KR20200037796A - 암 치료를 위한 염색체 불안정성 및 다운스트림 사이토졸 dna 시그널링의 표적화 - Google Patents

암 치료를 위한 염색체 불안정성 및 다운스트림 사이토졸 dna 시그널링의 표적화 Download PDF

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루이스 씨. 캔틀리
브라이언 엔고
사무엘 에프. 바쿰
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코넬 유니버시티
메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터
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Abstract

본원에 기술된 바와 같이, 염색체 비분리, 염색체 미세핵, 사이토졸 DNA 및 이들의 조합은 전이성 암의 지표이다. 염색체 불안정성, 예컨대, 염색체 비분리, 염색체 미세핵, 사이토졸 DNA 및 이들의 조합을 갖는 환자의 검출 및 치료에 유용한 방법 및 조성물이 본원에 기술된다. 예를 들어, 본 방법 및 조성물 중 일부는 키네신-13 단백질, 예컨대, Kif2b, MCAK/Kif2c 또는 KIF13A의 사용을 포함한다. 본 방법 및 조성물은 또한 STING, ENPP1, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 또는 이들의 임의의 조합의 억제제를 포함할 수 있다. 전이성 암을 포함하여 암의 치료에 유효한 화합물을 확인하는 방법이 또한 기술된다.

Description

암 치료를 위한 염색체 불안정성 및 다운스트림 사이토졸 DNA 시그널링의 표적화
본 출원은 2017년 7월 10일자로 출원된 미국 가출원 시리얼 제62/530,661호의 출원일에 우선권을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 구체적으로 원용된다.
연방 자금
본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 수여된 보조금 번호 CA197588 및 ARMY/MRMC에 의해 수여된 보조금 번호 W81XWH-16-1-0315에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
암은 신체의 여러 부분에서 비정상 세포의 제어되지 않은 성장이다. 현재 암은 수술, 방사선 요법, 화학 요법, 면역 요법 등에 의해 다양한 정도의 성공률로 치료될 수 있다. 그러나, 외과 요법은 광범위하게 전이된 종양 세포를 완전히 제거 할 수는 없다. 방사선 요법 및 화학 요법은 빠르게 증식하는 정상 세포의 존재 하에서 암 세포를 사멸시키기에 충분한 선택성을 갖지 않는다. 면역 요법은 크게 사이토카인 또는 치료적 암 백신의 사용으로 제한된다. 사이토카인은 심각한 독성을 유발할 수 있으며 백신을 지속적으로 사용하면 면역 내성이 생길 수 있다.
이전에는 사이토졸 DNA에 대한 주요 관심사 중 하나는 면역 반응을 유도한다는 것이었다. 그러나, 본원에 기술된 바와 같이, 염색체 불안정성은 사이토졸 DNA를 생성할 수 있으며, 이는 암 세포 전이의 발생률 및 가능성을 증가시킨다. 본원에 추가로 예시된 바와 같이, 염색체 불안정성, 예컨대, 염색체 비분리 및 미세핵은 또한 암 세포 전이의 발생률 및 가능성을 증가시킬 수 있다.
기술된 방법 조성물은 증가된 수준의 염색체 불안정성, 증가된 수준의 사이토졸 DNA, 염색체 비분리 또는 이들의 조합을 갖는 환자의 치료에 유용하다. 조성물 및 방법은 또한 전이, 암 약물 내성 또는 이들의 조합을 감소시키고/시키거나 억제할 수 있다. 일부 경우에, 조성물 및 방법은 키네신-13 발현을 조정하는데 유용하며, 조성물 및 방법은 염색체 불안정성을 감소시킬 수 있다.
예를 들어, 세포에서 키네신-13 단백질, 예컨대, Kif2b, MCAK/Kif2c 또는 KIF13A의 발현 및/또는 활성을 증가시킬 수 있는 방법 및 조성물이 본원에 기술된다. 일부 경우에, 방법 및 조성물은 ABCC4, ABCG2의 발현 및/또는 활성을 증가시킬 수 있다. 방법은 또한 포유 동물 세포에서 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1 또는 이들의 임의의 조합을 억제하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 조성물 및 방법은 전이성 암의 발생 및 진행을 포함하여 암의 진행을 치료 및 억제하는데 유용하다.
전이성 암을 포함하여 암의 치료에 유용한 새로운 화합물의 설계 및 개발에 대한 검정을 포함하는 다른 방법이 본원에 기술된다.
도 1a-1m은 염색체 이상이 인간 전이에서 만연하다는 것을 나타낸다. 도 1a는 매칭된 1차 종양 (P) 및 뇌 전이 (M)의 가중된 게놈 불안정성 지수 (wGII)를 그래프로 도시하며, 여기서, n = 61개의 1차 종양-전이 매칭된 쌍, 박스는 25th-75th 백분위수를 포괄하고, 바(bar)는 10th-90th 백분위수를 포괄하며, 유의성은 Wilcoxon 매칭된-쌍 부호의 순위 테스트(test)를 사용하여 시험하였다. RCC, 신장 세포 암종. 도 1ba는 전이와 매칭된 1차 유방 종양 사이의 wGII의 상이함을 그래프로 도시한다. 도 1bb는 전이와 매칭된 1차 폐 종양 사이의 wGII의 상이함을 그래프로 도시한다. 도 1bc은 전이와 매칭된 신장 세포 암종 1차 종양 사이의 wGII의 상이함을 그래프로 도시한다. 도 1bd는 전이와 매칭된 1차 종양 사이의 wGII의 상이함을 그래프로 도시한다. 도 1c는 Mitelman 데이터베이스에서 발견된 1차 (P) 유방 종양 (n = 637) 또는 전이 (M, n = 131) 중 클론의 수 (핵형에 기초함)를 그래프로 도시한다. 도 1d는 1차 유방 종양 (n = 983 클론) 또는 전이 (n = 186 클론)에서 발견된 클론 당 염색체 수의 Log2를 그래프로 도시한다. 도 1e는 1차 유방 종양 (n = 983 클론) 또는 전이 (n = 186 클론)에서 발견된 클론 당 염색체 이상의 수를 그래프로 도시한다. 도 1c-1e에서 박스는 25th-75th 백분위수를 포괄하고, 바는 10th-90th 백분위수를 포괄하며, 유의성은 2개의 꼬리를 갖는(tailed) Mann Whitney 테스트를 사용하여 시험하였다. 도 1f는 후기를 겪는 포르말린-고정된 파라핀-임베딩된 두경부 편평 세포 암종 세포의 이미지를 보여준다. 화살표는 염색체 비분리의 예를 가리키며, 스케일 바는 5-μm임. 도 1g는 임상적으로 검출 가능한 림프절 전이가 있는 환자 (N+, n = 22명의 환자) 또는 없는 환자 (N-, n = 18명의 환자)로부터의 종양에서 염색체 비분리의 증거를 나타내는 후기 세포의 백분율을 그래프로 도시한다. 박스는 25th-75th 백분위수를 포괄하고, 바는 10th-90th 백분위수를 포괄하며, 유의성은 2개의 꼬리를 갖는 Mann Whitney 테스트를 사용하여 시험하였다. 도 1h는 매칭된 1차 종양의 가중된 게놈 불안정성 지수 (wGII)의 함수로서 뇌 전이의 wGII를 그래프로 도시한다. 빨간색 선은 선형 회귀를 나타낸다. 도 1i는 1차 및 전이성 유방암으로부터 유래되고 도 1d-1e에서 도시된 샘플에서 주어진 클론 중 총 염색체 수의 함수로서 클론 당 염색체 이상의 수를 그래프로 도시하며, 데이터 포인트(point)는 평균 ± SD를 나타낸다. 도 1j는 염색체 비분리 빈도의 함수로서 N- 또는 N+ 환자(CIN-저(low) 및 CIN-고(high)에 대해 n = 20명의 환자)의 백분율을 그래프로 도시하고, 유의성은 Fisher Exact 테스트를 사용하여 시험하였다. 도 1k는 다양한 키네신-13 단백질을 발현하는 MDA-MB-231 세포에 대한 시간의 함수로서 세포 밀집도(cell confluence)를 그래프로 도시한다. 데이터 포인트는 평균 ± SD을 나타내고, n = 4번의 실험임. 도 1l은 로딩 대조군으로서 사용된 항-GFP 항체, β-액틴을 사용하여 염색된 다양한 GFP-태깅된 키네신-13 단백질을 발현하는 세포의 면역 블롯을 나타낸다. 도 1m은 미세소관 (DM1A), 중심체 (페리센트린) 및 DNA (DAPI)에 대해 염색된 MCAK 및 dnMCAK를 발현하는 세포를 나타내며, 스케일 바는 5-μm임.
도 2a-2j는 염색체 불안정성 (CIN)이 전이의 원동력임을 나타낸다. 도 2a는 항-동원체 단백질 (ACA) 및 DNA (DAPI)에 대해 염색된 후기 세포를 나타내며, 스케일 바는 5-μm임. 도 2ba은 대조군 세포 또는 키네신-13 단백질을 발현하는 세포에서 염색체 비분리의 증거를 나타내는 MDA-MB-231 후기 세포의 백분율을 그래프로 도시하고, 바는 평균 ± SD, n = 150개의 세포, 3번의 실험을 나타내고, 유의성은 2개의 꼬리를 갖는 t-테스트를 사용하여 시험하였다. 도 2bb는 대조군 세포 또는 키네신-13 단백질을 발현하는 세포에서 염색체 비분리의 증거를 나타내는 후기 H2030 세포의 백분율을 그래프로 도시하고, 바는 평균 ± SD, n = 150개의 세포, 3번의 실험을 나타내고, 유의성은 2개의 꼬리를 갖는 t-테스트를 사용하여 시험하였다. 도 2c는 상이한 키네신-13 단백질을 발현하는 MDA-MB-231 세포로 심장 내 주입 후 5 주에 이미지화된 전체 동물의 광자 플럭스(flux) (p/s)를 그래프로 도시한다. 유의성은 양측(two-sided) Mann Whitney 테스트를 사용하여 시험하였으며, n = 그룹 당 7-14 마리의 마우스, 4번의 독립적인 실험임. 도 2d는 상이한 키네신-13 단백질을 발현하는 MDA-MB-231 세포로 심장 내 주입 후 5 주에 이미지화된 전체 동물의 광자 플럭스 (p/s)의 이미지를 도시한다. 도 2e는 다양한 수준의 염색체 불안정성을 갖는 MDA-MB-231 세포를 주입한 마우스의 질환-특이적 생존을 그래프로 도시한다: CIN-고 (dnMCAK; 시간에 따른 가장 낮은 생존을 나타내는 가장 왼쪽 그래프), CIN-중(medium) (대조군, Kif2a, 또는 튜불린; 시간 경과에 따른 중간 수준의 생존을 나타내는 중간 그래프) 또는 CIN-저 (MCAK 또는 Kif2b; 시간 경과에 따른 대부분의 생존을 나타내는 가장 오른쪽 그래프), n = CIN-고의 경우 10마리의 마우스, CIN-중의 경우 23마리의 마우스 및 CIN-저의 경우 20마리의 마우스, 페어와이즈(pairwise) 유의성은 log-순위 테스트로 시험하였다. 도 2fa은 30일 동안 분할될 수 있는 모 MDA-MB-231 세포 #2로부터의 대표적인 핵형 (DAPI607 밴딩)을 나타낸다. 도 2fb는 30일 동안 분할될 수 있는 모 MDA-MB-231 세포 #4로부터의 대표적인 핵형 (DAPI607 밴딩)을 나타낸다. 도 2g는 30일 동안 분할될 수 있는 단일 MCAK 발현 세포로부터 유래된 세포의 대표적인 핵형 (DAPI607 밴딩)을 나타낸다. 도 2h는 30일 동안 분할될 수 있는 단일 Kif2a 발현 세포로부터 유래된 세포의 대표적인 핵형 (DAPI607 밴딩)을 나타낸다. 도 2i는 CIN-저 (MCAK; 각 염색체에 대한 왼쪽 바) 또는 CIN-중/고 (대조군, Kif2a, dnMCAK; 각 염색체에 대한 오른쪽 바) MDA-MB-231 세포 중 비클론성 (단일 클론 중 <25%의 세포가 존재함) 신염색체(neochromosome)의 수를 그래프로 도시한다. 'Mar'은 통상적인 밴딩에 의해 명확하게 확인될 수 없는 구조적으로 비정상적인 염색체를 나타내며, 바는 평균 ± SD, n = 7개의 클론 집단으로부터 140개의 세포를 나타내고, 유의성은 이원분산(two-way) ANOVA 테스트를 사용하여 시험하였다. 도 2j는 단일 Kif2a-발현 세포로부터 유래된 동일한 클론 집단에 속하는 6개의 별개의 세포로부터 취한 염색체의 예시를 보여 주며, 이는 다른 별개의 염색체와 염색체 22를 수반하는 수렴 전좌를 나타낸다.
도 3a-3m은 1차 종양 및 전이에서 염색체 불안정성 (CIN)에 대한 반대 역할을 설명한다. 도 3a는 도 3b-3e에 도시된 샘플의 수집 방법을 나타낸 개략도이며, 본래의 개략도의 세포의 색은 도 3b-3e의 바의 색과 일치한다. 도 3ba은 1차 종양 및 간 전이로부터 유래된 1차 계대 세포에서의 염색체 비분리의 증거를 설명하기 위해, ER 유방암 아형에 속하는 전이-수용성 환자-유래 이종이식편 (PDX)에서 발생하는 후기 세포의 백분율을 그래프로 도시한다. 도 3bb는 1차 종양 및 간 전이로부터 유래된 제1 계대 세포에서의 염색체 비분리의 증거를 설명하기 위해, TNBC 유방암 아형에 속하는 전이-수용성 환자-유래 이종이식편 (PDX)에서 발생하는 후기 세포의 백분율을 그래프로 도시한다. 도 3c는 주입된 세포, 1차 종양으로부터 유래된 제1 계대 세포, 동일한 동물에서 1차 종양으로부터 발생하는 자발적 전이 및 직접 심장 내 이식으로부터 획득한 전이에서 염색체 비분리의 증거를 설명하기 위해, CIN-저 세포에서 발생하는 후기 세포의 백분율을 그래프로 도시한다. 도 3d는 주입된 세포, 1차 종양으로부터 유래된 제1 계대 세포, 동일한 동물에서 1차 종양으로부터 발생하는 자발적 전이 및 직접 심장 내 이식으로부터 획득한 전이에서 염색체 비분리의 증거를 설명하기 위해, CIN-중 (Kif2a) 세포에서 발생하는 후기 세포의 백분율을 그래프로 도시한다. 도 3e는 주입된 세포, 1차 종양으로부터 유래된 제1 계대 세포, 동일한 동물에서 1차 종양으로부터 발생하는 자발적 전이 및 직접 심장 내 이식으로부터 획득한 전이에서 염색체 비분리의 증거를 설명하기 위해, CIN-고 (dnMCAK) 세포에서 발생하는 후기 세포의 백분율을 그래프로 도시한다. 도 2b-2e의 경우, 바가 평균 ± SD, n = 150개의 세포, 3번의 독립적인 실험을 나타내며, * p <0.05이고, 주입된 라인보다 더 높은 비분리 비율을 갖는 샘플을 나타내며, # p <0.05이고, 주입된 라인보다 더 낮은 비분리 비율을 갖는 샘플을 나타내고, ** p <0.05이고, 이는 동일한 동물, 2개의 꼬리를 갖는 t-검정으로부터의 전이 및 매칭된 1차 종양 사이의 유의한 상이함을 나타낸다. ST met, 연조직 전이. 도 3f는 CIN-저 (MCAK 및 Kif2b) 및 CIN-중/고 (대조군, Kif2a 및 dnMCAK) MDA-MB-231 세포 사이의 차별적으로 발현된 유전자의 변화를 나타내는 Volcano 플롯을 도시한다. 우측 상부 영역의 데이터 포인트 (2.6보다 큰 Log2)는 염색체 불안정성 (CIN) 시그니처(signature)를 결정하기 위해 후속으로 사용되는 유전자에 상응한다. 도 3g는 TAVAZOIE_전이 유전자 세트에 대한 풍부화도 플롯이다. 도 3h는 환자의 메타 분석에서 CIN 시그니처 유전자의 높은 (CIN-고; 낮은 그래프 라인) 또는 낮은 (CIN-저; 상부 그래프 라인) 발현을 갖는 환자의 원격 무전이 생존 (DMFS) 플롯을 보여준다. 도 3i는 171 명 환자의 검증 코호트에서 CIN 시그니처 유전자의 높은 (CIN-고; 낮은 그래프 라인) 또는 낮은 (CIN-저; 상부 그래프 라인) 발현을 갖는 환자의 원격 무전이 생존 (DMFS) 플롯을 보여준다. 실시예 1에서 언급된 바와 같이, CIN 시그니처 유전자는 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, FGF5, NTN4를 포함한다. 도 3j-3m은 염색체 불안정성이 전이의 형성 및 유지를 촉진한다는 것을 설명한다. 도 3ja은 키네신-13 단백질을 발현하는 MDA-MB-231 세포를 주입한 전체 동물의 시간에 따른 정규화된 광자 플럭스 플롯을 그래프로 도시한다. 바는 평균 ± s.e.m. n = 7-14 그룹 당 마우스를 나타낸다. 도 3jb는 질병 부담이 생물 발광을 사용하여 추적되는 dnMCAK를 발현하는 MDA-MB-231 세포로 주입된 마우스의 이미지를 보여준다. 도 3jc은 질병 부담이 BLI를 사용하여 추적되는 Kif2b를 발현하는 MDA-MB-231 세포로 주입된 마우스의 이미지를 보여준다. 도 3k는 대조군 또는 MCAK 발현 H2030 세포를 이용하여 심장 내 주입 후 5 주에 이미지화된 전체 동물의 광자 플럭스 (p/s)를 도시한다. 유의성은 양측 Mann Whitney 테스트, MCAK 그룹에서 n = 10마리의 마우스 및 대조군에서 5마리의 마우스를 사용하여 시험하였다. 도 3l은 종양 절제 전 (33 일차) 및 후 (90 일차)에 MDA-MB-231 세포로 동소 이식된 마우스의 대표적인 BLI 이미지를 보여준다. 90 일차에 dnMCAK 발현 세포가 이식된 마우스에서 전이가 검출될 수 있다. 도 3m은 다양한 수준의 염색체 불안정성을 갖는 MDA-MB-231 세포로 동소 이식된 마우스의 원격 무전이 생존 (DMFS)을 보여준다. 도시된 바와 같이, CIN-저 세포를 수용한 동물은 모두 생존한 반면 (상단 그래프 라인), CIN-중 세포를 수용한 대부분의 동물은 생존하였으나 (중간 그래프 라인), CIN-고 세포를 수용한 대부분의 동물은 생존하지 않았으며(하단 그래프 라인), n = 5-9 마우스 그룹, 페어와이즈 유의성은 log-순위 테스트로 시험하였다.
도 4a-4h는 염색체 불안정성이 중간엽 세포 특성을 풍부하게 한다는 것을 예시한다. 도 4a는 6,821개의 세포 (열) 및 상피에서 중간엽으로의 이행 (EMT, 행)에 관여하는 유전자의 유전자 발현 열지도를 보여준다. 검정 사각형은 중간엽 특성이 풍부한 유전자-세포 클러스터를 나타낸다. 도 4b는 비지도 K-최근접 근처(unsupervised K-nearest neighbor) 그래프 이론을 사용하여 확인된 12개의 하위집단을 갖는 6,821 MCAK, Kif2b 및 dnMCAK 발현 세포의 t-분포 확률적 임베딩(t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE)) 투영을 도시한다. 히트맵은 각 하위집단의 차등적으로 발현된 유전자의 유전자 세트 풍부화도 분석으로부터 유추된 FDRq <0.05를 갖는 유전자 세트에 대한 정규화된 풍부화도 점수 (NES)를 보여준다. 도 4c는 β-액틴, 비멘틴 및 DNA에 대해 염색된 MCAK 또는 dnMCAK를 발현하는 세포의 대표적인 이미지를 보여주며, 스케일 바는 50-μm임. 도 4d는 배양 18 시간 내에 콜라겐 막을 통해 침입한 세포의 대표적인 이미지를 보여준다. 도 4e는 배양 18 시간 내에 콜라겐 막을 통해 침입한 세포의 수를 그래프로 도시한다 (도 4d 참고). 바는 평균 ± SEM을 나타내고, * p <0.05, ** p <0.01, 양측 Mann Whitney 테스트, n = 10개의 고출력(high-power) 필드, 2번의 독립적인 실험. 도 4f는 벌크 RNA 발현 데이터에 기초하여 상이한 키네신-13 단백질을 발현하는 MDA-MB-231 세포의 주 성분 분석 (PCA) 플롯을 도시한다. 도 4g는 CIN-저 세포 (MCAK 및 Kif2b)와 비교하여 CIN-중/고 (대조군, Kif2a 및 dnMCAK)에서 고도로 풍부한 HALLMARK 유전자 세트의 유전자 세트 풍부화도 분석 (GSEA)의 결과를 도시한다. 도 4h는 정규화된 풍부화도 점수 대 거짓 발견률 (False Discovery Rate (FDR))의 플롯을 도시한다.
도 5a-5i는 염색체적으로 불안정한 세포에서 사이토졸 DNA로부터의 세포 내인성 염증을 설명한다. 도 5a는 발현 모듈을 나타내는 유전자-유전자 상관 관계 히트맵을 나타내고, HALLMARKS 유전자 세트는 모듈 2와 가장 유의하게 상관 관계가 있다. NES, 정규화된 풍부화도 점수. 도 5b는 키네신-13 발현 상태 또는 주요 유전자 시그니처의 발현 수준으로 표지된 6,821개의 MCAK, Kif2b 및 dnMCAK 발현 세포의 tSNE 투영 (상기)을 도시한다. 주요 유전자 시그니처 사이의 단일 세포 상관 관계 플롯이 하기에 도시되어 있다. 도 5ca은 ACA 및 DAPI로 염색된 세포에서 1차 핵 근처의 미세핵의 대표적인 이미지를 보여준다, 스케일 바는 5-μm임. 도 5cb는 다양한 키네신-13 단백질을 발현하는 MDA-MB-231 세포에서 미세핵의 백분율을 그래프로 도시한다. 도 5cc은 다양한 키네신-13 단백질을 발현하는 H2030 세포에서 미세핵의 백분율을 그래프로 도시한다. 도 5cb 및 5cc에서의 박스는 중앙값, 4분위 범위(inter-quartile range)를 포괄하며, 바는 5th-95th 백분위수를 포괄하며, n= 638-1127개의 세포, 10개의 고출력 필드, 3번의 독립적인 실험, 유의성은 양측 Mann Whitney 테스트를 사용하여 시험하였다. 도 5d는 이전에 도 3c-3e에 도시된 1차 종양 및 전이로부터 유래된 세포에서 미세핵의 백분율을 그래프로 도시한다. 바는 중앙값 및 사분위 범위를 나타내며, n = 10개의 1차 종양 및 28개의 전이, 500-1500 세포/샘플, 유의성은 양측 Mann Whitney 테스트를 사용하여 시험하였다. 도 5e는 모든 주입된 세포주 뿐만 아니라 1차 종양 및 전이로부터 유래된 세포에서 염색체 비분리의 증거를 나타내는 세포의 백분율과 미세핵의 백분율 사이의 상관 관계를 그래프로 도시한다. 도 5f는 DNA (DAPI), 사이토졸 이중 가닥 DNA (항-dsDNA 항체 사용) 또는 단일 가닥 DNA (항-ssDNA 항체 사용)에 대해 염색된 MCAK 및 dnMCAK 발현 세포를 도시하며, 스케일 바는 20-μm임. 도 5g는 CIN-중/고 및 CIN-저 MDA-MB-231 및 H2030 세포에서 정규화된 사이토졸 대 핵 DNA 비율을 그래프로 도시한다. 바는 평균 ± SD를 나타내며, 유의성은 양측 Mann Whitney 테스트를 사용하여 시험하였다. 도 5h는 DNA (DAPI), 사이토졸 DNA (dsDNA) 또는 Dnase2 (RFP 리포터)에 대해 염색된 세포를 도시하며, 스케일 바는 10-μm이고, 화살표는 Dnase2 발현 세포를 나타낸다. 도 5i는 DNA (DAPI), 사이토졸 DNA (dsDNA) 또는 mCherry-Lamin B2에 대해 염색된 세포를 도시하며, 스케일 바는 10-μm이고, 화살표는 mCherry-Lamin B2 발현 세포를 나타낸다.
도 6a-6j는 사이토졸 DNA에 대한 세포 반응으로부터의 전이를 설명한다. 도 6a는 DAPI (DNA), 사이토졸 DNA (dsDNA), 또는 항-cGAS 항체를 사용하여 염색된 세포를 도시하며, 스케일 바는 5-μm임. 도 6b는 키네신-13 단백질 (또는 라민 B2 및 dnMCAK)를 발현하는 세포 중 cCAS 국소화를 포함하는(cGAS+) 미세핵 또는 포함하지 않는(cGAS-) 미세핵의 백분율을 그래프로 도시하며, n = 400개의 세포, 2번의 실험, 유의성은 양측 Mann Whitney 테스트를 사용하여 시험하였다. 도 6c는 로딩 대조군으로서 β-액틴이 사용된, 상이한 키네신-13 단백질 또는 STING shRNA (dnMCAK)를 발현하는 세포로부터의 용해물의 면역 블롯을 보여준다. 도 6d는 CIN-중/고 세포 (대조군, Kif2a 및 dnMCAK), CIN-저 세포 (Kif2b 및 MCAK) 또는 STING-고갈된 dnMCAK 발현 세포 (STING shRNA)로부터의 인산화된 p100-대-총 p100 (위) 및 p52-대-p100 (아래) 단백질 수준의 정규화된 비율을 나타낸다. 바는 평균 ± s.e.m.을 나타내고, * p <0.05, ** p <0.01, 양측 Mann Whitney 테스트, n = 4개의 생물학적 복제물을 나타낸다. 도 6e는 RelB 및 DNA (DAPI)에 대해 염색된 MCAK, dnMCAK 발현 세포, 및 대조군 또는 STING shRNA를 발현하는 세포를 나타내고, 화살표는 RelB-양성 핵을 가리키고, 스케일 바는 20-μm임. 도 6f는 낮은 (<30th 백분위수) 또는 높은 (> 30th 백분위수) 염색체 불안정성 유전자 발현 시그니처를 갖는 유방암 환자에서 CIN-반응성 비정규 NF-κB 표적 유전자의 평균 z-정규화된 발현을 도시하며, 박스는 사분위 범위를 포괄하며, 바는 10th-90th 백분위를 포괄하고, 유의성은 양측 Mann Whitney 테스트를 사용하여 시험하였다. 도 6ga은 대조군 shRNA 또는 STING shRNA를 발현하는 세포로 심장 내 주입 후 5 주에 이미지화된 전체 동물의 광자 플럭스(p/s)를 그래프로 도시한다. 유의성은 양측 Mann Whitney 테스트를 사용하여 시험하였으며, n = 대조군에서 9 마리의 마우스 및 STING shRNA 그룹에서 16 마리의 마우스임. 도 6gb는 대조군 shRNA 또는 STING shRNA를 발현하는 세포로 심장 내 주입 후 5 주에 이미지화된 전체 동물을 보여준다. 도 6h는 배양 24 시간 이내에 콜라겐 막을 통해 침입한 DNA 감지 또는 비정규 NF-κB 경로에서 shRNA 표적화 유전자를 발현하는 세포의 수를 그래프로 도시한다. 바는 평균 ± s.e.m.을 나타내며, ** p <0.0001, 양측 Mann Whitney 테스트, n = 10개의 고출력 필드, 2번의 실험. 도 6i-6j는 단일 세포 시퀀싱 및 집단 검출을 설명한다. 도 6i는 도 4b에 제시된 모든 하위집단의 세포성 구성성분을 도시한다. 도 6j는 잔류 하위집단과 비교하여 상피에서 중간엽으로의 이행 (EMT) 및 염색체 불안정성 유전자 (하위집단 'M')에 대해 풍부한 세포의 하위집단에서의 주요 전이 및 침습 유전자의 발현을 나타내는 바이올린 플롯을 도시하며, 하위집단은 비지도 K-최근접 근처 그래프 이론을 사용하여 확인되었다.
도 7a-7f는 염색체 불안정성이 전이를 촉진하면서 동시에 많은 양의 면역 침윤물을 유발하는 바이러스-유사 면역 반응을 촉진한다는 것을 나타낸다. 도 7a는 염색체 불안정성이 많은 양의 면역 침윤물을 촉진시키는 바이러스-유사 면역 반응을 촉진한다는 것을 보여준다. 도 7b는 염색체 불안정성 (CIN)이 사이토졸 DNA에 대한 종양 세포 내인성 염증 반응을 통해 전이와 종양 면역 침윤물이 연결되어 있음을 나타내는 개략도이다. 도 7ca은 상처 생성 후 36 시간에 상처 부위에서의 세포의 대표적인 위상차 이미지를 나타낸다. 도 7cb는 상이한 키네신-13 단백질을 발현하는 세포 길이 대 폭 비율을 그래프로 도시한다. 도 7ca 및 7cb에서, 바는 사분위 범위를 포괄하며, n = 100개의 세포, 2번의 실험, ** p <0.0001, Mann Whitney 테스트. 도 7da은 β-카테닌 또는 DNA (DAPI)로 염색된 MCAK (CIN-저)를 발현하는 대표적인 세포를 나타내며, 스케일 바는 30-μm임. 도 7db는 β-카테닌 또는 DNA (DAPI)로 염색된 dnMCAK (CIN-고)를 발현하는 대표적인 세포를 나타내며, 스케일 바는 30-μm임. 도 7ea은 키네신-13 단백질을 발현하는 세포의 상처 치유 검정의 위상차 이미지를 도시하며, 스케일 바는 800-μm임. 도 7eb는 상처 생성 후 24h 및 45h에 상처 영역 (0h 시점으로 정규화됨)을 그래프로 도시한다. * p <0.05, 2개의 꼬리를 갖는 t-테스트. 도 7fa은 배양 18 시간 내에 8-μm 공극을 함유하는 폴리카보네이트 막을 통해 침입한 세포의 이미지를 보여준다. 7fb는 막의 바닥으로부터 긁힌 세포의 정규화된 광학 밀도 (O.D.)를 그래프로 도시하며, 바는 평균 ± s.e.m.을 나타내고, * p <0.05, 양측 t-테스트, n = 3번의 실험.
도 8a-8c는 염색체 불안정성이 미세핵 및 사이토졸 dsDNA를 생성한다는 것을 설명한다. 도 8a는 도 3c에 도시된 CIN-저 샘플에서 미세핵의 백분율을 그래프로 도시한다. 도 8b는 도 3d에 도시된 CIN-저 샘플에서 미세핵의 백분율을 그래프로 도시한다. 도 8c는 도 3e에 도시된 CIN-저 샘플에서 미세핵의 백분율을 그래프로 도시한다. 도 8a-8c에서 : 주입된 세포, 1차 종양으로부터 유래된 제1 계대 세포, 또는 전이 (1차 종양으로부터 발생하는 일부 자발적 전이, 직접 심장 내 이식으로부터 획득된 일부 전이). 바는 평균 ± s.e.m.을 나타내고, n = 500-1500개의 세포/샘플을 포함하는 10개의 고출력 필드, 3번의 실험, * p <0.05이고 주입된 라인보다 더 높은 비분리 비율을 갖는 샘플을 나타내며, # p <0.05이고 주입된 라인보다 더 낮은 비분리 비율을 갖는 샘플을 나타내며, ** p <0.05이고 동일한 동물로부터의 전이 및 매칭된 1차 종양 사이에 유의한 상이함을 나타내며, 2개의 꼬리를 갖는 t-테스트.
도 9a-9m은 예후에 대한 사이토졸 DNA 감지 경로의 효과를 설명한다. 도 9a는 대조군 shRNA 또는 STING shRNA를 공동 발현하는 dnMCAK 발현 세포로 주입한 마우스의 질환-특이적 생존을 그래프로 도시하며, n = 대조군에서 9 마리 마우스 및 STING shRNA 군에서 16 마리 마우스, 유의성은 log-순위 테스트로 시험하였다. 도시된 바와 같이, STING shRNA의 발현에 의한 STING 발현의 감소는 dnMCAK 발현 세포의 생존을 증가시킨다. 도 9b는 높은 수준 및 낮은 수준의 비정규 NF-κB 조절인자(여기서, NFKB2, RelB, MAP3K14는 NF-κB를 양성 조절하고, TRAF2, TRAF3, BIRC2, BIRC3은 NF-κB를 음성 조절함)를 발현하는 유방암 환자의 시간 경과에 따른 원격 무전이 생존 (DMFS)을 그래프로 도시한다. 도시된 바와 같이, 이러한 비정규 NF-κB의 조절인자의 낮은 수준의 발현은 생존을 개선시킨다. 도 9c는 높은 수준 및 낮은 수준의 CIN-반응성 비정규 NF-κB 표적 (여기서, PPARG, DDIT3, NUPR1, RAB3B, IGFBP4, LRRC8C, TCP11L2, MAFK, NRG1, F2R, KRT19, CTGF, ZFC3H1은 양성 조절하고, MACROD1, GSTA4, SCN9A, BDNF, LACTB는 CIN-반응성 비정규 NF-κB 표적을 음성 조절함)을 발현하는 유방암 환자의 시간 경과에 따른 원격 무전이 생존 (DMFS)을 그래프로 도시한다. 도시된 바와 같이, 이러한 CIN-반응성 비정규 NF-κB 표적의 하향 조절은 생존을 개선시킨다. 도 9d는 높은 수준 및 낮은 수준의 정규 NF-κB (NFKB1, RelA, TRAF1, TRAF4, TRAF5, TRAF6)의 조절인자를 발현하는 유방암 환자의 시간 경과에 따른 원격 무전이 생존 (DMFS)을 그래프로 도시한다. 도시된 바와 같이, 이러한 정규 NF-κB의 조절인자의 증가된 발현은 생존을 개선시킨다. 도 9e는 높은 수준 및 낮은 수준의 인터페론 시그널링(signaling)의 조절인자 (IRF1, IRF3, IRF7, TBK1)를 발현하는 유방암 환자의 시간 경과에 따른 원격 무전이 생존 (DMFS)을 그래프로 도시한다. 도시된 바와 같이, 이러한 인터페론 시그널링의 조절인자의 증가된 발현은 생존을 개선시킨다. 도 9f는 높은 수준 및 낮은 수준의 비정규 NF-κB의 조절인자를 발현하는 유방암 환자의 시간 경과에 따른 무재발 생존(RFS)을 그래프로 도시한다. 도시된 바와 같이, 낮은 수준의 비정규 NF-κB의 조절인자의 발현은 생존을 개선시킨다. 도 9g는 높은 수준 및 낮은 수준의 CIN-반응성 비정규 NF-κB 표적을 발현하는 유방암 환자의 시간 경과에 따른 무재발 생존 (RFS)을 그래프로 도시한다. 도시된 바와 같이, 약간 더 높은 수준의 CIN-반응성 비정규 NF-κB 표적의 발현은 생존을 다소 개선시킨다. 도 9h는 높은 수준 및 낮은 수준의 정규 NF-κB의 조절인자를 발현하는 유방암 환자의 시간 경과에 따른 무재발 생존 (RFS)을 그래프로 도시한다. 도시된 바와 같이, 정규 NF-κB의 조절인자의 증가된 발현은 생존을 개선시킨다. 도 9i는 높은 수준 및 낮은 수준의 인터페론 시그널링의 조절인자를 발현하는 유방암 환자의 시간 경과에 따른 무재발 생존 (RFS)을 그래프로 도시한다. 도시된 바와 같이, 인터페론 시그널링의 조절인자의 증가된 발현은 생존을 개선시킨다. 도 9j는 높은 수준 및 낮은 수준의 비정규 NF-κB의 조절인자를 발현하는 폐암 환자의 시간 경과에 따른 무진행 생존 (PFS)을 그래프로 도시한다. 도시된 바와 같이, 비정규 NF-κB의 조절인자의 감소된 발현은 생존을 개선시킨다. 도 9k는 높은 수준 및 낮은 수준의 CIN-반응성 비정규 NF-κB 표적을 발현하는 폐암 환자의 시간 경과에 따른 무진행 생존 (PFS)을 그래프로 도시한다. 도시된 바와 같이, CIN-반응성 비정규 NF-κB 표적의 감소된 발현은 생존을 개선시킨다. 도 9l은 높은 수준 및 낮은 수준의 정규 NF-κB의 조절인자를 발현하는 폐암 환자의 시간 경과에 따른 무진행 생존 (PFS)을 그래프로 도시한다. 도시된 바와 같이, 정규 NF-κB의 조절인자의 증가된 발현은 생존을 개선시킨다. 도 9m은 높은 수준 및 낮은 수준의 인터페론 시그널링의 조절인자를 발현하는 폐암 환자의 시간경과에 따른 무진행 생존 (PFS)을 그래프로 도시한다. 도시된 바와 같이, 인터페론 시그널링의 조절인자의 증가된 발현은 생존을 개선시킨다.
도 10a-10b는 cGAMP의 정량을 나타낸다. 도 10a는 LC-MS에 의해 검출될 수 있는 cGAMP 이행을 나타낸다. 도 10b는 표적화된 LC-MS 대사체학을 사용하여 염색체적으로 불안정한 소변 삼중-음성 유방암 세포 (4T1)에서 cGAMP의 정량을 그래프로 도시한다. 도시된 바와 같이, 4T1 세포에서 cGAS의 녹다운(knockdown)은 cGAMP의 존재비를 감소시킨다.
본원에 예시된 바와 같이, 인간 전이는 이의 1차 종양 대응물과 비교하여 유의하게 염색체적으로 보다 불안정하다. 보다 구체적으로, 진행중인 염색체 분리 오류 및 미세핵 또는 사이토졸 DNA의 존재는 염색체 분리 오류의 증가가 전이-개시 종양 세포 하위집단을 풍부하게 하기 때문에 전이를 예측한다. 반대로, 염색체 불안정성의 감소는 고도의 이수체-그러나 안정한-세포에서도 전이 발생의 내구성 억제로 이어진다. 본원에 기술된 방법 및 조성물은 이러한 염색체 불안정성 및 전이성 암을 검출, 모니터링 및 치료하는데 유용하다.
암 검출 및 모니터링
본원에 예시된 바와 같이, 염색체 불안정성은 대상체가 암을 갖는다는 것을 나타내는 마커이며, 염색체 불안정성은 전이성 암을 예측, 검출 및 모니터링하는데 특히 유용하다. 인간 고형 종양의 많은 백분율 (60-80%)은 염색체 불안정성을 함유한다. 따라서, 암, 특히, 전이성 암을 진단하는 방법이 본원에 기술된다. 이러한 방법은 전이성 암을 포함하여 암을 예측, 검출, 모니터링 및 치료하는데 놀랍게 유효하다. 본원에 기술된 치료 방법은 전이성 암을 예측, 검출 및 모니터링하는 방법과 짝을 이룰 수 있다.
예를 들어, 암 (전이성 암 포함)을 예측, 검출 및 모니터링하는 한 가지 방법은 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계; 및 샘플 내의 세포가 염색체 불안정성을 나타내는지 여부를 검출 및/또는 정량화하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 또한 염색체 불안정성이 대상체 샘플에서 검출되는 경우 대상체를 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 하나의 방법은 염색체 불안정성의 검출 가능한 수준을 갖는 세포 또는 조직을 갖는 대상체의 치료를 개시하거나 치료를 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 치료는 전이성 암의 발생 또는 진행을 감소시킬 수 있는 약제의 투여를 포함한다.
본원에 사용된 "시험 샘플을 수득하는 단계"는 환자로부터 조직 또는 체액 샘플을 제거하고/하거나, 환자로부터 조직 또는 체액 샘플을 받고/받거나, 의사로부터 환자의 조직 또는 체액 샘플을 받고/받거나, 우편 배달을 통해 환자의 조직 또는 체액을 받고/받거나, 저장 장치 (예컨대, 냉장고 또는 냉동고) 또는 시설로부터 환자의 조직 또는 체액 샘플을 제거하는 단계를 포함한다. 따라서, 시험 샘플을 수득하는 단계는 환자로부터 직접 시험 샘플의 제거 또는 수령을 포함할 수 있지만, 시험 샘플을 수득하는 단계는 또한 의료인으로부터, 저장 장치/시설, 의료 시설에서 운송 후 우편 배달 서비스, 및 이들의 임의의 조합으로부터 간접적으로 시험 샘플의 수령을 포함할 수 있다. 따라서 시험 샘플은 한 위치에서 시작하여 샘플이 수령되어 시험되는 다른 위치로 운송될 수 있다. 임의의 이러한 활동들 또는 활동들의 조합은 "시험 샘플을 수득하는 단계"를 포함한다. 시험 샘플은 체액 또는 조직 샘플일 수 있다. 예를 들어, 시험 샘플은 암 세포를 함유하는 것으로 의심되는 세포 샘플일 수 있다. 샘플은 하나 이상의 1차 종양으로부터의 세포 및/또는 조직, 1차 종양으로부터 유래된 종양 세포, 순환으로부터 정제된 종양 세포, 전이성 세포 샘플 또는 전이성 종양으로부터 유래된 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어 증가된 염색체 불안정성이 보다 공격적인 질환의 마커이기 때문에, 샘플은 확립된 전이로부터의 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 유방 또는 폐 조직 (또는 본원에 언급된 임의의 조직 유형)의 조직 생검일 수 있다. 다른 예에서, 암 (특히 전이성 암)을 예측, 검출 또는 모니터링하기 위해 일부 암 마커 (예컨대, cGAMP 수준)를 검출하는 경우, 샘플은 체액, 예컨대, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 복수액, 림프액, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 샘플 내의 세포가 염색체 불안정성을 나타내는 지의 여부를 검출 및/또는 정량화하는 단계는 샘플의 세포에서 미세핵, 염색체 비분리 또는 사이토졸 염색체 DNA를 검출 및/또는 정량화하는 단계를 포함할 수 있다. 미세핵, 염색체 비분리, 사이토졸 DNA 또는 이들의 조합을 검출 및/또는 정량화하는 단계는, 예를 들어, 현미경을 통해 세포 염색체를 검사하고, 미세핵, 염색체 비분리, 사이토졸 DNA, 또는 이들의 조합의 수(들)를 카운팅함으로써 수행될 수 있다.
일부 경우에, 세포 샘플은 고정 및/또는 용해될 수 있다. 후기 세포는 분석을 위해 선택될 수 있다. 염색체는 예를 들어 가시화를 개선하기 위해 프로테아제 (예컨대, 트립신)로 처리될 수 있다. 일부 경우에, 염색체는 염색체 또는 DNA의 가시화를 용이하게 하는 염료 또는 표지된 항체로 염색될 수 있다. 사용될 수 있는 염료의 예는 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색제, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 염색제, 퀴나크린 염색제, 젬사 염색제 및 다른 염색체 또는 DNA 염색제가 포함된다.
암, 특히, 전이성 암은 예를 들어, 10% 이상, 또는 11% 이상, 또는 12% 이상, 또는 13% 이상, 또는 14% 이상, 또는 15% 이상의 염색체가 비분리를 나타내는 경우, 예측, 검출 또는 진행 중일 수 있다. 일부의 경우에, 암, 특히 전이성 암은 약 15-20%의 염색체가 비분리를 나타내는 경우, 예측, 검출 또는 진행 중일 수 있다.
미세핵은 염색체 비분리보다 쉽게 확인될 수 있다. 암, 특히, 전이성 암은 예를 들어, 세포의 3% 이상, 4% 이상, 또는 5% 이상의 세포가 미세핵을 나타내는 경우, 예측, 검출될 수 있거나 진행 중일 수 있다. 일부 경우에, 암, 특히, 전이성 암은 약 5% 내지 8%의 세포가 미세핵을 나타내는 경우, 예측, 검출 또는 진행 중일 수 있다.
일부 경우에, 사이토졸 DNA의 임의의 양이 암의 지표이다. 사이토졸 DNA는 사이토졸 (핵이 아닌)의 DNA (염색)에 의해 검출될 수 있다. 사이토졸 DNA를 검출하기 위해 임의의 편리한 DNA 염색제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 사이토졸 DNA를 검출하고 정량화하기 위해 이중 가닥 DNA에 대한 염색제가 사용될 수 있다. 암, 특히, 전이성 암은 예를 들어, 정상적인 비암 조직과 비교하여 사이토졸 내의 염색 강도의 1 배 내지 2 배 증가가 관찰되는 경우, 예측될 수 있거나, 검출될 수 있거나, 진행 중일 수 있다. 비교에 사용되는 정상적인, 비암성 조직은 동일한 환자로부터 유래될 수 있거나 정상 조직 샘플로부터 유래된 기준 조직일 수 있다.
사이클릭 구아노신 모노포스페이트-아데노신 모노포스페이트 (cGAMP)를 검출하고 정량화하기 위한 검정이 본원에 기술되어 있고, 전이성 암을 포함하는 암을 갖는 환자를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플 중 총 cGAMP 농도는 기준 정상 조직 또는 동일한 환자로부터 취한 인접한 정상 조직과 비교하여 샘플 중 cGAMP 수준을 비교함으로써, 전이의 마커로서 사용될 수 있다. 10%, 또는 20%, 또는 30%, 또는 50%, 또는 70%, 또는 80%, 또는 90%의 cGAMP의 증가는 전이성 암을 포함하여 암이 있거나 발생할 환자를 확인할 수 있다. 일부 경우에, 정상보다 1 배 내지 2 배의 cGAMP의 증가는 전이성 암을 포함하여 암이 있거나 발생할 환자를 확인할 수 있다. 요법 전 및 요법 직후 샘플에서 증가된 cGAMP 농도는 종양 반응의 마커이다. cGAMP 수준에서 추가적인 1 배 내지 2 배 변화의 증가는 종양 반응의 지표이다.
CIN 유발 암 및 전이성 질환에 대한 신규한 대사산물 바이오마커로서 cGAMP를 사용하여 환자에서 전이성 질환을 진단하기 위한 방법이 본원에 기술된다. cGAMP의 측정은 전이성 질환을 갖는 환자를 정확하고 구체적으로 확인하기 위한 임상 양상으로서 작용할 수 있다. 환자 샘플 (종양, 비암성 조직, 혈액, 혈청, 소변 및 혈장)에서 cGAMP의 측정 및 그 안의 cGAMP의 상대적 존재 또는 부재는 임상의가 암 공격성 또는 전이성 질환의 진단 가능성뿐만 아니라 음성 진단 (예컨대, 정상 또는 질환의 결여)과 관련이 있을 수 있는 정보를 제공할 수 있다.
또한, 시간 경과에 따른 cGAMP의 수준을 결정하고 cGAMP 프로파일을 확립하는 것에 기초하여 치료에 대한 환자 반응을 모니터링하기 위한 방법이 본원에 기술된다. 이러한 방법은 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계; 액체 크로마토그래피 및/또는 질량 분석법을 사용하여 cGAMP의 수준을 측정하는 단계; 및 비교에 기초하여, 대상체가 전이성 질환을 갖는지 여부를 나타내는 증식을 생성하는 단계를 포함하는, 대상체에서 cGAMP 프로파일을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 기준 프로파일은 전이성 질환을 갖지 않는 건강한 대조군 대상체 집단, 국소화된 암성 질환을 갖는 대상체 집단, 및 전이성 질환을 갖는 대상체 집단으로부터 수득될 수 있다.
샘플에서 측정된 cGAMP 농도 또는 양은 정상 조직 (동일한 환자로부터일 필요는 없음)으로부터의 정상 기준 값과 비교될수 있거나, 인접한 정상 조직의 cGAMP 수준에 이용 가능한 경우 정상 기준 값과 비교될 수 있다. 예를 들어, 진단 또는 유방암 후 유방 절제술을 받은 환자의 경우, 정상 유방 샘플 (암과 관련되지 않은)에서 cGAMP 수준의 측정은 기준 또는 대조군 값으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 정상 조직을 이용할 수 없는 환자의 경우, 예를 들어, 비암성 유방으로부터의 기준 뱅크된(banked) 정상 조직을 기준 또는 대조군으로서 사용할 수 있다.
프로파일이 설정되면, cGAMP 수준을 기준 포인트로서 사용하여 추가 정보가 필요한 미지 샘플 및 샘플들과 비교하고 특성화할 수 있다. 예를 들어, 대조군(예컨대, 더 이른 시점에 대상체로부터 채취한 샘플 또는 상기 언급된 집단 프로파일로부터 결정된 평균 cGAMP 수준)에 비해 감소된 cGAMP 수준(기준선에 비해 적어도 10% 이상 또는 1 배 이상, 2 배 이상 감소)은 양성 치료 결과를 나타낼 수 있다. 그러나, 증가된 수준의 cGAMP (적어도 10% 이상, 또는 1 배 초과의 증가)는 전이성 질환의 존재 또는 가능성 및 불량한 치료 결과를 나타낼 수 있다.
전이성 질환의 결정은 기준 대조군 수준 또는 개인화된 종 방향 시점과 비교하여 측정된 cGAMP 수준에 기초한다. 대조군 수준은 전이성 질환을 갖지 않는, 또는 치료 전후의 대조군 대상체에서의 수준을 나타낸다.
전술한 실시양태 모두에서, 바이오마커로서 cGAMP의 수준을 측정하는 단계는 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS)을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
간략하게, 소변, 혈액, 혈장, 혈청 및 뇌척수액으로부터 샘플을 수집한다. 특정 실시양태에서, 샘플은 또한 종양 세포 또는 종양에 인접한 정상 조직 세포를 포함한다. 수집되면, 샘플은 본원에 기술된 바와 같이 처리된다. 본 발명의 실시양태에서 사용하기 위한 비제한적이고 예시적인 처리 단계는 유기산의 추출, 칼럼 정제 (예컨대, 음이온 교환 정제), 크로마토그래피 (예컨대, 크기 배제 크로마토그래피), 원심 분리 및 알콜 처리 (예컨대, 메탄올 또는 에탄올)를 포함한다.
예를 들어, 세포 샘플로부터의 세포를 세척한 후 액체 질소에서 동결시켜 세포의 대사 상태를 보존할 수 있다. 이어서 세포를 냉각 메탄올 (-80 ℃)로 수집/스크래핑할 수 있다. 이어서, 메탄올 대사산물 추출물은 Collins et al. (Cell Host & Microbe 17(6): 820-828 (2015))에 기술된 바와 같이 HyperSep 아미노프로필 고체상 컬럼을 사용하는 고체상 추출(SPE)에 의해 정제될 수 있다. 용출액을 건조시키고 ddH2O 중 70% 아세토니트릴에서 재구성할 수 있다. 재구성된 용출액은 LC-MS/MS 분석에 의해 분석될 수 있다.
일부 경우에, 혈청 또는 배지는 cGAMP 농도 또는 양에 대해 평가될 수 있다. 배양 배지 중 분리된 cGAMP를 검출/정량화하기 위해, 제어된 배지의 분취량을 수집하고, 메탄올과 80:20으로 혼합하고, 섭씨 4도에서 20 분간 3000 rpm에서 원심 분리할 수 있다. LC-MS/MS에 앞서 생성된 상층액을 수집하고 섭씨 -80도에서 저장하여 cGAMP 수준을 평가할 수 있다.
전체 세포 연관된 대사산물을 측정하기 위해, 배지를 흡인할 수 있고, 예컨대, 비-수렴성 밀도로 세포를 수확할 수 있다.
다양한 상이한 액체 크로마토그래피 (LC) 분리 방법이 사용될 수 있다.
각각의 방법은 주입된 대사산물 표준 용액에 최적화된 MS 매개 변수를 사용하여, 다중 반응 모니터링 (MRM) 모드에서 작동하는 삼중 사극자 질량 분석기(triple-quadrupole mass spectrometer)와 음성 전자 분무 이온화 (ESI, -3.0 kV)를 통해 커플링될(coupled) 수 있다.
진행중인 유방암 전이 및/또는 유방암 전이를 겪거나 생존할 환자를 확인하는 방법이 또한 본원에 기술된다. 시험 샘플에서 하나 이상의 다음 유전자의 감소된 발현은 진행중인 유방암 전이 및/또는 유방암 전이를 겪을 환자를 확인할 수 있다: PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, FGF5 또는 NTN.
본원에 기술된 바와 같이, 이들 유전자 PREDICTS의 상승된 발현은 유방암에서 원격 무전이 생존을 증가시켰다. 다음 유전자의 상승된 발현은 염색체 불안정성(CIN) 시그니처로서 지칭된다: PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, FGF5, 및 NTN4. 따라서, 무전이 생존을 가질 수 있는 환자를 확인하는 방법이 또한 본원에 기술되어 있고, 여기서 방법은 환자 샘플에서 하나 이상의 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, 또는 FGF5 유전자의 발현을 정량화하여 환자에 대해 이들 유전자 중 하나 이상에 대해 측정된 정량화된 발현 수준을 얻는 것을 포함한다. 일부 경우에, 이 방법은 이들 유전자의 발현 수준을 측정하나 다른 유전자는 측정하지 않는 단계를 포함할 수 있다.
KM-Plotter 데이터베이스 (웹 사이트 www.kmplot.com 참고)에 기탁된 마이크로어레이 유전자 발현 데이터세트는 본원에 기술된 바와 같이 평가되었다. 다음의 마이크로어레이 프로브가 각각의 유전자에 대해 사용되었다 (일부 유전자는 다수의 명칭을 가지며 대안의 명칭은 하기에 나열될 수 있음을 주의): 219132_at (PELI2), 205289_at (BMP2), 207586_at (SHH), 230398_at (TNS4), 227123_at (RAB3B), 213194_at (ROBO1), 227911_at (ARHGAP28), 213385_at (CHN2), 206224_at (CST1), 203305_at (F13A1), 208146_s_at (CPVL), 226492_at (SEMA6D), 201431_s_at (DPYSL3), 228640_at (PCDH7), 209781_s_at (에트왈(etoile)), 210972_x_at (TRA@), 220169_at (TMEM156), 206994_at (CST4), 266_s_at (CD24), 210311_at (FGF5), 200948_at (MLF2). 36 백분위수의 컷오프 값을 사용하여 하위 36-백분위수보다 높은 유전자의 누적 발현을 갖는 환자는 더 높은 무전이 생존을 갖는다.
제2 데이터 세트에서, 차세대 시퀀싱으로부터 유래된 공개적으로 기탁된 유전자 발현 데이터가 사용되었고, 중앙 발현 값은 개선된 생존을 갖는 환자를 확인하기 위해 컷오프 값으로서 사용되었다. PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, FGF5의 중앙 발현 값보다 큰 발현 값을 갖는 것이 개선된 생존을 갖는다. 따라서, 이들 유전자 각각의 발현 수준은 환자 샘플에서 정량화될 수 있고, 이러한 정량화된 발현 수준은 이들 유전자 각각에 대한 중앙 기준 발현 수준과 비교될 수 있다. 이들 유전자 각각에 대한 이러한 중앙 기준 발현 수준은 전이성 암을 갖는 일련의 환자로부터의 샘플에서 이들 유전자 각각의 중앙 발현일 수 있다.
시험된 샘플은 유방암 환자, 예를 들어, 전이성 유방암이 검출되지 않은 환자, 또는 유의한 전이성 유방암이 없는 환자로부터의 것일 수 있다. 유사하게, 중앙 기준 발현 수준은 진행성 전이성 유방암 환자로부터의 일련의 샘플로부터 수득될 수 있다.
이러한 유형의 분석에서, 사용된 환자 집단 및 검정에 따라 25-백분위수 내지 75-백분위수 범위의 컷오프 값을 사용하는 것이 일반적이다.
제1 및 제2 방법을 사용하여 유사한 결과를 얻었다.
따라서, 개선된 생존을 갖는 환자를 확인하는 방법이 본원에 기술된다. 방법은 1차 암 유형 (예컨대, 1차 유방암)을 갖는 환자로부터 샘플을 수집하는 단계; NextGen 시퀀싱을 위한 표준 프로토콜에 따른 RNA 정제 및 제조 (예컨대, 웹 사이트 qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/total-rna/rneasy-mini-kit/#orderinginformation 참고); RT-PCR, NextGen 시퀀싱 또는 마이크로어레이 방법을 사용하여 상대 또는 절대 RNA 발현 수준을 결정하는 단계; 23개의 유전자의 발현 값을 합산하는 단계; 이 코호트에서 원격 무전이 생존 (DMFS)을 예측하기 위한 최상의 컷오프를 결정하는 단계; 이를 후속 환자의 절대 컷오프로 사용하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에 최적의 보정을 위해 정상 조직 기준 대조군을 사용할 수 있다 (예컨대, 유방암의 경우 유방 조직, 췌장암의 경우 정상 췌장 등).
수득된 측정된 정량화된 발현 수준(들)은 대조군, 예를 들어, 유방암 전이가 진행중인 환자 세트에서 하나 이상의 상응하는 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, 또는 FGF5 유전자의 중앙 또는 평균 발현 수준과 비교될 수 있다. 측정된 정량화된 발현 수준(들)이 대조군 수준보다 큰 경우 환자는 무전이 생존을 가질 수 있다. 예를 들어, 측정된 정량화된 발현 수준(들)이 대조군 수준보다 큰 경우, 증가된 무전이 생존을 갖는 이러한 환자는 유방암 전이가 진행중인 환자의 대조군 세트보다 5 개월 이상, 10 개월 이상, 12 개월 이상, 15 개월 이상, 20 개월 이상, 25 개월 이상, 50 개월 이상 또는 100 개월 이상 더 긴 기간 동안 생존할 수 있다.
일부 경우에, 감소 또는 증가된 발현은 이들 유전자 중 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상, 또는 5개 이상, 또는 6개 이상, 또는 7개 이상, 또는 8개 이상, 또는 9개 이상, 10개 이상, 또는 11개 이상, 또는 12개 이상, 또는 13개 이상, 또는 14개 이상, 또는 15개 이상, 또는 16개 이상, 또는 17개 이상, 또는 18개 이상, 또는 19개 이상, 또는 20개 이상, 또는 21개 이상, 또는 22개 이상일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 이들 유전자의 감소 또는 증가된 발현은 대조군과 비교하여 상기 유전자의 발현의 적어도 10%, 또는 20%, 또는 30%, 또는 40%, 또는 50%, 또는 60%, 또는 75%, 또는 100% 감소 또는 증가일 수 있다. 이들 유전자 발현의 이러한 감소 또는 증가는 또한 대조군과 비교하여 적어도 1.2 배, 또는 1.5 배, 또는 2 배, 또는 3 배, 또는 5 배, 또는 7 배, 또는 10 배 증가할 수 있다. 이러한 대조군은 건강하거나 비암성 조직 샘플일 수 있다. 다른 경우에, 대조군은 암성 또는 전이성 조직일 수 있다.
치료 방법
놀랍게도, 염색체 불안정성에 의해 부여되는 전(pro)-전이성 표현형은 사이토졸 이중 가닥 DNA (dsDNA)에 대한 종양 세포-내인성 염증 반응에 의해 유발된다. 사이 클릭 GMP-AMP 합성효소 (cGAS) 및 이의 다운스트림(downstream) 이펙터(effector) STING에 의한 사이토졸 DNA의 감지는 비정규 NF-κB 경로를 활성화시키고 종양 세포-자율적 방식으로 침습 및 전이를 유발한다. 염색체 불안정성과 선천성 세포 염증 사이의 이러한 예기치 않은 연결은 게놈적으로 불안정한 종양에서 치료적 개입을 위한 새로운 방안을 제공한다. 따라서, 본원에 기술된 치료 방법은 특허 샘플 내의 세포가 증가된 수준의 사이토졸 DNA, 미세핵, 염색체 비분리 또는 이들의 조합을 나타내는지 확인하기 위한 방법을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 증가된 수준의 cGAMP는 또한 암, 특히, 전이성 암의 지표이다. 이후 증가된 수준의 사이토졸 DNA, 미세핵, 염색체 비분리 또는 이들의 조합을 갖는 환자는 본원에 기술된 바와 같이 또는 다양한 다른 치료 방법에 의해 치료될 수 있다.
예를 들어, 하나의 방법은 전이성 화학 요법제를 다음을 갖는 세포 샘플 또는 체액 샘플을 갖는 환자에 투여하여 환자의 전이상 암을 치료하는 단계를 포함할 수 있다:
a. 세포 샘플의 하나 이상의 세포 내에 10% 이상, 또는 11% 이상, 또는 12% 이상, 또는 13% 이상, 또는 14% 이상, 또는 15% 이상의 검출 가능한 염색체 비분리;
b. 세포 샘플의 하나 이상의 세포 내에 3% 이상, 4% 이상 또는 5% 이상의 세포 검출 가능한 미세핵;
c. 세포 샘플의 하나 이상의 세포 내에 검출 가능한 사이토졸 이중 가닥 DNA; 또는
d. 세포 샘플 또는 체액 샘플에서 적어도 10%, 또는 20%, 또는 30%, 또는 50%, 또는 70%, 또는 80%, 또는 90% 더 큰 농도 또는 양의 cGAMP.
다양한 화학 요법제가 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법은, 예를 들어, 키네신-13 단백질, 예컨대, Kif2b, MCAK/Kif2c 및/또는 KIF13A를 투여하고, 임의로 ABCC4 및/또는 ABCG2 단백질을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 방법은 트랜스진 또는 벡터에서 키네신-13 단백질, 예컨대, Kif2b, MCAK/Kif2c 및/또는 KIF13A의 발현, 및 임의로 트랜스진 또는 벡터에서 ABCC4 및/또는 ABCG2의 발현을 포함할 수 있다. 방법은 또한 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1 또는 이들의 임의의 조합을 억제하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 세포에서 키네신-13 단백질, 예컨대, Kif2b, MCAK/Kif2c 또는 KIF13A의 증가된 발현 및/또는 활성을 포함하는 방법 및 조성물이 본원에 기술된다. 이러한 방법 및 조성물은 암 치료에 유용하다. 방법 및 조성물은 ABCC4, ABCG2 또는 이들의 조합의 증가된 발현 및/또는 활성을 포함할 수 있다. 이러한 키네신-13 단백질, ABCC4 단백질, ABCG2 단백질 또는 이들의 조합의 작용제는 이들 단백질의 활성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 또한 포유 동물 세포에서 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1 또는 이들의 임의의 조합을 억제하는 단계를 포함할 수 있다. 세포는 생체 외 (예컨대, 배양에서) 또는 생체 내에 (예컨대, 대상체 동물 내에) 있을 수 있다.
본원에 기술된 조성물 및 방법은 키네신-13 단백질, 예컨대, Kif2b, MCAK/Kif2c 및/또는 KIF13A 단백질의 사용을 포함할 수 있다. 조성물 및 방법은 또한 키네신-13, 예컨대, Kif2b, MCAK/Kif2c, KIF13A 또는 이들의 조합을 코딩하는 키네신-13 핵산의 사용을 포함할 수 있다. 조성물 및 방법은 또한 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1, 또는 이들의 조합의 하나 이상의 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 억제제의 예는 항체 또는 억제성 핵산(예컨대, 담체 내 또는 발현 벡터로부터 발현됨)을 포함한다. 이러한 조성물 및 방법은 전이성 암을 포함하여 암의 발생을 치료 및 억제하는데 유용하다.
본원에 기술된 바와 같이, 키네신-13 단백질, 예컨대, Kif2b, MCAK/Kif2c 및/또는 KIF13A의 증가된 활성 및/또는 수준뿐만 아니라 ABCC4 및/또는 ABCG2의 증가된 활성 및/또는 수준은 전이성 암을 포함하여 암의 발생률 및/또는 진행을 감소시킬 수 있다. STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1 또는 이들의 임의의 조합의 감소된 발현은 전이성 암을 포함하여 암의 발병률 및/또는 진행을 감소시킬 수 있다.
키네신-13 단백질 및 핵산, 예컨대, Kif2b, MCAK/Kif2c 및 KIF13A에 대한 서열뿐만 아니라 ABCC4, ABCG2 단백질 및 핵산에 대한 서열, 및 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52 및 NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및 MST1에 대한 서열은 예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov의 생물정보센터(National Center for Biotechnology Information(NCBI))에 의해 유지되는 데이터베이스로부터 이용가능하다.
예를 들어, 하나의 키네신-13 단백질은 Kif2b 단백질이며, 이는 다음의 인간 서열(서열번호 1, NCBI 수탁 번호 NP_115948)을 가질 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
서열번호 1의 인간 Kif2b 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 하기 서열번호 2 (NCBI 수탁 번호 NM_032559)로서 제시되어 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
키네신-13 단백질은 MCAK/Kif2c 단백질이며, 이는 다음의 인간 서열(서열번호 3; NCBI 수탁 번호 BAG50306.1)을 가질 수 있다.
Figure pct00005
Figure pct00006
서열번호 3의 인간 MCAK/Kif2c 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 하기 서열번호 4 (NCBI 수탁 번호 AB264115.1)로서 제시되어 있다.
Figure pct00007
Figure pct00008
다른 키네신-13 단백질은 KIF13A 단백질이며, 이는 다음의 인간 서열(서열번호 5; NCBI 수탁 번호 NP_071396.4)을 가질 수 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
서열번호 5의 인간 KIF13A 단백질을 코딩하는 cDNA의 서열은 하기 서열번호 6(NCBI 수탁 번호 NM_022113.5)으로서 제시되어 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
인간 MCAK 단백질에 대한 예시적인 서열은 하기 서열번호 7; NCBI 수탁 번호 NP_006836.2)로서 제시되어 있다.
Figure pct00016
서열번호 7의 인간 MCAK 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 하기 서열번호 8 (NCBI 수탁 번호 NM_006845.3)로서 제시되어 있다.
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
인간 ABCC4 단백질에 대한 예시적인 서열은 하기 서열번호 9; NCBI 수탁 번호 AAH41560.1)로서 제시되어 있다.
Figure pct00020
서열번호 9의 인간 ABCC4 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 하기 서열번호 10(NCBI 수탁 번호 BC041560.1)으로서 제시되어 있다.
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
인간 ABCG2 단백질에 대한 예시적인 서열은 하기 서열번호 11; NCBI 수탁 번호 AAG52982.1)로서 제시되어 있다.
Figure pct00024
서열번호 11의 인간 ABCG2 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 하기 서열번호 12 (NCBI 수탁 번호 AY017168.1)로서 제시되어 있다.
Figure pct00025
Figure pct00026
킨신(kinsin)-13, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2 단백질 및 핵산은 서열 변이를 나타낼 수 있다. 그러나, 본원에 도시된 아미노산 및 핵산 서열과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 변이체는 여전히 유사한 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1 내지 12 중 어느 하나와 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 동일성을 갖는 킨신-13, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2 단백질 및 핵산은 여전히 본원에 기술된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
킨신-13, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2 단백질은 염색체 불안정성을 나타낼 수 있거나 암으로 고통받거나 암이 발생할 것으로 의심되는 대상체에 투여될 수 있다. 유사하게, 킨신-13, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2 단백질을 코딩하는 발현 카세트 및/또는 발현 벡터는 염색체 불안정성을 나타낼 수 있거나 암으로 고통받거나 암이 발생할 것으로 의심되는 대상체에 투여될 수 있다.
또한, 키네신-13 단백질 활성을 향상시키기 위해 킨신-13, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2 작용제가 투여될 수 있다. 예를 들어, Kif2c/MCAK에 특이적인 UMK57로 지칭되는 키네신-13 작용제는 염색체 불안정성을 나타낼 수 있거나 암으로 고통받거나 암이 발생할 것으로 의심되는 대상체에 투여될 수 있다. UMK57의 구조는 하기에 나타나 있으며, 여기서 X는 메틸(CH3) 기이다.
Figure pct00027
일부 경우에, 다양한 내인성 핵산 (mRNA) 및 단백질의 발현이 억제될 수 있다. 예를 들어, 다음의 발현이 억제될 수 있다:STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1 또는 이들의 임의의 조합.
인간 STING 단백질 서열 (서열번호 13; NCBI 수탁 번호 NP_938023 XP_291127)의 일 예가 하기에 제시되어 있다.
Figure pct00028
서열번호 13의 인간 STING 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 하기 서열번호 14 (NCBI 수탁 번호 NM_198282 XM_291127)로서 제시되어 있다.
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
cGAS (사이클릭 GMP-AMP 합성효소) 단백질은 다음의 인간 서열 (서열번호 15; NCBI 수탁 번호 NP_612450)을 포함할 수 있다.
Figure pct00032
서열번호 15의 인간 cGAS 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 하기 서열번호 16 (NCBI 수탁 번호 NM_138441)로서 제시되어 있다.
Figure pct00033
Figure pct00034
NF-κB 전사 인자 p52 단백질은 다음의 인간 서열 (서열번호 17; NCBI 수탁 번호 NP_001309863 XP_005269917)을 포함할 수 있다.
Figure pct00035
Figure pct00036
서열번호 17의 인간 NF-κB 전사 인자 p52 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 하기 서열번호 18 (NCBI 수탁 번호 NM_001322934 XM_005269860)로서 제시되어 있다.
Figure pct00037
Figure pct00038
NF-κB 전사 인자 RelB 단백질은 다음의 인간 서열 (서열번호 19; NCBI 수탁 번호 NP_006500)을 포함할 수 있다.
Figure pct00039
서열번호 19의 인간 NF-κB 전사 인자 RelB 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은하기 서열번호 20 (NCBI 수탁 번호 NM_006509)으로서 제시되어 있다.
Figure pct00040
Figure pct00041
예를 들어, ENPP1 단백질은 다음의 인간 서열 (서열번호 21; NCBI 수탁 번호 NP_006199.2)을 포함할 수 있다.
Figure pct00042
Figure pct00043
서열번호 21의 인간 ENPP1 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 하기 서열번호 22 (NCBI 수탁 번호 NM_006208.2)로서 제시되어 있다.
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
예를 들어, LTβR 단백질은 다음의 인간 서열 (서열번호 23; NCBI 수탁 번호 P36941.1)을 포함할 수 있다.
Figure pct00049
서열번호 23의 인간 LTβR 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 하기 서열번호 24 (NCBI 수탁 번호 NM_002342.2)로서 제시되어 있다.
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및 MST1 단백질 및 핵산은 서열 변이를 나타낼 수 있다. 그러나, 본원에 도시된 아미노산 및 핵산 서열과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 변이체는 여전히 유사한 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및 MST1 단백질 및 핵산은 90% 이상, 서열 번호 : 13-24 중 어느 하나와 서열 동일성이 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상일 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용된다.
발현 시스템
임의의 킨신-13, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2 단백질 뿐만 아니라 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1를 코딩하는 핵산을 코딩하는 핵산 세그먼트, 또는 임의의 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1 억제성 핵산을 포함하는 핵산 세그먼트는 임의의 적합한 발현 시스템에 삽입되거나 사용될 수 있다. 치료적 유효한 수량(quantity)의 킨신-13, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2 단백질이 이러한 발현 시스템으로부터 생성될 수 있다. 치료적 유효한 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 억제성 핵산은 또한 이러한 발현 시스템으로부터 생성될 수 있다.
핵산 (또는 억제성 핵산)의 재조합 발현은 벡터, 예컨대, 플라스미드를 사용하여 유용하게 달성된다. 벡터는 킨신-13, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2 단백질, 또는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52 및/또는 NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1와 같은 단백질을 코딩하는 핵산 세그먼트에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 벡터는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52 및/또는 NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1 억제성 핵산을 코딩하는 핵산 세그먼트에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다.
벡터는 또한 전사 및 번역에 필요한 다른 요소를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 벡터는 외인성 DNA를 함유하는 임의의 담체를 지칭한다. 따라서, 벡터는 외인성 핵산을 분해없이 세포 내로 수송하는 약제이며, 그것이 전달되는 세포에서 핵산의 발현을 산출하는 프로모터를 포함한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 핵산, 바이러스, 파지 핵산, 파지, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 킨신-13, KIF13A, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2를 운반, 코딩 및/또는 발현하기에 적합한 다양한 원핵 및 진핵 발현 벡터. STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52 및/또는 NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 억제성 핵산을 운반, 코딩 및/또는 발현하기에 적합한 다양한 원핵 및 진핵 발현 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 예를 들어, pET, pET3d, pCR2.1, pBAD, pUC 및 효모 벡터를 포함한다. 벡터는 예를 들어, 다양한 생체 내 및 생체 외 상황에서 사용될 수 있다.
카세트 또는 벡터에서의 발현 카세트, 발현 벡터 및 서열은 이종성일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "이종성"은 발현 카세트, 발현 벡터, 조절성 서열, 프로모터 또는 핵산과 관련하여 사용되는 경우 일부 방식으로 조작된 발현 카세트, 발현 벡터, 조절성 서열 또는 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 이종성 프로모터는 관심있는 핵산에 자연적으로 연결되지 않거나, 또는 세포 형질 전환 절차에 의해 세포로 도입된 프로모터일 수 있다. 이종성 핵산 또는 프로모터는 또한 유기체에 고유하지만 일부 방식으로 변경된 (예컨대, 다른 염색체 위치에 배치된, 돌연변이된, 다수의 카피로 첨가된, 비-고유 프로모터 또는 인핸서 서열에 연결된, 등) 핵산 또는 프로모터를 포함한다. 이종성 핵산은 cDNA 형태를 포함하는 서열을 포함하고; cDNA 서열은 센스 (MRNA를 생성하기 위함) 또는 안티센스 배향 (mRNA 전사체에 상보적인 안티센스 RNA 전사체를 생성하기 위함)으로 발현될 수 있다. 이종성 코딩 영역은, 예를 들어, 이종성 코딩 영역이 코딩 영역과 자연적으로 연관되지 않은 조절성 요소, 예컨대, 프로모터를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 결합되는 경우 또는 또는 이종성 코딩 영역이 자연적으로 발견되지 않는 염색체의 부분과 연관되는 경우(예컨대, 코딩 영역에 의해 코딩된 단백질이 정상적으로 발현되지 않는 유전자좌에서 발현된 유전자), 내인성 코딩 영역과 구별될 수 있다. 유사하게, 이종성 프로모터는 이들이 자연적으로 연결되지 않는 코딩 영역에 연결된 프로모터일 수 있다.
사용될 수 있는 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오 바이러스, AIDS 바이러스, 뉴런 영양성 바이러스, 신드비스 및 기타 바이러스와 관련된 것들을 포함한다. 벡터로 사용하기에 적합하게 하는 이들 바이러스의 특성을 공유하는 임의의 바이러스 패밀리가 또한 유용하다. 이용될 수 있는 레트로바이러스 벡터는 Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer. In Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington, (1985)에 의해 기술된 것들을 포함한다. 예를 들어, 이러한 레트로바이러스 벡터는 Murine Maloney Leukemia 바이러스, MMLV 및 원하는 특성을 발현하는 다른 레트로바이러스를 포함할 수 있다. 전형적으로, 바이러스 벡터는 비구조적 초기 유전자, 구조적 후기 유전자, RNA 폴리머라제 III 전사체, 복제 및 캡슐화에 필요한 역전된 말단 반복서열, 및 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 제어하기 위한 프로모터를 함유한다. 벡터로서 조작되는 경우, 바이러스는 전형적으로 하나 이상의 초기 유전자가 제거되고, 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트가 제거된 바이러스 핵산 대신에 바이러스 게놈에 삽입된다.
프로모터, 인핸서, 번역 개시 서열, 전사 종결 서열 및 기타 요소를 포함하여 다양한 조절성 요소가 발현 카세트 및/또는 발현 벡터에 포함될 수 있다. "프로모터"는 일반적으로 전사 개시 부위와 관련하여 비교적 고정된 위치에 있을 때 기능하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. 예를 들어, 프로모터는 킨신-13, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2 단백질을 코딩하는 핵산 세그먼트의 업스트림(upstream)에 있을 수 있다. 다른 예에서, 프로모터는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52 및/또는 NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 억제성 핵산 세그먼트의 업스트림에 있을 수 있다.
"프로모터"는 RNA 폴리머라제 및 전사 인자의 기본 상호 작용에 필요한 핵심 요소를 함유하고 업스트림 요소 및 반응 요소를 함유할 수 있다. "인핸서"는 일반적으로 전사 개시 부위로부터 비 고정된 거리에서 기능하며 전사 단위에 대해 5' 또는 3'일 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 또한, 인핸서는 코딩 서열 자체뿐만 아니라 인트론 내에 존재할 수 있다. 이들은 보통 길이가 10 내지 300이며 cis로 작동한다. 인핸서는 인근 프로모터로부터 전사를 증가시키는 기능을 한다. 인핸서, 예컨대, 프로모터는 또한 종종 전사 조절을 매개하는 반응 요소를 함유한다. 인핸서는 종종 발현 조절을 결정한다.
진핵 생물 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사의 종결을 위한 서열을 함유할 수 있으며, 이는 mRNA 발현에 영향을 미칠 수 있다. 이들 영역은 조직 인자 단백질을 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화된 세그먼트로서 전사된다. 3' 비번역 영역은 또한 전사 종결 부위를 포함한다. 전사 단위는 또한 폴리아데닐화 영역을 함유하는 것이 바람직하다. 이 영역의 한 가지 장점은 전사된 단위가 mRNA처럼 처리되고 수송될 가능성을 증가시킨다는 것이다. 발현 작제물에서 폴리아데닐화 신호의 확인 및 용도는 잘 확립되어 있다. 상동성 폴리아데닐화 신호가 트랜스진 작제물에 사용되는 것이 바람직하다.
발현 카세트 또는 발현 벡터로부터의 킨신-13, KIF13A, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2 단백질의 발현, 또는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52 및/또는 NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 억제성 핵산의 발현은 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 발현될 수 있는 임의의 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 사용될 수 있는 원핵 생물 프로모터의 예는 SP6, T7, T5, tac, bla, trp, gal, lac 또는 말토오스 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 진핵 생물 프로모터의 예는 구성적 프로모터, 예컨대, 바이러스 프로모터, 예컨대, CMV, SV40 및 RSV 프로모터 뿐만 아니라 조절 가능한 프로모터, 예컨대, 유도성 또는 억제성 프로모터, 예컨대, tet 프로모터, hsp70 프로모터 및 CRE에 의해 조절되는 합성 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 박테리아 발현을 위한 벡터는 pGEX-5X-3을 포함하고, 진핵 생물 발현을 위한 벡터는 pCIneo-CMV를 포함한다.
발현 카세트 또는 벡터는 마커 생산물을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 마커 생산물은 유전자가 세포로 전달되었고 일단 전달되면 발현되는지를 결정하는 데 사용된다. 마커 유전자는 β-갈락토시다제를 코딩하는 E. coli lacZ 유전자 및 녹색 형광 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커는 선택 가능한 마커일 수 있다. 이러한 선택 가능한 마커가 숙주 세포 내로 성공적으로 전달되는 경우, 형질전환된 숙주 세포는 선택적 압력하에 놓이면 생존할 수 있다. 선택적인 체제에는 두 가지 널리 사용되는 별개의 범주가 있다. 첫 번째 범주는 세포의 물질대사 및 보충 배지와 무관하게 성장하는 능력이 결여된 돌연변이 세포주의 사용을 기반으로 한다. 두 번째 범주는 임의의 세포 유형에 사용되는 선택 스키마(scheme)를 지칭하고 돌연변이 세포주의 사용을 필요로하지 않는 우세한 선택이다. 이러한 스키마는 일반적으로 약물을 사용하여 숙주 세포의 성장을 정지시킨다. 신규한 유전자를 갖는 세포는 약물 내성을 전달하는 단백질을 발현하고 선택에서 생존할 것이다. 이러한 우세한 선택의 예는 약물 네오마이신 (Southern P. and Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)), 미코페놀산 (Mulligan, R. C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980)) 또는 하이그로마이신 (Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985))을 사용한다.
유전자 전달은 비제한적으로 플라스미드, 바이러스 벡터, 바이러스 핵산, 파지 핵산, 파지, 코스미드 및 인공 염색체 같은 유전자 물질의 직접 전달을 사용하거나 세포 또는 운반체, 예컨대, 양이온 리포좀에서 유전자 물질의 전달을 통해 얻을 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고 본원에 기술된 방법에서 사용하기에 용이하게 적용 가능하다. 전이 벡터는 유전자를 세포로 전달하기 위한 (예컨대, 플라스미드), 또는 유전자를 전달하기 위한 일반적인 전략의 일부로서, 예컨대, 재조합 레트로바이러스 또는 아데노바이러스의 일부로서 임의의 뉴클레오티드 작제물일 수 있다(Ram et al. Cancer Res. 53 : 83-88, (1993)). 바이러스 벡터, 화학적 형질주입제 또는 물리-기계적 방법, 예컨대, 전기 천공법 및 DNA의 직접 확산을 포함하여 적절한 형질주입 수단은 예를 들어, Wolff, J. A., et al., Science, 247, 1465-1468, (1990); 및 Wolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991)에 기술되어 있다.
예를 들어, 키네신-13-관련 (예컨대, 킨신-13, MCAK, ABCC4, ABCG2 또는 KIF13A), 핵산 분자, 발현 카세트 및/또는 벡터, 및/또는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 억제성 핵산 분자, 발현 카세트 및/또는 벡터는 칼슘-매개 형질전환, 전기 천공법, 미세 주입, 리포펙션(lipofection), 유전자총(particle bombardment) 등을 비제한적으로 포함하는 임의의 방법에 의해 세포에 도입될 수 있다. 세포는 배양에서 확장된 후 대상체, 예컨대, 포유 동물, 예컨대, 인간에 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 양 또는 수는 다양할 수 있지만, 약 106 내지 약 109개 세포 범위의 양이 사용될 수 있다. 세포는 일반적으로 생리적 용액, 예컨대, 식염수 또는 완충 식염수로 전달된다. 세포는 또한 비히클, 예컨대, 리포좀, 엑소좀 또는 미세소포의 집단으로 전달될 수 있다.
일부 경우에, 트랜스제닉 세포는 키네신-13-관련 (예컨대, 킨신-13, MCAK, ABCC4, ABCG2 또는 KIF13A) 핵산 분자, 발현 카세트 및/또는 벡터를 함유하고/하거나 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 억제성 핵산을 생산하는 엑소좀 또는 미세소포를 생산할 수 있다. 미세소포는 다양한 단백질, 지질, mRNA 및 마이크로 RNA의 분비를 매개하고 근처 세포와 상호 작용하여 신호, 단백질, 지질 및 핵산을 세포에서 세포로 전달할 수 있다 (예컨대, Shen et al., J Biol Chem. 286(16): 14383-14395 (2011); Hu et al., Frontiers in Genetics 3 (April 2012); Pegtel et al., Proc. Nat'l Acad Sci 107(14): 6328-6333 (2010); WO/2013/084000 참고; 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 원용된다. 이러한 미세소포를 생산하는 세포는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52 및/또는 NF-κB 전사 인자 키네신-13-관련 (예컨대, 킨신-13, MCAK, ABCC4, ABCG2 또는 KIF13A), RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 단백질 및/또는 억제성 핵산을 발현하는데 사용될 수 있다.
키네신-13 단백질(들)을 발현하는, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14 및/또는 NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 억제성 핵산을 또한 임의로 발현할 수 있는, 이종성 발현 카세트 또는 발현 벡터 (예컨대, Kif2b, MCAK/Kif2c, 킨신-13, MCAK, ABCC4, ABCG2 또는 KIF13A)를 갖는 트랜스제닉 벡터 또는 세포는 대상체에 투여될 수 있다. 이종성 발현 카세트 또는 발현 벡터를 갖는 트랜스제닉 벡터 또는 세포는 또한 임의로 ENPP1을 발현할 수 있다. 트랜스제닉 세포에 의해 생산된 엑소좀은 키네신-13/MCAK 핵산 또는 단백질(들) (예컨대, Kif2b, MCAK/Kif2c, ABCC4, ABCG2 및/또는 KIF13A 핵산 또는 단백질(들))을 대상체의 종양 및 암 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 트랜스제닉 세포에 의해 생산된 엑소좀은 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 억제성 핵산을 대상체의 종양 및 암 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있다.
STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1의 억제제 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법 및 조성물은 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1 또는 이들의 임의의 조합에 대한 항체 또는 억제성 핵산의 사용을 포함할 수 있다.
억제성 핵산
다음의 발현은, 예를 들어, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1을 코딩하는 핵산을 특이적으로 인식하는 억제성 핵산을 사용함으로써 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1 또는 이들의 임의의 조합을 억제할 수 있다.
억제성 핵산은 세포 내 또는 엄격한 조건 하에서 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1 핵산에 혼성화될 하나 이상의 세그먼트를 가질 수 있다. 억제성 핵산은 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1을 코딩하는 핵산의 발현을 감소시킬 수 있다. 핵산은 게놈 DNA, 메신저 RNA 또는 이들의 조합에 혼성화될 수 있다. 억제성 핵산은 플라스미드 벡터 또는 바이러스 DNA에 통합될 수 있다. 단일 가닥 또는 이중 가닥, 원형 또는 선형일 수 있다.
억제성 핵산은 13개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는 리보오스 뉴클레오티드 또는 데옥시리보오스 뉴클레오티드의 중합체이다. 억제성 핵산은 자연 발생 뉴클레오티드; 합성, 변형 또는 슈도(pseudo)-뉴클레오티드, 예컨대, 포스포로티오레이트; 뿐만 아니라 검출 가능한 표지, 예컨대, P32, 비오틴 또는 디곡시제닌을 갖는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 억제성 핵산은 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), 또는 MST1 핵산의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 이러한 억제성 핵산은 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), 또는 MST1 핵산의 세그먼트에 완전히 상보적일 수 있다. 대안적으로, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1 서열에 대한 억제성 핵산 서열에서 일부 가변성이 허용된다. 억제성 핵산은 세포 내 조건 하에서 또는 엄격한 혼성화 조건 하에서 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1 핵산에 혼성화할 수 있고, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), 또는 MST1 핵산의 발현을 억제하기에 충분히 상보적이다. 세포 내 조건은 세포, 예컨대, 동물 또는 포유 동물 세포 내에서 전형적으로 발견되는 온도, pH 및 염 농도와 같은 조건을 지칭한다. 이러한 동물 또는 포유 동물 세포의 일 예는 골수성 전구 세포이다. 이러한 동물 또는 포유 동물 세포의 다른 예는 골수성 전구 세포로부터 유래된 보다 분화된 세포이다. 일반적으로, 엄격한 혼성화 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서의 특정 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5 ℃ 낮도록 선택된다. 그러나, 엄격한 조건은 본원에 달리 규정된 바와 같은 원하는 엄격도에 따라, 선택된 서열의 열 융점보다 약 1 ℃ 내지 약 20 ℃ 낮은 온도 범위를 포함한다. 예를 들어, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1 코딩 서열에 정확하게 상보적인 2, 3, 4 또는 5개 이상의 인접한 뉴클레오티드의 스트레치(stretch)를 포함하는 억제 올리고뉴클레오티드(각각은 인접한 코딩 서열에 상보적이지 않은 인접한 뉴클레오티드의 스트레치에 의해 분리됨)는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1 핵산의 기능을 억제할 수 있다. 일반적으로, 인접한 뉴클레오티드의 각각의 스트레치는 적어도 4, 5, 6, 7, 또는 8개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 비-상보적인 개재 서열(intervening sequence)은 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 당업자는 센스 핵산에 혼성화된 억제성 핵산의 계산된 융점을 용이하게 사용하여 특정 표적 핵산의 발현을 억제하기 위해 용인될 미스매칭(mismatching)의 정도를 추정할 수 있다. 본 발명의 억제성 핵산은 예를 들어, 짧은 헤어핀(hairpin) RNA, 작은 간섭 RNA, 리보자임 또는 안티센스 핵산 분자를 포함한다.
STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1을 코딩하는 핵산의 예가 본원에 제시되어 있다. 실시예 1은 서열번호 25-36을 포함하는 억제성 핵산 서열의 예를 제공한다. 또한 도 6 및 도 9 참고.
억제성 핵산 분자는 단일 또는 이중 가닥 (예컨대, 작은 간섭 RNA (siRNA)) 일 수 있고, 효소-의존적 방식으로 또는 입체 차단에 의해 기능할 수 있다. 효소-의존적 방식으로 기능하는 억제성 핵산 분자는 표적 mRNA를 분해하기 위해 RNase H 활성에 의존하는 형태를 포함한다. 이들은 단일 가닥 DNA, RNA 및 포스포로티오에이트 분자뿐만 아니라 센스-안티센스 가닥 쌍을 통한 표적 mRNA 인식에 이어 RNA-유도 침묵 복합체에 의한 표적 mRNA의 분해를 수반하는 이중 가닥 RNAi/siRNA 시스템을 포함한다. RNase-H 독립적인 입체 차단 억제성 핵산은 표적 mRNA에 결합하고 다른 과정을 방해함으로써 유전자 발현 또는 다른 mRNA-의존성 세포 과정을 간섭한다. 입체 차단 억제성 핵산은 2'-O 알킬 (보통 RNase-H 의존성 안티센스를 갖는 키메라), 펩티드 핵산 (PNA), 잠금(lacked) 핵산 (LNA) 및 모르폴리노 안티센스를 포함한다.
예를 들어, 작은 간섭 RNA는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1 번역을 특이적으로 감소시키기 위해 사용될 수 있어, 코딩된 폴리펩티드의 번역이 감소된다. SiRNA는 전사-후 유전자 침묵을 서열-특이적 방식으로 매개한다. 예를 들어, 웹 사이트 invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/rnai.html 참고. 일단 RNA-유도 침묵 복합체 내로 통합되면, siRNA는 복합체를 상동 mRNA 전사체로 이끔으로써 상동 내인성 mRNA 전사체의 절단을 매개한 다음, 복합체에 의해 절단된다. siRNA는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1 mRNA 전사체의 임의의 영역에 대해 상동성일 수 있다. 상동성 영역은 30개 이하의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 25개 미만의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 21 내지 23개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. SiRNA는 전형적으로 이중 가닥이고 2개의 뉴클레오티드 3' 돌출부(overhang), 예를 들어, 3' 돌출된 UU 디뉴클레오티드를 가질 수 있다. siRNA를 설계하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, Elbashir et al. Nature 411: 494-498 (2001); Harborth et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 13: 83-106 (2003) 참고.
IMGENEX (샌디에고, 캘리포니아)에서 시판된 헤어핀 siRNA를 발현하기 위한 pSuppressorNeo 벡터는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1 발현을 억제하는 siRNA를 생성하는데 사용될 수 있다. siRNA 발현 플라스미드의 구축은 mRNA의 표적 영역의 선택을 포함하며, 이는 시행 착오 과정일 수 있다. 그러나, Elbashir et al.은 ~ 80%의 시간 동안 작동하는 것으로 보이는 지침을 제공하였다. Elbashir, S.M., et al., Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs. Methods, 2002. 26(2): p. 199-213. 따라서, 합성 siRNA의 합성을 위해, 표적 영역은 바람직하게는 개시 코돈의 다운스트림의 50 내지 100개의 뉴클레오티드가 선택될 수 있다. 5' 및 3' 비번역 영역 및 개시 코돈에 가까운 영역은 조절성 단백질 결합 부위가 더 풍부할 수 있으므로 피해야 한다. siRNA는 AA로 시작할 수 있으므로 센스 및 안티센스 siRNA 가닥 모두에 대해 3' UU 돌출부를 가지며 대략 50% G/C 함량을 갖는다. 합성 siRNA에 대한 서열의 예는 5'-AA(N19)UU이며, 여기서 N은 mRNA 서열의 임의의 뉴클레오티드이고 대략 50% G-C 함량이어야 한다. 선택된 서열(들)은 다른 공지된 (예컨대, Blast 검색에 의해, 예를 들어, NCBI 웹 사이트를 통한) 코딩 서열에 대한 상동성을 최소화하기 위해 인간 게놈 데이터베이스의 다른 서열과 비교될 수 있다.
SiRNA는 화학적으로 합성되거나, 생체 외 전사에 의해 생성되거나, siRNA 발현 벡터 또는 PCR 발현 카세트로부터 발현될 수 있다. 예컨대, 웹 사이트 invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/rnai.html 참고. siRNA가 발현 벡터 또는 PCR 발현 카세트로부터 발현되는 경우, siRNA를 코딩하는 삽입물(insert)은 siRNA 헤어핀으로 접히는 RNA 전사체로서 발현될 수 있다. 따라서, RNA 전사체는 헤어핀의 루프를 형성하는 스페이서(spacer) 서열에 의해 이의 역 상보적 안티센스 siRNA 서열에 연결된 센스 siRNA 서열 및 3' 말단에 U'의 스트링(string)을 포함할 수 있다. 헤어핀의 루프는 임의의 적절한 길이, 예를 들어, 3 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 3 내지 23개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고, AUG, CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC 및 UUCAAGAGA를 포함하는 다양한 뉴클레오티드 서열(서열번호 60)일 수 있다. SiRNA는 또한 직접적으로 또는 트랜스진 또는 바이러스를 통해 도입된 이중 가닥 RNA의 절단에 의해 생체 내에서 생산될 수 있다. RNA-의존적 RNA 폴리머라제에 의한 증폭은 일부 유기체에서 발생할 수 있다.
억제성 핵산, 예컨대, 짧은 헤어핀 RNA siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 억제성 핵산의 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 발현 카세트로부터의 발현과 같은 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이는 자연 발생 뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은, 예를 들어, 억제성 핵산의 생물학적 안정성을 증가시키거나 억제성 핵산 및 표적 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1 핵산 사이에 형성된 듀플렉스(duplex)의 세포 내 안정성을 증가시키토록 설계된 변형된 뉴클레오티드 또는 비-포스포디에스테르 결합으로부터 제조된다.
억제성 핵산은 이용 가능한 방법을 사용하여, 예를 들어, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 핵산, 또는 이의 상보체의 서열을 코딩하는 발현 벡터로부터의 발현에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 이는 자연 발생 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, 및 ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 핵산은 예를 들어, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 핵산의 생물학적 안정성을 증가시키기 위해, 또는 억제성 핵산과 다른 (예컨대, 내인성) 핵산 사이에 형성된 듀플렉스의 세포 내 안정성을 증가시키기 위해 설계된 변형된 뉴클레오티드 또는 비-포스포디에스테르 결합으로부터 제조된다.
예를 들어, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κBB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 핵산은 포스포디에스테르 결합보다 펩티드 결합을 갖는 펩티드 핵산일 수 있다.
STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 핵산에 사용될 수 있는 자연 발생 뉴클레오티드는 리보오스 또는 데옥시리보오스 뉴클레오티드 아데노신, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실을 포함한다. STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 핵산에 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시하이드록실메틸) 우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀴오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀴오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐라데닌제, 우라실-5옥시아세트산, 위부톡소신, 슈도우라실, 퀴오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥스아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥스아세트산, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필) 우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다.
따라서, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자, RelB 핵산뿐만 아니라 ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 억제성 핵산은 변형된 뉴클레오티드뿐만 아니라 천연 뉴클레오티드, 예컨대, 리보오스 및 데옥시리보오스 뉴클레오티드의 조합을 포함할 수 있다. 억제성 핵산은 야생형(예컨대, 서열번호 14, 16, 18, 20, 22 또는 24)과 동일한 길이일 수 있다. STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52 및 NF-κB 전사 인자 RelB 핵산뿐만 아니라 ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 억제성 핵산은 또한 더 길고 다른 유용한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 핵산은 다소 짧다. 예를 들어, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1 억제성 핵산은 5' 또는 3' 말단으로부터 최대 5개의 뉴클레오티드가 없거나, 최대 10개의 뉴클레오티드가 없거나, 또는 최대 20개의 뉴클레오티드가 없거나, 최대 30개의 뉴클레오티드가 없거나, 최대 50개의 뉴클레오티드가 없거나, 최대 100개의 뉴클레오티드가 없을 수 있는 핵산 서열(예컨대, 서열번호 14, 16, 18, 20, 22 또는 24)을 갖는 세그먼트를 포함할 수 있다.
항체
항체는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14 및 NIK (MAP3K14), MST1의 억제제로서 사용될 수 있다. 항체는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14 및 NIK (MAP3K14), MST1 단백질의 다양한 에피토프에 대하여 발생될 수 있다. STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14 및 NIK (MAP3K14), MST1 단백질에 대한 일부 항체는 또한 상업적으로 이용 가능할 수 있다. 그러나, 본원에 기술된 방법 및 조성물에 따라 치료를 위해 고려되는 항체는 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체이고, 이들의 표적에 대해 매우 특이적이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체의 용도에 관한 것이다. 이러한 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 이러한 항체는 또한 인간화된 또는 완전 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 항체는 하나 이상의 원하는 기능적 특성, 예컨대, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1에 대한 높은 결합 친화도, 또는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1 수용체의 결합을 억제하는 능력을 나타낼 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1 항체, 또는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1 항체의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 언급된 용어 "항체"는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 이의 단일 쇄를 포함한다. "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 2개 이상의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L), 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 칭하는 보다 보존된 영역과 산재된 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭하는 초가변성(hypervariability)의 영역들로 추가로 다시 분할될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배치된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예컨대, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 구성성분 (C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 간단히 "항체 부분")은 항원(예컨대, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1의 도메인)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341 : 544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄(단일 쇄 Fv (scFv)로서 알려짐; 예컨대, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참고)로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다 (예컨대, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체가 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대, 다른 종으로부터의 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1-패밀리 분자와 교차 반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학 물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물에 대한 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 프레임워크 영역 및 CDR 영역 둘 다가 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기 (예컨대, 생체 외 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 다른 포유 동물 종, 예컨대, 마우스의 생식선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 영역 및 CDR 영역 둘 다가 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 일 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 인간 중쇄 트랜스진 및 불멸화 세포에 융합된 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예컨대, 트랜스제닉 마우스로부터 수득한 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다 .
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대, (a) 인간 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스염색체인 동물 (예컨대, 마우스)로부터 단리된 항체 (이하 추가로 설명됨), (b) 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 예컨대, 트랜스펙토마 (transfectoma)로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 및 (d) 다른 DNA 서열에 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함한 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 생체 외 돌연변이 유발 (또는, 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉 동물이 사용되는 경우, 생체 내 체세포 돌연변이 유발)이 수행될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VL 및 VH 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 VL 및 VH 서열로부터 유래되고 이와 관련되어 있지만, 생체 내에서 인간 항체 생식선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수있다.
본원에 사용된 "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스(class) (예컨대, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "인간 항체 유도체"는 인간 항체의 임의의 변형된 형태, 예컨대, 항체와 다른 약제 또는 항체의 컨쥬게이트를 지칭한다.
용어 "인간화된 항체"는 다른 포유 동물 종, 예컨대, 마우스의 생식선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 지칭한다. 인간 프레임워크 서열 내에서 추가적인 프레임워크 영역 변형이 이루어질 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대, 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭하도록 의도된다.
본원에 사용된 "인간 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1에 1 x 10-7 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10-9 M 이하, 보다 더 바람직하게는 1 x 10-8 M 내지 1 x 10-10 M 이하의 KD로 결합하는 항체를 지칭하도록 의도된다.
본원에 사용된 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호 작용의 결합 속도를 의미하는 반면, 본원에 사용된 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호 작용의 해리 속도를 지칭하도록 의도된다. 본원에 사용된 용어 "KD"는 Ka에 대한 Kd의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지고 몰 농도(M)로서 표시되는 해리 상수를 지칭하도록 의도된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하기 위한 바람직한 방법은 표면 플라스몬 공명, 바람직하게는 바이오센서 시스템, 예컨대, BiacoreTM 시스템을 사용하는 것이다.
본 발명의 항체는 항체의 특정 기능적 특징 또는 특성을 특징으로 한다. 예를 들어, 항체는 인간 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1에 높은 친화도, 예를 들어, 1 x 10-7 M 이하의 KD로 결합한다. 항체는 다음 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다:
(a) 인간 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 P52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), 또는 MST1와 1 x 10-7 M 이하의 KD로 결합함;
(b) STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1의 기능 또는 활성을 억제함;
(c) 암 (예컨대, 전이성 암)을 억제함; 또는
(d) 이들의 조합.
예를 들어, ELISA, 웨스턴 블랏 및 RIA를 포함하여, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), 또는 MST1에 대한 항체의 결합 능력을 평가하는 검정이 사용될 수 있다. 항체의 결합 동역학 (예컨대, 결합 친화도)은 당업계에 공지된 표준 검정, 예컨대, BiacoreTM. 분석에 의해 평가될 수 있다.
각각의 대상체 항체가 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1에 결합할 수 있다고 가정하면, VL 및 VH 서열은 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1에 결합하는 다른 결합 분자를 생성하기 위해 "혼합 및 매치"될 수 있다. 이러한 "혼합 및 매치된" 항체의 결합 특성은 상기 기술된 결합 검정을 사용하여 시험될 수 있고 실시예에 기술된 검정으로 평가될 수 있다. VL 및 VH 쇄가 혼합 및 매치되는 경우, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체될 수 있다. 마찬가지로, 바람직하게는 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체된다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다:
(a) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
여기서 항체는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1에 특이적으로 결합한다.
일부 경우에, CDR1 도메인 및/또는 CDR2 도메인(들)과 독립적으로, CDR3 도메인은 단독으로 동족 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정할 수 있고, 공통 CDR3 서열에 기초하여 동일한 결합 특이성을 갖는 다수의 항체가 예측 가능하게 생성될 수 있다. 예를 들어, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000)(뮤린 항-CD30 항체 Ki-4의 중쇄 가변 도메인 CDR3만을 사용하여 인간화된 항-CD30 항체의 생산을 설명함); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000)(모 뮤린 MOC-31 항-EGP-2 항체의 중쇄 CDR3 서열만을 사용하는 재조합 상피 당단백질-2 (EGP-2) 항체를 기술함); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998)(중쇄 및 경쇄 가변 CDR3 도메인을 사용하는 인간화된 항-인테그린 알파v베타3 항체의 패널을 설명함) 참고. 따라서, 일부 경우에 혼합 및 매치된 항체 또는 인간화된 항체는 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB 단백질, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 또는 MST1에 특이적인 CDR3 항원 결합 도메인을 함유한다.
소분자
STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52 및 NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14) 및/또는 MST1의 소분자 조정제가 또한 이용 가능하다. 예를 들어, SK4A 화합물은 ENNP1의 특이적 억제제이다 (Arad et al., SAT0037 An ENPP1-Specific Inhibitor Attenuates Extracellular Ecto-Pyrophosphatase Activity in Human Osteoarthritic Cartilage, 웹 사이트 ard.bmj.com/content/74/Suppl_2/662.1 (2015) 참고).
또한, 다음 화합물 (L524-0366)은 FN14 길항제이다.
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약물 개발에 대한 검정
후보 화합물을 이용한 치료에 대한 감수성에 대해 전이성 종양 샘플을 스크리닝하는 방법이 또한 본원에 기술된다. 구체적으로, 방법은 상승된 수준의 cGAMP를 갖는 증가된 염색체 불안정성을 나타내는 세포 (예컨대, CIN-돌연변이 세포) 또는 전이성 세포의 증식 또는 생존력을 선택적으로 방해하는 후보 화합물을 확인하기 위한 검정 단계를 포함할 수 있다.
증가된 염색체 불안정성을 나타내는 세포(예컨대, CIN-돌연변이 세포)의 증식 또는 생존력이 정상 대조군 세포와 비교하여 시험 화합물의 존재 하에서 감소되는 경우, 그 시험 화합물은 이러한 증가된 염색체 불안정성을 나타내는 세포의 성장 및/또는 전이를 감소시키기 위한 유용성을 갖는다.
유사하게, 세포 또는 세포 집단이 상승된 cGAMP 수준을 갖는 경우, 그 세포 또는 세포 집단은 암성이거나 암이 진행될 것이다. 이러한 세포 또는 세포 집단의 cGAMP 수준이 cGAMP 분비 세포에 대한 이전 수준과 비교하여 감소된 수준의 cGAMP를 나타내는 경우, 시험 화합물은 상승된 수준의 cGAMP를 갖는 세포의 성장 및/또는 전이를 감소시키기 위한 유용성을 갖는다.
검정은 화합물이 전이성 또는 CIN 암 세포 또는 세포주로부터의 감소된 수준의 cGAMP를 특이적으로 유발할 수 있는지 여부를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 화합물이 감소된 수준을 유발하는 경우, 화합물은 암을 치료하기 위한 치료제로서의 적합성과 같은 추가 연구를 위해 선택/확인될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 특징된 선택 방법에 의해 확인된 후보 화합물은 예를 들어, 동물 모델에 화합물을 투여함으로써, 종양을 표적하거나 암을 치료할 수 있는 능력에 대해 추가로 조사할 수 있다.
평가되는 세포는 암 환자 (전이성 암 환자 포함)로부터의 세포, 또는 공지된 암 유형 또는 암 세포주로부터의 세포, 또는 cGAMP의 과생산(overproduction)을 나타내는 세포를 포함할 수 있다. 이들 세포 유형 중 임의의 것으로부터 cGAMP의 생산을 감소시킬 수 있는 화합물이 환자에게 투여될 수 있다.
예를 들어, 하나의 방법은 (a) 환자로부터 세포 또는 조직 샘플을 수득하는 단계; (b) 샘플로부터의 공지된 수 또는 중량의 세포 또는 조직으로부터 생산된 cGAMP의 양 또는 농도를 측정하여 기준 cGAMP 값을 생성하는 단계; (c) 샘플로부터의 동일한 공지된 수 또는 중량의 세포 또는 조직을 시험 화합물과 혼합하여 시험 검정을 생성하는 단계; (d) 시험 검정(세포 배지 또는 세포 또는 조직 내)에서 cGAMP 양 또는 농도를 측정하여 시험 검정 cGAMP 값을 생성하는 단계; (e) 임의로 단계 (c) 및 (d)를 반복하는 단계; 및 기준 cGAMP 값보다 낮은 시험 검정 cGAMP 값을 갖는 임의의 시험 화합물을 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 시험 화합물의 독성 및/또는 효능을 추가로 평가하기 위해 시험 화합물을 동물 모델에 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 방법은 세포 또는 조직 샘플이 수득된 특허에 시험 화합물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 다른 방법은 KIF2B 및 KIF2C/MCAK 작용제 또는 활성화제를 확인하는데 유용한 검정을 포함할 수 있다. KIF2B 및 KIF2C/MCAK는 미세소관 동역학 및 염색체-방추사부착점 부착을 조절하기 위해 ATP 가수 분해 에너지를 이용하는 관련 분자 키네신 모터 단백질이다. 발현 또는 과잉 활성화(hyper activation)에 대한 KIF2B 및 MCAK의 중심적인 역할은 염색체 불안정성 (CIN)을 억제하여 암 요법를 위한 매력적인 표적이 된다. KIF2B 및 MCAK의 강력한 활성화제를 확인 및 평가하는데 사용될 수 있는 생체 외 검정 및 영상화 방법이 하기에 기술되어 있다.
ATP 가수 분해의 동역학의 측정은 KIF2B 및 MCAK를 활성화하고 CIN을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 이 검정은 2-아미노-6-머캅토-7-메틸퓨린 리보뉴클레오시드 (MESG)가 무기 포스페이트의 존재 하에 2-아미노-6-머캅토-7-메틸 퓨린으로 전환되는 경우 발생하는 흡광도 변화 (330 에서 360nm)를 기반으로 한다. 반응은 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 (PNP)에 의해 촉매된다. 한 분자의 무기 포스페이트 (Pi)는 비가역적 반응에서 한 분자의 2-아미노-6-머캅토-7-메틸퓨린을 생성할 것이다. 따라서, 360 nm에서의 흡광도는 ATPase 반응에서 생성된 Pi의 양에 정비례하며, MCAK 활성의 프록시로서 사용될 수 있다.
대안적으로, ADP 생산은 또한 BellBrook Labs의 Transcreener ADP 검정을 사용하여 MCAK 활성에 대한 판독 값으로서 모니터링할 수 있다. 이 검정은 ADP를 특이적으로 인식하는 항체에 결합된 형광 추적자(tracer) (633nm)를 대체하는 ADP의 능력을 기반으로 한다. 추적자의 변위는 633nm에서 레이저 여기에 의해 측정된 형광의 감소를 유발한다. 따라서, MCAK의 활성은 사용된 약물의 농도 및 형광 강도에서 생산/감소된 ADP의 양을 플롯팅함으로써 계산할 수 있다.
다음은 MCAK 활성화제의 효능을 확인하고 평가하는 방법의 또 다른 예이다. MCAK는 미세소관 팁을 결합시키고 미세소관 탈중합을 촉진함으로써 미세소관 길이를 음성 조절한다. 따라서, γ-튜불린-표지된 중심체 사이의 거리는 세포에서 MCAK 활성에 대한 간접 판독 값으로서 측정될 수 있다. 스핀들(Spindle) 길이는 MCAK 활성에 반비례하며 MCAK 활성을 촉진하는 잠재적 화합물을 평가하기 위한 프록시로서 작용할 수 있다. 이 방법은 고처리량(high-throughput) 이미징 현미경을 사용함으로써 화합물을 스크리닝하는 데 적용가능할 수 있다.
화합물 (예컨대, 본원에 기술된 임의의 방법을 통해 확인된 최고 히트(hit))은 효능의 판독 값으로서 형광 제자리 혼성화(Fluorescent in situ hybridization(FISH))과 함께, 지체(lagging) 염색체, 미세핵, 또는 염색체 비분리를 사용하는 세포 기반 검정에 사용될 수 있다. 표지된 γ-튜불린 동원체를 포함하는 염색체를 갖는 세포가 사용될 수 있다. 대안적으로, 중심체에서 γ-튜불린에 결합하는 표지된 항체가 검정에 사용될 수 있다.
NF-kB 유도 키나아제 (NIK)의 억제제의 효능을 확인하고 평가하기 위한 검정 방법이 또한 본원에 기술된다. NF-kB 유도 키나아제 (NIK)는 비정규 NF-kB 시그널링을 매개하고 전이와 연관된다. 따라서, NIK의 억제는 CIN 유도된 염증 반응 및 전이를 저해할 수 있다. NIK의 키나아제 기능의 특이적 억제는 다양한 화합물의 효능을 평가하기 위한 접근법을 제공한다. NIK 억제를 확인하고 평가하는 두 가지 방법이 아래에 기술되어 있다.
ADP 생산은 BellBrook Labs의 Transcreener ADP 검정을 사용하여 MCAK 활성에 대한 판독 값으로서 모니터링할 수 있다. 이 검정은 ADP를 특이적으로 인식하는 항체에 결합된 형광 추적자 (633nm)를 대체하는 ADP의 능력에 기초한다. 633nm에서 레이저 여기에 의해 측정된 추적자의 경쟁적 변위는 형광의 감소를 유발한다. 따라서, MCAK의 활성은 사용된 약물의 농도 및 형광 강도의 ADP 생산/감소된 양을 플롯 팅함으로써 계산할 수 있다.
NIK의 억제는 비정규 NF-κB 경로를 직접 억제하는 접근법을 제공한다. 이 검정은 고용량 세포 이미징을 사용하여 p52의 핵 전좌 (RELB; 비정규 NF-kB 시그널링)의 정량화에 의존한다. RELB 핵 전좌 검정을 위해, 세포를 상이한 농도의 화합물로 처리하고, 비정규 NF-kB 시그널링의 강력한 활성화제인 100ng/mL의 길항성 항림포톡신 베타 수용체 (LT-βR) 항체로 자극하였다. 핵으로의 RELB 전좌는 세포질 신호 강도에 대한 핵의 비율에 의해 정량화된다. RELB의 핵 전좌를 선택적으로 억제하는 강력한 화합물이 발견되었다.
이렇게 확인된 화합물은 CIN을 특징으로 하는 종양을 선택적으로 표적화하거나 암을 치료하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 cGAMP의 과생산을 나타내는 종양 또는 암 유형의 치료에 유용하다.
"치료" 또는 "치료하는"은 치료적 치료 및 예방적 또는 예방의 조치 둘 다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 사람은 이미 장애가 있는 사람 및 장애가 있는 사람 또는 장애를 예방할 수 있는 사람이 포함된다.
치료 목적을 위한 "대상체"는 인간, 가축 및 농장 동물을 포함하여 포유 동물 또는 조류로서 분류된 임의의 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대, 개, 말, 고양이, 소 등을 지칭한다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 용어 "암"은 고형 동물 종양 및 혈액성 악성 종양을 포함한다. 용어 "종양 세포(들)" 및 "암 세포(들)"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
"고형 동물 종양"은 두경부, 폐, 중피종, 종격, 폐, 식도, 위, 췌장, 간담즙 계, 소장, 결장, 결장 직장, 직장, 항문, 신장, 요도, 방광, 전립선, 요도, 음경, 고환, 부인과 기관, 난소, 유방, 내분비 계, 피부 중추 신경계의 암; 연조직 및 뼈의 육종; 및 피부 및 안구내 기원의 흑색종를 포함한다. 또한, 임의의 진행 단계에서 전이성 암, 예컨대, 미세 전이성 종양, 거대 전이성 종양 및 재발성 암이 치료될 수 있다.
용어 "혈액성 악성 종양"은 성인 또는 아동 백혈병 및 림프종, 호지킨 질환, 림프구성 및 피부 기원의 림프종, 급성 및 만성 백혈병, 혈장 세포 신생물 및 AIDS와 연관된 암을 포함한다 .
본 발명의 방법 및 조성물은 또한 유방암, 폐암, 부신피질암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 식도암, 두경부암, 간암, 췌장암, 전립선암, 흉선암, 암종 종양, 만성 림프구성 백혈병, 유잉 육종, 임신 영양막 종양, 간모세포종, 다발성 골수종, 비소세포 폐암, 망막모세포종 또는 난소 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 임의의 진행 단계의 암은 예컨대, 1차, 전이성 및 재발성 암은 치료 또는 검출될 수 있다. 일부 경우에, 전이성 암은 치료되지만 1차 암은 치료되지 않는다. 수많은 유형의 암에 관한 정보는, 예컨대, the American Cancer Society (cancer.org), 또는 예컨대, Wilson et al. (1991) Harrison's Principles of Internal Medicine, 12th Edition, McGraw-Hill, Inc로부터 찾아볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료될 암 및/또는 종양은 유방암 또는 폐암으로 유래된 것들이다.
전이성 암의 치료 또는 이를 치료하는 것은 암 세포 이동의 감소 또는 하나 이상의 전이성 종양의 확립의 감소를 포함할 수 있다. 치료는 또한 전이성 암의 하나 이상의 증상, 예컨대, 기침, 호흡 곤란, 객혈, 림프절 병증, 증대된 간, 메스꺼움, 황달, 뼈 통증, 뼈 골절, 두통, 발작, 전신 통증 및 이들의 조합의 완화 또는 축소를 포함한다. 치료는 암을 치료할 수 있고, 예컨대, 전이성 암을 예방할 수 있고, 전이성 종양 형성 및 성장을 실질적으로 제거할 수 있고/있거나 전이성 암 세포의 이동을 정지시키거나 억제할 수 있다.
항암 활성은 당업자에게 이용 가능한 방법을 사용하여 다양한 암 (예컨대, 유방암, 폐암 또는 전립선 암)의 진행을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 항암 활성은 치사 용량 (LD100) 또는 50% 유효 용량 (ED50), 또는 암 세포의 이동을 예방하는 본 발명의 약제의 50% 성장 억제 (GI50) 용량을 확인함으로써 결정될 수 있다. 일 양태에서, 항암 활성은 예를 들어, 1차 종양 부위로부터 근위 또는 원위 부위에서 암 세포 마커의 발현을 검출함으로써 측정되는 경우, 또는 전이를 검출하기 위해 이용 가능한 방법을 사용하여 평가되는 경우, 암 세포 이동의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 감소시키는 약제의 양이다.
다른 예에서, 염색체 불안정성을 촉진하는 약제는 종양 세포를 면역 요법에 감작시키기 위해 투여될 수 있다. 염색체 불안정성은 면역 체크포인트 차단과 함께 상승작용을 하는 바이러스 유사 반응을 촉진한다. 따라서, 염색체 불안정성을 촉진하는 약제를 투여함으로써, 종양 세포는 면역계 및 다양한 면역 요법에보다 민감해질 수 있다.
조성물
본 발명은 또한 화학 요법제를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 약제는 폴리펩티드, (예컨대, 발현 카세트 또는 발현 벡터 내) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 소분자, 본원에 기술된 방법에 의해 확인된 화합물, 또는 이들의 조합일 수 있다. 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. "약학적으로 허용가능한"은 담체, 희석제, 부형제 및/또는 염이 제형의 다른 성분과 상용성이며, 이의 수용자에게는 해롭지 않음을 의미한다.
조성물은 임의의 편리한 형태로 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 킨신-13, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 이러한 킨신-13, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2 단백질 또는 폴리펩티드의 조합을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 조성물은 킨신-13, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2 단백질을 코딩하는 핵산 세그먼트를 포함하는 킨신-13, MCAK, ABCC4 및/또는 ABCG2 핵산 또는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 또는 발현 카세트는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 중 어느 하나와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 화학 요법제 (예컨대, 폴리펩티드, (예컨대, 발현 카세트 또는 발현 벡터 내) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 소분자, 본원에 기술된 방법에 의해 확인된 화합물, 또는 이들의 조합)는 "치료적 유효량"으로 투여된다. 이러한 치료적 유효량은 원하는 생리학적 효과, 예컨대, 암의 하나 이상의 증상의 감소를 얻기에 충분한 양이다. 예를 들어, 화학 요법제는 세포 전이를 5%, 또는 10%, 또는 15%, 또는 20%, 또는 25%, 또는 30%, 또는 35%, 또는 40%, 또는 45%, 또는 50%, 또는 55%, 또는 60%, 또는 65%, 또는 70%, 또는 80%, 또는 90%, 095%, 또는 97%, 또는 99%, 또는 5% 내지 100% 사이의 임의의 수의 백분율까지 감소시킬 수 있다. 암의 증상은 또한 종양 악액질, 종양 유도성 통증 병태, 종양 유도성 피로, 종양 성장 및 전이성 확산을 포함할 수 있다. 따라서, 화학 요법제는 또한 종양 악액질, 종양 유도성 통증 병태, 종양 유도성 피로, 종양 성장 또는 이들의 조합을 5%, 또는 10%, 또는 15%, 또는 20%, 또는 25%, 또는 30%, 또는 35%, 또는 40%, 또는 45%, 또는 50%, 또는 55%, 또는 60%, 또는 65%, 또는 70%, 또는 80%, 또는 90%, 095%, 또는 97%, 또는 99%, 또는 5% 내지 100% 사이의 임의의 수의 백분율까지 감소시킬 수 있다.
원하는 효과(들)를 달성하기 위해, 화학 요법제는 단일 또는 분할 투여량으로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 화학 요법제는 다른 투여량이 유익한 결과를 제공할 수 있지만, 체중에 대해 적어도 약 0.01 mg/kg 내지 약 500 내지 750 mg/kg, 적어도 약 0.01 mg/kg 내지 약 300 내지 500 mg/kg, 적어도 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 내지 300 mg/kg 또는 적어도 약 1 mg/kg 내지 약 50 내지 100 mg/kg의 투여량으로 투여될 수 있다. 투여되는 양은 투여를 위해 선택된, 포유동물에 대한 소분자, 화합물, 펩티드 또는 핵산의 유형, 질환, 체중, 신체 병태, 건강 및 연령을 비제한적으로 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자는 동물 모델 또는 당업계에서 이용 가능한 다른 시험 시스템을 이용하여 임상의에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 화학 요법제의 투여는, 예를 들어, 수용자의 생리학적 병태에 따라, 투여의 목적이 치료적 또는 예방적인지, 및 숙련된 실무자에게 공지된 다른 요인에 따라 단일 용량으로, 다중 용량으로, 연속적이거나 간헐적인 방식으로 존재할 수 있다. 본 발명의 화학 요법제 및 조성물의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나 일련의 이격된 용량일 수 있다. 국소 및 전신 투여가 모두 고려된다.
조성물을 제조하기 위해, 소분자, 화합물, 폴리펩티드, 핵산, 발현 카세트 및 다른 약제가 필요 또는 원하는 바에 따라 합성 또는 달리 수득되거나 정제된다. 이들 소분자, 화합물, 폴리펩티드, 핵산, 발현 카세트 및 다른 약제는 약학적으로 허용가능한 담체에 현탁되고/되거나 동결 건조되거나 달리 안정화될 수 있다. 소분자, 화합물, 폴리펩티드, 핵산, 발현 카세트, 다른 약제 및 이들의 조합은 적절한 농도로 조정될 수 있고 임의로 다른 약제와 조합될 수 있다. 단위 용량에 포함된 소정의 소분자, 화합물, 폴리펩티드, 핵산 및/또는 다른 약제의 절대 중량은 광범위하게 다양할 수 있다. 예를 들어, 약 0.01 내지 약 2 g, 또는 약 0.1 내지 약 500 mg의 하나 이상의 분자, 화합물, 폴리펩티드, 핵산 및/또는 다른 약제, 또는 복수의 분자, 화합물, 폴리펩티드, 핵산, 및/또는 다른 약제가 투여될 수 있다. 대안적으로, 단위 투여량은 약 0.01 g 내지 약 50 g, 약 0.01 g 내지 약 35 g, 약 0.1 g 내지 약 25 g, 약 0.5 g 내지 약 12 g, 약 0.5 g 내지 약 8 g, 약 0.5 g 내지 약 4 g, 또는 약 0.5 g 내지 약 2 g으로 다양할 수 있다.
본 발명의 화학 요법제의 일일 용량이 또한 다양할 수 있다. 이러한 일일 용량은 예를 들어 약 0.1 g/일 내지 약 50 g/일, 약 0.1 g/일 내지 약 25 g/일, 약 0.1 g/일 내지 약 12 g/일, 약 0.5 g/일 내지 약 8 g/일, 약 0.5 g/일 내지 약 4 g/일, 및 약 0.5 g/일 내지 약 2 g/일의 범위일 수 있다.
치료에 사용하기 위한 화학 요법제의 양은 선택된 특정 담체뿐만 아니라 투여 경로, 치료되는 암 병태의 성질 및 환자의 연령 및 병태에 따라 달라질 것임이 이해될 것이다. 궁극적으로 담당 의료인은 적절한 투여량을 결정할 수 있다. 또한, 약학 조성물은 단일 단위 투여 형태로서 제형화될 수 있다.
따라서, 화학 요법제(들)를 포함하는 하나 이상의 적합한 단위 투여 형태는 비경구 (피하, 정맥 내, 근육 내 및 복강 내 포함), 경구, 직장, 피부, 경피, 흉강 내, 폐내 및 비강내(호흡기) 경로를 포함하여 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 화학 요법제(들)는 또한 서방형을 위해 제형화될 수 있다 (예를 들어, 마이크로캡슐화를 사용하여, WO 94/07529 및 미국특허 제4,962,091호 참고). 적절한 경우, 제형은 별개의 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있고 약학 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 화학 요법제를 액체 담체, 고체 매트릭스, 반고체 담체, 미분 고체 담체 또는 이들의 조합과 혼합한 다음, 필요한 경우, 생성물을 원하는 전달 시스템으로 도입 또는 성형하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 화학 요법제(들)는 편리한 담체, 예컨대, 나노 입자, 알부민, 폴리알킬렌 글리콜에 연결되거나 전구약물 형태로 공급될 수 있다. 화학 요법제(들) 및 이들의 조합은 담체와 조합되고/되거나 비히클, 예컨대, 리포좀에 캡슐화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 수용액, 현탁액, 정제, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 및 리포좀 및 다른 서방형 제형, 예컨대, 성형된 중합체 겔을 포함하는 많은 형태로 제조될 수 있다. 억제제의 투여는 또한 수용액 또는 서방형 비히클에서의 비경구 또는 국소 투여를 포함할 수 있다.
따라서, 화학 요법제(들) 및/또는 다른 약제는 때때로 경구 투여 형태로 투여될 수 있지만, 이 경구 투여 형태는 제형화되어, 소분자, 화합물, 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 이들의 조합이 치료적 유용성을 제공하기 전에 분해 또는 파괴로부터 소분자, 화합물, 폴리펩티드, 핵산, 발현 카세트, 및 이들의 조합을 보호할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 소분자, 화합물, 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및/또는 다른 약제가 위를 통과한 후에 장으로 방출되도록 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 예를 들어, 미국특허 제6,306,434호 및 그에 함유된 참고 문헌에 기술되어 있다.
액체 약학 조성물은 예를 들어, 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 유화제, 시럽제 또는 엘릭시르제, 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 구성하기 위한 건조 분말의 형태일 수 있다. 이러한 액체 약학 조성물은 통상적인 첨가제, 예컨대, 현탁제, 유화제, 비수성 비히클 (식용유를 포함할 수 있음), 또는 보존제를 함유할 수 있다. 약학 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유화제와 같은 형태를 취할 수 있으며, 제형화제, 예컨대, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 적합한 담체에는 식염수 용액, 캡슐화제 (예컨대, 리포좀) 및 기타 물질이 포함된다. 화학 요법제(들) 및/또는 다른 약제는 담체의 존재 또는 부재 하에서 건조 형태 (예컨대, 동결 건조 형태)로 제형화될 수 있다. 담체를 원하는 경우, 담체는, 편리한 액체 중 건조 형태, 현탁액 또는 가용성 농축 형태로 포장된 억제제에 추가하기 위해 약학 형태로 포함되거나, 별도의 용기에 별도로 포장될 수 있다.
화학 요법제(들) 및/또는 다른 약제는 비경구 투여(예컨대, 주입, 예를 들어, 볼루스 주입 또는 연속 주입에 의함)를 위해 제형화될 수 있고, 앰플, 미리충전된 실린지, 첨가된 보존제를 포함하는 소 부피의 주입 용기 또는 다회 용량 용기 에 단위 투여 형태로 제시될 수 있다.
조성물은 또한 다른 성분, 예컨대, 화학 요법제, 항 바이러스제, 항박테리아제, 항미생물제 및/또는 보존제를 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 추가의 치료제의 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 알킬화제, 예컨대, 질소 머스타드, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아, 에틸렌이민 및 트리아젠; 항대사산물, 예컨대, 엽산 길항제, 퓨린 유사체 및 피리미딘 유사체; 항생제, 예컨대, 안트라사이클린, 블레오마이신, 미토마이신, 닥티노마이신 및 플리카마이신; 효소, 예컨대, L-아스파라기나아제; 파르네실-단백질 전이 효소 억제제; 호르몬제, 예컨대, 글루코코르티코이드, 에스트로겐/항에스트로겐, 안드로겐/항안드로겐, 프로게스틴 및 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 아나타고니스트(anatagonist), 옥트레오티드 아세테이트; 미세소관 파괴제, 예컨대, 엑틴아시딘(ecteinascidin) 또는 이의 유사체 및 유도체; 미세소관 안정화제, 예컨대, 파클리탁셀 (Taxol®), 도세탁셀 (Taxotere®), 및 에포틸론 A-F 또는 이의 유사체 또는 유도체; 식물 유래 생산물, 예컨대, 빈카 알칼로이드, 에피포도필로톡신, 탁산; 및 토포아이소머라아제 억제제; 프레닐-단백질 전이 효소 억제제; 및 여러가지 약제, 예컨대, 하이드록시우레아, 프로카바진, 미토타인, 헥사메틸멜라민, 백금 배위 착물, 예컨대, 시스플라틴 및 카보플라틴; 및 항암제 및 세포 독성제로서 사용되는 기타 약제, 예컨대, 생물학적 반응 개질제, 성장 인자; 면역 조정제 및 모노클로날 항체. 조성물은 또한 방사선 요법과 함께 컨쥬게이션되어 사용될 수 있다.
본 설명은 다음 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 임의의 방식으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 인용된 모든 참고 문헌 (문헌 참조, 발행된 특허, 본 출원 전체에 인용된 공개 특허 출원 포함)의 내용은 본원에 명백히 참조로 원용된다.
실시예 1 : 재료 및 방법
이 실시예는 본 발명의 개발에 사용된 일부 재료 및 방법을 기술한다.
1차 전이 매칭된 쌍의 게놈 분석.
매칭된 1차 종양 및 정상을 포함하는 61개 뇌 전이로부터의 전체 엑솜 DNA 서열 데이터 (Brastianos et al. Cancer Discovery 5, 1164-1177 (2015))는 유전자형 및 표현형(dbGAP) 데이터베이스로부터 다운로드하여 (McGranahan et al. Science 351, 1463-1469 (2016))에 기술된 바와 같이 처리하여, 각 샘플에 대한 대립 유전자 특이적 분절된 DNA 카피 수 데이터를 얻었다. 종양 배수성과 관련된 비정상으로 분류된 게놈의 비율을 기술하는 가중된 게놈 불안정성 지수 (wGII)는 (Burrell et al., Nature 494, 492-496 (2013))에 기술된 바와 같이 결정되었다.
Mitelman 데이터베이스 분석.
Mitelman 데이터베이스에서 이용 가능한 모든 유방 선암종 사례 (Mitelman et al. Database of Chromosome Aberrations and Gene Fusions in Cancer. cgap.nci.nih.gov, cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman에서 이용가능함)를 분석하였다. 1차 문헌은 샘플의 공급원(1차 종양 또는 전이)을 결정하기 위해 검토 되었다. 클론 핵형이 범위로서 보고되는 경우, 이 클론에 대한 평균값을 사용하였다. 핵형 이상은 클론의 전체 핵형으로부터의 수치적 이상뿐만 아니라 구조적 이상을 포함한다.
HNSCC에서 염색체 분리 분석.
1차 종양 표본은 두경부 편평 상피 세포 암종(HNSCC)을 갖는 60명의 환자로부터 분석되었다(Chung et al. Cancer Cell 5, 489-500 (2004)). 40명의 환자는 고해상도 현미경 분석을 위해 충분한 품질의 헤마톡실린 및 에오신-염색된 (H&E) 1차 종양 샘플을 가졌다. 분석은 전술한 바와 같이 후기를 겪고 있는 동안 고정된 세포로 제한되었다(Bakhoun et al. Clin. Cancer Res. 17, 7704-7711 (2011); Zaki et al. Cancer 120, 1733-1742 (2014)). 염색체 비분리는 후기 동안 남아 있는 분리 염색체 사이의 헤마톡실린 염색 존재에 의해 정의되었으며, 염색체 비분리의 증거와 함께 후기를 겪는 세포의 백분율로서 보고되었다. 임상 림프절 상태는 림프절 종양 침습의 임상적 검사 또는 방사선학적 증거에 의해 정의되었다 (Chung et al. Cancer Cell 5, 489-500 (2004)).
단일 세포 핵형.
배양물을 최종 농도 0.1μg ml-1 에서 콜세미드로 처리하였다. 37℃에서 45 분 동안 항온처리한 후, 배양물을 트립신처리하고, 예열된 0.075M KCl에 재현탁시키고, 37℃에서 추가 10분 동안 항온처리하고 메탄올-아세트산(3:1)에 고정시켰다. 이어서, 고정된 세포 현탁액을 슬라이드 상에 떨어뜨리고, 5분 동안 0.08㎍/ml 2xSSC 중 DAPI로 염색하고, 안티페이드 용액 (Vectashield, Vector Labs)에 장착하였다. 중기 스프레드(spread)는 GenASI Cytogenetic suite (Applied Spectral Imaging, Carlsbad)가 장착된 Nikon Eclipse E800 형광 현미경을 사용하여 포착되었다. 각각의 샘플에 대해, 최소 20개의 반전된 DAPI-염색된 중기는 완전히 핵형화되었고, 국제 인간 세포 유전학 명명법(ISCN) 2013에 따라 분석하였다.
세포 배양.
세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 구입하였다. 종양(MDA-MB-231 및 H2030) 및 293T 세포를 페니실린 (50 Uml-1) 및 스트렙타비딘 (50μgml-1)의 존재하에 10% FBS 및 2mM의 L-글루타민이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 모든 세포는 마이코플라스마에 대해 음성으로 시험되었다. 세포 밀집도는 IncuCyte 생세포 분석 시스템(Essen Bioscience)을 사용하여 측정되었다.
면역형광 현미경 검사법.
세포 고정 및 항체 염색은 (Bakhoun et al. Nat Commun 6, 5990 (2015))에 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략히, 세포는, 동원체, 중심체, cGAS, 비멘틴, β-액틴, 또는 α-튜불린에 대한 염색시, 아이스 콜드(ice-cold) (-30℃) 메탄올로 15분 동안, 또는 RelB, p65, IRF3, ssDNA, dsDNA, CoxIV 또는 β-카테닌에 대한 염색시, 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 이어서, 세포를 1% 트리톤을 사용하여 4분 동안 투과시켰다. 항체 정보에 대해 표 1 참고.
표 1: 면역형광을 위해 사용된 항체
Figure pct00054
사이토졸 dsDNA 및 ssDNA 염색에 사용되는 선택적 원형질막 투과화를 위해, 세포는 고정 후 5분 동안 0.02% 사포닌으로 처리하였다. 단일 가닥(Thermo Fisher FEREN0321) 및 이중 가닥(Life Technologies - EN0771)-특이적 뉴클레아제 처리를 위해, 세포를 2분 동안 0.02% 사포닌으로 투과시키고, 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정하기 전에 10분 동안 뉴클레아제로 처리하였다. TBS-BSA는 항체 염색 동안 차단제로서 사용되었다. DAPI는 이차 항체와 함께 추가되었다. 세포를 Prolong Diamond Antifade Mountant(Life Technologies - P36961)에 장착하였다.
면역블랏팅.
세포를 펠렛화하고 RIPA 완충제를 사용하여 용해시켰다. 단백질 농도는 BCA 단백질 검정을 사용하여 결정하고 20-30mg의 총 단백질을 각 레인(lane)에 로딩하였다. 단백질을 구배 SDS-PAGE에 의해 분리시키고 PVDF 막으로 옮겼다. 항체 정보에 대해 표 2 참고.
표 2: 면역블랏을 위해 사용된 항체
Figure pct00055
도 6d에 도시된 정량적 비교를 위해, 3개의 생물학적 복제물로부터의 면역 블랏을 사용하였다. 밴드 강도는 ImageJ (imagej.nih.gov/ij의 웹사이트 참고)를 사용하여 수득하였으며, β-액틴 (적재 제어)으로 정규화하고 백그라운드(background)를 뺀다. 세포를 제어하기 위해 비율을 표준화하였다.
녹다운 및 과발현 작제물.
루시퍼라제 발현은 pLVX 플라스미드 (tdTomato 발현)를 사용하여 달성하였고, 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 세포를 tdTomato 발현을 위해 분류하였다. 키네신-13 발현은 플라스미드(pEGFP) 형질주입 또는 렌티 바이러스 (pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro) 발현을 사용하여 달성되었으며, 여기서 세포는 각각 G418 (0.5 mgml-1) 또는 퓨로마이신 (5 μgml-1)을 사용하여 선택하였다. Dnase2 과발현은 선택을 위해 사용된 퓨로마이신과 함께 pLenti-GIII-CMV-RFP-2A-Puro 플라스미드를 사용하여 달성하였다. 키네신-13 또는 라민 B2 (pQCXIB-mCherry-lmnb2) 작제물을 함유하는 플라스미드는 각각 Compton 및 Hetzer Laboratories에 의해 친절하게 제공되었다. 블라스티시딘을 사용하여 10 μg/ml-1 에서 lmnb2 발현 세포를 선택하였다. 다른 모든 플라스미드는 Applied Biological Materials Inc. (www.abmgood.com)에서 구입하였다. STING, NFKB2, RelB 및 cGAS의 안정적인 녹다운은 pRRL (SGEP 또는 SGEN) 플라스미드에서 shRNA를 사용하여 달성되었으며 MSKCC RNA 간섭 코어로부터 수득하였다. 표적 당 2 내지 4개의 별개의 shRNA 헤어핀을 스크리닝하였다. 표적화된 shRNA 서열은 표 3에 열거되어 있다.
표 3: 안티센스 shRNA 서열
Figure pct00056
동물 연구.
동물 실험은 Weill Cornell 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다. 질환-특이적 생존의 경우, 거듭제곱(power) 분석은 그룹 당 10 마리의 마우스가, 대조군에서 3 개월의 중앙 질환-특이적 생존 및 250일의 총 추적기간을 고려할 때, 80% 거듭제곱 및 95% 신뢰도로 <0.2 또는 >5의 상대적 위험률(relative hazard ratio)에서의 차이를 검출하기에 충분할 것으로 나타났다. 동물을 무작위로 분류할 필요가 없었다. 조사자은 그룹 할당에 대해 맹목적이지 않았다. 심장 내 주입은 전술한 바와 같이 수행되었다(Chen et al. Nature 533, 493-498 (2016)). 간략히, 세포를 트립신처리하고 PBS로 세척하고 (100μl의 PBS 중) 1x105 세포를 암컷 무흉선 6-7 주령 무흉선 누드(nu/nu) 마우스(Jackson Laboratory strain 002019)의 좌심실에 주입하였다. 이어서 마우스에 D-루시페린 (150 mgkg-1)을 즉시 주입시키고 tan IVIS Spectrum Xenogen 기기 (Caliper Life Sciences)를 사용하여 생물발광 이미징 (BLI)을 실시하여 종양 세포의 전신 전염을 가능하게하였다. BLI를 사용하여 주입 후 5 주차에 전이성 부담(burden)을 측정하였고 MDA-MB-231 마우스의 경우 BLI 이미지를 1-2 주마다 최대 17 주 동안 촬영하였다. BLI 이미지는 Living Image Software v.2.50을 사용하여 분석하였다.　질환-특이적 생존 엔드포이트는, 마우스가 사망하거나 IACUC 프로토콜 하에서 안락사에 대한 기준을 충족시키는 경우 충족되고 전이성 질환의 방사선학적 증거를 갖는다. 동소(Orthotopic) 종양 이식을 위해, 50μl의 PBS 중 2.5x105 세포를 Matrigel (BD Biosciences)과 1 : 1로 혼합하고 제4 유선 지방 패드 내에 주입하였다. 동물 당 하나의 종양 만이 이식되었다. 1차 종양은 최대 치수가 ~ 1.5 cm에 도달했을 때 외과적으로 촉발되었고, 전이성 전염은 1 주 내지 3 주 간격으로 최대 30 주 동안 BLI 이미징을 사용하여 평가되었다.　BLI 신호가 1차 종양 이식 부위 외부에서 보이는 경우, 원격 무전이 생존 엔드포인트가 충족되었다. 1차 종양 및 전이로부터 단기 배양을 유도하기 위해 마취된 동물 (이소플루오란)을 이미지화한 다음 희생시켰다. 그 뒤에, 전이성 병변의 정확한 위치를 정의하기 위해 수확된 장기에 대해 엑스-비보(Ex-vivo) BLI를 수행하였다. 그 뒤에, 1차 종양 및 전이는 기계적으로 해리되고 DMEM에서 선택 배지와 함께 배양되어 종양 세포를 선택하였다. 모든 후속 검정은 한 번의 계대 후에 수행되었다.
환자 유래 이종이식편(PDX) 검정.
인간 전이성 유방암의 PDX 모델은 여성 NOD-scid IL2Rgammanull (NSG)(Jackson Laboratories strain 005557)에서 IRB 승인 프로토콜 (MSKCC IRB # 97-094)에 동의한 환자로부터 새로 얻은 외과적으로 절제된 종양 표본을 이식함으로써 성공적으로 생성하였다. 에스트로겐 수용체-양성 PDX는 뼈에 전이된 유방암으로부터 유래되었다. 삼중-음성 PDX는 염증성 유방암 환자의 액와 림프절 전이로부터 확립되었다. PDX는 최대 3번의 연속 계대 동안 유지되었다. 간략히, 새로 수득한 종양 조직 표본을 마우스의 유선 지방 패드에 직접 이식하거나, GFP-루시퍼라제 또는 pUltra-Chili-Luc 플라스미드 (Addgene 플라스미드: 48688)에서 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 비필수 아미노산을 갖는 혈청이 없는 MEM 배지(Cat# 41500018, Thermofisher)에서 1-2mm 조각으로 다진 다음 마우스로 이식하였다. 일반적으로, 생착 후 첫 1-3 주 동안 PDX 종양 성장이 명백해졌으며, 종양은 추가 4-8 주 동안 계속 성장하였다. BLI 또는 스펙트럼 CT 이미지화를 사용하여 1차 종양 성장 및 전이를 추적하였다. 1차 종양 및 전이의 수확 시점에서, 본 발명자들은 1차 종양 및 폐 및 간 전이로부터 직접 1차 세포 배양을 유도하였다. 간략히, 500 mg의 신선한 벌크 종양 조직을 1-2 mm3 크기의 조각으로 잘게 자르고 세포 탈착 및 1-2 시간에 걸친 분리를 위해 Accutase (AT104; Innovative Cell Technologies)에서 항온처리하였다. 해리된 조직을 100μm 세포 스트레이너(strainer)를 통해 시빙(sieving)하고 1200 RPM에서 원심 분리하여 세포를 펠렛화하였다. 펠렛을 세척하고 3% FBS로 상기 MEM 완충액에 재현탁시켰다. 하나의 계대 후 염색체 비분리에 대해 세포를 분석하였다.
RNA 시퀀싱 및 분석. QIAShredder (Qiagen - 79654) 및 RNA 추출 키트 (Qiagen - 74106)를 사용하여 세포로부터 벌크 RNA를 추출하고 HiSeq2500 또는 HiSeq4000 (Illumina Inc.)을 사용하여 시퀀싱하였다. 원본(raw) FASTQ 파일의 품질을 FastQC(웹 사이트 bioinformatics.babraham. ac.uk/projects/fastqc/ 참고)로 확인한 후 STAR (v2.4.1d, 2-패스 모드)를 사용하여 인간 참조 GRCh38에 매핑하였다 (Dobin et al. Bioinformatics 29, 15-21 (2013)). 유전자 발현은 cufflinks (v2.2.1, 기본 매개 변수) 및 HTSeq (v0.6.1)를 사용하여 추정되었다 (Trapnell et al. Nat Biotechnol 28, 511-515 (2010); Anders et al. Bioinformatics 31, 166-169 (2015)). 　DESeq2 (v1.14.1)를 사용하여 차등 발현 분석을 수행하였다(Love et al. Genome Biol. 15, 550 (2014)). 감독되지 않은 분석에 앞서, DESeq2 R 패키지를 사용하는 분산-안정화 변환을 사용하여 발현 카운트를 변환하였다. 모든 사용자 코드, 통계 분석 및 시각화는 Python or R에서 수행되었다. Nextflow를 사용하여 일부 전산적 파이프라인을 관리하였다 (웹 사이트 nextflow.io 참고).
단일 세포 RNA 시퀀싱.
세포를 트립신처리하고 PBS에 재현탁시켰다. 400 세포/μl, > 95% 생존율에서 세포 현탁액 21μl를 10X Genomics Chromium 플랫폼 상에 로딩하여 바코딩된 단일 세포 GEM을 생성하였다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 (scRNA-seq) 라이브러리는 10X Genomics 사양 (Single Cell 3' Reagent Kits User Guide PN-120233, 10x Genomics, Pleasanton, CA, USA)에 따라 제조되었다. GEM-역전사(RT) (2 시간 동안 55 ℃, 5분 동안 85 ℃; 4 ℃에서 유지)는 96-Deep Well Reaction Module (Bio-Rad, Hercules)을 갖춘 C1000 Touch Thermal cycler에서 수행되었다. RT 후, GEM을 분리시키고 단일 가닥 cDNA는 DynaBeads MyOne Silane Beads (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 및 SPRIselect 시약 키트 (0.6 × SPRI; Beckman Coulter)로 세척되었다.　cDNA는 96-Deep Well Reaction Module (3 분 동안 98 ℃; 15 초 동안 98 ℃, 20 초 동안 67 ℃, 및 1 분 동안 72 ℃ x 14 사이클; 1 분 동안 72 ℃; 4 ℃에서 유지)과 함께 C1000 Touch Thermal cycler를 사용하여 14주기 동안 증폭되었다. cDNA의 품질은 Agilent Bioanalyzer 2100 (Santa Clara, CA)을 사용하여 분석되었다.　생성된 cDNA를 Covaris S220 기기 (Covaris, Woburn, MA)를 사용하여 ~ 200bp로 전단하고 0.6 x SPRI 비드를 사용하여 세정하였다. 생산물은 말단- 수리되고, 'A'-꼬리가 있으며 키트에 제공된 어댑터에 결찰되었다. 키트에서 제공하는 지수 (45 초 동안 98 ℃; 20 초 동안 98 ℃, 30 초 동안 60 ℃, 및 20 초 동안 72 ℃ x 14 사이클; 72 ℃에서 1 분 동안; 4 ℃에서 유지)를 사용하여 10주기의 PCR 증폭을 통해 각 라이브러리에 대한 고유한 샘플 인덱스를 도입하였다. 2 회 SPRI 세정 후, Qubit 형광 측정 정량화 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 라이브러리를 정량화하고 Agilent Bioanalyzer 2100에서 품질을 평가하였다. 4개의 라이브러리를 풀링(pooling)하고 페어 엔드 판독 플로우 셀에서 10pM에서 HiSeq2500 빠른 모드로 클러스터링하고 98 사이클의 R1 이후에 R2에서 14bp I7 인덱스 (10X 바코드), 8bp I5 인덱스 (샘플 인덱스) 및 10bp(UMI) 동안 시퀀싱하였다. 시퀀싱 이미지의 1차 처리는 Illumina의 실시간 분석 소프트웨어 (RTA)를 사용하여 수행되었다. 디멀티플렉싱(Demultiplexing) 및 사후 처리는 제조업체 권장 사항에 따라 10X Genomics Cell Ranger 파이프라인을 사용하여 수행되었다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터 (scRNA-seq)는 Cell Ranger 파이프라인을 사용하여 원본 판독으로부터 분자 카운트 검정으로 처리되었다(Zheng et al. Nat Commun 8, 14049 (2017)). 또한, 분석에 대한 실험 아티팩트(artifact)의 영향을 최소화하기 위해, 데이터는 전처리되어 낮은 총 분자 카운트 (라이브러리 크기), 낮은 복잡성 및 높은 미토콘드리아 함량을 갖는 세포를 필터링하고 바이모달 적합(bimodal fit)으로 식별하였다. 세포 내 각 유전자의 발현 수준을 총 라이브러리 크기로 나눈 다음 모든 세포의 중앙 라이브러리 크기로 스케일링함으로써 나머지 세포를 정규화하였다. 라이브러리 크기로 정규화한 후; 드롭아웃 노이즈(dropout noise)의 대체(imputation)에 대한 확산 고유 값을 계산할 때 생성된 Markov Matrix의 견고성을 개선하기 위해 주요 구성성분 분석(principal component analysis(PCA))을 수행하였다 (van Dijk et al. bioRxiv (2017)). 주 구성성분(principle component)의 수는 데이터에서 대략 80%의 분산을 유지하고 제1 주 구성성분을 제외하도록 선택되었으며, 이는 라이브러리 크기와 높은 상관 관계가 있다. 정규화 및 비정규화 카운트 매트릭스의 대체는 3의 거듭 제곱된 Markov matrix (거듭 제곱은 대략 가중된 가장 가까운 이웃의 수에 상응함)를 사용하고, (van Dijk et al. bioRxiv (2017))에 기술된 바와 같이 21개의 가장 가까운 이웃한 세포에 따라 계산된 유전자 발현 분포를 사용하여 수행하였다. 부분 집단은 Phenograph (Levine et al. Cell 162, 184-197 (2015)) 를 사용하여 식별되었으며, 하나 이상의 부분 집단에서 차등적으로 발현된 유전자는 매칭된 분자의 무작위 다운 샘플링을 위한 부트스트랩 방법 및 각 부분 집단으로부터의 세포 카운트를 사용하여 Kruskal-Wallis 순위 통계에 의해 식별되었다.　t-분포 확률적 임베딩 (t-SNE)을 사용하여 상위 5,150개의 차등적으로 발현된 유전자에 의해 서브세트된 대체 카운트 매트릭스의 제1 20 가지 주 구성성분에 기초한 부분 집단 구조를 시각화 하였다(Kruskal Wallis 순위 통계의 거짓 발견률(False Discovery Rate (FDR)). q는 <0.05). 다른 소집단 대비 집단 M에서 주요 유전자 시그니처의 평균 발현을 z-정규화하고 바이올린 플롯으로 시각화하였다. 모든 유전자 시그니처는 실시예 1의 말미에 주석을 달았다.　유전자 시그니처 사이의 상관 관계는 세포 당 시그니처 당 모든 유전자의 평균 발현에 따라 스페어만 순위 상관계수를 사용하여 계산되었다. Ward의 최소 분산 방법은 차별적으로 발현된 상피에서-중간엽으로의 이행(EMT) 유전자의 정규화된 발현에 의해 계층적인 클러스터 세포에 적용되었다.
환자 생존 분석.
생존 분석에 사용되는 유전자에는 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, FGF5, (선택적으로 NTN4)가 포함된다(표 5 참고).
생존 마커를 평가하기 위해 2개의 독립적인 데이터 세트를 사용하였다. 첫번째는 메타 분석 (Gy
Figure pct00057
rffy et al., Breast Cancer Res. Treat. 123, 725-731 (2010))과 검증 코호트 (Hatzis et al. J. Am. Med. Assoc. 305, 1873-1881 (2011))였다.　메타 분석을 위해, KM-Plotter 데이터베이스 (www.kmplot.com)에 기탁된 공개적으로 이용 가능한 마이크로어레이 유전자 발현 데이터 세트가 각 유전자에 대해 다음 마이크로어레이 프로브와 함께 사용되었다 (일부 유전자에는 여러 이름이 있으며 대체 이름이 하기에 나열될 수 있음을 유의): 219132_at (PELI2), 205289_at (BMP2), 207586_at (SHH), 230398_at (TNS4), 227123_at (RAB3B), 213194_at (ROBO1), 227911_at (ARHGAP28), 213385_at (CHN2), 206224_at (CST1), 203305_at (F13A1), 208146_s_at (CPVL), 226492_at, (SEMA6D), 201431_s_at (DPYSL3), 228640_at (PCDH7), 209781_s_at (etoile), 210972_x_at (TRA@), 220169_at (TMEM156), 206994_at (CST4), 266_s_at (CD24), 210311_at (FGF5), 200948_at (MLF2). 메타 분석 코호트의 경우, JetSet 최상의 프로브 세트가 사용되었고 자동 선택은 25th 및 75th 백분위 수 사이의 최상의 컷오프를 위해 사용되었다. DMFS 데이터가 이용 가능한 검증 코호트의 경우 (Hatzis et al. JAMA 305, 1873-1881 (2011)), 데이터 세트 및 중앙값에 대한 z-정규화된 발현 데이터가 컷오프로서 사용되었다. DMFS 곡선은 로그 순위 테스트를 사용하여 비교하였다.　제1 데이터 세트에 대해, 최상의 컷오프 값은 36-백분위 수인 것으로 결정되었고, 그 결과 36-백분위 수 아래인 상기 유전자의 누적 발현이 있는 환자가 더 높은 무전이 생존을 갖도록 사용되었다. 제2 데이터 세트에서, 공개적으로 기탁된 유전자 발현 데이터를 사용하여 차세대 시퀀싱으로부터 유래하였으며 중앙 발현 값을 컷오프로서 사용하여 유사한 결과를 얻었다. 이 유형의 분석에서, 환자 집단 및 사용된 검정에 따라 25-백분위 수 내지 75-백분위 수 범위의 컷오프 값을 사용하는 것이 일반적이므로 이를 포함해야한다.
생체 외 침습 및 이동 검정.
침습 및 이동/주화성 검정을 위해, CytoSelect 세포 침습 (CBA-110) 및 세포 이동 (CBA-100) 키트가 각각 사용되었다. 간략히, 3x105 세포를 혈청이 없는 배지에 현탁시키고 막의 상부에 놓았다. 혈청을 함유하는 배지를 바닥에 놓고 콜라겐 막의 하부 표면으로 침입한 세포를 염색하고 18-24 시간 후에 카운트하였다. 주화성 검정을 위해, 정량화를 위해 비색 접근법 (OD 560nm)을 사용하였다. 스크래치 검정을 위해, 세포가 > 90% 합류(confluence)에 도달할 때 1 시간 동안 미토마이신 C (10 μgml-1)로 처리한 다음, 1% FBS를 함유하는 DMEM에 넣었다.　p200 피펫 팁을 사용하여 상처를 가하고 상처의 이미지를 즉시 그리고 후속 규칙적인 간격으로 취하였다. 상처 표면적의 정량화를 위해 ImageJ를 사용하였다.
사이토졸 DNA의 정량화.
대략 1x107 세포를 용해시키고 미토콘드리아 단리 키트 (Thermo Fisher - 89874)를 사용하여 핵, 사이토졸 및 미토콘드리아 분획을 수득하였다. 후속 DNA 정제를 가능하게하기 위해 프로테아제 억제제를 사용하지 않았다. 미토콘드리아를 12,000xg에서 정제하여 사이토졸 분획에서의 오염을 최소화하였다. 이어서 Qiagen DNeasy 혈액 및 조직 키트 (Qiagen - 69506)를 사용하여 핵, 사이토졸, 미토콘드리아 분획으로부터 DNA를 단리하고 dsDNA를 Qubit dsDNA HS 시약을 사용하여 Qubit 2.0 (Invitrogen)을 사용하여 정량화하였다.
데이터 이용성.
모든 RNA 시퀀싱 데이터는 Sequence Read Archive(SRA, www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)에 기탁되었다. 단일 세포 RNAseq 데이터는 다음 수탁번호 : SRP104750로 기탁되었다. 벌크 RNAseq 데이터는 다음 수탁번호 : SRP104476에 기탁되었다. 웹 사이트 ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/review/SRP104476_20170424_100917_3d522deaf85577451c01974654b36ad3의 링크에서 접근할 수 있다.
생존을 평가하기 위한 CIN 유전자 발현 시그니처 : PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, FGF5, (선택적으로 NTN4). 단백질 및 이들 단백질을 코딩하는 핵산에 대한 서열의 예는 표 5에 제시되어 있다.
표 5. CIN 유전자 발현 시그니처 유전자
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CIN-반응성 비정규(noncanonical) NF-kB 시그니처:
PPARG, DDIT3, NUPR1, RAB3B, IGFBP4, LRRC8C, TCP11L2, MAFK, NRG1, F2R, KRT19, CTGF, ZFC3H1, MACROD1, GSTA4, SCN9A, BDNF, LACTB
* 굵게 표시된 유전자는 억제되었다 (생존 및 TCGA 분석에 음수 값이 사용됨)
비정규 NF-kB 조절성 유전자:
NFKB2, RelB, MAP3K14, TRAF2, TRAF3, BIRC2, BIRC3
* 굵게 표시된 유전자는 억제되었다 (생존 및 TCGA 분석에 음수 값이 사용됨)
정규(Canonical) NF-kB 조절성 유전자:
NFKB1, RelA, TRAF1, TRAF4, TRAF5, TRAF6
인터페론 조절성 유전자
IRF1, IRF3, IRF7, TBK1
상피에서-중간엽으로의 이행(EMT)의 조절인자: VIM, ZEB2, SNAI2, ZEB1
염증 유전자:
RGS16, DENND5A, BTG2, STAT3, IFITM3, CD47, SLAMF7, REL, BCL6, IL18BP, NAMPT, PDE4B,
IL8, PSME2, P2RX4, IFI44, CCR7, KLF10, ADRM1, KLF9, NFIL3, CNP, LDLR, HES1, HLA-A, PARP9, NUB1, STAT2, VIP, TGIF1, PVR, MOV10, PSMA2, EIF4E3, IER3, PLA2G4A, TRAFD1, MYD88, VAMP5, TRIM14, TUBB2A, BPGM, B2M, HRH1, PSMB9, LATS2, PTPN6, DCBLD2, PSMB8, IL1R1, PSMB2, SQSTM1, PTX3, ITGA5, EDN1, SLC31A1, SAMHD1, PNPT1, CSF1, TNFRSF9, SOCS1, RELB, VEGFA, ARL4A, DUSP5, CMKLR1, CD38, SLC4A4, SP110, PLAU, DDX58, PSME1, TRAF1, SPSB1, TDRD7, F2RL1, EPSTI1, SAMD9L, NINJ1, RNF19B, LIF, RIPK1, SLC2A6, IRF7, PTAFR, IRAK2, CD14, ITGB8, SCARF1, KIF1B, FOSL2, SOCS3, DUSP1, IRF1, SLC2A3, HBEGF, CXCL3, TNIP1, AHR, SGMS2, FZD5, GCH1, SLC25A28, OSMR, RSAD2, APOL6, ICOSLG, JAG1, G0S2, GEM, KLF4, NFKB1, STAT1, HLA-C, IFIH1, LY6E, EFNA1, SLC16A6, BHLHE40, TRIM26, CD82, CYBB, IL15RA, GABBR1, RELA, PHLDA2, MAP3K8, NUP93, IL7R, PTPRE, IFI27, SNN, NR4A2, SPPL2A, RHOG, SAT1, SLC7A1, IL6, IL15, RAF1, CCL20, ACVR1B, BIRC2, RBCK1, LAP3, ID2, TNFSF10, SIK1, BST2, PANX1, GADD45A, PML, CD40, TRIM21, SECTM1, SSPN, TXNIP, BTG1, AREG, KYNU, PTGS2, IRS2, C3AR1, STAT4, ATP2A2, BIRC3, MAP2K3, CXCL1, NFKBIA, IFNAR1, MET, NR4A1, CXCL2, EBI3, CD83, DNAJB4, CASP7, PHLDA1, NLRC5, IL1B, TRIM25, IER5, RNF213, IL10, NFAT5, ADAR, PNP, MMP14, ICAM4, PPAP2B, SDC4, ABCA1, DUSP2, EIF2AK2, IER2, HERC6, BMP2, IL7, ISG20, GMPR, PSEN1, XAF1, SERPINB8, MTHFD2, EREG, TNFAIP3, TMEM140, KDM6B, CXCL11, CASP1, CYR61, IRF9, GBP2, ADM, TRIP10, PTGER2, METTL7B, SOD2, OAS2, CSF3, SERPINE1, MXD1, ICAM1, ZC3H12A, BCL3, PFKFB3, OGFR, SRI, IFNAR2, FUT4, IL6ST, TNIP2, DUSP4, PROCR, TLR2, OASL, JAK2, C1S, NMI, UBE2L6, LAMP3, TRIB1, TIPARP, IFIT3, GFPT2, IFI30, PPP1R15A, FAM46A, ELF1, UPP1, NOD1, CCL5, FOS, VAMP8, RTP4, TPBG, IL23A, BEST1, CEBPB, TNFSF15, SCN1B, P2RY2, STAT5A, CHST2, HIF1A, ZFP36, KLF2, LPAR1, EHD1, PLSCR1, PDLIM5, OAS1, CXCL10, JUNB, PFKP, CD274, CD55, TNFSF9, ADORA2B, ETS2, OAS3, CASP8, ISG15, WARS, SLC7A2, TNFRSF1B, PARP14, FAS, SAMD9, EIF1, CD74, TOR1B, PTPN2, MARCKS, ST8SIA4, SEMA4D, LYSMD2, ATF3, FOSB, PSMB10, ISOC1, PSMA3, IFNGR2, SMAD3, RIPK2, MARCH1, DHX58, IL4R, TRIM5, LITAF, B4GALT5, NLRP3, ITGB3, CIITA, IFITM1, PIM1, BTG3, CD44, PLK2, DRAM1, FPR1, RHOB, EGR1, GNAI3, C1R, NCOA3, PARP12, ABI1, RCAN1, EMP3, IRF2, HLA-DMA, LAMB3, MYC, ATP2B1, YRDC, HLA-DRB1, NDP, MCL1, F3, MT2A, IFI44L, SERPINB2, MAFF, FJX1, LGALS3BP, IL18, GADD45B, TLR1, CEBPD, GNA15, CSF2, SPHK1, IFI35, LYN, PNRC1, IRF5, IFITM2, BANK1, AXL, KLF6, PTGER4, CASP3, PMEPA1, TNC, ZBTB10, PCDH7, CCRL2, CDKN1A, CCNL1, PER1, TLR3, B4GALT1, CLCF1, MVP, CFB, NFKBIE, PTPN1, USP18, NFKB2, CASP4, TNFAIP2, ACVR2A, CX3CL1, IFIT1, EMR1, CFLAR, DDX60, IDO1, CFH, IFIT2, NCOA7, INHBA, TIMP1, RNF144B, MX1, ATP2C1, TSC22D1, PELI1, TAPBP, GBP4, CCND1, SLC31A2, SGK1, ZNFX1, RAPGEF6, CCL2, HLA-B, NFE2L2, UBA7, HAS2, JUN, SLC11A2, FOSL1, SELL, PLAUR, BATF2, TNFAIP8, ST3GAL5, TANK, ARID5B, MX2, TAP1.
이동 및 운동성 유전자:
CALD1, CAV2, EGFR, FN1, ITGB1, JAG1, MSN, MST1R, NODAL, PDGFRB, RAC1, STAT3, TGFB1, VIM.
실시예 2: 인간 전이에서 증가된 염색체 불안정성
이 실시예는 염색체 불안정성이 인간 전이와 관련이 있음을 나타내는 실험을 기술하였다.
염색체 불안정성이 인간 전이와 관련이 있는지를 조사하기 위해, 전체 엑솜 서열 데이터를 13개의 종양 유형을 포함하는 61개의 1차 종양과 비교하고 최근에 공개된 코호트로부터의 데이터를 사용하여 뇌 전이와 매칭시켰다 (Brastianos et al. Cancer Discovery 5, 1164-1177 (2015)). 이들 데이터는 염색체 불안정성에 대한 게놈 프록시(proxy)로서 가중된 게놈 무결성(integrity) 지수 (wGII)를 사용하여 재분석하였다. wGII는 평균 종양 배수에서 벗어난 게놈의 백분율을 측정함으로써 카피 수 이질성을 평가한다 (Burrell et al. Nature 494, 492-496 (2013)). 전이가 이들의 매칭된 1차 종양과 비교하여 더 높은 wGII 점수를 가질 가능성이 큰 유의한 편향이 있었다 (도 1aa,ba 내지 1bd, 1h).
제2 접근법을 사용하여, 핵형 정보를 염색체 전좌의 Mitelman 데이터베이스에 보관된 637개의 1차 유방 종양 및 131개의 유방암 전이로부터 분석하였다 (Mitelman et al. cgap.nci.nih.gov/ Chromosomes/Mitelman 웹사이트). 1차 유방 종양은 단일 세포 핵형 분석에 의해 정의된 바와 같이 더 많은 클론을 함유하지만, 정상, 이배체(2n)에 가까운 핵형(near-diploid karyotype)에 대해 강한 편향을 나타냈다. 다른 한편으로, 유방암 전이로부터 유래된 샘플은 삼배체(3n)에 가까운 핵형에 대해 현저한 농축을 보였으며, 1차 종양과 비교하여 클론 당 평균 두 배의 염색체 이상을 가졌다 (도 1c-1e). 삼배체에 가까운 핵형이 염색체 불안정성이 최대화되는 수렴 최적화된 진화적 상태를 나타내는 것으로 추정되었다 (Carter et al. Nat Biotechnol 30, 413-421 (2012); Laughney et al. Cell Rep 12, 809-820 (2015); Storchova et al. J Cell Sci 121, 3859-3866 (2008)). 따라서, 염색체 이상의 수는 이배체와 사배체 (4n) 범위 사이의 핵형을 갖는 종양 샘플에서 가장 높았다 (도 1i).
제3 접근법을 사용하여, 진단 당시 림프절 전이에 대한 임상 데이터를 이용할 수 있는 국소 진행된 두경부 편평 세포 암종 (SCC) 환자에서 채취한 1차 종양 샘플로부터의 데이터를 분석하였다 (Chung et al. Cancer Cell 5, 489-500 (2004)). 염색체 불안정성의 동적인 성질의 척도로서, 본 발명자들은 후기를 겪고 있는 동안 고정된 세포에서 염색체 분리 무결성을 직접 평가하였다(Bakhoun et al. Clin. Cancer Res. 17, 7704-7711 (2011)). 정상적으로 분리되는 염색체 사이에 염색질의 존재는 염색체 비분리에 대한 증거로서 얻어졌다 (도 1f). 관련 림프절 전이가 있는 1차 종양은 림프절 확산(spread)이 없는 종양과 비교하여 더 높은 염색체 비분리 비율을 나타냈다. 유사하게, 종양이 높은 염색체 비분리 비율을 나타내는 환자는 임상적으로 연관된 림프절 전이와 함께 존재할 가능성이 더 높았다 (도 1f, 1j). 이러한 3가지 직교 접근법을 사용하여, 본 발명자들은 염색체 불안정성이 인간 전이에서 풍부하였고 1차 종양에 존재하는 경우 확산에 대한 더 높은 편향과 관련이 있다고 결론내렸다.
실시예 3: 염색체 불안정성이 전이를 유발함
염색체 불안정성이 전이에 인과적으로 관여되는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 유전자 접근법(Bakhoun et al., Nat. Cell Biol. 11, 27-35 (2009); Bakhoun et al., Nat Commun 6, 5990 (2015))을 고안하여, 인간 TNBC (MDA-MB-231) 및 폐 선암종 (H2030)의 이식 가능한 종양 모델에서 염색체 비분리의 비율을 변경하였다. 이들 고도의 전이성 종양 모델로부터의 세포는 각각 후기 세포의 47% 및 67%로 염색체 불안정성의 상승된 기저 속도를 나타내며, 후기 동안 염색체 분리 오류의 증거를 나타낸다 (도 2a, 2ba 내지 2bb). 동요되지 않은(unperturbed) 염색체 분리율을 갖는 이들 세포는 CIN-중 세포로서 지칭된다. 이들 세포에서 Kif2b 또는 MCAK/Kif2c의 과다 발현은 염색체 분리 오류 (CIN-저 세포로서 지칭됨)의 유의한 억제를 초래하였다. 반대로, 지배적인 음성 형태의 MCAK24 (dnMCAK)의 과발현은 MDA-MB-231 세포에서 염색체 분리 오류의 추가 증가를 초래시켰으며, 이는 CIN-고 세포로서 지칭된다 (도 2ba 내지 2bb,도 1l).
키네신-13 단백질의 과발현은 배양 중 세포 증식 속도 또는 세포 당 중심체의 수를 변경시키지 않았다 (도 1k, 1m). 중요한 제어로서, Kif2a는 과발현되었고, Kif2a는 임의의 방추사부착점 또는 동원체 국소화 도메인이 결여된 미세소관-탈중합 키네신-13 단백질의 제3 구성원이다 (Ems-McClung et al. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 276-282 (2010)). Kif2a 과발현은 Kif2b 및 MCAK와 유사한 간기 미세소관에서 미세소관-탈중합 활성을 나타내더라도 염색체 불안정성에 영향을 미치지 않았다 (도 2ba 및 2bb).
모 MDA-MB-231 세포주의 핵형 분석은 염색체적으로 불안정한 세포주로부터 예상되는 바와 같이 광범위하게 이수체 (삼배체에 가까운) 염색체 함량을 나타내었고, 염색체 이상(chromosomal abnormality)뿐만 아니라 유의한 핵형 이질성을 나타냈다 (도 2fa 내지 2fb). 이들 세포에서 염색체 불안정성의 억제는 CIN-중 또는 CIN-고 세포와 비교하여 CIN-저 세포에서 보다 적은 neo-염색체 (비클론적 구조적 이상을 나타내는 염색체)의 존재에 의해 입증된 바와 같이, 단일-세포 유래 클론에서 핵형 이질성의 감소를 초래하였다(도 2g-2i). 예를 들어, 염색체 22는 다른 염색체와 융합되어 동일한 Kif2a-발현 클론 집단 내의 상이한 세포에서 독특한 염색체 조합을 초래하여(도 2j), 염색체 불안정성에 의해 수렴 핵형 진화를 나타낸다. 반대로, 이러한 사건은 CIN-저 클론에서 흔하지 않았다. 그럼에도 불구하고, CIN-저 세포는 고도 이수체 핵형을 유지했지만, 이들 비정상 핵형을 안정된 방식으로 충실하게 전파시켰다 (도 2g, 2i). 염색체적으로 안정한 이수체 세포를 이들의 염색체적으로 불안정한 이수체 대응물과 비교함으로써, 전이에서 이수성에 독립적으로, 염색체 불안정성의 역할을 실험적으로 조사할 수 있다.
MDA-MB-231 세포를 전신 전염을 가능하게 하기 위해 무흉선 마우스의 좌심실에 직접 주입하였다 (도 3j-1 및 3j-2, 0 일). 이어서, 전이성 콜로니화를 생물 발광 리포터 검정을 사용하여 추적하였다. 실험적으로 변경된 염색체 비분리 비율이 전이성 콜로니화에 극적인 영향을 끼쳐, CIN-고 세포를 보유한 마우스는 뇌, 뼈, 폐, 부신 및 연조직에 존재하는 전이를 주입한 후 60 일 이내에 광범위하게 질환에 빠르게 굴복하였다. 반대로, CIN-저 세포를 주입한 마우스는 현저히 낮은 전이성 종양 부담을 나타내었고, 일부는 290 일에 걸쳐 생존하여 207 일의 중앙 생존을 갖는다 (도 2c-2e, 3j). 일부 동물에서, CIN-저 전이는 완화되다가 악화되고, 때때로 자발적으로 해결되는 반면, CIN-고 전이는 다수의 기관에 관여하고 빠르게 진행되어 사망으로 이어지며 (도 3j-1 및 3j-2), 이는. 초기의 염색체 불안정성 및 전이의 유지에 대한 잠재적 역할을 나타낸다. 폐 선암종 H2030 세포의 뇌실내 주입 후 유사한 결과가 얻어졌다 (도 3k).
1차 종양 설정으로부터 시작하여 전이에서 염색체 불안정성의 역할을 평가하기 위해, 본 발명자들은 유방 지방 패드에 MDA-MB-231의 동소 주입 다음, 1차 종양의 외과적 절제를 수행하여 전이성 전염을 위한 시간을 가능하게 하였다 (도 3l, 실시예 1에 기술된 방법 참고). CIN-저, CIN-중 및 CIN-고 종양이 비슷한 속도로 촉진성(palpable) 종양을 형성할 수 있었기 때문에 염색체 불안정성 상태가 1차 종양 이식 효율을 눈에 띄게 변경하지는 않았지만 (도시되지 않음), CIN-고 세포를 동소 주입한 마우스는 CIN-저 종양 세포로 주입된 동물과 비교하여 유의하게 더 짧은 원격 무전이 생존(DMFS)을 나타내며, 이는 전이성 사건이 없는 것이다. 종합적으로, 이들 결과는 염색체 불안정성이 종양 전이의 중요한 요소이며 염색체 불안정성을 억제하는 것이 심지어 고도 비정상 및 이수체 세포에서도 전이 가능성을 감소시킨다는 것을 보여준다.
종양 전염 동안 염색체 불안정성과 관련하여 선택 동역학을 평가하기 위해, 본 발명자들은 주입된 세포뿐만 아니라 1차 종양 또는 전이성 콜로니로부터 유래된 세포 (계대 1)에서의 염색체 비분리를 평가하였다 (도 3j-1 및 3j-2). 이 분석은 2개의 유방암 서브타입 (ER+ 및 TNBC)에 속하는 2개의 전이-수용성 환자-유래 이종이식편(PDX)에서 먼저 수행되었다 (실시예 1 참고). PDX 종양 모델 둘 다에서, 동소 이식된 1차 종양으로부터 유래된 세포는 동일한 동물로부터 유래되는 매칭된 전이와 비교하여 더 낮은 염색체 비분리 비율을 가졌다 (도 3b). 이어서, 이 분석을 MDA-MB-231 세포를 사용하여 반복하였고, 주입된 세포의 염색체 불안정성 상태에 관계없이, 대부분의 전이는 주입된 세포와 비교하여 유의하게 더 높은 비율의 염색체 비분리를 갖는 세포에서 풍부한 것을 발견하였다 (도 3c-3e). 반대로, 대부분의 1차 종양으로부터 유래된 세포는 주입된 세포와 비교하여 유의하게 더 낮은 비율의 염색체 비분리를 가졌다 (도 3d-3e). 유선 지방 패드에 CIN-고 세포가 주입되는 경우(도 3e, 가장 왼쪽 바), 동일한 동물에서 자발적으로 발생하는 전이에서 1회 더 증가하기 전에(도 3e, 'met'이라고 표지된 바에 해당함), 1차 종양에서 염색체 비분리 비율이 유의하게 감소하였다(도 3e, '1차'로 표지된 상응하는 바). 이 결과는 염색체 불안정성으로 인한 빠른 게놈 가소성의 가능성을 보여주고, 전이의 진화 동안 높은 비율의 염색체 비분리에 대한 강한 선택적인 압력을 나타낸다.
실시예 4 : 염색체 불안정성이 중간엽 특성을 풍부하게 함
염색체 불안정성에 대한 반응으로 세포 변화를 조사하기 위해, CIN-저, CIN-중 및 CIN-고 MDA-MB-231 세포의 벌크 RNA 시퀀싱(RNA-seq)을 수행하고 CIN-저 세포와 CIN-중/고 세포를 비교하는 경우 1,584개의 차등적으로 발현된 유전자를 발견하였다(도 3f). 유전자 발현에 대한 주 구성성분 분석 (PCA)은 이들의 염색체 불안정성 상태에 따라 샘플을 정확하게 분리하였다 (도 4f). 유전자 세트 농축 분석 (GSEA)은 전이 관련 유전자 세트가 CIN-저 세포와 비교하여 CIN-중/고 세포에서 가장 고도로 농축된 것으로 밝혀졌으며(도 3g), 이는 염색체 비분리가 전이에서 관찰된 것과 유사한 전사 변화를 유도함을 나타낸다. 실제로, CIN-저 세포와 비교하여 CIN-중/고 세포에서 상위 23개의 차등적으로 발현된 유전자는 메타-분석(Gy
Figure pct00067
rffy et al. Breast Cancer Res. Treat. 123, 725-731 (2010)) 뿐만 아니라 검증 코호트 (Hatzis et al., JAMA 305, 1873-1881 (2011))에서 원격 무전이 생존 (DMFS)을 예측하였기 때문에 인간 유방암 환자에서 매우 예후적이었다(도 3h-3i).
상승된 발현 PREDICTS가 유방암에서 원격 무전이 생존을 증가시킨 23개의 유전자 목록은 염색체 불안정성 (CIN) 시그니처로서 지칭되며, 다음의 상승된 발현을 포함한다: PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, FGF5, 및 NTN4. 이러한 예측력은 종양 서브타입, 등급 및 림프절 상태에 걸쳐 크게 보존되었다. 예를 들어, 23-유전자 염색체 불안정성 (CIN) 시그니처는 CIN-저 세포 환자가 노드 음성, 노드 양성, 2 등급, 3 등급, 1/2 등급, 3 등급, ER+, ER- 및 Her2+ 유방암을 포함하여 다양한 유방암을 갖는 CIN-고 세포 환자에 비해 증가된 원격 무전이 생존을 가짐을 정확하게 확인하였다.
상피에서 중간엽(EMT) 전사 프로그램은 또한 CIN-중/고 세포에서 고도로 농축되었다 (도 4g). 염색체 불안정성이 세포 이질성에 어떻게 영향을 미치는지 더 이해하기 위해, 단일 세포 RNA 시퀀싱 (scRNA-seq)을 총 6,821개의 세포를 포함하는, 2개의 CIN-저 MDA-MB-231 세포주 (Kif2b 및 MCAK) 및 1개의 CIN-고 세포주 (dnMCAK)에서 비드 기반 분자 바코드 기술 (Klein et al. Cell 161, 1187-1201 (2015))을 사용하여 수행하였다. 단일 세포 라이브러리 크기는 샘플에서 일관되었다. 주요 EMT 유전자를 사용한 단일 세포의 클러스터링은 이들의 CIN-상태에 기반하여 대부분의 세포를 성공적으로 분류하였고, 이는 비멘틴 및 ZEB1과 같은 주요 EMT 조절인자를 포함하는 중간엽 마커가 고도로 농축된 세포의 분획을 나타냈다. 이 분획은 주로 dnMCAK 발현 CIN-고 세포로 구성되었다(도 4a). 반대로, CIN-저 세포는 상피 마커에서 고도로 농축되었다.
이 후, 모든 유전자에 기반한 비지도(unsupervised) 그래프 기반 클러스터링 (Levine et al. Cell 162, 184-197 (2015))을 사용하여 편향되지 않은 방식으로 고유 하위 집단을 확인하였다. 상피에서 중간엽으로의 이행 (EMT) 및 전이에 관여하는 유전자의 증가된 발현을 나타내는 하위 집단 (하위 집단 'M'으로서 지칭됨)이 확인되었으며, 이는 염색체 불안정성 (CIN) 유전자 시그니처를 위해 부수적으로 농축되었다. 하위 집단 M은 각각 CIN-저 세포의 오직 6%와 비교하여 총 dnMCAK 발현 세포의 45%를 포함하였다 (도 4b, 도 6i-6j).
이러한 결과는 고해상도 형광 현미경을 사용하여 실험적으로 검증되었으며, 이로써 dnMCAK를 발현하는 세포가 액틴 세포 프레임워크 재구성을 나타내는 (길이 대 폭 비율에 의해 정의된)보다 연장된 특징을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들은 또한 중간엽 특성, 예컨대, 광범위 비멘틴 염색 및 β-카테닌의 국소화를 나타냈다: MCAK 발현 세포의 세포-세포 접합에서부터 dnMCAK 발현 세포의 세포질 및 핵까지 (도 4c, 도 7c-7d). 따라서, 높은 수준의 염색체 불안정성을 갖는 세포는 증가된 이동 용량을 나타내었고 생체 외에서 콜라겐 기저막을 통해 유의하게 더 침습적이었다 (도 4d, 도 7e-7f). 종합적으로, 이들 결과는 염색체 불안정성이 전이성 과정을 용이하게 하는 세포-자율 침습 프로그램을 촉진한다는 것을 입증한다.
실시예 5 : 염색체 불안정성-유도된 세포 내인성 염증
이 실시예는 염색체 불안정성이 내인성 염증을 유도한다는 것을 예시한다.
염색체 불안정성 반응 경로를 추가로 정의하기 위해, scRNA-seq 데이터를 사용하여 유전자-유전자 피어슨 상관 분석을 수행하고 2개의 큰 유전자 모듈을 확인하였다. 모듈 2는 다수의 염증 경로뿐만 아니라 상피에서 중간엽으로의 이행 (EMT)에 관여하는 유전자를 함유하였다 (도 5a).
실시예 1에 기술된 바와 같이, EMT 유전자는 VIM, ZEB2, SNAI2 및 ZEB1을 포함한다. 염증 경로 유전자는 RGS16, DENND5A, BTG2, STAT3, IFITM3, CD47, SLAMF7, REL, BCL6, IL18BP, NAMPT, PDE4B, IL8, PSME2, P2RX4, IFI44, CCR7, KLF10, ADRM1, KLF9, NFIL3, CNP, LDLR, HES1, HLA-A, PARP9, NUB1, STAT2, VIP, TGIF1, PVR, MOV10, PSMA2, EIF4E3, IER3, PLA2G4A, TRAFD1, MYD88, VAMP5, TRIM14, TUBB2A, BPGM, B2M, HRH1, PSMB9, LATS2, PTPN6, DCBLD2, PSMB8, IL1R1, PSMB2, SQSTM1, PTX3, ITGA5, EDN1, SLC31A1, SAMHD1, PNPT1, CSF1, TNFRSF9, SOCS1, RELB, VEGFA, ARL4A, DUSP5, CMKLR1, CD38, SLC4A4, SP110, PLAU, DDX58, PSME1, TRAF1, SPSB1, TDRD7, F2RL1, EPSTI1, SAMD9L, NINJ1, RNF19B, LIF, RIPK1, SLC2A6, IRF7, PTAFR, IRAK2, CD14, ITGB8, SCARF1, KIF1B, FOSL2, SOCS3, DUSP1, IRF1, SLC2A3, HBEGF, CXCL3, TNIP1, AHR, SGMS2, FZD5, GCH1, SLC25A28, OSMR, RSAD2, APOL6, ICOSLG, JAG1, G0S2, GEM, KLF4, NFKB1, STAT1, HLA-C, IFIH1, LY6E, EFNA1, SLC16A6, BHLHE40, TRIM26, CD82, CYBB, IL15RA, GABBR1, RELA, PHLDA2, MAP3K8, NUP93, IL7R, PTPRE, IFI27, SNN, NR4A2, SPPL2A, RHOG, SAT1, SLC7A1, IL6, IL15, RAF1, CCL20, ACVR1B, BIRC2, RBCK1, LAP3, ID2, TNFSF10, SIK1, BST2, PANX1, GADD45A, PML, CD40, TRIM21, SECTM1, SSPN, TXNIP, BTG1, AREG, KYNU, PTGS2, IRS2, C3AR1, STAT4, ATP2A2, BIRC3, MAP2K3, CXCL1, NFKBIA, IFNAR1, MET, NR4A1, CXCL2, EBI3, CD83, DNAJB4, CASP7, PHLDA1, NLRC5, IL1B, TRIM25, IER5, RNF213, IL10, NFAT5, ADAR, PNP, MMP14, ICAM4, PPAP2B, SDC4, ABCA1, DUSP2, EIF2AK2, IER2, HERC6, BMP2, IL7, ISG20, GMPR, PSEN1, XAF1, SERPINB8, MTHFD2, EREG, TNFAIP3, TMEM140, KDM6B, CXCL11, CASP1, CYR61, IRF9, GBP2, ADM, TRIP10, PTGER2, METTL7B, SOD2, OAS2, CSF3, SERPINE1, MXD1, ICAM1, ZC3H12A, BCL3, PFKFB3, OGFR, SRI, IFNAR2, FUT4, IL6ST, TNIP2, DUSP4, PROCR, TLR2, OASL, JAK2, C1S, NMI, UBE2L6, LAMP3, TRIB1, TIPARP, IFIT3, GFPT2, IFI30, PPP1R15A, FAM46A, ELF1, UPP1, NOD1, CCL5, FOS, VAMP8, RTP4, TPBG, IL23A, BEST1, CEBPB, TNFSF15, SCN1B, P2RY2, STAT5A, CHST2, HIF1A, ZFP36, KLF2, LPAR1, EHD1, PLSCR1, PDLIM5, OAS1, CXCL10, JUNB, PFKP, CD274, CD55, TNFSF9, ADORA2B, ETS2, OAS3, CASP8, ISG15, WARS, SLC7A2, TNFRSF1B, PARP14, FAS, SAMD9, EIF1, CD74, TOR1B, PTPN2, MARCKS, ST8SIA4, SEMA4D, LYSMD2, ATF3, FOSB, PSMB10, ISOC1, PSMA3, IFNGR2, SMAD3, RIPK2, MARCH1, DHX58, IL4R, TRIM5, LITAF, B4GALT5, NLRP3, ITGB3, CIITA, IFITM1, PIM1, BTG3, CD44, PLK2, DRAM1, FPR1, RHOB, EGR1, GNAI3, C1R, NCOA3, PARP12, ABI1, RCAN1, EMP3, IRF2, HLA-DMA, LAMB3, MYC, ATP2B1, YRDC, HLA-DRB1, NDP, MCL1, F3, MT2A, IFI44L, SERPINB2, MAFF, FJX1, LGALS3BP, IL18, GADD45B, TLR1, CEBPD, GNA15, CSF2, SPHK1, IFI35, LYN, PNRC1, IRF5, IFITM2, BANK1, AXL, KLF6, PTGER4, CASP3, PMEPA1, TNC, ZBTB10, PCDH7, CCRL2, CDKN1A, CCNL1, PER1, TLR3, B4GALT1, CLCF1, MVP, CFB, NFKBIE, PTPN1, USP18, NFKB2, CASP4, TNFAIP2, ACVR2A, CX3CL1, IFIT1, EMR1, CFLAR, DDX60, IDO1, CFH, IFIT2, NCOA7, INHBA, TIMP1, RNF144B, MX1, ATP2C1, TSC22D1, PELI1, TAPBP, GBP4, CCND1, SLC31A2, SGK1, ZNFX1, RAPGEF6, CCL2, HLA-B, NFE2L2, UBA7, HAS2, JUN, SLC11A2, FOSL1, SELL, PLAUR, BATF2, TNFAIP8, ST3GAL5, TANK, ARID5B, MX2, 및 TAP1을 포함한다.
염색체 불안정성 시그니처 유전자는 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, FGF5, 및 NTN4를 포함한다. 유방암에서 증가된 원격 무전이 생존을 예측하는 상승된 발현을 갖는 23개의 유전자 목록은 이들 유전자의 상승된 발현이 검출될 때 염색체 불안정성(CIN) 시그니처로서 지칭된다.
염증 관련 유전자, 염색체 불안정성 시그니처 유전자, 및 EMT 유전자 사이에는 유의한 상관 관계가 있었으며, 이들 모두는 하위 집단 M이 풍부하였다 (도 4b, 블랙 박스; 도 5b). 벌크 RNA-seq 데이터는 또한 염색체 불안정성-중/고 세포에서 염증 반응 및 TNF-α/NF-κB 경로에 관여하는 유전자에 대한 유의한 농축을 나타내었다 (도 4h). 이들 데이터는 염색체 불안정성과 종양 세포 내인성 염증 사이에 관계가 존재할 수 있음을 나타낸다.
심지어 생체 내 이식 이전에도 염색체 불안정성에 반응하는 세포-내인성 염증의 유도는 예상치 못하며 바이러스 감염을 암시한다. 본 발명자들은 염색체 불안정성이 사이토졸 내에 게놈 DNA를 도입하여, 따라서 항 바이러스 면역을 위해 일반적으로 보유한 내인성 세포 염증을 유발함으로써 세포 염증을 유도할 수 있는지 여부를 알아보았다.
염색체 불안정성-중/고 세포는 1차 종양과 비교하여 전이성 병변으로부터 유래된 세포를 비교할 때 보여지는 바와 같이 미세핵에 대해 더 높은 우세를 나타냈다. 염색체 비분리 비율과 미세핵의 빈도 사이에는 전체적으로 유의한 상관 관계가 있었다 (도 5c-5e, 도 8a-8c).
파열되기 쉬운 미세핵의 존재가 사이토졸 DNA의 생성에 기여하는지를 결정하기 위해, 세포를 선택적인 원형질막 투과화 후 2개의 상이한 항-dsDNA 항체를 사용하여 염색하였다. 각각의 경우에, dnMCAK를 발현하는 세포는 낮은 수준의 염색체 불안정성을 나타내는 세포와 비교하여 유의하게 증가된 사이토졸 dsDNA 및 단일 가닥 DNA (ssDNA)의 수준을 나타냈다 (도 5g). 미토콘드리아 염색으로부터 구별되는 dsDNA 신호는 이중 가닥 특이적 (단일 가닥 특이적이지 않은) 뉴클레아제로 처리한 후 및 Dnase2의 과발현 후 사라지므로 이들 항체의 특이성을 확인하였다 (도 5h).
아세포 분획 후 dsDNA 수준의 직접 정량화는 중간 내지 높은 수준의 염색체 불안정성을 나타내는 세포에 비해 낮은 수준의 염색체 불안정성을 나타내는 세포에서 사이토졸 DNA의 4 배 감소를 나타냈다 (CIN-중/고 세포; 도 5g). 마지막으로, 아세포 분획의 30x 적용범위(coverage)에서의 전체 게놈 시퀀싱은 사이토졸 DNA의 게놈 기원을 확인시켜 주었다 (미도시). 사이토졸 dsDNA가 미세핵 파열로부터 발생한다는 것을 추가로 확인하기 위해, mCherry-Lamin B2는 미세핵 외피를 안정화시키는 수단으로서 과발현되었고 (Hatch et al. Cell 154, 47-60 (2013)), 세포는 Lamin B2 과발현 세포에서 사이토졸 dsDNA 염색의 선택적 감소가 있는지를 확인하기 위해 관찰하였다 (도 5i). 종합적으로, 이들 결과는 염색체 불안정성이 미세핵 파열을 통해 게놈 기원의 사이토졸 DNA를 유도한다는 것을 입증한다.
실시예 6: 사이토졸 DNA 반응으로부터의 전이
이 실시예는 DNA를 사이토졸에 노출시키면 암 세포 전이를 유발할 수 있음을 설명한다.
사이토졸 dsDNA는 바이러스 감염에 대항하기 위해 사용되는 I 형 인터페론 시그널링을 유도하는 독특한 시그널링 경로를 유도한다. 염색체적으로 불안정한 세포에서 사이토졸 dsDNA의 다운스트림 결과를 조사하기 위해, 세포를 사이토졸 DNA의 주요 센서인 순환 GMP-AMP 합성효소(cGAS)에 대해 염색하였다 (Sun et al. Science 339, 786-791 (2013)). cGAS는 염색체 불안정성 수준에 관계없이 존재하는 모든 미세핵의 대략 절반에 대한 현저한 국소화를 나타냈다 (도 6a-6b).
선택적 혈장 막 투과 후에 항-dsDNA 항체를 사용하여 cGAS-플러스 미세핵을 양성 염색한 반면, cGAS-미세핵은 그렇지 않았다 (도 6a). 또한, Lamin B2 과발현을 통한 미세핵 외피 안정화(Hatch et al., Cell 154, 47-60 (2013))는 cGAS 염색으로 미세핵의 상대적 분율을 유의하게 감소시켰다 (도 6b). 종합적으로, 이들 결과는 미세핵 파열이 cGAS에 의한 사이토졸 DNA 감지에 필요하다는 것을 입증한다. 또한, 염색체 불안정성은 미세핵 무결성 자체에 영향을 미치지 않지만, 세포 당 전체 미세핵의 수를 증가시키고 결과적으로 cGAS 활성화 확률을 증가시킨다 (도 5c-5e, 도 6a-6b).
cGAS는 2'3'-사이클릭 GMP-AMP (cGAMP)의 형성을 촉매하여 인터페론 유전자 자극물질 (STING, TMEM173으로서 알려져 있음)을 활성화시켜 I형 인터페론 생성을 유도한다. CIN-고 세포에서 증가된 STING 단백질 수준이 관찰되었다 (도 6c). 그러나, p65 또는 IRF 인산화에 유의한 변화의 결여 뿐만 아니라 핵 전좌의 부재에 의해 입증되는 다운스트림 인터페론 조절성 인자 또는 정규 NF-κB 경로의 활성화에 대한 증거는 없었다 (도 6c). 이는 암 세포가 사이토졸 DNA 감지의 다운스트림 인터페론 생산을 억제한다는 관찰과 일치한다 (Stetson et al., Cell 134, 587-598 (2008); Lau et al. Science 350, 568-571 (2015)). 그러나, 사이토졸 DNA는 비정규 NF-κB 경로를 STING-의존적 및 TBK1-독립적 방식으로 활성화시킬 수 있다 (Abe et al. J. Virol. 88, 5328-5341 (2014)).
중간 수준 내지 높은 수준의 염색체 불안정성을 나타내는 세포 (CIN-중/고 세포)에서 비정규 NF-κB 경로 활성화에 대한 증거가 관찰되었다. 이들 세포는 비정규 경로의 활성화와 일치하는, 더 낮은 수준의 비정규 NF-κB 전구체 단백질인 p100 뿐만 아니라 총 p100 풀에 비해 증가된 양의 인산화된 p100 및 이의 절단된 생성물 p52를 가졌다 (도 6c-6d). 비정규 NF-κB 경로 억제제인 TRAF2의 수준에서도 유의한 감소가 있었다 (도 6c). 중간 내지 높은 수준의 염색체 불안정성을 나타내는 CIN-중/고 세포에서 p52의 결합 파트너인 RelB의 핵 전좌가 관찰되었다 (도 6e).
흥미롭게도, STING 고갈은 비정규 NF-κB 활성화 및 RelB 핵 전좌를 중단시켰고, 이는 다른 염증 및 EMT 경로뿐만 아니라 TNF-α/NF-κB의 음성 풍부화와 관련이 있었다 (도 6d-6e).
벌크 RNA-seq 데이터는 다수의 비정규 NF-κB 표적 유전자를 나타내었고, 이는 염색체 불안정성에 반응하여 상향 조절되었다 (따라서 CIN-반응성 NC-NF-κB 유전자로 지칭되며, 이는 PPARG, DDIT3, NUPR1, RAB3B, IGFBP4, LRRC8C, TCP11L2, MAFK, NRG1, F2R, KRT19, CTGF, ZFC3H1, MACROD1, GSTA4, SCN9A, BDNF, LACTB를 포함함). 유사하게, 단일-세포 분석은 염색체 불안정성-시그니처 유전자와 CIN-반응성 NC-NF-κB 유전자 사이에 유의한 상관 관계가 있음을 보여 주었다 (도 4b 및 도 5b).
독립적인 데이터세트에서 염색체 불안정성-시그니처 유전자와 CIN-반응성 NC-NF-κB 유전자 사이의 관계를 검증하기 위해, RNA-seq 데이터를 TCGA 유방암 데이터베이스로부터 분석하였다. CIN-반응성 NC-NF-κB 유전자의 유의한 상향조절은 더 높은 수준의 CIN-시그니처 유전자를 갖는 종양에서 관찰되었다 (도 6f). 또한, 비정규 NF-κB 경로 또는 이의 CIN-반응성 표적 유전자의 주요 조절인자의 더 높은 발현은 유방암 및 폐암에서 더 짧은 DMFS 및 무질환 생존과 관련이 있었다. 반대로, 정규 NF-κB 경로 (NFKB1, RelA, TRAF1, TRAF4, TRAF5, TRAF6) 또는 인터페론 조절성 인자 (IRF1, IRF3, IRF7, TBK1)의 상향 조절은 개선된 예후와 관련이 있었다 (도 9).
종합적으로, 이들 데이터는 염색체 불안정성이 비정규 NF-κB 경로의 선택적 활성화에서 나타나는 사이토졸 dsDNA 반응을 유도하고 이들 특징이 불량한 예후와 관련됨을 보여준다.
STING 활성이 종양 세포-자율 방식으로 전이에 중요한지 여부를 시험하기 위해, 높은 수준의 염색체 불안정성을 나타내는 STING-고갈된 세포의 심장 내 주입을 수행하였다. STING-충만한 대응물이 주입된 마우스와 비교하여 STING-고갈된 세포를 주입한 마우스에서 전이성 전염 및 수명 연장에 있어서 유의한 감소가 있었다 (도 6ga 및 6gb, 도 9a).
유사하게, STING, cGAS, 또는 비정규 NF-κB 전사 인자 p52 및 RelB의 고갈은 높은 수준의 염색체 불안정성을 나타내는 세포의 침습 포텐셜의 유의한 감소를 초래하였다 (CIN-고 세포; 도 6h).
한편, cGAMP의 첨가는 MCAK (CIN-저) 세포가 콜라겐 막을 통해 이동하고 침습하는 능력을 증가시켰다 (도 6h).
따라서, 사이토졸 DNA에 반응하는 종양 세포 자율 STING 활성화는 부분적으로 비정규 NF-κB 경로를 통한 침윤 및 전이를 촉진한다.
실시예 7 : 염색체 불안정성은 또한 면역 침윤물과 상관 관계가 있음
본원에 제공된 데이터는 염색체 불안정성(CIN)이 전이 및 사이토졸 DNA에 대한 종양 세포 내인성 염증 반응을 통한 종양 면역 침윤물의 형성을 연결하는 신규한 경로가 존재함을 보여주었다. 본 발명자들에 의해 확인된 경로는 도 7b에 요약되어 있다. 간단히, 본 발명자들은 CIN이 염색체-함유 미세핵의 형성을 촉진하며, 이는 종종 이들의 DNA 함량을 세포질 (또는 사이토졸)에 노출시키는 것을 파괴시킨다. 정상적인 세포에서는 발생하지 않는 이 비정상적인 상황은 바이러스 감염을 연상시킨다. cGAS를 통해 사이토졸 DNA를 감지한 후, 암 세포는 cGAMP (소분자)의 형성을 촉진하여 STING을 활성화시킨다. 정규 경로를 상향 조절하는 대신에 암 세포는 비정규 NF-kB 경로 (NIK 및 RelB/p52)를 활성화시켜 전-전이성 프로그램의 상향 조절을 초래한다. 한편, cGAMP는 종양 세포를 빠져 나가 근처 스트로마(neighboring stroma), 특히, 항원 제시 세포를 STING 단백질과 직접 연계함으로써 활성화시킬 수 있다.
현재 종양 세포를 공격하기 위해 면역 시스템을 활성화시키는 데 종양 내 cGAMP 주입의 용도를 탐색하기 위한 전-임상 노력이 진행되고 있다. 본 발명자들은 종양 세포에서 cGAMP 자체가 면역 세포를 활성화시키는 항-종양 역할과 대조적으로, 전이를 촉진한다는 것을 발견하였기 때문에 이러한 노력이 자체 위험없이 이루어질 수 없다고 생각한다.
염색체 불안정성이 전이를 촉진하지만 동시에 많은 양의 면역 침윤물을 모집하는 바이러스 유사 면역 반응을 촉진한다는 발견(도 7a)은 염색체적으로 불안정한 세포가 이 면역 활성화의 존재 하에서 생존하고 번성하며 전이될 수 있음을 보여준다.
염색체 불안정성을 나타내는 세포는 자신의 세포질 내에서 사이토졸 DNA 신호 (및 이의 부산물)를 최대한으로 보존하는 데 능숙한 것으로 보인다. 즉, 이들은 추정 cGAMP 운반체 ABCG2 및 ABCC4를 하향 조절한다. 또한, 이들 세포는, cGAMP를 효율적으로 분해하고 원형질막의 세포 외 한층(leaflet)에만 존재하는 가수 분해 효소인 ENPP1의 유의하게 많은 양을 생산한다. 따라서, 이 염색체적으로 불안정한 종양 세포는 세포 내 환경에서 cGAMP를 보존하고, 이의 수송을 감소시키고, 필요한 경우 누출될 때 분해시킨다. 또한, 이들 종양 세포는 다량의 M-CSF를 생산하는데, 이는 전-종양 M2 대식세포의 생성을 촉진하는 사이토카인이다.
이러한 면역 활성화는 염색체 침윤과 관련된 암의 치료를 용이하게 하도록 동원될 수 있다.
예를 들어, 종양에 cGAMP를 직접 주입하는 (및 종양 세포에서 활성화 전이 위험) 대신에, 염색체적으로 불안정한 종양 세포에 의해 생산된 cGAMP는 ENPP1을 억제함으로써 세포에 대한 것일 수 있으며, 이는, 세포에 존재하면 이를 파괴하는 능력에 기초한다. 다른 접근법은 세포 외 공간으로의 cGAMP 수송을 증가시키고 근처 면역 세포를 활성화시키기 위해 ABC 운반체에 대한 작용제를 사용하는 것이다.
실시예 8 : 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS)을 사용한 cGAMP 검출 및 정량화
이 실시예는 액체 크로마토 그래피-탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)이 이의 특이성, 재현성 및 감도로 인해 cGAMP의 측정을 위한 실용적인 기술임을 설명한다. LC-MS/MS는 매우 특이적이므로 다른 뉴클레오티드로부터의 간섭을 최소화한다. LC-MS/MS의 더 큰 특이성은 분석물 특이적 전구체로부터 유래되어, 이온 질량-대-전하 (m/z) 값 및/또는 분석물 특이적 잔류 시간을 생산한다.
재료 & 방법:
cGAMP 용액을 표준으로서 사용하였다. cGAMP 표준 용액을 LC-MS/MS 분석을 위해 ddH2O 중 70% 아세토니트릴에서 제조하였다.
세포 배양을 위해, 세포를 10cm 플레이트에서 성장시켰다.
수집 및 샘플 준비:
세포를 PBS로 2 회 및 LC/MS 등급의 물로 1 회 세척하였다 (염을 제거하기 위함). 이어서, 플레이트를 액체 질소 상에서 급속 냉동시켜 세포의 대사 상태를 보존하였다. 이어서, 세포를 2ml의 차가운 80% LC-MS 등급 메탄올 (-80℃) 내에 수집/스크래핑하였다. 이어서, 메탄올 대사산물 추출물을 Collins, AC et al. 2015에 이전에 기술된 바와 같이 HyperSep 아미노프로필 고체상 컬럼을 사용하여 고체상 추출(SPE)에 의해 정제하였다. 용출액을 진공 원심 분리기에서 완전하게 건조시키고, 100 ㎍ 단백질/㎕의 농도로 ddH2O 중 70% 아세토니트릴에서 재구성하였다. 15 ㎕를 LC-MS/MS 분석에 적용하였다.
혈청/배지 샘플 준비:
배양 배지에서 분비된 cGAMP를 검출하기 위해, 500 ㎕ 분취량의 조절된 배지를 수집하고, 메탄올과 80:20으로 혼합하고, 섭씨 4도에서 20 분 동안 3,000 rpm으로 원심분리할 수 있다. LC-MS/MS에 앞서 생성된 상청액을 수집하고 섭씨 -80도에서 저장하여 cGAMP 수준을 평가할 수 있다. 전 세포 연관된 대사산물을 측정하기 위해, 배지를 흡인할 수 있고, 예컨대, 비-융합성 밀도로 세포를 수확할 수 있다. 다양한 상이한 액체 크로마토그래피 (LC) 분리 방법이 사용될 수 있다. 각각의 방법은 주입된 대사산물 표준 용액에 최적화된 MS 매개 변수를 사용하여, 다중 반응 모니터링 (MRM) 모드에서 작동하는 삼중 사극자 질량 분석기와 음성 전자 분무 이온화 (ESI, -3.0 kV)를 통해 커플링될 수 있다.
cGAMP 분석.
고체상 추출 (SPE) 후, 샘플을 진공 원심분리기 (Eppendorf Vacufuge, Eppendorf, Germany)를 사용하여 건조시키고 ddH2O 중 70% 아세토니트릴에서 재구성하였다. 가용화되지 않은 입자를 제거하기 위해, 샘플을 4 ℃에서 10 분 동안 21,130g에서 원심분리하였다. 상청액은 동적 다중 반응 모니터링 (dMRM)에서 양이온 모니터링을 사용하여 Agilent 1260 HPLC 및 JetStream 전기 분무 이온화 공급원이 장착된 Agilent 6460 삼중 사극자 질량 분석기 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)로 구성된 LC/MS 시스템 내에 주입하였다. 분석물 cGAMP는 40 ℃의 컬럼 구획 온도에서 수성 중성 상 컬럼 (CogentTM Diamond Hydride, 4 μm 입자 크기, 150 mm x 2.1 mm; Microsolv Technology Corporation, NJ)의 간섭 신호로부터 분석되었다. 샘플을 4 ℃로 유지하고 주입 부피는 15 μL이었다. Chen et al. (PLoS One 7(6): p. e37149 (2012))에 의해 이전에 기술된 구배 크로마토그래피는 간섭 피크로부터 크로마토그래피 분리를 달성하도록 최적화되었다. 수성 이동상(A)은 0.025% 아세트산을 포함하는 50% 이소프로판올이고, 유기 이동상 (B)은 5mM 암모늄 아세테이트를 함유하는 90% 아세토니트릴이었다. 크로마토그래피 피크 무결성 및 ESI 이온화에 대한 금속 이온의 간섭을 제거하기 위해, EDTA를 최종 농도 6 μM로 이동상에 첨가하였다. 적용되는 최종 구배는 컬럼을 재생하기 위해 0-1.0 분 99% B, 1.0-10.0 분 내지 60% B, 10.1-20 분 0% B 및 20.1 분 99% B이었다. 유속은 0.4 mL/분이었다. Agilent Masshunter 워크 스테이션 수집 소프트웨어 (B.06.00 빌드 6.0.6025.4 SP4)를 사용하여 데이터를 중심 모드로 저장하였다. 획득한 원본 데이터 파일은 Agilent MassHunter 정성 분석 소프트웨어 (B.07.00 빌드 7.0.7024.0, Agilent Technologies) 및 정량 분석 소프트웨어 (B.07.01 빌드 7.1.524.0)로 처리되었다. MS-분석을 위한 작동 공급원 파라미터는: 가스 온도 280 ℃; 가스 흐름 11 L/분; 분무기 압력 35 psi; 차단 가스(sheath gas) 온도 350 ℃; 차단 가스 흐름 11 L/분; 모세관 전압 4000V; 노즐 전압 300V; 단편화 전압(fragmentor voltage) 145V; 세포 가속기 전압(cell accelerator voltage) 2V. LC-흐름이 MS로 향하는 경우 4 분의 작동 시간에서 시작하여 dMRM 데이터를 획득하였다.
화합물 특이적 파라미터는 Agilent Optimizer 소프트웨어 (6400 시리즈 삼중 사극자 버전 B.06.00 빌드 6.0.6025.4 SP4)를 사용하여 최적화되었다.
최적화된 dMRM 이행은 탈글리코실화된 염기 이온을 생성하였다: cGAMP의 경우 675.1→136.1* (CE 65 eV)는 아데닌의 형성을 나타내고, 675.1→152.1** (CE 65 eV)는 구아닌의 형성을 나타낸다. 또한, 675.1→312.0 (CE 61 eV) 및 675.1→524.1 (CE 35 eV)의 dMRM 이행이 기록되었다. *는 정량자(quantifier) 이행을 나타내고 **는 정성자(qualifier) 이행을 나타낸다 (도 10a 참고). 모든 cGAMP 이행이 동일한 모 이온으로부터 유래되었으므로, 4개의 이행 모두를 최종 TIC (총 이온 전류) 내로 합산하여 신호 존재비(signal abundance) 및 신호 대 노이즈 비율을 증가시켰다.
결과
도 10b는 표적화된 LC-MS 대사체학을 사용하여 염색체적으로 불안정한 소변 삼중-음성 유방암 세포 (4T1)에서 cGAMP의 정량을 그래프로 도시한다. 도시된 바와 같이, 4T1 세포에서 cGAS의 녹다운은 cGAMP의 존재비를 감소시켰다. 이러한 결과는 cGAMP가 다양한 샘플에서 정량화될 수 있고, cGAMP가 환자에서 전이성 질환을 검출하고 모니터링하기 위한 마커일 수 있음을 보여준다.
실시예 9: KIF2B 및 MCAK 작용제를 확인/평가하기 위한 ATPase 검정
KIF2B 및 KIF2C/MCAK는 미세소관 동역학 및 염색체-방추사부착점 부착을 조절하기 위해 ATP 가수분해 에너지를 이용하는 관련 분자성 키네신 운동 단백질이다. 발현 또는 과잉 활성화에 대한 KIF2B 및 MCAK의 중심적인 역할은 염색체 불안정성 (CIN)을 억제하는 것이며, 이는 이들이 암 요법에 대한 매력적인 표적이 된다. 여기서, KIF2B 및 MCAK의 강력한 활성화제를 확인하고 평가하기 위한 두 가지 방법 (생체 외 검정 및 이미징 방법)이 본 실시예에 요약되어 있다.
방법 1 KIF2B 또는 MCAK 활성에 대한 생체 외 검정:
ATP 가수 분해의 동역학을 측정하는 것은 KIF2B 및 MCAK를 활성화하고 CIN을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 전략이다. 이 검정은 무기 포스페이트 (Pi)의 존재하에서 2-아미노-6-머캅토-7-메틸퓨린 리보뉴클레오시드 (MESG)가 2-아미노-6-머캅토-7-메틸 퓨린으로 전환되는 경우 발생하는 흡광도 시프트(shift) (330에서 360nm)를 기반으로 한다(예컨대, Webb, M.R. 1992 참고). 생물학적 시스템에서 무기 포스페이트 및 포스페이트 방출 동역학을 측정하기 위한 연속 분광광도 검정. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4884-4887). 반응은 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 (PNP)에 의해 촉매된다. 한 분자의 무기 포스페이트는 비가역적 반응에서 한 분자의 2-아미노-6-머캅토-7-메틸 퓨린을 생성할 것이다. 따라서, 360 nm에서의 흡광도는 ATPase 반응에서 생성된 Pi의 양에 정비례하며, MCAK 활성의 프록시로서 사용될 수 있다.
대안적으로, ADP 생산은 또한 BellBrook Labs의 Transcreener ADP 검정을 사용하여 MCAK 활성에 대한 판독 값(readout)으로서 모니터링될 수 있다. 이 검정은 ADP를 특이적으로 인식하는 항체에 결합된 형광 추적자 (633nm)를 대체하는 ADP의 능력에 기초한다. 추적자의 변위는 633nm에서 레이저 여기에 의해 측정된 형광 감소를 유발한다. 따라서, MCAK의 활성은 사용된 약물의 농도 및 형광 강도에서 생성/감소되는 ADP의 양을 플롯팅함으로써 계산할 수 있다.
방법 2 KIF2B 또는 MCAK 활성에 대한 세포 기반 검정:
MCAK는 미세소관 팁을 결합시키고 미세소관 탈중합화를 촉진함으로써 미세소관 길이를 음성 조절한다. 따라서, γ-튜불린-표지된 중심체 사이의 거리는 세포에서 MCAK 활성에 대한 간접 판독 값으로서 측정될 수 있다. 스핀들 길이는 MCAK 활성에 반비례하며 MCAK 활성을 촉진하는 잠재적 화합물을 평가하기 위한 프록시로서 작용할 수 있다 (예컨대, Lockhart, A & Cross, R.A. 1996. Kinetics and Motility of the Eg5 Microtubule Motor. Biochemistry 35: 2365 - 2373 참고). 이 방법은 고처리량 이미징 현미경을 사용함으로써 화합물을 스크리닝할 수 있다.
화합물 (예컨대, 본원에 기술된 임의의 방법을 통해 확인된 최고 히트(hit))은 후속적으로 지체(lagging) 염색체, 미세핵, 또는 염색체 비분리를 사용하는 세포 기반 검정에 사용될 수 있으며, 이는 효능의 판독 값으로서 FISH를 사용한다. 형광 제자리 혼성화 (FISH)는 높은 정도의 서열 상보성으로 염색체의 부분에만 결합하는 형광 프로브를 사용하는 분자 세포 유전학 기술이다. 프로브는 본원에 기술된 임의의 염색체 또는 유전자의 서열의 일부를 포함할 수 있다.
실시예 10: NF-kB 유도 키나아제 (NIK) 억제제를 확인/평가하기 위한 ATPase 검정
NF-kB 유도 키나아제 (NIK)는 비정규 NF-kB 시그널링을 매개하며 전이와 관련이 있다. 따라서, NIK의 억제는 CIN-유도된 염증 반응 및 전이를 억제할 수 있다. 이 실시예는 NIK 억제를 확인하고 평가하는 데 사용할 수 있는 두 가지 방법을 요약한다.
방법 1:
NIK의 키나아제 기능의 특이적 억제는 다양한 화합물의 효능을 평가하는 접근법을 제공한다. 따라서, ADP 생산은 BellBrook Labs의 Transcreener ADP 검정을 사용하여 NIK 활성에 대한 판독 값으로서 모니터링할 수 있다. 이 검정은 ADP를 특이적으로 인식하는 항체에 결합된 형광 추적자 (633nm)를 대체하는 ADP의 능력에 기초한다. 633nm에서 레이저 여기에 의해 측정된 추적자의 경쟁적 변위는 형광 감소를 유발한다. 따라서, NIK의 활성은 사용된 약물의 농도 및 형광 강도에서 생성/감소된 ADP의 양을 플롯팅함으로써 계산할 수 있다.
방법 2:
NIK의 억제는 비정규 NF-κB 경로를 직접 억제하는 접근법을 제공한다. 이 검정은 고용량 세포 이미징을 사용하여 p52의 핵 전좌 (RELB; 비정규 NF-kB 시그널링)의 정량화에 의존한다. 인간 RELB에 대한 서열의 예는 하기에 서열번호 59로서 도시된다.
Figure pct00068
Figure pct00069
RELB 핵 전좌 검정을 위해, 세포를 상이한 농도의 화합물로 처리하고 100 ng/mL의 (예컨대, 시그마 알드리치 (Sigma Aldrich)로부터의) 길항성 항-림포톡신 베타 수용체 (LT-βR) 항체, 비정규 NF-κB 시그널링의 강력한 활성화제로 자극하였다. 핵 내로의 RELB 전좌는 세포질 신호 강도에 대한 핵의 비율에 의해 정량화된다. RELB의 핵 전좌를 선택적으로 억제하는 강력한 화합물이 발견되었다.
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본원에서 참조되거나 언급된 모든 특허 및 공개물은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가의 기술 수준을 나타내며, 각각의 이러한 참조된 특허 또는 공개물은 그 전문이 개별적으로 참조로 원용되거나 그 전문이 본원에 개시된 것과 동일한 정도로 참조로 구체적으로 원용된다. 출원인은 임의의 이러한 인용된 특허 또는 공개물로부터의 임의의 모든 자료 및 정보를 이 명세서 내에 물리적으로 원용할 권리를 보유한다.
진술:
2) 하기를 포함하는 세포 샘플 또는 체액 샘플을 갖는 환자에게 전이성 화학요법제를 투여하여, 환자의 전이성 암을 치료하는 단계를 포함하는 방법:
a. 세포 샘플의 하나 이상의 세포 내에 10% 이상, 또는 11% 이상, 또는 12% 이상, 또는 13% 이상, 또는 14% 이상, 또는 15% 이상의 검출 가능한 염색체 비분리;
b. 세포 샘플의 하나 이상의 세포 내에 3% 이상, 4% 이상 또는 5% 이상의 세포 검출 가능한 미세핵;
c. 세포 샘플의 하나 이상의 세포 내에 검출 가능한 사이토졸 이중 가닥 DNA; 또는
d. 세포 샘플 또는 체액 샘플 중 적어도 10%, 또는 20%, 또는 30%, 또는 50%, 또는 70%, 또는 80%, 또는 90% 더 큰 농도 또는 양의 cGAMP.
3) 진술 1에 있어서, 비분리를 나타내는 세포 샘플의 후기 세포 중 15-20%의 염색체를 갖는 환자에게 전이성 화학요법제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
4) 진술 1 또는 2에 있어서, 미세핵을 나타내는 세포 샘플 중 5-8%의 세포를 갖는 환자에게 전이성 화학요법제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
5) 진술 1, 2 또는 3에 있어서, 정상적인 비암 조직과 비교하여 사이토졸 내에서 염색 강도의 1 배 내지 2 배 증가를 갖는 환자에게 전이성 화학요법제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
6) 진술 1, 2, 3 또는 4에 있어서, 비 암성 체액 샘플보다 체액 샘플에서 1 배 내지 2 배 더 큰 농도 또는 양의 cGAMP를 갖는 환자에게 전이성 화학요법제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
7) 진술 1-4 또는 5에 있어서, 시간 경과에 따라 환자로부터의 샘플을 모니터링하여 환자의 세포 또는 체액 내에서 염색체 비분리, 미세핵, 사이토졸 이중 가닥 DNA 또는 cGAMP를 정량화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
8) 진술 1-5 또는 6에 있어서, 전이성 화학요법제가 서열번호 1, 3 또는 5 중 어느 하나에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 키네신-13 단백질(들)을 포함하는 조성물인, 방법.
9) 진술 1-6 또는 7에 있어서, 전이성 화학요법제가 서열번호 2, 4 또는 6 중 어느 하나에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 키네신-13 핵산을 포함하는 조성물인, 방법.
10) 진술 1-7 또는 8에 있어서, 전이성 화학요법제가 임의의 서열번호 7에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 MCAK 단백질, 또는 서열번호 8에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 MCAK 핵산을 포함하는 조성물인, 방법.
11) 진술 1-8 또는 9에 있어서, 전이성 화학요법제가 하나 이상의 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), 또는 MST1 억제성 핵산을 포함하는 조성물인, 방법.
12) 진술 1-9 또는 10에 있어서, 전이성 화학요법제가 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36 중 어느 하나에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 억제성 핵산을 포함하는 조성물인, 방법.
13) 진술 1-10 또는 11에 있어서, 전이성 화학요법제가 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), 또는 MST1 단백질에 대한 친화도로 결합하는 하나 이상의 항체를 포함하는 조성물인, 방법.
14) 진술 1-11 또는 12에 있어서, 전이성 화학요법제가 서열번호 1, 3, 5 또는 7 중 어느 하나에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 키네신-13 또는 MCAK 단백질을 코딩하는 핵산 세그먼트에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 갖는 발현 벡터를 포함하는 조성물인, 방법.
15) 진술 1-12 또는 13에 있어서, 전이성 화학요법제가 하기 구조를 갖는 키네신-13의 작용제를 포함하는 조성물이되, X는 메틸 기인, 방법:
Figure pct00073
.
16) 진술 1-13 또는 14에 있어서, 체액 샘플 또는 세포 샘플 중 cGAMP의 농도 또는 양이 질량 분석법 (MS)과 함께 액체 크로마토그래피 (LC)를 포함하는 방법으로 정량화되는, 방법.
17) 진술 1-14 또는 15에 있어서, 체액 샘플 또는 세포 샘플 중 cGAMP가 알콜에서 추출 및/또는 용해되어 알콜 추출물을 생산하고, 알콜 추출물이 크로마토그래피될 수 있고, 크로마토그래피로부터의 용출물이 cGAMP의 농도 또는 양을 측정하기 전에 아세토니트릴, 물 또는 이들의 조합에 현탁될 수 있는, 방법.
18) 하나 이상의 키네신-13 단백질, 하나 이상의 MACK 단백질, 키네신-13의 하나 이상의 작용제, MACK의 하나 이상의 작용제, 또는 이들의 조합을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
19) 진술 17에 있어서, 하나 이상의 키네신-13 단백질 또는 MCAK가 서열번호 1, 3, 5 또는 7 중 어느 하나에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는, 방법.
20) 진술 17 또는 18에 있어서, 키네신-13의 하나 이상의 작용제가 하기와 같되, X는 메틸 기인, 방법:
Figure pct00074
.
21) 진술 17, 18 또는 19에 있어서, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1 또는 이들의 임의의 조합의 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
22) 포유동물 세포에서 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1 또는 이들의 임의의 조합을 억제하는 단계를 포함하는 방법.
23) 키네신-13 또는 MACK 단백질을 코딩하는 핵산 세그먼트에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
24) 진술 22에 있어서, 하나 이상의 키네신-13 단백질 또는 MACK 단백질이 서열번호 1, 3, 5 또는 7 중 어느 하나에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는, 방법.
25) 진술 17-23 또는 23에 있어서, 서열번호 9, 11, 13 또는 15 중 어느 하나에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성 또는 상보성을 갖는 억제성 핵산 세그먼트에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
26) 진술 1-23 또는 24에 있어서, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), MST1 또는 이들의 임의의 조합의 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
27) 진술 1-24 또는 25에 있어서, ABCC4, ABCG2, 또는 이들의 조합의 작용제를 투여하는 단계; ABCC4 또는 ABCG2를 코딩하는 핵산 세그먼트에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 투여하는 단계; 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 방법.
28) 진술 1-25 또는 26에 있어서, 환자의 세포가 투여 전에 염색체 불안정성을 나타내는, 방법.
29) 진술 1-26 또는 27에 있어서, 환자가 암을 갖는 것으로 의심되는, 방법.
30) 진술 1-27 또는 28에 있어서, 환자가 암이 진행되는 것으로 의심되는, 방법.
31) 진술 1-28 또는 29에 있어서, 환자가 암을 갖는, 방법.
32) 진술 1-29 또는 30에 있어서, 환자가 전이성 암을 갖는, 방법.
33) 진술 1-30 또는 31에 있어서, 방법이 대상체에서 암의 전이를 억제하는, 방법.
34) 진술 1-31 또는 32에 있어서, 방법이 단백질 또는 발현 벡터를 수용하지 않은 대조군 대상체와 비교하여 대상체에서 암의 전이를 억제하는, 방법.
35) 문단 1-32 또는 33에 있어서, 방법이 염색체 불안정성을 억제하는, 방법.
36) 환자로부터의 시험 샘플에서 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, 또는 FGF5 중 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 정량화하여, 시험 샘플에서 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, 또는 FGF5 중 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 정량화된 발현 수준을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
37) 진술 35에 있어서, 건강한 또는 비 암성 샘플에서 하나 이상의 상응하는 유전자의 대조군 발현 수준과 비교하여, 시험 샘플에서 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, 또는 FGF5 중 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 정량화된 발현 수준에서 하나 이상의 차이를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
38) 진술 35 또는 36에 있어서, 건강한 또는 비 암성 샘플이 염색체 불안정성을 나타내지 않는, 방법.
39) 전이성 암을 갖는 환자로부터의 샘플 (또는 샘플 세트)에서 하나 이상의 상응하는 유전자의 대조군 발현 수준과 비교하여, 시험 샘플에서 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, 또는 FGF5 중 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 정량화된 발현 수준에서 하나 이상의 차이를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
40) 진술 35-37 또는 38에 있어서, 시험 샘플에서 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, 또는 FGF5 중 2 개 이상, 또는 3 개 이상, 또는 4 개 이상, 또는 5 개 이상, 또는 6 개 이상, 또는 7 개 이상, 또는 8 개 이상, 또는 9 개 이상, 10 개 이상, 또는 11 개 이상, 또는 12 개 이상, 또는 13 개 이상, 또는 14 개 이상, 또는 15 개 이상, 또는 16 개 이상, 또는 17 개 이상, 또는 18 개 이상, 또는 19 개 이상, 또는 20 개 이상, 또는 21 개 이상 또는 22 개 이상의 유전자의 발현 수준을 정령화하는 단계를 포함하는, 방법.
41) 진술 35-38 또는 39에 있어서, 건강한 또는 비 암성 샘플에서 하나 이상의 상응하는 유전자의 대조군 발현 수준과 비교하여, 시험 샘플에서 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, 또는 FGF5 중 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 정량화된 발현 수준의 차이가 적어도 10%, 또는 20%, 또는 30%, 또는 40%, 또는 50%, 또는 60%, 또는 75%, 또는 100%의 발현 증가인, 방법.
42) 진술 35-39 또는 40에 있어서, 샘플 (또는 전이성 암을 갖는 한명 이상의 환자로부터의 샘플 세트)에서 하나 이상의 상응하는 유전자의 평균 대조군 발현 수준과 비교하여, 시험 샘플에서 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, 또는 FGF5 중 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 정량화된 발현 수준의 차이가 적어도 10%, 또는 20%, 또는 30%, 또는 40%, 또는 50%, 또는 60%, 또는 75%, 또는 100%의 발현 증가인, 방법.
43) 진술 35-40 또는 41에 있어서, 대조군 발현 수준과 비교하여, 시험 샘플에서 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24, 또는 FGF5 중 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 정량화된 발현 수준의 차이가 적어도 1.2 배, 또는 1.5 배, 또는 2 배, 또는 3 배, 또는 5 배, 또는 7 배, 또는 10 배의 발현 증가의 이들 상응하는 유전자의 발현의 적어도 증가인, 방법.
44) 대상체에 STING 단백질을 투여하거나, 대상체에서 발현 카세트 또는 발현 벡터로부터 STING 단백질을 발현시켜, 염색체적으로 불안정한 종양 세포에 대한 치료적 도구로서 사이토졸 DNA 감지의 정규 경로 다운스트림을 복원하고/하거나 활성화하고, 세포 내인성 세포독성 경로를 유도하는 단계를 포함하는, 방법.
45) 대상체에 하나 이상의 STING 작용제를 투여하여, 염색체적으로 불안정한 종양 세포에 대한 치료적 도구로서 사이토졸 DNA 감지의 정규 경로 다운스트림을 복원하고/하거나 활성화하고, 세포 내인성 세포독성 경로를 유도하는 단계를 포함하는, 방법.
46) 진술 43 또는 44에 있어서, 종양 세포를 면역 요법에 민감하게 하는, 방법.
47) 담체, 및 서열번호 1, 3 또는 5 중 어느 하나에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 키네신-13 단백질을 포함하는, 조성물.
48) 담체, 및 서열번호 2, 4 또는 6 중 어느 하나에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 키네신-13 핵산을 포함하는, 조성물.
49) 진술 46 또는 47에 있어서, 서열번호 7에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 MCAK 단백질, 또는 서열번호 8에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 MCAK 핵산을 추가로 포함하는, 조성물.
50) 진술 46, 47 또는 48에 있어서, 하나 이상의 STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), 또는 MST1 억제성 핵산을 포함하는, 조성물.
51) 진술 46-48 또는 49에 있어서, 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36 중 어느 하나에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 억제성 핵산을 포함하는, 조성물.
52) 진술 46-49 또는 50에 있어서, STING, cGAS, NF-κB 전사 인자 p52, NF-κB 전사 인자 RelB, ENPP1, LTβR, BAFFR, CD40, RANK, FN14, NIK (MAP3K14), 또는 MST1 단백질에 대한 친화도로 결합하는 하나 이상의 항체를 포함하는, 조성물.
53) 진술 46-50 또는 51에 있어서, 서열번호 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 또는 23 중 어느 하나에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질에 대한 친화도로 결합하는 하나 이상의 항체를 포함하는, 조성물.
54) 서열번호 1, 3, 5, 또는 7 중 어느 하나에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 키네신-13 또는 MCAK 단백질을 코딩하는 핵산 세그먼트에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
55) 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36 중 어느 하나에 대해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성 또는 상보성을 갖는 억제서어 핵산 세그먼트에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
56) (a) 시험 화합물을 배양 배지에서 암 (또는 전이성 암) 세포와 혼합하여 시험 검정을 생산하는 단계; (b) 시험 화합물을 세포와 관련되거나 세포에 침투하기에 충분한 시간 및 조건 하에서 시험 검정을 항온처리하는 단계; (c) 배양 배지, 세포 또는 이들의 조합에서 cGAMP 양 또는 농도를 측정하여 시험 검정 cGAMP 값을 생산하는 단계; 및 (d) 기준 cGAMP 값보다 낮은 시험 검정 cGAMP 값을 갖는 시험 화합물을 선택하여 유효 시험 화합물을 생산하는 단계를 포함하는 방법.
57) 진술 55에 있어서, 기준 cGAMP 값이 시험 화합물을 함유하지 않는 검정 혼합물의 배양 배지, 세포 또는 이들의 조합에서의 cGAMP의 양 또는 농도인, 방법.
58) (a) 환자로부터 세포 또는 조직 샘플을 수득하는 단계; (b) 기준 cGAMP 값을 생성하기 위한 샘플로부터의 공지된 수 또는 중량의 세포 또는 조직으로부터 생산된 cGAMP의 양 또는 농도를 측정하는 단계; (c) 샘플로부터의 동일한 공지된 수 또는 중량의 세포 또는 조직을 시험 화합물과 혼합하여 시험 검정을 생성하는 단계; (d) 시험 검정(세포 배지, 또는 세포 또는 조직)에서 cGAMP 양 또는 농도를 측정하여 시험 검정 cGAMP 값을 생성하는 단계; (e) 임의로 단계 (c) 및 (d)를 반복하는 단계; 및 기준 cGAMP 값보다 낮은 시험 검정 cGAMP 값을 갖는 시험 화합물을 선택하여 유효 시험 화합물을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
59) 진술 55, 56 또는 57에 있어서, 전이성 암 세포 또는 전이성 조직이 배양 배지에 혼합되어 시험 검정을 생산하는, 방법.
60) 진술 55-57 또는 58에 있어서, cGAMP를 측정하기 전에 알콜(예컨대, 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올)을 이용하여 세포 또는 조직 샘플을 추출하여 알콜 추출물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
61) 진술 59에 있어서, 반-순수 시험 샘플의 cGAMP를 측정하기 전에, 하나 이상의 HyperSep 아미노프로필 고체상 컬럼을 사용하여 고체상 추출(SPE)에 의해 알콜 추출물을 정제하여 반-순수 시험 샘플을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
62) 진술 59 또는 60에 있어서, cGAMP를 측정하기 전에, 아세토니트릴, 물 또는 이들의 조합에 cGAMp를 현탁하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
63) 진술 55-60 또는 61에 있어서, cGAMP 양 또는 농도를 측정하는 단계가 cGAMP의 수준을 측정하기 위해 액체 크로마토그래피/질량 분광법을 포함하는, 방법.
64) 진술 55-61 또는 62에 있어서, 유효 시험 화합물을 동물 모델에 투여하여, 예를 들어, 유효 시험 화합물의 독성 및/또는 효능을 추가로 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
65) 진술 55-62 또는 63에 있어서, 유효 시험 화합물을 환자 또는 세포 또는 조직 샘플이 수득된 특허에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
66) (a) 시험 화합물을 배양 배지에서 암 (또는 전이성 암) 세포와 혼합하여 시험 검정을 생산하는 단계; (b) 시험 화합물을 세포 중 cGAMP 생산에 영향을 주기에 충분한 시간 및 조건 하에서 시험 검정을 항온처리하는 단계; (c) 배양 배지, 세포 또는 이들의 조합에서 cGAMP 양 또는 농도를 측정하여 시험 검정 cGAMP 값을 생산하는 단계; 및 (d) 기준 cGAMP 값보다 낮은 시험 검정 cGAMP 값을 갖는 시험 화합물을 선택하여 유효 시험 화합물을 생산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된 유효 시험 화합물.
67) 진술 65에 있어서, 전이성 암 세포 또는 전이성 조직이 배양 배지에서 혼합되어 시험 검정을 생산하는, 생산된 유효 시험 화합물.
68) 진술 65 또는 66에 있어서, cGAMP를 측정하기 전에, 세포를 알콜(예컨대, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올)을 이용하여 추출하여 알콜 추출물을 생산하는, 생산된 유효 시험 화합물.
69) 진술 65, 66 또는 67에 있어서, 방법이 세포 또는 조직 샘플을 메탄올을 이용하여 추출하여 메탄올 추출물을 생성하는 단계 및 메탄올 추출물에서 cGAMP를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 생산된 유효 시험 화합물.
70) 진술 67 또는 68에 있어서, 방법이 반-순수 시험 샘플의 cGAMP를 측정하기 전에, 하나 이상의 HyperSep 아미노프로필 고체상 컬럼을 사용하여 고체상 추출(SPE)에 의해 알콜 추출물 또는 메탄올 추출물을 정제하여 반-순수 시험 샘플을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 생산된 유효 시험 화합물.
71) 진술 65-68 또는 69에 있어서, cGAMP 양 또는 농도를 측정하는 단계가 cGAMP의 수준을 측정하기 위해 액체 크로마토그래피/질량 분광법을 포함하는, 생산된 유효 시험 화합물.
72) 진술 65-69 또는 70에 있어서, 방법이 유효 시험 화합물을 동물 모델에 투여하여, 예를 들어, 유효 시험 화합물의 독성 및/또는 효능을 추가로 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 생산된 유효 시험 화합물.
73) 진술 65-70 또는 71에 있어서, 방법이 유효 시험 화합물을 환자 또는 세포 또는 조직 샘플이 수득된 특허에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 생산된 유효 시험 화합물.
74) (a) 시험 화합물을, 2-아미노-6-머캅토-7-메틸퓨린 리보뉴클레오시드 (MESG)를 함유하는 시험 검정 혼합물 중 KIF2B 또는 MCAK와 혼합하는 단계; (b) 시험 검정 혼합물을 항온처리하여 항온처리된 시험 검정을 생산하는 단계; (c) 무기 포스페이트의 양을 측정하여 무기 포스페이트 검정 결과를 제공하는 단계; 및 (d) 무기 포스페이트 시험 결과를 대조군 또는 기준과 비교하는 단계를 포함하는 방법.
75) 진술 74에 있어서, 대조군은 KIF2B 또는 MCAK 및 2-아미노-6-머캅토-7-메틸퓨린 리보뉴클레오시드 (MESG)를 함유하나 시험 화합물을 함유하지 않는 대조군 검정에 존재하는 무기 포스페이트 (Pi)의 양인, 방법.
76) 진술 74에 있어서, 기준은 KIF2B 또는 MCAK 및 2-아미노-6-머캅토-7-메틸퓨린 리보뉴클레오시드 (MESG)를 함유하나 시험 화합물을 함유하지 않는 2개 이상의 대조군 검정에 존재하는 무기 포스페이트 (Pi)의 평균 양인, 방법.
77) 진술 74, 75 또는 76에 있어서, 대조군 또는 기준보다 높은 무기 포스페이트 시험 결과를 갖는 시험 화합물을 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
78) 진술 74-76 또는 77에 있어서, 대조군 또는 기준보다 높은 무기 포스페이트 시험 결과를 갖는 시험 화합물을 선택하는 단계, 및 제2 검정에서 시험 화합물을 평가하여 KIF2B 또는 MCAK의 활성화제로서 시험 화합물을 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
79) (a) 시험 화합물을 γ-튜불린-표지된 중심체 갖는 암 세포와 혼합하여 시험 검정을 생산하는 단계; (b) 시험 화합물이 암 세포를 침투하기에 충분한 시간 및 조건 하에서 시험 검정을 항온처리하여 항온처리된 시험 암 세포를 생산하는 단계; (c) 일련의 항온처리된 시험 암 세포 내에서 γ-튜불린-표지된 중심체 사이의 거리를 측정하여 평균 거리 결과를 생산하는 단계; 및 (d) 평균 거리 결과를 대조군 또는 기준과 비교하는 단계를 포함하는 방법.
80) 진술 79에 있어서, 거리가 형광 제자리 혼성화(FISH)에 의해 측정되는, 방법.
81) 진술 79 또는 80에 있어서, 대조군이 시험 화합물을 함유하지 않는 대조군 검정의 암 세포 중 γ-튜불린-표지된 중심체 사이의 거리인, 방법.
82) 진술 79 또는 80에 있어서, 기준이 시험 화합물을 함유하지 않는 대조군 검정의 일련의 γ-튜불린-표지된 암 세포 내의 γ-튜불린-표지된 중심체 사이의 평균 거리인, 방법.
83) 진술 79, 80 또는 81에 있어서, 대조군 또는 기준보다 낮은 평균 거리 결과를 갖는 시험 화합물을 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
84) 진술 74-76 또는 77에 있어서, 대조군 또는 기준보다 낮은 평균 거리를 갖는 시험 화합물을 선택하는 단계, 및 제2 검정의 시험 화합물을 평가하여 시험 화합물을 MCAK의 활성화제로서 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
85) (a) NF-kB 유도 키나아제를 시험 화합물, ATP, 및 항체에 결합된 형광 추적자 (633nm)를 갖는 항체와 혼합하되, 항체는 ADP를 특이적으로 인식하는 단계; (b) 시험 검정 혼합물을 항온처리하여 항온처리된 시험 검정을 생산하는 단계; (c) 항온처리된 시험 검정에서 형광의 양을 측정하는 단계; 및 (d) 항온처리된 시험 검정에서 형광의 양을 대조군 또는 기준과 비교하는 단계를 포함하는 단계.
86) 진술 85에 있어서, 대조군이 시험 화합물을 함유하지 않는 대조군 검정에서 형광의 양인, 방법.
87) 진술 85에 있어서, 기준이 시험 화합물을 함유하지 않는 일련의 대조군 검정에서 형광의 평균양인, 방법.
88) 진술 85, 86 또는 87에 있어서, 대조군 또는 기준보다 하나 이상의 항온처리된 시험 검정에서 더 많은 양의 형광을 갖는 시험 화합물을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
89) 진술 85-87 또는 88에 있어서, 대조군 또는 기준보다 하나 이상의 항온처리된 시험 검정에서 더 많은 양의 형광을 갖는 시험 화합물을 선택하ㄴ는 단계, 및 제2 검정에서 시험 화합물을 평가하여 시험 화합물을 NF-kB 유도 키나아제의 억제제로서 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
90) (a) 암 세포를 시험 화합물 및 항-림포톡신 베타 수용체 (LT-βR) 항체와 혼합하는 단계; (b) 시험 화합물이 암 세포를 침투하기에 충분한 시간 및 조건 하에서 시험 검정을 항온처리하여 항온처리된 시험 암 세포를 생산하는 단계; (c) 항온처리된 시험 암 세포의 핵으로의 RELB 전좌의 수량을 측정하는 단계; 및 (d) 항온처리된 시험 암 세포의 핵으로의 RELB 전좌의 양 수량을 대조군 또는 기준과 비교하는 단계를 포함하는 방법.
91) 진술 90에 있어서, 항온처리된 시험 암 세포의 핵으로의 RELB 전좌의 수량을 측정하는 단계가 세포질 신호 강도에 대한 핵의 비율을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
92) 진술 90 또는 91에 있어서, 대조군이 시험 화합물을 함유하지 않은 대조군 검정에서 핵으로의 RELB 전좌의 양인, 방법.
93) 진술 90 또는 91에 있어서, 기준이 시험 화합물을 함유하지 않는 일련의 대조군 검정에서 핵으로의 RELB 전좌의 평균량인, 방법.
94) 진술 90-92 또는 93에 있어서, 대조군 또는 기준보다 항온처리된 시험 암 세포의 핵으로의 낮은 수량의 RELB 전좌를 갖는 시험 화합물을 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
95) 진술 85-87 또는 88에 있어서, 대조군 또는 기준보다 항온처리된 시험 암 세포의 핵으로의 낮은 수량의 RELB 전좌를 갖는 시험 화합물을 선택하는 단계, 및 제2 검정에서 시험 화합물을 평가하여 시험 화합물을 NF-kB 유도 키나아제의 억제제로서 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
96) 진술 74-94 또는 95의 방법에 의해 생산된 유효 시험 화합물.
97) 진술 96에 있어서, 방법이 유효 시험 화합물을 동물 모델에 투여하여, 예를 들어, 유효 시험 화합물의 독성 및/또는 효능을 추가로 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 유효 시험 화합물.
98) 진술 96 또는 97에 있어서, 방법이 유효 시험 화합물을 환자 또는 세포 또는 조직 샘플이 수득된 특허에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 유효 시험 화합물.
본원에 기술된 특이적 방법 및 조성물은 바람직한 실시양태를 나타내며 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 다른 목적, 양태 및 실시양태는 본 명세서를 고려하여 당업자에게 생각될 것이며 청구 범위의 범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 사상 내에 포함된다. 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 본원에 개시된 발명에 대해 다양한 치환 및 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
본원에 예시적으로 기술된 본 발명은 본원에서 본질적으로 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 또는 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적절하게 실시될 수 있다. 본원에 예시적으로 기술된 방법 및 공정은 상이한 단계의 순서로 실시될 수 있으며, 방법 또는 공정은 본원 또는 청구 범위에 지시된 단계의 순서로 반드시 제한되는 것은 아니다.
본원 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥 상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "핵산" 또는 "발현 카세트" 또는 "세포"에 대한 언급은 복수의 이러한 핵산, 발현 벡터 또는 세포 (예를 들어, 핵산 또는 발현 카세트의 용액 또는 건조된 제제, 세포 집단) 등을 포함한다. 본 문서에서, 용어 "또는"은 달리 지시되지 않는 한, 비 배타적인 것을 지칭하기 위해, 또는 "A 또는 B"가 "A이지만 B가 아닌", "B이지만 A가 아닌" 및 "A 및 B"를 포함하는 것으로 사용된다.
어떠한 상황에서도 특허는 본원에 구체적으로 개시된 특이적 실시예 또는 실시양태 또는 방법으로 제한되는 것으로 해석될 수 없다. 어떠한 상황에서도 이러한 진술이 명시적이고 출원인에 의한 응답 서신에 분명히 채택한 자격이나 유보가 없는 경우가 아니면 임의의 심사관 또는 특허청의 임의의 다른 공무원 또는 직원에 의한 임의의 진술에 의해 특허가 제한되는 것으로 해석될 수 없다.
이용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로서 사용되며, 이러한 용어 및 표현의 사용은 도시되고 기술된 특징 또는 이의 일부의 임의의 등가물을 배제하려는 의도는 아니며, 그러나 청구된 바와 같이 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것이 인식된다. 따라서, 본 발명은 바람직한 실시양태 및 선택적 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 개념의 변형 및 수정은 당업자에 의해 이루어질 수 있으며, 이러한 변형 및 수정은 본 발명의 첨부된 청구 범위 및 진술에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있다는 것이 고려된다는 것이 이해될 것이다.
본 발명은 본원에 광범위하고 일반적으로 기술되었다. 속의(generic) 개시내용 내에 속하는 보다 좁은 종 및 아속 분류 각각은 본 발명의 일부를 형성한다. 이는, 소비 물질이 본원에 구체적으로 언급되는지 여부에 관계없이 속의 개시내용으로부터 임의의 주제를 제거하는 단서 또는 부정적 제한을 갖는 본 발명에서의 종의 설명을 포함한다. 또한, 본 발명의 특징 또는 양태가 Markush 그룹의 관점에서 기술되는 경우, 당업자는 본 발명이 또한 Markush 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위 그룹의 관점에서 기술됨을 인식할 것이다.
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Glu Gln Arg 145 150 155 160 Glu Lys Arg Arg Arg Leu Gln Gln Glu Ile Arg Ala Arg Arg Ala Leu 165 170 175 Asp Val Asn Thr Arg Asn Pro Asn Tyr Glu Ile Met His Met Ile Glu 180 185 190 Glu Tyr Arg Arg His Leu Asp Ser Ser Lys Ile Ser Val Leu Glu Pro 195 200 205 Pro Gln Glu His Arg Ile Cys Val Cys Val Arg Lys Arg Pro Leu Asn 210 215 220 Gln Arg Glu Thr Thr Leu Lys Asp Leu Asp Ile Ile Thr Val Pro Ser 225 230 235 240 Asp Asn Val Val Met Val His Glu Ser Lys Gln Lys Val Asp Leu Thr 245 250 255 Arg Tyr Leu Gln Asn Gln Thr Phe Cys Phe Asp His Ala Phe Asp Asp 260 265 270 Lys Ala Ser Asn Glu Leu Val Tyr Gln Phe Thr Ala Gln Pro Leu Val 275 280 285 Glu Ser Ile Phe Arg Lys Gly Met Ala Thr Cys Phe Ala Tyr Gly Gln 290 295 300 Thr Gly Ser Gly Lys Thr Tyr Thr Met Gly Gly Asp Phe Ser Gly Thr 305 310 315 320 Ala Gln Asp Cys Ser Lys Gly Ile Tyr Ala Leu Val Ala Gln Asp Val 325 330 335 Phe Leu Leu Leu Arg Asn Ser Thr Tyr Glu Lys Leu Asp Leu Lys Val 340 345 350 Tyr Gly Thr Phe Phe Glu Ile Tyr Gly Gly Lys Val Tyr Asp Leu Leu 355 360 365 Asn Trp Lys Lys Lys Leu Gln Val Leu Glu Asp Gly Asn Gln Gln Ile 370 375 380 Gln Val Val Gly Leu Gln Glu Lys Glu Val Cys Cys Val Glu Glu Val 385 390 395 400 Leu Asn Leu Val Glu Ile Gly Asn Ser Cys Arg Thr Ser Arg Gln Thr 405 410 415 Pro Val Asn Ala His Ser Ser Arg Ser His Ala Val Phe Gln Ile Ile 420 425 430 Leu Lys Ser Gly Arg Ile Met His Gly Lys Phe Ser Leu Val Asp Leu 435 440 445 Ala Gly Asn Glu Arg Gly Ala Asp Thr Thr Lys Ala Ser Arg Lys Arg 450 455 460 Gln Leu Glu Gly Ala Glu Ile Asn Lys Ser Leu Leu Ala Leu Lys Glu 465 470 475 480 Cys Ile Leu Ala Leu Gly Gln Asn Lys Pro His Thr Pro Phe Arg Ala 485 490 495 Ser Lys Leu Thr Leu Val Leu Arg Asp Ser Phe Ile Gly Gln Asn Ser 500 505 510 Ser Thr Cys Met Ile Ala Thr Ile Ser Pro Gly Met Thr Ser Cys Glu 515 520 525 Asn Thr Leu Asn Thr Leu Arg Tyr Ala Asn Arg Val Lys Lys Leu Asn 530 535 540 Val Asp Val Arg Pro Tyr His Arg Gly His Tyr Pro Ile Gly His Glu 545 550 555 560 Ala Pro Arg Met Leu Lys Ser His Ile Gly Asn Ser Glu 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gcaggaaaat gtaacaatcc agaaacaaaa acggagatcc gtcaactcca aaattcctgc 420 tccaaaagaa agtcttcgaa gccgctccac tcgcatgtcc actgtctcag agcttcgcat 480 cacggctcag gagaatgaca tggaggtgga gctgcctgca gctgcaaact cccgcaagca 540 gttttcagtt cctcctgccc ccactaggcc ttcctgccct gcagtggctg aaataccatt 600 gaggatggtc agcgaggaga tggaagagca agtccattcc atccgtggca gctcttctgc 660 aaaccctgtg aactcagttc ggaggaaatc atgtcttgtg aaggaagtgg aaaaaatgaa 720 gaacaagcga gaagagaaga aggcccagaa ctctgaaatg agaatgaaga gagctcagga 780 gtatgacagt agttttccaa actgggaatt tgcccgaatg attaaagaat ttcgggctac 840 tttggaatgt catccactta ctatgactga tcctatcgaa gagcacagaa tatgtgtctg 900 tgttaggaaa cgcccactga ataagcaaga attggccaag aaagaaattg atgtgatttc 960 cattcctagc aagtgtctcc tcttggtaca tgaacccaag ttgaaagtgg acttaacaaa 1020 gtatctggag aaccaagcat tctgctttga ctttgcattt gatgaaacag cttcgaatga 1080 agttgtctac aggttcacag caaggccact ggtacagaca atctttgaag gtggaaaagc 1140 aacttgtttt gcatatggcc agacaggaag tggcaagaca catactatgg gcggagacct 1200 ctctgggaaa 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gagaaggcta tggaagagct caaggagatc atacagcaag gaccagactg 2100 gcttgagctc tctgagatga ccgagcagcc agactatgac ctggagacct ttgtgaacaa 2160 agcggaatct gctctggccc agcaagccaa gcatttctca gccctgcgag atgtcatcaa 2220 ggccttacgc ctggccatgc agctggaaga gcaggctagc agacaaataa gcagcaagaa 2280 acggccccag tgacgactgc aaataaaaat ctgtttggtt tgacacccag cctcttccct 2340 ggccctcccc agagaacttt gggtacctgg tgggtctagg cagggtctga gctgggacag 2400 gttctggtaa atgccaagta tgggggcatc tgggcccagg gcagctgggg agggggtcag 2460 agtgacatgg gacactcctt ttctgttcct cagttgtcgc cctcacgaga ggaaggagct 2520 cttagttacc cttttgtgtt gcccttcttt ccatcaaggg gaatgttctc agcatagagc 2580 tttctccgca gcatcctgcc tgcgtggact ggctgctaat ggagagctcc ctggggttgt 2640 cctggctctg gggagagaga cggagccttt agtacagcta tctgctggct ctaaaccttc 2700 tacgcctttg ggccgagcac tgaatgtctt gtactttaaa aaaatgtttc tgagacctct 2760 ttctacttta ctgtctccct agagtcctag aggatcccta ctgttttctg ttttatgtgt 2820 ttatacattg tatgtaacaa taaagagaaa aaataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaa 2886 <210> 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540 Pro Glu Asn Asn Ile Pro Gly Glu Arg Val Ala Thr Val Leu Ala Thr 545 550 555 560 Asp Ala Asp Ser Gly Lys Asn Ala Glu Ile Ala Tyr Ser Leu Asp Ser 565 570 575 Ser Val Met Gly Ile Phe Ala Ile Asp Pro Asp Ser Gly Asp Ile Leu 580 585 590 Val Asn Thr Val Leu Asp Arg Glu Gln Thr Asp Arg Tyr Glu Phe Lys 595 600 605 Val Asn Ala Lys Asp Lys Gly Ile Pro Val Leu Gln Gly Ser Thr Thr 610 615 620 Val Ile Val Gln Val Ala Asp Lys Asn Asp Asn Asp Pro Lys Phe Met 625 630 635 640 Gln Asp Val Phe Thr Phe Tyr Val Lys Glu Asn Leu Gln Pro Asn Ser 645 650 655 Pro Val Gly Met Val Thr Val Met Asp Ala Asp Lys Gly Arg Asn Ala 660 665 670 Glu Met Ser Leu Tyr Ile Glu Glu Asn Asn Asn Ile Phe Ser Ile Glu 675 680 685 Asn Asp Thr Gly Thr Ile Tyr Ser Thr Met Ser Phe Asp Arg Glu His 690 695 700 Gln Thr Thr Tyr Thr Phe Arg Val Lys Ala Val Asp Gly Gly Asp Pro 705 710 715 720 Pro Arg Ser Ala Thr Ala Thr Val Ser Leu Phe Val Met Asp Glu Asn 725 730 735 Asp Asn Ala Pro Thr Val Thr Leu Pro Lys Asn Ile Ser Tyr Thr Leu 740 745 750 Leu Pro Pro Ser Ser Asn Val Arg Thr Val Val Ala Thr Val Leu Ala 755 760 765 Thr Asp Ser Asp Asp Gly Ile Asn Ala Asp Leu Asn Tyr Ser Ile Val 770 775 780 Gly Gly Asn Pro Phe Lys Leu Phe Glu Ile Asp Pro Thr Ser Gly Val 785 790 795 800 Val Ser Leu Val Gly Lys Leu Thr Gln Lys His Tyr Gly Leu His Arg 805 810 815 Leu Val Val Gln Val Asn Asp Ser Gly Gln Pro Ser Gln Ser Thr Thr 820 825 830 Thr Leu Val His Val Phe Val Asn Glu Ser Val Ser Asn Ala Thr Ala 835 840 845 Ile Asp Ser Gln Ile Ala Arg Ser Leu His Ile Pro Leu Thr Gln Asp 850 855 860 Ile Ala Gly Asp Pro Ser Tyr Glu Ile Ser Lys Gln Arg Leu Ser Ile 865 870 875 880 Val Ile Gly Val Val Ala Gly Ile Met Thr Val Ile Leu Ile Ile Leu 885 890 895 Ile Val Val Met Ala Arg Tyr Cys Arg Ser Lys Asn Lys Asn Gly Tyr 900 905 910 Glu Ala Gly Lys Lys Asp His Glu Asp Phe Phe Thr Pro Gln Gln His 915 920 925 Asp Lys Ser Lys Lys Pro Lys Lys Asp Lys Lys Asn Lys Lys Ser Lys 930 935 940 Gln Pro Leu Tyr Ser Ser Ile Val Thr Val Glu Ala Ser Lys Pro Asn 945 950 955 960 Gly Gln Arg Tyr Asp Ser Val Asn Glu Lys Leu Ser Asp Ser Pro Ser 965 970 975 Met Gly Arg Tyr Arg Ser Val Asn Gly Gly Pro Gly Ser Pro Asp Leu 980 985 990 Ala Arg His Tyr Lys Ser Ser Ser Pro Leu Pro Thr Val Gln Leu His 995 1000 1005 Pro Gln Ser Pro Thr Ala Gly Lys Lys His Gln Ala Val Gln Asp Leu 1010 1015 1020 Pro Pro Ala Asn Thr Phe Val Gly Ala Gly Asp Asn Ile Ser Ile Gly 1025 1030 1035 1040 Ser Asp His Cys Ser Glu Tyr Ser Cys Gln Thr Asn Asn Lys Tyr Ser 1045 1050 1055 Lys Gln Met Arg Leu His Pro Tyr Ile Thr Val Phe Gly 1060 1065 <210> 53 <211> 345 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Met Glu Glu Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Met Ala Glu Lys Asp Ser Leu 1 5 10 15 Asp Pro Ser Phe Thr His Ala Leu Arg Leu Val Asn Gln Glu Ile Glu 20 25 30 Lys Phe Gln Lys Gly Glu Gly Lys Glu Glu Lys Tyr Ile Asp Val Val 35 40 45 Ile Asn Lys Asn Met Lys Leu Gly Gln Lys Val Leu Ile Pro Val Lys 50 55 60 Gln Phe Pro Lys Phe Asn Phe Val Gly Lys Leu Leu Gly Pro Arg Gly 65 70 75 80 Asn Ser Leu Lys Arg Leu Gln Glu Glu Thr Leu Thr Lys Met Ser Ile 85 90 95 Leu Gly Lys Gly Ser Met Arg Asp Lys Ala Lys Glu Glu Glu Leu Arg 100 105 110 Lys Ser Gly Glu Ala Lys Tyr Phe His Leu Asn Asp Asp Leu His Val 115 120 125 Leu Ile Glu Val Phe Ala Pro Pro Ala Glu Ala Tyr Ala Arg Met Gly 130 135 140 His Ala Leu Glu Glu Ile Lys Lys Phe Leu Ile Pro Asp Tyr Asn Asp 145 150 155 160 Glu Ile Arg Gln Ala Gln Leu Gln Glu Leu Thr Tyr Leu Asn Gly Gly 165 170 175 Ser Glu Asn Ala Asp Val Pro Val Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Arg 180 185 190 Thr Arg Gly Val Pro Ala Pro Ala Ile Thr Arg Gly Arg Gly Gly Val 195 200 205 Thr Ala Arg Pro Val Gly Val Val Val Pro Arg Gly Thr Pro Thr Pro 210 215 220 Arg Gly Val Leu Ser Thr Arg Gly Pro Val Ser Arg Gly Arg Gly Leu 225 230 235 240 Leu Thr Pro Arg Ala Arg Gly Val Pro Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Pro 245 250 255 Pro Pro Pro Pro Thr Gln Glu Thr Tyr Gly Glu Tyr Asp Tyr Asp Asp 260 265 270 Gly Tyr Gly Thr Ala Tyr Asp Glu Gln Ser Tyr Asp Ser Tyr Asp Asn 275 280 285 Ser Tyr Ser Thr Pro Ala Gln Ser Gly Ala Asp Tyr Tyr Asp Tyr Gly 290 295 300 His Gly Leu Ser Glu Glu Thr Tyr Asp Ser Tyr Gly Gln Glu Glu Trp 305 310 315 320 Thr Asn Ser Arg His Lys Ala Pro Ser Ala Arg Thr Ala Lys Gly Val 325 330 335 Tyr Arg Asp Gln Pro Tyr Gly Arg Tyr 340 345 <210> 54 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 1 5 10 15 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 20 25 30 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 35 40 45 Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 50 55 60 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 65 70 75 80 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys 85 90 95 Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn 100 105 110 Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val 115 120 125 Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 130 135 140 <210> 55 <211> 296 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Met Thr Lys Thr Ala Leu Leu Lys Leu Phe Val Ala Ile Val Ile Thr 1 5 10 15 Phe Ile Leu Ile Leu Pro Glu Tyr Phe Lys Thr Pro Lys Glu Arg Thr 20 25 30 Leu Glu Leu Ser Cys Leu Glu Val Cys Leu Gln Ser Asn Phe Thr Tyr 35 40 45 Ser Leu Ser Ser Leu Asn Phe Ser Phe Val Thr Phe Leu Gln Pro Val 50 55 60 Arg Glu Thr Gln Ile Ile Met Arg Ile Phe Leu Asn Pro Ser Asn Phe 65 70 75 80 Arg Asn Phe Thr Arg Thr Cys Gln Asp Ile Thr Gly Glu Phe Lys Met 85 90 95 Cys Ser Ser Cys Leu Val Cys Glu Pro Lys Gly Asn Met Asp Phe Ile 100 105 110 Ser Gln Glu Gln Thr Ser Lys Val Leu Ile Arg Arg Gly Ser Met Glu 115 120 125 Val Lys Ala Asn Asp Phe His Ser Pro Cys Gln His Phe Asn Phe Ser 130 135 140 Val Ala Pro Leu Val Asp His Leu Glu Glu Tyr Asn Thr Thr Cys His 145 150 155 160 Leu Lys Asn His Thr Gly Arg Ser Thr Ile Met Glu Asp Glu Pro Ser 165 170 175 Lys Glu Lys Ser Ile Asn Tyr Thr Cys Arg Ile Met Glu Tyr Pro Asn 180 185 190 Asp Cys Ile His Ile Ser Leu His Leu Glu Met Asp Ile Lys Asn Ile 195 200 205 Thr Cys Ser Met Lys Ile Thr Trp Tyr Ile Leu Val Leu Leu Val Phe 210 215 220 Ile Phe Leu Ile Ile Leu Thr Ile Arg Lys Ile Leu Glu Gly Gln Arg 225 230 235 240 Arg Val Gln Lys Trp Gln Ser His Arg Asp Lys Pro Thr Ser Val Leu 245 250 255 Leu Arg Gly Ser Asp Ser Glu Lys Leu Arg Ala Leu Asn Val Gln Val 260 265 270 Leu Ser Ala Glu Thr Thr Gln Arg Leu Pro Leu Asp Gln Val Gln Glu 275 280 285 Val Leu Pro Pro Ile Pro Glu Leu 290 295 <210> 56 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Met Ala Arg Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Leu Met Ala Thr Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ser Lys Glu Glu Asn Arg Ile Ile Pro Gly 20 25 30 Gly Ile Tyr Asp Ala Asp Leu Asn Asp Glu Trp Val Gln Arg Ala Leu 35 40 45 His Phe Ala Ile Ser Glu Tyr Asn Lys Ala Thr Glu Asp Glu Tyr Tyr 50 55 60 Arg Arg Pro Leu Gln Val Leu Arg Ala Arg Glu Gln Thr Phe Gly Gly 65 70 75 80 Val Asn Tyr Phe Phe Asp Val Glu Val Gly Arg Thr Ile Cys Thr Lys 85 90 95 Ser Gln Pro Asn Leu Asp Thr Cys Ala Phe His Glu Gln Pro Glu Leu 100 105 110 Gln Lys Lys Gln Leu Cys Ser Phe Glu Ile Tyr Glu Val Pro Trp Glu 115 120 125 Asp Arg Met Ser Leu Val Asn Ser Arg Cys Gln Glu Ala 130 135 140 <210> 57 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Met Gly Arg Ala Met Val Ala Arg Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Ser Ser Glu Thr Thr Thr Gly 20 25 30 Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gly Leu Ala Pro 35 40 45 Asn Pro Thr Asn Ala Thr Thr Lys Ala Ala Gly Gly Ala Leu Gln Ser 50 55 60 Thr Ala Ser Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Leu Leu His Leu Tyr Ser 65 70 75 80 <210> 58 <211> 268 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Met Ser Leu Ser Phe Leu Leu Leu Leu Phe Phe Ser His Leu Ile Leu 1 5 10 15 Ser Ala Trp Ala His Gly Glu Lys Arg Leu Ala Pro Lys Gly Gln Pro 20 25 30 Gly Pro Ala Ala Thr Asp Arg Asn Pro Arg Gly Ser Ser Ser Arg Gln 35 40 45 Ser Ser Ser Ser Ala Met Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ser Ser Pro Ala 50 55 60 Ala Ser Leu Gly Ser Gln Gly Ser Gly Leu Glu Gln Ser Ser Phe Gln 65 70 75 80 Trp Ser Pro Ser Gly Arg Arg Thr Gly Ser Leu Tyr Cys Arg Val Gly 85 90 95 Ile Gly Phe His Leu Gln Ile Tyr Pro Asp Gly Lys Val Asn Gly Ser 100 105 110 His Glu Ala Asn Met Leu Ser Val Leu Glu Ile Phe Ala Val Ser Gln 115 120 125 Gly Ile Val Gly Ile Arg Gly Val Phe Ser Asn Lys Phe Leu Ala Met 130 135 140 Ser Lys Lys Gly Lys Leu His Ala Ser Ala Lys Phe Thr Asp Asp Cys 145 150 155 160 Lys Phe Arg Glu Arg Phe Gln Glu Asn Ser Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser 165 170 175 Ala Ile His Arg Thr Glu Lys Thr Gly Arg Glu Trp Tyr Val Ala Leu 180 185 190 Asn Lys Arg Gly Lys Ala Lys Arg Gly Cys Ser Pro Arg Val Lys Pro 195 200 205 Gln His Ile Ser Thr His Phe Leu Pro Arg Phe Lys Gln Ser Glu Gln 210 215 220 Pro Glu Leu Ser Phe Thr Val Thr Val Pro Glu Lys Lys Lys Pro Pro 225 230 235 240 Ser Pro Ile Lys Pro Lys Ile Pro Leu Ser Ala Pro Arg Lys Asn Thr 245 250 255 Asn Ser Val Lys Tyr Arg Leu Lys Phe Arg Phe Gly 260 265 <210> 59 <211> 579 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Met Leu Arg Ser Gly Pro Ala Ser Gly Pro Ser Val Pro Thr Gly Arg 1 5 10 15 Ala Met Pro Ser Arg Arg Val Ala Arg Pro Pro Ala Ala Pro Glu Leu 20 25 30 Gly Ala Leu Gly Ser Pro Asp Leu Ser Ser Leu Ser Leu Ala Val Ser 35 40 45 Arg Ser Thr Asp Glu Leu Glu Ile Ile Asp Glu Tyr Ile Lys Glu Asn 50 55 60 Gly Phe Gly Leu Asp Gly Gly Gln Pro Gly Pro Gly Glu Gly Leu Pro 65 70 75 80 Arg Leu Val Ser Arg Gly Ala Ala Ser Leu Ser Thr Val Thr Leu Gly 85 90 95 Pro Val Ala Pro Pro Ala Thr Pro Pro Pro Trp Gly Cys Pro Leu Gly 100 105 110 Arg Leu Val Ser Pro Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro His Leu Val 115 120 125 Ile Thr Glu Gln Pro Lys Gln Arg Gly Met Arg Phe Arg Tyr Glu Cys 130 135 140 Glu Gly Arg Ser Ala Gly Ser Ile Leu Gly Glu Ser Ser Thr Glu Ala 145 150 155 160 Ser Lys Thr Leu Pro Ala Ile Glu Leu Arg Asp Cys Gly Gly Leu Arg 165 170 175 Glu Val Glu Val Thr Ala Cys Leu Val Trp Lys Asp Trp Pro His Arg 180 185 190 Val His Pro His Ser Leu Val Gly Lys Asp Cys Thr Asp Gly Ile Cys 195 200 205 Arg Val Arg Leu Arg Pro His Val Ser Pro Arg His Ser Phe Asn Asn 210 215 220 Leu Gly Ile Gln Cys Val Arg Lys Lys Glu Ile Glu Ala Ala Ile Glu 225 230 235 240 Arg Lys Ile Gln Leu Gly Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Gly Ser Leu Lys 245 250 255 Asn His Gln Glu Val Asp Met Asn Val Val Arg Ile Cys Phe Gln Ala 260 265 270 Ser Tyr Arg Asp Gln Gln Gly Gln Met Arg Arg Met Asp Pro Val Leu 275 280 285 Ser Glu Pro Val Tyr Asp Lys Lys Ser Thr Asn Thr Ser Glu Leu Arg 290 295 300 Ile Cys Arg Ile Asn Lys Glu Ser Gly Pro Cys Thr Gly Gly Glu Glu 305 310 315 320 Leu Tyr Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Glu Asp Ile Ser Val Val 325 330 335 Phe Ser Arg Ala Ser Trp Glu Gly Arg Ala Asp Phe Ser Gln Ala Asp 340 345 350 Val His Arg Gln Ile Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Pro Tyr Glu Asp 355 360 365 Leu Glu Ile Val Glu Pro Val Thr Val Asn Val Phe Leu Gln Arg Leu 370 375 380 Thr Asp Gly Val Cys Ser Glu Pro Leu Pro Phe Thr Tyr Leu Pro Arg 385 390 395 400 Asp His Asp Ser Tyr Gly Val Asp Lys Lys Arg Lys Arg Gly Met Pro 405 410 415 Asp Val Leu Gly Glu Leu Asn Ser Ser Asp Pro His Gly Ile Glu Ser 420 425 430 Lys Arg Arg Lys Lys Lys Pro Ala Ile Leu Asp His Phe Leu Pro Asn 435 440 445 His Gly Ser Gly Pro Phe Leu Pro Pro Ser Ala Leu Leu Pro Asp Pro 450 455 460 Asp Phe Phe Ser Gly Thr Val Ser Leu Pro Gly Leu Glu Pro Pro Gly 465 470 475 480 Gly Pro Asp Leu Leu Asp Asp Gly Phe Ala Tyr Asp Pro Thr Ala Pro 485 490 495 Thr Leu Phe Thr Met Leu Asp Leu Leu Pro Pro Ala Pro Pro His Ala 500 505 510 Ser Ala Val Val Cys Ser Gly Gly Ala Gly Ala Val Val Gly Glu Thr 515 520 525 Pro Gly Pro Glu Pro Leu Thr Leu Asp Ser Tyr Gln Ala Pro Gly Pro 530 535 540 Gly Asp Gly Gly Thr Ala Ser Leu Val Gly Ser Asn Met Phe Pro Asn 545 550 555 560 His Tyr Arg Glu Ala Ala Phe Gly Gly Gly Leu Leu Ser Pro Gly Pro 565 570 575 Glu Ala Thr <210> 60 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide sequence <400> 60 uucaagaga 9 <210> 61 <211> 750 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 tgcctccaga aagggttgag aagataatgg atcagattga aaagtacatc atgactcatc 60 tctgtaaata tgcgttctgt ccagaacccc agtgagcctg gaagactggg tgctatggga 120 aatgtcatca atccaatgct agtgaaagat gtgactgggg aatgctgaaa aatgcgcacc 180 cctgggagga atgaggaaag atgacatcca ctgacttgtt atttttttga gaaggagtct 240 tgctctgttg cccaggctgg agtgtggtgg cacgatctcg gctcactgat gatgagaaga 300 aagatcttgc cattcaaaag aggatcagag tggaagcttc tctgtggtgt cagaaagacg 360 aggaatgtgg tgacctcacc tatccatctc cctcaaggca gcttttgacc tgaactggtt 420 atttcctact tgcctcctgg agttgctaat aaaataaaca ctaaagcttc gcagtttcta 480 aaaagaccat gaagccctga gagtaatgaa aaggttcctg aaattgaggt cactgtggaa 540 ggagaatcta atgcctgatg atctgtcact atctcccatc acccccagat gggaccatct 600 agttgcagga aaagaaggtc aagactccca gtcattctac attatgcctc agccaagatg 660 tctcacccca ctctctctga tgcaacaaga agcccctgga gaacgtttca gtcccatttt 720 gtacttctgt catgtgctca tcacagtctg 750

Claims (25)

  1. (a) 시험 화합물을 배양 배지 중 전이성 암 세포 샘플과 혼합하여 시험 검정물을 생산하는 단계;
    (b) 상기 시험 화합물이 세포와 연관되거나 세포에 침투하기에 충분한 시간 및 조건 하에서 상기 시험 검정물을 항온처리하는 단계;
    (c)
    · 시험 검정 값을 생성하기 위한 상기 배양 배지, 상기 세포 또는 이들의 조합 중 cGAMP 양 또는 농도;
    · 평균 거리 결과를 생성하기 위한 일련의 상기 세포 내에서 중심체 사이의 거리;
    · 상기 세포의 핵으로의 RELB 전좌의 수량(quantity)을 측정하는 단계; 및
    (d)
    · 기준 cGAMP 값보다 낮은 시험 검정 cGAMP 값;
    · 기준 거리보다 낮은 평균 거리 결과;
    · 기준 수량보다 적은 상기 세포의 핵으로의 RELB 전좌의 수량을 갖는 시험 화합물을 선택하는 단계
    를 포함하여, 이로써 염색체 불안정성의 치료에 유효한 시험 화합물을 생산하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기준이
    a. 시험 화합물을 함유하지 않는 검정 혼합물 중 cGAMP의 양 또는 농도;
    b. 시험 화합물을 함유하지 않는 검정 혼합물 내에서 전이성 암 세포의 동원체 사이의 거리; 또는
    c. 시험 화합물을 함유하지 않는 검정 혼합물 내에서 전이성 암 세포의 핵으로의 RELB 전좌의 수량인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 cGAMP를 측정하기 전에 상기 샘플 또는 배양 배지를 알콜로 추출하여 알콜 추출물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 반-순수(semi-pure) 시험 샘플의 cGAMP를 측정하기 전에, 하나 이상의 HyperSep 아미노프로필 고체상 컬럼를 사용하는 고체상 추출(solid phase extraction(SPE))에 의해 상기 알콜 추출물을 정제하여 반-순수 시험 샘플을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 또는 제4항에 있어서, cGAMP 양 또는 농도를 측정하는 단계가 cGAMP의 수준을 측정하기 위한 액체 크로마토그래피 및/또는 질량 분광법을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 시험 화합물을 동물 모델에 투여하여 치료제를 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 치료제를 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  8. (a) 환자로부터 세포 또는 조직 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 기준 cGAMP 값을 생성하기 위해 상기 샘플로부터의 기지의 수 또는 중량의 세포 또는 조직으로부터 생산된 cGAMP의 양 또는 농도를 측정하는 단계;
    (c) 상기 샘플로부터의 동일한 기지의 수 또는 중량의 세포 또는 조직을 시험 화합물과 혼합하여 시험 검정물을 생성하는 단계;
    (d) 상기 시험 검정물 중 cGAMP 양 또는 농도를 측정하여 시험 검정물 cGAMP 값을 생성하는 단계;
    (e) 선택적으로, 단계 (c) 및 (d)를 반복하는 단계; 및
    상기 기준 cGAMP 값보다 낮은 시험 검정물 cGAMP 값을 갖는 임의의 시험 화합물을 선택하여 하나 이상의 유효 시험 화합물을 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 샘플이 전이성 암 세포 또는 전이성 조직을 포함하는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, cGAMP를 측정하기 전에 상기 세포 또는 조직 샘플을 알콜로 추출하여 알콜 추출물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제8항, 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 세포 또는 조직 샘플을 메탄올로 추출하여 메탄올 추출물을 생산하는 단계 및 메탄올 추출물 중 cGAMP를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 반-순수 시험 샘플의 cGAMP를 측정하기 전에 하나 이상의 HyperSep 아미노프로필 고체상 컬럼을 사용하는 고체상 추출(SPE)에 의해 알콜 추출물 또는 메탄올 추출물을 정제하여 반-순수 시험 샘플을 생산하는 방법을 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제8항 내지 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 cGAMP 양 또는 농도를 측정하는 단계가 액체 크로마토그래피 및/또는 질량 분광법을 포함하는, 방법.
  14. 제8항 내지 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 유효 시험 화합물을 동물 암 모델에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제8항 내지 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 유효 시험 화합물을 환자에게 또는 상기 세포 또는 조직 샘플이 수득된 특허에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 또는 제15항의 방법에 의해 생산된 유효 시험 화합물.
  17. 전이성 화학요법제를 다음을 갖는 세포 샘플 또는 체액 샘플을 포함하는 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법:
    a. 상기 세포 샘플의 하나 이상의 세포 내에 10% 이상의 검출가능한 염색체 비분리;
    b. 상기 세포 샘플의 하나 이상의 세포 내에 3% 이상의 검출가능한 미세핵;
    c. 상기 세포 샘플의 하나 이상의 세포 내에 검출가능한 사이토졸 이중 가닥 DNA; 또는
    d. 상기 세포 샘플 또는 체액 샘플 중 10% 이상의 더 큰 농도 또는 양의 cGAMP.
  18. 제17항에 있어서, 전이성 화학요법제를 다음을 갖는 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법:
    a. 상기 세포 샘플의 후기 세포에서 비분리를 나타내는 15-20%의 염색체;
    b. 미세핵을 나타내는 상기 세포 샘플 중 5-8%의 세포;
    c. 정상 비암 조직과 비교하여 상기 사이토졸 내에서 염색 강도의 1 배 내지 2 배 증가; 또는
    d. 비암성 체액 샘플보다 상기 체액 샘플에서 1 배 내지 2 배 더 큰 농도 또는 양의 cGAMP.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 시간 경과에 따라 상기 환자로부터의 샘플을 모니터링하여 상기 환자의 세포 또는 체액 내의 염색체 비분리, 미세핵, 사이토졸 이중 가닥 DNA 또는 cGAMP를 정량화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 전이성 화학요법제가 하나 이상의 키네신-13 단백질(들), 하나 이상의 MCAK 단백질(들) 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물인, 방법.
  21. 제17항 내지 제19항 또는 제20항에 있어서, 전이성 화학요법제가 키네신-13 핵산 또는 키네신-13 단백질을 코딩하는 핵산 세그먼트에 작동가능하게 연결된 프로모터를 갖는 발현 카세트를 포함하는 조성물인, 방법.
  22. (a) 환자로부터의 시험 샘플 중 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24 또는 FGF5 유전자의 발현 수준을 정량화하여, 상기 시험 샘플 중 PELI2, BMP2, SHH, TNS4, RAB3B, ROBO1, ARHGAP28, CHN2, CST1, F13A1, CPVL, SEMA6D, C9orf152, NHSL2, GTF2IP7, DPYSL3, PCDH7, KHDRBS3, TRAC, TMEM156, CST4, CD24 또는 FGF5 유전자 각각의 정량화된 발현 수준을 생성하는 단계; 및
    (b) 각각의 정량화된 발현 수준이 이들 유전자 각각에 대한 중앙 기준 발현 수준보다 큰 경우 환자에게 더 긴 무전이 생존을 알리는 단계를 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 이들 유전자 각각에 대한 상기 중앙 기준 발현 수준이 전이성 암을 갖는 일련의 환자로부터의 샘플에서의 이들 유전자 각각의 중앙 발현인, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 환자가 유방암을 갖는, 방법.
  25. 다음을 갖는 세포 샘플 또는 체액 샘플을 포함하는 환자에게 투여하기 위한 조성물에서의 화학요법제의 용도:
    a. 상기 세포 샘플의 하나 이상의 세포 내에 10% 이상의 검출가능한 염색체 비분리;
    b. 상기 세포 샘플의 하나 이상의 세포 내에 3% 이상의 검출가능한 미세핵;
    c. 상기 세포 샘플의 하나 이상의 세포 내에 검출가능한 사이토졸 이중 가닥 DNA; 또는
    d. 상기 세포 샘플 또는 체액 샘플 중 10% 이상의 더 큰 농도 또는 양의 cGAMP.
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