JP2013049662A - 微小胞膜タンパク質及びその応用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】細胞アポトーシス感受性タンパク質(CSE1L)に対する抗体、又はリン酸化CSE1Lに対する抗体。抗体が、リン酸化CSE1Lに対する抗体。(a)被験体からテスト生体液サンプルを得る工程;(b)1以上の健常者からコントロールサンプルを得る工程;(c)テスト生体液サンプル及びコントロールサンプルをin vitroで抗体と接触させる工程;(d)テスト生体液サンプル中の微小胞のCSE1L又はリン酸化CSE1Lの量を測定する工程;及び(e)コントロールサンプル中の微小胞のCSE1L又はリン酸化CSE1Lの量を測定する工程;を含む被験体の癌を診断するin vitroの方法。
【選択図】なし
Description
SEQ ID NO: 1
1 gtcgcgccat tttgccgggg tttgaatgtg aggcggagcg gcggcaggag cggatagtgc
61 cagctacggt ccgcggctgg ggttccctcc tccgtttctg tatccccacg agatcctata
121 gcaatggaac tcagcgatgc aaatctgcaa acactaacag aatatttaaa gaaaacactt
181 gatcctgatc ctgccatccg acgtccagct gagaaatttc ttgaatctgt tgaaggaaat
241 cagaattatc cactgttgct tttgacatta ctggagaagt cccaggataa tgttatcaaa
301 gtatgtgctt cagtaacatt caaaaactat attaaaagga actggagaat tgttgaagat
361 gaaccaaaca aaatttgtga agccgatcga gtggccatta aagccaacat agtgcacttg
421 atgcttagca gcccagagca aattcagaag cagttaagtg atgcaattag cattattggc
481 agagaagatt ttccacagaa atggcctgac ttgctgacag aaatggtgaa tcgctttcag
541 agtggagatt tccatgttat taatggagtc ctccgtacag cacattcatt atttaaaaga
601 taccgtcatg aatttaagtc aaacgagtta tggactgaaa ttaagcttgt tctggatgcc
661 tttgctttgc ctttgactaa tctttttaag gccactattg aactctgcag tacccatgca
721 aatgatgcct ctgccctgag gattctgttt tcttccctga tcctgatctc aaaattgttc
781 tatagtttaa actttcagga tctccctgaa ttttgggaag gtaatatgga aacttggatg
841 aataatttcc atactctctt aacattggat aataagcttt tacaaactga tgatgaagag
901 gaagccggct tattggagct cttaaaatcc cagatttgtg ataatgccgc actctatgca
961 caaaagtacg atgaagaatt ccagcgatac ctgcctcgtt ttgttacagc catctggaat
1021 ttactagtta caacgggtca agaggttaaa tatgatttgt tggtaagtaa tgcaattcaa
1081 tttctggctt cagtttgtga gagacctcat tataagaatc tatttgagga ccagaacacg
1141 ctgacaagta tctgtgaaaa ggttattgtg cctaacatgg aatttagagc tgctgatgaa
1201 gaagcatttg aagataattc tgaggagtac ataaggagag atttggaagg atctgatatt
1261 gatactagac gcagggctgc ttgtgatctg gtacgaggat tatgcaagtt ttttgaggga
1321 cctgtgacag gaatcttctc tggttatgtt aattccatgc tgcaggaata cgcaaaaaat
1381 ccatctgtca actggaaaca caaagatgca gccatctacc tagtgacatc tttggcatca
1441 aaagcccaaa cacagaagca tggaattaca caagcaaatg aacttgtaaa cctaactgag
1501 ttctttgtga atcacatcct ccctgattta aaatcagcta atgtgaatga atttcctgtc
1561 cttaaagctg acggtatcaa atatattatg atttttagaa atcaagtgcc aaaagaacat
1621 cttttagtct cgattcctct cttgattaat catcttcaag ctggaagtat tgttgttcat
1681 acttacgcag ctcatgctct tgaacggctc tttactatgc gagggcctaa caatgccact
1741 ctctttacag ctgcagaaat cgcaccgttt gttgagattc tgctaacaaa ccttttcaaa
1801 gctctcacac ttcctggctc ttcagaaaat gaatatatta tgaaagctat catgagaagt
1861 ttttctctcc tacaagaagc cataatcccc tacatcccta ctctcatcac tcagcttaca
1921 cagaagctat tagctgttag taagaaccca agcaaacctc actttaatca ctacatgttt
1981 gaagcaatat gtttatccat aagaataact tgcaaagcta accctgctgc tgttgtaaat
2041 tttgaggagg ctttgttttt ggtgtttact gaaatcttac aaaatgatgt gcaagaattt
2101 attccatacg tctttcaagt gatgtctttg cttctggaaa cacacaaaaa tgacatcccg
2161 tcttcctata tggccttatt tcctcatctc cttcagccag tgctttggga aagaacagga
2221 aatattcctg ctctagtgag gcttcttcaa gcattcttag aacgcggttc aaacacaata
2281 gcaagtgctg cagctgacaa aattcctggg ttactaggtg tctttcagaa gctgattgca
2341 tccaaagcaa atgaccacca aggtttttat cttctaaaca gtataataga gcacatgcct
2401 cctgaatcag ttgaccaata taggaaacaa atcttcattc tgctattcca gagacttcag
2461 aattccaaaa caaccaagtt tatcaagagt tttttagtct ttattaattt gtattgcata
2521 aaatatgggg cactagcact acaagaaata tttgatggta tacaaccaaa aatgtttgga
2581 atggttttgg aaaaaattat tattcctgaa attcagaagg tatctggaaa tgtagagaaa
2641 aagatctgtg cggttggcat aaccaactta ctaacagaat gtcccccaat gatggacact
2701 gagtatacca aactgtggac tccattatta cagtctttga ttggtctttt tgagttaccc
2761 gaagatgata ccattcctga tgaggaacat tttattgaca tagaagatac accaggatat
2821 cagactgcct tctcacagtt ggcatttgct gggaaaaaag agcatgatcc tgtaggtcaa
2881 atggtgaata accccaaaat tcacctggca cagtcacttc acatgttgtc taccgcctgt
2941 ccaggaaggg ttccatcaat ggtgagcacc agcctgaatg cagaagcgct ccagtatctc
3001 caagggtacc ttcaggcagc cagtgtgaca ctgctttaaa ctgcattttt ctaatgggct
3061 aaacccagat ggtttcctag gaaatcacag gcttctgagc acagctgcat taaaacaaag
3121 gaagttttcc ttttgaactt gtcacga
SEQ ID NO: 2
MELSDANLQTLTEYLKKTLDPDPAIRRPAEKFLESVEGNQNYPL
LLLTLLEKSQDNVIKVCASVTFKNYIKRNWRIVEDEPNKICEADRVAIKANIVHLMLS
SPEQIQKQLSDAISIIGREDFPQKWPDLLTEMVNRFQSGDFHVINGVLRTAHSLFKRY
RHEFKSNELWTEIKLVLDAFALPLTNLFKATIELCSTHANDASALRILFSSLILISKL
FYSLNFQDLPEFWEGNMETWMNNFHTLLTLDNKLLQTDDEEEAGLLELLKSQICDNAA
LYAQKYDEEFQRYLPRFVTAIWNLLVTTGQEVKYDLLVSNAIQFLASVCERPHYKNLF
EDQNTLTSICEKVIVPNMEFRAADEEAFEDNSEEYIRRDLEGSDIDTRRRAACDLVRG
LCKFFEGPVTGIFSGYVNSMLQEYAKNPSVNWKHKDAAIYLVTSLASKAQTQKHGITQ
ANELVNLTEFFVNHILPDLKSANVNEFPVLKADGIKYIMIFRNQVPKEHLLVSIPLLI
NHLQAGSIVVHTYAAHALERLFTMRGPNNATLFTAAEIAPFVEILLTNLFKALTLPGS
SENEYIMKAIMRSFSLLQEAIIPYIPTLITQLTQKLLAVSKNPSKPHFNHYMFEAICL
SIRITCKANPAAVVNFEEALFLVFTEILQNDVQEFIPYVFQVMSLLLETHKNDIPSSY
MALFPHLLQPVLWERTGNIPALVRLLQAFLERGSNTIASAAADKIPGLLGVFQKLIAS
KANDHQGFYLLNSIIEHMPPESVDQYRKQIFILLFQRLQNSKTTKFIKSFLVFINLYC
IKYGALALQEIFDGIQPKMFGMVLEKIIIPEIQKVSGNVEKKICAVGITNLLTECPPM
MDTEYTKLWTPLLQSLIGLFELPEDDTIPDEEHFIDIEDTPGYQTAFSQLAFAGKKEH
DPVGQMVNNPKIHLAQSLHMLSTACPGRVPSMVSTSLNAEALQYLQGYLQAASVTLL
LTpEYpLKKTLDPDPAC(Tpはリン酸スレオニンを表し、Ypはホスホチロシンを表す)
実験で用いられた抗体は、抗−p21/ras(EP1125Y)(Epitomics,Burlingame,CA,USA);抗−CSE1L(3D8)及び抗−MAPK1/MAPK3(リン酸 T202/204,G15−B)(Abnova,Taipei,Taiwan);抗−CSE1L(24)、抗−ホスホチロシン(PY20)、及び抗−ホスホセリン/スレオニン(22A/pSer/Thr)(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA);抗−β−チューブリン(D66)(Sigma,St.Louis,MO,USA);抗−β−アクチン(Ab−5)及び抗−GFP(Ab−1)(Lab Vision,Fremont,CA,USA);抗−MMP−2(H−76)及び抗−ホスホスレオニン(H2)(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA);ヤギ抗−マウスIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA,USA);Alexa Fluor 488(又は568)(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)に結合しているヤギ抗−マウス(又は抗−ウサギ)IgG2次抗体。
ネオマイシン選択マーカーを有するv−H−Ras(pZIP−v−H−ras)発現ベクターは、Dr.Channing J Derから提供を受けた。ネオマイシン選択マーカーを有する哺乳類のCSE1L発現ベクター(pcDNA−CSE1L)は、CSE1L cDNA(Apa I、pGEM−CSE1L vectorのI断片ではない。)を、pcDNA3.1ベクターのApaI及びIでないサイトに挿入することで作成される。CSE1L shRNA プラスミド(sc−29909−SH)は、CSE1Lの発現をノックダウンするように設計されている。また、いかなる細胞情報の特異的分解を導かない暗号化したshRNA配列をエンコードする、コントロールshRNAプラスミド(sc−108060)は、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz)に注文した。CSE1L shRNAプラスミド及びコントロールshRNAプラスミドは、ピューロマイシン選択マーカーを有する。
B16F10メラノーマ細胞は、ATCC(Manassas,VA,USA)から入手した。細胞は、熱不活性化ウシ胎仔血清を10%、ペニシリンを100units/ml、ストレプトマイシンを100mg/ml、及びグルタミン酸塩を2mmol/L添加したダルベッコ改変イーグル培地で、5%CO2の加湿条件下、37℃で培養した。B16−dEV、B16−Ras、B16−CSE1L、及びB16−Ras/抗−CSE1L細胞を得るため、リオフェクチンプラス試薬(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)の手順書にしたがい、B16F10細胞に、コントロールpZIP−NeoSV(X)1エンプティベクター+コントロールshRNAプラスミド、pZIP−v−H−ras+コントロールshRNAプラスミド、pcDNA−CSE1L+コントロールshRNAプラスミド、及びpZIP−v−H−ras+CSE1L shRNAプラスミドが導入された。形質転換された細胞は、1mg/mlのG418で3週間、次いで、1μg/mlのピューロマイシンで3週間処理することで選択された。多剤抵抗性を有するコロニー(>50)は、集められ集団培養された。形質転換した細胞は、200μg/mlのG418及び0.2μg/mlのピューロマイシンを含む培地中に保管された。実験には、G418及びピューロマイシンを含まない培地で培養された細胞を用いた。
細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄され、氷冷した放射性免疫沈降法(RIPA)バッファー[25mM Tris–HCl(pH7.2)、0.1% SDS、0.1% TritonX−100、1% デオキシコール酸ナトリウム、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM オルトバナジウム酸ナトリウム、1mM フッ化フェニルメチルスルホニル、10μg/ml アプロチニン、5μg/ml ロイペプチン、25mM β−グリセロリン酸エステル、5mM オルトバナジウム酸ナトリウム、及び5mM フッ化ナトリウム]に溶解した。タンパク質濃度は、BCAタンパク質分析キット(Pierce,Rockford,IL,USA)を用いて測定した。タンパク質サンプルは、各々50μgを、SDS−ポリアクリルアミドゲル上に載せた。タンパク質は、ニトロセルロース膜(Amersham Pharmacia,Buckinghamshire,UK)に転写された。膜は、ブロッキングバッファー[1% ウシ血清アルブミン(BSA)、50mM Tris–HCl(pH7.6)、150mM NaCl、及び0.1% Tween−20]を用い、室温で1時間ブロックされた。ブロットは、1次抗体と4℃で一晩インキュベートされ、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合している2次抗体と1時間インキュベートされた。タンパク質レベルは、Forte Western HRP Substrate(Millipore Corp.,Billerica,MA,USA)を用い、手順書に従って測定した。
ビオチン結合抗体で免疫ブロットするため、ビオチン結合抗体は、Biotin Labeling Kit−NH2 kit(Dojindo Laboratories,Kumamoto,Japan)の手順書に従って、抗−CSE1L抗体をビオチニル化することによって調整された。次いで、免疫ブロットは、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ストレプトアビジンと反応し、タンパク質量はForte Western HRP Substrateによって検出される。
ガラスカバースライド(12×12mm)上で4日間成長した細胞は、1000rpmで10分間、サイトスピンすることでスライド上に密着した。細胞は、PBSで洗浄され、4%パラホルムアルデヒドで固定され、メタノールで透過処理され、0.1%BSAを含むPBSでブロックされた。サンプルは、一次抗体で1時間インキュベートされた。サンプル、次いでPBSで3回洗浄され、Alexa Fluor 488(又は568)に結合している2次抗体とインキュベートされ、倒立蛍光顕微鏡で測定された。各実施条件で、表面に微小胞を示した細胞が確認された。300の細胞がそれぞれの実施で観察され、3つの独立した実施のデータが、ブロットされた。標準偏差棒が示される。
同じ数の細胞(1×104細胞/dish)が、100mmの培養皿に播種された。培地は、3日毎に新しいものに交換された。細胞数は、細胞播種後、24時間毎に、トリパンブルー色素排除分析法(trypan blue exclusion assay)によりカウントされた。カウントの際には、3つのプレートの細胞数がカウントされ、それぞれのプレートは1回のみカウントした。
細胞は、対数増殖期中期から後期に入ったあたりの状態(subconfluence)まで増殖され、PBSで洗浄され、ウシ胎仔血清を含まない培地に変更された。48時間のインキュベーション後、馴化培地は回収され、細胞数がカウントされた。浮遊している可能性のある細胞を除く為、培地は10,000rpmで10分間遠心分離され、その後、上澄みが回収された。
微小胞は、サイズ排除クロマトグラフィー及び超遠心分離法により、馴化培地又は血清から調整された。馴化培地又は血清は、PBSで平衡化されたセファロース2Bカラム(Amersham Biosciences,NJ,USA)に入れられた。フラクション(1ml)が集められ、タンパク質量は280nmの吸光度を測定することでモニターした。>50ミリオンkDaのタンパク質を含む空隙容量ピーク材料は、4℃、105,000gで1時間遠心分離された。ペレットは微小胞を含み、50μlのPBSに再縣濁された。
プラスチック皿で成長した細胞は、PBSで洗浄され、免疫沈降溶解バッファー[10mM Tris−HCl(pH7.4)、10mM EDTA、0.4% デオキシコール酸、0.5% TritonX−100、1mM フッ化フェニルメチルスルホニル、10μg/ml アプロチニン、5μg/ml ロイペプチン、25mM β−グリセロリン酸エステル、5mM オルトバナジウム酸ナトリウム、5mM フッ化ナトリウム]で、4°C、20分間インキュベートした。細胞は掻き集められ、ピペッティングにより破壊された。細胞溶解物は、12,000g、4℃、10分間の遠心分離で、不溶性物質が除去され、タンパク質濃度は、BCAタンパク質分析kit(Pierce)を用いて測定した。細胞溶解物(500μg)は、免疫沈降バッファー[50mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl]中の一次抗体と、4°C、3時間、インキュベーとされ、次いで、タンパク質A/Gスラリーに、アガロースビーズ(Santa Cruz)が添加され、更に、2時間インキュベーとされた。免疫沈降物は、溶解バッファーで3回洗浄され、次いで、SDS−PAGEに置かれ、抗体で免疫ブロットされた。マウス抗−GFP抗体が、コントロール反応として用いられた。血清サンプルの免疫沈降のため、血清は、アガロース結合抗−リン酸スレオニン抗体(H2)(Santa Cruz)を含むPBSバッファーで、4℃で、緩やかな旋回をかけながら一晩インキュベーとされた。免疫沈降物は、免疫沈降溶解バッファーで3回洗浄され、SDS−PAGEにかけられ、次いで、抗−CSE1L抗体と免疫ブロットされた。コントロール免疫沈降は、アガロース結合通常マウスIgG(Santa Cruz)を用いて実施された。
GST−CSE1L融合タンパク質は、ENDEXT技術手順書(CellFree Sciences,Yokohama,Japan)に記載されている方法に従って、小麦胚芽無細胞タンパク質合成システムを用いて生成した。簡単に説明すると、pcDNA−CSE1Lベクター中のCSE1Lのオープン・リーディング・フレームが制限酵素で切断され、小麦胚芽発現ベクターpPEU−E01−MCS(CellFree Sciences)にサブクローンされた。CSE1L mRNAの転写は、2μgのサブクローンプラスミドを、転写プレミックス溶液(CellFree Sciences)を含むチューブに加えることで行われた。混合液は、転写反応のため、37℃で6時間インキュベートされた。翻訳反応のため、10μlのmRNA混合物が、10μlの小麦胚芽抽出溶液(WEPRO 3240,CellFree Sciences)に加えられた。翻訳混合物(20μl)は、下層に翻訳混合物を含む2層を形成するために、SUB−AMIX(CellFree Sciences)を含むウェルの底に移された。26℃で16時間のインキュベーション後、混合物は、GST−CSE1L融合タンパク質の精製のために用いられた。GST−CSE1L融合タンパク質は、グルタチオン−セファロース4Bビーズ及びBulk GST Purification Modules(Amersham Pharmacia)を用いて精製を行った。精製されたGST−CSE1L融合タンパク質は、トロンビンで開裂され、GSTは、Amicon Ultra−4 Centrifugal Filter Units (Millipore,Billerica,MA,USA)を用いて除去された。
パラフィンブロック中の癌組織から取り出された組織及び非癌組織から取り出された組織が、縦方向に切断され、組織マイクロアレイを作成するため、BiosynMatric Handmade Kit(Formosa Transcrip,Kaohsiung,Taiwan)のマニュアル方法を用いて、新しいパラフィンブロック中に配置された。現発癌の形態学的な代表領域の存在を確認するため、組織セクション(4−μm)が、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された。免疫組織化学が、抗−CSE1L抗体(clone 3D8)又は抗−MAPK1/MAPK3(リン酸T202/204)抗体の50倍希釈物を用いて実施された。免疫組織化学検出は、Histostain kit(Zymed,San Francisco,CA,USA)の標識ストレプトアビジン−ビオチン法を用いて、手順書とおりに実施した。切片は、ジアミノベンジジンと反応させられ、蒸留水で洗浄され、マイヤーヘマトキシリンで対比染色された。
マトリゲル基底膜浸潤性分析は、マトリゲル(BD Biosciences)及び孔サイズが8μmのポリビニルピロリドン−フリー ポリカーボネート フィルター(polyvinylpyrrolidone−free polycarbonate filters)(Costar,Cambridge,MA,USA)を用いて行われた。フィルターは、4℃で一晩、37℃で更に2時間、マトリゲル(1:10 in DMEM)でコートされた。フィルターは、DMEMで3回洗浄され、ミクロ走行性チャンバー(microchemotaxis chambers)に置かれた。細胞は、0.1%トリプシン−EDTAで洗浄され、FBSを10%含むDMEM培地中に再縣濁され、次いで、血清−フリーDMEM培地で洗浄された。細胞(3×105)は、DMEM(200μl)に縣濁され、走行性チャンバーの上方コンパートメントに置かれた。FBSを20%含む培地(300μl)が、化学誘引物質源として走行性チャンバーの下方コンパートメントに置かれた。培養インキュベーターで12時間のインキュベート後、フィルターの上面の細胞は、綿棒で完全に拭き取られた。フィルターの下面の細胞は、メタノールで固定され、Liu’s A及び Liu’s B試薬で染色され、そして、顕微鏡でカウントされた。ミクロ走行性チャンバーに浸入した細胞も、同様にカウントされた。分析は、3回繰り返され、各々の分析は、夫々の細胞ライン用フィルターの複製を4回繰り返して行われた。各複製のため、選択されたフィールドから任意の10の腫瘍細胞が決められ、カウントが平均化された。
細胞は、PBSで洗浄され、Hepesバッファー(pH6.8)中、15分間、0.5%グルタルアルデヒド及び2%パラホルムアルデヒド混合物で固定され、次いで、2%パラホルムアルデヒドを含むHepesバッファー(pH6.8)中、4℃で14日間固定された。サンプルは、80%エタノールで脱水処理され、Lowicryl HM20樹脂(Polysciences,Tokyo,Japan)の濃縮物に浸透した。Lowicryl HM20樹脂のポリマー化は、24時間、UV照射(波長ピーク360nm)することで行った。極薄切片は、切断及び2%ネオプレン(Ohken,Tokyo,Japan)でコートされたニッケル格子上に固定された。100%エタノールに3分間浸漬後、サンプルは、65℃の0.01M EDTA(pH7.2)に24時間浸漬した。サンプルは、PBSで3回(5分/洗浄)洗浄され、1%BSAを含むPBS及び0.1%Tween−20で15分間、ブロックされた。サンプルは、PBSに希釈された一次抗体(1:30)の混合物とインキュベートされ、PBSで3回(5分/洗浄)洗浄され、18−nm(又は12−nm)の金標識2次抗体と反応し、次いで、PBSで3回(5分/洗浄)洗浄した。サンプルは、酢酸ウラニルで染色され、透過型電子顕微鏡(日立社製 H−7000、Tokyo、Japan)で観察された。
細胞数が標準化された馴化培地から採取された微小胞は、1mg/mlのゼラチンを含む10%SDS−PAGEで分離された。ゲルは、SDSを除去するため、2.5%Triton X−100で30分間洗浄され、次いで、50mM Tris−HCl(pH7.6)、200mM NaCl及び10mM CaCl2を含むバッファーで、37℃で24時間、インキュベートした。ゲルは、クマシーブルー R−250(0.125% Comassie blue R−250、50% メタノール、10% 酢酸)で30分間染色され、脱色液(20% メタノール、10% 酢酸、70% ddH2O)で、鮮明なバンドが視認できるまで脱色した。
6〜7週(N=18)及び14〜15週(N=26)のオスのC57BL/6マウス(National Laboratory Animal Center,Taipei,Taiwan)が、標準状態の動物飼育室(22℃;湿度50%、12時間の明暗周期)で飼育された。実験は、4つのグループ(B16−dEV、B16−CSE1L、B16−Ras及びB16−Ras/抗−CSE1L細胞が注入されたマウス)で行われ、異なる週齢のマウスも同様に4つのグループに分配された。それぞれのマウスには、生きている細胞(100μlPBS中に3×104細胞/mouse)が、尾静脈注射された。実験は、B16−dEV、B16−CSE1L、B16−Ras、B16−Ras/抗−CSE1L細胞がそれぞれ注射された11、14、8及び11匹のマウスで行われた。注射後3週間で、マウスは解剖された。肺中の腫瘍細胞数は、肉眼検査及び顕微鏡検査で行われた。マウスのケアと実験は、台湾中央研究院(Academia Sinica, Taiwan)の動物ケア委員会のガイドラインに従って実施した。16−dEV、B16−CSE1L、B16−Ras、B16−Ras/抗−CSE1L細胞の注射後、3週間後までに、それぞれ、3、10、4、1匹のマウスが死亡したので、それらは、統計から除外した。また、16−dEV、B16−CSE1L、B16−Ras、B16−Ras/抗−CSE1L細胞を注射したマウスの内、それそれ、1、1、0、3匹のマウスは肺に腫瘍細胞が成長しなかったので、統計から除外した。
結腸直腸癌のサンプルは、中華キリスト病院(Changhua Christian Hospital)において、IRB−承認ガイドラインを用い、診察時にインフォームド・コンセントを行い、且つ未治療の115の連続した患者から得られた。すべての患者は、関与の前に、施設内倫理委員会が承認したガイドラインを用いてインフォームド・コンセントを行い説明事項について理解した。腫瘍は、段階に分けられ、対がん米国合同委員会(American Joint Committee on Cancer)の癌ステージマニュアルに従って、分類された。コントロールの健常者の血清サンプルは、60人の健常個体(平均年齢61.0±8.7歳、年齢範囲22〜71歳)から得られた。血清サンプルは、血液が凝固するよう少なくとも30分は室温で放置した。懸濁の可能性のある細胞及び血清中の細胞破片を除去するため、サンプルは、10,000rpmで10分間遠心分離され、上澄みは回収された後、−80℃で保存した。表1は、患者の基本特性を示す。
抗−CSE1L抗体(clone24)及び抗−マウスIgGが、Qdot800抗体複合体キット(Invitrogen)を用い、キット添付マニュアルに従って量子ドットに抱合された。Qdotは、N−コハク酸イミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボン酸塩(SMCC)で活性化され、抗体はジチオスレイトールで還元された。還元された抗体は、活性化されたQdotsと共有結合し、複合化反応は、β―メルカプトエタノールで抑えられた。複合体は、限外ろ過により濃縮されサイズ除去クロマトグラフィーにより精製された。複合体の濃縮物は、蛍光分光計により決定された。
週齢6〜7のオスのC57BL/6マウスは、生きているB16−CSE1L細胞(100μlPBS中に3×104細胞/mouse)が背面皮膚に注射された。腫瘍細胞の接種から3週間後、マウスの腫瘍は、量子ドット−接合抗−CSE1L抗体又は量子ドット−接合抗−マウスIgG(100μlのPBS中500pmole/mouse)と共に、尾静脈に注入された。マウスは、Xenogen IVIS 200イメージング・システム(励起:525/50nm;発光:832/65nm)を用い、注入後、0、1及び4時間経過時に観察した。NIR蛍光画像は、カメラで撮影された。
リン酸タンパク質、LTpEYpLKKTLDPDPAC(Tpは、リン酸スレオニン及びYpはリン酸チロシンを意味する)、及び非リン酸タンパク質、LTEYLKKTLDPDPACは、固相法を用いて合成された。リン酸化されたタンパク質は、N−末端システインのチオールを介して、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に接合した。ニュージーランドウサギが、タンパク質で5回免疫を与えられた。免疫血清は、最後の免疫付与から1週間後に回収された。IgGフラクションは、プロテインGカラム(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を用いて精製された。抗体は、リン酸化タンパク質アフィニティーカラムで精製され、次いで、非リン酸特異的抗体を除去するため、非リン酸タンパク質クロス吸着を行った。力価と抗体特異性は、ELISA及び免疫ブロット法でテストされた。
精製された微小胞懸濁液(5μl)が、96ウェルのドットブロットマニフォールド装置(BRL,Bethesda,MD,USA)のニトロセルロース膜(Amersham Pharmacia)の夫々のウェルに滴下された。膜は、ブロッキングバッファー[1%BSA、50mM Tris−HCl(pH7.6)、150mM NaCl及び0.1%Tween−20]を用い室温で1時間、ブロックされた。ブロットは、4℃で一晩、一次抗体とインキュベートされ、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した2次抗体と1時間インキュベーションされた。タンパク質レベルは、Forte Western HRP Substrate(Millipore)を用い、キットの添付マニュアルに従って検出した。
血清サンプルは、96−well Nunc Immunoplate MaxiSorb plates(Nunc,Roskilde,Denmark)を用いて4℃で一晩、複製した。サンプルは吸引され1%BSAを含むPBSでブロックされた。ブロッキングバッファーが除去され、次いで、PBST(0.05%Tween−20を含むPBS)で洗浄された。ウェルは、ビオチン結合抗−リン酸−CSE1L抗体又はビオチン結合抗−CSE1L抗体で1時間、インキュベートされた。ビオチン結合抗体又はビオチン結合抗体は、ビオチンラベル キット−NH2(Dojindo Laboratories,Kumamoto,Japan)を用いて、抗体をビオチン化することで準備した。ウェルは、次いでPBSTで洗浄され、ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)と反応され、次いで、基質試薬(R&D Systems)とインキュベーションした。校正のため、PBSを含む3つのブランクウェルが、バックグランド値の測定に用いられ、PBSを含む、且つ他のELISA試薬のすべてと反応した3つのブランクウェルがコントロールウェルとして用いられた。450nmにおける吸光度は、Thermo Multiskan EX Microplate Photometer(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)を用いて、30分以内に測定した。コントロールウェルのもっとも高いOD値より高いサンプルウェルのOD値は、SE1L陽性、又はリン酸化CSE1陽性と考えられる。
データは、SPSS 14.0統計ソフトを用いて分析された。統計学的差異は、フィッシャーの正確確率検定で両側検定(two−tailed Fisher’s exact test)を行い分析した。α−level≦0.01は、統計学的に意義があると考えられた。
〔v−H−rasが導入された安定細胞の作製、CSE1L、及びv−H−ras plus CSE1L shRNA発現プラスミド〕
B16F10メラノーマ細胞に、B16−Ras細胞にv−H−rasコーディング領域を運ぶレトロウィルス発現ベクターであるpZIP−v−H−rasが導入された;pcDNA−CSE1L、B16−CSE1L細胞を得るための人CSE1Lコーディング領域を運ぶレトロウィルス発現ベクター;B16−Ras/抗−CSE1L細胞を得るためのpZIP−v−H−ras plus CSE1L shRNAプラスミド。コントロールとして、B16−Ras細胞及びB16−CSE1L細胞に、如何なる細胞メッセージも伝えないごちゃ混ぜになったshRNA配列をコードするコントロールshRNAプラスミド(pshEV)が導入された;B16F10細胞に、B16−dEV細胞を得るためコントロールベクターpshEV及びpZIP−NeoSV(X)1が導入された。免疫ブロットの結果は、RasレベルはB16−Ras及びB16−Ras/抗−CSE1L細胞で増加したことを示した;CSE1Lレベルは、B16−CSE1L細胞で増加し、B16−Ras/抗−CSE1L細胞で減少したことを示した(図1)。
〔v−H−rasが誘導する腫瘍細胞微小胞の生成〕
ras腫瘍遺伝子は、細胞形質転換の重要な伝達物質で、多様な種類の人癌に存在する;ERKは、多様な種類の細胞外刺激やRas及びErbB等のプロトオンコジーンファミリーに応答して活性化され、分子標的治療の重要なターゲットである(Roberts et al. 2007)。顕微鏡検査では、B16−Ras細胞表面は多くの気泡状の微小胞で覆われているが、B16F10及びB16−dEVコントロール細胞では確認されなかった(図2A)。細胞外小胞の形成は、しばしば、偽足(pseudopodia)又は突起伸長(protrusion extension)と一体となっている(Bianco et al. 2005)。微小胞の成長の存在は、B16−Ras細胞の偽足又は細胞質の底部に観察された(図2B)。脱落微小胞は、メタロプロテイナーゼで濃縮されていた(Taraboletti et al.2002)。メタロプロテイナーゼ−2(MMP−2)基質は、B16−Ras細胞中の微小胞に局在する(図2C)。v−H−rasトランスフェクションは、微小空胞MMP−2及びPD98059レベルを増加した。それは潜在的なERK活性阻害因子、微小胞中でv−H−rasが誘導した増加したMMP−2の弱毒化の治療の可能性を意味する(図2D)。DAPI(4’,6−diamidino−2−phenylindole)染色は、細胞中にアポトーシスに関するクロマチン凝縮/分解のサインが無いことを示している。つまり、B16−Ras細胞膜の微小胞の存在は微小胞の生成に関与しており、ERKはv−H−rasによって誘導される微小胞の形成に関与している。
〔v−H−rasトランスフェクションがCSE1L分泌物を増加〕
免疫ブロットの結果は、v−H−rasトランスフェクションがCSE1L分泌物を増加することを示した。また、PD98059処理は、B16F10細胞のv−H−ras−誘導CSE1L分泌物の増加を弱めた(図3)。v−H−rasトランスフェクション及びPD98059処理は、細胞中のCSE1L発現に明らかに影響したとはいえなかった(図3)。したがって、v−H−rasトランスフェクションは、CSE1L分泌物を刺激し、このことはERK活性に関係した。
〔CSE1Lは、セリン/スレオニン及びチロシンリン酸化タンパク質〕
GST−CSE1L融合タンパク質が、小麦胚芽無細胞タンパク質合成系を用いて合成された。免疫ブロットは、合成されたCSE1Lタンパク質は、抗−リン酸セリン/スレオニン及び抗−ホスホチロシン抗体と反応した(図4)。したがって、CSE1Lは、セリン/スレオニン及びチロシンリン酸化タンパク質である。
〔v−H−rasトランスフェクションはCSE1Lリン酸化を増加し、リン酸化CSE1Lは癌血清中に存在〕
B16−dEV細胞、B16−Ras細胞、及びPD98059で処理されたB16−Ras細胞から精製された細胞溶解物中のCSE1Lタンパク質は、抗−CSE1L抗体で免疫沈降された。免疫沈降物は、HRP(西洋わさびペルオキシダーゼ)結合抗−リン酸スレオニン抗体で免疫ブロットされた。結果は、B16F10細胞へのv−H−rasトランスフェクションは、CSE1Lのスレオニンのリン酸化反応を増加し、そして、PD98059処理は、CSE1L中でv−H−rasによるスレオニンのリン酸化反応を抑制すること示している(図5A)。つまり、CSE1Lはリン酸化タンパク質で、Ras−ERK信号によりリン酸化される。血清飢餓B16−dEV、B16−Rasから回収された細胞の細胞数が標準化された馴化培地中、及びPD98059で処理されたB16−Ras細胞のCSE1Lタンパク質は、抗−CSE1L抗体で免疫沈降された。免疫沈降物は、HRP結合抗−リン酸スレオニン抗体で免疫ブロットされた。結果は、B16F10細胞へのv−H−rasトランスフェクションは、スレオニンリン酸化CSE1Lの分泌物を増加し、そして、PD98059処理は、B16−Ras細胞から馴化培地中に、v−H−ras増加によるスレオニンリン酸化反応物を分泌することを抑制することを示している(図5B)。
結腸直腸癌患者及び健常者ドナーの血清中のスレオニンリン酸化CSE1Lのレベルが分析された。結腸直腸癌患者(N=36)又は健常者ドナー(N=36)から採取された血清スレオニンリン酸化CSE1Lタンパク質は、アガロースゲル結合抗−リン酸化スレオニン抗体で免疫沈降された。免疫沈降物は抗−CSE1L抗体で免疫ブロットされた。結果は、癌血清サンプルからの免疫沈降物中にはスレオニンリン酸化CSE1Lが存在することを示したが、健常者ドナーの血清サンプルには存在していなかった(図5C)。血清CSE1Lレベルは、健常者ドナーのサンプルより癌患者のサンプルの方が高かったが、違いは、スレオニンリン酸化CSE1Lのアッセイで見られたように顕著ではなかった。
〔結腸直腸癌におけるリン酸化−ERK及びCSE1Lの高発現、及び腫瘍中のCSE1Lとリン酸−ERKの相関染色強度の一致〕
〔CSE1Lが細胞中のv−H−ras−誘導の微小胞の発生を媒介する〕
顕微鏡検査は、B16−Ras/抗−CSE1L細胞及びCSE1L shRNAプラスミドが導入されたB16−Ras細胞の表面には微小胞が存在していないことを示している(図7A)。B16−Ras/抗−CSE1L細胞の細胞質又は偽足の底部にも微小胞の蓄積はなかった(図7A)。顕微鏡検査は、B16−CSE1L細胞の表面には微小胞が存在していることを示している(図7B)。v−H−rasが誘導する微小胞と違い、CSE1Lは、細胞あたり、ほとんど微小胞を誘導しせず、小胞は細胞の表面突起(invadopodia)の先端に多く存在し、また、サイズも大きかった(図7B)。これらの違いは意味がある、なぜなら、v−H−rasトランスフェクションはERK活性を刺激して、ERKは微小胞の生成と放出を媒介するからである。CSE1Lの過剰発現は微小胞の生成を刺激するに過ぎない;そのため、CSE1Lに誘導された微小胞は、細胞膜に蓄積し大きなサイズになる。先行研究は、小胞は原形質膜で形成され、糸状偽足に沿って、糸状偽足の先端に移動することを示している(Bianco et al.2005)。CSE1Lは、偽足の底部に位置したMMP−2の豊富な発育過程の微小胞で着色された(図7C)。CSE1Lは、また、B16−Ras細胞の脱落した微小胞の後に位置した発育過程の微小胞の細胞質で着色された(図7C)。更に、CSE1L shRNAは、v−H−rasが誘導する微小胞の成長を阻害した(図7A)。つまり、CSE1Lは、微小胞生成の調節遺伝子であり、v−H−rasが誘導する微小胞の生成を媒介する。
〔CSE1Lはv−H−rasにより誘導された腫瘍細胞のin vitro浸潤を媒介する〕
DMSO又は50μMPD98059で処理又は処理されていない血清飢餓B16−dEV、B16−Ras、B16−CSE1L及びB16−Ras/抗−CSE1L細胞から採取した微小胞のゼラチン酵素電気泳動分析の結果は、v−H−rasトランスフェクションは、微小胞MMP−2の酵素電気泳動の活性を増加した、及びPD98059処理は微小胞MMP−2の酵素電気泳動の活性におけるv−H−rasが誘導する増加を弱めることができた(図8A)。CSE1Lの過剰発現は、微小胞MMP−2の酵素電気泳動の活性を増加した、そして、CSE1L shRNA トランスフェクションは微小胞MMP−2の酵素電気泳動の活性におけるv−H−rasが誘導する増加を弱めることができた(図8A)。マトリゲル・ベースの浸潤分析は、v−H−Ras トランスフェクション及びCSE1Lの過剰発現とも、B16F10細胞のin vitro浸潤を増加させ、CSE1L shRNAトランスフェクションはv−H−Rasが誘導した細胞の浸潤能力が増加することを弱めた(図8B)。つまり、CSE1Lは、v−H−Rasにより誘導された腫瘍細胞のin vitro浸潤を媒介する。
〔CSE1Lはv−H−rasが誘導した癌細胞の転移を媒介する〕
MMP−2は、腫瘍浸潤で本質的な役割を果たす(Taraboletti et al.2002)。免疫蛍光は、CSE1LはB16−Ras及びB16−CSE1L細胞表面の微小胞のMMP−2と共局在化されていることを示している(図9A)。また、CSE1Lは、微小胞に選択的に蓄積されていた(図9A)。C57BL/6マウスによる動物実験では、CSE1Lの過剰発現及びv−H−Rasトランスフェクションは、それぞれ、361.5%(P<0.01)及び246.1%(P<0.01)のB16F10細胞の肺腫瘍転移を示した;CSE1L shRNAトランスフェクションはv−H−Rasが誘導した腫瘍の肺転移を100%(P<0.01)に弱めた;B16−Ras及びB16−Ras/抗−CSE1L細胞の成長速度は類似しているにもかかわらず(図9B及びC)。つまり、CSE1Lは、v−H−Rasにより誘導された腫瘍細胞の転移を媒介する。
〔CSE1Lは微小胞膜に局在化し抗−CSE1L抗体は腫瘍をターゲットとすることができる〕
免疫蛍光の結果は、CSE1Lは微小胞膜に局在化することを示した(図10A)。免疫金電子顕微鏡検査は、CSE1L及びMMP−2は小胞に局在化し、そしてCSE1Lは小胞膜に主に局在化することを更に示した(図10B)。脱落した微小胞は腫瘍細胞膜の上で広範囲に広がり、脱落微小胞は、腫瘍細胞の周りの細胞外環境に留まっている可能性がある;それゆえ、微小胞膜タンパク質は、癌治療の潜在的ターゲットとなる可能性がある。微小胞膜中のCSE1Lの局在化は、CSE1Lが癌治療の潜在的ターゲットとなり得ることを示している。腫瘍のあるC57BL/6マウスに、Qdot800ナノクリスタル結合抗−CSE1L抗体、又はコントロールとしてQdot800ナノクリスタル結合抗マウスIgGが尾静脈注射された。in vivoイメージの結果は、抗−CSE1L抗体結合量子ドットを注入したマウスの腫瘍中には重要な近赤外(NIR)蛍光信号の存在を示したが、コントロールのIgG結合量子ドットを注入したマウスの腫瘍中では観察されなかったことを示した(図10C)。つまり、抗−CSE1L抗体は、腫瘍をターゲットとすることがでる。
〔抗−リン酸CSE1L抗体はリン酸化されたCSE1Lと反応する〕
リン酸CSE1Lに特異的な抗体は、CSE1Lの推定リン酸化領域と一致するようになっている合成リンペプチドをニュージーランド・ウサギに免疫接種することで作製した。抗−リン酸−CSE1L抗体の力価は、間接的なELISAによって測定された(表2)。免疫ブロットの結果は、抗−リン酸−CSE1L抗体はリン酸化したCSE1Lと反応することを示した(図11)。
〔リン酸化CSE1Lは微小胞に局在する〕
リン酸化CSE1Lが微小胞に局在するか否かが分析された。抗−リン酸CSE1L抗体を用いた免疫蛍光は、リン酸化CSE1Lが微小胞(矢印)に局在化していることを示した(図12)。
〔癌血清から分離された微小胞のCSE1Lの存在〕
微小胞が、結腸直腸癌の患者及び健常者ドナーの血清から分離された。分離された微小胞は、96ウェルドットブロットマニホールド(BRL,Bethesda,MD,USA)に入れられ、血清微小胞のCSE1Lの存在は、抗−CSE1L抗体及び抗−リン酸CSE1L抗体を用いたドットブロットにより分析された。ブロットの強さは、IS−1000デジタル画像処理システムを用いて定量化された(Kaiser Alpha Innotech,USA)。結果は、癌血清サンプルから分離された微小胞のCSE1Lの罹患率は、健常者ドナーの血清サンプルより高い値を示した(図13A)。また、癌血清サンプルから分離された微小胞のリン酸化CSE1Lの罹患率は、健常者ドナーの血清サンプルより高い値を示すことも結果より明らかとなった(図13B)。CSE1Lは、癌患者から分離された血清微小胞の96.5%(111/115)で検出され、健常者ドナーから分離された血清微小胞では6.6%(4/60)検出された。P−値は、癌グループと健常者グループで<0.01であった。標準として合成されたCSE1Lを使って、癌患者からの血清微小胞のCSE1Lのカット―オフ値は、≥21ng/mlと決定された。リン酸化CSE1Lは、癌患者から分離された血清微小胞の98.2%(113/115)で検出され、健常者ドナーから分離された血清微小胞では3.3%(2/60)検出された。P−値は、癌グループと健常者グループで<0.01であった。標準として合成されたリン酸化CSE1Lタンパク質を使って、癌患者からの血清微小胞のリン酸化CSE1Lのカット―オフ値は、≥15ng/mlと決定された。
〔癌患者の血清のリン酸化CSE1Lのより高い罹患率、及び癌診断には血清中のリン酸化CSE1Lの分析がCSE1Lの分析より優れていること〕
結果は、癌血清から分離された微小胞にリン酸化CSE1Lが存在していることを示している(実施例13)。免疫沈降の結果は、癌血清サンプルからの免疫沈降物にはリン酸化CSE1Lが存在するが、健常者の血清サンプル中には存在しないことを示している(図5C)。結腸直腸癌患者の血清中のCSE1L及びリン酸化CSE1Lの罹患率が分析された。ELISAの結果は、癌血清の92.1%(106/115)はリン酸化CSE1L−陽性であったのに対し、健常者ドナーの血清では、わずか1.6%(1/60)がリン酸化CSE1L−陽性であった(図14)。P−値は、癌グループと健常者グループで<0.01であった。標準として合成されたリン酸化CSE1Lタンパク質を使って、癌患者からの血清中のリン酸化CSE1Lのカット―オフ値は、≥3ng/mlと決定された。ELISAの結果は、癌血清の65.2%(75/115)はCSE1L−陽性であったのに対し、健常者ドナーの血清では、13%(8/60)がCSE1L−陽性であった。標準として合成されたCSE1Lを使って、癌患者からの血清中のCSE1Lのカット―オフ値は、≥8ng/mlと決定された。癌検出のためのリン酸化CSE1L血清の感度と選択性は、それぞれ、92.1%と98.3%であった。
癌検出のためのCSE1L血清の感度と選択性は、それぞれ、65.2%と86.6%であった。したがって、リン酸化CSE1L血清の分析は、CSE1L血清の分析より癌診断に優れている。
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Claims (15)
- 細胞アポトーシス感受性タンパク質(CSE1L)に対する抗体、又はリン酸化CSE1Lに対する抗体。
- 抗体が、リン酸化CSE1Lに対する抗体であることを特徴とする請求項1に記載の抗体。
- (a) 被験体からテスト生体液サンプルを得る工程;
(b) 1以上の健常者からコントロールサンプルを得る工程;
(c) テスト生体液サンプル及びコントロールサンプルをin vitroで請求項1に記載されている抗体と接触させる工程;
(d) テスト生体液サンプル中の微小胞のCSE1L又はリン酸化CSE1Lの量を測定する工程;及び
(e) コントロールサンプル中の微小胞のCSE1L又はリン酸化CSE1Lの量を測定する工程;
を含む被験体の癌を診断するin vitroの方法において、
工程(d)で測定されたテスト生体液サンプル中の微小胞のCSE1L又はリン酸化CSE1Lの量を、ステップ(e)で測定されたコントロールサンプルのCSE1L又はリン酸化CSE1Lの平均量と比較し、CSE1Lの増加又はリン酸化CSE1Lの存在が被験体に癌が存在することを示すことを特徴とする方法。 - CSE1L又はリン酸化CSE1Lの量が前記サンプルのドットブロット分析により測定されることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- CSE1Lの量が、抗−CSE1L抗体及び微小胞との結合による分析で測定され;リン酸化CSE1Lの量が、抗−リン酸化CSE1L抗体及び微小胞との結合による分析で測定されることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 被験体が人であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- (a) 被験体からテスト生体液サンプルを得る工程;
(b) 1以上の健常者からコントロール生体液サンプルを得る工程;
(c) テスト生体液サンプル及びコントロール生体液サンプルをin vitroで請求項2に記載されている抗体と接触させる工程;及び
(d) テスト生体液サンプル中のリン酸化CSE1Lの量及びコントロールサンプル中のリン酸化CSE1Lの量を測定する工程;
を含む被験体の癌を診断するin vitroの方法において、
テスト生体液サンプル中のリン酸化CSE1Lの量をコントロール生体液サンプルのリン酸化CSE1Lの平均量と比較し、リン酸化CSE1Lの増加が被験体に癌が存在することを示すことを特徴とする方法。 - リン酸化CSE1Lの量は、前記サンプルを酵素免疫測定法(ELISA)により測定したものであることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- リン酸化CSE1Lの量は、抗−リン酸化CSE1L抗体及びリン酸化CSE1Lを結合して分析したものであることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 被験体が人であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- (a) 被験体から生体液サンプルを得る工程;
(b)生体液サンプルをin vitroで請求項1に記載されている抗体と接触させる工程;及び
(c)抗体に結合している微小胞を分離する工程;
を含む生体液サンプルから微小胞を分離するin vitroの方法。 - 抗−CSE1L抗体又は抗−リン酸化CSE1L抗体、及び医薬品賦形剤、希釈剤またはキャリヤを含む医薬組成物。
- 生体液サンプルをin vitroで請求項1に記載されている抗体と接触させる工程;及び抗体の結合を検出する工程を含む生体液サンプル中の微小胞の存在を検出するin vitroの方法において、微小胞のCSE1L又はリン酸化CSE1Lへの抗体の結合が生体液サンプル中の微小胞の存在を示すことを特徴とする方法。
- 請求項1の抗体を含む微小胞をin vitroで検出及び/又は分離するためのキット。
- 請求項2の抗体を含む生体液サンプル中のリン酸化CSE1Lをin vitroで検出するためのキット。
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