CS276441B6

CS276441B6 - Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS HE-182

Info

Publication number: CS276441B6
Application number: CS902925A
Authority: CS
Inventors: Milos Rndr Csc Nemec; Jan Mudr Csc Vanak; Dagmar Mudr Csc Drimalova; Vladimir Mudr Csc Viklicky
Original assignee: Nemec Milos; Jan Mudr Csc Vanak; Dagmar Mudr Csc Drimalova; Viklicky Vladimir
Priority date: 1990-06-13
Filing date: 1990-06-13
Publication date: 1992-05-13
Also published as: CS292590A3

Abstract

Lymfocytární hybridom, produkující proti- ' látku proti lidskému skupinovému antigenu H, uložený ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze pod označením IMG CZAS HE-182. Samotná monoklonální protilátka hybridomů HE-182 je vhodná pro použití ve zdravotnické praxi jako imunohistochemické diagnostikům skupinového antigenu H v soupravě diagnostik skupinových antigenů ABO systému, obsahující monoklonální protilátky HE-10, HE-14, HEB-20, HEB-27 a HE-181, určené k upřesnění patologicko-anatomické diagnózy nádorových onemocnění epiteliálních tkání člověka.

Description

Vynález se týká nového hybridomů, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeněho fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/O-Agl4 a myší slezinné lymfoidní buňky produkující protilátku proti lidskému skupinovému antigenu H.

Antigeny A, 8 a H lidského skupinového systému ABO jsou tradičně nazývány antigeny krevních skupin. Vyšetřování skupinové příslušnosti erytrocytů v systému ABO je základním a nejčastějším sérologickým vyšetřením v humánní hematologické a transfúzní praxi. Provádí se například jako základní součást úplného předtransfúzního vyšetření, kontroly krevní skupiny u lůžka při začátku krevní transfúze, sérologických vyšetřování rodiček a vyšetřování novorozenců.

Výskyt A, B a H skupinových antigenů však zdaleka není omezen jen na erytrocyty. Antigeny systému ABO patří k hlavním aloantigenním znakům epiteliálních buněk a byly prokázány i na některých typech neuronů. Z teoretických i praktických hledisek poutají značnou pozornost změny v expresi A, B i H skupinových antigenů provázející vývojové, diferenciační a nádorové procesy v epiteliálních buňkách. Řada studií prokázala, že s rozvojem karcinomů plic, žaludku, prostaty nebo močového měchýře dochází ke ztrátě A, B a H skupinových antigenů, které jsou ve zdravé epiteliální tkáni přítomny. Odlišnou expresí skupinových antigenů se vyznačuje epitel sliznice tlustého střeva. Jestliže v prenatalním období jsou skupinové sntigeny ABO systému přítomny v epitelu celého tlustého střeva, potom po narození zůstávají zachovány v proximální části, rychle však mizí v distální části tračníku, znovu se objevují v souvislosti s rozvojem distálně lokalizovaných karcinomů - například v esovité kličce a rektu - a stávají se tak významnými diagnostickými znaky nádorového procesu.

Kvalitativním zlomem ve studiu struktury a tkáňové lokalizace antigenů ABO systému bylo zavedení monoklonálních protilátek připravovaných hybridomovou technologií. Komerčně dostupné monoklonální protilátky proti skupinovým antigenům A a B, dodávané například firmami Celtech (Velká Británie), Serotec (Velká Británie), Biotest-Diagnostics (NSR), Immunotech (Francie) a Diagnostics Pateur (Francie)·, jsou ve vyspělých státech zaváděny do klinické praxe jako serologická typizační diagnostika krevních skupin, která díky vysoké specifičnosti, účinnosti a standardnosti postupně vytlačují klasická diagnostická séra připravovaná z lidské krve. Serologická diagnostika na bázi monoklonálních protilátek proti skupinovým antigenům A a B již byla vyvinuta také v Československu.

Monoklonální protilátky - produkty lymfocytárních hybridomů - se rostoucí měrou prosazují také jako imunohistochemická a imunocytochemická diagnostika antigenů ABO systému v onkologických výzkumech i praxi patologicko-anatomických pracovišt. Jako například lze uvést anti-A, anti-B a anti-H monoklonální diagnostika společnosti Dakopatts (Dánsko, USA). V Československu byla ve spolupráci Ústavu molekulární genetiky v Praze a Ústavu sér a očkovacích látek v Olomouci vyvinuta souprava pro enzymoimunologickou detekci skupinových antigenů A a B na tkáňových řezech po fixaci formolem a zalití do parafinu. Souprava, založená na monoklonálních protilátkách produkovaných hybridomy HE-10 (AO 260 746), He-14 (A0 260 748), HEB-20 (AO 260 747) a HEB-27 (AO 260 749), byla s úspěchem prakticky prověřena při imunohistochemické diagnostice nádorových onemocnění epiteliálních tkání - například sliznic tlustého střeva. V současnosti bude možné doplněním soupravy o dosud chybějící monoklonální protilátky proti skupinovému antigenu H rozšířit její využití i na pacienty s krevní skupinou 0.

Zdrojem monoklonální protilátky proti lidskému skupinovému antigenu H je hybridom, uložený ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská 1083 pod označením IMG CZAS HE-182.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, 0.: Production of monoclonal antibodies: Strategy and tactics, J. Immunol. Meth. 35 : 1 , 1985; Galfré, G., Hoše, S. S., Milstein, C., Butcher, G. W. ,

CS 276441 B 6 2

Howard, 1. C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines, Nature, 266: 550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie Sp2/0-Agl4 a buněk získaných ze sleziny myši kmene BALB/c, imunizované lidskými erytrocyty krevní skupiny A,,.

Lymfocitární hybridom HE-182 produkuje monoklonální protilátku proti skupinovému antigenu H. Hybridom HE-182 je možné kultivovat V podmínkách in vitro v kultivačních médiích vhodných pro savčí buňky nebo v podmínkách in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Hybridom HE-182 je možné dlouhodobě uchovávat v konzervách uložených v kapalném dusíku, Produkci protilátky je možné zahájit po rozmražení buněčné konzervy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu. Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem HE-182 je specifická pro lidský skupinový antigen H a je prostá jakýchkoliv balastních protilátek.

Příklad .

Za účelem pomnožení buněk hybridomu HE-182 v podmínkách in vitro bylo vpraveno 1 x 10^ hybridomových buněk do kultivační lahve Legroux obsahující 20 ml kultivačního média RPMI obsahujícího 10% fetálního telecího séra. Po třech dnech růstu kultury hybridomových buněk bylo z lahve získáno kultivační médium obohacené o monoklonální protilátku HE-182 uvolňovanou do média hybridomovými buňkami.

Specifičnost a hemaglutinační účinnost monoklonální protilátky HE-182 byla testována makrotitrací v aglutinačních zkumavkách postupným dvojnásobným ředěním kultivačního média, obsahujícího monoklonální protilátku, izotonickým roztokem chloridu sodného podle společné oborové normy ON 86 4500. Výsledky vyšetřehí specifičnosti a účinnosti protilátky HE-182 se souborem typových erytrocytů a srovnání s požadavkem oborové normy ON 86 4508 pro diagnostikům určující skupinu H lidské krve jsou uvedeny v tabulce č. 1.

Tabulka č. 1

Výsledky sérologického vyšetření kultivačního média obsahujícího monoklonální protilátku HE-182 podle oN 86 4500

Krvinky skupiny	Počet vyšetření	Titr	Požadavek ON 86 4508
^A1 .	12	4-8+	negativní
^A2	10	32-64+	16+
	8	8-16 +	negativní
^a ₂b	6	16-32+	norma neuvádí
B	10	16-32+	norma neuvádí
0	10	64-256+	norma neuvádí
0 (fenotyp Bombay)*	2	negativní	norma neuvádí

+ skupinový antigen H chybí (h/h genotyp)

Ze skupiny sérologických vyšetření, jejichž výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 1, je zjevné, že monoklonální protilátka HE-182 reaguje v hemaglutinačním testu se skupinovým antigenem H v membránách erytrocytů. Vedle celkového obrazu reaktivity protilátky HE-182, který odpovídá dosud publikovaným výsledkům, dosženým pomocí zahraničních anti-H monoklonálních protilátek, je nejpřesvědčivějším důkazem specifičnosti protilátky HE-182 nega

CS 276441 B 6 tivní výsledek s erytrocyty, v nichž skupinový antigen H chybí (erytrocyty 0-fenotyp Bombay). Neředěné kultivační médium obsahující protilátku HE-182 nedává s erytrocyty a . AjB zcela negativní reakci: protilátka HE-182 proto v dané formě nemůže sloužit jako sérologické diagnostikům anti-H ve smyslu oborové normy ON 86 4508 k bezpečnému odlišení krevních skupin A^ a popřípadě A^B a A£B. Může však být použita k sérologickým vyšetřováním přítomnosti skupinového antigénu H na erytrocytech.

Z hlediska praktického využití je významné, že monoklonální protilátka HE-182 reaguje se skupinovým antigenem H na tkáňových řezech po fixaci formolem a zalití do parafinu a jako imunohistochemické diagnostikům se plně vyrovná standardnímu anti-H diagnostiku prodávanému společností Oakopatts (Dánsko, USA). '

Buňky hybridomu HE-182 mají morfologický obraz typických myelomových buněk. V podmínkách in vitro rostou v podobě polosuspenzních kultur. Základními kultivačními médii jsou RPMI nebo Eaglovo esenciální médium s Hanksovou solnou směsí, doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3mM) a pyruvát sodný (ImM) (médium označované jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV). Média jsou pro kultivaci hybridomu HE-182 doplněna penicilinem, streptomycinem, 2-merkaptoetanolem (5 x 10^), pufrem HEPS (2 - 4x 10^-5 M) a inaktivovaným bovinním sérem pro TK (Bioveta, n.p., Ivanovice na Hané 10 %). Pro získávání kultivačního média obohaceného o monoklonální protilátku HE-182 (supernatantu kultury hybridomových buněk) k diagnostickým účelům je v kultivačním médiu nahrazeno inaktivní bovinní sérum fetálním telecím sérem.

Hybridom HE-182 je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 16 hodin. Produkovaná monoklonální protilátka je myší imunoglobulin třídy IgM.

Monoklonální protilátka produkovaná myším lymfocytárním hybridomem HE-182 může být využita ve zdravotnické praxi jako součást kolekce imunohistochemických diagnostik skupi-’ nových antigenů ABO systému obsahující také monoklonální protilátky HE-10, HE-14, HEB-20 a HEB-27 k upřesnění patologickoanatomické diagnózy nádorových onemocnění epiteliálních tkání člověka.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS HE-182 produkující monoklonální protilátku IgM proti lidskému skupinovému antigénu H.