JPS63503516A - 抗腫瘍モノクローナル抗体によるヒト癌の放射線免疫検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗腫瘍モノクローナル抗体による ヒト癌の放射線免疫検出 本発明は抗腫瘍モノクローナル抗体によるヒ）・病の放射線免疫検定に関する。

腫瘍関連抗原に特異的な放射性標識抗体が体内の船足着物を検出し５ることはよ く矧られている。本発明はヒト悪性結腸直腸細胞と反応する、放射性物質て標識 された特異的モノクローナル抗体に関する。

本発明方法は、特に結腸直腸領域にある船足着物の存在および位置を正確に＃断 する方法を提供することが判明した。

本発明によれば、 １、本明細書中で以下に記載するハイブリドーマＸＭＭＣＯ’１９１の試料を調 製し； ２、ＸＭＭＣＯ−７９１ハイプリドーマによって産生される関連抗体を分離・精 製して１ｇ０２ｂアイソタイプを得；３、こうして得られた抗体を放射性標識で 標識し；４、有効濃度の上記標識抗体を含む組成物を調製し；５、上記抗体組成 物を患者に投与し； ６、その後放射能の濃度を検出すべ（上記患者をスクリーニングし、それにより 抗体濃度および地定着物の存在を知る； ことからなる腫瘍関連抗原の検出方法が提供される。

抗体は好ましくはヨウ素１３１で標識される。スクリーニングはガンマカメラを 用いて行うことができる。ガンマカメラにより得られた画像は画像鮮明化技法を 用いて鮮明にすることができ、その画像鮮明化技法はｏ＊ｍ７＋ｃおよび１Ｉａ ｔ＋ｔｚ、より成る群の少なくとも１種から選ばれるアイソトープを使用するこ とによる血球および血液トランスフェリンの標識化を伴う。

以下に本発明方法の実施例について添付の図面をお照しながら説明する。

図面において、 第１ｃＬ図は画像鮮明化前の抗体の局在を示す骨盤の腹側放射１ｆｓ画像である 。

第１ｂ図は画像鮮明化後の抗体の局在を示す骨盤の腹側放射線画像である。

第２図は一人の患者の脳に２次疾患が存在することを示す。

第３ａ図は切除標本の放射線画像であり、そして第３ｈ図は隣接結腸壁に小さな 関連ポリープをもつ結！ｉ５腫瘍を示す腸の顕微鏡用切片である。

ハイブリドーマの作製 雄Ｅ　ａ　ｌ　ｂ　／ｃマウスに雪原性肉腫細胞ａ−７９１Ｔの細胞を１０’個 腹腔内注射する。１週間後１０’個の７９１１細胞の２回目の腹腔内接種を行い 、その後融合用ｐｓ、ＦｉＡ摘出の５日前に２Ｘ１０’個の７９１１細胞の心臓 内注射による２次免疫接種を行う。

ｙｉＦ臓を無菌的に取り出し、ＲＰＭ１１６４０培地中でその牌臓を細片化する ことにより組胞忍濁液を調製する。

その後１０６個の脛細胞と１０’個のＰ３Ｎ５１ｅＪ胞とを５０％ポリエチレン グリコールな使用して融合する。次に、ｔｌｌ　Ｉ標識プロティンＡ結合試験を 用いて７９１Ｔ細胞および他の標的に対する反応性について上清をスクリーニン グする。その後、陽性ハイブリドーマはガン（Ｇ％ｓｎ　）ら、Ｉｎｔ、　Ｊ、 　Ｃａｎｃｅｒ　２６　：　１９８０．３２５−３３０に記載されるように０． ３％寒天にクローニングする。本質的には、大量培養した抗体陽性ハイブリドー マ細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＣ８中の０．３％寒天に懸濁し、そしてこれを２５ ｃｍ”培養皿中のラット腹腔滲出細胞の供給細胞層上に重層した０、５％寒天の 薄層上にまいた。

単一細胞から生育するコロニーを分離し、別々に増殖させた。各クローンの上清 を抗７９１Ｔ抗体についてスクリーニングし、陰性クローンは捨てた。

抗体はｐＨ７，５の０．１モルクエン酸リン酸緩衝液中１：１で腹水を希釈する ことにより調製した。こうして調製した液体はその後セファロ〜スープロチイン Ａカラムに通す。カラムを十分に洗浄した後、英国サーＩＪ　−、サウス・クロ イドンのＬＫＢ社から市販されているタイプのＬＫＢウルトラグラッド・グレジ エント・ミキサー（ＬＫＢ　Ｕｌｔｒａｇｒａｄ　ｇｒａｄｉｍｓｔ　ｔｎｉｚ ｍｒ）を使って、流速１２−７時でｐＨ３のクエン酸−リン酸緩衝液を用いて免 疫グロブリンを溶出する。ｐＨ３で溶出した物質を集め、リン酸緩衝液硫酸塩に 対して透析し、そして正圧膜限外濾過により濃縮してＸＭＭＣＯ−７９１モノク ローナル抗体と称するモノクローナル抗体を得た。ハイブリドーマ細胞株ＸＭＭ ＣＯ−７９１は１９８６年８月１４日に２０８５２−１７７６メリーランド州ロ ツクビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショｙ（ＡＴＣＣ）Ｋ寄託 され、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＥ　９１７３を授与された。

こうして産生された抗体は１９７８年にフレーカ−（Ｆｒａｋａｒ）およびスペ ック（Ｓｐｅａｋ）によって開示されたヨードダン法によりヨウ素１３１で標識 する。

標識するために、ヨードゲン（英国チェンジャー、チェスターのピアス・ケミカ ル社から入手し得る１、３゜４．６−チトラクロロー３ｇ　、６ａ−ジフェニル グリコウリル）の３００μｔアリコートは塩化メチレン中で４μｙ／ｄ　の抗体 と混合し、そして英国レスターシェア、レスターのサーステッ）　（Ｓａｒａｔ ａｄｔ　）社から市販されているタイプの円錐形ポリプロピレンチューブ中で窒 素下に蒸発乾固させる。英国プックス、アマ−ジャム、ラジオケミカルセンター から入手し５るタンパク質のヨウ素化に適する等級のヨウ素１３１のヨウ化ナト リウムアイソトープを１■／−の濃度のタンパク質と共にチューブに加え、室温 で１５分間インキュベーションする。反応はヨードゲン伝覆チューブから反応混 合物を取り比すことにより停止させる。遊離の放射性ヨウ素は、リン酸緩衝液硫 酸塩中のセファデックスＧ２５（スウェーテン国つプサラのファーマシ７社から 市販されている）に反応混合物を通過させることにより分離する。

この目的のために、抗体は５　Ｍｅｉ　Ｉ””７５００μ？７９１　Ｔ／３６中 で標識する。抗体調製物中の放射能を計数し、その後その抗体溶液を０．２２ミ クロン膜のフィルターで濾過して滅菌する。次に、約２０μＶの抗体を含む滅菌 調製物２−は注射による投与の準備として滅菌食塩水２００ｗ１１に加える。

実施例３゜ １１人の患者を試験し、そのうち５人は１次結腸直腸８をもつことが知られてお り、残りの６人は以前の側腹切開術で組織学的に確認された、広範囲の散在性疾 患を有していた。２次疾患を有する１人の患者は、放射性標識抗体を注入する２ 週間前に、彼の手術不能の直腸腫瘍に３０Ｇ、の放射線療法用量を受け取った。

もう１人の患者は脳に驕散した２次疾患を有し、そして残りの人達は腹部に制限 された病気をもっていた。患者の平均年齢は６４才（４４オ〜７５才）であり、 ３人は女性であって８人は男性であった。

この試験の性質を１１人の患者に詳しく説明して、彼等の同意を得た。放射性ヨ ウ素の甲状腺による取込みは、抗体注入の少なくとも２４時間前に開始して、２ 週間にわたり６０Ｍ／７日のヨウ化カリウムを投与することにより連断した。ア ナフィラキシ−の試験のために、抗体注入の３０分前にそれぞれの患者の右腕に １ミルの抗体溶液を皮下注射した。抗体を用いて患者のリンパ球をｉ豐Ｎｒｏで 試験し、それにより彼等の正常細胞との交差反応が存在しないことを確かめた。

ｌ１ｌｌ標識抗体の投与後２４時間して、腹部および骨盤（７）ｊｊｌｌｌオよ び背側の画像をガンマカメラで写し、コンピュータで記録した。その他の部位も 必要に応じて画像形成を行った。その後外科手術を受けない患者は４８時間目と ７２時間目に観察した。

画像鮮明化はＣａ５６ｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９８０　：　４０　：３０４ ６−３０４９に報告された１画像形成による放射線免疫検出２と題するプランド （ＤａＬａ％ｄ）らの論文に記載されるパックグラウンド放射能の減算（ａＫｂ ｔデａｃｔｔｏ％）により達成された。患者の赤血球を１ｆ１１７’、で４％１ マ０標識し、そして腫瘍の位置に応じて５５５ｍ７％標識塩化インジウム浴液を 投与して血液トランスフェリンを標識した。

それぞれの画像において記録されたカウント数を同等にするための正規化（龍ｏ ｒｍａｌｉａａｔｉｏ％）の後、血液プールのｅ９ｇｎ７＋、および１１１１％ 画像を対応する１３′Ｉ標識抗体の画像から減算した。１次らをもつ５人の患者 の腫瘍はＩＵ　Ｉ標識抗体の投与後４８時間して切除し、その後すぐに再び画像 形成を行って標識抗体の分布を針側した。組織１２当たりの１３１１標識抗体の 相対的取込みは、腫瘍からの放射能カウント数を測定し、そしてこれらの活性を 正常結腸組織の隣接領域からのカウント数と比較することにより決定した。

結果は下記の表１に示す： 腫瘍 １　７１　１凍結節　中程度 男性　Ｓ状結腸癌 （５ｘ６ｘ２ｃｍ） ２　６６　１凍結節　高　度 女性　直腸Ｓ状結腸癌 （４Ｘ４ｘ３ｃｌＬ） 男性　Ｓ状結腸癌 （４Ｘ３Ｘ３ｃｍ） ４　６７　２つの１次癌　中程度 男性　横行結腸および直腸 ５　６４　１次潰瘍形成性の　高　民 男性　Ｓ状結腸癌 （６Ｘ３Ｘ３ｃｍ） ６　５８　手術後に大綱２°　中程度 男性　を伴う散在性癌 （１０Ｘ１５Ｘ３り ７　７１　手術後に肝臓２°　中程度 男性　を伴う散在性癌 （６Ｘ６Ｘ３二） ８　５０　手術後に肝臓に２°　中程度男性　を伴う散在性癌 ９　７２　３０Ｇ、の放射線　中程度 男性　療法で治療した手 術不耗の直腸帰 １０　４４　手術後、肝臓と脳　中程度男性　に２°を伴う散在性 盲腸帰 （２ｘ２ｘ１ｃｍ’脳） １１　６０　骨盤再発を伴うＳ　中程度女性　状結腸の散在性舶 （６Ｘ６Ｘ５ｃｍ） 表１（綬き） 腫瘍対非腫瘍の比 １９９″’ＴｃＲＥＣポジティブ；　１．５／１　８．０／１１１ｍ−ｈ−骨盤 Ｋ１１次疾 患　”ｆｉＴｅＲＢＣポジティブ；　１．５／１　２．１／１膀胱に付着し た骨盤中に１ 次疾患 ３””ＴｃＲＢＣ検ｍされ一’ｊ； 膀胱の後ろ ４　””ＴｃＲＢＣポジティブ；　１．５／１　２．１／１上胃郁と骨 盤の両方 ５　°”’ＴｅＲＢＣポジティブ；　１．２／１　１．５／１骨盤に１次 疾、ｖＡ ６　””ＴａＲＢＣポジティブ；　２．０／１　８．１／１腹膜および 大綱２゜ ７　””ＴｃＲＢＣポジティブ；　１．２／１　５．１／ｌｌ１ｌ”Ｉｓ−骨盤 および トランスフェリン　肝臓 ８　””ＴｃＲＢＣポジティブ；　１．５／１　４．４／１肝臓に２゜ ９　””ＴｃＲＢＣ；　検出されず　−−ＨｍＴ、硫黄 トランスフェリン １０９−リｃ　ＲＥＣポジティブ；　１．３７１　４．０／１１′坤りｎ−脳お よび肝 トランスフェリン　臓に２゜ １１　１１９９％ＲＢＣ；　ポジティブ；　１．９／１　４．３／ｌｌ１ｌ惧Ｉ ％−直腸の腹側 トランスフェリン　の塊 表２は５つの切除標本の手術後画像形成および計数の結果を示している。

画像に　組＠ｉ？ 対する　当たりの 忍者　腫　瘍　切除塊　腫瘍対　腫瘍対非の大きさ　非腫瘍　腫瘍の力 の比　ラント数 Ｓ状結腸鼎 ケース２１送結節　４Ｘ４ｘ５ｃｍ　２．５／１　５．８／１直腸Ｓ状 結腸癌 結腸癌 ケース４２つの１次３Ｘ３Ｘ２ｃｍ　２．１／１　３．１／１５Ｉ瘍形成性 直腸癌 および 慣行結Ｍ＆　４Ｘ４Ｘ２ｃ！ｒＬ　２．０／１　計数さケース５１次潰瘍形　６ Ｘ３ｘ３ｃｍ　１．５／１　１．１／１成性Ｓ状 結腸楠 壷　画像上に確認された診断未確定の癌前述のことから１１人の患者はすべて本 方法に十分耐えることができ、都合の慾い反応は全く起こらないことが認められ るだろう。体温および脈拍数は抗体注入の間および注入後２週間にわたって安定 したままであり、そして予備注入インキュベーション試験の間患者の小さいリン パ球はモノクローナル抗体と交差反応しなかった。

１１人の患者のうち１０人において、注入したヨウ素１３１標識抗体は表１に示 した癌定着物の中に局在下し、その際腫瘍対非腫瘍の平均比は減算前が１．５７ １であり、血液プールについての減算後が４．４　／　１であった。ネガティブ の手術前試験の１つ（３の場合）では、切除した標本のその後の画像はポジティ ブであり４表２）、この患者の腫瘍を証明する際の最初の失敗はそれが膀胱によ って覆い隠されていた結果であると考えられた。抗体からのヨウＸ１３１のＮ％ ｇｉ９０放出および尿中へのその排泄はすべての患者において膀胱画像をもたら した。

ガンマカメラでポジティブ画像を示した９つの場合において、その画像形成部位 は臨床的に又は手術で証明された腫瘍部位と正確に一致した。

第１９（６の場合）は腹水および明らかな触知可能な再発を有する女性の骨盤か ら発生した大きい大綱塊（０鴬ｅｎｔａｌ常ａ８１）を示す。４の場合では、１ 次直腸癌が手術前に確認されたばかりでなく、これまで診断未確定の第２の同期 腫瘍も発見された。バリウム注腸試験はもとの直腸癌を証明したにすぎなかった 。１０の場合には、脳の２次疾患が明らかに確認された（第２図参照）。

これは患者の右手側麻痺と一致し、あとで検死により確かめられた。これは確認 された腫瘍のうちで最も小さかつた。それは２Ｘ２Ｘ１αの大きさであった。腫 瘍の病期、肉眼的外観または顕微鏡的グレード（分化の程度）と抗体の取込みと の間には相関関係が全くなかった。

１次腫瘍をもつ５人の患者のうち４人はポジティブの手術前画像を有しくネガテ ィブ画像は患者の膀胱が腫瘍を見えなくしていたために生じた）、そして切除し た標本はすべて癌定着物による抗体取込みを立証したＣ表２参照）。標本でのａ 瘍対非腫瘍の平均取込み比は２．１（１，５〜２．５７１の範囲）であり、４の 場合には２つの切除腫瘍が約２／１の取込み比での画像形成により確認された。

あらゆる場合に、ヨウ素１３１標識モノクローナル抗体の局在は腫瘍の大きさお よび外形と正確に一致した。第３図は達成された局在下の程度を示している。

結節腫瘍が観察されるばかりでなく、厘径１αのポリープも明らかに確認できる 。

切除標本における、癌組織１１当たりのカウント数は正常結腸のそれに比べて１ ．１　／　１〜５．８　／　１の範囲であり、平均値は２．８　／　１であった 。標識抗体注入の２日後に腫瘍を切除した２人の患者（１および２の場合）では 、切除腫瘍は腫瘍組織」？当たり注入用量の０．００５％のヨウ素１３１を含有 していた。

ハイプリドーマ細胞株ＸＭＭＣＯ−７９１は１９８６年８月１４日に２０８５２ −１７７６メリーランド州ロツクビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クションＣＡＴＣＣ）に寄託され、セしてＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９１７３を付与 された。

第１Ａ図 第１Ｂ図 ９９“Ｔｃ二月１簗 第３八図 ゛第３８図 国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．（ｉ）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９１７３をもつハイブリドーマＸＭＭＣＯ−７ ９１の試料を調製し；（ｉｉ）腫瘍関連抗体ＸＭＭＣＯ−７９１を分離・精製し てＬｇＧ２ｂアイソタイプを得； （ｉｉｉ）こうして得られた抗体を放射性標識で標識し；（ｉＶ）有効濃度の上 記標識抗体を含む組成物を調製し；（ｖ）上記抗体組成物を患者に投与し；そし て（ｖｉ）放射能の濃度を検出すべく上記患者をスクリーニングし、それにより 抗体濃度を知る；ことから成る、腫瘍関連抗原の検出方法。
2. ２．抗体をＩ１３１で標識する、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．スクリーニングはガンマカメラを用いて行う、請求の範囲第２項記載の方法 。
4. ４．画像鮮明化技法を使用する、請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．画像鮮明化技法は９９ｍＴｃおよび１１３ｍＩｎ５より成る群の少なくとも １種から選はれるアイソトープによる血球および血液トランスフェリンの標識化 を伴う、請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．４ＴＣＣ寄託番号ＨＢ９１７３をもつハイブリドーマ細胞株ＸＭＭＣＯ−７ ９１。
7. ７．ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９１７３をもつハイブリドーマ細胞株ＸＭＭＣＯ−７ ９１により産生されるモノクローナル抗体またはその活性断片。
8. ８．ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９１７３をもつハイプリドーマ細胞株ＸＭＭＣＯ−７ ９１により産生されるものと実質的に同じ結合活性を有するモノクローナル抗体 またはその活性断片。