KR20030032947A - 센티널 바이러스 ⅱ - Google Patents
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Abstract
본 발명은 H101.c33 또는 센티널 바이러스 II (SVII)로 명명된 신규 바이러스에 관한 것이다. 단리된 SVII 바이러스, SVII 바이러스로부터의 폴리뉴클레오티드 및 단백질, 및 SVII 바이러스 및 SVII 바이러스 단백질에 결합하는 항체가 제공된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 단백질 및 항체를 사용하여 SVII 바이러스 또는 감수성자에서의 SVII 바이러스에 의한 감염을 검출할 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 바이러스 단백질의 재조합 제조를 위한 재조합 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다.
Description
엄밀히 정의된 용어 "간염"은 간의 염증을 가리킨다. 다양한 상이한 화학적, 바이러스성 및 생물학적 약제가 간염을 유발할 수 있다. 그러나, 더욱 일반적으로 용어 간염은 바이러스 감염, 특히 간친화성 바이러스 감염에 의해 야기되는 간의 염증을 가리킨다.
바이러스성 간염은 크게 두 카테고리로 분류될 수 있다:급성 및 만성. 급성 바이러스성 간염은 황달, 무기력, 오심 및 상승된 혈중 간효소를 특징으로 한다. 바이러스성 간염은 대부분의 경우 자동적으로 해결되지만, 일부 급성 간염 피해자 (일반적으로 약 10 % 미만)에서는 이환률 및 사망률이 매우 높은 전격성 괴사 간염이 발병된다. 흥미롭게도, 급성 간염은 많은 경우에 간과되거나 "독감"으로 간주될 정도로 병세가 가볍다. 만성 간염은 훨씬 더 의미있는 공중 보건 문제를 발생시키고, 미국에서 간 이식에 대해 가장 일반적인 이유이다. 만성 간염은 급성 간염과 유사한 증상과 함께 악화 또는 "재발" 뿐만 아니라 간문맥 고혈압 및 간부전에 이르게 하는 간경변 (간의 반흔)을 특징으로 한다. 급성 간염 감염이 간과될 수 있으므로, 많은 만성 간염 환자는 이들의 질환이 꽤 진전될때까지 진단되지 않아, 치료에 대한 선택권을 제한한다.
"간염 바이러스"로 칭해지는 6 가지의 상이한 과의 바이러스가 있다 (A, B, C, D, E 및 G; F는 인공적인 것으로 발견됨). 개발도상국에서, 만성 감염을 구축할 수 있는 이러한 간염 바이러스는 공중보건의 관점에서 가장 중요한 바이러스인 것으로 일반적으로 간주된다. 간염 바이러스 중에서, B형 간염 바이러스 및 C형 간염 바이러스만이 만성 간염과 관련된 만성 감염을 구축하는 것으로 공지된 간염 바이러스이다. 그러나, HBV 및 HCV는 수혈 간염의 모든 경우의 원인이 아니다. 용어 "원인불명의 간염" 및 "비A-G형"은 공지된 간염 바이러스에 귀착될 수 없는 수혈 간염을 가리키기 위해 사용된다.
"수혈 간염"으로 앞서 칭해진 B형 간염은 경피, 성적 및 수직 경로를 통해 전파된다. 헤파드나비리다에 (hepadnaviridae)과의 일원인 B형 간염 바이러스는 급성 및 만성 간염 모두를 발생시킬 수 있다. B형 간염 바이러스 (HBV)는 잘 특징화되어 있고, 다양한 스크리닝 및 진단 분석법이 현재 이용가능하다. 부가적으로, 재조합 백신이 제조되어, 미국에서 대부분의 취학연령 어린이에 대해 요구된다.
종래에 "비-A형, 비-B형 간염"으로 알려진 C형 간염은 경피 경로를 통해 주로 전파되지만, HBV와 같이, 성적 및 수직 전파 또한 발생한다. 소수의 급성 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염만이 임상적으로 명백하고, 이는 이러한 바이러스가 매우 높은 비율로 만성 감염을 구축하기 때문에 문제가 된다. 이러한 조합은 미국에서 만성 HCV 감염이 미국에서 간 이식에 대해 주요한 이유가 되도록 한다.
공혈(供血) 내의 항-HBV 및/또는 HCV 항체의 검출을 위한 스크리닝 분석법의 출현으로 "수혈 간염"의 전파가 실질적으로 감소되었다. 그러나, 20-30 %의 감염성 혈액 제공이 여전히 검출되지 않는다. 이러한 감염성 샘플의 검출에 대한 실패는 하나 이상의 간염 바이러스가 동정되지 않고 존재하는 것에 주로 기인하는 것으로 여겨진다.
더욱 최근에는, 6 가지의 공지된 간염 바이러스에 더하여, 간염-관련 신규 바이러스가 동정되었다. TTV로 공지된 바이러스는 표현 차이 분석 (representation difference analysis: RDA) 기술을 사용하여 바이러스로부터 게놈 서열을 동정한 일본인 그룹에 의해 최초로 동정되었다 (Nishizawa 등, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun, 241(1):92-97). 파르보비리다에 (parvoviridae)과의 일원인 것으로 원래 여겨졌던 이러한 바이러스는 파르보비리다에의 분자량보다 현저히 낮은 부유성 밀도를 갖는 비교적 작은 바이러스이다. TTV는 원형(圓形)의 단일 가닥 DNA 게놈으로 인해 시르시노비리다에 (circinoviridae)로 공지된 바이러스과의 원형(原型) 인간원으로 제안되었다 (Mushahwar 등, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(6):3177-3182).
최근, Diasorin, Inc.는 신규 간염 바이러스의 단리를 발표하였다. SEN-V로 명명된 이 바이러스는 건강한 집단에서 매우 우세하고 간염 환자로부터의 혈액 샘플에 제한되지 않는 것으로 나중에 밝혀졌으며, 간염 바이러스일 것 같지 않다. SEN-V의 폴리뉴클레오티드 서열 및 단리 방법은 개시되지 않았다.
따라서, 비-A형/비-G형 간염의 검출을 위한 조성물 및 방법, 뿐만 아니라비-A형/비-G형 간염 감염의 예방을 위한 조성물 및 방법 및 비-A형/비-G형 간염 감염의 치료를 위한 조성물 및 방법이 당업계에서 요구된다.
발명의 개요
본 발명가들은 원인불명의 비-A형/비-G형 간염과 관련된 신규 바이러스를 발견하였다. 이로부터 다양한 유용한 발명이 유래되어, 예를 들어, 하기를 제공한다:
1) 단리된 SVII 바이러스를 함유하는 조성물. 단리된 SVII 바이러스의 예로는 도 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 단리된 바이러스가 포함된다.
2) 도 1의 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화될 수 있는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 이의 상보물, 단리된 SVII 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 이의 상보물이 포함되는 단리된 폴리뉴클레오티드. 단리된 폴리뉴클레오티드는 안티센스 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
3) 단리된 SVII 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 조성물.
4) 단리된 SVII 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 백신 조성물. 백신 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보조제를 함유할 수 있다.
5) SVII 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.
6) 단리된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터로, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드의 전사로 SVII 안티센스 폴리뉴클레오티드가 제조되는 발현 벡터.
7) SVII 바이러스 또는 이의 단백질에 결합하는 단리된 폴리클로날 항체 및모노클로날 항체.
8) 샘플을 SVII 바이러스 또는 이의 단백질에 결합하는 항체와 접촉시키고, 상기 항체와 SVII 바이러스 또는 이의 단백질의 복합체를 검출하는 것을 포함하는 SVII 바이러스의 검출 방법.
9) 샘플을 SVII 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하는 프로브 폴리뉴클레오티드와 접촉시키고, 상기 프로브와 SVII 폴리뉴클레오티드의 혼성화를 검출하는 것을 포함하는 SVII 바이러스의 검출 방법.
10) 샘플을 SVII 폴리뉴클레오티드와 선택적으로 혼성화하는 제 1 프라이머 폴리뉴클레오티드 및 SVII 폴리뉴클레오티드의 상보물과 혼성화하는 제 2 프라이머 폴리뉴클레오티드와 접촉시키고, 프라이머 확장 DNA 합성을 수행하고, 합성 생성물을 검출하는 것을 포함하는 SVII 바이러스의 검출 방법.
본 발명은 바이러스 분야, 특히 간염 바이러스에 관한 것이다.
도 1은 센티널 바이러스 II (SVII) 클론으로부터의 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열 및 개념적인 번역을 나타낸다 (표준 단일문자 코딩을 사용하고; k, m, r, s, y 및 w는 각각 T/G, A/C, G/A, G/C, T/C 및 A/T를 가리킨다). "포지티브"로 지정된 가닥은 "+"로 라벨링하고, 이의 역 상보물은 "-"로 라벨링한다. 번호매김은 + 가닥 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 오픈 리딩 프레임 P1, M1 및 M2 또한 나타난다. - 가닥 및 M1 및 M2 리딩 프레임은 오른쪽에서 왼쪽으로 판독한다.
본 발명가들은 센티널 바이러스 II (Sentinel Virus II: SVII)로 명명된 신규 간염 바이러스를 발견 및 단리하였고, 이는 원인불명의 비A-G형 간염과 관련된다. 원형(原形) 바이러스는 적어도 약 371 개 염기의 DNA 게놈을 함유한다. 원형 바이러스로부터의 게놈 서열은 도 1에 나타나 있다. 따라서, 본 발명은 단리된 SVII를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 SVII 바이러스 게놈 또는 이의 단편을 함유하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. SVII 감염 및/또는 SVII 바이러스 자체의 검출에 사용하기 위한 단리된 뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머 또한 제공된다. 프로브 및/또는 프라이머는 SVII의 신규 변이체의 동정 및 단리 방법에서 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 추가적인 양상에서는 단리된 SVII 바이러스 단백질 및/또는 이의 단편, 뿐만 아니라 이종형 (비-SVII) 단백질과 융합된 SVII 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 융합 단백질이 제공된다. 2 이상의 SVII 에피토프를 함유하는 모자이크 폴리펩티드 또한 포함된다. 동일한 SVII 단백질로부터의 2 이상의 에피토프를 함유하는 본 발명의 모자이크 폴리펩티드에서, 에피토프 사이의 개재 아미노산은 실질적으로 결실되거나 이종형 서열로 치환된다. 대안적으로, 본 발명의 모자이크 폴리펩티드는 상이한 SVII 단백질로부터의 2 에피토프를 함유하거나 또는 SVII과의 2 이상의 바이러스로부터의 동종형 에피토프를 함유할 수 있다.
본 발명은 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 내에서 작동가능한 프로모터에작동적으로 연결된 SVII 바이러스의 오픈 리딩 프레임으로부터 유래되는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 발현 구축물을 제공한다. 발현 구축물을 함유하는 발현 벡터 및 재조합 숙주 세포 또한 제공된다.
SVII과 바이러스의 에피토프에 특이적인 항체 또한 제공된다. 모노클로날 항체 및 단리된 폴리클로날 항체가 포함된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 SVII 감염의 검출 및/또는 SVII 바이러스의 검출을 위한 분석법 및 이러한 분석법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 분석법은 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 활용하는 면역분석법 또는 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로의 혼성화 또는 증폭 기술을 사용하는 핵산-기재 분석법일 수 있다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 SVII 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 백신을 제공한다. 백신은 단백질-기재 또는 DNA-기재 백신일 수 있다. 단백질-기재 백신은, 임의로 보조제와 조합된, SVII로부터 유래된 하나 이상의 폴리펩티드를 함유한다. DNA-기재 백신은 백신화될 대상 내에서 활성 (예를 들어, 백신화될 대상이 인간인 경우 인간 세포 내에서 활성)인 프로모터에 작동적으로 연결된 SVII 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
일반적인 기술
본 발명의 실행에서, 달리 언급되지 않는다면, 당업자의 범주 내인 분자생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이같은 기술은 문헌, 예컨대 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 제2판 (Smnbrook 등, 1989)];["Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, 편저, 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, 편저, 1987)]; ["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; ["Handbook of Experimental Immunology" (D.M. Weir & C.C. Blackwell, 편저)]; ["Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, 편저, 1987)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel 등, 편저, 1987 및 주기적인 개정판)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis 등, 편저, 1994)]; ["Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan 등, 편저, 1991 및 주기적인 개정판)]; 및 ["Immunochemistry in Practice" (Johnstone 및 Thorpe, 편저, 1996; Blackwell Science)]에 상세히 설명되어 있다.
정의
용어 "센티널 바이러스 II" 및 "SVII"는 인간에서 경피 노출을 통해 전파될 수 있고 A형 간염 바이러스 (HAV), B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), D형 간염 바이러스 (HDV), E형 간염 바이러스 (HEV) 및 G형 간염 바이러스 (HGV)와 혈청학적으로 구분되는 바이러스, 바이러스의 유형, 또는 바이러스의 부류를 가리킨다. SVII는 도 1의 아미노산 서열과 적어도 약 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 전체 아미노산 서열 상동성 및/또는 도 1의 아미노산 서열과 적어도 약 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 전체 아미노산 서열 동일성을갖는 메이저 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 갖는 게놈을 함유한다. 대안적으로, "SVII 변이체"는 도 1의 서열과 적어도 약 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 전체 뉴클레오티드 서열 동일성을 가질 수 있고, 도 1의 아미노산 서열과 적어도 약 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 전체 아미노산 서열 상동성 및/또는 도 1의 아미노산 서열과 적어도 약 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 전체 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF를 코딩한다.
"SVII 폴리펩티드" 또는 "SVII 단백질"은 SVII 바이러스 게놈의 ORF에 의해 코딩되는 폴리펩티드이다. 예시적인 SVII 폴리펩티드는 도 1에 나타난 아미노산 서열에서 나타난다. 바람직하게는, SVII 폴리펩티드는 적어도 약 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40 또는 50 개의 아미노산이고, 약 250, 200, 150, 134. 125, 110, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50 개 미만의 아미노산일 수 있으며, 상한이 항상 하한보다 큰 것을 제외하고는 상한 및 하한은 독립적으로 선택된다.
"변형 SVII 폴리펩티드"는 도 1의 임의의 상응하는 아미노산 서열과 적어도 약 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 상동성 및/또는 도 1의 임의의 아미노산 서열의 상응하는 부분과 적어도 약 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 변형 SVII 폴리펩티드는 적어도 약 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40 또는 50 개의아미노산이고, 약 250, 200, 150, 134, 125, 110, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50 개 미만의 아미노산일 수 있으며, 상한이 항상 하한보다 큰 것을 제외하고는 상한 및 하한은 독립적으로 선택된다.
"SVII 폴리뉴클레오티드"는 도 1에 나타난 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편과 동일한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 이의 상보물, 또는 SVII 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보물이다. 바람직하게는, SVII 폴리뉴클레오티드는 길이가 적어도 약 15, 20. 25, 30, 35, 40, 50 또는 60 개인 뉴클레오티드이고, 약 371, 350, 300, 250, 200, 150, 125, 75, 50, 40 또는 30 개 미만인 뉴클레오티드이며, 상한이 항상 하한보다 큰 것을 제외하고는 상한 및 하한은 독립적으로 선택된다. 당해 폴리뉴클레오티드에 대한 "상보물"은, 왓슨-크릭 염기 짝지움에 따라, 대조 폴리뉴클레오티드의 역 상보물을 갖는 폴리뉴클레오티드이다. 상보적인 폴리뉴클레오티드는 왓슨-크릭 염기짝지움을 사용하여 적절한 조건 하에 대조 폴리뉴클레오티드에 혼성화시킬 수 있다.
"변형 SVII 폴리뉴클레오티드"는 변형 SVII 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보물 또는 SVII 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보물이지만, SVII 폴리뉴클레오티드의 정의 내에 속하지 않는다. 변형 SVII 폴리뉴클레오티드는 어떠한 공지된 서열에서도 발견되지 않는다. 바람직하게는, 변형 SVII 폴리뉴클레오티드는 길이가 적어도 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 또는 60 개의 뉴클레오티드이고, 약 400, 370, 367, 350, 300, 200, 150, 125, 100, 75 또는 50 개 미만인 뉴클레오티드이며, 상한이항상 하한보다 큰 것을 제외하고는 상한 및 하한은 독립적으로 선택된다.
"아미노산 서열 상동성" 및 "아미노산 서열 동일성"은 두 서열의 비교시 상동성이거나 동일한 아미노산의 백분율을 가리킨다. 이러한 정렬 및 백분율 서열 상동성 또는 서열 동일성은 당업계에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 [Current Pratocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel 등, 편저, 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기술된 것들을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 파라메터가 정렬을 위해 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, 정렬 프로그램은 하기의 디폴트 파라메터를 사용하는 BLASTP이다: 데이타베이스 = 비-중복 (비-중복 GenBank CDS 번역 + PDB + SwissProt + PIR + PRF), 저복합성 필터링 = ON, 예상 = 10, 매트릭스 = BLOSUM62 (갭 존재 비용 11, 잔기 당 갭 1, 람다 0.85) 및 단어 크기 = 3. 정렬은 갭(gapped) 또는 언갭으로(ungapped) 수행될 수 있고, 바람직하게는 갭으로 수행된다. 이러한 BLASTP 구현 및 이러한 파라메터들은 하기의 인터넷 주소에서 확인될 수 있다: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
"뉴클레오티드 서열 동일성"은 두 서열의 비교시 동일한 뉴클레오티드 잔기의 백분율을 가리킨다. 이러한 정렬 및 백분율 서열 동일성은 당업계에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel 등, 편저, 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기술된 것들을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 파라메터가 정렬을 위해 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, 정렬 프로그램은 하기의 디폴트 파라메터를 사용하는 BLASTN이다: 데이타베이스 = 비-중복 (모든 비-중복 GenBank + EMBL + DDBJ+ PDB 서열), 저복합성 필터링 = ON, 예상 = 10, 매트릭스 = BLOSUM62, 갭 존재 비용 = 5, 갭 확장 비용 = 2, 미스매치 페널티 = -3, 매치 리워드 = 1, 및 단어 크기 = 11. 정렬은 갭 또는 언갭으로 수행할 수 있고, 바람직하게는 갭으로 수행된다. 이러한 BLASTN 구현 및 이러한 파라메터들은 하기의 인터넷 주소에서 확인될 수 있다:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
SVII 폴리뉴클레오티드 서열에 "선택적으로 혼성화할 수 있는" 폴리뉴클레오티드는 (i) 공지된 바이러스 폴리뉴클레오티스 서열에 혼성화하지 않으면서 SVII 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화하거나 또는 공지된 바이러스 폴리뉴클레오티드 서열의 증폭을 프라이밍하지 않으면서 SVII 폴리뉴클레오티드 서열의 증폭을 특이적으로 프라이밍하는 것이다. 선택적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 혼성화는 높은 스트린젠시 (stringency), 중간 스트린젠시 또는 낮은 스트린젠시 (예를 들어, 미스매치를 허용함)에서 적절하게 달성될 수 있다. 높은 스트린젠시 조건은 예상 하이브리드의 Tm보다 12-20 ℃ 낮은 최종 세정을 사용하고, 중간 및 낮은 스트린젠시 혼성화는 하이브리드의 Tm보다 21-30 ℃ 및 31-40 ℃ 낮은 최종 세정 조건을 사용한다. 긴 폴리뉴클레오티드의 Tm은 Tm= 8.15 - 16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G + C) - 0.63(%포름알데히드) - 600/N (식중 N은 연구되는 선택적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 길이이다)으로 확인될 수 있고, 약 70 내지 15 개 길이의 올리고뉴클레오티드의 Tm은 Tm= 8.15 - 16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G + C) - 600/N으로 확인될 수 있으며, ≤14 개 뉴클레오티드의 짧은 올리고뉴클레오티드의 Tm은 Tm= 2(A + T) + 4(G + C)로 확인될 수 있다. 증폭의 프라이밍은 바람직하게는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (예를 들어, 50 mM KCl, 10 mM 트리스-HCl, pH 8.3 (20 ℃에서), 1.5 mM MgCl2, 임의로 0.01 % 젤라틴) 및 테르메스 아쿠아티쿠스 (T. aquaticus) DNA 중합효소의 변형 버젼인 AmpliTaq Gold™ (PE Biosystems)에 대한 표준 조건 하에 수행된다.
"단리된" 바이러스, 바이러스 구조물 (예를 들어, 캡시드), 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 이의 정상 환경에서 발견되는 오염 성분으로부터 적어도 부분적으로 정제된 것이다. 예를 들어, 단리된 바이러스는 혈액, 혈청 또는 조직 단백질로부터 적어도 부분적으로 정제된 것이다. 단리된 바이러스 폴리뉴클레오티드의 경우, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 단백질 및/또는 기타 바이러스 성분으로부터 적어도 부분적으로 정제되고, 이의 정상적인 주변 (milieu)으로부터 부가적으로 제거될 수 있다 (예를 들어, 정상적으로는 폴리뉴클레오티드 측면에 있는 뉴클레오티드 서열이 제거될 수 있다).
본원에서 사용되는 당해 서열 및 조절 서열은 당해 서열의 발현 또는 전사가 조절 서열의 영향 또는 조절 하에 놓이도록 공유결합적으로 연결된 경우 "작동적으로 연결된" 것으로 표현된다. 용어 "작동적으로 연결된"은 기능적 관계로의 폴리뉴클레오티드 요소의 배향에 관련된다. 작동적으로 연결된은 연결된 DNA 서열이 일반적으로 물리적으로 연속적이고, 두 단백질 코딩 영역을 접합시키는 것이 필요한 곳에서 연속적이고 동일한 리딩 프레임 내에 있는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 프로모터로부터 수킬로염기 떨어진 경우에도 일반적으로 기능하고 인트론 서열이 다양한 길이일 수 있으므로, 일부 폴리뉴클레오티드는 작동적으로 연결되었지만 연속적이지 않을 수 있다. 당해 서열이 기능성 단백질로 번역되기를 원한다면, 두 DNA 서열은, 5' 조절 서열 내의 프로모터의 유도로 당해 서열이 전사되고 두 DNA 서열 간의 연결의 성질이 (1) 프래임-시프트 돌연변이를 도입하지 않거나, (2) 당해 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 상응하는 RNA 전사물의 단백질로 번역되는 능력을 방해하지 않는다면, 작동적으로 연결된 것으로 표현된다. 따라서, 프로모터 영역은 프로모터 영역이 DNA 서열의 전사를 실행시켜 생성된 전사물이 원하는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있다면 당해 서열에 작동적으로 연결될 것이다. 용어 "작동적으로 연결된"은 최종 단백질 코딩 영역이 전체 단백질 코딩 영역을 통해 적절한 리딩 프레임을 유지하기 위해 프레임시프트 또는 스플라이스를 필요로 하는 작동성 연결을 포함한다는 것을 주지해야 한다 (예를 들어, 레트로바이러스 시스템에서 나타나는 바와 같이).
본원에서 사용된 용어 "항체"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 면역글로불린 분자 또는 면역글로불린 분자의 단편을 의미한다. 항체는 면역학 분야의 당업자에게 주지되어 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 손상되지 않은 항체 분자뿐만 아니라 항원 결합 능력을 보유하는 항체 분자의 단편 또한 의미한다. 이같은 단편 또한 당업자에게 주지되어 있고, 생체외 및 생체내 모두에서 적당하게 사용된다. 특히, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 임의 이소타입 (IgA, IgG, IgE, IgD, IgM)의 손상되지 않은 면역글로불린 분자뿐만 아니라 공지된 활성 (즉, 항원-결합) 단편 F(ab')2, Fab, Fv, scFv, Fd, VH및 VL또한 포함된다. 항체 단편에 대해, 예를 들어, ["Immunochemistry in Practice" (Johnstone 및 Thorpe, 편저, 1996; Blackwell Science), p.69] 참조. 용어 "항체"에는 단쇄 항체, CDR-그래프트 항체, 디아바디, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 Fab 발현 라이브러리가 또한 포함된다. 상기 용어에는 본 발명의 항체와 또다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 일부 ("융합 파트너")를 함유하는 융합 폴리펩티드가 또한 포함된다. 융합 파트너의 예로는 생물학적 반응 개질제, 림포카인, 사이토카인, 및 세포 표면 항원이 포함된다. "항체 활성"은 면역글로불린의 가변영역 내에 위치한 항원 결합 부위를 통해 다른 가능한 항원에 우선하여 특이적 항원에 결합하는 항체의 능력을 의미한다. 용어 "혈청학적으로 구별되는"은 다른 종으로부터 항원 차이에 의해 다른 종의 폴리펩티드, 단백질 또는 바이러스로부터 구분되는 특이적 항체에 의해 면역학적으로 동정될 수 있는 폴리펩티드, 단백질 또는 바이러스를 기술한다.
본원에서 사용된 용어 "함유하는" 및 이의 동족은 포함하는 의미로 사용된다; 즉, 용어 "포함하는" 및 이의 상응하는 동족과 동등하다.
단리된 SVII 바이러스
단리된 SVII는 바람직하게는 SVII로 감염된 개인으로부터 유래되는 혈장 또는 혈청으로부터 제조된다. SVII 바이러스는 침강, 특히 제조용 규모의 등밀도 구배 원심분리 및 면역단리가 포함되지만 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 혈청 또는 혈장으로부터 단리할 수 있다.
SVII 바이러스 입자는 당업계에 공지된 침강 기술 (예를 들어, 초원심분리)을 사용하여 단리할 수 있다. SVII 바이러스를 함유하는 물질을 처리하여 큰 세포잔해물 및 임의의 세포를 제거하고 (예를 들어, 여과 또는 중속/고속 원심분리에 의해), 이어서 초원심분리하여 SVII 바이러스를 침강시킨다. 바람직하게는, SVII를 함유하는 물질을 바이러스의 침강 전에, 예컨대 트리스-완충 염수로 희석시키거나, EDTA로 트리스-완충시킨다. 예를 들어, SVII 바이러스를 200,000 ×g에서 18 시간 동안의 원심분리에 의해 침강시킬 수 있다 (예를 들어, TEN 완충액으로 희석된 SVII-함유 혈청으로, SW41Ti 로터 내에서 200,000 ×g).
등밀도 구배 원심분리에 의한 SVII의 분석은 SVII가 수크로스 밀도 구배를 사용하여 측정시 밀도가 ~1.26 g/㎤이고, CsCl3구배 상에서는 밀도가 ~1.26 내지 1.28 g/㎤임을 가리킨다. 등밀도 구배 원심분리는 적절한 밀도 구배를 형성하는 당업계에 공지된 임의의 구배-형성 화합물, 바람직하게는 약 1.2 내지 1.35 g/㎤의 구배를 형성하는 구배 형성 화합물을 사용하여 수행할 수 있다; 수크로스 및 염화세슘 (CsCl)이 바람직한 구배 형성 화합물이다. SVII를 함유하는 혈장 또는 혈청을 수크로스 구배 상에 레이어링시키거나 적절한 원심분리 튜브 내의 CsCl에 균질 혼합물로 도입한 후, 평형까지 원심분리한다. 단리된 SVII 바이러스는 구배의 적절한 밀도 분획을 수집함으로써 회수할 수 있다.
면역단리 기술은 당업계에 주지된 임의의 적절한 분리 매질과 조합된 SVII-특이적 항체를 사용한다. 바람직한 분리 매질에는 고체 플라스틱 물질 (예를 들어, 패닝에서 사용하는 것), 크로마토그래피성 매질 (예를 들어, 면역친화 크로마토그래피) 및 마그네틱 입자 (예를 들어, 면역마그네틱 분리)가 포함된다. SVII 항체를 분리 매질과 콘쥬게이션시키고, 이를 SVII 바이러스를 함유하는 물질에 노출시킨다. 결합되지 않은 물질을 제거하고, 남아있는 결합되지 않은 물질을 면역분리 기판으로부터 세정한 후, 결합된 SVII를 전형적으로 pH가 조절되었거나 염농도가 높은 용출 완충액을 사용하여 용출시킨다.
대안적으로, 단리된 SVII 바이러스를 생체외 배양 방법에 의해 제조할 수 있다. 다양한 이같은 방법이 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 적절한 숙주세포, 바람직하게는 간 세포주를 SVII로 감염시키고, 감염된 세포를 배양하고, 배양매질로부터 또는 숙주 세포를 용균시킴으로써 SVII 바이러스 입자를 수집하는 것을 포함한다. 밀도 구배 분리 또는 면역단리 기술을 사용하여 바이러스를 추가적으로 정제할 수 있다.
단리된 SVII 폴리뉴클레오티드
단리된 SVII 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 바이러스 입자로부터의 바이러스 DNA의 직접적인 단리, SVII 라이프 사이클의 일부로서전사된 바이러스 RNA의 직접적인 단리, 혼성화 방법의 사용 (즉, 바이러스 DNA로부터 제조된 DNA 라이브러리, 또는 바이러스-함유 혈청 또는 혈장 내의 바이러스 DNA의 동정), 증폭 방법의 사용 (즉, 바이러스 DNA, 바이러스 DNA 함유 라이브러리, 또는 혈장 또는 혈청으로부터 단리된 DNA의 중합효소 연쇄 반응), 또는 직접적인 합성에 의해 제조할 수 있다. 도 1에 나타난 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여, 혼성화 및 증폭 방법에서 사용하기 위한 프로브 또는 프라이머를 고안하고 합성을 위한 서열을 선택할 수 있다. 바람직하게는, 선택된 프로브 또는 프라이머는 유일하다 (예를 들어, GenBank 또는 기타 서열 데이타베이스에 발견되지 않음).
단리된 게놈 폴리뉴클레오티드는 단리된 바이러스 입자의 추출에 의해 제조할 수 있다. 단리된 바이러스 입자를 당업계에 공지된 임의의 DNA 추출 기술 , 예컨대 구아니디늄 HCl 추출에 적용한 후, 임의로 추가적인 정제 및/또는 농축 기술 예컨대 아가로스 겔 정제, 페놀/클로로포름 추출 또는 염 존재하에서의 에탄올 침전에 적용할 수 있다.
DNA 라이브러리의 제조는 당업계에 주지되어 있다. 바이러스 입자 또는 바이러스-함유 혈장 또는 혈청으로부터 단리된 DNA를 당업계에서 통상적으로 사용되는 기술을 사용하여 편리한 라이브러리 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 가장 통상적으로, 람다 파지-기재 라이브러리 벡터를 사용하여 라이브러리를 제조하지만, 코스미드 및 플라스미드 라이브러리 또한 통상적으로 사용된다. 파지-기재 라이브러리는 대장균 숙주 세포의 '잔디'의 감염에 의해 플레이팅하고, 코스미드및 플라스미드 라이브러리는 전형적으로 플레이팅된 세포 내로 형질전환된다. 플레이팅 후, 라이브러리로부터의 DNA를 스크리닝 필터로 옮기고, SVII 폴리뉴클레오티드 프로브로 스크리닝한다. 바람직하게는 프로브는 전형적으로 방사성 뉴클레오티드 (예를 들어,32P)의 혼입에 의해 혼성화가 검출될 수 있도록 개질되지만, 다른 개질 프로브 (예를 들어, 디곡시게닌 또는 비오틴 라벨링됨)를 라벨링된 프로브에 결합하고 발색성 또는 검출가능 기질 상에 작용하는 개질 효소 (예를 들어, 알칼리성 포스파타제 또는 루시페라제)를 사용하여 검출할 수 있다. SVII 폴리뉴클레오티드 프로브에 혼성화하는 클론을, 당업계에 공지된 대로, 하나 이상의 "라운드"의 정제 (예를 들어, 점진적으로 더욱 정제된 클론에 대한 플레이팅 및 스크리닝 프로세스를 반복)에 의해 정제한다. SVII DNA는 스크리닝 절차에서 단리된 클론으로부터 DNA를 수확함으로써 제조될 수 있고, 임의로 제한 엔도뉴클리아제 절단에 의해 라이브러리 벡터 DNA로부터 추가로 단리될 수 있다. 대안적으로, 스크리닝에 의해 단리된 클론 DNA를 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 방법론을 사용하는 SVII 바이러스 DNA의 증폭을 위해 기질로서 적절하게 사용할 수 있다. PCR 프라이머를 SVII 바이러스 DNA로부터 고안할 수 있거나, 더욱 편리하게는, 당업자에게 명백한 바와 같이, 라이브러리 DNA가 삽입된 부위의 측면인 라이브러리 벡터 내의 DNA 서열과 혼성화하도록 고안할 수 있다.
SVII 바이러스 폴리뉴클레오티드는 SVII DNA를 함유하는 샘플로부터의 증폭에 의해 또한 단리될 수 있다. 증폭용 프라이머는 도 1에 나타난 서열을 기재로 고안될 수 있고, 바람직하게는 다른 바이러스로부터의 바이러스 DNA 또는 동물 또는 원핵생물로부터의 게놈 DNA가 아니라 SVII DNA가 증폭되도록 고안된다. 부가적으로, 당업계에 공지된 바와 같이, 프라이머 서열은 증폭을 실질적으로 저해하고 심지어 차단할 수도 있는 분자내 2차 구조를 최소화하도록 선택한다. 중합효소 연쇄 반응 증폭에 대한 프로토콜은, 다른 증폭 방법 예컨대 결찰효소 연쇄 반응에 대한 프로토콜과 같이, 당업계에 공지되어 있다. 증폭 후, SVII DNA를 크기 선별 (예를 들어, 겔 전기영동) 또는 화학적 추출 (예를 들어, 페놀/클로로포름 추출)에 의해 추가로 정제하고/정제하거나 염의 존재 하에서의 에탄올 침전에 의해 농축시킬 수 있다.
SVII 폴리뉴클레오티드는 또한 화학적으로 합성할 수 있지만, 사슬 길이가 증가하면 폴리뉴클레오티드 합성 수율이 떨어지므로, 합성된 SVII 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 길이가 약 50-60 개 뉴클레오티드 미만이다. 폴리뉴클레오티드의 합성 방법은 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 뉴클레오티드 (또는 개질 뉴클레오티드)를 합성 폴리뉴클레오티드의 성장 말단에 반복적으로 부가하는 것이 수반된다. 다양한 상이한 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 특정 방법 및 화학의 선택은 실행자에 달려있다.
SVII 폴리뉴클레오티드는 SVII 바이러스의 검출 (SVII 감염의 진단에 유용), SVII 폴리펩티드의 제조, SVII-기재 발현/형질도입 벡터의 구축, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 또는 안티센스 SVII 벡터의 구축을 위해서가 포함되는 다양한 용도를 갖는다.
안티센스 SVII 폴리뉴클레오티드는 SVII 게놈으로부터 제조된 mRNA 분자의 절편에 선택적으로 혼성화할 수 있는 SVII 폴리뉴클레오티드이다. 안티센스 SVII 폴리뉴클레오티드는 임의 크기의 SVII 폴리뉴클레오티드일 수 있지만, 바람직하게는 길이가 약 200 개 뉴클레오티드 미만이다. 안티센스 SVII 폴리뉴클레오티드는 SVII로 감염된 세포 내에서 SVII 단백질의 발현 및/또는 SVII 바이러스 복제를 차단한다. 따라서, SVII 안티센스 폴리뉴클레오티드는 SVII 감염의 치료 및/또는 SVII 감염 증상의 완화 (SVII 바이러스혈증의 축소 포함)에 사용될 수 있다.
SVII 안티센스 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는 경우, 뉴클레아제에 대한 내성을 증가시키기 위해 개질된 올리고뉴클레오티드로서 합성하는 것이 바람직하다. 개질된 올리고뉴클레오티드는 5' 및 3' 말단에 포스포로아미디트가 포함되도록 (Dagle 등, 1990, Nucl. Acids Res. 18:4751-4757), U.S. 특허 제 4,469,863 호에 개시된 에틸 또는 메틸 포스포네이트 유사체가 혼입되도록, 포스포로티오에이트 (Stein 등, 1988. Nucl. Acids Res. 16:3209-3221) 또는 2'-0-메틸리보뉴클레오티드 (Inove 등, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131)가 혼입되도록, 또는 혼성 RNA-DNA 유사체인 키메라 올리고뉴클레오티드로서 (Inove 등, 1987, FEBS Lett. 215:327) 합성될 수 있다.
SVII 안티센스 폴리뉴클레오티드는 "나출(naked) DNA"로서, 일반적으로 비경구 주사에 의해, 바람직하게는 정맥내 주사 또는 간문맥내로의 도입에 의해 SVII 바이러스로 감염된 개인에게 전달되어, 올리고뉴클레오티드의 천연발생 소비를 착취할 수 있다. 대안적으로, SVII 안티센스 폴리뉴클레오티드는 벡터, 예컨대 바이러스 벡터를 통해 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터는 숙주 세포, 바람직하게는 SVII로 감염된 인간 숙주 세포 내에서 작동성인 프로모터, 및 이에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하고, 상기 서열의 전사로 SVII 안티센스 폴리뉴클레오티드가 제조된다. 바람직한 바이러스 벡터로는 당업계에 공지된 아데노-관련 바이러스 벡터가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 바이러스 벡터에 의해 전달되는 SVII 안티센스 바이러스 폴리뉴클레오티드는 정맥내 투여되고, 바람직하게는 간문맥 내로 투여된다.
단리된 SVII 폴리펩티드
SVII 단백질은 SVII 바이러스로부터의 전체 ORF, SVII 바이러스로부터의 하나 이상의 융합 단백질, SVII 바이러스로부터의 단일 단백질, 또는 이들의 단편을 함유할 수 있다. 동일한 단백질 내에 2 이상의 SVII 단백질 단편을 함유하는 "모자이크 단백질" 또한 포함된다. 모자이크 단백질 내의 SVII 단백질 단편은 동일한 SVII 단백질 또는 상이한 SVII 단백질로부터 유래될 수 있다. SVII 단백질 단편이 동일한 SVII 단백질로부터 유래되는 경우, 정상적으로 단편들을 분리시키는 아미노산 서열은 실질적으로 결실되거나 관련되지 않은 "스페이서" 서열로 대체된다. 본 발명에 포함되는 또다른 모자이크 단백질은 2 이상의 상이한 SVII 바이러스로부터의 하나 이상의 에피토프의 상동성 버젼을 함유하는 "초에피토프 (superepitope)" 모자이크 단백질이다. 초에피토프 모자이크 단백질은, 예를 들어, SVII 바이러스 감염을 총칭적으로 검출하기 위한 스크리닝 분석에서 사용할 수 있다.
SVII 폴리펩티드는 단리된 바이러스 입자로부터의 정제, 재조합 제조 및 화학적 합성이 포함되는, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 다량의 바이러스 입자를 천연원으로부터 단리하는 것이 비교적 어렵기 때문에, 재조합 제조 및/또는 화학적 합성이 바람직한 제조 방법이다.
단백질의 제조합 제조는 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 "발현 벡터" 내로 클로닝하고, 이를 적절한 숙주 세포 내로 도입한다. 숙주 세포를 단백질의 발현에 적절한 조건 하에 배양하고, 재조합 단백질을 수집한다. 일반적으로 발현 구축물은 숙주 세포 내에서 작동가능한 프로모터/오퍼레이터 또는 프로모터/인핸서, 및 마커를 함유하는 세포의 선별을 가능하게 하는 적절한 마커를 함유하지만, 발현 구축물의 정확한 상세사항은, 당업자에게 명백하듯이, 원하는 숙주 세포 및 발현 구축물의 성질에 따라 변할 것이다. 바람직하게는, 프로모터/오퍼레이터 또는 프로모터/인핸서는 배양 조건에서의 변화에서 "조절가능"하여 SVII 단백질 (또는 SVII 단백질 융합 단백질)의 발현에 이를 것이다.
SVII 펩티드가 재조합 제조를 위해 "융합 단백질" 내로 혼입될 수 있음을 주지하여야 한다. 융합 단백질은 융합 파트너에 연결된 당해 단백질 (예를 들어, SVII 단백질)을 함유하고, 두 부분의 분리를 가능하게 하는 당해 단백질과 융합 파트너 사이의 특이적 절단 부위를 임의로 함유한다. 융합 파트너는 단백질의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 있을 수 있지만, 당해 단백질이 "삽입물"로서 코딩 영역의 서열 내에 혼입된 융합 단백질 또한 구현된다. SVII 단백질 삽입물을 함유하는 융합 단백질은 스크리닝 도구로서, 예를 들어, "파지 디스플레이" 시스템 내로 혼입된 경우, 특히 유용할 수 있다 (예를 들어, SVII 단백질 서열이 람다 파지 코트 단백질 내로 삽입된 경우).
유용한 융합 파트너로는 융합 단백질의 정제를 용이하게 하는 단백질 (예를 들어, 글루타티온-S-트랜스페라제, 올리고-히스티딘, 및 myc 종양유전자로부터 유래된 특정 서열), 융합 단백질의 가용성을 증가시키는 단백질 (예컨대 U.S. 특허 제 5,629,172 호에 개시된 대장균 DsbA), 또는 단백질을 기판에 결합시키는 "링커"를 생성시키는 단백질 (예를 들어, 말단 리신을 갖는 폴리글리신을 사용하여 SVII 단백질을 면역분석에서 사용하기 위한 기판에 연결시킬 수 있음)이 포함된다.
일반적으로, 발현 구축물은 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 재조합 DNA 발현 벡터 내로 적절한 제한 엔도뉴클리아제를 사용하여 삽입시킴으로써 생성된다. 제한 엔도뉴클리아제 부위는 천연 발생 부위이거나, 또는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발, PCR 또는 링커/어댑터의 폴리뉴클레오티드로의 결찰에 의해 도입된 합성 부위일 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 편리한 제한효소 부위를 혼입시키고/혼입시키거나 의도된 숙주 세포에 대한 코돈 사용을 최적화시키기 위해 고안된 합성 서열일 수 있다. 사용되는 특정 엔도뉴클리아제는 사용되는 모(母) 발현 벡터의 제한 엔도뉴클리아제 절단 패턴에 의해 지정될 것이다. 제한 부위의 선택은 코딩 서열을 컨트롤 서열과 적절히 배향시켜 적절한 프레임내 리딩 및 단백질의 발현을 달성하도록 이루어진다.
폴리뉴클레오티드는 임의의 적절한 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 발현 벡터는 플라스미드, 코스미드, 효모 인공 염색체 (YAC) 및 바이러스가 포함되지만 이에 한정되지 않는 다수의 형태에서 발견될 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 적어도 벡터가 증식되는 생물체 내에서, 그리고 종종 재조합 숙주 세포 내에서 또한 활성인 자가 복제 부위를 함유할 것이다. 발현 벡터는 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 마커 서열, 예컨대 양성 선별 마커, 예컨대 항생제 내성 유전자 (예를 들어, bla, tetR, neoR, 또는 hygR) 또는 영양요구체에 상보적인 유전자 (예를 들어, trp 또는 DHFR) 및/또는 음성 선별 마커 예컨대 헤르페스 심플렉스 바이러스 1 티미딘 키나제를 또한 전형적으로 함유할 것이다. 또한 발현 벡터는 전사 및 번역의 개시 및 종결에 필요한 서열 (예를 들어, 프로모터, 샤인-달가르노 (Shine-Dalgarno) 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 종결 부위)을 함유할 것이고, 전사를 조절하는 서열 (예를 들어, SV40 인핸서 또는 lac 리프레서)을 임의로 함유할 수 있고, 또한 프로세싱을 지시하는 서열, 예컨대 인트론 또는 폴리아데닐화 부위를 필요하다면 함유할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터의 전사 및 번역 조절 서열과 적절한 배향 및 관계로 발현 벡터 내로 삽입되어, 프로모터로부터의 전사 및 리보좀 결합 부위로부터의 번역을 허용하고, 이둘 모두는 단백질이 발현될 숙주 세포 내에서 기능성이어야 한다. 전사 조절 서열은 바람직하게는 유도성이다 (즉, 배양 조건의 변화에 의해 조절될 수 있음, 예컨대 대장균에 대한 lac 오페론 또는 포유동물 세포에 대한 메탈로티오네인 프로모터). 이같은 발현 벡터의 예는 U.S. 특허 제 5,304,493 호 (Belagaje 등)에 기술된 플라스미드이다. 참조문헌에 기술된 A-C-B 프로인슐린을 코딩하는 유전자를 제한효소 NdeI 및 BamHI으로 플라스미드 pBR182로부터 제거할 수 있다. 본 발명의 단백질을 코딩하는 유전자를 NdeI/BamHI 제한 단편 카세트 상에서 플라스미드 골격 내로 삽입할 수 있다.
미생물 숙주가 일반적으로 본 발명의 단백질의 재조합 발현에 바람직하고, 대장균 예컨대 W3110 (독립영양성, ATCC NO. 27325), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 및 기타 장내세균 예컨대 살모넬라 티피무리움 (Samonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 및 각종 슈도모나스 종이 포함되는 임의의 통상적으로 사용되는 미생물 숙주를 사용할 수 있다. 대안적으로, 효모 예컨대 사카로미세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe)가 포함되는 진핵생물 숙주 세포, 뿐만 아니라 고급 진핵생물 예컨대 비-효모 균 세포, 식물 세포, 곤충 세포 (예를 들어, Sf9) 및 포유동물 세포 (예를 들어, COS, CHO)를 사용할 수 있다.
완성된 발현 구축물을 재조합 숙주 세포 내로 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법, 예컨대 CaCl2형질감염, Ca2PO4형질감염, 바이러스 형질도입, 지질-매개 형질감염, 전기천공, 탄도 형질감염 등에 의해 도입한다. 발현 구축물의 도입 후, 재조합 숙주 세포를 일반적으로 발현 구축물의 존재를 선별하기에 적절한 조건하에 배양하거나 (예를 들어, bla를 함유하는 발현 구축물로 박테리아 숙주에 대해 앰피실린의 존재 하에 배양), 또는 대안적으로 임의의 적절한 수단 (예를 들어, SVII 단백질-특이적 항체를 사용하는 형광 활성화 세포 분류, FACS)에 의해 단백질의 발현을 선별할 수 있다.
선별 및 적절한 단리 절차 (예를 들어, 리스트리킹 또는 한계희석 클로닝) 후, 재조합 숙주 세포를 당업계에 공지된 임의의 적절한 기술을 사용하여 제조 규모 (이는 실행자의 필요에 따라, 미생물 숙주 세포에 대해 500 ㎖ 진탕 플라스크에서 수백 리터 발효기로, 또는 포유동물 숙주 세포에 대해 T25 플라스크에서 수백 리터 생물반응기로일 수 있다)로 배양한다. 발현 벡터 내의 프로모터/인핸서가 유도성인 경우, 단백질의 발현은 배양이 적절한 세포 밀도에 도달한 후 특정 구축물에 대해 적절하게 유도되거나 (예를 들어, 유도인자의 첨가에 의해, 또는 리프레서가 매질로부터 결핍되도록 함으로써), 또는 수확에 대해 적절한 밀도에 도달할 때까지 세포들을 성장시킨다. 본 발명의 재조합 단백질의 수확은, 당업자에게 명백하듯이, 재조합 숙주 세포의 정확한 성질, 발현 구축물, 및 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 따라 좌우될 것이다. 단백질이 분비되는 발현 구축물에 대해, 단백질은 일반적으로 배양 용기로부터 배지를 제거함으로써 회수되는 반면, 단백질이 세포내에 축적되는 발현 구축물은 세포를 회수 및 용균시켜 발현 단백질을 유리시키는 것이 필요하다.
고수준의 박테리아 발현 시스템에서 발현되는 단백질은 특징적으로 과립 또는 봉입체로 응집하며, 이는 고수준의 과발현 단백질을 함유한다. 단백질 응집물을 가용화시켜 원하는 단백질 생성물을, 예를 들어, 강한 변성 용액 예컨대 구아니디늄-HCl을 가능하게는 환원제 예컨대 디티오트레이톨 (DTT)과 함께 사용하여, 추가로 정제 및 단리한다. 변성제의 농도를 감소시키고 산화제를 첨가하는 것이 일반적으로 수반되는 "리폴딩" 반응 후, 가용화된 단백질은 이의 활성형으로 회수된다. 단백질의 리폴딩에 대해 일반적으로 적용가능한 것으로 여겨지는 프로토콜은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, U.S. 특허 제 4,511,502 호, 제 4,511,503 호 및 제 4,512,922 호에 개시되어 있다.
짧은 (예를 들어, 약 20 개 미만의 아미노산 잔기) SVII 단백질은 당업계에 공지된 방법인 합성 화학을 사용하여 또한 편리하게 제조할 수 있다. 긴 펩티드 길이에서는 수율로 감수되므로, 이러한 합성은 약 15 개 미만의 아미노산 잔기의 펩티드에 대해 바람직한 제조 방법이다.
SVII 폴리펩티드는 SVII 감염의 예방 및/또는 SVII 감염의 치료용 백신에서 사용될 수 있다. 임의의 SVII 폴리펩티드 또는 SVII 폴리펩티드의 조합물을 SVII 백신에서 사용할 수 있다. 에피토프들을 일반적으로 분리시키는 아미노산이 결실된, 단일 SVII 단백질로부터의 다중 에피토프를 함유하는 SVII 모자이크 폴리펩티드가 백신 제형물에서 사용하기에 바람직한 SVII 단백질이다. 백신에서 사용하기에 바람직한 또다른 바람직한 SVII 단백질은 단일 단백질 내로 융합된 다중 SVII 바이러스로부터의 상동성 에피토프들을 함유하는 초에피토프 단백질이다.
SVII 백신은 당업계에 공지된 방법에 따라 제형된다. 바람직하게는 백신은 비경구 투여용 액체 제형물이다. 백신은 당업계에 공지된 약학적 부형제예컨대 생리학적 및 약학적으로 허용가능한 염, 완충액, 방부제, 벌크화제, 삼투압제 등을 함유하여 제형될 수 있고, 이들은 USP (UNITED STATES PHARMACOPEIA, United States Pharmocopeial Convention, Inc., Rockville, MD, 1995)에서 확인할 수 있다.
SVII 단백질-기재 백신은 또한 보조제와 함께 제형될 수 있다. SVII 단백질-기재 백신에서 사용하기 위한 보조제로는 화학적 보조제 예컨대 수산화알루미늄 (특히 수산화알루미늄 젤), 칼륨 백반, 프로타민, 인산알루미늄 및 인산칼슘, 인터류킨 1.베타가 포함되는 사이토카인 보조제, 종양 괴사 인자 알파, 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 예컨대 U.S. 특허 제 5,980,911 호에 기술된 것들, 및 수중유 에멀션 예컨대 프로인드 완전 및 불완전 보조제가 포함된다.
SVII 백신은 바람직하게는 비경구적으로, 더욱 바람직하게는 경피 투여에 의해 전달된다. 바람직한 투여 경로로는 근육내 및 피하 주사뿐만 아니라 비경구 공기-구동 투여 (예를 들어, 무침 주사)가 포함된다. 백신은 단일 투여 또는 다중 투여로 제공될 수 있다. 다중 투여가 제공되는 경우, 바람직하게는 하루, 일주일 또는 한달에 적어도 한번으로 분리된다.
SVII 항체
SVII에 대한 항체는 본 발명에 의해 제공되는 단리된 바이러스 입자 및/또는 SVII 바이러스 단백질을 사용하여 제조할 수 있다. 단리된 폴리클로날 항체뿐만 아니라 모노클로날 항체를 제조할 수 있다.
SVII 단백질에 대한 단리된 폴리클로날 항체는 바람직하게는 면역원성 형태의 "SVII 면역원" (예를 들어, 단리된 SVII 바이러스 입자, SVII 단백질(들), 캐리어에 연결된 SVII 올리고펩티드, 또는 SVII 융합 단백질)을 동물, 바람직하게는 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트 또는 토끼), 염소, 소 또는 말에 주사함으로써 제조된다. 가장 통상적으로는, SVII 면역원의 제 1 주사는 오일/물 에멀션 완전 보조제 예컨대 프로인드 완전 보조제로서 이루어지고, 이는 주사된 면역원에 대한 면역 반응을 개선시키는 면역계의 비-특이적 활성화제를 함유한다. 나중의 주사는 전형적으로 불완전 보조제 (예를 들어, w/o 에멀션 비-특이적면역 활성화제 내에서)로 이루어진다. 대안적으로, SVII 면역원을 고체 기질에 흡착시켜 또는 단순 용액으로 도입할 수 있다. 혈청을 수확하여 특이적 항체의 존재에 대해 임의의 편리한 분석법, 가장 전형적으로는 단순 면역분석법 예컨대 표적으로서의 SVII 면역원 및 종-특이적 항-면역글로불린 2차 항체를 사용하는 ELISA (효소-연결 면역흡착 분석법)를 사용하여 테스트한다.
본 발명의 모노클로날 항체는 다수의 상이한 기술에 의해 제조할 수 있다. 하이브리도마 기술에 대해서는, 일반적으로 [Harrow & Lane (1988)], U.S. 특허 제 4,491,632 호, 제 4,472,500 호 및 제 4,444,887 호, 및 [Methods in Enzymology, 73B:3 (1981)]을 참조한다. 전통적인 모노클로날 항체 기술에는 상기 단락에 기술된 바와 같이 면역화된 동물, 전형적으로 마우스로부터 회수된 항체-생산 세포의 고정 및 클로닝이 수반된다. 세포는, 예를 들어, 비-생산 골수종과의 융합, 엡스테인 바르 바이러스 (Epstein Barr Virus)로의 감염, 또는 종양유전자 DNA로의 형질전환에 의해 고정시킬 수 있다. 처리된 세포를 클로닝 및 배양하고, 원하는 특이성의 항체를 생산하는 클론을 선별한다. 특이성 테스트는 다수의 기술에 의해, 예컨대 면역화 항원을 검출 시약으로 면역분석법에서 이용하여 배양 상층액에 대해 수행한다. 이어서 선별된 클론으로부터의 모노클로날 항체의 공급물을 큰 부피의 배양 상층액으로부터, 또는 클론이 주사된 적절히 제조된 숙주 세포의 복수액으로부터 정제할 수 있다.
모노클로날 항체를 수득하는 대안적인 방법에는 면역적격 세포 또는 바이러스 입자를 본 발명의 단백질과 접촉시키는 것이 수반된다. 이러한 문맥에서, "면역적격"은 세포 또는 입자가 추가적인 유전적 재배열 없이 항원에 특이적인 항체를 발현하거나 발현할 수 있고, 항원의 제시에 의해 세포 혼합물로부터 선별될 수 있음을 의미한다. 면역적격 진핵생물 세포는 면역화된 포유동물 도너로부터 수확할 수 있거나, 또는 이들은 면역화되지 않은 도너로부터 수확하여 면역원 및 면역자극성 성장 인자의 존재 하에 배양함으로써 생체외에서 예비자극시킬 수 있다. 원하는 특이성의 세포는 특이적 클론이 증식되도록 하지만 비-특이적 클론은 증식되도록 하지 않는 배양 조건 하에 면역원과 접촉시킴으로써 선별할 수 있다. 면역적격 파지는 이들의 표면에 면역글로불린 가변 영역 절편을 발현하는 것으로 추론된다. [Marks 등, New Engl. J. Med. 335:730, 1996]; 국제 특허 출원 94/13804 호, 92/01047 호, 90/02809 호; 및 [McGuinness 등, Nature Biotechnol. 14:1149, 1996] 참조. 원하는 특이성의 파지는, 예를 들어, 고체 상에 부착된 SVII 면역원에의 흡착에 의해 선별한 후, 대장균에서 증폭시킬 수 있다.
항체는 혈청, 세포 상층액, 용균물, 또는 복수액으로부터 전통적인 생화학분리 기술, 예컨대 황산암모늄 침전, 약한 음이온 교환 수지 예컨대 DEAE 상에서의 이온 교환 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 및 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 특이적 친화 기술, 예컨대 SVII 면역원을 친화 부분으로 사용하는 친화 크로마토그래피 또한 단독으로 또는 전통적인 생화학 분리 기술과 조합하여 사용하여 본 발명의 항체를 단리할 수 있다.
수득된 항체를 바람직하게는 SVII 바이러스 단백질과 반응하는 능력뿐만 아니라 당해 진단 샘플 내에 또한 존재하는 잠재적인 교차반응 물질과의 낮은 교차반응성에 대해 스크리닝 또는 정제한다. 원치않는 활성은, 필요하다면, SVII 감염에 대해 음성인 개인으로부터의 혈청으로부터의 항원 제제 또는 교차반응 물질을 사용하여 폴리클로날 항혈청으로부터 흡착시킬 수 있다.
특정 항체가 결합하는 에피토프는 단편을 제조하고 항체의 결합능을 테스트하여 지도화할 수 있다. 예를 들어, 면역원의 전체 서열을 커버하고 8개의 잔기를 오버래핑하는 12 개 아미노산의 연속적인 펩티드를 제조할 수 있다. 펩티드는 F-Moc 화학에 의해 SPOTS™ 키트 (Genosys)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 나일론 막 지지체 상에 제조될 수 있다. 이어서 제조된 막을 항체와 오버레이시키고, 세정하고, 알칼리성 포스파타제 또는 양고추냉이 페록시다제와 콘쥬게이션된 항-인간 IgG와 오버레이시킨다. 사용된 특정 효소 콘쥬게이트에 대한 적절한 기질을 첨가하여 테스트를 전개시킨다. 양성 염색은 항체에 의해 인식되는 항원 단편을 가리킨다. 이어서 단편을 사용하여 당해 에피토프를 인식하는 다른 항체를 수득할 수 있다. 동일한 에피토프를 인식하는 두 항체는 표준 면역분석법에서 결합에 대해 경쟁할 것이다.
본 발명의 항체는 SVII 바이러스의 검출 및/또는 동정에 사용될 수 있고, 또한 바이러스 입자 및/또는 바이러스 단백질의 단리에 유용할 수 있다.
SVII의 검출
본 발명의 폴리뉴클레오티드, 단백질 및 항체는 SVII 바이러스 감염의 검출 및 SVII 자체의 검출을 위한 방법 또는 키트에서 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 단백질 및/또는 항체를 사용하는 분석법은 원하는 분석법의 효용에 따라 다양한 포맷으로 고안될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 SVII 바이러스 게놈 DNA의 검출에 사용될 수 있다. 혈액 샘플 내에서의 SVII 게놈 DNA의 검출은 샘플이 SVII 바이러스로 오염되고 샘플의 원천이 SVII로 감염되었음을 가리킨다. 뉴클레오티드 검출을 위한 광범위한 상이한 분석법이 공지되어 있지만, 모든 이같은 분석법은 일반적으로 프라이머 또는 프로브가 샘플 내의 DNA에 혼성화되는 혼성화 단계를 필요로 한다.
단리된 SVII 게놈 서열의 한정된 부분을 기초로 사용하여, 약 8 개 이상의 뉴클레오티드의 올리고머를, 절단에 의해 또는 합성적으로 제조할 수 있고, 이는 SVII 게놈에 혼성화한다. SVII 폴리뉴클레오티드에 대한 천연 또는 유래 프로브는 혼성화에 의한 독특한 바이러스 서열의 검출을 가능하게 하는 길이이다. 일반적으로, 프로브는 길이가 최소 6 내지 8 개의 뉴클레오티드이고, 적어도 10 내지 12 개 뉴클레오티드의 서열이 바람직하고, 적어도 약 20 개 뉴클레오티드의 것이 가장 바람직하다. 분석법의 원하는 효용에 따라 (예를 들어, 모든 SVII 바이러스의 검출 대 단일 SVII 바이러스 유형의 검출), 프로브는 SVII 바이러스 사이에서 보존되는 SVII 게놈 서열의 영역 또는 SVII 바이러스 사이에서 매우 다른 SVII 게놈 서열의 영역에 기초할 수 있다. 이러한 프로브들은 자동화 올리고뉴클레오티드 합성 방법이 포함되는 통상적인 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. SVII 게놈의 임의의 독특한 부분의 상보물이 일반적으로 만족스러울 것이다. 일반적으로, 완전한 상보성이 프로브에서 바람직하지만, 단편의 길이가 증가되면 필요할 수 있다.
일반적으로, 분석될 테스트 샘플, 예컨대 혈액 또는 혈청을 이에 함유된 핵산이 추출되도록 처리한다. 핵산 샘플은 전형적으로 분석을 위해 고체 지지체 (예를 들어, 니트로셀룰로스) 상에 흡착되지만 (예비적인 크기 분리 예컨대 겔 전기영동과 함께 또는 없이), 용액 상 포맷 분석법 예컨대 U.S. 특허 제 4,868,105 호에 기술된 분석법 또한 사용할 수 있다.
분석법의 포맷 및 검출 시스템에 따라, 프로브는 직접적으로 라벨링되거나 또는 라벨의 결합에 의해 나중에 검출되도록 개질될 수 있다. 적절한 라벨 및 라벨을 프로브에 부착시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 닉(nick) 번역 또는 키나제화에 의한 방사성 라벨, 라벨이 나중에 결합되도록 하는 개질, 예컨대 비오틴화, 뿐만 아니라 프로브에 직접적으로 결합되거나 프로브의 개질을 통해 결합될 수 있는 형광 또는 화학발광 라벨이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
기본적인 핵산 혼성화 분석법에서, 단일-가닥 샘플 핵산을 적절한 스트린젠시의 혼성화 및 세정 조건 하에 프로브와 접촉시키고, 생성된 듀플렉스를 검출한다. 스트린젠시의 조절은 당업계에 공지되어 있고, 염 농도, 프로브 길이, 포름알데히드 농도, 온도 등과 같은 변수에 좌우된다. 바람직하게는, 혼성화 및 세정은 스트린젠트 조건 하에 수행된다. 결합된 프로브의 검출은 분석법에서 사용된 라벨/검출 시스템의 요구조건에 따라 수행된다. 예를 들어, 프로브가 방사성 라벨링된 경우, 프로브 결합은 방사능사진에 의해 검출된다. 프로브가 라벨이 나중에 결합되도록 개질된 경우 (예를 들어, 비오틴 또는 디곡시게닌의 프로브에의 공유 결합 또는 폴리A 꼬리의 프로브에의 부가에 의해), 라벨이 개질 결합 부분에 연결된다 (예를 들어, 검출가능한 효소 예컨대 알칼리성 포스파타제, 녹색 형광 단백질 또는 루시페라제에 연결된 스트렙타비딘, 또는 항-디곡시게닌 항체에 결합된 형광 또는 기타 라벨). 형광 프로브의 검출은 일반적으로 형광강도 측정기에 의해 달성되는 반면, 발광 라벨은 발광강도측정기 또는 사진 플레이트를 사용하여 검출할 수 있다. 분석법으로부터의 시그널을 증폭시키는 분지된 DNA 기술 및 기타 방법을 사용할 수 있다 (Urdea 등, 1989, Clim. Chem. 35(8):1571-1575; U.S. 특허 제 5,849,481 호).
기타 분석법은 샘플 내의 SVII 게놈 DNA의 증폭을 위한 프로브로서 프라이머를 사용한다. 중합효소 연쇄 반응, 결찰효소 연쇄 반응, Q-베타 복제효소, NDSBA (Compton, 1991, Nature 350(6313):91-92) 등과 같은 방법을 사용하여 샘플 내에 존재하는 모든 SVII 게놈 DNA 또는 이의 일부의 다수의 카피를 생성시킬 수 있다. 일반적으로 이같은 분석법에서의 검출은 전형적으로 겔 전기영동 및 존재하는 임의의 밴드의 가시화에 의한 예상 크기의 증폭 생성물의 검출에 의한 것이다.
SVII 바이러스는 또한 샘플 내의 바이러스 단백질의 존재를 검출하기 위한 본 발명의 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 광범위한 면역분석법 포맷을 SVII 바이러스 또는 바이러스 단백질의 검출을 위한 본 발명의 항체와 함께 사용할 수 있다.
대부분의 기본적인 형태에서, 샘플 내의 SVII 바이러스 또는 SVII 단백질을 검출하기 위한 면역분석법은 SVII 단백질(들)과 본 발명의 항체의 복합체를 검출한다. 하나 이상의 본 발명의 항체가 필요하지만, 바람직한 면역분석법 포맷은 2 이상의 본 발명의 항체를 필요로 한다.
많은 분석법 포맷은 샘플 또는 샘플로부터의 SVII 단백질이 고체 지지체 상에 고정되는 것을 필요로 한다. 연결은 당업계에 공지된 다양한 수단, 가장 통상적으로는 단백질 결합 표면 (예를 들어 폴리스티렌 플레이트 또는 니트로셀룰로스 또는 PVA 막)에의 결합 또는 기판에 결합하는 항체에의 결합에 의해 달성될 수 있다. 이러한 제 2 정렬은 "샌드위치" 면역분석법에서 사용되고, SVII 바이러스 단백질의 검출에 바람직하다.
샘플 (또는 샘플로부터의 SVII 단백질)을 기판 상에 고정시킨 후, 검출 항체를 샘플과 접촉시키고 검출 항체의 존재를 검출한다. 검출 항체는 염료 또는 유색 입자로의 항체의 개질로 인해 그 자체로 검출가능할 수 있거나, 검출 시약이 검출 항체에 결합되도록 개질될 수 있거나, 발색성 기질 상에 작용하는 효소로 개질될 수 있다.
검출 항체의 검출의 정확한 상세사항은 물론 사용되는 검출 시스템에 따라 좌우될 것이다. 직접적으로 검출가능한 검출 항체는, 예를 들어, 단순 점검, 광현미경 또는 비색계 (유색 입자 예컨대 라텍스 비드 또는 콜로이드성 금속으로 개질된 항체), 방사분석 (방사성 화합물로 개질된 항체) 또는 형광분석 또는 형광현미경 (형광 염료로 라벨링된 항체)에 의해 검출될 수 있다. 효소를 포함하도록 개질된 검출 항체는 분석물을 효소에 의한 프로세싱시 검출가능하게 되는 기질 (예를 들어, 효소에 의한 프로세싱 후 색이 변하거나 형광 또는 발광이 되는 기질)을 함유하는 용액 내에서 인큐베이션하고 임의의 프로세싱된 기질을 적절한 방법 (예를 들어, 발색 기질에 대해서는 비색계, 형광 기질에 대해서는 형광분석 등)을 사용하여 검출함으로써 전형적으로 검출된다. 다른 검출 항체는 "간접적"으로 검출되도록 개질될 수 있는데, 개질된 검출 항체에 결합하는 2차 시약이 결합된 검출 항체가 검출되도록 한다. 2차 시약은 검출가능하도록 개질된다 (염료 또는 유색 입자로 직접적으로, 또는 효소 및 검출가능한 기질로 간접적으로).
실시예 1: SVII 바이러스 DNA의 단리
SVII 게놈 DNA를 함유하는 DNA 클론을 Lititsyn 등 (1993, Science 259:964-951)이 기술한 표현 차이 분석 (RDA) 방법의 변형을 사용하여 단리하였다. 이러한 방법은 "드라이버" DNA 원을 사용하여 "테스터" DNA 원에 독특한 서열의 증폭을 강화시킨다.
H101로 명명된 원인불명의 간염 환자로부터의 혈청을 "테스터" DNA 원으로사용하였다. DNA를 프로테이나제 K 절단에 이어 페놀 및 클로로포름 추출에 의해 추출하였다. 100 ㎕ H101 혈청으로부터 단리된 DNA를 10 유닛의 Sau3A I으로 3 시간 동안 37 ℃에서 완전히 절단시켰다. 효소를 65 ℃에서 20 분 동안 인큐베이션시켜 불활성화시켰다.
절단된 DNA를 T4 DNA 결찰효소 완충액 (ATP 함유, New England Biolabs) 내의 1 nmol의 각각의 올리고와 혼합시키고, 혼합물을 2 분 동안 55 ℃에서 인큐베이션시켜 변성시키고, 점진적으로 혼합물을 10-15 ℃로 약 한시간에 걸쳐 냉각시켜 링커를 어닐링시킨 후, 800 유닛의 T4 결찰효소 (New England Biolabs)를 첨가하고 하룻밤 동안 12-16 ℃에서 인큐베이션함으로써, 링커 R-Bgl-24 (5'-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3') 및 R-Bgl-12 (5'-GATCTGCGGTGA-3')를 절단된 DNA에 결찰시켰다.
1 라운드의 PCR로는 정량가능한 양의 DNA가 수득될 수 없으므로, 테스트 앰플리콘을 네스트 PCR 반응에 의해 제조하였다. 결찰 생성물의 일부를 PCR 완충액, dNTP 및 추가적인 250 pmol의 R-Bgl-24 올리고와 혼합하고, 미네랄 오일 상에 오버레이시켰다. R-Bgl-24 올리고는 혼합물을 3 분 동안 72 ℃에서 인큐베이션함으로써 '방출된다'. 돌출물(overhangs)을 7.5 유닛의 AMPLITAQTaq DNA 중합효소 (PE Biosystems)를 첨가하고 추가로 5 분 동안 72 ℃에서 인큐베이션함으로써 충전시켰다. 테스터 앰플리콘은 혼합물을 95 ℃에서 1분 및 72 ℃에서의 3분을 20 사이클 진행시킨 후 72 ℃에서 10 분 동안 최종 확장 단계에 적용하여 제조하였다. 10 ㎕의 제 1 라운드 PCR 생성물 및 링커 R-Bgl-25 (5'-ACTCTCCAGCCTCTCACCGCAGATC-3')를 사용하여 제 2 라운드의 PCR 반응을 제 1 라운드와 동일한 조건 하에 15 사이클 진행시켰다. 이어서 생성물을 페놀/클로로포름으로 추출하고, 아세트산나트륨 및 이소프로판올로 침전시켰다. 침전물을 원심분리에 의해 수집하고, 상층액의 제거 후 공기 건조시키고, TE (트리스-EDTA)에 재현탁시켰다. R-Bgl-24 링커를 본질적으로 상기와 같이 Sau3A I 절단에 의해 제거한 후, 효소를 65 ℃에서 불활성화시켰다. 절단 생성물을 아세트산나트륨 및 에탄올을 사용하여 글리코겐의 존재 하에 침전시키고, 원심분리에 의해 수집하고, 상층액의 제거 후 공기 건조시키고, TE에 재현탁시켰다. 이어서 생성물을 1 % TAE에서 1 % 아가로스겔 상에서 분리하고, 150-1500 개의 뉴클레오티드에 상응하는 겔 분획을 절단하켰다. 절단된 테스터 앰플리콘을 QIAGENQiaex II 겔 추출 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다. 2 ㎍의 테스터 앰플리콘 DNA를 본질적으로 R-Bgl 링커에 대해 기술된 대로 J-Bgl-24 및 J-Bgl-12 링커 (각각 5'-ACCGACGTCGACTATCCATGAACA-3' 및 5'-GATCTGTTCATG-3')와 결찰시켰다.
드라이버 앰플리콘은, 제 2 Sau3A I 절단 후 새로운 링커를 첨가하지 않는 것을 제외하고는 본질적으로 테스터 앰플리콘에 대해 기술된 대로, 10 명의 건강한 혈액 제공자로부터 풀링된 혈청으로부터 추출된 DNA로부터 제조하였다.
드라이버 및 테스터 앰플리콘을 100:1 질량비로 혼합하고, 페놀/클로로포름으로 추출하고, 아세트산나트륨 및 에탄올로 침전시켰다. 펠렛을 원심분리에 의해 수집하고, 상층액의 제거 후 공기건조시키고, 4 ㎕의 EE ×3 완충액 (30 mM EPPS, pH 8.0, 3 mM EDTA)에 재현탁시켰다. 혼합물을 98 ℃에서 5분 동안 변성시키고, 1 ㎕의 5 M NaCl을 첨가하고, 추가로 98 ℃에서 2 분 동안 및 이어서 65 ℃에서 20 분 동안 인큐베이션함으로서 혼성화된 미네랄 오일에 오버레이시켰다.
테스트/드라이버 혼성화 혼합물을 이중 가닥 테스터 DNA만을 선택적으로 증폭시키는 조건 하에 증폭시켰다. 혼성화 혼합물의 일부를, 확장 사이클을 70 ℃에서 수행한 것을 제외하고는 본질적으로 J-Bgl 결찰 테스터 DNA의 증폭에 대해 수행한 대로, 10 사이클 증폭시켰다. 증폭 생성물을 수집하고, 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜로 추출한 후, 아세트산나트륨 및 이소프로판올로 침전시켰다. 침전물을 원심분리에 의해 수집하고, 상층액의 제거 후 공기 건조시키고, TE에 재현탁시켰다. 단일 가닥 DNA를 개조 콩 뉴클레아제 (mung bean nuclease: New England BioLabs)로 30 분 동안 30 ℃ 절단시켜 제거하고, 이어서 효소를 98 ℃에서 5 분 동안 열 불활성화시켰다. 절단 생성물을 추가적인 J-Bgl-24 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 15 사이클 재증폭시켰다.
증폭 생성물을 수집하고, 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜로 추출하고, 아세트산나트륨 및 이소프로판올로 침전시키고, 원심분리에 의해 수집하고, 70 % 에탄올로 세정하고, 상층액의 제거 후 공기건조시키고, TE에 재현탁시켜 제 1 차이 생성물 (First Difference Product: DP1)을 형성시켰다.
제 2 차이 생성물 (DP2)은 DP1을 Sau3A I으로 절단하고, 본질적으로 R-Bgl 링커로부터 J-Bgl 링커로의 스위치에 대해 기술된 대로 N-Bgl 링커 (N-Bgl-12 및 N-Bg1-24, 각각 5'-GATCTTCCCTCG-3' 및 5'-AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAA-3')로 J-Bgl 링커를 치환하고, N-링커 DP1을 1:800 질량비로 드라이버 앰플리콘과 혼성화시키고, 증폭 동안의 확장을 72 ℃에서 수행하는 것을 제외하고는 DP1에 대해 기술된 대로 증폭/절단/증폭시킴으로써 생성시켰다.
제 3 차이 생성물 (DP3)은 DP2를 Sau3A I으로 절단하고 J-Bgl 링커로 N-Bgl 링커를 치환한 후, 드라이버 앰플리콘과 4 ×105:1 드라이버:테스터 질량비로 혼성화시키고, DP1에 대해서와 같이 증폭/절단/증폭시킴으로써 생성시켰다.
3회 라운드의 공제성 혼성화 및 선택적인 증폭 후, 원래 테스터 앰플리콘의 "희미한" 패턴과 비교하여, 뚜렷한 밴드가 겔 전기영동 후 나타났다. DNA를 각각의 밴드로부터 QIAGEN겔 추출 키트 (Cat. No. 28704)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 단리한 후, TA 플라스미드 2.1 (InVitrogen Cat. K2000-01) 내로 결찰시켰다. 이어서 생성된 플라스미드의 라이브러리를 대장균 내로 형질전환시키고 플레이팅하였다. 각각의 라이브러리로부터의 30 콜로니를 선별하고, PE Biosciences PCR 서열분석 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 서열분석하였다. 서열을 GenBank 데이타베이스에 대해 DNA 및 단백질 수준에서 비교하였다. 데이타베이스와 상당한 상동성을 나타내지 않는 클론을 "공지되지 않음"으로 분류하였다. 각각의 "공지되지 않음"을 인간 게놈 DNA 내의 존재에 대해 PCR에 의해 각각의 "공지되지 않은" 서열로부터 고안된 프라이머를 사용하여 테스트하였다. 분석은 인간 게놈 DNA 내에 존재하는 임의의 서열에 대해 중지되었다. 공지되지 않은 한 371 뉴클레오티드 (최초로 "클론 33" 또는 "H101.c33"으로 명명)를 추가적인 특징화를 위해 선별하였다. H101.c33의 뉴클레오티드 서열은 도 1에 나타난다.
클론 33의 뉴클레오티드 서열을 모든 6 개의 가능한 리딩 프레임에서의 개념적인 번역에 의해 분석하였다. 한 큰 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 동정되었다: ORF1. ORF1의 아미노산 서열 또한 도 1에 나타난다.
클론 33의 비-인간 기원을 PCR로 확인하였다. 클론 33에 특이적인 PCR 프라이머를 사용한 인간 게놈 DNA의 증폭 후, 증폭 생성물이 검출되지 않았다. 클론 33의 비-인간 기원의 확인시, 센티널 바이러스 II 또는 SVII로 재명명하였다.
SVII의 존재를 환자 H101의 혈청에서 피크 ALT 수준에 상응하는 2 시점에서 SVII에 특이적인 PCR 프라이머를 사용하여 확인하였다.
실시예 2: SVII 바이러스 입자의 물리적 특징화
SVII 양성 혈청을 밀도 구배 초원심분리에 의해 분획화하여 SVII 바이러스 입자의 부유 밀도를 결정하였다.
마커로서의 HBV로 스파이크된 SVII 양성 혈청의 500 ㎕ 샘플을 연속적인 수크로스 밀도 구배 (20-65% 수크로스, w/w)의 표면에 레이어링시켰다. 샘플을 Beckman SW41Ti 로터 내에서 39,000 rpm으로 15 시간 동안 6 ℃에서 원심분리하였다. 분획 (500 ㎕)을 실리콘 배관에 부착된 유리 모세관을 통해 관의 바닥으로부터 펌핑에 의해 수집하였다.
각각의 분획을 SVII에 대해 네스트 PCR을 사용하여 분석하였다. 제 1 라운드는 프라이머쌍 33.1/33.2 (각각 5'-GGATTGACGACGACGACGAC-3' 및 5'-TGTCAAATACCCGCTCAGGA-3')를 사용하였고, 제 2 라운드는 프라이머쌍 33.3/33.4 (각각 5'-GACGACGACGACGACATTG-3' 및 5'-CAAATACCCGCTCAGGAAGG-3')를 사용하였다. 분획을 2회 라운드의 PCR을 사용하여 HBV에 대해서 또한 분석하였다: 제 1 라운드는 프라이머 HBV1 및 HBV4 (각각 5'-CATCTTCTTRTTGGTCTTCTGG-3' 및 5'-CAAGGCAGGATAGCCACATTGTG-3'), 및 프라이머 HBV3 (5'-CCTATGGGAGTGGGCCTCAG-3') 및 HBV4. SVII 바이러스는 1.26 g/㎤에 상응하는 분획에서 발견되었다.
SVII 부유 밀도를 또한 CsCl 구배에서 측정하였다. 마커로서의 HBV로 스파이크된, SVII 양성 혈청의 500 ㎕ 샘플을 적절한 원심분리 튜브 내의 균질성 CsCl 용액 (밀도 4.2 g/㎤ 및 굴절율 1.3645)과 혼합하였다. 샘플을 Beckman SW41Ti 로터 내에서 35,000 rpm으로 70 시간 동안 6 ℃에서 원심분리하였다. 튜브의 바닥 근처의 측벽을 천공시키고 500 ㎕ 분획을 수집함으로써 분획들을 수집하고, 수크로스 구배 실험에 대해 기술된 대로 분석하였다. SVII는 1.26-1.28 g/㎤에 상응하는 분획에서 발견되었다.
실시예 3: SVII 감염의 보급율
700 개 이상의 혈청 샘플을 PCR에 의해 SVII의 존재에 대해 분석하였다. 샘플을 (a) "초정상" 혈액 제공자 (정상 혈액값, 간염 바이러스 마커가 없음, ≥5 혈액제공으로 수혈-관련 이벤트에서 연루되지 않음); (b) "정상" 혈액 제공자 (혈액 제공 기준을 만족시킴); (c) "실격" 혈액 제공자 (건강하지만 현재 규칙 하에 혈액을 제공할 수 없는 개인); 및 (d) "간염" 환자, 급성 간염, 만성 HBV, 만성 HCV, 원인불명 (비A-E형) 및 중복감염 간염 (HBV 및 HCV 또는 HCV 및 HDV)으로 분리됨.
샘플을 혈청 샘플로부터 추출된 DNA의 네스트 PCR 증폭에 의해 프라이머쌍 33.1/33.2 및 33.3/33.4를 사용하여 분석하였다. SVII 게놈 DNA는 혈액 제공 스크리닝 기준을 만족시키는 개인으로부터의 혈청 샘플에서는 검출되지 않았고, 혈액 제공 스크리닝 기준을 만족시키지 않는 건강한 개인에서도 매우 낮은 보급율로만 확인되었다. 그러나, SVII는 급성 간염 환자로부터의 혈청에서는 높은 보급율로 확인되었고, 만성 간염 환자, 특히 만성 HCV 환자 및 1 초과 유형의 간염 바이러스로 중복감염된 환자에서 또한 확인되었다. 결과를 하기 표 1에 요약한다.
| 군 | 샘플 수 | 양성 |
| 초정상 | 100 | 0% |
| 정상 | 96 | 0% |
| 실격 | 172 | 2% |
| 간염급성만성 HBV만성 HCV원인불명만성 HBV/HCV/HDV | 3742479989479 | 18%63%1%29%23%4% |
Claims (13)
- 단리된 SVII 바이러스를 함유하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단리된 SVII 바이러스가 도 1에 나타난 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 조성물.
- 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 단리된 폴리뉴클레오티드:도 1에 나타난 뉴클레오티드 서열과 선택적으로 혼성화할 수 있는 단리된 폴리뉴클레오티드,도 1에 나타난 뉴클레오티드 서열과 선택적으로 혼성화할 수 있는 단리된 폴리뉴클레오티드의 상보물,SVII 단백질 또는 SVII 단백질의 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및SVII 단백질 또는 SVII 단백질의 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드의 상보물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드가 안티센스 폴리뉴클레오티드인 단리된 폴리뉴클레오티드.
- 단리된 SVII 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 조성물.
- 단리된 SVII 단백질 또는 이의 단편; 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 백신 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 보조제를 추가로 함유하는 백신 조성물.
- SVII 단백질 또는 SVII 단백질의 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.
- 단리된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터로, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드의 전사로 SVII 안티센스 폴리뉴클레오티드가 제조되는 발현 벡터.
- SVII 바이러스 또는 이의 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 폴리클로날 항혈청.
- SVII 바이러스 또는 이의 단백질에 결합하는 모노클로날 항체.
- 샘플을 SVII 바이러스 또는 이의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키고, 상기 항체와 SVII 바이러스 또는 이의 단백질의 복합체를 검출하는 것을포함하는 SVII 바이러스의 검출 방법.
- 샘플을 SVII 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하는 프로브 폴리뉴클레오티드와 접촉시키고, 상기 프로브와 SVII 폴리뉴클레오티드의 혼성화를 검출하는 것을 포함하는 SVII 바이러스의 검출 방법.
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