。 ２ ヒトの神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、リ
ンパ腫と反応しない。 ３ ヒトの肺、甲状腺、食道、胃、小腸、大腸
の正常上皮組織と反応する。」 に関するものである。 なお、以下の説明において述べる細胞、組織等
は特にことわりのない限りヒトの細胞、組織等を
示す。 本発明のNE−25抗体及びPE−35抗体のイムノ
グロブリン（Ig）のアイソタイプはIgG1である。
又、NE−25抗体が反応する抗原（NE−25抗原）
は肺小細胞癌に存在し、NE−25抗原は25×103ダ
ルトンの分子量のタンパク質抗原である。一方、
PE−35抗体が反応する抗原（PE−35抗原）は正
常上皮細胞及び上皮由来癌細胞に存在し、PE−
35抗原は35×103ダルトンの分子量のタンパク質
抗原である。 NE−25抗体の各種培養細胞株に対する反応性
については、肺小細胞癌に関しては大部分の細胞
株で陽性を示し、神経性腫瘍（神経膠腫及び神経
芽細胞腫）に関してはほとんど全ての細胞株で陽
性を示す。又、NE−25抗体の各種腫瘍組織に対
する反応性については、肺小細胞癌に関しては大
部分の症例で陽性を示し、神経性腫瘍（神経膠腫
及び神経芽細胞腫）に関してはほとんど全ての症
例で陽性を示し、肺扁平上皮癌、肺腺癌、肺大細
胞癌に関してはほとんどの症例で陰性を示す。
NE−25抗体の正常組織に対する反応性について
は神経、甲状腺及び副腎等と反応性がみられ、
肺、食道、胃、小腸、大腸、腎臓等とは反応性が
認められない。 一方、PE−35抗体の各種培養細胞株に対する
反応性については、肺小細胞癌、肺扁平上皮癌、
肺腺癌に関しては大部分の細胞株で陽性を示し、
胃癌、大腸癌、膵臓癌、肝胆道癌、乳癌、腎癌に
関してはほとんどの細胞株で陽性を示すが、神経
性腫瘍（神経膠腫及び神経芽細胞腫）、肉腫、リ
ンパ種に関してはほとんど全ての細胞株で陰性を
示す。又、PE−35抗体の各種腫瘍組織に対する
反応性については、肺癌、胃癌、大腸癌、膵臓
癌、肝胆道癌、乳癌に関してはほとんどの症例で
陽性を示し、神経性腫瘍（神経膠腫及び神経芽細
胞腫）肉腫、リンパ腫に関してはほとんど全ての
症例で陰性を示す。PE−35抗体の正常組織に対
する反応性については、気管支、食道、胃、小
腸、大腸等の上皮や甲状腺と反応がみられた。 NE−25抗体はその正常組織及び腫瘍組織にお
ける反応性より神経細胞及び神経内分泌細胞への
分化に伴つて表現される分化抗原を確認している
と考えられ、一方、PE−35抗体は汎上皮性抗原
とでも言うべき抗原に反応性を示し、神経内分泌
細胞への分化を示した肺癌とされる肺小細胞癌の
大部分には両抗原が認められた。NE−25抗体及
びPE−35抗体は肺癌の免疫組織学的検査に有用
な抗体である。 本発明のモノクローナル抗体は公知の方法例え
ばKohlerとMilsteinの方法［Nature256、495−
497（1975）］やUedaらの方法［Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 78、5122−5126（1981）］に従つて作製
することができる。 例えば本発明のモノクローナル抗体は次のよう
にして製造することができる。本発明のモノクロ
ーナル抗体が認識する抗原（例えば肺癌細胞、神
経性腫瘍細胞等）でマウス又はラツト等の動物を
免疫し、免疫された動物から抗体産生細胞を得、
これとミエローマ細胞とを融合し、得られたハイ
ブリドーマから本発明のモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマを選択し、これを培養し抗
体を回収する。免疫法、融合法、ハイブリドーマ
の選択、抗体の回収等は公知の常法により行なう
ことができる。 更に詳しくは、例えば次のようにして本発明の
モノクローナル抗体を製造することができる。 まず、マウスを肺癌細胞、神経性腫瘍細胞等で
免疫する。免疫する動物はマウスに限らず、ラツ
ト等のネズミ科の動物又はその他の動物を使用し
てもよいが、通常はマウスを用いることが好まし
い。この免疫用マウスとしては、BALB／Ｃ系
マウス、BALB／Ｃ系マウスと他系マウスとの
F1マウス等が用いられる。 マウスに対して肺癌細胞等を数日〜数週間おき
に数回接種する。その後マウスより脾臓を摘出
し、常法により脾細胞（抗体産生細胞を含む）を
採取する。 ミエローマ細胞としては同種の動物のものを用
いることが好ましく、マウス脾細胞を融合の相手
とする場合には、マウスミエローマ細胞を用い
る。具体的にはMOPC−21、NS／１［Nature.
256．495−497（1975）］、SP2／Ｏ−Ag14
［Nature、277．131−133［（1979）］、S194／５、
XXO.BU.1［J.Exp.Med.148．313−328（1978）］
などが用いられる。 脾細胞とミエローマ細胞は１対１〜10対１の割
合で混合し、融合は例えばNaCl（約0.85％）、ジ
メチルスルホキシド［10〜20％（Ｖ／Ｖ）］およ
び分子量1000〜6000のポリエチレングリコールを
含むリン酸緩衝液（PH7.2〜7.4）中で行う。 融合は例えば、両細胞を35〜37℃で１〜３分間
インキユベートすることによつて行う。 ハイブリドーマの選択は、例えばヒポキサンチ
ン（1.3〜1.4mg／dl）、アミノプテリン（18〜20μ
ｇ／dl）、チミジン（375〜400μｇ／dl）、ストレ
プトマイシン（50〜100μｇ／dl）、ペニシリン
（50〜100単位／ml）、グルタミン（3.5〜4.0ｇ／
）、牛胎児血清（10〜20％）を含む基礎培地を
用い、成育してくる細胞として選択する。 基礎培地としては、動物細胞の培養に一般に使
用されているRPMI1640倍地、EagleのMEM倍
地などが用いられる。 ハイブリドーマのクローン化は限界希釈法にて
少なくとも３回繰返して行うのが好ましい。 本発明の抗体を産生するハイブリドーマの選択
は、分泌される抗体の反応性を調べ前記と同じ反
応性を有する抗体を産生するハイブリドーマを選
択し、その認識する抗原分子が前記分子量を示す
ことを確認することにより行なわれうる。 ハイブリドーマを通常の動物細胞の培養と同様
にして培養すれば、培地中に本発明の抗体が生産
される。例えば、２〜５×106のハイブリドーマ
細胞をストレプトマイシン（50〜100μｇ／ml）、
ペニシリン（50〜100単位／ml）、グルタミン
（3.5〜4.0ｇ／）、牛胎児血清（10〜20％）を含
むRPMI1640培地10〜20mlを用い、フラスコ内で
95％CO2−５％O2存在下、35〜37℃、３〜７日間
培養することによつて培養液中に抗体が分泌、蓄
積される。 またハイブリドーマ細胞をプリスタン
（Pristane）処理のヌードマウスまたはBALB／
ｃマウスの腹腔内に移植して増殖することにより
腹水中に本発明の抗体を蓄積させることができ
る。即ち、これらマウス腹腔内にプリスタン
（Pristane、２、６、10、14tetramethyl
pentadecane、米国アルドリツチ社製）0.5〜１ml
を注射し、その後、２〜３週目に腹腔に５〜10×
106個のハイブリドーマ細胞を移植する。通常７
〜10日後に腹水が貯溜し、これを採取する。 本発明のモノクローナル抗体の 125I標識した
肺小細胞癌SCLC−SAを用いた免疫沈降反応に
よる分子量測定では、NE−25抗原は25×103ダル
トンを呈し、又、PE−35抗原は35×103ダルトン
を呈した。 免疫沈降反応： 標的細胞として肺小細胞癌培養株SCLC−SA2
×107個を200μｇのアイオドゲン存在下で0.5ｍCi
のNa 125Iで標識する。 これら標識した細胞を0.1〜１％（Ｖ／Ｖ）NP
−40を用いて可溶化し、その細胞抽出物（１〜10
×105cpm）をモノクローナル抗体（１〜10μ）
と４℃にて６〜12時間反応させ、第２次抗体とし
て５〜20μの家兎抗マウスイムノグロブリン
（Cappel社、米国）と４℃で30分間反応させ、さ
らに４℃で１時間スタフイロコツカス・アウレウ
ス（Cowan Ｉ株）と反応させ免疫沈降物を作製
し、SDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に
より解析する。 本発明モノクローナル抗体の生物学的活性は実
子例に示した。実施例中に用いたマウス混合血球
吸着試験［Mouse−mixed hemadsorption
assay、Ｍ−MHA］法は下記の方法に従い、マ
イクロプレート［Falcon社、3040］に単層細胞
培養または浮遊細胞を付着させた標的細胞への指
示細胞の付着の有無で観察する。指示細胞として
は、ヒツジ赤血球とマウス抗ヒツジ赤血球抗体を
反応させた後、さらに家兎抗マウスイムノグロブ
リン血清を反応させたものを用いる。 マウス混合血球吸着試験［Ｍ−MHA］： Ｍ−MHAはEspmarkとFagreusの原法
（Acta.Pathol.Microbiol.Scand.Suppl.154 258
−262、1962）を改良して行う。 指示赤血球の作製法は以下の通りである。 先滌羊赤血球２％浮遊液と等量の1000倍希釈マ
ウス抗羊赤血球抗体（BALB／ｃマウスに羊赤
血球を過免疫して作製）とを24℃にて45分間反応
させ先滌後再び２％浮遊液として等量の200倍希
釈家兎抗マウスイムノグロブリン（cappel社、米
国）を24℃にて45分間反応させた後、２回先滌後
再び２％浮遊液としたものをいわゆるＭ−MHA
の指示赤血球として用いる。 Ｍ−MHA検査法の手法としては、被検索細胞
は、ハイブリドーマ細胞培養上清またはハイブリ
ドーマ細胞接種BALB／ｃマウスもしくは
BALE／ｃ由来ヌードマウス腹水と24℃にて45分
間反応させ、抗体を先滌後除去後、0.2％指示羊
赤血球と24℃にて45分間反応させ、軽く一度リン
酸緩衝液生理食塩水（PBS）で先滌後光学的顕
微鏡下、指示赤血球のロゼツト形成の有無にて判
定する。 又、実施例中、本発明のモノクローナル抗体選
定のための各種組織の染色及び本発明のモノクロ
ーナル抗体による各種組織の染色は、Hsu、S.
M.等の方法（J.Histochem.Cytochem.29、577〜
580、1981）に準じてアビジン−ビオチン−ペル
オキシダ−ゼ複合体法（ABC法）によるアセト
ン固定、凍結切片の染色により行なつた。即ち肺
癌組織等の凍結切片を10％正常豚血清を含む
PBSにて30分間処理した後、抗体を含む液体と
室温で２時間反応させ、更に４℃で一夜反応させ
た。そしてPBSで15分間洗滌した後、ビオチン
化抗マウス免疫グロブリン（7.5μｇ／ml）にて30
分間処理した。これをPBSで15分間洗滌した後、
アビジンDH−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合
体と室温で30分間処理した。これをPBSで15分
間洗滌した後ジアミノベンチジン溶液（50mgジア
ミノベンチジン、0.006％H2O2、トリスバツフア
ーPH7.6）にて５〜10分間反応させた。細胞核を
ヘマトキシリンにて染色後、通常の方法で封入し
検鏡した。 （実施例） 実施例 １ （PE−35抗体の製造） ８週令の雌BALB／ｃマウスを初回５×106個
の肺小細胞癌培養株（肺小細胞癌培養株細胞
SCLC−SAとSCLC−SMを１：１に混合した細
胞集団）で皮下に免疫し、その１ケ月後より２週
間の間隔で２回腹腔内に各々１×107個の細胞を
注入し免疫を行つた。なお、肺小細胞癌培養株
SCLC−SA及びSCLC−SMはいずれも愛知県が
んセンターで樹立した株である。 最終免疫より３日後に脾臓を取り出し、ステン
レスメツシユを通すことにより細胞懸濁液を作製
した。この1.0×108個の脾細胞と2.0×107個の８
−アザグアニン耐性ミエローマ細胞P3−NS1−
Ag4／１（NS／１）を混合し、遠沈後沈渣に１ml
の47.5％ポリエチレングリコール（平均分子量
4000）を加え、２分間ゆるやかに撹拌した。洗浄
後、細胞混合液を10％牛胎児血清を含むRPMI培
地（完全RPMI培地）に懸濁し、96ウエルマイク
ロ培養プレートに１ウエル当り106個の割合で0.1
mlずつ分注した。24時間後、ヒポキサンチン
100μM、アミノプテリン0.4μM、チミジン16μM
を含む完全RPMI培地（HAT培地）を0.1ml加え
た。 培養開始後週２回培養上清0.1mlを捨て、HAT
培地0.1mlを加えた。14日後よりウエルに融合細
胞の出現が観察されはじめた。 その後各ウエルの培養上清を取り出し、前述の
Ｍ−MHA法により肺小細胞癌と反応する抗体が
産生されているか否かを確かめ、抗体産生が陽性
を示したウエル中のハイブリドーマを限界希釈法
により３回クローニングを繰り返した。即ち、細
胞を50個／mlあるいは10個／mlに希釈し、あらか
じめフイダー細胞がまかれた96ウエルマイクロ培
養プレートに0.1mlずつ分注し、HT培地
（100μMヒポキサンチンと16μMチミジンを含む
完全RPMI培地）により２週間培養した。１ウエ
ルに１個のハイブリドーマコロニーが形成された
場合をクローンとして取り出した。これらクロー
ンから、前述のＭ−MHA法及びABC法により、
前記PE−35抗体の欄に示した各細胞及び組織に
対する反応性を有する抗体を分泌しているハイブ
リドーマクローンを選択した。このようにした得
られたハイブリドーマを産生する抗体をPE−35
抗体と命名した。 このハイブリドーマをマウスの腹腔内に投与す
る次の方法で増殖させPE−35抗体を量産した。
即ち、マウス腹腔内にプリスタン0.5ml注射し、
その後２週目の腹腔に５×106個のハイブリドー
マ細胞を移植し、10日後に腹水を採取した。 実施例 ２ （NE−25抗体の製造） ８週令の雌BALB／ｃマウスに手術材料より
得られた神経芽細胞腫細胞（＃1134）５×106個
を皮下に注入し、１ケ月後より２週間の間隔で２
回腹腔内に各々１×107個の細胞を注入し免疫を
行つた。 最終免疫より３日後に脾臓を取り出し、ステン
レスメツシユを通すことにより細胞懸濁液を作製
した。この５×107個の脾細胞と１×107個の
NS／１を混合し、実施例１と同様にして細胞融
合、クローン化を行ない、前述のＭ−MHA法及
びABC法により、前記NE−25抗体の欄に示した
各細胞及び組織に対する反応性を有する抗体を分
泌しているハイブリドーマクローンを選択した。
このようにして得られたハイブリドーマの産生す
る抗体をNE−25抗体と命名した。このハイブリ
ドーマを実施例１と同様にして培養し、抗体を量
産した。 実施例 ３ 各癌及び正常組織又は細胞とNE−25抗体、PE
−35抗体との反応を調べるために、前記Ｍ−
MHA法及びABC法により試験を行つた。結果を
表１、表２及び表３に示した。 【表】 【表】 【表】 【表】 実施例 ４ 本発明のモノクローナル抗体のイムノグロブリ
ンのアイソタイプを知るため、本発明のモノクロ
ーナル抗体を寒天ゲル内で、マウスIgの各アイソ
タイプ（IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、
IgG3）に対するウサギ抗血清に対して沈降反応
を行なつた。 その結果、本発明のモノクローナル抗体NE−
25及びPE−35はいずれもIgG1と判明した。 実施例 ５ 実施例１で用いた肺小細胞癌培養株に対する反
応性をＭ−MHA法により検討したところNE−
25抗体及びPE−35抗体の反応性は、いずれの場
合も、ヌラミニダーゼ（neuraminidase）で処理
したものでは変化がなく、又、100℃、５分処理
により反応性が失活した。 以上の結果よりNE−25抗体及びPE−35抗体は
いずれもタンパク質抗原を認識する抗体であるこ
とがわかる。 実施例 ６ 前記の免疫沈降反応によりNE−25抗原とPE−
35抗原の分子量を測定した所、NE−25抗原は25
×103ダルトンを呈し、又、PE−35抗原は35×
103ダルトンを呈した。 （発明の効果） 本発明のモノクローナル抗体は肺癌の小細胞癌
と非小細胞癌の免疫組織学的鑑別に特に有用であ
る。又、肺小細胞癌治療への応用可能な抗体であ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒトの正常上皮細胞及び上皮由来癌細胞に存
在する35×103ダルトンの分子量のタンパク質抗
原抗と抗原体反応をし、次の性質を有するIgG1
アイソタイプに属するモノクローナル抗体PE−
35。 １ ヒトの肺癌、胃癌、大腸癌、乳癌、肝胆道癌
と反応する。 ２ ヒトの神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、リン
パ腫と反応しない。 ３ ヒトの肺、甲状腺、食道、胃、小腸、大腸の
正常上皮組織と反応する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1243599A JPH02174691A (ja) | 1989-09-21 | 1989-09-21 | モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1243599A JPH02174691A (ja) | 1989-09-21 | 1989-09-21 | モノクローナル抗体 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61056358A Division JPS62212399A (ja) | 1986-03-14 | 1986-03-14 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02174691A JPH02174691A (ja) | 1990-07-06 |
| JPH0320239B2 true JPH0320239B2 (ja) | 1991-03-18 |
Family
ID=17106212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1243599A Granted JPH02174691A (ja) | 1989-09-21 | 1989-09-21 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02174691A (ja) |
-
1989
- 1989-09-21 JP JP1243599A patent/JPH02174691A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02174691A (ja) | 1990-07-06 |
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