WO2011037262A1

WO2011037262A1 - 抗メチル化ｄｎａ抗体を産生するハイブリドーマおよびその利用

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Publication number: WO2011037262A1
Application number: PCT/JP2010/066847
Authority: WO
Inventors: 綾子酒井; 昌裕梶田
Original assignee: シスメックス株式会社
Priority date: 2009-09-28
Filing date: 2010-09-28
Publication date: 2011-03-31
Also published as: CN102574927B; EP2484698A4; EP2484698A1; JP4949538B2; JPWO2011037262A1; US9169330B2; CN102574927A; US20120184719A1

Abstract

　本発明は、５'－（５－メチル－２'－デオキシシチジン－３'－ホスホ）－２'－デオキシグアノシン３'－リン酸を含む抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られる、抗メチル化ＤＮＡ抗体を産生するハイブリドーマに関する。また、本発明は、該ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体および該抗体を用いてメチル化ＤＮＡを免疫沈降する方法に関する。

Description

抗メチル化ＤＮＡ抗体を産生するハイブリドーマおよびその利用

　本発明は、抗メチル化ＤＮＡ抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体、および該抗体を用いてメチル化ＤＮＡを免疫沈降する方法に関する。

　高等真核生物の染色体ＤＮＡでは、ＤＮＡを構成する塩基のうちシトシン（Ｃ）の５位がメチル化修飾されることがある。この高等真核生物におけるＤＮＡのメチル化は、遺伝情報の発現抑制機構として機能している。例えば、ある遺伝子のプロモーター領域によく見られるＣｐＧ配列を多く含む領域（「ＣｐＧアイランド」または「ＣＧ島」とも呼ばれる）がメチル化されている場合、その遺伝子の転写が抑制される。これに対して、ＣｐＧアイランドがメチル化されていない場合、プロモーター領域に転写因子が結合できるので、該遺伝子が転写可能な状態となる。

　このように、ＤＮＡのメチル化は遺伝子発現の制御機構の１つである。そのため、ＤＮＡのメチル化は、初期胚発生、組織特異的な遺伝子の発現、哺乳動物に特徴的な現象である遺伝子刷り込みやＸ染色体の不活性化、染色体の安定化、ＤＮＡ複製のタイミングなどの様々な生理的、病理的な現象に重要な役割を果たしている。
　さらに近年、癌やその他の疾病にＤＮＡのメチル化が深く関与することが明らかになってきている。そのため、様々な遺伝子のメチル化の解析に基づいた癌の確定診断や予後予測などについての研究がなされている。

　ＤＮＡのメチル化解析のためにメチル化ＤＮＡを回収する手法の１つとして、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法（Methylation DNA Immunoprecipitaion：ＭｅＤＩＰ法）が知られている。ＭｅＤＩＰ法では、メチル化ＤＮＡを特異的に認識する抗体またはメチル化ＤＮＡ結合タンパク質を用いてメチル化ＤＮＡを免疫沈降して、試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮することができる。また、このＭｅＤＩＰ法とマイクロアレイ解析技術とを組み合わせたＭｅＤＩＰ－ｃｈｉｐ法を用いることにより、ＤＮＡのメチル化状態を網羅的に解析できることも知られている。

　このようなＭｅＤＩＰ法に用い得る抗メチル化ＤＮＡ抗体は、これまでに種々の抗体が市販されており、例えば、５－メチルシトシンまたは５－メチルシチジンを認識する抗体がよく用いられている。また、特開２００３－１２５７６６号公報（特許文献１）には、５－メチル－２’－デオキシシチジンを抗原として用いてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマからモノクローナル抗体を得て、該抗体を用いる酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）により５－メチル－２’－デオキシシチジンを定量できることが記載されている。

特開２００３－１２５７６６号公報

　ＭｅＤＩＰ法により得られたＤＮＡについてメチル化ＤＮＡ解析を行う場合、該ＭｅＤＩＰ法では抗メチル化ＤＮＡ抗体によるメチル化ＤＮＡの回収量および濃縮率は高いことが好ましい。
　しかし、結合能の劣る抗メチル化ＤＮＡ抗体を用いてＤＮＡ含有量の少ない試料に対してＭｅＤＩＰ法を行った場合、メチル化ＤＮＡ解析に必要かつ十分な量のメチル化ＤＮＡを回収できないため、該解析の感度が低下する恐れがある。また、特異性の劣る抗メチル化ＤＮＡ抗体を用いてＭｅＤＩＰ法を行った場合、得られたＤＮＡ中の非メチル化ＤＮＡ含有量が多くなるため、メチル化ＤＮＡ解析の信頼性が低下する恐れがある。
　したがって、ＭｅＤＩＰ法によるメチル化ＤＮＡの回収量および濃縮率のさらなる向上のため、メチル化ＤＮＡに対して優れた結合能および特異性を有する抗メチル化ＤＮＡ抗体の開発が望まれていた。

　本発明は、上記のような事情に鑑みて、メチル化ＤＮＡに対して優れた結合能および特異性を有する抗メチル化ＤＮＡ抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
　また、本発明は、メチル化ＤＮＡの回収量および濃縮率に優れたＭｅＤＩＰ法を可能とする抗メチル化ＤＮＡ抗体を提供することを目的とする。
　さらに、本発明は、上記の抗メチル化ＤＮＡ抗体を用いる、メチル化ＤＮＡの回収量および濃縮率に優れたＭｅＤＩＰ法を提供することを目的とする。

　本発明者らは、以下の式（Ｉ）：

で示される、５’－（５－メチル－２’－デオキシシチジン－３’－ホスホ）－２’－デオキシグアノシン３’－リン酸（以下、「５－メチル－ｄＣｐｄＧｐ」ともいう）を抗原として用いることに着目した。そして、５－メチル－ｄＣｐｄＧｐを含む抗原で動物を免疫し、該動物から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマからメチル化ＤＮＡに対して優れた結合能および特異性を有する抗メチル化ＤＮＡ抗体を得られることを見出して、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明によれば、５－メチル－ｄＣｐｄＧｐを含む抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られるハイブリドーマ（以下、「本発明のハイブリドーマ」ともいう）が提供される。
　また、本発明によれば、上記のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体、および該抗体を用いてメチル化ＤＮＡを免疫沈降する方法が提供される。

　本発明のハイブリドーマにより、メチル化ＤＮＡ、特にメチル化ＣｐＧ配列に対して優れた結合能および特異性を有する抗メチル化ＤＮＡ抗体を得ることができる。また、得られた抗体を用いてＭｅＤＩＰ法を行うことにより、従来の抗メチル化ＤＮＡ抗体を用いた場合よりもメチル化ＤＮＡの回収量および濃縮率を著しく向上することができる。

本発明のハイブリドーマの培養上清および各種市販抗体を用いたＭｅＤＩＰ法で回収したメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡの量を示す棒グラフである。本発明のハイブリドーマの培養上清および各種市販抗体を用いたＭｅＤＩＰ法で回収したメチル化ＤＮＡの濃縮率を示す棒グラフである。各反応条件において、本発明のモノクローナル抗体および市販抗体を用いたＭｅＤＩＰ法で回収したメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡの量を示す棒グラフである。各反応条件において、本発明のモノクローナル抗体および市販抗体を用いたＭｅＤＩＰ法で回収したメチル化ＤＮＡの濃縮率を示す棒グラフである。本発明のモノクローナル抗体および市販抗体を用いたＭｅＤＩＰ法で回収した３ＭｅＣＧおよび３ＭｅＣＴの回収率を示す棒グラフである。

　「ＣｐＧ配列」とは、塩基配列中のシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）が５’から３’への方向にこの順序で隣り合った配列を意味する。同様に、「ＣｐＴ配列」とは、塩基配列中のＣとチミン（Ｔ）が５’から３’への方向にこの順序で隣り合った配列を意味する。なお、ＣｐＧおよびＣｐＴの「ｐ」の文字は、ＣとＧ（またはＴ）との間のホスホジエステル結合を表わす。

　「メチル化ＣｐＧ配列」とは、シトシンの５位がメチル化修飾されたＣｐＧ配列を表す。哺乳類のゲノムＤＮＡでは、ＣｐＧ配列を有する部位においてシトシンの５位がメチル化修飾されることが知られている。

　「ハイブリドーマ」とは、リンパ球などの抗体産生細胞とミエローマ（骨髄腫）細胞とを人工的に融合させて得られる雑種細胞を意味し、抗体産生能を有する培養可能な細胞である。

　本明細書において、メチル化ＤＮＡの「濃縮率」は、ＭｅＤＩＰ法により回収されたメチル化ＤＮＡの非メチル化ＤＮＡに対する重量比（［メチル化ＤＮＡの重量値］／［非メチル化ＤＮＡの重量値］）で表される。

　本発明のハイブリドーマは、５－メチル－ｄＣｐｄＧｐを含む抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られるハイブリドーマである。

　以下に、本発明のハイブリドーマの作製、該ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の製造および該抗体を用いてメチル化ＤＮＡを免疫沈降する方法について説明する。
　なお、これらの方法自体はいずれも当業者に周知慣用の技術であり、ハイブリドーマを作製する方法は、例えばHybridoma Techniques（Cold Spring Harbor Laboratory, １９８０年版）および細胞組織化学（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に、メチル化ＤＮＡを免疫沈降する方法は、例えばエピジェネティクス実験プロトコール（牛島俊和、眞貝洋一ら編、羊土社、２００８年）に記載されている。

１．本発明のハイブリドーマの作製
　本発明のハイブリドーマは、以下のようにして作製することができる。なお、一般にハイブリドーマの作製方法は、以下の：
（１）免疫用抗原を調製する工程、（２）動物を抗原で免疫する工程、（３）動物から抗体産生細胞を単離する工程、（４）抗体産生細胞との細胞融合に用いるミエローマ細胞を調製する工程、（５）抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合してハイブリドーマとする工程、（６）ハイブリドーマを選択的培養する工程、（７）目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする工程、および（８）スクリーニングにより選択されたハイブリドーマをクローニングする工程を含む。
　以下に、上記の各工程について、より詳しく説明する。

（１）抗原の調製
　本発明のハイブリドーマの作製には、免疫用抗原として５－メチル－ｄＣｐｄＧｐを含む抗原を用いる。
　５－メチル－ｄＣｐｄＧｐを含む抗原は、ハプテンとして少なくとも５－メチル－ｄＣｐｄＧｐを含む化合物と、免疫学的手法において該化合物に結合して免疫原性を生じさせる適切なキャリアー分子とのコンジュゲートを含む抗原であればよい。該抗原は、さらにアジュバントなどの補助剤を含んでいてもよい。
　また、上記の５－メチル－ｄＣｐｄＧｐを含む化合物は、好ましくは５－メチル－ｄＣｐｄＧｐを含む核酸、より好ましくは５－メチル－ｄＣｐｄＧｐを含むＤＮＡである。
　本発明のハイブリドーマを作製するためには、５－メチル－ｄＣｐｄＧｐとキャリアー分子とのコンジュゲートを適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液など）に溶解または懸濁し、これにフロイント完全アジュバントもしくは不完全アジュバント、またはミョウバンなどの補助剤を混合して調製した免疫用抗原を使用することが好ましい。

　上記のキャリアー分子としては、免疫学的手法において通常用いられ、ハプテンに結合して免疫原性を生じさせる分子であればよく、例えばウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ）、卵白アルブミン（Ovalbumin：ＯＶＡ）、スカシガイのヘモシアニン（Keyhole Limpet Hemocyanin：ＫＬＨ）が挙げられる。それらの中でもＫＬＨが好ましい。
　ハプテンとキャリアー分子とのコンジュゲートとしては、一般に、カルボキシル基とα‐アミノ基とを反応させたアミド結合を有するコンジュゲート、架橋剤を用いて両者を架橋して結合したコンジュゲートなどが挙げられる。そのようなコンジュゲートを得る方法としては、カルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、マレイミドベンゾイルオキシスクシンイミド（ＭＢＳ）法などを用い得るが、それらの中でもＭＢＳ法が好ましい。
　ＭＢＳ法を用いる場合、５－メチル－ｄＣｐｄＧｐのグアノシンのリン酸基に、メルカプト基を有するリンカー（例えば、炭素数１～５のアルキルチオール）をあらかじめ結合させておくことにより、該リンカーのメルカプト基とＫＬＨのアミノ基とを、ＭＢＳにより架橋して結合することができる。

（２）抗原による動物の免疫化
　上記の抗原により、哺乳類または鳥類から選択される動物を免疫できる。そのような動物は免疫学的手法に通常用い得る動物であればよく、哺乳類としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコなどが挙げられ、鳥類としては、例えばニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ダチョウなどが挙げられる。それらの中でも、マウスが好ましい。
　上記の抗原を動物に投与する方法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈注射、皮内注射または筋肉内注射のいずれであってもよいが、それらの中でも皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は、１回または適当な間隔、例えば１～５週間の間隔で複数回行うことができる。また、１回の免疫に使用する抗原量は、用いる動物によっても異なるが、１匹当たり１～1000μgを使用することが好ましい。
　なお、免疫された動物の体内で抗原に対する抗体が産生されているか否かを確認するために、該動物から血液を採取し、該血液から分離した血清について、ＥＬＩＳＡ法などにより抗原との反応性を評価することができる。該反応性が不十分である場合は、上記の免疫を追加して行うこともできる。

（３）抗体産生細胞の単離
　上記のようにして免疫された動物の細胞から、目的の抗体を産生する可能性がある抗体産生細胞を単離する。抗体産生細胞としては、脾臓、胸腺、リンパ節、末梢血またはこれらの組み合わせから得られる抗体産生能を有する細胞が挙げられるが、それらの中でも脾臓細胞またはリンパ節Ｂ細胞が好ましい。例えば、上記の動物への最終免疫の後、抗体産生が確認された動物から脾臓を摘出して、脾臓細胞を単離することができる。

（４）ミエローマ細胞の調製
　本発明のハイブリドーマの作製に用いるミエローマ細胞は、ハイブリドーマの作製に一般的に用いられる細胞から適宜選択できる。そのようなミエローマ細胞としては、例えばマウス由来のＰ３Ｕ１、Ｘ６３．６５３、Ｓｐ２／０、Ｘ６３－Ａｇ８、ＮＳ－１、ＭＰＣ－１１など、ラット由来のＡＧ１、ＡＧ２、ＡＧ３、ＲＣＹ３、２１０などが挙げられる。なお、抗体産生細胞とミエローマ細胞とは、同種の動物由来であることが好ましい。
　上記のミエローマ細胞を培養する培地としては、細胞培養において通常用いられる培地から選択でき、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０などにウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を適量添加した培地が挙げられる。

（５）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合
　細胞融合は、センダイウィルスを用いる方法、ポリエチレングリコールを用いる方法（ＰＥＧ法）、電気処理による方法（電気融合法）などにより行うことができる。ＰＥＧ法は、例えばKohlerおよびMilsteinの方法（Nature, 256: 495-497, 1975）に準じて行うことができ、例えば30～50％ポリエチレングリコール（平均分子量1000～4000）を用いて30～40℃の温度で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１～１０分間混合することによって行われる。
　また、電気融合法は、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞との混合液に、まず10～80 Vの交流電圧を１～20秒間通電して細胞同士を接触させ、次いで１～５kV/cmの高電圧直流パルスを10～100μ秒のパルス幅でかけることによって行われる。

（６）ハイブリドーマの選択的培養
　細胞融合により得られるハイブリドーマの選択は、ハイブリドーマのみが生育できる選択培地を用いて培養することにより行うことができる。そのような選択培地としては、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）またはＨａｚ（ヒポキサンチン－アザセリン）を含む培地を用いることが好ましい。
　例えば、ＨＡＴ含有培地を用いるハイブリドーマの選択的培養は、ミエローマ細胞としてＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）欠損株を用いた場合に有効である。すなわち、抗体産生細胞と融合しなかったＨＧＰＲＴ欠損ミエローマ細胞の増殖はＨＡＴにより阻害されるので、細胞融合工程後の細胞群をＨＡＴ含有培地で培養することによって、ハイブリドーマを選択的に培養することができる。

（７）ハイブリドーマのスクリーニング
　上記のようにして培養したハイブリドーマのうち、目的の抗体を産生できるハイブリドーマを選択するために、スクリーニングを行う。
　ハイブリドーマは産生した抗体を細胞外に分泌するので、選択培地中で増殖が認められたハイブリドーマの培養上清を採取し、この上清中の本発明のモノクローナル抗体の有無および抗体が存在する場合はその力価を、ＭｅＤＩＰ法およびＥＬＩＳＡ法により評価することにより、ハイブリドーマをスクリーニングすることができる。

（８）ハイブリドーマのクローニング
　上記のスクリーニングによって目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た後に、該ハイブリドーマのクローニングを行う。クローニングの方法としては、例えば、ウェルあたり１個の細胞が播種されるように希釈する方法（限界希釈法）、ソフトアガロース培地上に細胞を播種した後にコロニーを取得する方法、マイクロマニピュレータにより１個の細胞を取得する方法、セルソータにより１個の細胞を分離するＦＡＣＳ法などが挙げられるが、限界希釈法が簡便で好ましい。
　また、クローニングしたハイブリドーマについて、さらにスクリーニングおよびクローニングを繰り返して行い、抗体の力価がより優れたハイブリドーマを選択することもできる。

　本発明者らは、上記の工程に従って、５－メチル－ｄＣｐｄＧｐを含む抗原で免疫したマウスから得られた脾臓細胞とミエローマ細胞Ｐ３U１とを電気融合法で細胞融合して得られたハイブリドーマクローンのうち、ＭｅＤＩＰ法および競合阻害試験（ＥＬＩＳＡ法）において良好な力価を示したモノクローナル抗体を産生するクローンＳＣＲ１～７を取得した。

　なお、以下の表１に、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８、〒292-0818、日本）に寄託した各クローンの受託番号および受託年月日を示す。

２．本発明のモノクローナル抗体の製造
　本発明のモノクローナル抗体は、本発明のハイブリドーマの培養上清から得ることができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、本発明のハイブリドーマをヌードマウスなどの動物の腹腔内で増殖させて得られる腹水からも得ることができる。
　さらに、本発明のモノクローナル抗体は、遺伝子組み換え技術によって得ることもできる。すなわち、本発明のハイブリドーマのゲノムＤＮＡから本発明のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖抗体遺伝子を同定し、該抗体遺伝子の配列を有するＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組み込み、得られたベクターをミエローマ細胞などのＩｇタンパク質を産生しない細胞に導入して、本発明のモノクローナル抗体を発現させることにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることもできる。

　上記の培養上清および腹水は、本発明のモノクローナル抗体を含むので、そのままＭｅＤＩＰ法などに使用することもできる。しかし、ＭｅＤＩＰ法におけるメチル化ＤＮＡの回収量および濃縮率を向上させるために、上記の培養上清または腹水から本発明のモノクローナル抗体を精製し、精製された本発明のモノクローナル抗体を使用することが好ましい。
　本発明のモノクローナル抗体の精製方法としては、当業者に公知の方法から選択することができ、例えば、透析、硫酸アンモニウム分画、ポリエチレングリコール分画、エタノール分画、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲル濾過、凍結乾燥などが挙げられる。これらの精製方法の中でも、アフィニティクロマトグラフィーが好ましく、プロテインＡ（またはＧ）カラムを用いるアフィニティクロマトグラフィーがより好ましい。
　また、上記のようにして得られたモノクローナル抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ法などの公知の方法またはキットを用いることにより、サブクラスなどを決定できる。

　本発明のモノクローナル抗体には、該抗体を断片化することによって得られる活性フラグメントも含まれる。そのような活性フラグメントとしては、メチル化ＤＮＡに対する特異的結合活性を失っていないフラグメントであればよい。これらの活性フラグメントは、例えば、精製した本発明のモノクローナル抗体を、パパイン、ペプシンまたはトリプシンなどで処理することにより調製できる。

　本発明のモノクローナル抗体は、メチル化ＤＮＡに対して優れた結合能および特異性を有する。そのため、メチル化ＤＮＡを回収および濃縮する方法であるＭｅＤＩＰ法に好適に利用できる。

３．本発明のモノクローナル抗体を用いるメチル化ＤＮＡ免疫沈降法（ＭｅＤＩＰ法）
　本発明のモノクローナル抗体を用いるＭｅＤＩＰ法（以下、「本発明のＭｅＤＩＰ法」ともいう）は、抗メチル化ＤＮＡ抗体として本発明のモノクローナル抗体を用いることにより、従来の抗メチル化シトシン抗体などを抗メチル化ＤＮＡ抗体として用いた場合よりも、多量のメチル化ＤＮＡを回収して濃縮できる。
　したがって、本発明のＭｅＤＩＰ法により得られたメチル化ＤＮＡをメチル化ＤＮＡ解析に用いれば、濃縮率の高い多量のメチル化ＤＮＡを該解析の試料とすることができる。
　よって、本発明のＭｅＤＩＰ法は、メチル化ＤＮＡ解析用試料の調製に好適である。

　本発明のＭｅＤＩＰ法は、（１）生体試料から抽出したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ断片にする工程、（２）一本鎖ＤＮＡ断片から本発明のモノクローナル抗体を用いてメチル化ＤＮＡを免疫沈降する工程、および（３）免疫沈降したメチル化ＤＮＡを回収する工程の３工程を含む。また、本発明のＭｅＤＩＰ法は、メチル化ＤＮＡが特異的に得られたか否かをＤＮＡ回収後に確認するために、さらに（４）メチル化ＤＮＡを検出する工程を含むことが好ましい。
　以下に、各工程について、より詳しく説明する。

（１）生体試料からのＤＮＡの抽出、該ＤＮＡの断片化および一本鎖への変性
　解析対象から得た生体試料から、ＤＮＡを抽出する。生体試料としては、解析対象のＤＮＡを含む試料であれば特に限定されないが、好ましくはゲノムＤＮＡを含む試料、例えば培養細胞、臨床検体などを用い得る。臨床検体として具体的には、血液、血清、リンパ球、尿、乳頭分泌液、手術や生検などにより採取した組織などが挙げられる。

　生体試料からのＤＮＡの抽出は、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、細胞および／または組織を可溶化できる界面活性剤（コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムなど）を含む処理液と生体試料とを混合した後、物理的処理（撹拌、ホモジナイズなど）を施して生体試料に含まれるＤＮＡを溶液中に遊離させることによってＤＮＡを抽出できる。
　得られたＤＮＡは、公知の方法、例えば上記の溶液を遠心分離して上清を回収し、この上清をフェノール／クロロホルム抽出することなどによって精製してもよい。また、生体試料からのＤＮＡの抽出および精製は、市販のキットを用いて行うこともできる。

　次いで、得られたＤＮＡを適当な長さ、例えば、200～1000 bp程度に断片化する。
　ＤＮＡの断片化は、超音波処理、アルカリ処理、酵素処理などにより行うことができる。例えば、水酸化ナトリウムを用いてアルカリ処理を行なう場合は、ＤＮＡ溶液に水酸化ナトリウム溶液を終濃度0.1～1.0 Nとなるよう添加し、10～40℃で５～15分間インキュベートすることによりＤＮＡを断片化できる。また、酵素処理を行う場合、制限酵素を用いることができる。制限酵素は、ＤＮＡの塩基配列に基づいて適宜選択でき、例えばＭｓｅＩやＢａｍＨＩなどを用い得る。
　そして、上記のようにして得られたＤＮＡ断片を、加熱して変性させた後に急冷することにより一本鎖にする。例えば、ＤＮＡ断片を含む溶液を94～96℃で５～15分間加熱した後、２～４℃まで急冷することにより、ＤＮＡ断片を一本鎖にすることができる。

　次の免疫沈降の工程では、上記で得られた一本鎖ＤＮＡ断片を含む溶液に本発明のモノクローナル抗体を添加するので、該溶液を免疫沈降法において通常用いられる緩衝液で希釈することが好ましい。なお、希釈した溶液に抗体結合用担体をあらかじめ適量加えてローテーションなどをすることにより、該担体に非特異的に結合するタンパク質などを除く処理（以下、「プレクリアー処理」という）を行うこともできる。このような抗体結合用担体は、ＩｇＧのＦｃ領域と特異的に結合できる担体であればよく、例えばプロテインＡ（またはＧ）セファロースビーズなどが挙げられる。

（２）メチル化ＤＮＡの免疫沈降
　メチル化ＤＮＡの免疫沈降は、一本鎖ＤＮＡ断片を含む溶液に本発明のモノクローナル抗体を適量加えて、20分～24時間接触させて抗体と抗原とを反応させた後、抗体結合用担体を加えて、さらに20分～３時間接触させることにより行う。
　本発明のモノクローナル抗体の添加量（終濃度）は、一本鎖ＤＮＡ断片を含む溶液（１μg/ml）に対して、0.01～100μg/mlの範囲から選択される。また、本発明のモノクローナル抗体を用いてメチル化ＤＮＡの免疫沈降を行う場合、周囲温度は４～50℃、好ましくは４～37℃の範囲で行うことができる。
　また、メチル化ＤＮＡの免疫沈降は、上記の一本鎖ＤＮＡ断片を含む溶液に、抗体結合用担体にあらかじめ本発明のモノクローナル抗体を結合させた複合体を加えることにより行ってもよい。

（３）メチル化ＤＮＡの回収
　遠心分離などにより上記の抗体結合用担体を回収し、これを適切な洗浄用緩衝液で数回洗浄した後、適切な溶出用緩衝液を用いて、抗体結合用担体に結合した本発明のモノクローナル抗体により捕捉されたメチル化ＤＮＡを溶出して回収する。
　得られたメチル化ＤＮＡは、フェノール／クロロホルム法およびエタノール沈殿法などの当業者に公知の方法、またはキットなどにより精製してもよい。

（４）メチル化ＤＮＡの検出
　上記の免疫沈降によってメチル化ＤＮＡを特異的に回収できたか否かは、ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法、バイサルファイトシークエンス法などの公知のメチル化ＤＮＡ検出方法により確認できる。
（i）ＰＣＲ法または定量ＰＣＲ法による検出
　ＰＣＲ法または定量ＰＣＲ法によりメチル化ＤＮＡを検出する場合、一般に入手可能なＰＣＲ用または定量ＰＣＲ用キットを使用してもよい。また、ＰＣＲ法では、増幅産物の存在をアガロース電気泳動法で確認することによってメチル化ＤＮＡを検出できる。
　増幅の反応条件は、増幅する領域の塩基配列、増幅する長さなどに応じて、当業者が適宜決定できる。
　また、増幅用プライマーは、生体試料としての細胞および組織などにおいて、メチル化修飾されている遺伝子の配列に対するプライマー（検出用）およびメチル化修飾されていない遺伝子の配列に対するプライマー（陰性対照用）を用いればよい。

（ii）バイサルファイトシークエンス法による検出
　バイサルファイトシークエンス法によりメチル化ＤＮＡを検出する場合、ＭｅＤＩＰ法により回収したＤＮＡをバイサルファイト処理する。
　バイサルファイト処理とは、亜硫酸水素のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの亜硫酸水素塩（バイサルファイト）の溶液をＤＮＡ溶液に添加して、該ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシン（Ｃ）を、脱アミノ化反応によりウラシル（Ｕ）に変換する処理である。一方、バイサルファイトはメチル化シトシンには作用せず、上記のような塩基の変換は起こらない。したがって、ＤＮＡのメチル化状態の違いは、バイサルファイト処理によって塩基配列の違い（ＣおよびＵ）に変換される。
　このバイサルファイト処理によってＤＮＡ中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して、該ＤＮＡのシークエンス解析をすることにより、本来の塩基配列との違いを検出して、メチル化ＤＮＡを検出できる。

　以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）ハイブリドーマの作製
１．免疫用抗原およびＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング用抗原の調製
　下記の式（ＩＩ）で示される、５－メチル－ｄＣｐｄＧｐにプロパンチオールをリンカーとして結合させた５’－（５－メチル－２’－デオキシシチジン－３’－ホスホ）－２’－デオキシグアノシン３’－リン酸－３－メルカプトプロピルエステル（以下、「５－メチル－ｄＣｐｄＧｐＣ３Ｈ６ＳＨ」ともいう）と、キャリアーであるＫＬＨとを、ＭＢＳ法により架橋して結合させて、免疫用抗原を作製した。

　また、５－メチル－ｄＣｐｄＧｐＣ３Ｈ６ＳＨとＢＳＡとを、ＭＢＳ法により架橋して結合させて、ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング用抗原を作製した。
　上記の免疫用抗原100μgとフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）100μlとを混合し乳化して、ＦＣＡ抗原液を調製した。また、免疫用抗原100μgとフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）100μlを混合し乳化して、ＦＩＡ抗原液を調製した。

２．マウスへの免疫
　ＦＣＡ抗原液100μlを９週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー株式会社）の腹腔内に投与した（初回免疫）。その後、２週間毎に６回、ＦＩＡ抗原溶液100μlを腹腔内投与した（追加免疫）。

３．脾臓細胞とミエローマ細胞との細胞融合
　最後の追加免疫から14日後に、マウスから脾臓を無菌的に摘出した。そして、ＲＰＭＩ－１６４０培地中で脾臓から脂肪を除去した。脂肪を除去した脾臓に、注射器で培地を注入した後、脾臓の両端をはさみで切り落とし、脾臓から細胞を培地中に取り出した。得られた細胞を培地で分散させた後、ステンレスメッシュに通して脾臓細胞の懸濁液を取得した。
　得られた脾臓細胞（１×10⁸ cells）とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１（２×10⁷cells）とを混合し、電気融合装置ＳＳＨ－２（島津製作所製）を用いて細胞融合させた。なお、この細胞融合は、脾臓細胞とミエローマ細胞との混合液に交流電圧（40V）を10秒間通電した後、直流パルス（2.3 kV/cm、パルス幅40μ秒）をかけて行った。

４．ハイブリドーマの培養
　ハイブリドーマを1.2×10⁶ cells／mlとなるようにＨＡＴ含有培地（１×10^-4 Mヒポキサンチン、４×10^-7 Mアミノプテリン、1.5×10^-5 Mチミジンおよび20％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地）に懸濁し、96ウェルプレート（Nunc社製；以下、培養用プレートとする）の各ウェルに1.2×10⁵ cells／ウェルとなるように播種した。培養用プレートを37℃、５％ＣＯ₂の恒温槽内に静置し、ハイブリドーマの培養を開始した。10日間培養してハイブリドーマのコロニーを出現させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行った。

５．ＥＬＩＳＡ法によるハイブリドーマのスクリーニング
　リン酸緩衝液（140 mM ＮａＣｌ、2.7 mM ＫＣｌ、10 mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄および1.8 mM ＫＨ₂ＰＯ₄（pH 7.4）；以下、ＰＢＳという）に、上記１．で作製したスクリーニング用抗原を終濃度５μg／mlとなるように添加して、固定用抗原溶液を調製した。この固定用抗原溶液50μlを96ウェルのポリスチレン製マイクロタイタープレートの各ウェルに添加した（以下、抗原固定プレートとする）。抗原固定プレートを４℃で一晩静置した後、各ウェルをＰＢＳ（200μl／ウェル）で洗浄した。洗浄後、抗原固定プレートの各ウェルにブロックエース（大日本製薬株式会社）を200μl／ウェル添加して、該プレートを室温で１時間静置した。その後、各ウェルを0.05％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、「ＰＢＳ‐Ｔ」ともいう；200μl／ウェル）で洗浄した。

　次いで、上記のハイブリドーマの培養上清を、培養用プレートの各ウェルから採取し、抗原固定プレートの各ウェルに50μlずつ添加し、室温で１時間攪拌した。攪拌後、各ウェルをＰＢＳ‐Ｔ（200μl／ウェル）で２回洗浄した。洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇポリクローナル抗体（Cappel社製）を抗原固定プレートの各ウェルに100μlずつ添加し、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＰＢＳ‐Ｔ（200μl／ウェル）で洗浄を２回行った。洗浄後、ＨＲＰの基質であるオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤＡ）を含む基質液（10 mg／25 mlのＯＰＤＡ＋２μlの30％Ｈ₂Ｏ₂／25 mlのクエン酸溶液)を100μlずつ各ウェルに加え、抗原固定プレートを遮光して室温で２０分間静置した。そして、２ＮＨ₂ＳＯ₄を含む反応停止液を各ウェルに100μlずつ加えた後、各ウェル中の反応液について、マイクロプレートリーダ（Model 3550：Bio-Rad社製）を用いて490 nmの吸光度を測定した。

６．ＭｅＤＩＰ法によるハイブリドーマのスクリーニング
　ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７から抽出したゲノムＤＮＡ（４μg）を、制限酵素ＭｓｅＩ（ＮＥＢ社）と37℃で一晩反応させて、300～1000 bpになるように断片化した。次いで、反応後のＤＮＡ断片を95℃で10分間加熱して変性させ、４℃で急冷して一本鎖ＤＮＡ断片にした。得られた一本鎖ＤＮＡ断片を、Chromatin Immunoprecipitationアッセイキット（Upstate biotechnology社）に添付のマニュアルに従って、該アッセイキットに付属の希釈用緩衝液で希釈した。その後、ProteinG Sepharoseビーズ（GEヘルスケア社）を添加し、４℃で30分間ローテーションしてプレクリアー処理を行った。そして、遠心分離後に回収した上清をチューブに分注し、ＭｅＤＩＰ用検体および対照用検体とした。

　上記のＥＬＩＳＡ法を用いたスクリーニングにおいて高い吸光度を示したハイブリドーマの培養上清をＭｅＤＩＰ用検体に添加し、正常マウスＩｇＧ抗体（SantaCruz社）を対照用検体に添加した。そして、これらを４℃で一晩ローテーションして反応させた後、ProteinG Sepharoseビーズ（GEヘルスケア社）をそれぞれに添加して、さらに４℃で１時間ローテーションして免疫沈降を行った。これにより、上記の培養上清に含まれる抗体とＤＮＡとの複合体をProteinG Sepharoseビーズに結合させて回収した。次いで、回収したビーズを、Chromatin Immunoprecipitationアッセイキット（Upstate社）の洗浄用緩衝液で洗浄した後、上記の複合体中のＤＮＡを前記キットの溶出用緩衝液で溶出した。そして、溶出したＤＮＡを、プロテイナーゼＫと反応させた後、Qiaquick PCR purificationキット（QIAGEN社）を用いて精製した。
　なお、上記の洗浄、溶出および精製は、各キットの使用説明書の記載に基づいて行った。

　次に、上記のＭｅＤＩＰ法によって、メチル化ＤＮＡを特異的に回収できたか否かを確認するため、ＰＣＲ法およびアガロース電気泳動法を行った。
　（i）ＰＣＲ反応液の調製
　下記の試薬を混合して、25μlの反応液を調製した。
　　2x FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)（ROCHE社） 12.5μl
　　フォワード（Ｆ）プライマー（10μM）　　　　　　　　　　　　１μl
　　リバース（Ｒ）プライマー（10μM）　　　　　　　　　　　　　１μl
　　回収したＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μl
　　ｄＨ₂Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 9.5μl

　用いたプライマーの配列は、下記のとおりである。
　メチル化ＤＮＡ検出用プライマーセットとして、ＭＣＦ７細胞においてメチル化修飾を受けることが知られているＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのプライマーセットを用いた。以下にＧＳＴＰ１プライマーの配列を示す。
　　Ｆ：5'- GAGGCCTTCGCTGGAGTT -3'　（配列番号１）
　　Ｒ：5'- GTACTCACTGGTGGCGAAGA -3'　（配列番号２）

　また、非メチル化ＤＮＡ検出用プライマーセットとして、ヒトの第14染色体に存在し、ＣｐＧ配列を有さないためメチル化修飾を受けない領域（以下、CGF-1領域という）を増幅するためのプライマーセットを用いた。以下に、CGF-1領域の配列を示す。
＜CGF-1領域＞
GGAGGAGTCA AGAGAAGTTG GAAGCCAACT GAGAGAGAGG GAAGGCTTGA AGTGGTCAGG ACAGTGAACA CCTAAGAGAC ATCCACTGAA TTTGCCCACT AGGAAGCCAT TAGTGACTTC AATAGGAACA TCTTCAGTGC ATCATGAAGG CCAAAGATTG CCATGAAAGA GAGGAATGGA AATGGAGTGT GGG　（配列番号１０）

　また、以下にCGF-1プライマーの配列を示す。
　　Ｆ：5'- GGAGGAGTCAAGAGAAGTTGGAAGC -3' （配列番号３）
　　Ｒ：5'- CCCACACTCCATTTCCATTCCTC -3' （配列番号４）

　（ii）ＰＣＲの反応条件
　上記の反応液を用い、下記の条件でＰＣＲを行った。
　　95℃で10分を１サイクル、
　　95℃で30秒、66℃で15秒および72℃で30秒を45サイクル、
　　95℃で１分、66℃で30秒および95℃で30秒を１サイクル。
　（iii）アガロース電気泳動
　上記の各ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルを用いて電気泳動して、増幅産物の存在を確認した。そして、ＧＳＴＰ１遺伝子の増幅産物がより多く、かつCGF-1領域の増幅産物がより少ない結果となった培養上清のハイブリドーマを選択した。

７．ハイブリドーマのクローニング
　選択したハイブリドーマを、Hybridoma Cloning Factor（IGEN社）を用いた限界希釈法によりクローニングした。クローニングから10日目に、上記のＥＬＩＳＡ法を用いたハイブリドーマのスクリーニングと同様の方法で、抗体を産生するハイブリドーマ（抗体産生ハイブリドーマ）をクローニングした。

８．競合阻害試験による抗体産生ハイブリドーマの選択
　以下の化合物１および２の各溶液（１ｍＭ）を調製し、これらを95℃で10分間熱処理した後、氷中で２分間冷却した。
　　化合物１：５－メチル－ｄＣｐｄＧｐＣ３Ｈ６ＳＨ
　　化合物２：ＮＮＮＣＧＮＮＮ　（「Ｎ」は、任意のヌクレオチドを示す）

　ＰＢＳに、上記の１．で作製したスクリーニング用抗原を終濃度５μg／mlとなるように添加して、固定用抗原溶液を調製した。この固定用抗原溶液50μlを96ウェルのポリスチレン製マイクロタイタープレートの各ウェルに添加した（以下、抗原固定プレートとする）。抗原固定プレートを４℃で一晩静置した後、各ウェルをＰＢＳ（200μl／ウェル）で洗浄した。洗浄後、抗原固定プレートの各ウェルにブロックエース（大日本製薬株式会社）を200μl／ウェル添加して、該プレートを室温で１時間静置した。その後、各ウェルをＰＢＳ‐Ｔ（200μl／ウェル）で洗浄した。

　次いで、上記のハイブリドーマの培養上清および上記の化合物１の溶液を、抗原固定プレートの各ウェルにそれぞれ50μlずつ添加し、室温で１時間攪拌した。攪拌後、各ウェルをＰＢＳ‐Ｔ（200μl／ウェル）で２回洗浄した。洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇポリクローナル抗体（Cappel社製）を各ウェルに100μlずつ添加し、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＰＢＳ‐Ｔ（200μl／ウェル）で洗浄を２回行った。洗浄後、上記のＯＰＤＡを含む基質液を100μlずつ各ウェルに加え、抗原固定プレートを遮光して室温で20分間静置した。そして、２ＮＨ₂ＳＯ₄を含む反応停止液を各ウェルに100μlずつ加えた後、各ウェル中の反応液について、マイクロプレートリーダ（Model 3550：Bio-Rad社製）を用いて490 nmの吸光度を測定した。

　これにより、抗体産生ハイブリドーマから産生される抗体の化合物１への交差反応を確認した。また、化合物１の溶液に代えて、化合物２の溶液を用いて同様に抗体産生ハイブリドーマから産生される抗体の化合物２への交差反応を確認した。これらの結果に基づいて、化合物１に交差反応を示すが、化合物２に交差反応を示さない抗体を産生する抗体産生ハイブリドーマを選択した。

　上記のクローニングおよび競合阻害試験を２回行って選択されたハイブリドーマについて、さらに上記のＭｅＤＩＰ法によるハイブリドーマのスクリーニングを行って、７つのハイブリドーマのクローン（ＳＣＲ１～７）を得た。
　なお、表１に示すとおり、ＳＣＲ２は2009年８月25日に受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８０５号として、ＳＣＲ１、３および６は2009年９月10日にそれぞれ受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８１０号、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８１１号および受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８１２号として、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８、〒292-0818、日本）に寄託された。

（実施例２）ＭｅＤＩＰ法によるモノクローナル抗体の力価の検討
１．ＭｅＤＩＰ法によるメチル化ＤＮＡの回収
　実施例１の６．と同様の操作を行って、ＭＣＦ７から抽出したゲノムＤＮＡ（４μg）から、一本鎖ＤＮＡ断片の希釈液を調製し、この希釈液をプレクリアー処理して、ＭｅＤＩＰ用検体および対照用検体を得た。

　上記のＳＣＲ１～７の培養上清、市販の抗メチル化シトシン抗体および抗メチル化シチジン抗体をそれぞれＭｅＤＩＰ用検体に添加し、正常マウスＩｇＧ抗体（SantaCruz社）、正常ラビットＩｇＧ抗体（SantaCruz社）および上記のＥＬＩＳＡ法を用いたスクリーニングにおいて抗体産生能を認められなかったハイブリドーマの培養上清（陰性対照の上清）をそれぞれ対照用検体に添加した。そして、これらを４℃で一晩ローテーションして抗体と抗原とを反応させた後、ProteinG Sepharoseビーズ（GEヘルスケア社）をそれぞれに添加して、さらに４℃で１時間ローテーションして免疫沈降を行った。そして、実施例１の６．と同様の操作を行って、回収したビーズからＤＮＡを溶出し、これを精製した。
　なお、以下の表２に、用いた市販抗体のメーカー、クローン名などを示す。

２．定量ＰＣＲ法
　次に、上記のＭｅＤＩＰ法によって得られたメチル化ＤＮＡの回収量および濃縮率を検討するため、定量ＰＣＲ法を行った。
　（i）ＰＣＲ反応液の調製
　下記の試薬を混合して、25μlの反応液を調製した。なお、上記のＭＣＦ７から抽出したゲノムＤＮＡの希釈系列（0.1、1.0、10および100 ng/μl）についても、同様に反応液を作製して、これらを検量線作成用サンプルとした。
　　2x FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)（ROCHE社） 12.5μl
　　Ｆプライマー（10μM）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μl
　　Ｒプライマー（10μM）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μl
　　回収したＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μl
　　ｄＨ₂Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 9.5μl

　プライマーには、上記のＧＳＴＰ１プライマー（配列番号１および２）ならびにCGF-1プライマー（配列番号３および４）を用いた。
　上記の反応液について、Mx3005P（Stratagene社製）を用いて、下記の反応条件で定量ＰＣＲを行った。

　（ii）定量ＰＣＲの反応条件
　　95℃で10分を１サイクル、
　　95℃で30秒、66℃で15秒および72℃で30秒を45サイクル、
　　95℃で１分、66℃で30秒および95℃で30秒を１サイクル。

３．結果
　図１および２に、各抗体を用いたＭｅＤＩＰ法によって得られたメチル化ＤＮＡの回収量および濃縮率を示した。図１は、ＳＣＲ１～７のハイブリドーマの培養上清および各種市販抗体を用いてＭｅＤＩＰ法で回収されたメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡの量を示す棒グラフである。図２は、ＳＣＲ１～７のハイブリドーマの培養上清および各種市販抗体を用いてＭｅＤＩＰ法で回収したメチル化ＤＮＡの濃縮率を示す棒グラフである。
　図１および２から、ＳＣＲ１～７の培養上清によるメチル化ＤＮＡの回収量および濃縮率は、市販抗体と比較して、いずれも顕著に高いことが明らかとなった。

　例えば、図１から、ＳＣＲ１～７のハイブリドーマの培養上清を用いると、各種市販抗体よりも、ＭｅＤＩＰ法によるメチル化ＤＮＡの回収量が顕著に高いことが分かる。より具体的には、市販抗体の中で最も多い回収量を示したNovus社の抗体と比較して、ＳＣＲ１は45.9倍、ＳＣＲ２は136.4倍、ＳＣＲ３は109.3倍、ＳＣＲ４は54倍、ＳＣＲ５は56.6倍、ＳＣＲ６は78.1倍、ＳＣＲ７は132.8倍の回収量を示した。この結果から、本発明のハイブリドーマから産生される抗体は、各種市販抗体よりもメチル化ＤＮＡへの結合能が高いことが示唆される。
　さらに、ＳＣＲ１～７のハイブリドーマの培養上清を用いたＭｅＤＩＰ法は、メチル化ＤＮＡの回収量の増加に比べ、非メチル化ＤＮＡの回収量の増加がほとんどないことが分かる。このことから、本発明のハイブリドーマから産生される抗体は、各種市販抗体よりも、メチル化ＤＮＡへの特異性が高いことが示唆される。

　また、図２から、各種市販抗体に比べ、ＳＣＲ１～７から産生される抗体は、ＭｅＤＩＰ法によるメチル化ＤＮＡの濃縮率が高いことが分かる。より具体的には、濃縮率について、Inputと比較して、ＳＣＲ１は67倍、ＳＣＲ２は124倍、ＳＣＲ３は97倍、ＳＣＲ４は57倍、ＳＣＲ５は84倍、ＳＣＲ６は108倍、ＳＣＲ７は99倍の濃縮率を示した。
　さらに、市販抗体の中で最も高い濃縮率を示したDiagenode社の抗体と比較して、ＳＣＲ１は3.3倍、ＳＣＲ２は6.1倍、ＳＣＲ３は4.8倍、ＳＣＲ４は2.8倍、ＳＣＲ５は4.1倍、ＳＣＲ６は5.3倍、ＳＣＲ７は4.9倍の濃縮率を示した。
　この結果から、本発明のハイブリドーマから産生される抗体は、各種市販抗体よりもメチル化ＤＮＡへの特異性が高いことが示唆される。

（実施例３）腹水からのモノクローナル抗体の精製
１．腹水の作製
　５匹のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（６週齢、雌性：日本チャールズリバー株式会社）の腹腔内に、ハイブリドーマＳＣＲ２（１×10⁷ cells／匹）を接種した。接種から１週間後、該マウスにＳＣＲ２（１×10⁷ cells／匹）を追加接種した。追加接種から２週間後、該マウスから注射器を用いて腹水を採取した。

２．硫安塩析
　得られた腹水17.5 mlに、50％飽和となる量（5.1 g）の硫酸アンモニウムを少量ずつ加え、冷却しながら撹拌して沈殿を得た。次いで、この沈殿を回収し、ＰＢＳで溶解して溶液にした。そして、該溶液を透析チューブに入れ、４リットルのＰＢＳで12日間透析した。透析後、チューブ内の溶液を0.45μmフィルターで濾過することにより、精製されたモノクローナル抗体（279 mg）を得た。
　また、得られたモノクローナル抗体のサブクラスは、Mouse monoclonal antibody isotypingテストキット（Serotec社）を用いて検討した結果、ＩｇＧ2a（κ）であった。
　以下の実施例４では、このＳＣＲ２から得たモノクローナル抗体を用いた。

（実施例４）モノクローナル抗体の温度特性の検討
１．ＭｅＤＩＰ法
　実施例１の６．と同様の操作を行って、ＭＣＦ７から抽出したゲノムＤＮＡ（４μg）から、一本鎖ＤＮＡ断片の希釈液を調製し、この希釈液をプレクリアー処理して、ＭｅＤＩＰ用検体および対照用検体を得た。

　上記のＳＣＲ２から得たモノクローナル抗体、Diagenode社の抗メチル化シチジン抗体をそれぞれＭｅＤＩＰ用検体に添加し、正常マウスＩｇＧ抗体（SantaCruz社）を対照用検体に添加した。そして、これらを４℃で一晩、４℃で１時間、室温で１時間または３７℃で１時間の条件でローテーションして抗体と抗原とを反応させた後、ProteinG Sepharoseビーズ（GEヘルスケア社）をそれぞれに添加して、さらに各温度で１時間ローテーションして免疫沈降を行った。そして、実施例１の６．と同様の操作を行って、回収したビーズからＤＮＡを溶出し、これを精製した。

２．定量ＰＣＲ法
　次に、上記のＭｅＤＩＰ法によって得られたメチル化ＤＮＡの回収量および濃縮率を検討するため、定量ＰＣＲ法を行った。
　（i）ＰＣＲ反応液の調製
　下記の試薬を混合して、25μlの反応液を調製した。なお、上記のＭＣＦ７から抽出したゲノムＤＮＡの希釈系列（0.1、1.0、10および100 ng/μl）についても、同様に反応液を作製し、これらを検量線作成用サンプルとした。
　　2x FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)（ROCHE社） 12.5μl
　　Ｆプライマー（10μM）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μl
　　Ｒプライマー（10μM）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μl
　　回収したＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μl
　　ｄＨ₂Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 9.5μl

　メチル化ＤＮＡ検出用プライマーセットとして、ＦＢＲＳ遺伝子およびＲＥＸＯ１Ｌ１遺伝子を増幅するためのプライマーセットを用いた。なお、本発明者らは、これらのプライマーセットにより増幅される領域が、ＭＣＦ７細胞においてメチル化修飾を受けることを確認している（後述する参考例を参照されたい）。
　また、非メチル化ＤＮＡ検出用プライマーとして、上記のCGF-1プライマーセットを用いた。
　以下にＦＢＲＳプライマーセットおよびＲＥＸＯ１Ｌ１プライマーセットの配列を示す。
・ＦＢＲＳプライマーセット
　　Ｆ：5'- GAGAAGTAGTTGGAAGGAGAGG -3'　（配列番号５）
　　Ｒ：5'- CCCTACACTAACTACAATAATTTAATATCC -3'　（配列番号６）
・ＲＥＸＯ１Ｌ１プライマーセット
　　Ｆ：5'- GTAGGATGGTTTGGATTTGGGGTAA -3' （配列番号７）
　　Ｒ：5'- CAACTACTCCTAACTCTATAAACTACCAA -3' （配列番号８）

　上記の反応液について、Mx3005P（Stratagene社製）を用いて、下記の反応条件で定量ＰＣＲを行った。

　（ii）定量ＰＣＲの反応条件
　　95℃で10分を１サイクル、
　　95℃で30秒、66℃で15秒および72℃で30秒を45サイクル、
　　95℃で１分、66℃で30秒および95℃で30秒を１サイクル。
　ただし、ＦＢＲＳプライマーセットを用いた反応液については、下記の条件で定量ＰＣＲを行った。
　　95℃で10分を１サイクル、
　　95℃で30秒、63℃で15秒および72℃で30秒を45サイクル、
　　95℃で１分、63℃で30秒および95℃で30秒を１サイクル。

３．結果
　図３および４に、各条件におけるＭｅＤＩＰ法によって得られたメチル化ＤＮＡの回収量および濃縮率を示した。図３は、各反応条件における、ＳＣＲ２から得たモノクローナル抗体および市販抗体を用いたＭｅＤＩＰ法で回収したメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡの量を示す棒グラフである。図４は、各反応条件において、ＳＣＲ２から得たモノクローナル抗体および市販抗体を用いたＭｅＤＩＰ法で回収したメチル化ＤＮＡの濃縮率を示す棒グラフである。

　図３から、ＳＣＲ２から得たモノクローナル抗体は、いずれの反応条件においても、ＭｅＤＩＰ法によるメチル化ＤＮＡの回収量が高いことが分かる。また、ＳＣＲ２から得たモノクローナル抗体は、いずれの反応条件においても、ＭｅＤＩＰ法による非メチル化ＤＮＡの回収量の増加がほとんどないことが分かる。このことから、ＳＣＲ２から得たモノクローナル抗体は、各反応条件において、メチル化ＤＮＡへの高い結合能および特異性を有することが示唆される。
　さらに、図４から、ＳＣＲ２から得たモノクローナル抗体は、いずれの反応条件においても、ＭｅＤＩＰ法によるメチル化ＤＮＡの濃縮率が高いことが分かる。このことから、ＳＣＲ２から得たモノクローナル抗体は、各反応条件において、メチル化ＤＮＡへの高い特異性を有することが示唆される。
　上記の結果から、従来、ＭｅＤＩＰ法においては４℃で一晩の反応を行っていたが、本発明のモノクローナル抗体を用いれば、４℃で１時間、室温で１時間および37℃で１時間のいずれの条件下でもＭｅＤＩＰ法を行うことが可能であることが示された。

（参考例）バイサルファイトシークエンス法によるメチル化ＤＮＡの検出
　実施例４で用いたＦＢＲＳ遺伝子およびＲＥＸＯ１Ｌ１遺伝子のプライマーセットにより増幅される領域が、ＭＣＦ７細胞においてメチル化修飾を受けることをバイサルファイトシークエンス法により検討した。
１．バイサルファイト処理したＤＮＡ溶液の調製
　ＭＣＦ７細胞から抽出したゲノムＤＮＡ（２μg）を19μlの水に希釈し、これに６N水酸化ナトリウム水溶液を１μl添加して終濃度0.3 Nとし、37℃で15分間インキュベーションして変性させた。
　次いで、上記のＤＮＡ溶液に3.6 M重亜硫酸ナトリウム／0.6 Mヒドロキノン溶液を120μl添加した後、95℃で30秒および50℃で15分を１サイクルとして、これを15サイクル繰り返すことにより、バイサルファイト処理をした。そして、処理した溶液をWizard（登録商標）DNA Clean-up System（Promega社）を用いて脱塩し、ＴＥ緩衝液50μlで溶出して、非メチル化シトシンをウラシルに変換したＤＮＡ溶液を得た。
　上記のＤＮＡ溶液に３N水酸化ナトリウム水溶液を５μl添加して、室温で５分間インキュベーションした後、Qiaquick PCR purificationキット（QIAGEN社）で精製して、ＤＮＡ溶液を得た。

２．シークエンス解析
　得られたＤＮＡ溶液を鋳型として、上記のＦＢＲＳ遺伝子およびＲＥＸＯ１Ｌ１遺伝子のプライマーセットを用いてＰＣＲ法を行った。
　（i）ＰＣＲ反応液の調製
　下記の試薬を混合して、15μlの反応液を調製した。
　　10x Ex Taq（登録商標）バッファー（タカラバイオ株式会社） 12.5μl
　　dNTP mix（2.5 mＭ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.2μl
　　Ｆプライマー（10μM）　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.6μl
　　Ｒプライマー（10μM）　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.6μl
　　ＤＮＡ溶液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μl
　　Ex Taq（登録商標）ポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）　 0.12μl
　　ｄＨ₂Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　9.98μl

　上記の反応液を用い、下記の条件でPCRを行った。
　（ii）定量ＰＣＲの反応条件
　　95℃で４分30秒を１サイクル、
　　95℃で30秒、66℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　４℃で放置。
　ただし、ＦＢＲＳプライマーセットを用いた反応液については、下記の条件で定量ＰＣＲを行った。
　　95℃で４分30秒を１サイクル、
　　95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　４℃で放置。

　得られた各ＰＣＲ産物を、TAクローニングキット（Invitrogen社）のpCR（登録商標）2.1ベクターに組み込み、これらのプラスミドを回収し、M13Rvプライマーを用いてシークエンス解析を行った。
　なお、以下にM13Rvプライマーの配列を示す。
　　5'- CAGGAAACAGCTATGAC -3' （配列番号９）

　シークエンス結果に基づいて、ＦＢＲＳ遺伝子およびＲＥＸＯ１Ｌ１遺伝子の増幅領域に存在するＣｐＧ配列のメチル化状態を表３に示す。この表において、ＣｐＧ配列の行に示される数字は、各遺伝子の増幅領域の5'末端から出現順に数えたＣｐＧ配列の番号である。●はメチル化ＣｐＧ配列、○は非メチル化ＣｐＧ配列を表わす。

　表３に示されるように、ＭＣＦ７細胞においては、ＦＢＲＳおよびＲＥＸＯ１Ｌ１遺伝子の増幅された領域に存在するＣｐＧ配列のほとんどがメチル化される傾向にあった。
　したがって、上記のプライマーセットは、ＭｅＤＩＰ法により回収されたＭＣＦ７細胞のメチル化ゲノムＤＮＡの定量ＰＣＲに好適に用いることができる。

（実施例５）本発明のモノクローナル抗体が認識するエピトープの検討
　メチル化ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドである３ＭｅＣＧと、メチル化ＣｐＴを含むオリゴヌクレオチドである３ＭｅＣＴとを抗原として用いて、本発明のモノクローナル抗体が認識するエピトープを検討した。
１．ＭｅＤＩＰ法
　実施例１の６．と同様の操作を行って、ＭＣＦ７から抽出したゲノムＤＮＡ（４μg）から、一本鎖ＤＮＡ断片の希釈液を調製した。次いで、この希釈液をプレクリアー処理して、ＤＮＡ試料を得た。そして、得られたＤＮＡ試料に、予め95℃で10分間加熱して変性させ、４℃で急冷した３ＭｅＣＧを添加し、３ＭｅＣＧ検体とした。なお、３ＭｅＣＧの配列を以下に示す。
＜３ＭｅＣＧ＞
5'-CGAGGTCGACGGTATTGATm5cGAGTATCGATAGTm5cGATATCGATATCGATATm5cGATATACAACGTCGTGACTGG-3' （配列番号１１）
（配列中の「m5c」は、５－メチルシトシンを示す。）

　上記の３ＭｅＣＧ検体の調製において、３ＭｅＣＧに代えて、３ＭｅＣＴを用いた以外、同様に操作して３ＭｅＣＴ検体を調製した。なお、３ＭｅＣＴの配列を以下に示す。
＜３ＭｅＣＴ＞
5'-CGAGGTCGACGGTATTGATm5cTAGTATCGATAGTm5cTATATCGATATCGATATm5cTATATACAACGTCGTGACTGG-3' （配列番号１２）

　上記のＳＣＲ２およびＳＣＲ３から得たモノクローナル抗体ならびにDiagenode社の抗メチル化シチジン抗体を、それぞれ３ＭｅＣＧ検体および３ＭｅＣＴに添加した。そして、これらの検体を４℃で一晩、ローテーションして抗体と抗原とを反応させた。その後、ProteinG Sepharoseビーズ（GEヘルスケア社）をそれぞれに添加し、実施例１の６．と同様の操作を行って、回収したビーズからＤＮＡを溶出し、これを精製した。

２．定量ＰＣＲ法
　次に、上記のＭｅＤＩＰ法によって得られたメチル化ＤＮＡの回収量を検討するため、定量ＰＣＲ法を行った。
　（i）ＰＣＲ反応液の調製
　実施例２と同様の反応液を、25μl調製した。

　メチル化ＤＮＡ検出用プライマーセットとして、以下の配列番号１２および配列番号１３に示されるプライマーを用いた。このプライマーセットは、上記の３ＭｅＣＧおよび３ＭｅＣＴを特異的に増幅できる。
　　Ｆ：5'- CGAGGTCGACGGTAT -3' （配列番号１３）
　　Ｒ：5'- CCAGTCACGACGTTGTA -3' （配列番号１４）

　上記の反応液について、Mx3005P（Stratagene社製）を用いて、下記の反応条件で定量
ＰＣＲを行った。

　（ii）定量ＰＣＲの反応条件
　　95℃で10分を１サイクル、
　　95℃で30秒、55℃で15秒および72℃で30秒を45サイクル、
　　95℃で１分、55℃で30秒および95℃で30秒を１サイクル。

　検量線を作成するために、３ＭｅＣＧおよび３ＭｅＣＴのそれぞれの希釈系列を調製した。そして、これらについて定量ＰＣＲを行って検量線を作成した。この検量線に基づいて、上記のＭｅＤＩＰ法で回収された各ＤＮＡについて定量ＰＣＲ法により得られたＣｔ値からコピー数を算出し、これをメチル化ＤＮＡの回収量（ｃｏｐｙ）とした。
　また、上記のＭｅＤＩＰ法で用いた免疫沈降前の３ＭｅＣＧ検体および３ＭｅＣＴ検体について定量ＰＣＲを行い、得られたＣｔ値からコピー数を算出し、これをInput DNAの回収量（ｃｏｐｙ）とした。算出されたメチル化ＤＮＡの回収量（ｃｏｐｙ）およびInput DNAの回収量（ｃｏｐｙ）から、以下の式（１）により回収率（ｃｏｐｙ／ｃｏｐｙ）を算出した。
［回収率（ｃｏｐｙ／ｃｏｐｙ）］＝［メチル化ＤＮＡの回収量（ｃｏｐｙ）］／［Input DNAの回収量（ｃｏｐｙ）］　・・・　（１）

３．結果
　表１および図５に、ＳＣＲ２およびＳＣＲ３から得たモノクローナル抗体、ならびにDiagenode社の抗メチル化シチジン抗体を用いたＭｅＤＩＰ法による、３ＭｅＣＧおよび３ＭｅＣＴの回収率を示す。

　表１および図５から明らかなように、Diagenode社の抗メチル化シチジン抗体を用いた
ＭｅＤＩＰ法では、３ＭｅＣＧと３ＭｅＣＴの回収率の間には、顕著な差は見られなかった。
　一方、ＳＣＲ２およびＳＣＲ３のそれぞれから得たモノクローナル抗体を用いたＭｅＤＩＰ法では、３ＭｅＣＴの回収率に比べ、３ＭｅＣＧの回収率の方が顕著に高いことがわかる。より具体的には、ＳＣＲ２から得たモノクローナル抗体は、３ＭｅＣＧを、３ＭｅＣＴの325倍回収していることがわかる。また、ＳＣＲ３から得たモノクローナル抗体は、３ＭｅＣＧを、３ＭｅＣＴの160倍回収していることがわかる。
　このことから、ＳＣＲ２およびＳＣＲ３から得たモノクローナル抗体は、メチル化ＣｐＧ配列をエピトープとして認識していることが示された。

　本出願は、２００９年９月２８日に出願された日本国特許出願特願２００９－２２２８９３号および２００９年１２月２８日に出願された日本国特許出願特願２００９－２９８２１３号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。

Claims

　５’－（５－メチル－２’－デオキシシチジン－３’－ホスホ）－２’－デオキシグアノシン３’－リン酸を含む抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られるハイブリドーマ。
　抗原が、５’－（５－メチル－２’－デオキシシチジン－３’－ホスホ）－２’－デオキシグアノシン３’－リン酸を含む核酸を含む抗原である、請求項１に記載のハイブリドーマ。
　核酸がＤＮＡである、請求項２に記載のハイブリドーマ。
　ハイブリドーマが、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８１０号（ＳＣＲ１）、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８０５号（ＳＣＲ２）、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８１１号（ＳＣＲ３）または受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８１２号（ＳＣＲ６）として独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託されている、請求項１に記載のハイブリドーマ。
　請求項１～４のいずれか１項に記載のハイブリドーマから得られる、モノクローナル抗体。
　エピトープが、メチル化ＣｐＧ配列である、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
　生体試料から抽出したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ断片にする工程と、
　一本鎖ＤＮＡ断片から請求項５または６に記載のモノクローナル抗体を用いてメチル化ＤＮＡを免疫沈降する工程と、
　免疫沈降したメチル化ＤＮＡを回収する工程と
を含む、メチル化ＤＮＡを免疫沈降する方法。