JPH031958B2 - - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、テオフイリン(1,3−ジメチルキ
サンチン)に対する単クローン抗体の生産のため
の交雑細胞株、均質で単一特異性の抗体、および
それらのテオフイリンに対する免疫定量法(イム
ノアツセイ)への利用に関する。 1975年にKohlerおよびMilstein両氏は、マウ
スの骨髄細胞を羊の赤血球に対する単クローン抗
体を分泌する免疫処理されたマウス脾臓細胞に融
合させることに由来する継続的な交雑細胞株(ハ
イブリドーマ)の確立を報告した〔「Nature」第
256巻第495頁(1975年)〕。それ以来、他の抗原お
よびハプテンに対する単クローン抗体の生産につ
いて多数の報丈が提出された。例えばF.
MelchersM.PotterおよびN.Warner氏ら編
「Current Topics in Microbiology and
Immunology」第81巻(1978年刊行)および同書
中の引用文献、またR.Kennet、T、McKearnお
よびK.Bechtol氏ら編「Monoclona Autibodies」
(1980年刊行)および同書中の引用文献を参照さ
れたい。 ハイブリドーマを生成する一般的技術は周知さ
れ且つ理解されているが、望ましい特性を揃えて
有する抗体を分泌するハイブリーマ細胞株の調製
および選別にはいまだ多大の困難がある。 欧州特許出願第25722号(1981年3月25日公告)
は、人体T−淋巴球細胞表面抗原に対する単クロ
ーン抗体の生産を開示している。 心臓のグリコシドであるジゴキシンに対する単
クローン抗体の生産は「Federation
Proceedings」第39巻第928頁(1980第)および
「Scand.J.Clin.Lab.Invest.」第4巻第75頁(1981
年)において報告された。 体液中の各種の治療薬剤のレベルをモニターす
るために使用可能な臨床診断的定量法の需要が速
やかに増加している。ぜんそく治療剤であるテオ
フイリンは、その有効範囲が非常に狭い薬剤であ
る。テオフイリンに対する免疫定量法には高度に
特異的な抗体を必要とする。それは体液中にはテ
オフイリンと構造的に類似する他のキサンチン化
合物が存在し、もしそれらが抗テオフイリン抗体
により認識されれば分析対象となるテオフイリン
濃度の誤つた値をもたらすからである。テオフイ
リンは1,3−ジメチルキサンチンであり、交差
反応性を有する最も屡々出現する4種のキサンチ
ン化合物は、カフエイン(1,3,7−トリメチ
ルキサンチン)、テオブロミン(3,7−ジメチ
ルキサンチン)、キサンチンおよびヒポキサンチ
ンである。最も頻繁に出現するキサンチン化合物
はカフエインであり、日常の飲料のいたるところ
に存在する。それはまた新生児におけるテオフイ
リン代謝の産物であり、カフエインのレベルがテ
オフイリンのレベルに接近することもあり得る。
それゆえ、テオフイリンに対する診断的免疫定量
法に用いる抗テオフイリン抗体はカフエインと交
差反応をしないことが必須の要件である。 テオフイリンその他の化合物で一般に化学式量
(formula weight)1000以下のものは、それ自体
が免疫原性を有する担体に結合されなければ免疫
原とならない〔例えばH.N.Eisen氏著
「Immunology」ハーパー・アンド・ロウ社)
1980年版参照〕。このような化合物はハプテンと
呼ばれ、ハプテンを免疫原化するために担体に結
合させる各種の方法が当業界に知られている。担
体およびハプテンを担体に結合させる部位の選択
がハプテン−担体複合体の免疫原特性ならびに産
生される抗体の特異性に影響することが知られて
いる〔例えば「Methods in Enzymology」第70
巻第85頁(1980年)参照〕。 米国特許第4156081号明細書は、3−位置置換
のテオフイリン誘導体の合成およびカフエインと
交差反応しない抗体を産生するための免疫原とし
てのそれらの利用を記述している。しかしながら
それらは1−メチルキサンチンと交差反応する。
さらにまた、商業的免疫定量実施のためには多量
の抗血清を要し、また動物の免疫処置による抗体
の産生は遅く、手間がかかり、そして動物の種類
によりまた同種の動物でも飼育系統が異なれば必
ずしも再現性がよくない。 欧州特許出願第44441号(1982年1月27日公告)
は、薬剤に対する単クローン抗体の産生を開示し
ている。しかしそれはカフエインに対する交差反
応性を全く欠如するようなテオフイリンに対する
単クローン抗体を開示してはいない。 本発明の細胞株(セルライン)は、3種の連続
的交雑単クローン細胞株であり、それぞれテオフ
イリンに対する新規な単クローン抗体を産生する
能力を有する。細胞株は、8−位置置換テオフイ
リン−担体複合体(免疫原)を用いて免疫処置さ
れたマウスからの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞の
交雑体である。本発明による抗体のそれぞれは、
テオフイリンに対する粒子促進濁度阻害免疫定量
法〔米国特許出願第315922号(1981年10月28日
付)および特開昭58−47258号公報参照〕により
測定したときにはカフエインとの交差反応性は5
%以下である。テオフイリンに対する免疫定量
法、特に粒子により促進される濁度阻害免疫定量
法へのこれらの抗体の利用も期待される。 第1図、第2図および第3図は、それぞれ細胞
株30/15、17/14、および61/7により産生され
るテオフイリンに対する単クローン抗体を用いる
粒子により促進される濁度阻害免疫定量法により
得られる標準検量曲線である。 単クローン抗体は、所望の抗原またはハプテン
(本発明の場合にはテオフイリン)を用いて免疫
処置されたマウスからの脾臓細胞をマウスの骨髄
腫細胞に融合させることにより産生される。単ク
ローン抗体の対象にしようとする化合物がハプテ
ンである場合には、最初に免疫原性能を得るため
にそのハプテンを高分子量担体と結合させること
が必要である。このような担体には、蛋白質、多
糖質、および各種のラテツクス粒子が含まれる。
本発明の目的のために、テオフイリンをその8−
位置を介して陣笠貝へモシアニン(KLH)のア
ミノ基に結合剤としてカルボジイミドを用いて結
合させ、そしてテオフイリン−8−KLHを得る。 実施にあたつては、数週間ないし数ケ月の期間
をかけて間隔をおいて数回の免疫処置を行う。免
疫処置されたマウスのごとき動物から毎回注射の
時に採用し、そして血清中に所望の抗体の存否を
検査する。適当な検査定量法のどれでもよいが、
放射免疫定量法および酵素にリンクした免疫吸着
定量法がしばしば用いられる。血清中に抗体が検
出されれば、その動物を殺し、脾臓を細胞融合操
作のために無菌的に取り出す。 数種類のマウス骨髄腫細胞株が融合のパートナ
ーとして有用であることが知られている。 これらの細胞株の特徴は、上記の引用文献すな
わち「Current Topics in Microbiology and
Immunology」に記述されている。一般的に、骨
髄腫細胞株でそれ自体の免疫グロブリン産物を分
泌しない株を選ぶことが好ましい。 融合操作は、融合促進剤としてポリエチレング
リコールを用いて行われることが最も多い。セン
ダイウイルスのごとき融合促進剤を用いてもよ
い。脾臓細胞の骨髄腫細胞に対する比率は場合に
より異なるが、5〜10:1の比率が最も多く用い
られる。 融合の後に、細胞を希釈し、ヒポキサンチン/
アミノプリテン/チミジン(HAT)培地のごと
き選択培地に倍養する。融合しない脾臓細胞は有
限回数の分裂の後に死滅する。また骨髄腫細胞
は、それが有するヒポキサンチン−グアニンホス
ホリボシルトランスフエラーゼ(HGPRT)遺伝
子の突然変異のためにHAT培地中では生存不能
で死滅する。交雑体および融合しない細胞の懸濁
液を、容器1当りの細胞数を限定するために、培
養前に希釈する。通常微量力価検定用プレートの
くぼみ孔1個につき細胞数1〜5個にまで希釈す
る。 細胞の増殖が認め得られるに至れば、培養上清
液を、固相放射免疫定量法またはその他の適当な
検定法により、所望の抗体の存否について検定す
る。対象となる抗体の産生が認められるくぼみ孔
の細胞をクローンとして軟寒天に採取するか、ま
たは希釈を限定して単クローン性を保証する。 ハイブリドーマを容器中で培養して培養上清液
を収穫するか、またはハイブリドーマをマウスに
注射するかによつて多量の抗体が得られる。抗体
はハイブリドーマをプリスタンで前処置した同系
統または同種のマウスの腹腔内に注射することに
より腹水液中から得られる。抗体はハイブリドー
マを静脈内に注射することにより血清中から得ら
れる。抗体の1ml当りの量は差異があり、通常培
養上清液中で最も少なく、腹水液中で最も多い。 かくして造出された単クローン抗体はその免疫
グロブリン類および亜類により、またその等電点
決定パターンにより特徴づけられる。親和性定数
が得られ、そして抗体は関連性のある一連の抗原
(ハプテン)との反応性をもとにして特徴づけら
れる。 本発明は、テオフイリンに対する単クローン抗
体よりなる。3種の異なるクローンタイプすなわ
ち30/15、17/14、および61/7が、Balb/c
系統のマウスをテオフイリン−8−LKHを用い
る免疫処置によつて誘導された。三者はすべて1
回の融合の生成物である。三者はすべて同じ重い
(H)および軽い(L)鎖の群に属するが、等電点決定パ
ターンはそれぞれ著明に異なる。三者はすべてテ
オフイリンを結合し、テオフイリン量測定のため
の免疫定量法に利用することができる。用いられ
る免疫定量法の一つは、粒子により促進される濁
度阻害免疫定量法である。これらのクローンタイ
プのうちで、テオフイリンに対する免疫定量法へ
の主要な妨害物質であるカフエインと交差反応す
るものはない。また他のキサンチン化合物との交
差反応性も低い。 3種類のハイブリドーマ細胞株すなわち30/
15、17/14および61/7は米国菌株保存機関
(ATCC)に1982第8月5日に寄託され、それぞ
れHB8152号、HB8153号、およびHB8154号の
ATCC保存番号を与えられている。 本発明のハイブリドーマ細胞株は、マウスの骨
髄腫細胞株P3−NSI−1−Ag4−1(NS−1と称
する)とBalb/c脾臓細胞との交雑体である。
NS−1細胞株自体もBalb/c系統マウスに由来
し、kL(軽)鎖を合成するが、それは分泌されな
い。NS−1は、ソーク研究所細胞分譲センター
(米国カリフオルニア州ラ・ホヤ市所在)から得
られる。 本発明のハイブリドーマ細胞株は交雑体であ
り、このことはそれぞれの交雑体クローン中にお
ける双方の親株の遺伝子産物の存在によつて立証
される。それぞれの細胞株は、産生する抗体およ
びその他の定量検定法における反応成績について
みれば、少なくとも1年間安定な挙動をすること
が示された。 30/15細胞株は、凍結した材料から2度の機会
に再クローニングされ、17/14株は凍結した材料
から1回再クローニングされた。61/7株は再ク
ローニングされたことがない。 実施例 1 単クローン抗体テオフイリン細胞株の生成 A テオフイリン−8−KLHの調製 8−(3−カルボキシプロピル)−テオフイリ
ンを、米国特許出願第315922号(1981年10月28
日付)(特開昭58−47258号公報参照)の記述に
従い合成した。この化合物15mgをN−ヒドロキ
シサクシニシド7mgとジメチルホルムアミド2
ml中で4℃において18時間反応させた。この時
間の終りに、PH8.5の0.1M炭酸ナトリウム、15
mlに溶解したKLH200mgを加えた。反応混合液
を18時間4℃で撹拌した。反応しなかつたテオ
フイリンを透析により除去した。 B 免疫処理 Balb/c系統のマウスに完全なフロインド
氏補助剤0.3ml中に乳化したテオフイリン−8
−KLH(上記Aに従つて調製)300μgを注射し
た。上記と同様にして、21日間隔で3回追加増
量注射を行つた。最後の追加注射の7日後にマ
ウスから採血し、I125標識付プロテインAを用
いる固相放射免疫定量法および粒子により促進
される濁度阻害免疫定量法により血清を循環性
抗テオフイリン抗体について検定した。マウス
には腹腔内に最後の追加注射を行い、その4日
後に融合のために脾臓を取り出した。 C 粒子により促進される濁度阻害免疫定量法 この定量法はつぎのようにマウス血清のスク
リーニングに用いられた。すなわちマウス血清
5μをPH7.8、全量1ml中にテオフイリン−
HSAで被覆したラテツクス粒子〔米国特許出
願第315922号(1981年10月28日付)および特開
昭58−47258号公報参照〕12.5μ、ポリエチレ
ングリコール60002.5%(V/V、最終濃度)
を含む0.15Mの燐酸塩緩衝液の測定容器に加え
た。抗体により媒介されるラテツクス粒子の凝
集による濁度を自記分光光度計を用いて340nm
で37℃において測定した。血清5μにつき濁
度形成率が0.2吸光度単位に達するマウスを選
んで後にその脾臓を融合に用いた。 D 融合 脾臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸
濁液を調製した。それらの脾臓細胞をNS−1
骨髄腫細胞と5:1の比率(それぞれの細胞数
は108および107である)で30%(V/V)のポ
リエチレングリコール0.2mlを用いて無血清培
地中で融合させた。融合した細胞を無血清培地
中で洗浄し、無血清培地30mlに懸濁し、マウス
の腹腔マクロフアージ食細胞層を含む96孔の微
量力価検定用プレートに接種した(孔1個につ
き約50μ)。 HAT選別培地を18時間後に加えた。5日後
から隔日に各孔中の交雑細胞コロニーを検査し
た。交雑体が検出された場合(融合後約2週
間)には、その孔をマークし、細胞の増殖がさ
らに多量に拡大することが望ましくなる時点に
達するまで観察を続けた。この時点において交
雑細胞を含む孔の培養上清液を収穫し、細胞を
24孔のプレートに移して拡大培養した。3週間
後に交雑細胞をHT培養地(ヒポキサンチンお
よびチミジンを含有する)で培養した。この段
階においてマクロフアージ食細胞層は培養から
死細胞および残骸を除去したので使用を止め
た。 E スクリーニング 上記の収穫した培養上清液中の抗テオフイリ
ン抗体について固態放射免疫定量法によりスク
リーニングを行つた。スクリーニングに用いら
れた抗原は、上記のテオフイリン−8−KLH
と同様にして合成されたテオフイリン−8−
BSA(1モルのBSAにつきテオフイリン20モ
ル)であつた。第2の抗体はI125標識付の山羊
の抗マウスIgであつた。 総数56個の陽性の孔が放射免疫定量法により
検出された。これらの孔はI125標識付のプロテ
インAを用いて再びスクリーニングを行つた。
この試薬はIgG類に属する抗体のみを検出す
る。56の陽性培養上清液中細胞株30/15、17/
14および61/7を含む28はIgG類に属すること
が証明された。 これら28の培養上清液を遊離のテオフイリン
を結合する能力についてスクリーニングを行つ
た。遊離のテオフイリン(最終濃度10μg/ml)
を固態放射免疫定量法にとりこませ、遊離のテ
オフイリンを結合する能力は、固定化されたテ
オフイリン−8−BSA抗原に結合される本発
明の抗体の減少によつて立証された。 表1は、3種類の細胞株により産生される抗
体に関するこれらの定量検定の結果を示す。デ
ータにみられる通り、これらの抗体の固定化さ
れたテオフイリン−8−BSAへの結合は遊離
のテオフイリンにより阻害されるが、その5倍
量の遊離のカフエインによつて阻害されない。
サンチン)に対する単クローン抗体の生産のため
の交雑細胞株、均質で単一特異性の抗体、および
それらのテオフイリンに対する免疫定量法(イム
ノアツセイ)への利用に関する。 1975年にKohlerおよびMilstein両氏は、マウ
スの骨髄細胞を羊の赤血球に対する単クローン抗
体を分泌する免疫処理されたマウス脾臓細胞に融
合させることに由来する継続的な交雑細胞株(ハ
イブリドーマ)の確立を報告した〔「Nature」第
256巻第495頁(1975年)〕。それ以来、他の抗原お
よびハプテンに対する単クローン抗体の生産につ
いて多数の報丈が提出された。例えばF.
MelchersM.PotterおよびN.Warner氏ら編
「Current Topics in Microbiology and
Immunology」第81巻(1978年刊行)および同書
中の引用文献、またR.Kennet、T、McKearnお
よびK.Bechtol氏ら編「Monoclona Autibodies」
(1980年刊行)および同書中の引用文献を参照さ
れたい。 ハイブリドーマを生成する一般的技術は周知さ
れ且つ理解されているが、望ましい特性を揃えて
有する抗体を分泌するハイブリーマ細胞株の調製
および選別にはいまだ多大の困難がある。 欧州特許出願第25722号(1981年3月25日公告)
は、人体T−淋巴球細胞表面抗原に対する単クロ
ーン抗体の生産を開示している。 心臓のグリコシドであるジゴキシンに対する単
クローン抗体の生産は「Federation
Proceedings」第39巻第928頁(1980第)および
「Scand.J.Clin.Lab.Invest.」第4巻第75頁(1981
年)において報告された。 体液中の各種の治療薬剤のレベルをモニターす
るために使用可能な臨床診断的定量法の需要が速
やかに増加している。ぜんそく治療剤であるテオ
フイリンは、その有効範囲が非常に狭い薬剤であ
る。テオフイリンに対する免疫定量法には高度に
特異的な抗体を必要とする。それは体液中にはテ
オフイリンと構造的に類似する他のキサンチン化
合物が存在し、もしそれらが抗テオフイリン抗体
により認識されれば分析対象となるテオフイリン
濃度の誤つた値をもたらすからである。テオフイ
リンは1,3−ジメチルキサンチンであり、交差
反応性を有する最も屡々出現する4種のキサンチ
ン化合物は、カフエイン(1,3,7−トリメチ
ルキサンチン)、テオブロミン(3,7−ジメチ
ルキサンチン)、キサンチンおよびヒポキサンチ
ンである。最も頻繁に出現するキサンチン化合物
はカフエインであり、日常の飲料のいたるところ
に存在する。それはまた新生児におけるテオフイ
リン代謝の産物であり、カフエインのレベルがテ
オフイリンのレベルに接近することもあり得る。
それゆえ、テオフイリンに対する診断的免疫定量
法に用いる抗テオフイリン抗体はカフエインと交
差反応をしないことが必須の要件である。 テオフイリンその他の化合物で一般に化学式量
(formula weight)1000以下のものは、それ自体
が免疫原性を有する担体に結合されなければ免疫
原とならない〔例えばH.N.Eisen氏著
「Immunology」ハーパー・アンド・ロウ社)
1980年版参照〕。このような化合物はハプテンと
呼ばれ、ハプテンを免疫原化するために担体に結
合させる各種の方法が当業界に知られている。担
体およびハプテンを担体に結合させる部位の選択
がハプテン−担体複合体の免疫原特性ならびに産
生される抗体の特異性に影響することが知られて
いる〔例えば「Methods in Enzymology」第70
巻第85頁(1980年)参照〕。 米国特許第4156081号明細書は、3−位置置換
のテオフイリン誘導体の合成およびカフエインと
交差反応しない抗体を産生するための免疫原とし
てのそれらの利用を記述している。しかしながら
それらは1−メチルキサンチンと交差反応する。
さらにまた、商業的免疫定量実施のためには多量
の抗血清を要し、また動物の免疫処置による抗体
の産生は遅く、手間がかかり、そして動物の種類
によりまた同種の動物でも飼育系統が異なれば必
ずしも再現性がよくない。 欧州特許出願第44441号(1982年1月27日公告)
は、薬剤に対する単クローン抗体の産生を開示し
ている。しかしそれはカフエインに対する交差反
応性を全く欠如するようなテオフイリンに対する
単クローン抗体を開示してはいない。 本発明の細胞株(セルライン)は、3種の連続
的交雑単クローン細胞株であり、それぞれテオフ
イリンに対する新規な単クローン抗体を産生する
能力を有する。細胞株は、8−位置置換テオフイ
リン−担体複合体(免疫原)を用いて免疫処置さ
れたマウスからの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞の
交雑体である。本発明による抗体のそれぞれは、
テオフイリンに対する粒子促進濁度阻害免疫定量
法〔米国特許出願第315922号(1981年10月28日
付)および特開昭58−47258号公報参照〕により
測定したときにはカフエインとの交差反応性は5
%以下である。テオフイリンに対する免疫定量
法、特に粒子により促進される濁度阻害免疫定量
法へのこれらの抗体の利用も期待される。 第1図、第2図および第3図は、それぞれ細胞
株30/15、17/14、および61/7により産生され
るテオフイリンに対する単クローン抗体を用いる
粒子により促進される濁度阻害免疫定量法により
得られる標準検量曲線である。 単クローン抗体は、所望の抗原またはハプテン
(本発明の場合にはテオフイリン)を用いて免疫
処置されたマウスからの脾臓細胞をマウスの骨髄
腫細胞に融合させることにより産生される。単ク
ローン抗体の対象にしようとする化合物がハプテ
ンである場合には、最初に免疫原性能を得るため
にそのハプテンを高分子量担体と結合させること
が必要である。このような担体には、蛋白質、多
糖質、および各種のラテツクス粒子が含まれる。
本発明の目的のために、テオフイリンをその8−
位置を介して陣笠貝へモシアニン(KLH)のア
ミノ基に結合剤としてカルボジイミドを用いて結
合させ、そしてテオフイリン−8−KLHを得る。 実施にあたつては、数週間ないし数ケ月の期間
をかけて間隔をおいて数回の免疫処置を行う。免
疫処置されたマウスのごとき動物から毎回注射の
時に採用し、そして血清中に所望の抗体の存否を
検査する。適当な検査定量法のどれでもよいが、
放射免疫定量法および酵素にリンクした免疫吸着
定量法がしばしば用いられる。血清中に抗体が検
出されれば、その動物を殺し、脾臓を細胞融合操
作のために無菌的に取り出す。 数種類のマウス骨髄腫細胞株が融合のパートナ
ーとして有用であることが知られている。 これらの細胞株の特徴は、上記の引用文献すな
わち「Current Topics in Microbiology and
Immunology」に記述されている。一般的に、骨
髄腫細胞株でそれ自体の免疫グロブリン産物を分
泌しない株を選ぶことが好ましい。 融合操作は、融合促進剤としてポリエチレング
リコールを用いて行われることが最も多い。セン
ダイウイルスのごとき融合促進剤を用いてもよ
い。脾臓細胞の骨髄腫細胞に対する比率は場合に
より異なるが、5〜10:1の比率が最も多く用い
られる。 融合の後に、細胞を希釈し、ヒポキサンチン/
アミノプリテン/チミジン(HAT)培地のごと
き選択培地に倍養する。融合しない脾臓細胞は有
限回数の分裂の後に死滅する。また骨髄腫細胞
は、それが有するヒポキサンチン−グアニンホス
ホリボシルトランスフエラーゼ(HGPRT)遺伝
子の突然変異のためにHAT培地中では生存不能
で死滅する。交雑体および融合しない細胞の懸濁
液を、容器1当りの細胞数を限定するために、培
養前に希釈する。通常微量力価検定用プレートの
くぼみ孔1個につき細胞数1〜5個にまで希釈す
る。 細胞の増殖が認め得られるに至れば、培養上清
液を、固相放射免疫定量法またはその他の適当な
検定法により、所望の抗体の存否について検定す
る。対象となる抗体の産生が認められるくぼみ孔
の細胞をクローンとして軟寒天に採取するか、ま
たは希釈を限定して単クローン性を保証する。 ハイブリドーマを容器中で培養して培養上清液
を収穫するか、またはハイブリドーマをマウスに
注射するかによつて多量の抗体が得られる。抗体
はハイブリドーマをプリスタンで前処置した同系
統または同種のマウスの腹腔内に注射することに
より腹水液中から得られる。抗体はハイブリドー
マを静脈内に注射することにより血清中から得ら
れる。抗体の1ml当りの量は差異があり、通常培
養上清液中で最も少なく、腹水液中で最も多い。 かくして造出された単クローン抗体はその免疫
グロブリン類および亜類により、またその等電点
決定パターンにより特徴づけられる。親和性定数
が得られ、そして抗体は関連性のある一連の抗原
(ハプテン)との反応性をもとにして特徴づけら
れる。 本発明は、テオフイリンに対する単クローン抗
体よりなる。3種の異なるクローンタイプすなわ
ち30/15、17/14、および61/7が、Balb/c
系統のマウスをテオフイリン−8−LKHを用い
る免疫処置によつて誘導された。三者はすべて1
回の融合の生成物である。三者はすべて同じ重い
(H)および軽い(L)鎖の群に属するが、等電点決定パ
ターンはそれぞれ著明に異なる。三者はすべてテ
オフイリンを結合し、テオフイリン量測定のため
の免疫定量法に利用することができる。用いられ
る免疫定量法の一つは、粒子により促進される濁
度阻害免疫定量法である。これらのクローンタイ
プのうちで、テオフイリンに対する免疫定量法へ
の主要な妨害物質であるカフエインと交差反応す
るものはない。また他のキサンチン化合物との交
差反応性も低い。 3種類のハイブリドーマ細胞株すなわち30/
15、17/14および61/7は米国菌株保存機関
(ATCC)に1982第8月5日に寄託され、それぞ
れHB8152号、HB8153号、およびHB8154号の
ATCC保存番号を与えられている。 本発明のハイブリドーマ細胞株は、マウスの骨
髄腫細胞株P3−NSI−1−Ag4−1(NS−1と称
する)とBalb/c脾臓細胞との交雑体である。
NS−1細胞株自体もBalb/c系統マウスに由来
し、kL(軽)鎖を合成するが、それは分泌されな
い。NS−1は、ソーク研究所細胞分譲センター
(米国カリフオルニア州ラ・ホヤ市所在)から得
られる。 本発明のハイブリドーマ細胞株は交雑体であ
り、このことはそれぞれの交雑体クローン中にお
ける双方の親株の遺伝子産物の存在によつて立証
される。それぞれの細胞株は、産生する抗体およ
びその他の定量検定法における反応成績について
みれば、少なくとも1年間安定な挙動をすること
が示された。 30/15細胞株は、凍結した材料から2度の機会
に再クローニングされ、17/14株は凍結した材料
から1回再クローニングされた。61/7株は再ク
ローニングされたことがない。 実施例 1 単クローン抗体テオフイリン細胞株の生成 A テオフイリン−8−KLHの調製 8−(3−カルボキシプロピル)−テオフイリ
ンを、米国特許出願第315922号(1981年10月28
日付)(特開昭58−47258号公報参照)の記述に
従い合成した。この化合物15mgをN−ヒドロキ
シサクシニシド7mgとジメチルホルムアミド2
ml中で4℃において18時間反応させた。この時
間の終りに、PH8.5の0.1M炭酸ナトリウム、15
mlに溶解したKLH200mgを加えた。反応混合液
を18時間4℃で撹拌した。反応しなかつたテオ
フイリンを透析により除去した。 B 免疫処理 Balb/c系統のマウスに完全なフロインド
氏補助剤0.3ml中に乳化したテオフイリン−8
−KLH(上記Aに従つて調製)300μgを注射し
た。上記と同様にして、21日間隔で3回追加増
量注射を行つた。最後の追加注射の7日後にマ
ウスから採血し、I125標識付プロテインAを用
いる固相放射免疫定量法および粒子により促進
される濁度阻害免疫定量法により血清を循環性
抗テオフイリン抗体について検定した。マウス
には腹腔内に最後の追加注射を行い、その4日
後に融合のために脾臓を取り出した。 C 粒子により促進される濁度阻害免疫定量法 この定量法はつぎのようにマウス血清のスク
リーニングに用いられた。すなわちマウス血清
5μをPH7.8、全量1ml中にテオフイリン−
HSAで被覆したラテツクス粒子〔米国特許出
願第315922号(1981年10月28日付)および特開
昭58−47258号公報参照〕12.5μ、ポリエチレ
ングリコール60002.5%(V/V、最終濃度)
を含む0.15Mの燐酸塩緩衝液の測定容器に加え
た。抗体により媒介されるラテツクス粒子の凝
集による濁度を自記分光光度計を用いて340nm
で37℃において測定した。血清5μにつき濁
度形成率が0.2吸光度単位に達するマウスを選
んで後にその脾臓を融合に用いた。 D 融合 脾臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸
濁液を調製した。それらの脾臓細胞をNS−1
骨髄腫細胞と5:1の比率(それぞれの細胞数
は108および107である)で30%(V/V)のポ
リエチレングリコール0.2mlを用いて無血清培
地中で融合させた。融合した細胞を無血清培地
中で洗浄し、無血清培地30mlに懸濁し、マウス
の腹腔マクロフアージ食細胞層を含む96孔の微
量力価検定用プレートに接種した(孔1個につ
き約50μ)。 HAT選別培地を18時間後に加えた。5日後
から隔日に各孔中の交雑細胞コロニーを検査し
た。交雑体が検出された場合(融合後約2週
間)には、その孔をマークし、細胞の増殖がさ
らに多量に拡大することが望ましくなる時点に
達するまで観察を続けた。この時点において交
雑細胞を含む孔の培養上清液を収穫し、細胞を
24孔のプレートに移して拡大培養した。3週間
後に交雑細胞をHT培養地(ヒポキサンチンお
よびチミジンを含有する)で培養した。この段
階においてマクロフアージ食細胞層は培養から
死細胞および残骸を除去したので使用を止め
た。 E スクリーニング 上記の収穫した培養上清液中の抗テオフイリ
ン抗体について固態放射免疫定量法によりスク
リーニングを行つた。スクリーニングに用いら
れた抗原は、上記のテオフイリン−8−KLH
と同様にして合成されたテオフイリン−8−
BSA(1モルのBSAにつきテオフイリン20モ
ル)であつた。第2の抗体はI125標識付の山羊
の抗マウスIgであつた。 総数56個の陽性の孔が放射免疫定量法により
検出された。これらの孔はI125標識付のプロテ
インAを用いて再びスクリーニングを行つた。
この試薬はIgG類に属する抗体のみを検出す
る。56の陽性培養上清液中細胞株30/15、17/
14および61/7を含む28はIgG類に属すること
が証明された。 これら28の培養上清液を遊離のテオフイリン
を結合する能力についてスクリーニングを行つ
た。遊離のテオフイリン(最終濃度10μg/ml)
を固態放射免疫定量法にとりこませ、遊離のテ
オフイリンを結合する能力は、固定化されたテ
オフイリン−8−BSA抗原に結合される本発
明の抗体の減少によつて立証された。 表1は、3種類の細胞株により産生される抗
体に関するこれらの定量検定の結果を示す。デ
ータにみられる通り、これらの抗体の固定化さ
れたテオフイリン−8−BSAへの結合は遊離
のテオフイリンにより阻害されるが、その5倍
量の遊離のカフエインによつて阻害されない。
【表】
F 半限界的希釈によるクローニング
関心の対象となる細胞株(30/15、17/14、
61/7)を、半限界的希釈すなわち微量力価検
定孔1個につき細胞約3個におけるクローニン
グが可能な数になるまで拡大培養した。また一
定量の細胞を喪失に対する安全保障として、生
きたまま液体窒素で凍結保存した。腹腔マクロ
フアージ食細胞層を再び用いた。孔中に充分な
数の細胞が存在する場合には、培養上清液を固
相放射免疫定量法を用いて再びスクリーニング
を行つた。陽性を示す孔を拡大培養および再ク
ローニングのために選んだ。 G 限界的希釈におけるクローニング 選んだ孔について、厳密なポアツソン統計に
よる限界的希釈におけるクローニングを行つ
た。この場合孔の1/3は増殖を示すことが期待
され、それぞれの孔中で増殖した細胞はただ1
個のハイブリドーマ細胞の子孫である確率は非
常に高い。孔中に充分な数の細胞が存在する場
合には、その培養上清液を単クローン抗体の存
在について再び試験した。細胞株三者はすべて
所望の抗体を産生し続けた。 H 鎖の組成 3種類の細胞株すなわち30/15、17/14、お
よび61/7に由来するすべての単クローン抗体
は寒天ゲル二重拡散法により検定したところ、
ガンマ重(H)鎖(第1亜類)およびカツパ軽(L)鎖
よりなつていた。 実施例 2 腹水癌中における単クローン抗体の産生 大量の抗テオフイリン単クローン抗体を産生さ
せるために、約106個のハイブリドーマ細胞をプ
リスタンで前処置した同系統のBalb/cマウス
に腹腔内注射した。採取された腹水液は高濃度の
抗テオフイリン活性を有することが固態放射免疫
定量法および粒子により促進される濁度阻害免疫
定量法の両方により下記のごとく明示された。 実施例 3 テオフイリンに対する免疫定量測定 細胞株30/15、17/14および61/7で前処置し
たマウスからの腹水液を、acaTM臨床分析器(デ
ユポン社製品)における粒子により促進される濁
度阻害免疫定量測定に用いた。テオフイリン0〜
40μg/mlを含有する血清をベースとするテオフ
イリン検量標準液20μが分析器の充填ステーシ
ヨン内の分析テストパツク中へ自動的に注入さ
れ、続いて3%(容器中容量)のポリエチレング
リコール6000、0.1%のGAFACRE−610、および
0.15Mの燐酸塩を含有する緩衝液4.980mlが注入
される。パツクは自動的に37℃に加温される。テ
オフイリン−HSAで被覆したラテツクス粒子
〔米国特許出願第315922号(1981年10月28日付)
および特開昭58−47258号公報参照〕40mlおよび
750mMのジチオエリスリトール溶液50μがそれぞ
れ分析器のブレーカー/ミキサーの第2番およ
び第3番のくぼみ孔から加えられた。抗テオフイ
リン抗体は、無菌過した腹水液として(17/
50μ、細胞株により異なる量)ブレーカー/ミ
キサーの第6番くぼみ孔から加えられた。濁度
の形成率はブレーカー/ミキサーにおける反応
開始の約39秒後に340nmにおいて自動的に測定さ
れた。 第1図は30/15の腹水液28μを用いて得られ
た典型的な標準曲線を示す。第2図は17/14の腹
水液17μを用いて得られた典型的な標準曲線を
示す。第3図は、61/7の腹水液を用いて得られ
た典型的な標準曲線を示す。 実施例 4 細胞株30/15、17/14および61/7のテオフイリ
ンに対する特異性 免疫定量測定においてテオフイリンを精密に測
定するためには、試料中に存在する他のキサンチ
ン化合物に対する抗テオフイリン抗体の交差反応
性はごく少ないかまたは皆無でなくてはならな
い。交差反応性は、テオフイリン10μg/mlを含
有する試料中に問題になる物質が最終濃度
10μg/mlに存在する場合に派生する測定誤差の
パーセントと定義される。 表はカフエイン、テオブロミン、1,7−ジ
メチルキサンチン、3−メチルキサンチン、ヒポ
キサンチン、およびキサンチンに対する抗体30/
15、17/14および61/7の交差反応性を2種類の
家兎抗血清(924PO213および904PO518)と比較
する。2種類の家兎抗血清はテオフイリン−8−
BSAに対して産生され、試験された10種類以上
の家兎抗血清中の典型的なものである。 細胞株30/15、17/14および61/7により産生
される本発明の単クローン抗体はテオフイリンに
対して特異的であり、多クローン性の家兎抗血清
よりも優れている。
61/7)を、半限界的希釈すなわち微量力価検
定孔1個につき細胞約3個におけるクローニン
グが可能な数になるまで拡大培養した。また一
定量の細胞を喪失に対する安全保障として、生
きたまま液体窒素で凍結保存した。腹腔マクロ
フアージ食細胞層を再び用いた。孔中に充分な
数の細胞が存在する場合には、培養上清液を固
相放射免疫定量法を用いて再びスクリーニング
を行つた。陽性を示す孔を拡大培養および再ク
ローニングのために選んだ。 G 限界的希釈におけるクローニング 選んだ孔について、厳密なポアツソン統計に
よる限界的希釈におけるクローニングを行つ
た。この場合孔の1/3は増殖を示すことが期待
され、それぞれの孔中で増殖した細胞はただ1
個のハイブリドーマ細胞の子孫である確率は非
常に高い。孔中に充分な数の細胞が存在する場
合には、その培養上清液を単クローン抗体の存
在について再び試験した。細胞株三者はすべて
所望の抗体を産生し続けた。 H 鎖の組成 3種類の細胞株すなわち30/15、17/14、お
よび61/7に由来するすべての単クローン抗体
は寒天ゲル二重拡散法により検定したところ、
ガンマ重(H)鎖(第1亜類)およびカツパ軽(L)鎖
よりなつていた。 実施例 2 腹水癌中における単クローン抗体の産生 大量の抗テオフイリン単クローン抗体を産生さ
せるために、約106個のハイブリドーマ細胞をプ
リスタンで前処置した同系統のBalb/cマウス
に腹腔内注射した。採取された腹水液は高濃度の
抗テオフイリン活性を有することが固態放射免疫
定量法および粒子により促進される濁度阻害免疫
定量法の両方により下記のごとく明示された。 実施例 3 テオフイリンに対する免疫定量測定 細胞株30/15、17/14および61/7で前処置し
たマウスからの腹水液を、acaTM臨床分析器(デ
ユポン社製品)における粒子により促進される濁
度阻害免疫定量測定に用いた。テオフイリン0〜
40μg/mlを含有する血清をベースとするテオフ
イリン検量標準液20μが分析器の充填ステーシ
ヨン内の分析テストパツク中へ自動的に注入さ
れ、続いて3%(容器中容量)のポリエチレング
リコール6000、0.1%のGAFACRE−610、および
0.15Mの燐酸塩を含有する緩衝液4.980mlが注入
される。パツクは自動的に37℃に加温される。テ
オフイリン−HSAで被覆したラテツクス粒子
〔米国特許出願第315922号(1981年10月28日付)
および特開昭58−47258号公報参照〕40mlおよび
750mMのジチオエリスリトール溶液50μがそれぞ
れ分析器のブレーカー/ミキサーの第2番およ
び第3番のくぼみ孔から加えられた。抗テオフイ
リン抗体は、無菌過した腹水液として(17/
50μ、細胞株により異なる量)ブレーカー/ミ
キサーの第6番くぼみ孔から加えられた。濁度
の形成率はブレーカー/ミキサーにおける反応
開始の約39秒後に340nmにおいて自動的に測定さ
れた。 第1図は30/15の腹水液28μを用いて得られ
た典型的な標準曲線を示す。第2図は17/14の腹
水液17μを用いて得られた典型的な標準曲線を
示す。第3図は、61/7の腹水液を用いて得られ
た典型的な標準曲線を示す。 実施例 4 細胞株30/15、17/14および61/7のテオフイリ
ンに対する特異性 免疫定量測定においてテオフイリンを精密に測
定するためには、試料中に存在する他のキサンチ
ン化合物に対する抗テオフイリン抗体の交差反応
性はごく少ないかまたは皆無でなくてはならな
い。交差反応性は、テオフイリン10μg/mlを含
有する試料中に問題になる物質が最終濃度
10μg/mlに存在する場合に派生する測定誤差の
パーセントと定義される。 表はカフエイン、テオブロミン、1,7−ジ
メチルキサンチン、3−メチルキサンチン、ヒポ
キサンチン、およびキサンチンに対する抗体30/
15、17/14および61/7の交差反応性を2種類の
家兎抗血清(924PO213および904PO518)と比較
する。2種類の家兎抗血清はテオフイリン−8−
BSAに対して産生され、試験された10種類以上
の家兎抗血清中の典型的なものである。 細胞株30/15、17/14および61/7により産生
される本発明の単クローン抗体はテオフイリンに
対して特異的であり、多クローン性の家兎抗血清
よりも優れている。
添付図面において第1図、第2図および第3図
は、それぞれ細胞株30/15、17/14、および61/
7により産生されるテオフイリンに対する単クロ
ーン抗体を用いる際の粒子促進濁度阻害免疫定量
法により得られる標準検量曲線である。
は、それぞれ細胞株30/15、17/14、および61/
7により産生されるテオフイリンに対する単クロ
ーン抗体を用いる際の粒子促進濁度阻害免疫定量
法により得られる標準検量曲線である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 カフエインに対する交差反応性が5%または
それ以下であるテオフイリンに対する単クローン
抗体。 2 テオブロミンに対する交差反応性が30%また
はそれ以下でありそして3−メチルキサンチンに
対する交差反応性が5%またはそれ以下である特
許請求の範囲第1項記載の単クローン抗体。 3 カフエインに対する交差反応性が5%または
それ以下である抗テオフイリン単クローン抗体を
利用するテオフイリンに対する免疫定量方法。 4 粒子により促進される濁度阻害免疫定量法で
ある特許請求の範囲第3項記載の免疫定量方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US39368082A | 1982-06-30 | 1982-06-30 | |
US393680 | 1982-06-30 | ||
US406554 | 2003-04-03 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63276369A Division JPH02426A (ja) | 1982-06-30 | 1988-11-02 | 交雑細胞株 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5920228A JPS5920228A (ja) | 1984-02-01 |
JPH031958B2 true JPH031958B2 (ja) | 1991-01-11 |
Family
ID=23555785
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58116233A Granted JPS5920228A (ja) | 1982-06-30 | 1983-06-29 | テオフイリンに対する単クローン抗体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5920228A (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR112014030843A2 (pt) * | 2012-07-04 | 2019-10-15 | Hoffmann La Roche | anticorpo anti-teofilina, formulação farmacêutica e uso do anticorpo |
-
1983
- 1983-06-29 JP JP58116233A patent/JPS5920228A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5920228A (ja) | 1984-02-01 |
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