CS276354B6 - Myší lymfocytární hybridom IMG-CZAS HE-195 produkující protilátku proti lidskému skupinovému antigenu A - Google Patents

Abstract

Myší lymfocytární hybridom, produkuje protilátku proti antigenu lidské krevní skupiny A, je uložen ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze pod označením IMG HE-195. Samotná monoklonální protilátka hybridomů HE-195 je vhodná pro použití ve zdravotnické praxi jako diagnostikům skupinového antigenu A při vyšetřování skupinové příslušnosti lidských erytrocytů v systému ABO.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného futzi buňky myší myelomové linie Sp2/O-Ag 14 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti lidskému antigenu krevní skupiny A.

Diagnostická séra proti lidskému antigenu krevní skupiny A (zkráceně diagnostická séra anti-A) jsou základní složkou diagnostických souborů sloužících k určení skupinové příslušnosti lidských erytrocytů v systému ΛΒΟ. Vyšetřování skupinové příslušnosti v systému ABO je základním a nejčastějším sérologickým vyšetřením v humánní hematologické a transfúzní praxi. Provádí se například jako základní součást úplného předtransfúzního vyšetření, kontroly krevní skupiny u lůžka při začátku krevní transfúze, sérologických vyšetřování při potransfuzních příhodách, předporodního vyšetřování rodiček a vyšetřování novorozenců.

Diagnostická séra anti-A se dosud připravují z lidské krve vybraných dárců, u nichž byly předem prokázány přirozené vysoké hodnoty aglutininů anti-A nebo· z krve dobrovolných dárců záměrně imunizovaných slinami vylučovatelů skupinově specifické substance A, případně substancí A připravenou z lidských slin nebo zvířecího materiálu - například žaludeční mukózy prasat či koní. Substance užívané k imunizaci lidských dobrovolníků je nezbytné podrobit státní kontrole sterility, antigenní účinnosti a neškodnosti. Protože koncentrace žádaných protilátek v séru klesá po imunizaci s časem, je nutné provádět imunizace opakovaně. Imunizace dobrovolníků izolovanými substancemi mohou být provázeny nepříznivými projevy, jimž lze předcházet pouze desenzibilizací imunizovaných jedinců. Závažným problémem imunizace dobrovolníků jsou opatření směřující k prevenci rozšiřování choroby AIDS. Je zřejmé, že dosud užívaný způsob přípravy diagnostik anti-A klade značné nároky na materiální, kádrové, metodické i organizační zajištěni výrobního procesu.

Vedle žádaných protilátek proti skupinovému antigenu A se v séru každého záměrně imunizovaného i neimunizovaného dárce, jehož organismus je nepřetržitě vystaven nejrůznějším antigenním podnětům, vyskytují v heterogenní - složením vždy jedinečné a neopakovatelné směsi mnohé další protilátky, z nichž některé přímo ovlivňují reakci séra s erytrocyty a znehodnocují diagnostickou účinnost získaného séra. Takové protilátky je nezbytné ze séra odstranit. Standardizace jednotlivých šarží diagnostických sér je při stávajícím způsobu .přípravy obtížná a vždy neúplná, nebol z vlastní podstaty dosavadní přípravy sér vyplývá nemožnost získat dvě výrobní šarže stejných vlastností. Nepříznivým rysem dosavadního způsobu přípravy diagnostických sér anti-A je spotřeba velkých množství lidské krve. ·

Mnohé z uvedených problémů dosud používaného postupu přípravy diagnostických lidských sér anti-A jo možné odstranit zavedením.přípravy monoklonálních protilátek anti-A, produkovaných lymfocytárními hybridomy.

Hybridomy produkující monoklonální protilátky proti lidskému skupinovému antigenu A již byly připraveny v řadě zemí. Monoklonální protilátky anti-A komerčně dostupné například od firem Celtech (Velká Británie), Serotec (Velká Británie), Biotest-Diagnostics (NSR) a Diagnostics Pasteur (Francie), jsou postupně zaváděny do klinické praxe jako šerologická typizační diagnostika skupinového antigenu A.

Také v Československu byla připravena řada lymfocytárních hybridomů produkujících monoklonální protilátky proti lidskému skupinovému antigenu A. Některé z nich se již staly předmětem přihlášky vynálezu a autorské ochrany. Jde o hybridomy HE-02 (čs. autorské osvědčení č. 228 859), HE-18 (čs. autorské osvědčení č. 229 996) a HE-24 (čs. autorské osvědčení č. 229 995), produkující monoklonální protilátky využitelné ve zdravotnické praxi k bezpečnému odlišení erytrocytů A-^B od erytrocytů AjB a hybridomy HE-10 a HE-14, produkující monoklonální protilátky využitelné k detekci skupinového antigenu A na tkáňových řezech při imunohistochemické diagnostice nádorových onemocnění epiteliálních

CS 276 354 B6 tkání - například sliznic tlustého střeva. Žádná z monoklonálních protilátek proti skupinovému antigenu A, produkovaných hybridomy, nereaguje v podmínkách testů užívaných k typizaci skupinové příslušnosti v ABO systému s erytrocyty AgB a nemůže proto být použita jako diagnostikům anti-A podle oborové normy.

Uvedené nevýhody dosud chráněných hybridomů odstraňuje lymfocytární hybridem, uložený ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze. 4, Vídeňská 1083 pod označením IMG CZAS HE-195, který je zdrojem monoklonální protilátky proti lidskému antigenu krevní skupiny A splňující požadavky oborové normy ON 86 4511 na diagnostikům anti-A.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Kohler G., Milstein C.: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256: 495, 1975; Galfré G., Howe S.C., Milstein C., Butcher G.W., Howard J.C.: Antibodies to major histocompatibility antigen produced by hybrid cell lines, Nature 266: 550, 1977; Fazekas de St. Groth S., Scheidigger D.: Production of monoclonal antibodies: Strategy and tactics, 0. Immunol Meth. 35: 1, 1980. (klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie Sp2/0-Ag 14 a buněk získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných buňkami linie lidského epidermoidního karcinomu A 431.

Lymfocytární hybridom HE-195 produkuje monoklonální protilátku proti skupinovému antigenu A, která reaguje s lidskými typovými erytrocyty Ap A-^B, A₂, A₂8 a a nereaguje s erytrocyty 8 a 0. Hybridom HE-195 je možné kultivovat v podmínkách in vitro v kultivačních médiích vhodných pro živočišné (savčí) buňky nebo v podmínkách in vivo v peritoneální dutině myší kmen BALB/c. Hybridom HE-195 je možné dlouhodobě uchovávat v konservách uložených v kapalném dusíku. Produkci protilátky je možné zahájit po rozmražení buněčné konservy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu k imunizaci. Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem HE-195 je specifická pro antigeny krevní skupiny člověka A a je prostá jakýchkoliv balastních protilátek.

Příklad

Za účelem pomnožení buněk hybridomů HE-195 v podmínkách in vitro bylo vpraveno 1,5 x x 10^ hybridomových buněk do kultivační lahve Legroux obsahující 20 ml kultivačního média RPMI obsahujícího 10¾ fetálního telecího séra. Po třech dnech růstu kultury hybridomových buněk bylo z lahve získáno kultivační médium obohacené o monoklonální protilátku He-195 uvolňovanou do média hybridomovými buňkami. Účinnost monoklonální protilátky HE-195 byla testována makrotitrací v aglutinačních zkumavkách postupným dvojnásobným ředěním kultivačního média obsahujícího monoklonální protilátku izotonickým roztokem chloridu sodného podle společné oborové normy ON 86 4500. Výsledky vyšetření účinnosti protilátky HE-195 se souborem typových erytrocytů a srovnání s minimálně přijatelnými titry podle oborové normy ON 86 4511 jsou uvedeny v tabulce 1. '

Tabulka 1

Výsledky serologického vyšetření kultivačního média obsahujícího monoklonální protilátku HE-195 podle ON 86 4500

Krvinky skupiny	. Počet vyšetření	Průměrný titr	Minimální přijatelný titr podle ON 86 4511
A1	30	256 ++	256 +
a2	14	256 +	128 +
ΑχΒ a2b A3	6	256 ++	256 +
11 2	64 + 8 + χ)	32 + norma nevyžaduje

CS 276 354 B6

x) diagnostické sérum anti-A SEVAC dosahuje s krvinkami Aj titru 4 +.

Ze souboru vyšetření, jejichž výsledky jsou uvedeny v tabulce 1 vyplývá, že kultivační médium obsahující monoklonální protilátku HE-195 splňuje podmínky oborové normy MZ ČSR ON 86 4511 pro skupinové diagnostické sérum anti-A.

Avidita monoklonální protilátky HE-195 byla testována na podložním skle smícháním 10% suspenze typových krvinek v izotonickém. roztoku chloridu sodného se stejným množstvím kultivačního média obsahujícího monoklonální protilátku a stanovením reakčního času podle čl. 9 společné oborové normy ON 86 4500. Příklad výsledků vyšetření avidity protilátky HE-195 s typovými erytrocyty a srovnání s maximálními přijatelnými reakčními časy podle oborové normy ON 86 4511 jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Výsledky vyšetření avidity kultivačního média obsahujícího monoklonální protilátku HE-195 podle ON 86 4500

Krvinky skupiny ' Reakční čas^x^ Maximální přijatelný čas^{* xx})

Α_χ 5,3 s 15 s

A2 5,0 s 30 s

Α_χΒ 5,2 s 30 s '

A2B 8,3 s 45 s

x) průměrná hodnota ze 3 měření xx) podle Oborové normy ON 86 4511

Z výsledků uvedených v tabulce č. 2 vyplývá, že kultivační médium obsahující monoklonální protilátku HE-195 splňuje požadavky oborové normy MZ ČSR ON 86 4511 na aviditu skupinového diagnostického séra anti-A. .

S typovými erytrocyty B (36 vyšetření) a 0 (41 vyšetření) kultivační médium obsahující monoklonální protilátku HE-195 nereagovalo.

Buňky hybridomu HE-195 mají morfologický obraz typických myších myelomových buněk.

V podmínkách in vitro rostou v podobě polosuspenzních kultur. Základním kultivačním médiem je RPMI 1640 doplněné podle běžné receptury penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, pufrem HEPES, 2-merkaptoetanolem, L-glutaminem, puryvátem sodným a fatálním telecím sérem. Hybridom je kultivován při 37°C. Střední generační čas je 16,5 hodiny a modální počet chromosomů byl 14 měsíců po sestrojení hybridomu 81 chromosomů. Produkovaná monoklonální protilátka je myší imunoglobulin třídy IgM.

Monoklonální protilátka produkovaná myším lymfocytárním hybridomem HE-195 může být ve zdravotnické praxi využita jako diagnostikům antigénu krevní skupiny A.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY .

   Myší lymfocytární hybridám IMG-CZAS HE-195 produkující monoklonální protilátku třídy IgM proti antigenu lidské krevní skupiny A.