CS260748B1 - Myší lymfocytární hybridom produkující protilátku proti lidskému erytrocytárnímu skupinovému antigenu A - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskému erytrocytárnímu skupinovému antigenu A, uloženého ve sbírce hybromidů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením HE-14. Monoklonální protilátka hybridomu HE-14 je vhodná jako součást diagnostického panelu obsahujícího také monoklonální protilátky HE-10, HEB-20 a HEB-27 k upřesnění patologicko anatomické diagnózy nádorových onemocnění tenkého a tlustého střeva.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, to je hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného· fúzí buňky myší myelomové linie P3-X63 Ag8.653 a myší slezinné lymfoidní buňky produkující protilátku proti lidskému erytrocytárnímu .skupinovému antigenu A.

Diagnostická· séra proti lidskému erytrocytárnímu skupinovému antigenu A [zkráceno diagnostická séraanti-A) jsou základní složkou souborů diagnostických sér sloužících k určení skupinové příslušnosti lidských erytrocytů v systému ABO. Vyšetřování skupinové příslušnosti v systému ABO je základním a nejčastějším sérologickým vyšetřením v humánní hematologické a transfúzní praxi. Provádí se např. jako základní součást úplného předtransfúzního vyšetření, kontroly krevní skupiny u lůžka při začátku krevní transfúze, sérologických vyšetřování rodiček a vyšetřování novorozenců.

Výskyt antigenů krevně skupinového systému ABO není omezen pouze na erytrocytární membrány. Ve formě glykoproteinů se nacházejí např. v sekretech žlázových, buněk gastrointestinálního, genitálního a· respiračního traktu. Antigenní sacharidové struktury jsou rovněž součástí buněčných membrán epiteliáiní tkáně, přičemž pozornost se soustřeďuje na změny v expresi těchto antigenů v souvislosti s vývojovými, diferenciačními a zejména nádorovými procesy. Značný počet imunohistochemických studií prokázal, že např. u karcinomů plic, žaludku, prostaty a močového měchýře dochází ke ztrátě A a B isoantigenů, které jsou normálně přítomny ve zdravé epiteliáiní tkáni.

Krevně skupinové antigeny A a B jsou přítomny také v epileliálních buňkách sliznice tlustého střeva lidského plodu. Po narození zůstávají zachovány v proximální části, rychle však mizí v distální části tračníku. Krevně skupinové antigeny se znovu objevují u distálně lokalizovaných karcinomů — — např. v esovité kličce a rektu — a stávají se významným, diagnostickým znakem rozvoje nádoru.

Diagnostická séra anti-A se dosud většinou připravují z lidské krve vybraných dárců, u nichž byly předem prokázány přirozené vysoké hodnoty aglutininů anti-A nebo z krve dobrovolných dárců záměrně imunizovaných slinami vylučovatelů skupinově specifické substance A, příp. substancí A připravenou z lidských slin nebo zvířecího materiálu — např. žaludeční mukózy prasat ěi koní. Substance užívané k imunizaci lidských dobrovolníků je nezbytné podrobit státní kontrole sterility, neškodnosti a účinnosti. Protože koncentrace žádaných protilátek v> séru klesá po imunizaci s časem, je •nutné provádět imunizaci opakovaně. Imunizace dobrovolníků izolovanými substancemi mohou být provázeny nepříznivými projevy.

Vedle žádaných protilátek anti-A se v séru každého záměrně imunizovaného i ne4 imunizovaného dárce vyskytují v· heterogenní — složením vždy jedinečné a neopakovatelné směsi — mnohé další protilátky·, z nichž některé přímo ovlivňují reakci séra s erytrocyty a znehodnocují diagnostickou účinnost získaného séra. Takové protilátky je nezbytné ze séra odstranit. Standardizace jednotlivých šarží diagnostických sér je při stávajícím způsobu přípravy obtížná a vždy neúplná, neboť z vlastní podstaty dosavadní přípravy sér vyplývá nemožnost získat dvě výrobní šarže stejných vlastností. Nepříznivým rysem dosavadního způsobu přípravy diagnostických sér anti-A spotřeba velkých množství lidské krve.

Mnohé z uvedených problémů dosud používaného postupu přípravy diagnostických lidských sér anti-A a řadu obtíží vyplývajících z nepříznivých vlastností současných diagnostických sér je možné odstranit zavedením přípravy myších monoklonálních protilátek anti-A, produkovaných lymfocytárními hybridomy.

Takovéto hybridomy produkující protilátky byly připraveny v řadě zemí i v ČSSR a v některých z nich jsou již komerčně dostupné a začínají se používat ·ν· klinické serologické praxi. Jde např. o výrobky firem

Serotec (Anglie),

Immunotech (Francie),

Biotest-Diagnostics (NSR),

Diagnostics Pasteur (Francie],

Celtech (Anglie).

V ČSSR dosud chráněné hybridomy (HE-24 AO 229 996, HE-02 AO 228 859), produkují protilátky nevhodné pro použití v. imunohistochemii. Nabízené protilátky v zahraničí jsou určeny pro sérologické vyšetření krevních skupin. Žádná z uvedených zahraničních firem neuvádí možnost využití nabízených protilátek v imunohistochemii.

Uvedené nevýhody odstraňuje hybridom, uložený ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská ul. 1083 pod označením IMG CZAS HE-14, který je zdrojem monoklonální protilátky proti lidskému erytrocytárnímu skupinovému antigenu A.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, O.: Production of monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth.: 35: 1, 1985; Galfré, G., Howe, S. S., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře, 266 : 550, 1977} klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných slinami vylučovatele skupinově specifické substance A.

Lymfocytární hybridom HE-14 produkuje zcela homogenní protilátku, tzv·. protilátku monoklonální, specificky reagující s lidskými typovými erytrocyty Al, AiB ,a A2 a která nereaguje s erytrocyty AžB, B a O. Hybridóm HE-14 je možné kultivovat v podmínkách in vitro v kultivačních médiích vhodných pro živočišné buňky nebo v podmínkách in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Hybridóm HE-14 je možné dlouhodobě uchovávat v konzervách uložených v kapalném dusíku. Produkci protilátky je možné zahájit po rozmražení buněčné konzervy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu. Monoklonální protilátka produkovaná hybrídomem HE-14 je specifická pro lidský erytrocyíární skupinový antigen A a je prostá jakýchkoliv balastních protilátek.

Příklad

Za účelem pomnožení buněk hybridomu HE-14 v podmínkách in vitro bylo vpraveno 1 X 10® hybridomových buněk do kultivační láhve Legroux obsahující 20 ml kultivačního média RPMI (ÚMG ČSAV). Po třech dnech růstu kultury hybridomových buněk bylo z láhve získáno kultivační médium obohacené o monoklonální protilátku HE-14 uvolňovanou do mádla hybridomovými buňkami. Účinnost monoklonální protilátky HE-14 byla testována postupným dvojnásobným ředěním kultivačního média obsahujícího monoklonální protilátku v prostředí izotonického roztoku chloridu sodného v aglutinačních zkumavkách pdle oborové normy T a b u 1 k a

ON 84 3225. Kultivační médium aglutinovalo na -ý- (podle ON 84 3225) erytrocyty Ai v ředění 1 : 32, erytrocyty AiB v ředění 1 : 16, erytrocyty Až v ředění 1: 2. S erytrocyty AžB, B a O kultivační médium obsahující monoklonální protilátku HE-14 nereagovalo.

Pro testování reaktivity protilátky HE-14 na tkáňových řezech byly bioipttcké vzorky odebírány z několika míst tlustého střeva, fixovány ve formaldehydu a zality do parafinu. Po odparafínovaní řezů byla aplikována protilátka HE-14 (naředěný supernatantj a její vazba na terčové struktury byla sledována pomocí prasečí protilátky proti myšímu imunoglo-bulinu značené křenovou peroxidázou (Ústav sér a očkovacích látek, Praha). Protilátka HE-14 výrazně barvila na řezech z normální tkáně difúzně buňky epitelu krypt s maximem v prcximální části tlustého střeva a vymizením .pozitivity v oblasti esovlté kličky a konečníku. Pozitivní reakce se projevila v oblasti distálního tračníku. Pozitivní reakce se projevila v oblasti distálního tračníku pouze ve vzorcích z nádorové tkáně (adenokareinoím sigmoidea). Obraz získaný při použití protilátky HE-10 byl zásadně odlišný, byly barveny pouze supranuklenární oblasti buněk a pozitivní reakce byla přítomna též v epiteliálních buňkách v sousedství nádoru. Silná pozitivní reakce byla též pozorována s přítomnými erytrocyty. Výsledky jsou shrnuty v tabulce.

Reaktivita monoklonálních protilátek v tkáňových řezech¹

Monoklonální protilátka Cílový antigen pacientů s krevní skupinou A

Tračník

Distální tračník

Adenokarcinom distálního tračníku

HE-14 A

HE-10 ,A

HE-02 A

HE-18 A

HE-24 A

HEB-20 B !+ — 1+ !+² - +²

Poznámka:

¹ fixace formolem, zalití do parafinu ² lokalizace v buňkách pouze v oblasti Golgiho aparátu

260

Buňky hybridomů HE-14 mají ultrastrukturální obraz typických myelomových buněk, kde převažující organelou jsou volné a na membrány vázané polyribosomy. V podmínkách in vitro rostou v podobě polosuspenzních kultur. Základními kultivačními médii jsou RPMI nebo Eaglovo· minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí, doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3mM) a pyruvát sodný (lmMj médium označované jako H-MEMd, Ostav molekulární genetiky ČSAV). Média jsou pro kultivaci hybridomů HE-14 doplněna penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (5 X ΙΟ^-5 M), pufrem HEPES (2 — 4 X 10^-3 M) a inaktivovaným bovinním sérem pro TK (Bloveta n. p., Ivanovice na Hané, 101%). Pro získávání kultivačního média obohaceného· o monoklonální protilátku HE-14 (supernatantu kultury hyhridomových buněk) k diagnostickým účelům je v kultivačním médiu nahrazeno in•aktivované bovinní sérum inaktivovaným fetálním telecím sérem.

Hybridom HE-14 je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 17 hodin, modální počet chromosomů 40 měsíců po sestrojení (fúzi) je 70 chromosomů. Produkovaná monoklonální protilátka je myší imunoglobulin třídy IgM, kappa.

Monoklonální protilátka produkovaná myším lymfocytárním hybridomem HE-14 může být využita ve zdravotnické praxi jako součást diagnostického panelu obsahujícího také monoklonální protilátky HE-10, HEB-20 a HEB-27 k upřesnění patologicko anatomické diagnózy nádorových onemocnění tenkého a tlustého střeva.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT

   Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS HE-14, produkující monoklonální protilátku

   YNÁLEZU proti lidskému erytrocytárnímu skupinovému antigenu A třídy IgM.