CS276441B6

CS276441B6 - Murine lymphocyte hybridoma igm czas he-182

Info

Publication number: CS276441B6
Application number: CS902925A
Authority: CS
Inventors: Milos Rndr Csc Nemec; Jan Mudr Csc Vanak; Dagmar Mudr Csc Drimalova; Vladimir Mudr Csc Viklicky
Original assignee: Nemec Milos; Jan Mudr Csc Vanak; Dagmar Mudr Csc Drimalova; Viklicky Vladimir
Priority date: 1990-06-13
Filing date: 1990-06-13
Publication date: 1992-05-13
Also published as: CS292590A3

Abstract

Lymfocytární hybridom, produkující proti- ' látku proti lidskému skupinovému antigenu H, uložený ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze pod označením IMG CZAS HE-182. Samotná monoklonální protilátka hybridomů HE-182 je vhodná pro použití ve zdravotnické praxi jako imunohistochemické diagnostikům skupinového antigenu H v soupravě diagnostik skupinových antigenů ABO systému, obsahující monoklonální protilátky HE-10, HE-14, HEB-20, HEB-27 a HE-181, určené k upřesnění patologicko-anatomické diagnózy nádorových onemocnění epiteliálních tkání člověka.Lymphocyte hybridoma, producing anti- an anti-human H antigen deposited in the collection of hybridomas of the Molecular Institute genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences under the designation CZG HEAS-182. Monoclonal antibody alone hybridoma HE-182 is suitable for use in medical practice as immunohistochemical diagnostics of the H group antigen in a set of group antigen diagnostics ABO system containing monoclonal antibodies HE-10, HE-14, HEB-20, HEB-27, and HE-181 intended to specify pathological-anatomical diagnosis of epithelial cancer human tissue.

Description

Vynález se týká nového hybridomů, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeněho fúzí buňky myší myelomové linie Sp2/O-Agl4 a myší slezinné lymfoidní buňky produkující protilátku proti lidskému skupinovému antigenu H.The invention relates to a novel hybridoma, i.e. a hybrid single-celled organism, constructed by the fusion of a mouse myeloma line Sp2 / O-Ag14 and a mouse splenic lymphoid cell producing an antibody against the human group antigen H.

Antigeny A, 8 a H lidského skupinového systému ABO jsou tradičně nazývány antigeny krevních skupin. Vyšetřování skupinové příslušnosti erytrocytů v systému ABO je základním a nejčastějším sérologickým vyšetřením v humánní hematologické a transfúzní praxi. Provádí se například jako základní součást úplného předtransfúzního vyšetření, kontroly krevní skupiny u lůžka při začátku krevní transfúze, sérologických vyšetřování rodiček a vyšetřování novorozenců.Antigens A, 8 and H of the human ABO group system are traditionally called blood group antigens. Examination of erythrocyte group affiliation in the ABO system is the basic and most common serological examination in human hematological and transfusion practice. It is performed, for example, as an essential part of a complete pre-transfusion examination, bedside blood group monitoring at the beginning of a blood transfusion, maternal serological examinations and neonatal examinations.

Výskyt A, B a H skupinových antigenů však zdaleka není omezen jen na erytrocyty. Antigeny systému ABO patří k hlavním aloantigenním znakům epiteliálních buněk a byly prokázány i na některých typech neuronů. Z teoretických i praktických hledisek poutají značnou pozornost změny v expresi A, B i H skupinových antigenů provázející vývojové, diferenciační a nádorové procesy v epiteliálních buňkách. Řada studií prokázala, že s rozvojem karcinomů plic, žaludku, prostaty nebo močového měchýře dochází ke ztrátě A, B a H skupinových antigenů, které jsou ve zdravé epiteliální tkáni přítomny. Odlišnou expresí skupinových antigenů se vyznačuje epitel sliznice tlustého střeva. Jestliže v prenatalním období jsou skupinové sntigeny ABO systému přítomny v epitelu celého tlustého střeva, potom po narození zůstávají zachovány v proximální části, rychle však mizí v distální části tračníku, znovu se objevují v souvislosti s rozvojem distálně lokalizovaných karcinomů - například v esovité kličce a rektu - a stávají se tak významnými diagnostickými znaky nádorového procesu.However, the occurrence of A, B and H group antigens is far from being limited to erythrocytes. The antigens of the ABO system belong to the main alloantigenic features of epithelial cells and have also been shown on some types of neurons. From a theoretical and practical point of view, changes in the expression of A, B and H group antigens accompanying developmental, differentiation and tumor processes in epithelial cells attract considerable attention. A number of studies have shown that with the development of cancers of the lung, stomach, prostate or bladder, A, B and H group antigens, which are present in healthy epithelial tissue, are lost. The epithelium of the colonic mucosa is characterized by differential expression of group antigens. If in the prenatal period group ABO system antigens are present in the epithelium of the entire colon, then after birth they remain in the proximal part, but rapidly disappear in the distal part of the colon, reappearing in connection with the development of distally localized cancers - for example in esophageal - and thus become important diagnostic features of the tumor process.

Kvalitativním zlomem ve studiu struktury a tkáňové lokalizace antigenů ABO systému bylo zavedení monoklonálních protilátek připravovaných hybridomovou technologií. Komerčně dostupné monoklonální protilátky proti skupinovým antigenům A a B, dodávané například firmami Celtech (Velká Británie), Serotec (Velká Británie), Biotest-Diagnostics (NSR), Immunotech (Francie) a Diagnostics Pateur (Francie)·, jsou ve vyspělých státech zaváděny do klinické praxe jako serologická typizační diagnostika krevních skupin, která díky vysoké specifičnosti, účinnosti a standardnosti postupně vytlačují klasická diagnostická séra připravovaná z lidské krve. Serologická diagnostika na bázi monoklonálních protilátek proti skupinovým antigenům A a B již byla vyvinuta také v Československu.A qualitative breakthrough in the study of the structure and tissue localization of ABO system antigens was the introduction of monoclonal antibodies prepared by hybridoma technology. Commercially available monoclonal antibodies against group antigens A and B, available for example from Celtech (UK), Serotec (UK), Biotest-Diagnostics (NSR), Immunotech (France) and Diagnostics Pateur (France), are being introduced in developed countries. into clinical practice as serological typing diagnostics of blood groups, which, thanks to their high specificity, efficiency and standardization, gradually displace classical diagnostic sera prepared from human blood. Serological diagnostics based on monoclonal antibodies against group antigens A and B have already been developed in Czechoslovakia.

Monoklonální protilátky - produkty lymfocytárních hybridomů - se rostoucí měrou prosazují také jako imunohistochemická a imunocytochemická diagnostika antigenů ABO systému v onkologických výzkumech i praxi patologicko-anatomických pracovišt. Jako například lze uvést anti-A, anti-B a anti-H monoklonální diagnostika společnosti Dakopatts (Dánsko, USA). V Československu byla ve spolupráci Ústavu molekulární genetiky v Praze a Ústavu sér a očkovacích látek v Olomouci vyvinuta souprava pro enzymoimunologickou detekci skupinových antigenů A a B na tkáňových řezech po fixaci formolem a zalití do parafinu. Souprava, založená na monoklonálních protilátkách produkovaných hybridomy HE-10 (AO 260 746), He-14 (A0 260 748), HEB-20 (AO 260 747) a HEB-27 (AO 260 749), byla s úspěchem prakticky prověřena při imunohistochemické diagnostice nádorových onemocnění epiteliálních tkání - například sliznic tlustého střeva. V současnosti bude možné doplněním soupravy o dosud chybějící monoklonální protilátky proti skupinovému antigenu H rozšířit její využití i na pacienty s krevní skupinou 0.Monoclonal antibodies - products of lymphocyte hybridomas - are also gaining ground as immunohistochemical and immunocytochemical diagnostics of ABO system antigens in oncological research and the practice of pathological and anatomical workplaces. Examples include anti-A, anti-B and anti-H monoclonal diagnostics from Dakopatts (Denmark, USA). In Czechoslovakia, in cooperation with the Institute of Molecular Genetics in Prague and the Institute of Sera and Vaccines in Olomouc, a kit was developed for enzymimmunological detection of group antigens A and B on tissue sections after formalin fixation and paraffin embedding. The kit, based on monoclonal antibodies produced by hybridomas HE-10 (AO 260 746), He-14 (A0 260 748), HEB-20 (AO 260 747) and HEB-27 (AO 260 749), has been successfully tested in practice in immunohistochemical diagnosis of cancers of epithelial tissues - for example, colonic mucosa. At present, by supplementing the kit with the still missing monoclonal antibodies against group antigen H, it will be possible to extend its use to patients with blood group 0.

Zdrojem monoklonální protilátky proti lidskému skupinovému antigenu H je hybridom, uložený ve sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská 1083 pod označením IMG CZAS HE-182.The source of the monoclonal antibody against the human group antigen H is a hybridoma, stored in the collection of hybridomas of the Institute of Molecular Genetics of the Czechoslovak Academy of Sciences in Prague 4, Vídeňská 1083 under the name IMG CZAS HE-182.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, 0.: Production of monoclonal antibodies: Strategy and tactics, J. Immunol. Meth. 35 : 1 , 1985; Galfré, G., Hoše, S. S., Milstein, C., Butcher, G. W. ,Said hybridoma was obtained in a manner known from the literature (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, 0 .: Production of monoclonal antibodies: Strategy and tactics, J. Immunol. Meth. 35: 1, 1985; Galfré, G., Boys, SS, Milstein, C., Butcher, GW,

CS 276441 B 6 2CS 276441 B 6 2

Howard, 1. C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines, Nature, 266: 550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie Sp2/0-Agl4 a buněk získaných ze sleziny myši kmene BALB/c, imunizované lidskými erytrocyty krevní skupiny A,,.Howard, 1. C .: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines, Nature, 266: 550, 1977) by cloning a set of hybrid cells resulting from a fusion of Sp2 / 0-Agl4 mouse myeloma cells and BALB mouse spleen cells. / c, immunized with human blood group A erythrocytes.

Lymfocitární hybridom HE-182 produkuje monoklonální protilátku proti skupinovému antigenu H. Hybridom HE-182 je možné kultivovat V podmínkách in vitro v kultivačních médiích vhodných pro savčí buňky nebo v podmínkách in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Hybridom HE-182 je možné dlouhodobě uchovávat v konzervách uložených v kapalném dusíku, Produkci protilátky je možné zahájit po rozmražení buněčné konzervy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu. Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem HE-182 je specifická pro lidský skupinový antigen H a je prostá jakýchkoliv balastních protilátek.The HE-182 lymphocytic hybridoma produces a monoclonal antibody against the H group antigen. The HE-182 hybridoma can be cultured in vitro in culture media suitable for mammalian cells or in vivo in the peritoneal cavity of BALB / c mice. The HE-182 hybridoma can be stored for a long time in cans stored in liquid nitrogen. Antibody production can be started after thawing the cell can without the need for additional antigen. The monoclonal antibody produced by the HE-182 hybridoma is specific for human group H antigen and is free of any ballast antibodies.

Příklad .Example.

Za účelem pomnožení buněk hybridomu HE-182 v podmínkách in vitro bylo vpraveno 1 x 10^ hybridomových buněk do kultivační lahve Legroux obsahující 20 ml kultivačního média RPMI obsahujícího 10% fetálního telecího séra. Po třech dnech růstu kultury hybridomových buněk bylo z lahve získáno kultivační médium obohacené o monoklonální protilátku HE-182 uvolňovanou do média hybridomovými buňkami.In order to propagate HE-182 hybridoma cells in vitro, 1 x 10 6 hybridoma cells were placed in a Legroux culture flask containing 20 ml of RPMI culture medium containing 10% fetal calf serum. After three days of growth of the hybridoma cell culture, a culture medium enriched in monoclonal antibody HE-182 released into the medium by the hybridoma cells was obtained from the flask.

Specifičnost a hemaglutinační účinnost monoklonální protilátky HE-182 byla testována makrotitrací v aglutinačních zkumavkách postupným dvojnásobným ředěním kultivačního média, obsahujícího monoklonální protilátku, izotonickým roztokem chloridu sodného podle společné oborové normy ON 86 4500. Výsledky vyšetřehí specifičnosti a účinnosti protilátky HE-182 se souborem typových erytrocytů a srovnání s požadavkem oborové normy ON 86 4508 pro diagnostikům určující skupinu H lidské krve jsou uvedeny v tabulce č. 1.The specificity and haemagglutination activity of the HE-182 monoclonal antibody was tested by macrotitration in agglutination tubes by successive two-fold dilutions of the culture medium containing the monoclonal antibody with isotonic sodium chloride solution according to common industry standard ON 86 4500. and comparisons with the requirement of industry standard ON 86 4508 for diagnostics determining group H of human blood are given in Table 1.

Tabulka č. 1Table 1

Výsledky sérologického vyšetření kultivačního média obsahujícího monoklonální protilátku HE-182 podle oN 86 4500Results of serological examination of culture medium containing monoclonal antibody HE-182 according to oN 86 4500

Krvinky skupiny Blood cells group Počet vyšetření Number of examinations Titr Titr Požadavek ON 86 4508 Requirement ON 86 4508 ^A1 . ^A 1. 12 12 4-8+ 4-8 + negativní negative ^A2 ^A 2 10 10 32-64+ 32-64 + 16+ 16+ 8 8 8-16 + 8-16 + negativní negative ^a ₂b ^a ₂ b 6 6 16-32+ 16-32 + norma neuvádí the standard does not specify B B 10 10 16-32+ 16-32 + norma neuvádí the standard does not specify 0 0 10 10 64-256+ 64-256 + norma neuvádí the standard does not specify 0 (fenotyp Bombay)* 0 (Bombay phenotype) * 2 2 negativní negative norma neuvádí the standard does not specify

+ skupinový antigen H chybí (h/h genotyp)+ group antigen H missing (h / h genotype)

Ze skupiny sérologických vyšetření, jejichž výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 1, je zjevné, že monoklonální protilátka HE-182 reaguje v hemaglutinačním testu se skupinovým antigenem H v membránách erytrocytů. Vedle celkového obrazu reaktivity protilátky HE-182, který odpovídá dosud publikovaným výsledkům, dosženým pomocí zahraničních anti-H monoklonálních protilátek, je nejpřesvědčivějším důkazem specifičnosti protilátky HE-182 negaFrom the group of serological tests, the results of which are shown in Table 1, it is clear that the monoclonal antibody HE-182 reacts in the hemagglutination test with the group antigen H in erythrocyte membranes. In addition to the overall picture of the reactivity of the HE-182 antibody, which corresponds to the results published so far, obtained with foreign anti-H monoclonal antibodies, the most convincing evidence of the specificity of the HE-182 antibody is nega

CS 276441 B 6 tivní výsledek s erytrocyty, v nichž skupinový antigen H chybí (erytrocyty 0-fenotyp Bombay). Neředěné kultivační médium obsahující protilátku HE-182 nedává s erytrocyty a . AjB zcela negativní reakci: protilátka HE-182 proto v dané formě nemůže sloužit jako sérologické diagnostikům anti-H ve smyslu oborové normy ON 86 4508 k bezpečnému odlišení krevních skupin A^ a popřípadě A^B a A£B. Může však být použita k sérologickým vyšetřováním přítomnosti skupinového antigénu H na erytrocytech.CS 276441 B 6 positive result with erythrocytes lacking group H antigen (Bombay O-phenotype erythrocytes). Undiluted culture medium containing HE-182 antibody does not co-do with erythrocytes and. AjB completely negative reaction: the antibody HE-182 in its given form cannot therefore serve as serological diagnostics of anti-H in the sense of the industry standard ON 86 4508 for safe differentiation of blood groups A ^ and possibly A ^ B and A £ B. However, it can be used for serological tests for the presence of group H antigen on erythrocytes.

Z hlediska praktického využití je významné, že monoklonální protilátka HE-182 reaguje se skupinovým antigenem H na tkáňových řezech po fixaci formolem a zalití do parafinu a jako imunohistochemické diagnostikům se plně vyrovná standardnímu anti-H diagnostiku prodávanému společností Oakopatts (Dánsko, USA). 'From a practical point of view, it is important that the HE-182 monoclonal antibody reacts with the H group antigen on tissue sections after formalin fixation and paraffin embedding, and as immunohistochemical diagnostics it is fully equivalent to standard anti-H diagnostics sold by Oakopatts (Denmark, USA). '

Buňky hybridomu HE-182 mají morfologický obraz typických myelomových buněk. V podmínkách in vitro rostou v podobě polosuspenzních kultur. Základními kultivačními médii jsou RPMI nebo Eaglovo esenciální médium s Hanksovou solnou směsí, doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3mM) a pyruvát sodný (ImM) (médium označované jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV). Média jsou pro kultivaci hybridomu HE-182 doplněna penicilinem, streptomycinem, 2-merkaptoetanolem (5 x 10^), pufrem HEPS (2 - 4x 10^-5 M) a inaktivovaným bovinním sérem pro TK (Bioveta, n.p., Ivanovice na Hané 10 %). Pro získávání kultivačního média obohaceného o monoklonální protilátku HE-182 (supernatantu kultury hybridomových buněk) k diagnostickým účelům je v kultivačním médiu nahrazeno inaktivní bovinní sérum fetálním telecím sérem.HE-182 hybridoma cells have a morphological picture of typical myeloma cells. In vitro, they grow in the form of semi-suspension cultures. The basic culture media are RPMI or Eagle's essential medium with Hanks' salt mixture, supplemented with non-essential amino acids, L-glutamine (3 mM) and sodium pyruvate (ImM) (a medium called H-MEMd, Institute of Molecular Genetics, Czechoslovak Academy of Sciences). Media for culture of HE-182 hybridoma are supplemented with penicillin, streptomycin, 2-mercaptoethanol (5 x 10 6), HEPS buffer (2 - 4x 10 ^-5 M) and inactivated bovine serum for blood pressure (Bioveta, np, Ivanovice na Hané 10% ). To obtain culture medium enriched in monoclonal antibody HE-182 (hybridoma cell culture supernatant) for diagnostic purposes, inactive bovine serum is replaced with fetal calf serum in the culture medium.

Hybridom HE-182 je kultivován při 37 °C. Střední generační čas je 16 hodin. Produkovaná monoklonální protilátka je myší imunoglobulin třídy IgM.The HE-182 hybridoma is cultured at 37 ° C. The median generation time is 16 hours. The monoclonal antibody produced is a murine IgM immunoglobulin.

Monoklonální protilátka produkovaná myším lymfocytárním hybridomem HE-182 může být využita ve zdravotnické praxi jako součást kolekce imunohistochemických diagnostik skupi-’ nových antigenů ABO systému obsahující také monoklonální protilátky HE-10, HE-14, HEB-20 a HEB-27 k upřesnění patologickoanatomické diagnózy nádorových onemocnění epiteliálních tkání člověka.The monoclonal antibody produced by the murine lymphocyte hybridoma HE-182 can be used in medical practice as part of a collection of immunohistochemical diagnostics of group antigens of the ABO system also containing monoclonal antibodies HE-10, HE-14, HEB-20 and HEB-27 to refine the pathological-anatomical diagnosis. human epithelial tissue cancer.

Claims

PATENT CLAIMS

IMG CZAS HE-182 mouse lymphocyte hybridoma producing IgM monoclonal antibody against human H. group antigen.