CN102574927B - 产生抗甲基化dna抗体的杂交瘤及其利用 - Google Patents

产生抗甲基化dna抗体的杂交瘤及其利用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及将从用包含5′-(5-甲基-2′-脱氧胞苷-3′-磷酸)-2′-脱氧鸟苷3′-磷酸的抗原免疫的动物得到的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到的，产生抗甲基化DNA抗体的杂交瘤。另外，本发明涉及由该杂交瘤产生的单克隆抗体及使用该抗体将甲基化DNA免疫沉降的方法。

Description

产生抗甲基化DNA抗体的杂交瘤及其利用
【技术领域】
本发明涉及产生抗甲基化DNA抗体的杂交瘤、由该杂交瘤产生的单克隆抗体、及使用该抗体将甲基化DNA免疫沉降的方法。
【背景技术】
在高等真核生物的染色体DNA中，构成DNA的碱基之中胞嘧啶(C)的5位有被甲基化修饰的情况。此高等真核生物中的DNA的甲基化作为遗传信息的表达抑制结构发挥功能。例如，包括多个某基因的启动子区域中常见的CpG序列的区域(也称为“CpG岛”或“CG岛”)被甲基化时，其基因的转录被抑制。对此，CpG岛不被甲基化时，启动子区域可结合转录因子，因此该基因成可转录的状态。
如此，DNA的甲基化是基因表达的控制结构之一。因此，DNA的甲基化在初期胚发生、组织特异性的基因的表达、作为哺乳动物中特征性的现象的基因印迹或X染色体的失活、染色体的稳定化、DNA复制的时机等的各种各样的生理的、病理性的现象中发挥重要的作用。
再者近年越来越明了在癌或其他疾病中涉及DNA的甲基化。因此，进行对于基于各种各样的基因的甲基化的解析的癌的确定诊断或预后预测等。
作为用于DNA的甲基化解析而回收甲基化DNA的方法之一，知甲基化DNA免疫沉降法(methylation DNA Immunoprecipitaion：MeDIP法)。在MeDIP法中，使用特异性地识别甲基化DNA的抗体或甲基化DNA结合蛋白质将甲基化DNA免疫沉降，可浓缩样品中包括的甲基化DNA。另外知，通过使用将此MeDIP法和微阵列解析技术组合的MeDIP-芯片法，可一并解析DNA的甲基化状态。
可在这样的MeDIP法中使用的抗甲基化DNA抗体，至今有各种的抗体市售，例如，常使用识别5-甲基胞嘧啶或5-甲基胞苷的抗体。另外，在特开2003-125766号公报(专利文献1)中记载，将5-甲基-2’-脱氧胞苷作为抗原使用而制备杂交瘤，从此杂交瘤得单克隆抗体，通过使用该抗体的酶联免疫吸附法(ELISA法)可定量5-甲基-2’-脱氧胞苷。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：特开2003-125766号公报
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
对通过MeDIP法得到的DNA进行甲基化DNA解析时，优选在该MeDIP法中由抗甲基化DNA抗体的甲基化DNA的回收量及浓缩率高。
但是，使用结合能差的抗甲基化DNA抗体对DNA含有量少的样品实施MeDIP法时，由于无法回收甲基化DNA解析中必要并且充分的量的甲基化DNA，有该解析的灵敏度降低的担忧。另外，使用特异性劣的抗甲基化DNA抗体实施MeDIP法时，由于得到的DNA中的非甲基化DNA含有量变多，有甲基化DNA解析的信赖性降低的担忧。
从而，为了通过MeDIP法更提高甲基化DNA的回收量及浓缩率，期望对甲基化DNA有优良的结合能及特异性的抗甲基化DNA抗体的开发。
本发明鉴于如上述一样的事实，旨在提供对甲基化DNA有优良的结合能及特异性的产生抗甲基化DNA抗体的杂交瘤。
另外，本发明旨在提供使甲基化DNA的回收量及浓缩率中优良的MeDIP法可能的抗甲基化DNA抗体。
再者，本发明旨在提供使用上述的抗甲基化DNA抗体的，甲基化DNA的回收量及浓缩率优良的MeDIP法。
【解决课题的技术方案】
本发明人关注于将以下的式(I)：
【化1】
所示的，5’-(5-甲基-2’-脱氧胞苷-3’-磷酸)-2’-脱氧鸟苷3’-磷酸(以下，也称为“5-甲基-dCpdGp”)作为抗原使用。然后，用包含5-甲基-dCpdGp的抗原免疫动物，将从该动物得到的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合而制备杂交瘤，发现从此杂交瘤得到有对甲基化DNA优良的结合能及特异性的抗甲基化DNA抗体，从而完成本发明。
即，根据本发明，提供将从用包含5-甲基-dCpdGp的抗原免疫的动物得到的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到的杂交瘤(以下，也称为“本发明的杂交瘤”)。
另外，根据本发明，提供由上述的杂交瘤产生的单克隆抗体、及使用该抗体将甲基化DNA免疫沉降的方法。
【发明效果】
由本发明的杂交瘤可得有对甲基化DNA、特别是甲基化CpG序列优良的结合能及特异性的抗甲基化DNA抗体。另外，通过使用得到的抗体进行MeDIP法，相比使用以往的抗甲基化DNA抗体时更可显著地升高甲基化DNA的回收量及浓缩率。
【附图说明】
【图1】是示利用使用本发明的杂交瘤的培养上清及各种市售抗体的MeDIP法回收的甲基化DNA及非甲基化DNA的量的柱状图。
【图2】是示利用使用本发明的杂交瘤的培养上清及各种市售抗体的MeDIP法回收的甲基化DNA的浓缩率的柱状图。
【图3】是示在各反应条件中，利用使用本发明的单克隆抗体及市售抗体的MeDIP法回收的甲基化DNA及非甲基化DNA的量的柱状图。
【图4】是示在各反应条件中，利用使用本发明的单克隆抗体及市售抗体的MeDIP法回收的甲基化DNA的浓缩率的柱状图。
【图5】是示利用使用本发明的单克隆抗体及市售抗体的MeDIP法回收的3MeCG及3MeCT的回收率的柱状图。
【实施方式】
“CpG序列”是指碱基序列中的胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)从5’向3’的方向以此顺序邻接的序列。同样地，“CpT序列”是指碱基序列中的C和胸腺嘧啶(T)从5’向3’的方向以此顺序邻接的序列。再有，CpG及CpT的“p”的文字表示C和G(或者T)之间的磷酸二酯键。
“甲基化CpG序列”表示胞嘧啶的5位被甲基化修饰的CpG序列。知在哺乳类的基因组DNA中，在有CpG序列的部位中胞嘧啶的5位被甲基化修饰。
“杂交瘤”是指将淋巴细胞等的抗体产生细胞和骨髓瘤(骨髓肿)细胞人工地融合而得到的杂种细胞，是有抗体产生能的培养可能的细胞。
在本说明书中，甲基化DNA的“浓缩率”以通过MeDIP法回收的甲基化DNA的相对于非甲基化DNA的重量比([甲基化DNA的重量值]/[非甲基化DNA的重量值])表示。
本发明的杂交瘤是将从用包含5-甲基-dCpdGp的抗原免疫的动物得到的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到的杂交瘤。
接下来，对本发明的杂交瘤的制备、由该杂交瘤产生的单克隆抗体的制备及使用该抗体将甲基化DNA免疫沉降的方法进行说明。
再有，这些的方法自体均为本领域技术人员周知惯用的技术，制备杂交瘤的方法在例如Hybridoma Techniques(冷泉港实验室，1980年版)及细胞组织化学(山下修二等，日本组织细胞化学会编；学际企画、1986年)中记载，将甲基化DNA免疫沉降的方法在例如外因遗传学实验流程(牛岛俊和、真贝洋一等编、羊土公司、2008年)中记载。
1.本发明的杂交瘤的制备
本发明的杂交瘤可如以下一样制备。再有，一般而言杂交瘤的制备方法包括以下的步骤：
(1)制备免疫用抗原的步骤、(2)将动物用抗原免疫的步骤、(3)从动物单离抗体产生细胞的步骤、(4)制备与抗体产生细胞的细胞融合中使用的骨髓瘤细胞的步骤、(5)将抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合而作为杂交瘤的步骤、(6)选择性培养杂交瘤的步骤、(7)筛选产生目的抗体的杂交瘤的步骤、及(8)克隆通过筛选选择的杂交瘤的步骤。
接下来，对上述的各步骤进行更详细地说明。
(1)抗原的制备
在本发明的杂交瘤的制备中，作为免疫用抗原使用包含5-甲基-dCpdGp的抗原。
包含5-甲基-dCpdGp的抗原只要是包括作为半抗原至少包含5-甲基-dCpdGp的化合物与在免疫学方法中与该化合物结合而发生免疫原性的适宜的载体分子的缀合物的抗原即可。该抗原再包括佐剂等的辅助剂也可。
另外，上述的包含5-甲基-dCpdGp的化合物优选是包含5-甲基-dCpdGp的核酸、更优选是包含5-甲基-dCpdGp的DNA。
为了制备本发明的杂交瘤，优选使用将5-甲基-dCpdGp和载体分子的缀合物溶解或悬浮到适当的缓冲液(例如，磷酸缓冲液等)中，向其中混合弗氏完全佐剂或不完全佐剂、或者明矾等的辅助剂而制备的免疫用抗原。
作为上述的载体分子，只要是在免疫学方法中通常使用，结合到半抗原而发生免疫原性的分子即可，可举出例如牛血清白蛋白(BovineSerum Albumin：BSA)、卵清蛋白(Ovalbumin：OVA)、匙孔青贝血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin：KLH)。它们之中也优选KLH。
半抗原和载体分子的缀合物而言，一般而言，可举出有使羧基和α-氨基反应的酰胺键的缀合物、使用交联剂而将两者交联结合的缀合物等。得到那样的缀合物的方法而言，可使用碳二亚胺法、戊二醛法、偶氮缩合法、马来酰亚胺苯甲酰氧基琥珀酰亚胺(MBS)法等，它们之中也优选MBS法。
在使用MBS法时，通过向5-甲基-dCpdGp的鸟苷的磷酸基预先结合具有巯基的接头(例如，碳原子数1～5的烷基巯基)，可将该接头的巯基和KLH的氨基通过MBS交联而结合。
(2)由抗原的动物的免疫化
由上述的抗原，可免疫选自哺乳类或鸟类的动物。那样的动物只要是可在免疫学方法中通常使用的动物即可，哺乳类而言，可举出例如小鼠、大鼠、猪鼠、兔、牛、马、山羊、羊、猪、狗、猫等，鸟类而言，可举出例如鸡、鸭、火鸡、鸵鸟等。它们之中也优选小鼠。
将上述的抗原施用到动物的方法是皮下注射、腹腔内注射、静脉注射、皮内注射或肌肉内注射之任何也可，它们之中也优选皮下注射或腹腔内注射。免疫可以1次或适当的间隔、例如1～5周的间隔多次进行。另外，1次的免疫中使用的抗原量根据使用的动物而不同，优选每1只使用1～1000μg。
再有，为了确认在免疫的动物的体内是否产生针对抗原的抗体，从该动物采集血液，对从该血液分离的血清，通过ELISA法等可评价与抗原的反应性。该反应性不充分时，也可追加进行上述的免疫。
(3)抗体产生细胞的单离
从如上述一样免疫的动物的细胞，单离有产生目的抗体的可能性的抗体产生细胞。抗体产生细胞而言，可举出从脾脏、胸腺、淋巴节、末梢血或这些的组合得到的有抗体产生能的细胞，它们之中也优选脾脏细胞或淋巴节B细胞。例如，可在向上述的动物的最终免疫之后，从确认抗体产生的动物摘出脾脏，单离脾脏细胞。
(4)骨髓瘤细胞的制备
本发明的杂交瘤的制备中使用的骨髓瘤细胞可从杂交瘤的制备中一般地使用的细胞中适宜选择。那样的骨髓瘤细胞而言，可举出例如小鼠来源的P3U1、X63.653、Sp2/0、X63-Ag8、NS-1、MPC-11等，大鼠来源的AG1、AG2、AG3、RCY3、210等。再有，优选抗体产生细胞和骨髓瘤细胞是同种的动物来源。
培养上述的骨髓瘤细胞的培养基而言，可选自细胞培养中通常使用的培养基，可举出例如Dulbecco改变Eagle培养基(DMEM)、Iscove改变Dulbecco培养基(IMDM)、向RPMI-1640等适量添加胎牛血清(FCS)的培养基。
(5)抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合
细胞融合可通过使用仙台病毒的方法、使用聚乙二醇的方法(PEG法)、通过电处理的方法(电融合法)等而进行。PEG法可根据例如Kohler及Milstein的方法(Nature，256：495-497，1975)进行，例如通过使用30～50％聚乙二醇(平均分子量1000～4000)在30～40℃的温度，将抗体产生细胞和骨髓瘤细胞混合1～10分钟来进行。
另外，电融合法是，例如，向抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的混合液首先通电10～80V的交流电压1～20秒钟而使细胞们接触，接下来通过以10～100μ秒的脉宽实施1～5kV/cm的高电压直流脉冲来进行。
(6)杂交瘤的选择的培养
通过细胞融合得到的杂交瘤的选择可通过使用仅杂交瘤可培育的选择培养基进行培养。那样的选择培养基而言，优选使用包括HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤及胸腺嘧啶)或Haz(次黄嘌呤-氮杂丝氨酸)的培养基。
例如，使用含有HAT的培养基的杂交瘤的选择培养是在作为骨髓瘤细胞使用HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)缺损株时有效。即，由于不与抗体产生细胞融合的HGPRT缺损骨髓瘤细胞的增殖被HAT抑制，通过将细胞融合步骤后的细胞群在含有HAT的培养基中培养，可选择性培养杂交瘤。
(7)杂交瘤的筛选
为了在如上述一样培养的杂交瘤之中，选择可产生目的抗体的杂交瘤，进行筛选。
由于杂交瘤将产生的抗体向细胞外分泌，采集在选择培养基中确认增殖的杂交瘤的培养上清，通过由MeDIP法及ELISA法评价此上清中的本发明的单克隆抗体的有无及抗体存在时的其效价，可筛选杂交瘤。
(8)杂交瘤的克隆
通过上述的筛选得到产生目的单克隆抗体的杂交瘤之后，进行该杂交瘤的克隆。克隆的方法而言，可举出例如，稀释至每孔接种1个的细胞的方法(有限稀释法)、在软琼脂糖培养基上接种细胞之后，取得集落的方法、通过显微操作仪取得1个的细胞的方法、通过细胞分选仪分离1个细胞的FACS法等，优选简便的有限稀释法。
另外，对于克隆的杂交瘤，再重复进行筛选及克隆，选择抗体的效价更优良的杂交瘤也可。
本发明人，根据上述的步骤，在将从用包含5-甲基-dCpdGp的抗原免疫的小鼠得到的脾脏细胞和骨髓瘤细胞P3U1通过电融合法进行细胞融合而得到的杂交瘤克隆之中，取得产生在MeDIP法及竞争结合抑制试验(ELISA法)中示良好的效价的单克隆抗体的克隆SCR1～7。
再有，以下的表1中示在独立行政法人制品评价技术基盘机构(千叶县木更津市上总镰足2-5-8、292-0818、日本)中保藏的各克隆的保藏号及保藏年月日。
【表1】
  克隆   保藏号  保藏年月日
  SCR1   NITE BP-810号  2009年9月10日
  SCR2   NITE BP-805号  2009年8月25日
  SCR3   NITE BP-811号  2009年9月10日
  SCR6   NITE BP-812号  2009年9月10日
2.本发明的单克隆抗体的制备
本发明的单克隆抗体可从本发明的杂交瘤的培养上清得到。另外，本发明的单克隆抗体也可从使本发明的杂交瘤在裸鼠等的动物的腹腔内增殖而得到的腹水中得到。
再者，本发明的单克隆抗体通过基因重组技术得到也可。即，从本发明的杂交瘤的基因组DNA鉴定本发明的单克隆抗体的重链及轻链抗体基因，将有该抗体基因的序列的DNA片段整合到适当的表达载体，将得到的载体导入骨髓瘤细胞等的不产生Ig蛋白质的细胞，通过表达本发明的单克隆抗体，得到本发明的单克隆抗体也可。
由于上述的培养上清及腹水包含本发明的单克隆抗体，直接在MeDIP法等中使用也可。但是，为了提高MeDIP法中的甲基化DNA的回收量及浓缩率，从上述的培养上清或腹水纯化本发明的单克隆抗体，优选使用纯化的本发明的单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体的纯化方法而言，可选自本领域技术人员公知的方法，可举出例如，透析、硫酸铵分级分离、聚乙二醇分级分离、乙醇分级分离、亲和层析、离子交换柱层析、高效液相层析、凝胶过滤、冷冻干燥等。这些的纯化方法之中也优选亲和层析，更优选使用蛋白A(或者G)柱的亲和层析。
另外，如上述一样得到的单克隆抗体，例如，可通过使用ELISA法等的公知的方法或试剂盒来确定亚类等。
在本发明的单克隆抗体也包括通过将该抗体片段化而得到的活性片段。那样的活性片段而言，只要是不失对甲基化DNA的特异性结合活性的片段即可。这些的活性片段，例如，可通过将纯化的本发明的单克隆抗体用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶等处理来制备。
本发明的单克隆抗体对甲基化DNA有优良的结合能及特异性。
因此，可在作为回收及浓缩甲基化DNA的方法的MeDIP法中适宜地利用。
3.使用本发明的单克隆抗体的甲基化DNA免疫沉降法(MeDIP法)
使用本发明的单克隆抗体的MeDIP法(以下，也称为“本发明的MeDIP法”)，通过作为抗甲基化DNA抗体使用本发明的单克隆抗体，相比以往的将抗甲基化胞嘧啶抗体等作为抗甲基化DNA抗体使用时，可回收更大量的甲基化DNA而浓缩。
从而，将通过本发明的MeDIP法得到的甲基化DNA在甲基化DNA解析中使用，则可将浓缩率高的大量的甲基化DNA作为该解析的样品。
从而，本发明的MeDIP法适宜于甲基化DNA解析用样品的制备。
本发明的MeDIP法包括下列3步骤：(1)使从活体样品提取的DNA成为单链DNA片段的步骤、(2)从单链DNA片段使用本发明的单克隆抗体将甲基化DNA免疫沉降的步骤、及(3)回收免疫沉降的甲基化DNA的步骤。另外，本发明的MeDIP法为了在DNA回收后确认是否特异性地得到甲基化DNA，再优选包括(4)检测甲基化DNA的步骤。
接下来，对各步骤进行更详细地说明。
(1)从活体样品的DNA的提取、该DNA的片段化及向单链的变性
从由解析对象得到的活体样品提取DNA。活体样品而言，只要是包括解析对象的DNA的样品，就不特别限定，优选是包括基因组DNA的样品、可使用例如培养细胞、临床待测样品等。作为临床待测样品，具体可举出，血液、血清、淋巴细胞、尿、乳头分泌液、通过手术或活体检查等采集的组织等。
从活体样品的DNA的提取可通过本领域技术人员公知的方法进行。例如，可通过将包括可使细胞及/或组织可溶化的表面活性剂(胆酸钠、十二烷基硫酸钠等)的处理液和活体样品混合之后，实施物理处理(搅拌、均化等)而使活体样品中包括的DNA游离到溶液中来提取DNA。
也可将得到的DNA，通过公知的方法、例如将上述的溶液离心分离而回收上清，将此上清用苯酚/氯仿提取等来纯化。另外，从活体样品的DNA的提取及纯化也可使用市售的试剂盒进行。
接下来，将得到的DNA片段化成适当的长度，例如，200～1000bp程度。
DNA的片段化可通过超声波处理、碱处理、酶处理等来进行。例如，可使用氢氧化钠进行碱处理时，向DNA溶液中添加氢氧化钠溶液至终浓度达到0.1～1.0N，通过于10～40℃温育5～15分钟来将DNA片段化。另外，进行酶处理时，可使用限制酶。限制酶可基于DNA的碱基序列适宜选择，可使用例如MseI或BamHI等。
然后，将如上述一样得到的DNA片段加热变性之后，使通过急冷却成为单链。例如，通过将包括DNA片段的溶液于94～96℃加热5～15分钟之后，急冷却至2～4℃，可使DNA片段成为单链。
在以下的免疫沉降的步骤中，由于向包括上述得到的单链DNA片段的溶液添加本发明的单克隆抗体，优选将该溶液用免疫沉降法中通常使用的缓冲液稀释。再有，也可向稀释的溶液预先适量加抗体结合用载体而通过旋转等，对非特异性地结合到该载体的蛋白质等进行除处理(以下，称之为“预清除处理”)。这样的抗体结合用载体只要是可与IgG的Fc区域特异性地结合的载体即可，可举出例如蛋白A(或者G)琼脂糖珠等。
(2)甲基化DNA的免疫沉降
甲基化DNA的免疫沉降通过向包括单链DNA片段的溶液适量加本发明的单克隆抗体，接触20分钟～24小时而使抗体和抗原反应之后，加抗体结合用载体而，再接触20分钟～3小时来进行。
本发明的单克隆抗体的添加量(终浓度)选自相对于包括单链DNA片段的溶液(1μg/ml)是0.01～100μg/ml的范围。另外，使用本发明的单克隆抗体进行甲基化DNA的免疫沉降时，可在周围温度4～50℃、优选是4～37℃的范围进行。
另外，甲基化DNA的免疫沉降也可通过向上述的包括单链DNA片段的溶液加向抗体结合用载体预先结合本发明的单克隆抗体的复合物来进行。
(3)甲基化DNA的回收
通过离心分离等回收上述的抗体结合用载体，将其用适宜的清洗用缓冲液清洗数次之后，使用适宜的溶出用缓冲液，由结合到抗体结合用载体的本发明的单克隆抗体将捕捉的甲基化DNA溶出而回收。
得到的甲基化DNA也可通过苯酚/氯仿法及乙醇沉淀法等的本领域技术人员公知的方法、或者试剂盒等来纯化。
(4)甲基化DNA的检测
至于是否可通过上述的免疫沉降特异性地回收甲基化DNA，可通过PCR法、定量PCR法、亚硫酸氢盐测序法等的公知的甲基化DNA检测方法来确认。
(i)由PCR法或定量PCR法的检测
通过PCR法或定量PCR法检测甲基化DNA时，一般而言也可使用可得到的PCR用或定量PCR用试剂盒。另外，在PCR法中，可通过用琼脂糖电泳法确认扩增产物的存在来检测甲基化DNA。
扩增的反应条件可由本领域技术人员根据扩增的区域的碱基序列、扩增的长度等适宜确定。
另外，扩增用引物是，使用在作为活体样品的细胞及组织等中，针对甲基化修饰的基因的序列的引物(检测用)及针对未被甲基化修饰的基因的序列的引物(阴性对照用)即可。
(ii)由亚硫酸氢盐测序法的检测
通过亚硫酸氢盐测序法检测甲基化DNA时，将通过MeDIP法回收的DNA用亚硫酸氢盐处理。
亚硫酸氢盐处理是指将亚硫酸氢的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等的亚硫酸氢盐(亚硫酸氢盐)的溶液添加到DNA溶液中，将该DNA中包括的非甲基化胞嘧啶(C)通过脱氨基化反应变换为尿嘧啶(U)的处理。另一方面，亚硫酸氢盐不与甲基化胞嘧啶作用，不发生如上述一样的碱基的变换。从而，DNA的甲基化状态的差异通过亚硫酸氢盐处理而变换为碱基序列的差异(C及U)。
通过此亚硫酸氢盐处理而将DNA中的非甲基化胞嘧啶变换为尿嘧啶，可通过该DNA的测序解析，检测与原本的碱基序列的差异，检测甲基化DNA。
接下来，通过实施例详细地说明本发明，但本发明不受这些的实施例的限定。
【实施例】
【实施例1：杂交瘤的制备】
1.由免疫用抗原及ELISA法的筛选用抗原的制备
向下述的式(II)所示的，5-甲基-dCpdGp通过MBS法交联结合作为接头结合丙烷巯基的5’-(5-甲基-2’-脱氧胞苷-3’-磷酸)-2’-脱氧鸟苷3’-磷酸-3-巯基丙酯(以下，也称为“5-甲基-dCpdGpC3H6SH”)和作为载体的KLH来制备免疫用抗原。
【化2】
另外，将5-甲基-dCpdGpC3H6SH和BSA通过MBS法交联结合，制备由ELISA法的筛选用抗原。
将上述的免疫用抗原100μg和弗氏完全佐剂(FCA)100μl混合而乳化，制备FCA抗原液。另外，将免疫用抗原100μg和弗氏不完全佐剂(FIA)100μl混合而乳化，制备FIA抗原液。
2.向小鼠的免疫
将FCA抗原液100μl施用到9周龄的雌性Balb/c小鼠(日本Charles River株式会社)的腹腔内(初次免疫)。其后，每2周6次、将FIA抗原溶液100μl腹腔内施用(追加免疫)。
3.脾脏细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合
从最后的追加免疫14天后，从小鼠无菌摘出脾脏。然后，在RPMI-1640培养基中从脾脏除去脂肪。向除去脂肪的脾脏用注射器注入培养基之后，将脾脏的两端用夹切落，从脾脏将细胞取出到培养基中。将得到的细胞在培养基中分散之后，使通过不锈钢网而取得脾脏细胞的悬浮液。
将得到的脾脏细胞(1×108细胞)和小鼠骨髓瘤细胞P3U1(2×107细胞)混合，使用电融合装置SSH-2(岛津制作所制)进行细胞融合。再有，此细胞融合是向脾脏细胞和骨髓瘤细胞的混合液通电交流电压(40V)10秒钟之后，施加直流脉冲(2.3kV/cm、脉宽40μ秒)来进行。
4.杂交瘤的培养
将杂交瘤悬浮于含有HAT的培养基(包括1×10-4M次黄嘌呤、4×10-7M氨基喋呤、1.5×10-5M胸腺嘧啶及20％FCS的RPMI-1640培养基)至达到1.2×106细胞/ml，向96孔板(Nunc公司制；以下，称之为培养用板)的各孔接种至达到1.2×105细胞/孔。将培养用板在37℃、5％CO2的恒温槽内静置，开始杂交瘤的培养。培养10天而使出现杂交瘤的集落，进行产生单克隆抗体的杂交瘤的筛选。
5.由ELISA法的杂交瘤的筛选
向磷酸缓冲液(140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4及1.8mM KH2PO4(pH 7.4)；以下，称之为PBS)中添加上述1.中制备的筛选用抗原至达到终浓度5μg/ml，制备固定用抗原溶液。将此固定用抗原溶液50μl添加到96孔的聚苯乙烯制微滴定板的各孔中(以下，称之为抗原固定板)。将抗原固定板于4℃静置一晚之后，将各孔用PBS(200μl/孔)清洗。清洗后，向抗原固定板的各孔以200μl/孔添加BLOCK ACE(大日本制药株式会社)，将该板于室温静置1小时。其后，将各孔用包括0.05％Tween20的PBS(以下，也称为“PBS-T”；200μl/孔)清洗。
接下来，从培养用板的各孔采集上述的杂交瘤的培养上清，向抗原固定板的各孔各添加50μl，于室温搅拌1小时。搅拌后，将各孔用PBS-T(200μl/孔)清洗2次。清洗后，向抗原固定板的各孔各添加100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记抗小鼠Ig多克隆抗体(Cappel公司制)，于室温反应1小时。反应后，将各孔用PBS-T(200μl/孔)清洗2次。清洗后，以各孔各100μl加包括作为HRP的底物的正苯二胺(OPDA)的底物液(10mg/25ml的OPDA+2μl的30％H2O2/25ml的柠檬酸溶液)，将抗原固定板遮光而使于室温静置20分钟。然后，向各孔加各100μl包括2N H2SO4的反应停止液之后，对各孔中的反应液，使用酶标仪(Model 3550：Bio-Rad公司制)测定490nm的吸光度。
6.由MeDIP法的杂交瘤的筛选
将从人乳腺癌细胞株MCF7提取的基因组DNA(4μg)用限制酶MseI(NEB公司)于37℃反应一晚，片段化成300～1000bp。接下来，将反应后的DNA片段于95℃加热10分钟而变性，于4℃急冷却而使成为单链DNA片段。将得到的单链DNA片段根据染色质免疫沉淀测定试剂盒(Upstate biotechnology公司)中附带的手册，用附属于该测定试剂盒的稀释用缓冲液稀释。其后，添加蛋白G琼脂糖珠(GEHEALTHCARE公司)，于4℃旋转30分钟而进行预清除处理。然后，离心分离后，将回收的上清分注到管中，作为MeDIP用待测样品及对照用待测样品。
将上述的使用ELISA法的筛选中示高的吸光度的杂交瘤的培养上清添加到MeDIP用待测样品，将正常小鼠IgG抗体(SantaCruz公司)添加到对照用待测样品。然后，将这些于4℃旋转一晚而反应之后，分别添加蛋白G琼脂糖珠(GE HEALTHCARE公司)，再者于4℃旋转1小时而进行免疫沉降。由此，将上述的培养上清中包括的抗体和DNA的复合物结合到蛋白G琼脂糖珠而回收。接下来，将回收的珠用染色质免疫沉淀测定试剂盒(Upstate公司)的清洗用缓冲液清洗之后，将上述的复合物中的DNA用上述试剂盒的溶出用缓冲液溶出。然后，使溶出的DNA与蛋白酶K反应之后，使用QiaquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN公司)纯化。
再有，上述的清洗、溶出及纯化基于各试剂盒的使用说明书的记载进行。
接下来，为了确认通过上述的MeDIP法，是否可特异性地回收甲基化DNA，进行PCR法及琼脂糖电泳法。
(i)PCR反应液的制备
将下述的试剂混合，制备25μl的反应液。
  2×FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(ROCHE公司)  12.5μl
  正向(F)引物(10μM)  1μl
  反向(R)引物(10μM)  1μl
  回收的DNA  1μl
  dH2O  9.5μl
使用的引物的序列如下。
作为甲基化DNA检测用引物组，使用用于扩增MCF7细胞中已知被甲基化修饰的GSTP1基因的启动子区域的引物组。以下示GSTP1引物的序列。
F：5′-GAGGCCTTCGCTGGAGTT-3′(SEQ ID NO：1)
R：5′-GTACTCACTGGTGGCGAAGA-3′(SEQ ID NO：2)
另外，作为非甲基化DNA检测用引物组，使用用于扩增在人的第14染色体中存在，无CpG序列而未被甲基化修饰的区域(以下，称之为CGF-1区域)的引物组。以下示CGF-1区域的序列。
<CGF-1区域>
   GGAGGAGTCA     AGAGAAGTTG     GAAGCCAACT
GAGAGAGAGG GAAGGCTTGA AGTGGTCAGG ACAGTGAACA
CCTAAGAGAC ATCCACTGAA TTTGCCCACT AGGAAGCCAT
TAGTGACTTC AATAGGAACA TCTTCAGTGC ATCATGAAGG
CCAAAGATTG CCATGAAAGA GAGGAATGGA AATGGAGTGT
GGG(SEQ ID NO：10)
另外，以下示CGF-1引物的序列。
F：5′-GGAGGAGTCAAGAGAAGTTGGAAGC-3′(SEQ IDNO：3)
R：5′-CCCACACTCCATTTCCATTCCTC-3′(SEQ ID NO：4)
(ii)PCR的反应条件
使用上述的反应液，在下述的条件下进行PCR。
于95℃10分钟的1个循环、
于95℃30秒钟、于66℃15秒钟及于72℃30秒钟的45个循环、
于95℃1分钟、于66℃30秒钟及于95℃30秒钟的1个循环。
(iii)琼脂糖电泳
将上述的各PCR产物使用2％琼脂糖凝胶进行电泳，确认扩增产物的存在。然后，选择成为GSTP1基因的扩增产物更多，并且CGF-1区域的扩增产物更少的结果的培养上清的杂交瘤。
7.杂交瘤的克隆
将选择的杂交瘤通过使用杂交瘤克隆因子(IGEN公司)的有限稀释法克隆。从克隆第10天，用与上述的使用ELISA法的杂交瘤的筛选同样的方法，克隆产生抗体的杂交瘤(抗体产生杂交瘤)。
8.由竞争结合抑制试验的抗体产生杂交瘤的选择
制备以下的化合物1及2的各溶液(1mM)，将这些于95℃热处理10分钟之后，在冰中冷却2分钟。
化合物1：5-甲基-dCpdGpC3H6SH
化合物2：NNNCGNNN(“N”示任意的核苷酸)
向PBS中添加在上述的1.中制备的筛选用抗原至达到终浓度5μg/ml，制备固定用抗原溶液。将此固定用抗原溶液50μl添加到96孔的聚苯乙烯制微滴定板的各孔(以下，称之为抗原固定板)。将抗原固定板于4℃静置一晚之后，将各孔用PBS(200μl/孔)清洗。清洗后，向抗原固定板的各孔以200μl/孔添加BLOCK ACE(大日本制药株式会社)，将该板于室温静置1小时。其后，将各孔用PBS-T(200μl/孔)清洗。
接下来，向抗原固定板的各孔各自添加各50μl上述的杂交瘤的培养上清及上述的化合物1的溶液，于室温搅拌1小时。搅拌后，将各孔用PBS-T(200μl/孔)清洗2次。清洗后，将HRP标记抗小鼠Ig多克隆抗体(Cappel公司制)以各100μl添加到各孔，于室温反应1小时。反应后，将各孔用PBS-T(200μl/孔)清洗2次。清洗后，将上述的包括OPDA的底物液以各100μl加到各孔，将抗原固定板遮光而于室温静置20分钟。然后，将包括2N H2SO4的反应停止液以各100μl加到各孔之后，对各孔中的反应液，使用酶标仪(Model 3550：Bio-Rad公司制)测定490nm的吸光度。
由此确认，由抗体产生杂交瘤产生的抗体的向化合物1的交差反应。另外，代替化合物1的溶液，使用化合物2的溶液同样地确认由抗体产生杂交瘤产生的抗体的向化合物2的交差反应。基于这些的结果，选择产生化合物1中示交差反应，但化合物2中未示交差反应的抗体的抗体产生杂交瘤。
对于进行2次上述的克隆及竞争结合抑制试验而选择的杂交瘤，再进行上述的由MeDIP法的杂交瘤的筛选，得7个杂交瘤的克隆(SCR1～7)。
再有，如表1所示，SCR2是在2009年8月25日以保藏号NITEBP-805号，SCR1、3及6是在2009年9月10日分别以保藏号NITEBP-810号、保藏号NITE BP-811号及保藏号NITE BP-812号在独立行政法人制品评价技术基盘机构(千叶县木更津市上总镰足2-5-8、292-0818、日本)保藏。
【实施例2：由MeDIP法的单克隆抗体的效价的检查】
1.由MeDIP法的甲基化DNA的回收
进行与实施例1的6.同样的操作，从由MCF7提取的基因组DNA(4μg)，制备单链DNA片段的稀释液，将此稀释液预清除处理，得MeDIP用待测样品及对照用待测样品。
将上述的SCR1～7的培养上清、市售的抗甲基化胞嘧啶抗体及抗甲基化胞苷抗体各自添加到MeDIP用待测样品，将正常小鼠IgG抗体(SantaCruz公司)、正常兔IgG抗体(SantaCruz公司)及在上述的使用ELISA法的筛选中确认不到抗体产生能的杂交瘤的培养上清(阴性对照之上清)各自添加到对照用待测样品。然后，将这些于4℃旋转一晚而使抗体和抗原反应之后，向各自添加蛋白G琼脂糖珠(GE HEALTHCARE公司)，再于4℃旋转1小时而进行免疫沉降。然后，进行与实施例1的6.同样的操作，从回收的珠溶出DNA，将其纯化。
再有，在以下的表2示使用的市售抗体的厂商、克隆名等。
【表2】
  厂商   抗体名   克隆名   免疫动物
  Calbiochem   抗-5-甲基胞嘧啶小鼠mAb   16233D3   小鼠
  abcam   5-甲基胞苷   33D3   小鼠
  Eurogentec   5-甲基胞苷   单克隆   小鼠
  Aviva System Biology   5-甲基胞嘧啶   33D3   小鼠
  Novus Biologicals   胞嘧啶(5-甲基)   多克隆   羊
  Diagenode   5-甲基胞苷   单克隆   小鼠
2.定量PCR法
接下来，为了检查上述的由MeDIP法得到的甲基化DNA的回收量及浓缩率，进行定量PCR法。
(i)PCR反应液的制备
将下述的试剂混合，制备25μl的反应液。再有，对于上述的从MCF7提取的基因组DNA的稀释系列(0.1、1.0、10及100ng/μl)也同样地制备反应液，将这些作为标准曲线制成用样品。
  2×FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(ROCHE公司)  12.5μl
  F引物(10μM)  1μl
  R引物(10μM)  1μl
  回收的DNA  1μl
  dH2O  9.5μl
引物则使用上述的GSTP1引物(SEQ ID NO：1及2)以及CGF-1引物(SEQ ID NO：3及4)。
对于上述的反应液，使用Mx3005P(Stratagene公司制)，在下述的反应条件下进行定量PCR。
(ii)定量PCR的反应条件
于95℃10分钟的1个循环、
于95℃30秒钟、于66℃15秒钟及于72℃30秒钟的45个循环、
于95℃1分钟、于66℃30秒钟及于95℃30秒钟的1个循环。
3.结果
图1及2示通过使用各抗体的MeDIP法得到的甲基化DNA的回收量及浓缩率。图1是示使用SCR1～7的杂交瘤的培养上清及各种市售抗体通过MeDIP法回收的甲基化DNA及非甲基化DNA的量的柱状图。图2是示使用SCR1～7的杂交瘤的培养上清及各种市售抗体通过MeDIP法回收的甲基化DNA的浓缩率的柱状图。
从图1及2知，由SCR1～7的培养上清的甲基化DNA的回收量及浓缩率，相比市售抗体，均显著地高。
例如，从图1知，使用SCR1～7的杂交瘤的培养上清，则相比各种市售抗体，由MeDIP法的甲基化DNA的回收量显著地更高。更具体而言，相比在市售抗体之中示最多的回收量的Novus公司的抗体，SCR1示45.9倍、SCR2示136.4倍、SCR3示109.3倍、SCR4示54倍、SCR5示56.6倍、SCR6示78.1倍、SCR7示132.8倍的回收量。结果提示，由本发明的杂交瘤产生的抗体，相比各种市售抗体，向甲基化DNA的结合能更高。
再者知，使用SCR1～7的杂交瘤的培养上清的MeDIP法，相比甲基化DNA的回收量的增加，几乎无非甲基化DNA的回收量的增加。因此提示，由本发明的杂交瘤产生的抗体，相比各种市售抗体，向甲基化DNA的特异性更高。
另外，从图2知，相比各种市售抗体，由SCR1～7产生的抗体的由MeDIP法的甲基化DNA的浓缩率高。更具体而言，对于浓缩率，相比输入，SCR1示67倍、SCR2示124倍、SCR3示97倍、SCR4示57倍、SCR5示84倍、SCR6示108倍、SCR7示99倍的浓缩率。
再者，相比市售抗体之中示最高的浓缩率的Diagenode公司的抗体，SCR1示3.3倍、SCR2示6.1倍、SCR3示4.8倍、SCR4示2.8倍、SCR5示4.1倍、SCR6示5.3倍、SCR7示4.9倍的浓缩率。
结果提示，由本发明的杂交瘤产生的抗体，相比各种市售抗体，向甲基化DNA的特异性更高。
【实施例3：从腹水的单克隆抗体的纯化】
1.腹水的制备
向5只Balb/c裸鼠(6周龄、雌性：日本Charles River株式会社)的腹腔内接种杂交瘤SCR2(1×107细胞/只)。从接种1周后，向该小鼠追加接种SCR2(1×107细胞/只)。从追加接种2周后，从该小鼠使用注射器采集腹水。
2.硫酸铵盐析
向得到的腹水17.5ml各少量加达50％饱和的量(5.1g)的硫酸铵，冷却着搅拌而得到沉淀。接下来，回收此沉淀，用PBS溶解而作为溶液。然后，将该溶液放入透析管，用4L的PBS透析12天。透析后，通过将管内的溶液用0.45μm滤器过滤，得纯化的单克隆抗体(279mg)。
另外，使用小鼠单克隆抗体同种分型测试试剂盒(Serotec公司)检查得到的单克隆抗体的亚类的结果是IgG2a(κ)。
在以下的实施例4中使用由此SCR2得到的单克隆抗体。
【实施例4：单克隆抗体的温度特性的检查】
1.MeDIP法
进行与实施例1的6.同样的操作，从由MCF7提取的基因组DNA(4μg)，制备单链DNA片段的稀释液，对此稀释液进行预清除处理，得MeDIP用待测样品及对照用待测样品。
将从上述的SCR2得到的单克隆抗体、Diagenode公司的抗甲基化胞苷抗体各自添加到MeDIP用待测样品，将正常小鼠IgG抗体(SantaCruz公司)添加到对照用待测样品。然后，将这些在于4℃一晚、于4℃1小时、于室温1小时或于37℃1小时的条件下旋转而使抗体和抗原反应之后，向各自添加蛋白G琼脂糖珠(GEHEALTHCARE公司)，再在各温度旋转1小时而进行免疫沉降。然后，进行与实施例1的6.同样的操作，从回收的珠溶出DNA，将其纯化。
2.定量PCR法
接下来，为了检查通过上述的MeDIP法得到的甲基化DNA的回收量及浓缩率，进行定量PCR法。
(i)PCR反应液的制备
将下述的试剂混合，制备25μl的反应液。再有，对于上述的由MCF7提取的基因组DNA的稀释系列(0.1、1.0、10及100ng/μl)，也同样地制备反应液，将这些作为标准曲线制成用样品。
作为甲基化DNA检测用引物组，使用用于扩增FBRS基因及REXO1L1基因的引物组。再有，本发明人确认，由这些的引物组扩增的区域在MCF7细胞中被甲基化修饰(参照后述的参考例)。
另外，作为非甲基化DNA检测用引物，使用上述的CGF-1引物组。
以下示FBRS引物组及REXO1L1引物组的序列。
●FBRS引物组
F：5′-GAGAAGTAGTTGGAAGGAGAGG-3′(SEQ ID NO：5)
R：5′-CCCTACACTAACTACAATAATTTAATATCC-3′(SEQID NO：6)
●REXO1L1引物组
F：5′-GTAGGATGGTTTGGATTTGGGGTAA-3′(SEQ IDNO：7)
R：5′-CAACTACTCCTAACTCTATAAACTACCAA-3′(SEQ IDNO：8)
对于上述的反应液，使用Mx3005P(Stratagene公司制)，在下述的反应条件下进行定量PCR。
(ii)定量PCR的反应条件
于95℃10分钟的1个循环、
于95℃30秒钟、于66℃15秒钟及于72℃30秒钟的45个循环、
于95℃1分钟、于66℃30秒钟及于95℃30秒钟的1个循环。
但是，对使用FBRS引物组的反应液，在下述的条件下进行定量PCR。
于95℃10分钟的1个循环、
于95℃30秒钟、于63℃15秒钟及于72℃30秒钟的45个循环、
于95℃1分钟、于63℃30秒钟及于95℃30秒钟的1个循环。
3.结果
图3及4示，各条件下的通过MeDIP法得到的甲基化DNA的回收量及浓缩率。图3是示在各反应条件下的，通过使用由SCR2得到的单克隆抗体及市售抗体的MeDIP法回收的甲基化DNA及非甲基化DNA的量的柱状图。图4是示在各反应条件下，通过使用由SCR2得到的单克隆抗体及市售抗体的MeDIP法回收的甲基化DNA的浓缩率的柱状图。
从图3知，由SCR2得到的单克隆抗体，在任何的反应条件下，由MeDIP法的甲基化DNA的回收量高。另外知，由SCR2得到的单克隆抗体，在任何的反应条件下，几乎无由MeDIP法的非甲基化DNA的回收量的增加。因此提示，由SCR2得到的单克隆抗体，在各反应条件下，有向甲基化DNA的高的结合能及特异性。
再者，从图4知，由SCR2得到的单克隆抗体，在任何的反应条件下，由MeDIP法的甲基化DNA的浓缩率高。因此提示，由SCR2得到的单克隆抗体，在各反应条件中，有向甲基化DNA的高的特异性。
从上述的结果示，以往、在MeDIP法中于4℃进行一晚的反应，但使用本发明的单克隆抗体，则可在于4℃1小时、于室温1小时及于37℃1小时之任何的条件下也进行MeDIP法。
【参考例：由亚硫酸氢盐测序法的甲基化DNA的检测】
通过亚硫酸氢盐测序法检查由实施例4中使用的FBRS基因及REXO1L1基因的引物组扩增的区域在MCF7细胞中被甲基化修饰。
1.亚硫酸氢盐处理的DNA溶液的制备
将由MCF7细胞提取的基因组DNA(2μg)在19μl的水中稀释，向其中添加1μl 6N氢氧化钠水溶液而使终浓度0.3N，于37℃温育15分钟而使变性。
接下来，向上述的DNA溶液添加120μl3.6M亚硫酸氢钠/0.6M氢醌溶液之后，以于95℃30秒钟及于50℃15分钟的1个循环，通过将其重复15个循环，处理亚硫酸氢盐。然后，将处理的溶液使用Wizard(注册商标)DNA Clean-up System(Promega公司)脱盐，在TE缓冲液50μl中溶出，得到将非甲基化胞嘧啶变换为尿嘧啶的DNA溶液。
向上述的DNA溶液添加5μl 3N氢氧化钠水溶液，于室温温育5分钟之后，用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN公司)纯化，得到DNA溶液。
2.测序解析
以得到的DNA溶液作为模板，使用上述的FBRS基因及REXO1L1基因的引物组进行PCR法。
(i)PCR反应液的制备
将下述的试剂混合，制备15μl的反应液。
  10x Ex Taq(注册商标)缓冲液(宝生物株式会社)   12.5μl
  dNTP mix(2.5mM)   1.2μl
  F引物(10μM)   0.6μl
  R引物(10μM)   0.6μl
  DNA溶液   1μl
  Ex Taq(注册商标)聚合酶(宝生物株式会社)   0.12μl
  dH2O   9.98μl
使用上述的反应液，在下述的条件下进行PCR。
(ii)定量PCR的反应条件
于95℃4分钟30秒钟的1个循环、
于95℃30秒钟、于66℃15秒钟及于72℃30秒钟的40个循环、
于4℃放置。
但是，对于使用FBRS引物组的反应液，在下述的条件下进行定量PCR。
于95℃4分钟30秒钟的1个循环、
于95℃30秒钟、于60℃15秒钟及于72℃30秒钟的40个循环、
于4℃放置。
将得到的各PCR产物整合到TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)的pCR(注册商标)2.1载体，回收这些的质粒，使用M13Rv引物进行测序解析。
再有，以下示M13Rv引物的序列。
5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′(SEQ ID NO：9)
基于测序结果，表3示在FBRS基因及REXO1L1基因的扩增区域中存在的CpG序列的甲基化状态。在此表中，CpG序列的行中示的数字是从各基因的扩增区域的5′末端依出现顺序数的CpG序列的编号。●表示甲基化CpG序列、○表示非甲基化CpG序列。
【表3】FBRS
  CpG序列   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14
  克隆1   ○   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ○   ●
  克隆2   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ○   ●   ○   ●
  克隆3   ●   ●   ●   ●   ○   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●
  克隆4   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ○   ●   ○   ●
  克隆5   ●   ●   ○   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●
  克隆6   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●
PEXO1L1
 CpG序列   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27
 克隆1   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ○   ●   ●   ●   ○   ●   ○   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ○   ●   ●   ●   ●
 克隆2   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ○   ○   ○   ○   ○
 克隆3   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ●   ○   ○   ○   ○
如表3所示，在MCF7细胞中，FBRS及REXO1L1基因的扩增的区域中存在的CpG序列几乎全有被甲基化的倾向。
从而，上述的引物组可在通过MeDIP法回收的MCF7细胞的甲基化基因组DNA的定量PCR中适宜地使用。
【实施例5：本发明的单克隆抗体识别的表位的检查】
将作为包括甲基化CpG的寡核苷酸的3MeCG和作为包括甲基化CpT的寡核苷酸的3MeCT作为抗原使用，检查本发明的单克隆抗体识别的表位。
1.MeDIP法
进行与实施例1的6.同样的操作，从由MCF7提取的基因组DNA(4μg)，制备单链DNA片段的稀释液。接下来，对此稀释液进行预清除处理，得到DNA样品。然后，向得到的DNA样品添加预先于95℃加热10分钟而变性，并于4℃急冷却的3MeCG，作为3MeCG待测样品。再有，以下示3MeCG的序列。
<3MeCG>
5′-CGAGGTCGACGGTATTGATm5cGAGTATCGATAGTm5c
GATATCGATATCGATATm5cGATATACAACGTCGTGACTGG-3′
(SEQ ID NO：11)
(序列中的“m5c”表示5-甲基胞嘧啶。)
在上述的3MeCG待测样品的制备中，除了代替3MeCG，使用3MeCT以外、进行同样地操作而制备3MeCT待测样品。再有，以下示3MeCT的序列。
<3MeCT>
5′-CGAGGTCGACGGTATTGATm5cTAGTATCGATAGTm5c
TATATCGATATCGATATm5cTATATACAACGTCGTGACTGG-3′
(SEQ ID NO：12)
将由上述的SCR2及SCR3得到的单克隆抗体以及Diagenode公司的抗甲基化胞苷抗体各自添加到3MeCG待测样品及3MeCT。然后，将这些待测样品于4℃旋转一晚而使抗体和抗原反应。其后，向各自添加蛋白G琼脂糖珠(GE HEALTHCARE公司)，进行与实施例1的6.同样的操作，从回收的珠溶出DNA，将其纯化。
2.定量PCR法
接下来，为了检查上述的通过MeDIP法得到的甲基化DNA的回收量，进行定量PCR法。
(i)PCR反应液的制备
制备25μl与实施例2中同样的反应液。
作为甲基化DNA检测用引物组，使用以下的SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13所示的引物。此引物组可特异性地扩增上述的3MeCG及3MeCT。
F：5′-CGAGGTCGACGGTAT-3′(SEQ ID NO：13)
R：5′-CCAGTCACGACGTTGTA-3′(SEQ ID NO：14)
对于上述的反应液，使用Mx3005P(Stratagene公司制)，在下述的反应条件下进行定量PCR。
(ii)定量PCR的反应条件
于95℃10分钟的1个循环、
于95℃30秒钟、于55℃15秒钟及于72℃30秒钟的45个循环、
于95℃1分钟、于55℃30秒钟及于95℃30秒钟的1个循环。
为了制成标准曲线，制备3MeCG及3MeCT的各自的稀释系列。然后，对于这些进行定量PCR而制成标准曲线。基于此标准曲线，用上述的MeDIP法对回收的各DNA，从通过定量PCR法得到的Ct值算出拷贝数，将其作为甲基化DNA的回收量(拷贝)。
另外，对于上述的MeDIP法中使用的免疫沉降前的3MeCG待测样品及3MeCT待测样品进行定量PCR，从得到的Ct值算出拷贝数，将其作为输入DNA的回收量(拷贝)。从算出的甲基化DNA的回收量(拷贝)及输入DNA的回收量(拷贝)，根据以下的式(1)算出回收率(拷贝/拷贝)。
[回收率(拷贝/拷贝)]＝[甲基化DNA的回收量(拷贝)]/[输入DNA的回收量(拷贝)]...(1)
3.结果
表1及图5示通过由SCR2及SCR3得到的单克隆抗体、以及使用Diagenode公司的抗甲基化胞苷抗体的MeDIP法的3MeCG及3MeCT的回收率。
【表4】
如表1及图5所示，使用了Diagenode公司的抗甲基化胞苷抗体。
通过MeDIP法，在3MeCG和3MeCT的回收率之间，未见显著的差异。
另一方面知，在使用分别从SCR2及SCR3得到的单克隆抗体的MeDIP法中，相比3MeCT的回收率，3MeCG的回收率显著地更高。更具体而言知，由SCR2得到的单克隆抗体以3MeCT的325倍回收3MeCG。另外知，由SCR3得到的单克隆抗体以3MeCT的160倍回收3MeCG。
因此示，由SCR2及SCR3得到的单克隆抗体将甲基化CpG序列作为表位识别。
本申请与2009年9月28日申请的日本国专利申请特愿2009-222893号及2009年12月28日申请的日本国专利申请特愿2009-298213号相关，将这些的专利权利要求、说明书、附图及摘要的全部通过引用并入本说明书中。

Claims (3)

1.杂交瘤，其是以保藏号NITE BP-805号在独立行政法人制品评价技术基盘机构保藏的杂交瘤。
2.单克隆抗体，其由权利要求1所述的杂交瘤产生。
3.将甲基化DNA免疫沉降的方法，其包括：
使从活体样品提取的DNA成为单链DNA片段的步骤；
从单链DNA片段使用权利要求2所述的单克隆抗体将甲基化DNA免疫沉降的步骤；以及
回收免疫沉降的甲基化DNA的步骤。
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