CS229995B1 - Myší lymfocytární hybridom - Google Patents

Abstract

Vynález se týká myšího, lymfocytárního hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskému erytrocytarnimu skupinovému antigenu A, uloženého ve sbírce hybridomu Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením HE-24. Samotna monoklonální protilátka hybridomu HE-24 je vhodná pro odlišení lidského erytrocytárniho antigenu podskupiny AiB od antigenu podskupiny A2B ve zdravotnické praxi.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzi buňky myší myelomové linie P3-X63-Ag0.653 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti lidskému erytrocytárnímu skupinovému antigenu A.

Diagnostická séra proti lidskému erytrocytárnímu skupinovému antigenu A /zkráceně diagnostická séra anti-A/ jsou základní složkou souborů diagnostických sér sloužících k určení skupinové příslušnosti lidských erytrocytfl v systému ABO. Vyšetřování skupinové příslušnosti v systému ABO je základním a nejčastějším sérologickým vyšetřením v humánní hematologické a transfúzní praxi. Provádí se např. jako základní součást úplného předtransfúzního vyšetření, kontroly krevní skupiny u lůžka při začátku krevní transfúze, sérologických vyšetřování při potransfúzních příhodách, předporodního vyšetřování rodiček a vyšetřování novorozenců.

Diagnostická séra anti-A se dosud připravují z lidské krve vybraných dárců, u nichž byly předem prokázány přirozené vysoké hodnoty aglutininů anti-A nebo z krve dobrovolných dárců záměrně imunizovaných slinami vylučovatelů skupinově specifické substance A, příp, substancí A připravenou z lidských slin nebo zvířecího materiálu - např. žaludeční mukozy prasat či koní. Substance užívané k imunizaci lidských dobrovolníků je nezbytné podrobit státní kontrole sterility, neškodnosti a účinnosti. Protože koncentrace žádaných protilátek v séru klesá po imunizace s časem, je nutné provádět imunizace opakovaně. Imunizace dobrovolníků Izolovanými substancemi mohou být provázeny nepříznivými projevy, jimž lze předcházet oouze desenzibilizací imunizovaných jedinců. Dosud užívaný způsob přípravy diagnotických sér anti-A klade tedy značné nároky na materiální, kádrové, metodické i organizační zajištění výrobního procesu ·

229 995

Vedle žádaných protilátek anti-A se v séru každého záměrně imunizovaného i neimunizovaného dárce, jehož organismus je nepřetržitě vystaven nejrůznějším antigenním podnětům, vyskytují v heterogenní - složením vždy jedinečné a neopakovatelné - směsi mnoh^ další protilátky, z nichž některé přímo ovlivňují reakci séra s erytrocyty a znehodnocují diagnostickou účinnost získaného séra. Takové protilátky je nezbytné ze séra odstranit. Standardizace jednotlivých šarží diagnotických sér je při stávajícím způsobu přípravy obtížná a vždy neúplná, nebol z vlastní podstaty dosavadní přípravy sér vyplývá nemožnost získat dvě výrobní šarže stejných vlastností. Nepříznivým rysem dosavadního způsobu přípravy diagnostických sér anti-A je spotřeba velkých množství lidské krve.

Při sérologických vyšetřováních s diagnostickými séry anti-A připravenými dosavadním způsobem může být dosaženo chybných výsledků způsobených neočekávanými vlastnostmi diagnostických sér i vyšetřovaných erytrocytů. Četné obtíže a chyby se mohou projevit při odlišování podskupin A^ a A^, příp. A^B a A£B a při určovaní slabých aglutinogenů A.

•

Mnohé z uvedených problémů dosud používaného postupu přípravy diagnotických lidských sér anti-A i řadu obtíží vyplývajících z nepříznivých vlastností současných diagnotických sér je možné odstranit zavedením přípravy myších monoklonálních protilátek anti-A, produkovaných lymfocytárními hybridomy.

Zdrojem monoklonální protilátky proti lidksému erytrocytárnímu skupinovému antigenu A je hybridom, uloženy ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídenská ul 1083 pod označením IMG CZAS HE-24.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury -Fazekas de St, Groth, S.,Scheidigger,D.sProduction of monoclonal antibodies:Stratégy and tactics, 3. Immunol. Meth,, 35:1,1980; Galfré,G.,Howe,S.C.,Milstein,C.,Butcher,G.M.,Howard^

3,C.:Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lineš. Nátuře, 286:550, 1977/klonování

229 995 souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie P3-X63-Ag8,653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných slinami vylučovatele skupinově specifické substance A,

Lymfocytární hybridom HE-24 produkuje zcela homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální,· která specificky reaguje s lidskými typovými erytrocyty Α^,Α^Β a A₂ a nereaguje s etytrocyty A₂B, B a 0. Hybridom HE-24 je možné kultivovat v podmínkách in vitro v kultivačních médiích vhodných pro živočišné buňky nebo v podmínkách in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Hybridom HE-24 je možné dlouhodobě uchovávat v konservách uložených v kapalném dusíku. Produkci protilátky je možné zahájit po rozmražení buněčné konservy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu, Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem HE-24 je specifická pro lidský erytrocytární skupinový antigen A a je prostá jakýchkoliv balastních protilátek.

Příklad:

Za účelem pomnožení buněk hybridomu HE-24 v podmínkách in g

vitro bylo vpraveno 1 x 10 hybridomových buněk do kultivační lahve Legroux obsahující 20 ml kultivačního média H»MEMd. Po třech dnech růstu kultury hybridomových buněk bylo z lahve získáno kultivační médium obohacené o monoklonální protilátku HE-24 uvolňovanou do média hybridomovými buňkami. Účinnost monoklonální protilátky HE-24 byla testována postupným dvojnásobným ředěním kultivačního média obsahujícího monoklonální protilátku v prostředí izotonického roztoku chloridu sodného v aglutinačních zkumavkách podle oborové normy ON Θ4 3225. Kultivační médium aglutinovalo na ♦ /podle ON Θ4 3225/ erytrocyty A,* v ředění 1:1024, erytrocyty A^B v ředění 1:512, erytrocyty A₂ v ředění 1:128. S erytrocyty A₂B, B a 0 kultivační médium obsahující monoklonální protilátku HE-24 nereagovalo.

229 995

Buňky hybridomu HE-24 mají ultrastrukturální obraz typických myelomových buněk, kde převažující organelou jsou volné a na membrány vázané polyribosomy, V podmínkách in vitro rostou v podobě polosuspensních kultur. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí, doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin /3mM/ a pyruvát sodný /1mM/. Toto médium /označované jako H«MEMd, Ostav molekulární genetiky ČSAV/ je pro kultivaci hybridomu HE-24 doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem /5x10~^M/, pufrem HEPES /2-4x10*^M/ a inaktivovaným bovinním sérem pro TK. /Bioveta n.p,, Ivanovice na Hané, 10%/, Pro získávání kultivačního média obohaceného o monoklonální protilátku HE-24 /supernatantu kultury hybridomových buněk/ k diagnostickým účelům je v kultivačním médiu nahrazeno inaktivované bovinní sérum inaktivovaným fetálním telecím sérem.

Hybridom HE-24 je kultivován při 37°C, Střední generační čas je 13 hod,, modální počet chromosomů 20 měsíců po sestrojení /fúzi/ je Θ6 chromosomů.Produkovaná monoklonální protilátka je myší imunoglobulin třídy IgM, lambda.

Monoklonální protilátka produkovaná myším lymfocytárním hybridomem HE-24 může být využita ve zdravotnické praxi k bezpečnému odlišení lidského erytrocytárního antigenu podskupiny A^B od antigenu podskupiny A2B.

Claims (1)

1. pRedmět VYNÁLEZU

   229 995

   Myší lymfocytární hybridám IMG CZAS HE-24, produkující monoklonální protilátku třídy IgM proti lidskému erytrocytár· nímu skupinovému antigenu A.