JPS6242999A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の６Ｔ細イー１説明 １産業計の）１１用分野） 本発明はヒ１への、特に食道癌の診１１ｉｉ、″右川な
七ツクｎ　−ｊ−ル抗体に関づる。

［従来の技術１ 食１１４１鬼院Ｉｌ）進行症例が大部分を占めでおり、
確たる早期診断法は確立されでいない。

し発明が解決しようどする問題）：工１食道癌の悪牲厖
は高く、９−　ＩＩにリンパ節や他臓器へ転移し、予後
は不良である。（Ｋっで、食道癌の早期発見が可能イＩ
−診断法の確Ｓ″ｌが望４、れている。

［問題を解決りるための手段」 本発明者等は甲明診断と治療への応用を意図【）、食道
癌関連抗原に対りるｔツクＩ’ｉｌ　−−Ｊ−ル抗体に
ついて種々検討を（ｊなった結果、本発明を完成した。

即Ｉ〕、本発明＋、Ｌ、 ［１，ヒト良道揺Ｉ（Ｊ含３１、れる抗（Ｉ：ミと抗原
抗体殴＋ｒ、１をし、次のｆ１質を右ＪるＩｏＭのクラ
スに属りる土ツクローノル抗１本１−△−２゜（ １）　　に１・ｎ）？１癌と陵１，６する（２）　　に
１〜胎す己；１μｍ−皮ど弱く反応リ−る、。

に］）　　ヒ１−の食道粘１１ｔ、ｊ　、胃、赤血球、
末梢血リンパ球の１１−常組織と反応しイＣい。

２　じ１〜食）６癌に含Ｊ、れる抗原と抗１６Ｉ抗体反
応をし、次の１１１質を右りるＩ（］Ｇ１１１１群に属
するｔツクロープル抗体［−△　３゜ （１）　　ヒト食道癌ど反応−１６１゜（２）　　ヒ１
へ了゛菖頚癌、膀胱癌、胎県１Ｉｌｉ　、Ｉ皮、肺癌と
弱く反応−リ−る。

に１）　　ヒ１−の食道粘膜、胃、胎県腸１−皮、界血
球。

末梢血リンパ球のｉｆ−當組織と反応１ノない。」に関
づる（・）の（パある。

なお、以上の説明において述へる細胞、組織等は１５　
ｉＪ′ｌことわりの＜−Ｌい限り全Ｃ上１〜の細胞、組
織′１１ン（゛ある３゜ 木ブを明のＬツタｌ−］　−）］ル抗体］−△２及び１
−△こ３は、１９述ηる実施例（こ示りＪ＝５４ｃ、良
道卿Ｊとは反応（Ｊるが、１Ｆ常Ｑ道粘膜や、胃、末梢
面リンパ球、界血球の１１常組織と反１芯しない。、■
、［△−２抗体は胎す５腸に皮ど弱く反１＝６　’！Ｊ
る。、［△−３抗体は胎児腸ｌ−皮と艮応しイ１いが、
肺癌ヤ）了冨頚箱、膀胱癌、胎県肺１１にとは弱く反応
りる１゜［△−２及び［△−３抗体はぞれイ゛れＨＩＭ
。

１　！Ｉ　Ｇ　１ｉ１１Ｉ群に属りるｂのである。。

本発明のＴｌ　、、ｕ＋＋　−−、プル抗体は例λぽ次
のよう（こしてｌ！ｌＪ造ＪることがＣさる。即ら、ヒ
］・食）ｒ１癌細胞等でマウス叉はラフ１〜等の動物を
免役し、免役された動物から抗体Ｒ１細胞ｋｌ！ｉ、Ｃ
れと骨髄■Φ細胞を融合し、得られた融合細胞をり［１
−ン化し、ヒト食通癌に対りる抗体を産イ１づる融合細
胞を選択し、これを培善して抗体を同ＩＮ　Ｊる。免疫
。

融合、融合細胞の選択等は公知の通常の１７ｊ払にＪ、
−）で行（１うことができる。

更に詳しくは、例えば次の３Ｊ、うにし−Ｃ本発明のｔ
ツク［１−プル抗体をｇＡＪ造覆ることができる。

先ず、マウスを食道８１１Ｉ胞−Ｃ免役Ｍる。免役する
動物ｔよマウスに限らず、ラフ１〜等のネズミ）１の動
物又（、Ｌイの他の動物を使用してもＪ、いが、通常は
・ｌウスを用いるＵ）が好ｔ　Ｌい。例ンぼＦ（ＡＩ−
１１／Ｃマウスに食道癌細胞を数Ｆ−１〜数週問おきに
数回接種する。接種に１はｌ　１ｌＴｊ当り　１回につ
き１０６へ−［１８個の細胞を使うのが好ま（〕い。

イの後・／１”ノスＪ、り牌臓を摘出（）、遠心分−目
、二より抗体産１１−細胞を得る。この細胞は増殖し−
（いく能力を持たないので・、自己１１１石能力を有Ｊ
る細胞と融合さける。自己増殖能力をイ」する細胞とし
ては骨髄腫細胞が特＋ニー’）７ましい。骨髄肝細胞ど
しては、同種の動物のものを用いるのが好Ｊ、１ノい。

■、骨髄肝細胞どしては、抗体を産’Ｆし１．’ｃいｂ
のを選択−するのがりｒましい。抗体首／１細胞とけ髄
呻細胞をポリ■ブレングリー］−ル等の細胞融合剤と混
合し、細胞融合を行なう。抗体Ｒ４ｌ−細胞と（Ｓｔ　
ｌＩｆ＋腫細胞の使用割合（ま、ＩＩＩＩ胞数比で５：
１へ−１０：１　どするのが好、１、しい。

（（ノられｔ、二融合細胞は限！ＩＩ＋！希釈法により
分離し、１個の細胞に由来する細胞の集団、？ｌ’　＜
Ｋね１−）クローンと（Ｊる。

抗体は公知の方法、例λ７ばＶｔ光抗体法■しＬ酵素抗
体法等ｉ、：　Ｊ、Ｖ〕各種細胞組織等ど反応さ（濤、
イの結束から所望の抗体を産！１′４−るハイブリトー
ンを選択する 選択しｔＪハイブリドーマを４−！′！Ｙ−ｊ−Ｌ−兜
−８培養法ゾロリ　ｙ−ｉ　ｙ−ｏ移植法により増殖さ
ｔ！抗体をｖ）る。

１−！ｉ　　ロー（−ｒ９−培養法とし−（は、例λば
次のＪ、うに行４ｆうことがτ゛きる７、即り、バイブ
リド−７を適当むＩ８養液（例えばＩ）−Ｍ　Ｆ　Ｍ　
ｒＲＩｌｌ！　＞で′増殖限界になるまＣ培養し、ぞの
培養１γ＾を回収Ｊる１、１γｒ１中に分泌されＩ、二
しツク［］−プル抗体は一般にｔま精製しくｒいで用い
られるが、例えば以上の／８仏によりＩｇＭ、ｌｏＧ分
画にしでし使用できる。

即ら、培養１−清を４０％飽和ｔａ安（・沈澱さｔ！に
後、ＩｌＮ　　７．８の２０　ｍＭリン酸緩！ｌＩｉ液
’（゛）１７衡化しＩＬジ］−プルアミノｌ（ル［ル［
ｌ−スカラム又はＬ）／７　”ｉ−ックスＧ２００カラ
ムを通過させ不純物を除去しで用いる。

又、Ｌμ　ｙ−ｉＹＯ移植法と（ッでは、例えば次のＪ
−うに行なうことができる。即Ｉ５．９一体内、例えば
メートマウス腹腔内にハイブリドーマを注入１）、ヌー
ドマウス体内で腫瘍どじで生育させ、メートマウス血清
あるいは股木から抗体を（Ｉｊｌ収ＣＪる。史に詳しく
　１．Ｊ、、バイブリド−７を移植ηる１３△ｌｆ３／
ｃマウス腹腔内にあらかじめ（１（）〜１４［ｌ前より
）　２，６．１０．１４−　ｊｌ−ラメチルペンタｊ゛
カンを０５ｎ認×２．３回２１躬しておき、次にハイ１
リドーマ５ｘ１０６−・１０７個を腹腔内に移植ケる。

移植されたマウスを適当な時間飼育すると、腹腔内にハ
イシリトーンの腫瘍が形成され、脚部が肥大してくる。

この結果、股木及び血清中（３二高濶度の上ツク［−１
−ノル抗体が１１−成されるので、ぞれらをｌ宋ＩＰＩ
するこの股木及び面γ＾中には目的とＪるピック［］−
ノル抗抗体外に、マウス自ｑに由来り−る多り［１−ン
竹抗体が含まれているが、それらはヒ１への組織とは反
応しないため、特に分離しないで用いられる。又、３ｒ
ＨＶｉｔｒ−〇−培養法の揚台どｆａｉ１様に、ｉｎ　
　ｖｉｖｏ移柚法ＩＪおいてもＩＯＭ、７００分画にし
て使用することもできる。

［実施例１ 害コ屯−例１ １）免疫 ８掴合の記ＩＢ△Ｌ、　Ｂ　／　Ｃマウスを５×１０６
個の食道陥由来の細胞株（以Ｆ　Ｔ　Ｅ−２という）で
成上に免役し、その後１個間の間隔で４四設計内に５×
１０６個の細胞を注入した。さらに、牌臓摘出３日前に
２×１０６個の細胞を尾静脈及び前部皮下に注入し！、
：。

２）　　ｍ飽融含 最終免疫より３１１後に牌臓を取り出し、ステンレスメ
ツシ］を通すことにより細胞懸濁液を作製し１．：、こ
の１．Ｏｘ　１０８個の牌細胞と１□０×１０７個の８
−７ザグアニン耐性骨髄腫細胞Ｐ　３−　Ｘ　６３−△
ｔａ８／Ｕｌ　　（Ｐ３　ＬＪｌ　）を混合し、遠沈（
殺沈清に１ｍＱの４４４％ポリエチレングリ凹−ル（平
均分子量１ｏｏｏ）を加え、３０秒間ゆるやかに撹拌り
、　／こ。

−〇　　　− 洗浄後、細胞ｉ７．合液ヲ１５　％　’Ｉ−胎県＋ｒｎ
　Ｉ’ｍ　ヲ介ｊｒ　Ｉ）−Ｍ　Ｉ：　Ｍ培地（Ｉ）ｕ
ｌｂｅｃｃｏ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　　Ｍ　ｌ−Ｍ培地）
に懸濁し、９６穴マイクロ１バ展ブレー１〜（Ｊ１穴当
り１０６個の割合でｏ、１ｍｅずつ分注した３、２４時
間後、ヒポ１−リンチン１１００ｆ１．アミノグー１リ
ン０．４μＭ、チミジン１６７７Ｍを含む［”ｌ　−Ｍ
　Ｆ　Ｍ培地（１１Ａ丁ＩＳ　ｔｉｌ＋　＞を０．１ｍ
（！加え／ｊ。

培養開始後２［−１目、３目１１　、　５１−１目、　
　７１４１１゜１０Ｆ−１Ｎ１　、１２Ｈ［ｌに培養−
１清０．１ｍＱを捨Ｕ、ｌ−１Δ丁培地０．１ｍＱを加
えた。１４日後約１１Ｏ％の穴にハイブリドーマがｌＩ
′ｌ蛸するのが′＠ｌ察された。

３）ハイ１リドーマの選択 １−　Ｅ　−２細胞に対して抗体をｇ／４しているハイ
ブリドーマを１１ｙ素抗体法により選択した。酊糸抗体
法【よ以上の如く行なった。

Ｔ−Ｆ　−、、−２細胞を９６穴マイク［１培養／ｌノ
ー１−（平底）に増殖限界に達りるまで１７５養し、丁
）３　Ｓにて＋ｉ同洗浄（）た。バイア　１Ｊドー７の
培養土ｒ＾　０１ｎ＆を加え、室温で１時間反応さ１！
た。５回洗浄した後、第２抗体として５０μｅの１汀１
ノリピペルＡ４−シダーげ標識１７ギ抗ンウス免疫グｌ
ｌ−７リンを加え、１時間反応さｌ！た。６へ・７同洗
−）Ｉこ後、１．１％過酸化水素水と１４ｉｏ１１！ｉ
／威のアジノービス（３−■ヂルベンゾチ？ゾリンー　
６−６−スルフ４ン酎）（ＡＢ■−８）を含む５０ｍＭ
り「ン酸緩笥液を１００ｐ加え、１０分間室温で・発色
させた。停止に液と（）て１０％シ］つ酸を５０μｅ加
え、４０ｂｎｍの吸光度をマイクロプレー１〜用の分光
九度剖により測定［）、０，０２以１−吸光度のあるハ
イ１リドーマを選択しに０選択されたバイブリド−７は
あらかじめＢΔ［１／Ｃマウスの胸腺細胞（フィーダー
細胞）をまかれｌ５２４穴培養プレートに移され、　１
００１．ｘＭヒポ−Ｆ　＋Ｊンブンと１６ｆ１Ｍブミジ
ンを含む１）−ＭＥＭ培地（Ｈ１−ｔ７４　＋１１１　
）で培養した。増殖限界に達し！、：後、再び酵素抗体
法【、二Ｊ、ｌ’）　Ｔ　Ｉ’　−２細胞に対して抗体
産りを？−ｉ　／、１っているハイブリドーマを選／Ｖ
だ１゜ 次に、選択され１＝ハイ１リド−７を限界希釈法に」、
す／）［１−ニングし！、−０Ｉ！ＩＩ　１５、細胞４
５０個／　ｍ（！あるいは１０個２・’ｍｉ！に希釈（
ッ、あらがじＶ）ツイータ−細胞を」、かれ／ｊ９６穴
ンイク「Ｉ培倍−ル−トに０．１ｍＱ’ｆつ分注し、１
−１１培地（により２週間培養した。１穴に　１個のバ
イブリド−７１１に一が形成された場合をり［１−ンど
して取り出しＩ、：。酵素抗体法に」、すＴ［−２細胞
に対して反応し、１１−常ヒｌ−線Ｈ月細胞に対して反
応しない抗体を分泌しているハイブリドーマ／）１−１
−ンを選択しｔＥｍ。

史に、これらのり［］−ンのうち、ヒト正常食道粘膜と
反応せず、食道癌と反応するり［１−ンを凍結切片の免
疫パーＡ４シダーゼ染色にＪ、り選択１）だ。つまり、
ヒトの食道癌及び正常組織をＪ゛術材判ノ〕冒Ｂ　ｉ’
ｉ　％その４−？！Ｊ！結切片を作製した。７セ］・ン
Ｔタノール固定後、バイブリド−マク［−１−ンの培養
上清を加え、￥渇で３０分反応させた。Ｊ、く洗った後
、ビオヂン標識抗マウスＩｊｌＧ十Ｍ抗体（γ鎖、λ鎖
、に鎖と反応する）と室温で３０分反応させた。更に洗
浄後、アビジンとビオチン標識西洋ワ＋少ビバー第４シ
ダーゼを加え？温で１時間反応させ、よく洗った後基質
として０．５ｍｑ／　ｄのジアミノベンヂジンど０．旧
％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍＭｔ〜リスー塩酸緩酎液（ｉｌ
耐−１７，０）を加え発色させた。

このようにして、ヒト食道癌とは反応するが、食通粘膜
、胃、赤血球、末梢血リンパ球の什常組織と反応【ノな
いｔツクローナル抗体を産生するハイブリドーマクロー
ン（２種）が得られ、これをＦＡ−２’　、　［／１３
’　と名付けた。そして、これらハイブリドーマＦＡ−
２’　、ＦＡ−３’　が産牛するセック１］１−ナルｂ
ｖ体をぞれぞれ［−Δ−２゜ＦＡ−３と命名しＩこ。

４）七ツク［］−フル抗体の作製 （ａ）　　　　　　（ｒｌ　　　ｖｉｔｒｏ　　培　ｔ
ｉ　　＞１１０５個／Ｉｄのバイブリド＝７を培養液（
＋）−Ｍ　Ｅ　Ｍ培地）で増殖限界（２×１０６個／ｄ
）になるまで培養し、その培養ｌ消を間取しＩこ。上清
中に分泌されたＴｉツクローナル抗体は精製しないで用
いた。（（［ｉ　ｔ、、以下の方法によりＩＱＭ、Ｉ（
ＩＧ分画にして使用することもできる。即ち、培養−１
−清を４０％飽和硫安で沈澱させた後、ＩＩＮ　　７．
８の２０ｍＭリン酸緩ｍ液で１１衡化したジエチルアミ
ノ１チルセル［１−スカラムを通過さ１！不純物を除去
１）で用いる。） （ｂ）　　　ＬＤ　　ｖｉｖρ移稙法 ハイブリドーマを移植する１３△Ｌ　Ｒ／　Ｃマウスに
あらかじめ（１０・〜１４１１前より）２゜Ｇ、　１０
．１Ｌ−ｊｈラメチルペンタデカンを２へ・；３回腹腔
中に０．５ｍＱ汀川し用おく。次にハイ１リドーマ５×
１０６個を腹腔内に移植Ｊる。移植されたマウスを３週
間飼ｆ′Ｔすると、腹腔内にバイブリド−７の腫瘍が形
成され、１１９部が肥大１ノでくる。この結果、腹水及
び血清中に高濃度のｔツクロープル抗体がノ１−成され
、それらを採取する。この腹水及び血清中には目的どづ
るｔツクローナル抗体以外に、マウス自身に由来覆る多
り［１−ン性抗体が含まれているが、−でねらはヒトの
組織とは反応しないために、特に分１１１１１　Ｌ、な
いで用いる。（また、４）の（ａｌに示した方法により
ＩＯＭ、ＩＯＧ分画にしても使用で・きる。） ５）土ツク【１−ノル抗体［Ａ−２及び［Ａ　３の特性 以下の例においては、前記４Ｈａ）で１９られた培養１
消をイのまま用い反応性を調べた。

（ａ）　　ｆ！道癌組織との反応性 ｆ術によりｔｉｌｌ除されＩ、−癌組織の凍結切片とに
八−２抗体との反応性を免疫パーオキシダーゼ染色にＪ
、り調べＬ゛。Ｆ　Ａ−２抗体は食道癌８例中５例と反
応した。

（１））　　各種組織又は培養細胞との反応性Ｅ　Ａ−
２及びＦＥ　Ａ−３抗体と組織の凍結切）４又は培養細
胞との反応性を免疫パーオキシダーゼ染色にＪ−り調べ
／ｊ　、また末梢面リンパ球に対Ｊる反応性を間接蛍光
抗体法によって、また赤血球に対りる反応性を間接凝集
試験によって調べた。結末を第１表及び第２表に示す。

第　　１　　表 ＦＡ−２ＦＡ−３ ヒト細胞培養株 （由　来　）（株細胞名） 食道癌、　　ＴＦ−２−１−十 食道癌、　　ＴＥ−１−十 食道癌、ＴＥ−５−＋ 食道癌、　　ＡＥ−１−（１−−− 食道癌、ＡＥ−２−＋　　　−＋− 子宮頚癌、ＩＩｅＬａ、　　　　　−−１旧■　　癌　
　、　　＾−５４９−十 胎兇肺十皮、Ｒ−６６−−＋− 大賜癌、Ｃｏ１ｏ−２０５−−− 大胆癌、５Ｗ１１１６　　−−　　− 胎児腸上皮、　　Ｆｌｏｗｌｌｏｏｏ　　　　＋　　　
　−膀胱癌、１’−２４−十 羊膜細胞、　旧Ｓｌｌ　　　　　−± リンパ腫、Ｒａ、ｉｉ　　　　　−− 第　　２　　表 （凍）は凍結切片を用いた。

支藩膚Ｉ ＦＡ−２，ＥＡ−３抗体はｄａｔ−ｓｐｏｔ−ａｓｓａ
Ｖ法により調べた結果、それぞれＩｑＭ、ＩｇＧＩ並群
に属づるものであることがわかった。

［発明の効果］ ＥＡ−２及びＥＡ−３抗体を用いた診断により、特に食
道癌の診断を的確に行うことが出来る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト食道癌に含まれる抗原と抗原抗体反応をし、次
   の性質を有するＩｇＭのクラスに属するモノクローナル
   抗体ＥＡ−２。 （１）ヒト食道癌と反応する。 （２）ヒト胎児腸上皮と弱く反応する。 （３）ヒトの食道粘膜、胃、赤血球、末梢血リンパ球の
   正常組織と反応しない。 ２、ヒト食道癌に含まれる抗原と抗原抗体反応をし、次
   の性質を有するＩｇＧ＿１亜群に属するモノクローナル
   抗体ＥＡ−３。 （１）ヒト食道癌と反応する。 （２）ヒト子宮頸癌、膀胱癌、胎児肺上皮、肺癌と弱く
   反応する。 （３）ヒトの食道粘膜、胃、胎児腸上皮、赤血球、末梢
   血リンパ球の正常組織と反応しない。