JPS6058926A - 肺小細胞癌細胞と反応するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

肺小細胞癌細胞と反応するモノクロ−ナル抗体

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JPS6058926A
JPS6058926A JP58167366A JP16736683A JPS6058926A JP S6058926 A JPS6058926 A JP S6058926A JP 58167366 A JP58167366 A JP 58167366A JP 16736683 A JP16736683 A JP 16736683A JP S6058926 A JPS6058926 A JP S6058926A
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JP
Japan
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tfs
antibody
cell
cells
mouse
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JP58167366A
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Tatsuo Yamashita
達雄 山下
Tsutomu Kaizu
海津 務
Shigeyoshi Osawa
大沢 重義
Fumikiyo Takaku
高久 史磨
Tetsuo Okabe
哲郎 岡部
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Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コノ発明はマクス・ハイグリドーマが産生ずるヒト肺癌
細胞に対す、る抗体ならびにそれらを産生ずるハイブリ
ドーマに関する。
近年、ハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を得
る手法が確立された結果、この手法でヒト癌細胞と反応
するモノクローナル抗体を得て癌の治療や診断に用いる
方法が開かれつつある。
肺癌のうちでも非小細胞癌はリンパ系転移を起こしやす
く、極めて予後の悪い腫瘍ではあるが、一方放射線療法
や化学療法に対する感受性が高いという一面もある。
そこで、肺小細胞症の治療に際しては放射線療法や化学
療法を施すことが行われる。
しかし、これらの療法はリンパ系を含む血液細胞に対す
る毒性を有する。そのだめ、例えば、これら血液系細胞
の幹細胞である骨髄細胞を、放射線療法や化学療法に先
立ってとり出して凍結しておき、治療後に戻すという骨
髄移植法が、この非小細胞癌の有効な治療法として検討
されている。
ところが前述のとさく、肺小細胞症はリンパ系転移を起
しやすいので、骨髄細胞をはじめとするリンパ系を含む
血液系細胞中に既に転移していることが多い。その際に
骨髄細胞中に存在するわずかの肺小細胞癌細胞から再発
が起るこ七を防ぐために、生体に戻す前の骨随細胞中の
腫瘍細胞を完全に除いておく必要が出てくる。
その手段として肺小細胞癌細胞と反応する抗体を用いる
ことが考えられているが、この目的に合った抗体を得る
ことは極めて困難であった。
この発明の発明者は、この目的に合った抗体を得る手段
aLでマクス・ハイブリドーマを用いて七ツクローナル
抗体を得る方法を利用する吉いう考えに立って、鋭意検
討した結果この発クツを完成した。
この発り]のモアクローナル抗体は、例えばリンパ系を
含む血液系細胞のごとき正常細胞中に混在する肺小癌細
胞を正常細胞に何ら悪影響を与えることなく殺す目的で
利用するこ七ができる。とりわけ骨髄移植法によって非
小細胞癌を治療する際に生体外に一時的に収り出した骨
髄細胞中の腫瘍細胞を殺す手段として極めて有効である
寸た、肺癌にはル1j小細胞!1′杓のほかに肺大細胞
痛、肺腺癌、肺扁平」1皮り1hがあり、また肺小細胞
症はさらに燕麦細胞フ1hと中間型に細分化されるなど
種々のタイプがあるが、これらを診断するこ々が重要で
ある。また、この発明の肺小細胞癌細胞と反応するモノ
クローナル抗体はこれらの診断にも用いることができる
この発明のモノクローナル抗体は マウス・ハイブリドーマADHI−79によって産生さ
れ、還元状態で分子量約42キログルトンの抗原を認識
し、補体依存性細胞障害活性を有するイムノグロブリン
G2aクラスのTFS ” l抗体または マウス・ハイグリドーマAI)H4−73によって産生
され、還元状態で分子量約39キaダルトンの抗原を認
識し、補体依存性細胞障害活性を有するイムノグロブリ
ンG2bクラスのTFS −2抗マウス・ハイグリドー
マADH,5−113によって産生され、還元状態で分
子量約110キロダルトンの抗原を認識するイムノグロ
ブリンG1クラスのTFS−3抗体または マウス・ハイブリドーマACTH1−72によって産生
され、還元状態で分子量約124キロダルトンの抗原を
認識するイムノグロブリンG1クラスのTFS −4抗
体である。
これらの抗体はヌードマウス(BALB nu/nu 
)に移植し継代培養したヒト肺小細胞癌細胞株であるT
NSC−1およびTNSC−2をそれぞれマウス(BA
LB/c)に感作させた後、モノクローナル抗体を産生
ずるハイブリドーマを得る常法に従ってそれぞれのマウ
スから胛1藏を摘出し、肺細胞懸濁液を作製し、同系統
のマウスの骨髄細胞と混合し、ポリエチレングリコール
を用いて融合させ、得られるハイブリドーマを常法に従
って培養し、産生ずるモノクローナル抗体を各種のヒト
IJft瘍細胞株および正常細胞と反応させ、ラジオイ
ムの発り]の目的に合致するものを選択することによっ
て得ることができる。
この発明のモノクロ、−ナル抗体のラジオイムノアッセ
イによる各種肺癌細胞株に対する反応性の試験結果は下
記の通りである。
試験例1 生するハイブリドーマの培養上清100μl と共に4
°Cて90分反応させ、リン酸緩衝生理食塩水(以下P
BSと略記)で2回洗浄後、l O,000〜20,0
00cpmの 1 標識ヤギ抗マクスイムノグロブリン
G抗体のF (a b’)2分画と4°Cで一夜反応さ
せた。PBSで3回洗浄後、結合した放射活性をガンマ
、カウンターで測定した。対照とし代 てP3x63Ag8の培養h ’11!Iをサンプルの
戻わりに用いて同様の操作を行ない、個々の測定値の対
照に対する割合をめ表1に示した。表1のテークにおい
て1.5以下は該抗体か該細胞上反応しないことを示し
、1.5 = 2.5は弱く反応することを示し、25
以上は強く反応することを示す。
肺癌以外の他の癌細胞様に対する反応性を試験例1と同
様に試験した結果を表2に示す。
造血系癌細胞様に対する反応性を試験例1と同様に試験
した結果を表3に示す。
正常人より分離した細胞および正常組織由来培養細胞株
に対する反応性を試験例1と同様に試験した結果を表4
に示す。
またヒト師事細胞癌細胞株TNSC−1をラクトパーオ
キシダーゼと過酸化水素の存在下に Iで標識し、可溶
化後金々のモノクローナル抗体と共沈させ、電気泳動を
行ない、各々のモノクローナル抗体の反応する抗原を調
べだ結果は表5の通りである。
寸だ、マウスの各ヘビー・チェイン・アイソタイプ(b
eavy cbain 1sotype)に対する抗血
清を用いてオフクロニー(Ouchterlony)法
によって調べた各抗体のヘビー・チェイン・アイソタイ
プは表5の通りである。
さらに、兎補体の共存下での細胞障害の有無に明細書の
浄書(内容に変更なし) ついて試験した結果を表5に示す。
また、中間型肺小細胞癌細胞であるMCl−69株およ
びNCl−128株に対する反応性を螢光抗体法で調べ
た結果、TFS−1とTFS−2はMCl−69株に+
、NCl−128株に一1TFS−2はNCl−69株
とNCl−129株の両方に−F、i” F S −4
はNCl−69株とNCl−129株の両方に−であっ
た以」二の試験結果が示す通り、TFS−1およびTF
S−2はヒト肺小細胞癌細胞をはじめとするいくつかの
ヒト肺癌細胞なとの癌細胞と反応し、ヒト正常細胞であ
る骨髄細胞、血液細胞および線維芽細胞とは反応せず、
袖体依存性細胞障害活性を有することから、ヒト師事細
胞癌などの癌の治療に用いることができ、またTFS−
3およびT F S −4はヒト肺小細胞癌細胞および
神経芽細胞腫細胞と高い特異性で反応することからヒト
師事細胞癌および神経芽細胞腫の診断に用いることがで
きる。
表5 (7JJ 抗体TFS−1,TFS−2,TFS−3お
よびTFS−4が認識する抗体の還元状態での分子量の
測定値の誤差は約±30%である。
以下、実施例に基つき、この発明をさらに詳しく説明す
る。
実施例1 免疫原である、BALB nu/nuマウスに移植し継
代した肺小細胞癌細胞TNSC−1(ADH(抗利尿ホ
ルモン+ antidiuretic hormone
 )産生性]をBALB/c マクスの腹腔に1〜4X
10’細胞/マクスずつ、3週間毎に3回投与した。
最終免疫4日後にそのマウスを開腹し、肝臓を摘出し肺
臓細胞濁懸液を調製した。その肝臓細胞懸濁液とマウス
・ミエローマP3 X 63Ag8U1(以下、P3U
1と略記)細胞懸濁液(BALB/cマクス由来のミエ
ローマ)を5:1の細胞比で混合し、遠心分離後、45
%ポリエチレングリコール(シグマ社製、分子i!: 
4.000 )を徐々に滴下し、6分間室温で放置させ
て細胞を融合させた。
この融合細胞を15%牛脂児血清添加グルベツコ小 改変イーグル最初栄養培地(2mMグルタミン。
2X10 M2−メルカプトエタノール、80μ7/m
eゲンタミシン硫酸塩、100単位/meペニシIJン
G、100μy/meストレプトマイシン硫酸塩および
0.25μy /meアンホテリシンBを含む)に懸濁
してヌンク(Nunc)社の24クエルプレートに植え
込み、翌日、翌々日およびその後2〜3日毎にHAT培
地(ヒポキサンチン、アメトプテリン、チミジン添加培
地)で半部交換して融合細胞のみを生育させた。培養1
1日後の培養液についてヒト腫瘍細胞株及び正常細胞に
対するラジオイムノアッセイ捷たは間接蛍光抗体法によ
ってT F S−1,TFS−2およびTFS−3を選
択した。
クローニングは住友ベークライト社製96穴マイクロテ
ストプレートを用い各フェルに1.2.4まだI″i8
個の細胞を植え込み単個細胞由来のクローンを得る限界
希釈法に依って行った。
実施例2 実施例1において感作させるヒト肺小細胞癌株をTNS
C−1のかわりにTNSC−2[ACTH(副腎皮質刺
敷ホルモン、adrenocorticotropic
bormone)産生性1株を用いたほかは実施例1と
全く同様の方法により、T F S −4を選択した。
出願 人 藤沢薬品工業株式会社 代理人 弁理士計木 高 手続補正書 (方式) %式% 2、発明の名称 肺小細胞癌細胞と反応するモノクローナル抗体 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市東区道修町4丁目3番地 (524)藤沢薬品工業株式会社 代表者 藤澤友吉部 4、代理人 ■ 532 大阪市淀用区加島2丁目1番6号 昭和59年1月11日 (発送日; 昭和59年1月311;l/)”−ゝ\ノ
ル1p佇 X 6、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の憫 7、補正の内容

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 ill マウス・ハイブリドーマADHI−79によっ
    て産生され、還元状態で分子量約42キログルトンの抗
    原を認識し、補体依存性細胞障害活性を有するイムノグ
    ロブリンG2aクラスのTFS −1抗体または マクス・ハイブリドーマADH4−73によって産生さ
    れ、還元状態で分子量約39キロダルトンの抗原を認識
    し、補体依存性細胞障害活性を有するイム/グロブリン
    G2bクラスのT F S −2抗体または クラス・ハイブリドーマADH5−113によって産生
    され、還元状態で分子量約110キロダルトンの抗原を
    認識するイムノグロブリン61クラスのTFS−3抗体
    捷だは って産生され、還元状態で分子量約124キロダルトン
    の抗原を認識するイムノグロブリン01クラスのTFS
    −4抗体。 (2) 還元状態で分子量約42キログルトンの抗原を
    認識し、補体依存性細胞障害活性を有するイまだは 還元状態で分子量約39キロダルトンの抗原を認識し、
    補体依存性細胞障害活性を有するイムノグロブリンG2
    .クラスのTFS −2抗体を産生ずるマウス・ハイグ
    リドーマADH4−73または還元状態で分子1約11
    0キログルトンの抗原を認識するイムノグロブリンG1
     クラスのTFS−3抗体を産生ずるマウス・ハイグリ
    ドーマADH5−113または 、 114 還元状態で分子堡約−目−神呻キログルトンの抗原を認
    識するイムノグロブリン61クラスのTFS−4坑休を
    産生するマウス・ハイブリドー
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