CS261297B1

CS261297B1 - Myší lymfocytární hybridom produkující protilátku proti lidskému krevná skupinovému antigenu B

Info

Publication number: CS261297B1
Application number: CS875458A
Authority: CS
Inventors: Vladimir Viklicky; Dagmar Drimalova; Jan Vanak; Milos Nemec
Original assignee: Vladimir Viklicky; Dagmar Drimalova; Jan Vanak; Milos Nemec
Priority date: 1987-07-20
Filing date: 1987-07-20
Publication date: 1989-01-12
Also published as: CS545887A1

Abstract

Řešeni se týká myšího lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskému krevně skupinovému antigenu B, uloženého ve sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV pod označením IMG ČZAS HEB-29. Monoklonální protilátka hybridomu HEB-29 je využitelná jako rutinní diagnostikům k sérologickým vyšetřováním lidského krevního skupinového antigenu B.

Description

Vynález se týká nového hybridomů, to je hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie Sp 2/0 a myší slezinné lymfoidní buňky produkující protilátku proti lidskému erytrocytárnímu skupinovému antigenu B.

Diagnostická séra proti lidskému erytrocytárnímu skupinovému antigenu B /zkráceně diagnostická séra anti-B/ jsou základní složkou souborů diagnostických sér sloužících k určení skupinové příslušnosti lidských erytrocytů v systému ABO. Vyšetřováni skupinové příslušnosti v systému ABO je základním a nejčastějším sérologickým vyšetřením v humánní, hematologické a transfúzní praxi. Provádí se např. jako základní součást úplného předtransfúzního vyšetření, kontroly krevní skupiny u lůžka při začátku transfúze, sérologiokýoh vyšetřování rodiček a vyšetřování novorozenců.

Diagnostická séra anti-B se dosud většinou připravují z lidské krve vybraných dárců, u nichž byly předem prokázány přirozené vysoké hodnoty aglutininů anti-B nebo z krve dobrovolných dárců záměrně imunizovaných slinami vylučovatelů skupinově specifické substance B, příp. substancí B připravenou z lidských slin nebo zvířecího materiálů - např. žaludeční mukózy prasat či koní. Substance užívané k imunizaci lidských dobrovolných dárců je nezbytné podrobit státní kontrole sterility, neškodnosti a účinnosti. Protože koncentrace žádaných protilátek v séru klesá po imunizaci s časem, je nutné provádět imunizaci opakovaně. Imunizace dobrovolníků izolovanými substancemi mohou být provázeny nepříznivými projevy, jimž lze předcházet pouze desenzibilizací imunizovaných jedinců. Dosud užívaný způsob přípravy diagnostických sér anti-B klade tedy značné nároky na materiální, kádrové, metodické i organizační zajištění výrobního procesu.

Vedle žádaných protilátek anti-B se v séru každého záměrně imunizovaného i neimunizovaného dárce vyskytuji v heterogenní - složením vždy jedinečné a neopakovatelné směsi - mnohé další protilátky, z nichž některé přímo ovlivňují reakci séra s erytrocyty a znehodnocují diagnostickou účinnost získaného séra. Takové protilátky je nezbytné ze séra odstranit. Standardizace jednotlivých šarží diagnostických sér je při stávajícím způsobu přípravy obtížná a vždy neúplná, neboř z vlastní podstaty dosavadní přípravy sér vyplývá nemožnost získat dvě výrobní šarže stejných vlastností. Nepříznivým rysem dosavadního způsobu přípravy diagnostických sér anti-B je spotřeba velkých množství lidské krve.

Mnohé z uvedených problémů dosud používaného postupu přípravy diagnostických lidských sér anti-B a řadu obtíží vyplývajících z nepříznivých vlastností současných diagnostických sér je možné odstranit zavedením přípravy myších monoklonálních protilátek anti-B, produkovaných lymfocytárnimi hybridomy.

Podobné hybridomy produkující protilátky byly připraveny v řadě zemí a v některých z nich jsou již komerčně dostupné a začínají se používat v klinické serologické praxi.

Jde např. o výrobky firem Serotec (Anglie), Immunotech (Francie), Biotest-Diagnostics (NSR), Diagnostics Pasteur (Francie), Celtech (Anglie). Nabízené protilátky v zahraničí jsou určeny pro serologické vyšetření krevních skupin. V Československu byly připraveny a jsou chráněny hybridomy HEB-20 a HEB-27, produkující protilátky proti .krevně skupinovému antigenu B, -vhodné pouze k použití v imunohistochemii a nevhodné pro použití v sérologii.

Uvedený nedostatek odstraňuje hybridom, uložený ve sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská ul. 1 083 pod označením IMG HEB-29, který je zdrojem monoklonální protilátky proti lidskému erytrocytárnímu skupinovému antigenu B. Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, 0.: Production og monoclonal antibodies: Stratégy and tactics, J. Immunol. Meth.: 35: 1,

1980; Galfré, G., Howe, S. S., Milstein, C., Butoher, G. W., Howard. J. C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš, Nátuře, 266: 550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie Sp 2/0 a buněk, získaných ze sleziny myší F^, /BALB/c χ B 10.A/, imunizovaných erytrocyty skupiny B. .

Lymfocytární hybridom HEB-29 produkuje zcela homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, specificky reagující s lidskými typovými erytrocyty B, A^B a A₂B, která nereagu je s erytrocyty A^, A₂ a 0. Hybridom HEB-29 je možné kultivovat v podmínkách j.n vitro v kultivačních médiích vhodných pro živočišné buňky nebo v podmínkách in vivo v peritoneální dutině myší /BALB/c χ B ÍO.A/F^. Hybridom HEB-29 je možné dlouhodobě uchovávat v konzervách uložených v kapalném dusíku. Produkci protilátky je možné zahájit po rozmražení buněčné konzervy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu. Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem HEB-29 je specifická pro lidský erytrocytární skupinový antigen B a je prostá jakýchkoliv balastních protilátek.

Monoklonální protilátka HEB-29 tvoří základ diagnostika, které plně odpovídá všem požadavkům současné oborové normy pro diagnostická séra anti-B /tj. avidita 15 sekund s celou krví v podmínkách kontroly u lůžka, minimální titr ve zkumavkovém hemaglutinačním testu 256 a účinnost při vyšetření aglutinogenu B sklíčkovou, destičkovou i zkumavkovou metodou/. Růstové a produkční vlastnosti hybridomu jsou velmi dobré a při srovnání se zahraničními protilátkami jsou základem pro ekonomicky výhodné využití protilátky HEB-29 jako základu komerčně připravovaného a prodávaného testovacího diagnostika.

Příklad

Za účelem pomnožení buněk hybridomu HEB-29 v podmínkách in vitro bylo vpraveno 1x10® hybridomových buněk do kultivační lahve Legroux obsahující 20 ml kompletního kultivačního média RPMI s fetálním telecím sérem Π8!. Po třech dnech růstu kultury hybridomových buněk tylo z láhve získáno kultivační médium obohacené o monoklonální protilátku HEB-29 uvolňovanou do média hybridomovými buňkami.

Účinnost monoklonální protilátky HEB-29 byla testována postupným dvojnásobným ředěním 5krát zahuštěného kultivačního média obsahujícího monoklonální protilátku v prostředí izotonického roztoku chloridu sodného v aglutinačních zkumavkách podle oborové normy ON 84 3225. Zahuštěné kultivační médium aglutinovalo na + /podle ON 84 3225/ erytrocyty Β v ředění 1:256. S erytrocyty Ap A₂ a 0 zahuštěné kultivační médium obsahující monoklonální protilátku HEB-29 nereagovalo.

Avidita monoklonální protilátky HEB-29 byla testována s 10% suspenzí erytrocytů B nebo A^B jednoupromytých a suspendovaných v izotonickém roztoku chloridu sodného na čistém podlotním skle podle oborové normy ON 86 4511. K počátku aglutinace erytrocytů B od různých dárců docházelo za 5 až 14 sekund k počátku aglutinace erytrocytů A^B od různých dárců za 8 až 15 sekund.

Tabulka

Srovnání účinnosti a avidity monoklonální protilátky HEB-29 s reaktivitou monoklonálních protilátek anti-B produkovaných hybridomy dosud přihlášenými v ČSSR jako vynálezy

Protilátka	B	Erytrocyty Α_χΒ titr/čas	^A1	a₂	0
HEB-29	256+/5-14S	256+/8-15s	-	-	-
HEB-20	32+/300S	16+/300S	-	-	-
HEB-27	16+/45-150s	16+/55-200S	-	-	-
diagnost. sérum	256+/7-15S	256+/9-25S

anti-B

SEVAC

Buňky hybridomů HEB-29 mají ultrastrukturální obraz typických myelomových buněk, kde převažující organelou jsou volné a na membrány vázané polyribosomy. V podmínkách in vitro rostou v podobě polosuspenznich kultur. Základními kultivačními médii jsou RPMI nebo Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí, doplněná o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin /3mM/ a pyruvát sodný /lmM/ /médium označované jako H-MEMd, Ostav molekulární genetiky ČSAV/. Média jsou pro kultivaci hybridomů HEB-29 doplněna penicilinem, streptomycinem, — 5 -3

2-merkaptoetanolem /5x10 M/, pufrem HEPES /2 až 4x10 M/ a inaktivovaným bovinním sérem pro TK /Bioveta n.p., Ivanovice na Hané, 10%/. Pro získávání kultivačního média obohaceného o monoklonální protilátku HEB-29 /supernatantu kultury hybridomových buněk/ k diagnostickým účelům je v kultivačním médiu nahrazeno inaktivované bovinní sérum fetálním telecím sérem /5 až 10%/.

Hybridom HEB-29 je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 15,5 hodin, modální počet chromosomů 40 měsíoů po sestrojení /fúzi/ je 84 chromosomů. Produkovaná protilátka je myší imunoglobulin třídy IgM, kappa.

Monoklonální protilátka produkovaná myším lymfocytárnim hybridomem HEB-29 může být využita ve zdravotnické praxi k rutinním serologickým vyšetřováním lidského krevního skupinového antigenu B.

Claims

předmEt vynálezu

Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS HEB-29, produkující monoklonální protilátku třídy IgM proti lidskému erytrocytárnímu skupinovému antigenu B.

Severografia, n, p., MOST

Cena 2,40 Kčs