CN104185640A - 阿尔茨海默病中的tau蛋白介导病变的基于蛋白质的疗法和诊断 - Google Patents

阿尔茨海默病中的tau蛋白介导病变的基于蛋白质的疗法和诊断 Download PDF

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Abstract

本发明提供结合tau蛋白的有助于启始和扩散病理性tau蛋白-tau蛋白相互作用的区域的独特治疗和诊断抗体以及它们的片段、部分、衍生物及其变体以及制备它们的方法。本发明也涉及使用那些抗体诊断、预防和治疗阿尔茨海默病和相关tau蛋白病变的方法。本发明也提供一种用于防治性和治疗性治疗阿尔茨海默病和其它神经变性tau蛋白病变的方法。这个方法需要注射会引发针对患者的脑中的病理性tau蛋白和tau蛋白沉积物的免疫反应的抗体和/或肽疫苗。适合疫苗代表携带本文提供的一种或多种tau蛋白治疗表位的tau肽。

Description

阿尔茨海默病中的TAU蛋白介导病变的基于蛋白质的疗法和诊断
本发明要求2011年9月19日提交的美国临时申请61/536,339和2012年5月30日提交的美国临时申请61/653,115的优先权益，所述申请的内容均以引用的方式并入本文。
序列表
本申请含有已通过EFS网以ASCII格式提交且据此以引用的方式整体并入本文的序列表。2012年9月13日创建的所述ASCII拷贝名为SEQUENCE_LISTING.txt且大小为155,400字节。
领域
本发明的特征在于用于干扰某些形式的tau蛋白的产生和清除的基于蛋白质(例如抗体、肽)方法和手段，所述某些形式的tau蛋白涉及阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)中的病理性tau蛋白-tau蛋白聚集体的促成和/或进展；以及用于产生适用于诊断和治疗阿尔茨海默病的抗tau蛋白抗体的方法。本发明进一步涉及用于诊断阿尔茨海默病的方法和手段，包括用于分级和评估治疗进展的方法。
背景
阿尔茨海默病(AD)是一种破坏高级脑结构，如涉及于记忆和认知中的那些脑结构的进行性神经变性病症。所述疾病导致认知功能缺陷和记忆、学习、语言衰退以及进行有意和有目的活动的能力衰退。AD也伴随相伴行为性、情绪性、人际性和社会性退化。这些认知和行为缺陷致使生活困难(Burns等,2002)。晚期AD患者常不能说话、理解语言和处理他们自己的基本个人护理，最终需要专职护理和监视，且常依赖于家庭成员和疗养院。AD是老年性痴呆的主要病因，且预测随着人口中的年长人士的比例增长，发病率会增加。预测患有AD的人士的总数仅在2000年与2050年之间即会增加至少三倍，从而致使AD成为世界范围内的公共健康问题(Sloane等,2002)。临床管理AD仍主要是支援性的。也就是说，治疗患者的目的是预防、控制或减轻来自AD的并发症和副作用，以及提高他们的生活舒适性和质量。对直接靶向疾病过程且具有疾病改善作用的治疗仍然存在未满足的需要。
AD的组织学特征在于在脑中存在神经元外斑块以及细胞内和细胞外神经原纤维缠结。斑块主要由β淀粉状蛋白(Αβ)组成，而缠结包含病理性形式的tau蛋白，如病理性tau蛋白构象异构体及其聚集体。斑块和缠结与疾病过程之间的关系仍不清楚，但研究表明淀粉状蛋白与tau蛋白发病机制之间存在关联(Hardy等,1998；Oddo等,2004；Rapoport等,2002；Roberson等,2007；Shipton等,2011)。Αβ在AD病变中的主要作用初始是在称为“Αβ级联”的假设中提出，其中在Αβ沉积之后是tau蛋白磷酸化和缠结形成，且接着神经元死亡(Hardy和Allsop,1991；Hardy和Selkoe,2002；对于综述，参见Walsh和Selkoe,2004；也参见Seabrook等2007)。因此，针对AD的初始治疗方法主要集中在靶向Αβ。然而，有文件证明在AD患者的脑Αβ病变程度与疾病临床进展之间缺乏关联(Braak和Braak,1991)。此外，无症状个体在尸体解剖时已显示广泛性，常常弥漫性淀粉状蛋白沉积(Braak和Braak,1991)，且至少在早期AD中，神经元损失和淀粉状蛋白沉积发生在不同脑区域中(Carter和Lippa,2001)。因此，单独靶向Αβ不足以改变任何或所有患者中的疾病过程。然而，正经历在AD患者中进行的临床试验的最先进疾病靶向疗法仍是旨在Αβ的产生和清除的那些疗法。这些疗法包括被动免疫疗法，例如巴品珠单抗(BAPINEUZUMAB)、苏兰珠单抗(SOLANEUZUMAB)和波恩珠单抗(PONEZUMAB)；以及小分子γ-分泌酶抑制剂司马西特(SEMAGACESTAT)(对于综述，参见Citron等,2010)。
已在众多研究中证明tau蛋白在AD病变中的一公认作用。举例而言，Braak显示AD神经变性的最密切关联是存在tau蛋白缠结而非淀粉状蛋白斑块(Braak和Braak,1991)。在另一研究中，培养的神经元中的Αβ神经毒性似乎取决于tau蛋白(Rapoport等,2002)。近来，降低内源性tau蛋白防止了表达人淀粉状蛋白前体蛋白的转基因小鼠的行为缺陷而不改变它们的高Αβ水平(Roberson等,2007)。Tau蛋白降低也保护转基因小鼠与非转基因小鼠两者免遭兴奋性毒性。同上。Santacruz等在tau蛋白病变模型中证明降低tau蛋白的量恢复了记忆功能(Santacruz等,2005)。因此，旨在降低tau蛋白的疗法可代表一种用于治疗AD和其它tau蛋白相关疾病状况的有效策略。
Tau蛋白属于固有无序蛋白质家族，所述固有无序蛋白质的特征在于在它们的生理环境中不存在刚性三维结构(Zilka等,2008)。然而，tau蛋白截短和过度磷酸化可导致自固有无序状态向多种可溶性及不溶性错误无序结构(包括成对螺旋纤维(PHF)和其它聚集体)的病理性转化(Wischik等,1988a；Wischik等,1988b；Novak等,1993；Skrabana等,2006；Zilka等,2008；Kovacech等,2010)。这些结构变化导致获得毒性功能、损失天然蛋白质的生理功能，或两者(Zilka等,2008；Kovacech等,2010)。
Tau蛋白的生理功能在于介导微管蛋白单体装配成构成神经元微管网状结构的微管(Buee等,2000)。Tau蛋白通过位于蛋白质的C末端部分中的重复区域结合微管。同上。这些重复结构域(R1-R4)彼此不相同，但包含高度保守的31-32个氨基酸(Taniguchi等,2005b)。在人脑中，存在因在tau蛋白的N末端部分中存在或不存在某些氨基酸以及在蛋白质的C末端处的3种(R1、R3和R4)或4种(R1-R4)重复结构域而彼此不同的6种独特tau蛋白亚型。也参见图1，其显示6种人亚型(2N4R、1N4R、2N3R、0N4R、1N3R和0N3R)。已提出tau蛋白用以诱导微管聚合的最强力部分是覆盖R1-R2的274-KVQIINKK-281区域(SEQ ID NO:113)。同上。此外，tau蛋白的病理和生理功能似乎受由全长蛋白质亚型及其片段所采用的特定结构构象和固有无序结构影响。举例而言，Kontsekova等描述某些截短tau蛋白分子内与那些截短tau蛋白分子关于微管装配的功能具有重大关系的构象区域(涵盖残基297-IKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSL-325(SEQ IDNO:114))(WO2004/007547)。
除它们的生理作用之外，tau蛋白重复序列被认为参与形成病理性tau蛋白聚集体和其它结构。因此，对能够区分生理性重复序列介导活性与病理性重复序列介导活性的tau蛋白靶向治疗和诊断方法存在需要。举例而言，病理性成对螺旋纤维(PHF)的链霉蛋白酶(pronase)抗性核心由3重复tau蛋白亚型和4重复tau蛋白亚型的微管结合区组成(Jakes等,1991；Wischik等1988a；Wischik等1988b)。此外，Novak等显示PHF的长度为93-95个氨基酸的蛋白酶抗性核心限于3个串联重复序列(Novak等,1993)。Von Bergen等确定最小tau肽/相互作用基元(306-VQIVYK-311；SEQ ID NO:115)以及tau蛋白上的第二位点(275-VQIINK-280)(SEQ ID NO:116)，所述基元和所述第二位点形成β折叠且被描述为潜在负责启始病理性tau蛋白聚集体PHF的形成(Von Bergen等,2000；EP1214598；WO2001/18546)。对于tau蛋白的功能图谱，参见图2。因此，当前策略旨在产生不破坏tau蛋白在微管稳定化方面的细胞内作用的抗聚集药物。
此外，尽管在生理情况下，tau蛋白被视为细胞内细胞质蛋白，但细胞内tau蛋白可被释放至细胞外间隙中且促进神经变性(Gómez-Ramos等,2006)。实际上，神经元损失已与神经原纤维缠结(由tau蛋白组成)在AD脑中的局部解剖分布相关联(West等,1994；Gomez-lsla等,1996,1997)。此外，总tau蛋白和磷酸化tau蛋白的水平在AD患者的脑脊髓液(CSF)中增加(Hampel等,2010)，且细胞外tau蛋白已被描述为脑中指示细胞内tau蛋白释放至细胞外间隙中的“鬼影缠结(ghost tangle)”(Frost和Diamond,2009)。此外，细胞外tau蛋白聚集体可进入细胞且刺激细胞内tau蛋白纤维化，从而进一步播种(seeding)用于产生病理性tau蛋白聚集体的tau蛋白单体(Frost等,2009)。所述研究已强调细胞外不溶性tau蛋白可充当可传播剂来以朊病毒样方式遍及脑散布tau蛋白病变(Frost等,2009；Frost和Diamond,2009)。清除细胞外tau蛋白缠结可减轻tau蛋白相关细胞外和细胞内病变。参见例如Asuni等,2007。因此，对能够通过阻碍细胞外tau蛋白的形成、促进其清除，或两者来降低细胞外tau蛋白的治疗以及对降低细胞内疾病tau蛋白的治疗存在需要。
总而言之，尽管tau蛋白似乎在AD的临床显现方面起病理性作用，但针对tau蛋白起作用的药物的开发已落后，此部分归因于tau蛋白在生理性微管动力学中的重要性和其复杂生物学(Dickey和Petrucelli,2006)。然而，对潜伏在病理性tau蛋白转化以下的分子机制的了解增加已开启出于治疗目的特异性靶向病理性tau蛋白修饰的可能性。因此，已出现直接或间接靶向tau蛋白级联的许多治疗方法(对于综述文章，参见例如Dickey和Petrucelli,2006；Schneider和Mandelkow,2008；Zilka等,2008)，包括预防或逆转tau蛋白聚集的化合物(Wischik等,1996；Necula等2005；Pickhardt等,2005；Taniguchi等,2005a；Larbig等,2007)、抑制tau蛋白激酶或活化tau蛋白磷酸酶的小分子型药物(Iqbal和Grundke-lqbal,2004；Noble等,2005；Iqbal和Grundke-lqbal,2007)、微管稳定化药物(Zhang等,2005)、有助于错误折叠tau蛋白的蛋白水解降解的药物(Dickey等,2005；Dickey等2006；Dickey和Petrucelli,2006)和免疫抑制药物(Zilka等,2008)以及包括主动和被动免疫的免疫治疗策略(Schneider和Mandelkow等,2008；Zilka等,2008；Tabira,T.Immunization Therapy for Alzheimer disease:A Comprehensive Review ofActive Immunization Strategies.Tohoku J.Exp.Med.,220:95-106(2010))。
更一般而言，自2007年以来，新型单克隆抗体(mAb)已以每年超过40种的速率进入临床研究。在2010年结束时，在美国有至少25种mAb和5种Fc融合蛋白处于2/3期或3期临床研究中(Reichert,2011)。这个趋势说明被动免疫疗法是治疗包括AD的人病症中的一种发展方法。参见例如Citron等,2010。实际上，尽管AD治疗面对克服血脑屏障(BBB)的障碍，但日益增长数目的临床前和临床研究报道抗体介导的疗法可自脑清除AD聚集体，且提出多种作用机制，如(i)抗体通过在AD中改变的BBB渗透性或BBB泄漏而摄取至脑中；(ii)抗体充当可溶性斑块形成性淀粉状蛋白物质的“外周血沉槽(peripheral sink)”；(iii)抗体分泌性细胞自外周进入脑中，从而局部递送抗体；以及(iv)在细胞内和跨越细胞转运IgG。对于综述，参见例如Citron等,2010以及Asuni等,2007。因此，靶向疾病形式的tau蛋白的治疗抗体代表一种治疗和/或诊断AD和其它tau蛋白病变的有希望方法(WO2004/007547、US2008/0050383)。
一种用以靶向tau蛋白病变的免疫疗法方法基于抗tau蛋白抗体可防止tau蛋白聚集、清除tau蛋白聚集体，或两者的见解。尽管研究已描述结合tau蛋白序列的抗体，且那些抗体中的一些据报道会干扰tau蛋白聚集和清除(Asuni等,2007)，但尚无单克隆抗tau蛋白抗体据报道正经历AD的体内临床前或临床试验。实际上，预测一种mAb在鼠类tau蛋白的微管结合结构域内具有3个结合位点(即在R3、R4和可能R1处)，但其不阻断微管结合。(Dingus等,1991)。Dingus未描述这个抗体对tau蛋白聚集的作用，且因此没有理由相信Dingus将阻断tau蛋白聚集。在其它报道中，产生区分tau蛋白亚型的mAb，但又未暗示这些mAb将对tau蛋白聚集具有任何影响(DeSilva等,2003；Ueno等,2007)。Taniguchi等证明某些针对R1或R2的抗tau蛋白mAb在体外抑制tau蛋白聚集成PHF，同时促进tau蛋白诱导的微管蛋白装配(Taniguchi等,2005b)。Taniguchi的RTA-1和RTA-2抗体分别特异性结合R1和R2。两种抗体皆不结合一个以上tau蛋白重复序列且两种抗体皆未被报道针对对tau蛋白聚集或清除的体内影响加以测试。尽管在AD的基于被动免疫疗法(即向患者施用抗体的疗法)的临床试验中存在至少3种抗淀粉状蛋白抗体，但尚无用于AD的基于被动tau蛋白免疫疗法的临床测试报告可用。
在AD的若干APP转基因小鼠研究中发现一种主动免疫方法(即患者的身体自身产生针对靶标的免疫性的方法)有效清除Αβ沉积物且逆转神经病理性病变(参见例如Schenk等,1999；Janus等,2000；Morgan等,2000；Sigurdsson等,2001)。近来，在tau蛋白缠结病变的小鼠模型中，采用磷酸化tau表位(Tau蛋白379-408[P-Ser396、404])的主动免疫疗法降低了聚集tau蛋白在脑中的程度且减缓了行为表型的进展(Asuni等,2007；Boutajangout等2010；US2008/0050383；US/2010/00316564)。所治疗的动物产生在脑中检测到且与识别病理性tau蛋白的抗体共定位的抗tau蛋白抗体(Asuni等,2007)。这个免疫治疗方法在动物中的功能性损伤的早期阶段(5个月)实质上比后期阶段(8个月)更有效，表明清除早期阶段病理性tau蛋白可具有治疗益处(Asuni等,2007；Zilka等,2008)。实际上，了解到并非所有tau蛋白都易受影响或可能甚至适于破环和清除。一些研究者已表明破坏tau蛋白聚集体可增加毒性中间体物质的丰度，而其它研究者已表明可检测tau蛋白聚集体不必定有毒且可甚至起保护作用(Lee等,2005)。因此，尽管用以靶向tau蛋白的免疫治疗方法已显示临床前希望，但对特异性靶向消除其会产生提高的持续益处的早期异常形式的tau蛋白的治疗剂仍然存在需要。然而，也仍然需要鉴定作为免疫疗法的适合靶标的那些tau蛋白种类。
为此，开发针对tau蛋白的mAb的另一考虑是鉴定和表征各种结构形式的tau蛋白(生理性、早期疾病性、晚期疾病性)和tau蛋白病变的所靶向阶段。Oddo等观察到在AD的转基因小鼠模型中，尽管Αβ免疫疗法清除Αβ斑块和早期tau蛋白病变，但成熟tau蛋白聚集体保持完整(Oddo等,2004)。类似地，尽管神经原纤维缠结继续积累，但在tau蛋白病变的P301L tau蛋白模型中，tau蛋白表达的遗传性(非免疫治疗性)降低改善了记忆力(Santacruz等,2005)。
尽管AD盛行，但其仍是神经学中的最大未满足医学需要(Citron,2010)。最普遍医学方法在于提供甚至在治疗数年之后也不有效的对症疗法。用于AD的新型治疗方法和策略需要超越针对症状的治疗以预防认知衰退且抵抗疾病的基础病理性过程。具体来说，需要开发单独或与其它AD靶向药物组合干扰疾病的至少一些最早期阶段的分子。所述分子将提供早期诊断(此可自身提高治疗结果)、预防和治疗AD的新型有利选项。
发明概述
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体，其中所述抗体结合一种或多种tau表位且能够展现两种或更多种以下性质：
a)显示对病理性tau蛋白的亲和力高于对生理性tau蛋白的亲和力；
b)抑制tau蛋白-tau蛋白聚集；以及
c)介导由小神经胶质细胞对病理性tau蛋白的摄取和降解；
且其中各tau表位包含tau蛋白的聚集促进区。
在一实施方案中，这个分离的抗体是如此以致一种或多种表位各自独立地选自以下位置内的表位：
i.相对于tau441的位置267-273或残基KHQPGGG(SEQ ID NO:98)；
ii.相对于tau441的位置298-304或残基KHVPGGG(SEQ ID NO:99)
iii.相对于tau441的位置329-335或残基HHKPGGG(SEQ ID NO:100)；和
iv.相对于tau441的位置361-367或残基THVPGGG(SEQ ID NO:101)。
在某些实施方案中，具有先前段落的实施方案中所述的性质的分离的抗体能够结合选自以下的一种或多种形式的病理性tau蛋白：人阿尔茨海默病患者的脑活检中、来自阿尔茨海默病的动物模型的脑样本中、或两者中的错序tau蛋白、错误无序tau蛋白、肌氨酰(sarkosyl)不溶性tau蛋白、神经原纤维缠结、神经原纤维网线和神经炎斑块。在某些实施方案中，分离的抗体是如此以致至少一种其识别的表位是构象表位。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体，其中所述抗体结合一种或多种tau表位且能够展现两种或更多种以下性质：
a)显示对病理性tau蛋白的亲和力高于对生理性tau蛋白的亲和力；
b)抑制tau蛋白-tau蛋白聚集；以及
c)介导由小神经胶质细胞对病理性tau蛋白的摄取和降解；
且其中各tau表位包含tau蛋白的聚集促进区。
在一实施方案中，这个分离的抗体是如此以致一种或多种表位各自独立地选自以下位置内的表位：
i.相对于tau441的位置268-273或残基HQPGGG(SEQ ID NO:223)；
ii.相对于tau441的位置299-304或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)
iii.相对于tau441的位置330-335或残基HKPGGG(SEQ ID NO:224)；和
iv.相对于tau441的位置362-367或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)。
在一实施方案中，这个分离的抗体是如此以致一种或多种其结合的表位各自独立地选自以下位置内的表位：
i.相对于tau441的位置268-273或残基HQPGGG(SEQ ID NO:223)；
ii.相对于tau441的位置299-304或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)
iii.相对于tau441的位置330-335或残基HKPGGG(SEQ ID NO:224)；和
iv.相对于tau441的位置362-367或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)；
且所述抗体包含：
a)抗体轻链可变区，所述抗体轻链可变区包含：
i.用于CDR1的QSLLNSRTRKNY(SEQ ID NO:117)或SEQ ID NO:247；
ii.用于CDR2的WAS(SEQ ID NO:118)或SEQ ID NO:253；和
iii.用于CDR3的KQSFYLRT(SEQ ID NO:119)或SEQ ID NO:255、257、258、259和260的任一者；以及
b)抗体重链可变区，所述抗体重链可变区包含：
iv.用于CDR1的GYIFTDYVIS(SEQ ID NO:120)、SEQ ID NO:261或SEQID NO:262；
v.用于CDR2的IFPRSGST(SEQ ID NO:121)、SEQ ID NO:264或SEQ IDNO:265；和
vi.用于CDR3的ARDYYGTSFAMDY(SEQ ID NO:122)、SEQ IDNO:266、SEQ ID NO:267或SEQ ID NO:269。
本发明也提供一种以构象特异性方式结合tau蛋白上的一种或多种表位的分离的抗体，其中：
a)所述一种或多种表位各自独立地选自以下位置内的表位：
i.相对于tau441的位置267-273或残基KHQPGGG(SEQ ID NO:98)；
ii.相对于tau441的位置298-304或残基KHVPGGG(SEQ ID NO:99)
iii.相对于tau441的位置329-335或残基HHKPGGG(SEQ ID NO:100)；和
iv.相对于tau441的位置361-367或残基THVPGGG(SEQ ID NO:101)；
b)所述表位的零者、一者、两者或三者是线性表位；以及
c)所述表位的零者、两者、三者或四者是构象表位。
本发明也提供一种以构象特异性方式结合tau蛋白上的一种或多种表位的分离的抗体，其中：
a)所述一种或多种表位各自独立地选自以下位置内的表位：
i.相对于tau441的位置268-273或残基HQPGGG(SEQ ID NO:223)；
ii.相对于tau441的位置299-304或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)
iii.相对于tau441的位置330-335或残基HKPGGG(SEQ ID NO:224)；和
iv.相对于tau441的位置362-367或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)。
b)所述表位的零者、一者、两者或三者是线性表位；以及
c)所述表位的零者、两者、三者或四者是构象表位。
在一个实施方案中，这个抗体是DC8E8，其中DC8E8是一种由在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)专利保藏号PTA-11994下保藏的杂交瘤产生的抗体。
在某些实施方案中，分离的抗体结合tau蛋白上与由DC8E8结合的那些表位相同的表位的一者或多者。在一实施方案中，分离的抗体与单克隆抗体DC8E8竞争结合tau蛋白。
本发明也提供一种分离的抗体，所述分离的抗体在其表位结合结构域中包含一种或多种选自以下的互补决定区(CDR)序列：
i.QSLLNSRTRKNY(SEQ ID NO:117)
ii.WAS(SEQ ID NO:118)
iii.KQSFYLRT(SEQ ID NO:119)
iv.GYIFTDYVIS(SEQ ID NO:120)
v.IFPRSGST(SEQ ID NO:121)；和
vi.ARDYYGTSFAMDY(SEQ ID NO:122)。
本发明也规定先前段落中所述的任何实施方案中所述的任何抗体都可是如此以致分离的抗体包含：
a)抗体轻链可变区，所述抗体轻链可变区包含：
i.用于CDR1的QSLLNSRTRKNY(SEQ ID NO:117)；
ii.用于CDR2的WAS(SEQ ID NO:118)；和
iii.用于CDR3的KQSFYLRT(SEQ ID NO:119)；以及
b)抗体重链可变区，所述抗体重链可变区包含：
iv.用于CDR1的GYIFTDYVIS(SEQ ID NO:120)
v.用于CDR2的IFPRSGST(SEQ ID NO:121)；和
vi.用于CDR3的ARDYYGTSFAMDY(SEQ ID NO:122)。
本发明也规定先前实施方案中所述的任何抗体都可是如此以致分离的抗体包含：
a)一种或多种来自单克隆抗体DC8E8的轻链CDR序列或一种或多种在与这些轻链CDR之一最优比对之后具有至少80％、90％或95％同一性的序列；和
b)一种或多种来自单克隆抗体DC8E8的重链CDR序列或一种或多种在与这些重链CDR之一最优比对之后具有至少80％、90％或95％同一性的序列；
且其中：
i.所述轻链CDR包含选自QSLLNSRTRKNY(SEQ ID NO:117)、WAS(SEQ ID NO:118)和KQSFYLRT(SEQ ID NO:119)的序列；以及
ii.所述重链CDR包含选自GYIFTDYVIS(SEQ ID NO:120)、IFPRSGST(SEQ ID NO:121)和ARDYYGTSFAMDY(SEQ ID NO:122)的序列。
本发明也规定先前实施方案中所述的任何抗体都可由以下组成或包含以下：Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv片段、任何其它抗原结合片段；或其抗原结合抗体部分；具有一种或多种以下免疫结合特征：
1.抗体以构象特异性方式结合一种或多种tau表位，其中：
a)所述一种或多种tau表位各自独立地选自以下位置内的表位：
i.相对于tau441的位置267-273或残基KHQPGGG(SEQ ID NO:98)；
ii.相对于tau441的位置298-304或残基KHVPGGG(SEQ ID NO:99)
iii.相对于tau441的位置329-335或残基HHKPGGG(SEQ ID NO:100)；和
iv.相对于tau441的位置361-367或残基THVPGGG(SEQ ID NO:101)；
b)所述表位的零者、一者、两者或三者是线性表位；
c)所述表位的一者、两者、三者或四者是构象表位；
2.抗体结合两种或更多种tau表位且能够显示对病理性tau蛋白的亲和力高于对生理性tau蛋白的亲和力，其中所述两种tau表位选自以下位置内的表位：
v.相对于tau441的位置267-273或残基KHQPGGG(SEQ ID NO:98)；
vi.相对于tau441的位置298-304或残基KHVPGGG(SEQ ID NO:99)
vii.相对于tau441的位置329-335或残基HHKPGGG(SEQ ID NO:100)；和
viii.相对于tau441的位置361-367或残基THVPGGG(SEQ ID NO:101)。
本发明也规定先前实施方案中所述的任何抗体都可由以下组成或包含以下：Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv片段、任何其它抗原结合片段；或其抗原结合抗体部分；具有一种或多种以下免疫结合特征：
1.抗体以构象特异性方式结合一种或多种tau表位，其中：
a)所述一种或多种tau表位各自独立地选自以下位置内的表位：
i.相对于tau441的位置268-273或残基HQPGGG(SEQ ID NO:223)；
ii.相对于tau441的位置299-304或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)
iii.相对于tau441的位置330-335或残基HKPGGG(SEQ ID NO:224)；和
iv.相对于tau441的位置362-367或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)。
b)所述表位的零者、一者、两者或三者是线性表位；
c)所述表位的一者、两者、三者或四者是构象表位；
2.抗体结合两种或更多种tau表位且能够显示对病理性tau蛋白的亲和力高于对生理性tau蛋白的亲和力，其中所述两种tau表位选自以下位置内的表位：
i.相对于tau441的位置268-273或残基HQPGGG(SEQ ID NO:223)；
ii.相对于tau441的位置299-304或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)
iii.相对于tau441的位置330-335或残基HKPGGG(SEQ ID NO:224)；和
iv.相对于tau441的位置362-367或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)。
本发明也涉及与先前实施方案中所述的任何分离的抗体竞争结合tau蛋白的任何分离的抗体。在一个实施方案中，当相对于分离的DC8E8测试与tau蛋白的结合时，分离的抗体竞争结合tau蛋白。
在一些实施方案中，抗体包含包括SEQ ID NO.:141的轻链。在一些实施方案中，抗体包含包括SEQ ID NO.:138的轻链。在一些实施方案中，抗体包含包括SEQ ID NO.:141的轻链和包括SEQ ID NO.:138的轻链。
本发明规定由本发明提供的抗体可选自：
a)单克隆抗体；
b)多克隆抗体；
c)重组抗体；
d)嵌合抗体；
e)人源化抗体；
f)人抗体；和
g)(a)至(f)的任一者的抗原结合片段或抗原结合部分。
由本发明提供的任何分离的抗体都可在哺乳动物中产生。在某些实施方案中，分离的抗体是由重组动物或由重组宿主细胞产生。
本发明规定本文提供的任何分离的抗tau蛋白抗体都可是如此以致其用一种或多种标记剂可检测地标记。在某些实施方案中，至少一种标记剂选自酶、放射性同位素、荧光团、核磁共振标记物和重金属。
在一些实施方案中，抗体包含至少一种连接于抗体分子的药物(组合药剂)。
本发明也提供编码先前实施方案中所述的任何抗tau蛋白抗体的免疫球蛋白链的至少一种CDR或至少结合结构域或可变区的分离的核酸。也提供包含那些核酸的任一者的分离的载体。在一些实施方案中，本发明提供一种包含这些分离的核酸和载体的一者或多者的分离的宿主细胞。
在某些实施方案中，本发明提供一种表达先前实施方案中所述的任何抗tau蛋白抗体的分离的细胞系。在一个实施方案中，分离的细胞系是杂交瘤。在一个实施方案中，分离的细胞系是自其产生单克隆抗体DC8E8的杂交瘤，且所述细胞系已于2011年7月13日以ATCC专利保藏编号PTA-11994保藏在美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA,USA)。
本发明提供本文提供的任何抗tau蛋白抗体、核酸和细胞作为药物或制造用于诊断、预防或治疗阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的药剂的用途。
在一些实施方案中，抗体包含在医药组合物中，所述医药组合物进一步包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。在一个实施方案中，医药组合物包含抗体与药学上可接受的载体和/或稀释剂的组合，其中所述组合包含至少两种不同抗体，且其中所述抗体各自独立地选自先前实施方案中所述的抗体。在一个实施方案中，至少一种抗体是DC8E8或人形式的DC8E8或人源化形式的DC8E8。
在一些实施方案中，抗体包含在组合物中，所述组合物进一步包含稀释剂和/或载体。组合物可为医药组合物、诊断组合物或任何其它组合物。在一些实施方案中，组合物可进一步包含至少一种选自以下的化合物或试剂：可检测标记、匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、破伤风类毒素或源于其它病原细菌的类毒素、血清白蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白分子或其片段、甲状腺球蛋白、卵球蛋白、通用T细胞表位、细胞因子、趋化因子、白介素1-α(IL-1α)、IL-1β、IL-2、IL-10、干扰素-γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白1α(ΜΙΡ1α)、ΜΙΡ1β和RANTES(在活化后受调控，由正常T细胞表达和分泌)。
本发明也提供一种供医药或诊断使用的制品(例如试剂盒)，所述制品包括包装材料和容器，所述容器包括冻干形式的任何一种或多种本文提供的抗tau蛋白抗体的溶液。在某些实施方案中，容器是用于向受试者递送抗体的装置或系统的组成部分。
在一些实施方案中，本发明提供一种包括如本文提供的抗tau蛋白抗体(参见上文)的医学装置，其中所述装置适于通过至少一种选自以下的模式接触或施用所述抗体：胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、鞘内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、推注、经阴道、经直肠、经颊、舌下、鼻内和经皮。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变或预防其进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种本文提供的抗tau蛋白抗体。在一些实施方案中，所述方法能够减轻运动损伤、提高运动功能、减轻认知损伤、提高认知功能或能够实现其组合效果。
在某些实施方案中，本发明涉及一种改善至少一种与受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种本文提供的抗tau蛋白抗体。
在另一实施方案中，本发明提供一种针对受试者中存在阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变，或针对确定受试者显现阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的风险来诊断或筛选受试者的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者或所述受试者的细胞、组织、器官、流体或任何其它样本与有效量的至少一种如本文提供的抗tau蛋白抗体接触；以及
b)确定包含病理性tau蛋白和所述抗体的复合物的存在，其中存在所述复合物是对与存在病理性tau蛋白相关的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的诊断。
在一相关实施方案中，本发明提供一种针对受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的存在、进展、消退或稳定化，或针对确定受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的阶段来监测受试者的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者或所述受试者的细胞、组织、器官、流体或任何其它样本与有效量的至少一种本文提供的抗tau蛋白抗体接触；以及
b)确定包含病理性tau蛋白和所述抗体的复合物的存在和/或特征，其中存在所述复合物是对与存在病理性tau蛋白相关的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的诊断。
在一些实施方案中，抗体是静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、鼻内、脑室内、鞘内或以气雾剂形式施用。
在治疗受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变或预防其进展的方法和改善至少一种与受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状的方法的一些实施方案中，各抗体的每剂有效量是所述受试者的每kg体重对应至少1mg。在一些实施方案中，各抗体的每剂有效量是每kg受试者体重对应至少10mg。在一些实施方案中，历经至少6个月的时期以多次剂量施用至少一种抗体。在一些实施方案中，向人受试者外周施用抗体以施加其有益作用。在一些实施方案中，在向人受试者外周施用时，抗体结合可溶性tau蛋白、肌氨酰不溶性tau蛋白或两者。在一些实施方案中，在向人受试者外周施用时，抗体结合tau蛋白，其中tau蛋白呈一种或多种选自以下的病理性形式：人阿尔茨海默病患者的脑活检中、来自阿尔茨海默病的动物模型的脑样本中的错序tau蛋白、错误无序tau蛋白、肌氨酰不溶性tau蛋白、神经原纤维缠结、神经原纤维网线和神经炎斑块。在一些实施方案中，在向人受试者外周施用时，抗体施加一种或多种效应子功能介导的对受试者的有益作用。在一些实施方案中，通过将抗体表达性细胞注射/植入至受试者的脑中来将抗体递送至外周中。在一些实施方案中，抗体表达性细胞是杂交瘤细胞。在一些实施方案中，杂交瘤细胞是表达DC8E8的杂交瘤。
在某些相关实施方案中，本发明提供一种分离的肽，其中：
a)所述分离的肽是tau蛋白的长度是至少6个氨基酸残基、长度是至少7个氨基酸残基、长度是至少9个氨基酸残基、长度是至少10个氨基酸残基、长度是至少12个氨基酸残基或长度是30个氨基酸残基的片段；以及
b)所述分离的肽包含tau蛋白治疗表位。
在一些相关实施方案中，治疗表位包括选自以下位置内的那些的治疗表位：
i.相对于tau441的位置267-273或残基KHQPGGG(SEQ ID NO:98)；
ii.相对于tau441的位置298-304或残基KHVPGGG(SEQ ID NO:99)
iii.相对于tau441的位置329-335或残基HHKPGGG(SEQ ID NO:100)；和
iv.相对于tau441的位置361-367或残基THVPGGG(SEQ ID NO:101)。
在某些相关实施方案中，本发明提供一种分离的肽，其中：
a)所述分离的肽是tau蛋白的长度是至少6个氨基酸残基、长度是至少7个氨基酸残基、长度是至少9个氨基酸残基、长度是至少10个氨基酸残基、长度是至少12个氨基酸残基或长度是30个氨基酸残基的片段；以及
b)所述分离的肽包含tau蛋白治疗表位。
在一些相关实施方案中，治疗表位包括选自以下位置内的那些的治疗表位：
i.相对于tau441的位置268-273或残基HQPGGG(SEQ ID NO:223)；
ii.相对于tau441的位置299-304或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)
iii.相对于tau441的位置330-335或残基HKPGGG(SEQ ID NO:224)；和
iv.相对于tau441的位置362-367或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)。
在一些相关实施方案中，治疗表位选自：
i.相对于tau441的位置268-273或残基HQPGGG(SEQ ID NO:223)；
ii.相对于tau441的位置299-304或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)
iii.相对于tau441的位置330-335或残基HKPGGG(SEQ ID NO:224)；和
iv.相对于tau441的位置362-367或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)。
在其它实施方案中，分离的肽是选自以下的序列：SEQ ID NO:1-4、SEQID NO:9-101和SEQ ID NO:108-112、NIKAVPGGGS(SEQ ID NO:200)、NIKHVPGGGS(SEQ ID NO:201)、IKHVPGGGS(SEQ ID NO:202)、KHVPGGGSV(SEQ ID NO:203)、HVPGGGSVQ(SEQ ID NO:204)、VPGGGSVQ(SEQ ID NO:205)、GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)、SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)、ANIKHVPGGGS(SEQ ID NO:144)、DAIKHVPGGGS(SEQ ID NO:146)、DNAKHVPGGGS(SEQ ID NO:149)、DNIAHVPGGGS(SEQ ID NO:151)、DNIKAVPGGGS(SEQ ID NO:159)、DNIKHAPGGGS(SEQ ID NO:161)以及DNIKHVPGGGS(SEQ ID NO:171)。
在其它实施方案中，分离的肽是选自以下的序列：SEQ IDNO:270(TENLKHQPGGGK)；SEQ ID NO:271(KHQPGGG)、SEQ IDNO:272(HQPGGG)；SEQ IDNO:275(ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS)、SEQ ID NO:276(KHVPGGG)、SEQ ID NO:277(HVPGGG)、SEQ IDNO:280(DNIKHVPGGGSVQIVYKPV)、SEQ ID NO:281(HHKPGGG)、SEQ IDNO:282(HKPGGG)和SEQ ID NO:283(THVPGGG)。
在其它实施方案中，分离的肽是选自以下的序列：SEQ IDNO:270(TENLKHQPGGGK)；SEQ ID NO:271(KHQPGGG)、SEQ IDNO:272(HQPGGG)；SEQ IDNO:275(ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS)、SEQ ID NO:276(KHVPGGG)、SEQ ID NO:277(HVPGGG)、SEQ IDNO:280(DNIKHVPGGGSVQIVYKPV)、SEQ ID NO:281(HHKPGGG)、SEQ IDNO:282(HKPGGG)和SEQ ID NO:283(THVPGGG)；且治疗表位选自：
i.相对于tau441的位置268-273或残基HQPGGG(SEQ ID NO:223)；
ii.相对于tau441的位置299-304或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)
iii.相对于tau441的位置330-335或残基HKPGGG(SEQ ID NO:224)；和
iv.相对于tau441的位置362-367或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)。
在其它实施方案中，分离的肽是选自以下的序列：SEQ IDNO:272(HQPGGG)和SEQ ID NO:277(HVPGGG)。
在某些实施方案中，分离的肽在至少一种选自测量肽的以下能力的测定的测定中具有活性：
a)与tau蛋白竞争结合单克隆抗体DC8E8的能力；
b)体内降低肌氨酰不溶性tau蛋白的水平的能力；
c)体内促进tau蛋白自脑清除的能力；
d)体内降低AD的至少一种生物化学标记物的水平的能力；
e)体内降低神经原纤维缠结(NFT)载荷的能力；
f)体内提高至少一种神经行为参数的能力；
g)有益改进受试者的AD的过程的能力；
h)降低脑中、脑脊髓液中或两者中的tau蛋白的水平的能力；和/或
i)在制备能够与单克隆DC8E8竞争结合tau蛋白的抗体中充当免疫原的能力。
本发明也涉及包含本文提供的任何分离的肽和部分的化合物。在某些实施方案中，所述部分在肽的N末端、C末端或连接于内部氨基酸，且其中所述部分选自以下一者或多者：半胱氨酸残基、磷酸基团、匙孔血蓝蛋白、破伤风类毒素或源于其它病原细菌的类毒素、血清白蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白分子或其片段、甲状腺球蛋白、卵球蛋白、通用T细胞表位、细胞因子、趋化因子、白介素1-α(IL-1α)、IL-1β、IL-2、IL-10、干扰素-γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白1α(ΜΙΡ1α)、ΜΙΡ1β和RANTES(在活化后受调控，由正常T细胞表达和分泌)。
也提供包含一种或多种由本发明提供的分离的肽和/或化合物以及药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂的医药组合物。在一些实施方案中，医药组合物适合于提供剂量在1ng与10mg之间的肽或化合物。在某些实施方案中，医药组合物适合于提供剂量大于10微克的肽或化合物。
本发明也涉及一种供医药或诊断使用的制品(例如试剂盒)，所述制品包括包装材料和容器，所述容器包括由本发明提供的冻干形式的肽和/或化合物的溶液。在一些实施方案中，容器是用于向受试者递送肽或化合物的装置或系统的组成部分。
也提供包括如由本发明提供的肽、化合物和/或肽/化合物组合物的医学装置，其中所述装置适于通过至少一种选自以下的模式接触或施用所述抗体：胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、鞘内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、推注、经阴道、经直肠、经颊、舌下、鼻内和经皮。
在相关实施方案中，本发明提供一种治疗受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变或预防其进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如由本发明提供的至少一种肽和/或至少一种化合物。在一些实施方案中，所述方法能够减轻运动损伤、提高运动功能、减轻认知损伤、提高认知功能或能够实现其组合效果。
在相关实施方案中，本发明提供一种改善至少一种与受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如由本发明提供的至少一种肽和/或至少一种化合物。
在这些治疗、预防或改善至少一种与受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状的方法的一些中，包括一种改善至少一种与受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状的方法，所述方法包括向人患者施用如由本发明提供的肽和/或化合物和/或增大免疫反应的佐剂，所述方法实现包含针对病理性tau蛋白的抗体的免疫反应，由此治疗至少一种与所述人患者的AD相关的症状、预防其进展或改善所述至少一种症状。
本发明也提供一种产生能够与DC8E8竞争结合tau蛋白的抗体的方法，所述方法包括用如由本发明提供的至少一种肽和/或至少一种化合物使受试者免疫。在一些实施方案中，至少一种肽是选自以下任一者的肽：SEQ IDNO:1-4、SEQ ID NO:9-101和SEQ ID NO:108-112、NIKHVPGGGS(SEQ IDNO:201)、IKHVPGGGS(SEQ ID NO:202)、KHVPGGGSV(SEQ ID NO:203)、HVPGGGSVQ(SEQ ID NO:204)、VPGGGSVQ(SEQ ID NO:205)、GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)、SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)、ANIKHVPGGGS(SEQ ID NO:144)、DAIKHVPGGGS(SEQ ID NO:146)、DNAKHVPGGGS(SEQ ID NO:149)、DNIAHVPGGGS(SEQ ID NO:151)、DNIKAVPGGGS(SEQ ID NO:159)、DNIKHAPGGGS(SEQ ID NO:161)以及DNIKHVPGGGS(SEQ ID NO:171)。在一个实施方案中，肽选自SEQ IDNO:1-4。在另一实施方案中，肽是SEQ ID NO.108。在一个实施方案中，肽是GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)。在某些实施方案中，肽是SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)。在某些实施方案中，肽选自SEQ IDNO:270(TENLKHQPGGGK)；SEQ ID NO:271(KHQPGGG)、SEQ IDNO:272(HQPGGG)；SEQ IDNO:275(ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS)、SEQ ID NO:276(KHVPGGG)、SEQ ID NO:277(HVPGGG)、SEQ IDNO:280(DNIKHVPGGGSVQIVYKPV)、SEQ ID NO:281(HHKPGGG)、SEQ IDNO:282(HKPGGG)和SEQ ID NO:283(THVPGGG)。在其它实施方案中，肽选自SEQ ID NO:272(HQPGGG)和SEQ ID NO:277(HVPGGG)。
也提供一种分离DC8E8或分离能够与DC8E8竞争结合tau蛋白的抗体的方法，所述方法包括使DC8E8或所述抗体与如由本发明提供的肽和/或化合物接触。
在相关实施方案中，本发明提供一种针对受试者中存在阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变，或针对确定受试者显现阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的风险来诊断或筛选受试者的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者或所述受试者的细胞、组织、器官、流体或任何其它样本与有效量的至少一种如由本发明提供的抗体接触；以及
b)确定包含病理性tau蛋白和所述抗体的复合物的存在，其中存在所述复合物是对与存在病理性tau蛋白相关的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的诊断。
在某些实施方案中，本发明提供一种针对阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的存在、进展、消退或稳定化，或针对确定受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的阶段来监测受试者的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者、或所述受试者的细胞、组织、器官、流体或任何其它样本与有效量的至少一种如由本发明的至少一个实施方案提供的抗体接触(例如施用)；以及
b)确定包含病理性tau蛋白和所述抗体的复合物的存在和/或特征，其中存在所述复合物是对与存在病理性tau蛋白相关的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的诊断。
在针对阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的存在、进展、消退或稳定化，或针对确定受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的阶段来监测受试者的方法的一些实施方案中，抗体、肽和/或化合物是静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、鼻内、脑室内、鞘内或以气雾剂形式施用。在一些实施方案中，各肽和/或化合物的有效量是每剂至少1μg、每剂至少10μg、每剂至少100μg。在一些实施方案中，各肽和/或化合物的有效量是在佐剂存在下每剂至少10μg，以及在不存在佐剂下每剂至少100μg。在一些实施方案中，历经至少6个月的时期以多次剂量施用至少一种肽或化合物。
根据一相关实施方案，本发明提供一种治疗受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变或预防其进展的方法，所述方法包括与至少一种选自以下的组合药剂组合向所述受试者施用有效量的如由本发明提供的至少一种抗体和/或至少一种肽和/或至少一种化合物：乙酰胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂、过渡金属螯合剂、生长因子、激素、非类固醇消炎药物(NSAID)、抗氧化剂、脂质降低剂、选择性磷酸二酯酶抑制剂、tau蛋白聚集抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂、抗淀粉状蛋白被动和主动免疫剂、抗淀粉状蛋白聚集抑制剂和分泌酶抑制剂。在一些实施方案中，所述方法能够减轻运动损伤、提高运动功能、减轻认知损伤、提高认知功能或能够实现其组合效果。
在一相关实施方案中，本发明提供一种改善至少一种与受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状的方法，所述方法包括与至少一种选自以下的组合药剂组合向所述受试者施用有效量的如由本发明提供的至少一种抗体、至少一种肽和/或至少一种化合物：乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂、过渡金属螯合剂、生长因子、激素、非类固醇消炎药物(NSAID)、抗氧化剂、脂质降低剂、选择性磷酸二酯酶抑制剂、tau蛋白聚集抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂、抗淀粉状蛋白被动和主动免疫试剂、抗淀粉状蛋白聚集抑制剂和分泌酶抑制剂。
在治疗、预防或改善至少一种与受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状的方法的一些实施方案中，所述方法包括与至少一种选自以下的组合药剂组合向人患者施用有效量的如由本发明提供的至少一种抗体、至少一种肽和/或至少一种化合物和/或增大免疫反应的佐剂：乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂、过渡金属螯合剂、生长因子、激素、非类固醇消炎药物(NSAID)、抗氧化剂、脂质降低剂、选择性磷酸二酯酶抑制剂、tau蛋白聚集抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂、抗淀粉状蛋白被动和主动免疫剂、抗淀粉状蛋白聚集抑制剂和分泌酶抑制剂；其中所述方法实现包含针对病理性tau蛋白的抗体的免疫反应，由此治疗至少一种与所述人患者的AD相关的症状、预防其进展或改善所述至少一种症状。
在治疗、预防或改善至少一种与受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状的方法的一些实施方案中，在施用如由本发明提供的抗体、肽和/或化合物之前、与之同时、或之后施用组合药剂。
在一相关实施方案中，本发明也提供一种医药组合物，所述医药组合物包含药学上可接受的载体和/或稀释剂；和
a)如由本发明提供的抗体；和/或
b)如由本发明提供的肽；和/或
c)如由本发明提供的化合物；
以及至少一种选自以下的组合药剂：乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂、过渡金属螯合剂、生长因子、激素、非类固醇消炎药物(NSAID)、抗氧化剂、脂质降低剂、选择性磷酸二酯酶抑制剂、tau蛋白聚集抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂、抗淀粉状蛋白被动和主动免疫试剂、抗淀粉状蛋白聚集抑制剂和分泌酶抑制剂。在一些实施方案中，抗体是DC8E8。在某些实施方案中，抗体包含至少一个来自DC8E8的CDR。在一些实施方案中，抗体包含至少一个来自DC8E8的可变链(轻链或重链)。在某些实施方案中，可使用人源化或人形式的DC8E8。在一些实施方案中，至少一种肽选自以下任一者：SEQ ID NO:1-4、SEQ ID NO:9-101和SEQ IDNO:108-112、NIKHVPGGGS(SEQ ID NO:201)、IKHVPGGGS(SEQ IDNO:202)、KHVPGGGSV(SEQ ID NO:203)、HVPGGGSVQ(SEQ ID NO:204)、VPGGGSVQ(SEQ ID NO:205)、GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)、SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)、ANIKHVPGGGS(SEQ ID NO:144)、DAIKHVPGGGS(SEQ ID NO:146)、DNAKHVPGGGS(SEQ ID NO:149)、DNIAHVPGGGS(SEQ ID NO:151)、DNIKAVPGGGS(SEQ ID NO:159)、DNIKHAPGGGS(SEQ ID NO:161)以及DNIKHVPGGGS(SEQ ID NO:171)。在一个实施方案中，肽选自SEQ ID NO:1-4。在另一实施方案中，肽是SEQID NO.:108。在一个实施方案中，肽是GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)。在某些实施方案中，肽是SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)。在某些实施方案中，肽选自SEQ ID NO:270(TENLKHQPGGGK)；SEQ IDNO:271(KHQPGGG)、SEQ ID NO:272(HQPGGG)；SEQ IDNO:275(ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS)、SEQ ID NO:276(KHVPGGG)、SEQ ID NO:277(HVPGGG)、SEQ IDNO:280(DNIKHVPGGGSVQIVYKPV)、SEQ ID NO:281(HHKPGGG)、SEQ IDNO:282(HKPGGG)和SEQ ID NO:283(THVPGGG)。在其它实施方案中，肽选自SEQ ID NO:272(HQPGGG)和SEQ ID NO:277(HVPGGG)。
实施方案的其它目标和优势将部分地阐述于随后描述中，且部分地将根据描述显而易知，或可通过实施实施方案加以认识。实施方案的目标和优势将借助于随附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。
应了解上文一般性描述与下文详述两者均仅具有示例性和说明性且不限制如所要求的实施方案。
并入本说明书中且构成本说明书的一部分的附图说明若干实施方案且连同描述一起用于说明实施方案的原理。本文论述的公布仅因其公开内容在本申请的提交日期之前而提供。它们都出于所有目的以引用的方式整体并入本文。本文中没有内容应解释为承认本发明由于先前发明而无权先于所述公布。此外，提供的公布日期可不同于可需要独立确认的实际公布日期。
附图简述
图1：人tau蛋白的六种亚型的示意图。
图2：人tau蛋白(2N4R)的示意性功能图。图2将“VQIINK”和“VQIVYK”分别公开为SEQ ID NO116和115。
图3：DC8E8可变区的核苷酸和氨基酸序列及其与最密切小鼠生殖系序列的比对。所述图显示核苷酸(SEQ ID NO:165)(A)和氨基酸(按照出现顺序分别是SEQ ID NO141(用于可变轻链)和117-119(用于其CDR的各者，根据IMGT)；(B)DC8E8的可变轻(VL)链区域的序列(比对按照出现顺序分别公开SEQ ID NO166和168)；和(C)DC8E8的可变轻链V基因与最密切小鼠生殖系序列IGKV8-21*01的比对(比对按照出现顺序分别公开SEQ ID NO166和167；随后是DC8E8的VL J基因(SEQ ID NO:168)与最密切小鼠J基因IGKJ1*01(SEQ ID NO:169)的比对)。所述图显示DC8E8的可变重链的核苷酸(SEQ ID NO:170)(在D中)和氨基酸序列及其三个CRD(按照出现顺序分别是SEQ ID NO171和120-122)序列。在(F)中显示DC8E8的以下比对：首先，DC8E8的可变重(VH)链V基因(SEQ ID NO172)与最密切小鼠生殖系序列IGHV1-81*01(SEQ ID NO172)；其次，DC8E8的可变重(VH)链D基因(SEQ IDNO174)与最密切小鼠生殖系序列IGHD2-14*01(SEQ ID NO175)；以及最后，DC8E8的可变重(VH)链J基因(SEQ ID NO176)与最密切小鼠生殖系序列IGHJ4*01(SEQ ID NO177)。也显示DC8E8κ轻链恒定区的序列(SEQ IDNO:178)(G)和重链恒定区的序列(SEQ ID NO:179)(H)。在蛋白质序列(B)和(E)中对互补决定区(CDR)加下划线且根据IMGT编号系统加以鉴定。
图4：DC8E8可变轻(VL)链序列(分别是SEQ ID NO166(V基因)和168(J基因))与最密切人生殖系VL基因(按照出现顺序分别是SEQ ID NO180-181)的比对。
图5：DC8E8可变重(VH)链序列(分别是用于V、D和J基因的SEQ ID NO172、174和176)与最密切人生殖系VH基因(按照出现顺序分别是SEQ ID NO182-183和185)的比对。
图6：使用ELISA通过tau蛋白缺失突变体对DC8E8的表位定位。(A)用于DC8E8表位定位的tau蛋白的示意图，和(B)它们的氨基酸序列(按照出现顺序分别是SEQ ID NO186-197、102、104和198-199)。(C)ELISA读数。DC8E8识别以下tau蛋白：Δ358-441、Δ421-441、Δ134-168、Δ1-220、Δ1-126、2N4R、2N3R、Δ(1-296；392-441)和Δ(1-150；392-441)/4R。DC8E8不识别以下tau蛋白：Δ222-427、Δ306-400、Δ228-441、Δ300-312、Δ257-400、Δ137-441、Δ283-441。
图7：(A)和(B)分别是用于表位定位的合成肽(按照出现顺序分别是SEQID NO206、207、208、2、210、211、212、3、214、215、4、217、26、219、36、221、222、109和88)及其序列的示意图。(C)通过ELISA用合成肽对DC8E8的表位定位。(D)tau蛋白内DC8E8能够结合的表位的示意图。DC8E8能够结合四个单独结合区的的任一者，其中所述结合区各自是名为表位1至4的单独表位。四个表位各自分别位于tau蛋白的第1(1号表位)、第2(2号表位)、第3(3号表位)和第4(4号表位)重复结构域内。如所示，四个DC8E8表位各自分别涵盖在以下氨基酸序列的各者之一内：分别是267-KHQPGGG-273(SEQ ID NO:98)(在tau蛋白的第1重复结构域内)、298-KHVPGGG-304(SEQ ID NO:99)(在tau蛋白的第2重复结构域内)、329-HHKPGGG-335(SEQ ID NO:100)(在tau蛋白的第3重复结构域内)和361-THVPGGG-367(SEQ ID NO:101)(在tau蛋白的第4重复结构域内)。
图8：(A)人tau蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:225)与来自其它物种的tau蛋白序列(按照出现顺序分别是SEQ ID NO226-245)的比对。全长人tau蛋白用于比对；仅显示来自比对的人tau蛋白的氨基酸265-368。对包含人tau蛋白和所比对序列上的四个单独DC8E8表位的区域加框且用粗体显示。(B)显示6种tau肽(按照出现顺序分别是SEQ ID NO201-205和200)与tauΔ(1-150；392-441)/4R(SEQ ID NO:199)竞争结合抗体DC8E8的能力的竞争ELISA，所述抗体DC8E8能够识别tau蛋白-tau蛋白聚集中涉及的至少一种tau表位，(C)显示7种tau肽(SEQ ID NO144、146、149、151、159、161和171)与tauΔ(1-150；392-441)/4R竞争结合抗体DC8E8的能力竞争ELISA，所述抗体DC8E8能够识别tau蛋白-tau蛋白聚集中涉及的至少一种tau表位。
图9：(A).用以表征DC8E8与tauΔ(1-150；392-441)/4R和2N4R的结合的表面等离子体共振(SPR)。(B).用以表征DC8E8与tauΔ(1-150；392-441)/3R和2N3R的结合的表面等离子体共振(SPR)。
图10：(A).DC8E8结合tauΔ(1-150；392-441)/4R和tau蛋白2N4R的缔合和解离速率，如通过SPR所测定。(B).DC8E8结合tauΔ(1-150；392-441)/3R和tau蛋白2N3R的缔合和解离速率，如通过SPR所测定。用于测量中的浓度指示在图中，虚线是通过电脑程序BIA评估软件4.1(Biacore AB)根据用于动力学参数计算的测量数据加以内插。
图11：单克隆抗体DC8E8能够区分临床前AD、临床初期AD和充分发展的末期AD。DC8E8显示对处于人临床前AD布拉克氏第I阶段的早期阶段(tau蛋白单体、二聚体)的病理性tau蛋白的染色。(A).抗体识别以下阶段：病理性tau蛋白寡聚物(箭号)和病理性tau蛋白聚合物(缠结)(箭头)。(B).在充分发展的阿尔茨海默病(末期-布拉克氏第VI阶段)中，DC8E8主要识别呈神经原纤维缠结(箭头)、神经炎斑块(在圆圈内部)和神经炎线(在五边形内部)形式的病理性tau蛋白聚合物(C).标尺：100μm。单克隆抗体DC8E8识别阿尔茨海默病中的所有发展阶段的缠结构造(D).DC8E8识别早期发展阶段的缠结构造-单体、二聚体和早期寡聚阶段(D1)、和晚期寡聚缠结前阶段(D2)以及晚期发展阶段的病理性tau蛋白聚合物-细胞内(D3)和细胞外神经原纤维缠结(D4)。箭头指示在金字塔形海马神经元内部的小寡聚tau蛋白聚集体(D1)。标尺：10μm
图12：(A)单克隆抗体DC8E8识别转基因大鼠SHR72中的神经原纤维变性。DC8E8识别tau蛋白寡聚阶段(箭号)和缠结阶段(箭头)的tau蛋白神经变性。此外，抗体与位于轴索纤维中的错误折叠tau蛋白(在矩形内部)反应。(B)在年龄匹配的对照大鼠脑中，抗体不显示神经元内染色。标尺：20μm。与人阿尔茨海默病中一样，DC8E8也识别转基因大鼠脑(SHR72)中的所有发展阶段的缠结构造。DC8E8识别早期发展阶段的缠结构造-单体、二聚体和早期寡聚阶段(C)、和晚期寡聚缠结前阶段(D)以及晚期发展阶段的病理性tau蛋白聚合物-细胞内(E)和细胞外神经原纤维缠结(丢失核)(F)。(C)中的箭头指示在神经元内部的小寡聚tau蛋白聚集体(A)。标尺：10μm
图13：(A)DC8E8对表达tauΔ(1-150；392-441)/3R的SHR24转基因大鼠的皮质中的神经原纤维缠结的染色。(B)DC8E8识别表达tauΔ(1-150；392-441)/4R的转基因大鼠SHR72的脑干中的神经原纤维缠结。用甲基绿对组织切片进行对比染色。箭号-神经原纤维缠结。标尺：50μm
图14：单克隆抗体DC8E8识别自转基因大鼠模型SHR24(同型皮质)和阿尔茨海默病患者(包括海马、内嗅和颞叶皮质的异型皮质组织)分离的脑样本中的可溶性tau蛋白(A)与不溶性tau蛋白(B)两者。箭头-人截短tau蛋白，箭号-大鼠内源性tau蛋白。对于可溶性tau蛋白部分，每个泳道装载15μg蛋白质。对于不溶性tau蛋白部分，将团块溶解于体积是1S的1/50的1x十二烷基硫酸钠(SDS)样本装载缓冲液中，装载与在可溶性部分的情况下相同的体积。单克隆抗体DC8E8识别自阿尔茨海默病患者(包括海马、内嗅和颞叶皮质的异型皮质组织)(C)和自转基因大鼠模型SHR72(脑干)(D)分离的脑样本中的可溶性tau蛋白(A)与不溶性tau蛋白(B)两者。箭号-生理性人tau蛋白(A)和大鼠内源性tau蛋白(B)，箭头-在SHR72大鼠的神经元中以转基因形式表达的人截短tau蛋白(tauΔ(1-150；392-441)/4R)(D)。对于可溶性tau蛋白部分，每个泳道装载15μg总蛋白。对于不溶性tau蛋白部分，将团块溶解于体积是1S的1/50的1x十二烷基硫酸钠(SDS)样本装载缓冲液中，装载与在可溶性部分的情况下相同的体积
图15：DC8E8在基于荧光的tau蛋白纤维化测定中抑制病理性tau蛋白-tau蛋白相互作用。TauΔ(1-150；392-441)/4R(图15A)或tauΔ(1-296；392-441)/4R(图15B)由肝素诱导来经受构象变化和纤维化，如通过硫代黄素T荧光所测量；测试mAb DC8E8、Rab50和DC11阻止病理性构象变化的能力。
图16：通过使用HRP缀合的mAb DC25进行免疫印迹来分析DC8E8阻止由截短tau蛋白tauΔ(1-296；392-441)/4R形成tau蛋白二聚体、三聚体和寡聚物的抑制潜力。
图17：由小神经胶质细胞BV2细胞对TauΔ(1-150；392-441)/4R的摄取和降解。单独(1μΜ)或与单克隆抗体DC8E8(1μΜtauΔ(1-150；392-441)/4R+1μΜDC8E8)复合添加TauΔ(1-150；392-441)/4R至小鼠BV2细胞中。在孵育各种时长(2、4、6和12小时)之后，用酸洗涤BV2细胞，提取细胞蛋白质且通过用全tau蛋白抗体DC25进行蛋白质印迹来分析内化tau蛋白的水平。对细胞溶解产物中(细胞内tau蛋白)(A)和细胞培养基中(细胞外tau蛋白)(B)的TauΔ(1-150；392-441)/4R进行免疫标记。用抗小鼠HRP缀合的抗体观察DC8E8抗体。每个泳道装载20μg蛋白质。
图18：如通过ELISA测试的DC8E8在37℃下的稳定性(保存期限)。在储存数月(1、2、3和4个月)之后，抗体识别tauΔ(1-150；392-441)/4R。棒条代表如所指示的抗体连续稀释度。一式三份进行测量。
图19：DC8E8识别且靶向人阿尔茨海默病的脑组织中的错误折叠(患病)tau蛋白。(A)用全tau蛋白DC25抗体进行的蛋白质印迹分析：
1)自人阿尔茨海默病的脑组织生物化学提取病理性tau蛋白(Greenberg和Davies,1989)；
2)模拟抗体(Rab50)不识别tau蛋白；
3)DC8E8识别且靶向人阿尔茨海默病的脑组织中的错误折叠(患病)tau蛋白；以及
(B)丽春红S染色：2)、3)用于实验中的抗体量(Rab50和DC8E8)的控制。
图20：DC8E8识别且靶向AD的SHR72大鼠模型的脑组织中的错误折叠(患病)tau蛋白。(A)用全tau蛋白DC25抗体进行的蛋白质印迹分析：
4)自人阿尔茨海默病的脑组织生物化学提取病理性tau蛋白(Greenberg和Davies,1989)；
5)模拟抗体(Rab50)不识别tau蛋白；
6)DC8E8识别且靶向人阿尔茨海默病的脑组织中的错误折叠(患病)tau蛋白；以及
(B)丽春红S染色：2)、3)用于实验中的抗体量(Rab50和DC8E8)的控制。
图21：在体内，DC8E8靶向转基因大鼠(SHR72)的脑中的病理性形式的tau蛋白且将病理性tau蛋白自脑转运至外周血液中。(A)DC8E8处理的动物的血清中的DC8E8抗体的浓度分别达到466、200和273μg/ml。(B)观察到DC8E8-tau蛋白复合物自脑体内转运至外周血液中。病理性tau蛋白达到平均血清浓度350pg/ml。由DC8E8达成的tau蛋白主动转运消除来自脑的病理性tau蛋白。另一方面，在用识别狂犬病病毒的模拟抗体(Rab50)(Macikova等,1992)处理的动物的血清中未检测到tau蛋白。通过Innotest hTAUELISA(Innogenetics,Belgium)测定处理的动物的血清中的tau蛋白的浓度。图显示连同标准平均误差(SEM)的平均值。大鼠A-C的8个棒条各自指示不同连续血清稀释度(从左至右，自100倍至12,800倍)。
图22：DC8E8单克隆抗体自转基因大鼠(SHR72)的脑移除病理性tau蛋白。(A)相较于模拟处理的动物(右侧版面)，脑内施用DC8E8(左侧版面)自神经元移除(箭号)病理性tau蛋白。(B)对模拟处理的动物和DC8E8处理的动物的神经元中的病理性tau蛋白的量的定量显示用DC8E8处理的动物中的病理性tau蛋白的量根本性降低(p<0.0001)。
图23：在细菌中表达的单克隆抗体DC8E8的重组scFv片段(scDC8E8v)识别病理性错误无序tauΔ(1-150；392-441)/4R。(A)对对照BL21细菌和具有scDC8E8v表达质粒的细菌的通过10％SDS-PAGE加以分离的粗溶解产物的考马斯亮蓝染色：泳道1，对照BL21细菌的粗溶解产物；泳道2，表达scDC8E8v的BL21细菌的粗溶解产物；和泳道M，蛋白质分子量标记物(PageRuller预先染色蛋白质阶梯#SM0672，Fermentas)。(B)丽春红S染色的含有tau蛋白的硝酸纤维素膜：泳道1，tauΔ(1-150；392-441)/4R，500ng；泳道2，tauΔ(1-150；392-441)/4R，250ng；泳道3，tauΔ(1-150；392-441)/4R，125ng；泳道4tauΔ228-441，50ng；和泳道M，蛋白质分子量标记物。(C)蛋白质印迹/含有tau蛋白的硝酸纤维素膜，所述tau蛋白如B)中加以装载，用来自表达scDC8E8v的细菌的溶解产物检测。(D)蛋白质印迹/含有tau蛋白的硝酸纤维素膜，所述tau蛋白如B)中加以装载，用阴性对照细菌溶解产物显色。
图24：单克隆抗体DC8E8的重组scFv片段(scDC8E8v)展现与DC8E8抗体-选择性识别tauΔ(1-150；392-441)/4R类似的tau蛋白结合性质。(A)通过SPR测定scDC8E8v结合AD tauΔ(1-150；392-441)/4R的动力学亲和力。(B)通过SPR测定scDC8E8v结合tau蛋白2N4R的动力学亲和力。(C)scDC8E8v结合的速率常数(k缔合和k解离)和缔合平衡常数。
图25：鉴定scDC8E8v结合位点中影响scDC8E8v/DC8E8识别错误无序tau蛋白的残基。(A)在自具有scDC8E8v表达质粒(wt)及其突变形式的BL21细菌的粗溶解产物分离蛋白质之后，聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色。各编号泳道对应于相应克隆编号(例如泳道2对应于2-VL-R33A)。表达的单链蛋白质由星号指示。对照细菌培养物不表达单链蛋白质。(B)丽春红S染色的含有tau蛋白的硝酸纤维素膜：泳道1，tauΔ(1-150；392-441)/4R，500ng；泳道2，tauΔ(1-150；392-441)/4R，250ng；泳道3，tauΔ(1-150；392-441)/4R，125ng。(C)对含有tau蛋白的硝酸纤维素膜的蛋白质印迹，所述tau蛋白如B)中加以装载，用来自表达scDC8E8v(wt凝胶)或其一种突变形式(印迹1-VL-N31A至22-VH-G102A)的细菌的溶解产物检测。
图26：(A)在残基261与373之间的放大区域(SEQ ID NO.246)内具有阴影框中所示的分别为SEQ ID NO98-101的四个DC8E8表位的tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:102)的示意图。(1)用作主动疫苗或用于纯化DC8E8抗体等的重叠tau蛋白源性肽免疫原的示意图，所述免疫原包含由DC8E8抗体识别的tau蛋白的四个区域的至少一者；(2)具有任选部分的其它修饰和设计肽和化合物的一般可能性。(B)对自用肽SEQ ID NO1-8和108处理的转基因大鼠(SHR72，表达tauΔ(1-150；392-441)/4R)的脑干制备的不溶性tau蛋白的免疫印迹分析的概述。用各种mAb进行免疫印迹分析以确定具有以下AD相关表位的不溶性tau蛋白的降低：mAb DC25(tau蛋白347-353)、mAbDC217(tau蛋白pThr217)、mAb DC209(tau蛋白pThr231)、mAb AT8(tau蛋白pSer202/pThr205)和mAb AT270(tau蛋白pThr181)。(C)对自用与佐剂组合的tau蛋白251-PDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINK-280(SEQ IDNO:1)处理的大鼠和自用单独佐剂处理的对照大鼠的脑干制备的不溶性tau蛋白的密度计量免疫印迹分析。平均值与标准平均误差一起呈现。
图27：对用tau蛋白251-PDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINK-280(SEQ ID NO:1)处理的模拟AD的转基因大鼠(SHR72)的神经行为评估。在第5剂免疫原之后10天，转基因大鼠用于行为测试。图代表平均值±SEM。所有统计数据都是使用非参数曼-惠特尼U检验获得。(A)横杆行走测试(3.5横杆)。(B)后肢滑动的次数(3.5横杆)。(C)神经量表。
图28：用tau肽SEQ ID NO:1对转基因大鼠SHR72疫苗接种导致神经原纤维缠结(NFT)载荷降低49％。抗体AT8用于评估转基因大鼠SHR72的脑组织中的NFT。
图29：对自用tau蛋白256-VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLS-285(SEQ ID NO:2)连同佐剂处理的转基因大鼠(SHR72)或用单独佐剂处理的对照大鼠的脑干制备的不溶性tau蛋白的定量免疫印迹分析。平均值与标准平均误差一起呈现。
图30：对用tau蛋白256-VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLS-285(SEQ ID NO:2)处理的转基因大鼠(SHR72)的神经行为评估。所有统计数据都是使用非参数曼-惠特尼U检验获得。(A)横杆行走测试(3.5横杆)。(B)后肢滑动的次数(3.5横杆)。(C)神经量表。
图31：用tau肽SEQ ID NO:2对转基因大鼠SHR72疫苗接种导致神经原纤维缠结(NFT)载荷降低60％。抗体AT8用于评估转基因大鼠SHR72的脑组织中的NFT。
图32：对自用具有磷酸化Ser262的tau蛋白256-VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLS-285(SEQ ID NO:2)连同佐剂处理的转基因大鼠(SHR72)或用单独佐剂处理的对照大鼠的脑干制备的不溶性tau蛋白的定量免疫印迹分析。平均值与标准平均误差一起呈现。
图33：用tau肽SEQ ID NO:2/磷酸基对转基因大鼠SHR72疫苗接种导致神经原纤维缠结(NFT)载荷降低77％。抗体AT8用于评估转基因大鼠SHR72的脑组织中的NFT。
图34：对自用tau蛋白259-KIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQ-288(SEQ ID NO:3)连同佐剂处理的转基因大鼠(SHR72)或用单独佐剂处理的对照大鼠的脑干制备的不溶性tau蛋白的定量免疫印迹分析。平均值与标准平均误差一起呈现。
图35：对用tau蛋白259-KIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQ-288(SEQ ID NO:3)处理的转基因大鼠(SHR72)的神经行为评估。所有统计数据都是使用非参数曼-惠特尼U检验获得。(A)横杆行走测试(3.5横杆)。(B)后肢滑动的次数(3.5横杆)。(C)神经量表。
图36：用tau肽SEQ ID NO:3对转基因大鼠SHR72疫苗接种导致神经原纤维缠结(NFT)载荷降低58％。抗体AT8用于评估转基因大鼠SHR72的脑组织中的NFT。
图37：对自用tau蛋白275-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304(SEQ ID NO:4)处理的转基因大鼠(SHR72)或用单独佐剂处理的对照大鼠的脑干制备的不溶性tau蛋白的定量免疫印迹分析。平均值与标准平均误差一起呈现。
图38.用tau肽SEQ ID NO:4对转基因大鼠SHR72疫苗接种显示神经行为参数中度提高。(A)横杆行走测试(3.5cm横杆)。(B)后肢滑动的次数(3.5cm横杆)。(C)神经量表。数据是以平均值连同标准平均误差一起的形式呈现。
图39：用tau肽SEQ ID NO:4对转基因大鼠SHR72疫苗接种导致神经原纤维缠结(NFT)载荷降低66％。抗体AT8用于评估转基因大鼠SHR72的脑组织中的NFT。
图40：对自用tau蛋白201-GSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVR-230/在位置217处携带磷酸化苏氨酸(SEQ ID NO:5)连同佐剂免疫的转基因大鼠(SHR72)或用单独佐剂处理的对照大鼠的脑干制备的不溶性tau蛋白的免疫印迹分析。平均值与标准平均误差一起呈现。
图41：对用tau蛋白201-GSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVR-230/在位置217处携带磷酸化苏氨酸(SEQ ID NO:5)处理的转基因大鼠(SHR72)的神经行为评估。所有统计数据都是使用非参数曼-惠特尼U检验获得。(A)横杆行走测试(3.5横杆)。(B)后肢滑动的次数(3.5横杆)。(C)神经量表。
图42：用tau肽SEQ ID NO:5对转基因大鼠SHR72疫苗接种显示对神经原纤维缠结(NFT)载荷无影响。抗体AT8用于评估转基因大鼠SHR72的脑组织中的NFT。
图43：对自用在位置396和404处携带磷酸化丝氨酸残基的tau蛋白379-RENAKAKTDHGAEIVYKSPW SGDTSPRHL-408(SEQ ID NO:6)和佐剂免疫的转基因大鼠(SHR72)或用单独佐剂处理的对照大鼠的脑干制备的不溶性tau蛋白的免疫印迹分析。平均值与标准平均误差一起呈现。
图44：对用在Ser396/Ser404处磷酸化的tau蛋白SEQ ID NO:6处理的转基因大鼠(SHR72)的神经行为评估。所有统计数据都是使用非参数曼-惠特尼U检验获得。(A)横杆行走测试(3.5横杆)。(B)后肢滑动的次数(3.5横杆)。(C)神经量表。
图45：用tau肽SEQ ID NO:6对转基因大鼠SHR72疫苗接种显示神经原纤维缠结(NFT)载荷不降低。抗体AT8用于评估转基因大鼠SHR72的脑组织中的NFT。
图46：对自用携带在位置202处的磷酸化丝氨酸残基和在205处的磷酸化苏氨酸残基的tau蛋白181-TPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRS-210(SEQ ID NO:7)连同佐剂免疫的大鼠(SHR72)或用单独佐剂处理的对照大鼠的脑干制备的不溶性tau蛋白的免疫印迹分析。平均值与标准平均误差一起呈现。
图47：对用携带在位置202处的磷酸化丝氨酸残基和在205处的磷酸化苏氨酸残基的tau蛋白181-TPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRS-210(SEQ ID NO:7)处理的SHR72大鼠的神经行为评估。所有统计数据都是使用非参数曼-惠特尼U检验获得。(A)横杆行走测试(3.5横杆)。(B)后肢滑动的次数(3.5横杆)。(C)神经量表。
图48：用tau肽SEQ ID NO:7对转基因大鼠SHR72疫苗接种显示对神经原纤维缠结(NFT)载荷无影响。抗体AT8用于评估转基因大鼠SHR72的脑组织中的NFT。
图49：对自用tau蛋白300-VPGGGSVQIVYKPVDLSK-317(SEQ ID NO:8)连同佐剂免疫的大鼠(SHR72)或用单独佐剂处理的对照大鼠的脑干制备的不溶性tau蛋白的免疫印迹分析。平均值与标准平均误差一起呈现。
图50：对用tau蛋白300-VPGGGSVQIVYKPVDLSK-317(SEQ ID NO:8)处理的转基因AD大鼠(SHR72)的神经行为评估。所有统计数据都是使用非参数曼-惠特尼U检验获得。(A)横杆行走测试(3.5横杆)。(B)后肢滑动的次数(3.5横杆)。(C)神经量表。
图51：用tau肽SEQ ID NO:8对转基因大鼠SHR72疫苗接种显示神经原纤维缠结(NFT)载荷不降低。抗体AT8用于评估转基因大鼠SHR72的脑组织中的NFT。
图52：用tau肽(SEQ ID NO:108)对转基因大鼠SHR72疫苗接种统计显著降低不溶性病理性tau蛋白(p<0.001)。自用tau肽免疫的转基因大鼠SHR72的脑提取病理性不溶性tau蛋白且通过免疫印迹加以分析。平均值与标准平均误差一起呈现。
图53：用tau肽(SEQ ID NO:108)对转基因大鼠SHR72疫苗接种统计显著提高神经行为参数(p<0.05)。(A)横杆行走测试(3.5cm横杆)。(B)后肢滑动的次数(3.5cm横杆)。(C)神经量表。数据是以平均值连同标准平均误差一起的形式呈现。
图54：用tau肽(SEQ ID NO:108)对转基因大鼠SHR72疫苗接种使神经原纤维缠结(NFT)载荷降低60％。抗体AT8用于评估转基因大鼠SHR72的脑组织中的NFT。
图55：由用肽tau蛋白275-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304(SEQ ID NO:4)免疫转基因大鼠(SHR72)产生的抗血清的ELISA显示在抗血清结合人病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R和人生理性tau蛋白2N4R方面存在差异。
图56：用tau肽SEQ ID NO:108对转基因大鼠SHR72疫苗接种诱导形成优先结合病理性tau蛋白的抗体。用ELISA测量的几何平均抗体效价显示由用tau肽SEQ ID NO:108疫苗接种引发的抗体展现对免疫原(SEQ IDNO:108肽)和对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R的最高结合活性。用作对照的生理性tau蛋白(tau2N4R)更微弱地被识别。
图57：用tau肽SEQ ID NO:108对转基因大鼠SHR72疫苗接种优先诱导形成对病理性tau蛋白具有特异性的IgG抗体同种型。显示由tau肽SEQ IDNO:108诱导的抗体的同种型分布。1:800稀释来自个别大鼠的血清且通过ELISA分析对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R的结合活性。
图58：对由用肽tau蛋白275-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304(SEQ ID NO:4)免疫SHR72大鼠产生的抗血清结合人tauΔ(1-150；392-441)/4R和人tau蛋白2N4R的SPR亲和力测定。
图59：用由用tau蛋白275-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304(SEQ ID NO:4)免疫转基因大鼠(SHR72)产生的大鼠抗体对来自人AD患者的脑的免疫组织化学染色。(A)抗血清识别阿尔茨海默病脑海马中的神经原纤维病变。(B)较大放大倍数显示神经原纤维缠结。标尺：100μm(A)、10μm(B)。
图60：用tau肽SEQ ID NO:108对转基因大鼠SHR72疫苗接种诱导识别来自人阿尔茨海默病脑组织的切片中的病理性tau蛋白的抗体。对3号(A)、5号(B)、6号(C)、7号(D)和8号(E)大鼠血清的代表性免疫染色显示所有测试的大鼠血清抗体都识别阿尔茨海默病患者的内嗅皮质的前α层中的神经原纤维缠结。来自仅用佐剂免疫的大鼠的汇合血清用作阴性对照(F)。使用来自内嗅皮质的连续脑组织切片。标尺：50μm。
图61：用tau肽SEQ ID NO:108对转基因大鼠SHR72疫苗接种诱导识别人阿尔茨海默病脑中以及转基因大鼠SHR72的脑中的病理性tau蛋白的特异性抗体。自人和大鼠脑组织提取病理性tau蛋白且通过用来自肽SEQ IDNO:108免疫的转基因大鼠SHR72的汇合血清进行免疫印迹加以分析。血清抗体识别单体(1号、2号和3号泳道)和寡聚(2号和3号泳道)病理性tau蛋白，包括AD特征性A68病理性tau蛋白。
图62：用tau肽SEQ ID NO:109免疫小鼠诱导对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R的结合活性统计显著高于对生理性tau蛋白2N4R的结合活性的抗体(p＝0.0115)。图代表对在1:800下稀释的个别血清的ELISA结果的统计评估。平均值与标准平均误差一起显示。
图63：用tau肽SEQ ID NO:110免疫小鼠诱导展现对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R的结合活性统计显著高于对生理性tau蛋白2N4R的结合活性的抗体(p＝0.0029)。图代表对在1:800下稀释的个别血清的ELISA结果的统计评估。平均值与标准平均误差一起显示。
图64：用tau肽SEQ ID NO:111免疫小鼠诱导展现对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R的结合活性统计显著高于对生理性tau蛋白2N4R的结合活性的抗体(p＝0.0007)。图代表对在1:800下稀释的个别血清的ELISA结果的统计评估。平均值与标准平均误差一起显示。
图65：用tau肽SEQ ID NO:112免疫小鼠诱导展现对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R的结合活性统计显著高于对生理性tau蛋白2N4R的结合活性的抗体(p<0.001)。图代表对在1:800下稀释的个别血清的ELISA结果的统计评估。平均值与标准平均误差一起显示。
图66：设计治疗表位GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)和SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)与病理性tauΔ(1-150；392-441)4R竞争结合抗体DC8E8。
图67：设计治疗表位GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)和SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)诱导产生统计显著区分病理性tauΔ(1-150；392-441)4R与生理性tau蛋白2N4R的抗体，如通过ELISA所测定。通过ELISA测试来自用肽250和251之一免疫的小鼠的血清(在1:3200稀释度下)中对tau蛋白：病理性tauΔ(1-150；392-441)4R和生理性tau蛋白2N4R具有特异性的抗体。
图68：用设计治疗表位GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)和SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)免疫诱导最强健产生IgG1同种型抗体。
图69：定量SPR(表面等离子体共振)测量结果显示由设计治疗表位1(GWSIHSPGGGSC，SEQ ID NO:250)(图69A)和设计治疗表位2(SVFQHLPGGGSC，SEQ ID NO:251)(图69B)诱导的抗体统计显著(分别p<0.001和p<0.01)区分病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R与生理性2N4R tau蛋白。
图70：用针对设计治疗表位1(GWSIHSPGGGSC，SEQ ID NO:250)和设计治疗表位2(SVFQHLPGGGSC，SEQ ID NO:251)产生的血清对人AD患病脑组织的免疫组织化学染色。(A)针对设计治疗表位1的抗血清识别AD患者的脑中的神经原纤维病变。(C)神经原纤维缠结和神经原纤维网线(箭号)的高倍放大。(B)针对设计治疗表位2的抗血清识别AD患者的脑中的神经原纤维病变。(D)染色的神经原纤维缠结和神经原纤维网线(箭号)的高倍放大。针对设计治疗表位1和设计治疗表位2的抗血清不识别对照人脑中的正常tau蛋白(E、F)。标尺：50μm(A、B、E、F)，20μm(C、D)。(G)针对设计治疗表位2(SVFQHLPGGGSC，SEQ ID NO:251)产生的血清识别转基因大鼠SHR72中的神经原纤维病变。(H)在年龄匹配的对照大鼠脑中，抗体不显示神经元内染色。血清识别寡聚缠结前阶段(I)以及细胞内阶段(J)。标尺：20μm(A、B)，10μm(C、D)。
图71：由设计治疗表位1(GWSIHSPGGGSC，SEQ ID NO:250)和设计治疗表位2(SVFQHLPGGGSC，SEQ ID NO:251)诱导的抗体识别自人阿尔茨海默病脑组织分离的可溶性和肌氨酰不溶性病理性tau蛋白。
图72：由设计治疗表位1(GWSIHSPGGGSC，SEQ ID NO:250)和设计治疗表位2(SVFQHLPGGGSC，SEQ ID NO:251)诱导的抗体识别自阿尔茨海默病大鼠模型(SHR72)的脑分离的可溶性(泳道1、3、5)和不溶性(泳道2、4、6)病理性tau蛋白。
图73：用设计治疗表位2(SVFQHLPGGGSC，SEQ ID NO:251)的免疫疗法显示处理的SHR72大鼠的神经行为参数(神经量表)显著提高。(A)横杆行走测试。(B)后肢滑动的次数(p<0.05)。(C)神经量表。用设计治疗表位2(SEQID NO:251)处理的大鼠相较于接受单独佐剂的转基因对照大鼠显示：a)横杆行走测试中的逃逸潜伏时间降低27％，b)后肢滑动的次数降低44％(p<0.05)，和c)神经量表评分降低26％。所有统计数据都是使用非参数曼-惠特尼U检验获得。
图74：用设计治疗表位2(SVFQHLPGGGSC，SEQ ID NO:251)的免疫疗法显示免疫的阿茲海默转基因SHR72大鼠的脑中的病理性tau蛋白统计显著降低。相较于接受单独佐剂的对照转基因大鼠，免疫疗法统计显著(p<0.05)降低免疫的动物中的病理性不溶性tau蛋白的量。在所有分析的tau表位下都观察到病理性不溶性tau蛋白降低(P<0.05)。
图75：(A)用于进一步评估DC8E8的最小表位(治疗性核心单元)和免疫原性效能测定的合成肽的示意图和(B)它们的氨基酸序列。
图76：通过竞争性ELISA，使用合成肽测定DC8E8最小表位(治疗性核心单元)。10种含有DC8E8识别序列的至少6个氨基酸的tau肽(SEQ IDNO:270、271、272、275、276、277、280、281、282和283)能够与病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R竞争结合抗体DC8E8。仅含有DC8E8识别序列的5个氨基酸的Tau肽(SEQ ID NO:273、274、278和279)不与tauΔ(1-150；392-441)/4R(SEQ ID NO:199)竞争结合抗体DC8E8。
图77：在用tau肽免疫C57BL小鼠之后，tau蛋白特异性抗体的诱导。(A)12聚体、7聚体和6聚体肽(分别为SEQ ID NO:270、271和272)具有免疫原性。由免疫诱导的抗体展现对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R的结合活性统计显著高于对生理性tau蛋白2N4R的结合活性(分别p<0.0079；p<0.0052；p<0.0079)。5聚体肽SEQ ID NO:273和274不具有免疫原性。(B)42聚体、19聚体、7聚体和6聚体肽(分别SEQ ID NO:275、280、276和277)具有免疫原性。由这些肽诱导的抗体统计显著(分别p<0.0079、p<0.0159、p<0.0079和p<0.0379)区分病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R与生理性tau蛋白2N4R。5聚体肽SEQ ID NO:278和279不具有免疫原性。(C)7聚体肽(SEQ IDNO:281和283)具有免疫原性。针对这些肽的抗血清统计显著(分别p<0.0379和p<0.0286)区分病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R与生理性tau蛋白2N4R。由6聚体肽SEQ ID NO:282诱导的针对病理性tau蛋白和生理性tau蛋白的抗体的水平极低。图代表对在1:800下稀释的个别血清的ELISA结果的统计评估。平均值与标准平均误差一起显示。
图78：在用tau肽免疫C57BL小鼠之后，tau蛋白特异性抗体的几何平均抗体效价。用tau肽SEQ ID NO:270、271、272、275、276、277、280、281和283对C57BL小鼠疫苗接种诱导形成tau蛋白特异性抗体。用ELISA测量的几何平均抗体效价显示通过用tau肽SEQ ID NO:270、271、272、275、276、277、280、281和283疫苗接种引发的抗体展现对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R的结合活性高于对生理性tau蛋白(tau2N4R)的结合活性。在用tau肽SEQ ID NO:273、274、278、279和282免疫小鼠之后检测到tau蛋白特异性抗体的效价较低。
图79A和79B：显示由tau肽诱导的抗体的同种型分布。用携带最小DC8E8表位的tau肽免疫C57/BL小鼠优先诱导形成对病理性tau蛋白具有特异性的IgG1和IgG2b抗体同种型。1:800稀释来自个别小鼠的汇合血清且通过ELISA分析对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R的结合活性。
图80：对在用tau肽免疫的小鼠C75BL中诱导的抗体对tauΔ(1-150；392-441)/4R和2N4R的结合能力的定量评估。表面等离子体共振(SPR)测量结果显示针对tau肽SEQ ID NO:270、271、272、275、276、277、280、281和283的抗体统计显著(**...p<0.001和*...p<0.01)区分病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R与生理性2N4R tau蛋白。KA-缔合平衡结合常数。
图81：在蛋白质印迹中，在用tau肽免疫的小鼠中诱导的抗体识别病理性形式的tau蛋白。用tau肽SEQ ID NO:270、271、272、275、276、277、280、281和283对C57BL小鼠疫苗接种诱导识别自人阿尔茨海默病脑组织以及自转基因大鼠SHR72的脑干分离的病理性tau蛋白的特异性抗体。在用肽SEQ ID NO:273、274、278、279和282免疫小鼠之后的抗血清不识别病理性tau蛋白形式。
图82A-C：人AD脑组织中由tau肽诱导的抗体识别的神经原纤维缠结。用tau肽SEQ ID NO:270、271、272、275、276、277、280、281和283对C57BL小鼠疫苗接种诱导识别阿尔茨海默病脑的海马中的神经原纤维病变的抗体。来自仅用佐剂免疫的小鼠的血清用作阴性对照。使用来自海马CA1的脑组织切片。标尺：100μm。
图83：用由用tau肽SEQ ID NO:270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282和283免疫C57BL小鼠产生的血清抗体对来自人AD患者的脑组织的免疫组织化学染色(和相应相对强度)的概述。
发明详述
术语“抗体”是指遗传工程改造、天然或完全或部分合成或重组产生的免疫球蛋白。其维持抗原结合性质和至少一种根据本发明的tau蛋白相关特征性质的所有衍生物、部分及片段也包括在所述术语中。所述术语也涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白质。这些蛋白质可源于天然来源或部分或完全合成或重组产生。抗体可为单克隆或多克隆的。抗体可为包括任何人类别：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE的任何免疫球蛋白类别的成员。在本发明的一些实施方案中，IgG类别的衍生物是优选的。
术语“分离的抗体”和“分离的肽”是指由cDNA来源、重组RNA来源或任何其它合成来源或其某一组合产生的蛋白质或肽；也指以下蛋白质和肽：根据它们的来源或衍生来源，(1)不与在自然界中所见的蛋白质缔合，(2)不含来自相同来源的其它蛋白质，例如不含鼠类蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不存在于自然界中。
此外，根据本发明的抗体也包括具有不影响或改变根据本发明的抗体的以上提及的特征的“保守性序列修饰”，即核苷酸和氨基酸序列修饰的所述抗体。可通过本领域中已知的标准技术，如定点突变诱发和PCR介导的突变诱发引入修饰。保守性氨基酸取代包括氨基酸残基经具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中加以定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，抗tau蛋白抗体中的预测非必需氨基酸残基可例如经来自同一侧链家族的另一氨基酸残基置换。
“抗体片段”和“抗体部分”包含全长抗体的一部分，通常至少是其抗原结合部分/结构域或可变区。抗体片段的实例包括双链抗体(diabody)、单链抗体分子、免疫毒素和由抗体片段形成的多特异性抗体。此外，抗体片段包括具有结合病理性tau蛋白的VH链的特征(即能够连同VL链一起装配)或结合病理性tau蛋白的VL链的特征(即能够连同VH链一起装配)以形成功能性抗原结合袋且由此提供结合病理性tau蛋白的性质的单链多肽。所述术语也包括本身不能提供效应子功能(例如ADCC/CDC)，但在与适当抗体恒定结构域组合之后提供这个功能的片段。
术语“嵌合抗体”是指通常通过重组DNA技术制备的包含来自一种来源或物种的可变区(即结合区)和至少一部分源于不同来源或物种的恒定区的单克隆抗体。包含鼠类可变区和人恒定区的嵌合抗体是尤其优选的。所述鼠类/人嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，所述基因包含编码鼠类免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段。由本发明涵盖的其它形式的“嵌合抗体”是类别或子类已自原始抗体的类别或子类修改或改变的那些。所述“嵌合”抗体也称为“类别转变抗体”。用于产生嵌合抗体的方法涉及目前本领域中已知的常规重组DNA和基因转染技术。参见例如Morrison,S.L.等,Proc.Natl.Acad Sci.USA81(1984)6851-6855；美国专利号5,202,238和5,204,244。
术语“人源化抗体”是指框架区(FR)和/或互补决定区(CDR)已被修饰来包含相较于亲本免疫球蛋白的特异性，具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个实施方案中，鼠类CDR移植入人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann,L.等,Nature332(1988)323-327；和Neuberger,M.S.等,Nature314(1985)268-270。特别优选CDR对应于表示识别抗原和在本文中描述为tau蛋白上的“治疗表位”的表位的序列的那些。
如本文所用的术语“人抗体”意图包括具有源于人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。抗体的恒定区可为例如人IgG1类型的恒定区。所述区域可为异型的并由例如Johnson,G.和Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218和其中提及的数据库所描述，且优先适用于一些实施方案，只要根据本发明的诱导ADCC和例如CDC的性质得以保留即可。
如本文所用的术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如自如NSO或CHO细胞的宿主细胞或自转殖人免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠，如XENOMOUSE，其为一种产生具有人抗体的氨基酸序列(例如人框架(FR)和人恒定区氨基酸序列)的抗体的遗传修饰小鼠)分离的抗体或使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。所述重组人抗体具有呈重排形式的源于人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。根据本发明的重组人抗体已经受体内体细胞高度突变。因此，重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是尽管源于且相关于人生殖系VH和VL序列，但不能天然体内存在于人抗体生殖系谱系内的序列。
术语“效应子功能”包括但不限于C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；和细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调。
术语“表位”在此处用于指代由结合蛋白或抗体识别的结合位点。表位可为任何分子或其集合，包括但不限于氨基酸、氨基酸侧链、糖和脂质，且可具有特定三维结构或构象。因此，表位可包含tau肽/蛋白质分子的包括一级、二级、三级或四级结构的任何部分，因为那些术语通常在本领域中是已知的。“线性表位”由连续氨基酸残基序列构成。线性表位是存在于生理性tau蛋白上(例如存在于tau蛋白2N/4R中)的表位。“构象表位”是抗体或结合蛋白以构象特异性方式结合的表位。在基于蛋白质的表位的情况下，结合可取决于携带表位的蛋白质的二级、三级或四级结构。换句话说，抗体以结构特异性方式、三级结构特异性方式或四级结构特异性方式进行结合。构象表位是存在于病理性tau蛋白中(例如存在于tauΔ(1-150；392-441)/4R中)的表位。
术语“治疗表位”是指tau蛋白内在本文中鉴定且发现当呈某些构象(由DC8E8抗体识别)时会促进tau蛋白-tau蛋白聚集的区域。结合这些区域的一者或多者的抗体(和其它结合蛋白)抑制早期和晚期阶段的tau蛋白聚集，包括tau蛋白单体转化成二聚体以及转化成高等聚集体形式；亦即抗体抑制自生理性tau蛋白转化成病理性tau蛋白。tau蛋白内的这些区域可涉及于通过促进在tau蛋白的邻近区域内形成β折叠来促进tau蛋白纤维化成成对螺旋纤维(PHF)。治疗表位包含在267-KHQPGGG-273(在tau蛋白的第1重复结构域内)、298-KHVPGGG-304(在tau蛋白的第2重复结构域内)、329-HHKPGGG-335(在tau蛋白的第3重复结构域内)和361-THVPGGG-367(在tau蛋白的第4重复结构域内)内。在一些实施方案中，治疗表位各自分别包含在268-HQPGGG-273(在tau蛋白的第1重复结构域内)、299-HVPGGG-304(在tau蛋白的第2重复结构域内)、330-HKPGGG-335(在tau蛋白的第3重复结构域内)和362-HVPGGG-367内。
术语“显示对病理性tau蛋白的亲和力高于对生理性tau蛋白的亲和力”是指抗体与至少一种形式的病理性tau蛋白之间的相互作用程度高于抗体与至少一种形式的生理性tau蛋白之间的相互作用程度。相互作用可通过例如如以下实施例中所述的ELISA或表面等离子体共振(SPR)来测量。
术语“特异性结合”与“对…具有特异性”可互换且意味抗体或其抗原结合片段(或其它结合蛋白)与在生理条件下相对稳定的抗原或表位形成复合物。特异性结合的特征可在于解离常数为约1×10-6M或更小，例如小于约100nM，且主要例如小于10nM。用于确定两个分子是否特异性结合的方法在本领域中是已知的且包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。通常，由本发明提供的抗体或其抗原结合片段是结合抗原或表位的所述解离常数至少约1×10-6M或更小，但结合其它分子的解离常数不为所述解离常数的分子。
“优先结合”是指对病理性tau蛋白的亲和力高于对生理性tau蛋白的亲和力的结合，例如对tauΔ(1-150；392-441)/4R的亲和力高于对2N4R的亲和力的结合。
“通用T细胞表位”是选自流感血球凝集素：HA307-319(PKYVKQNTLKLAT)(SEQ ID NO:123)；PADRE(AKXVAAWTLKAAA)(SEQ ID NO:124)；疟疾CS：T3表位(EKKIAKMEKASSVFNV)(SEQ ID NO:125)；乙型肝炎表面抗原：HBsA919_28(FFLLTRILTI)(SEQ ID NO:126)；热休克蛋白65：hsp65153_171(DQSIGDLIAEAMDKVGNEG)(SEQ ID NO:127)；卡介苗(QVHFQPLPPAWKL)(SEQ ID NO:128)；破伤风类毒素：TI830-844(QYIKANSKFIGITEL)(SEQ ID NO:129)；破伤风类毒素：TI947-967(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)(SEQ ID NO:130)；和HIV gp120T1(KQIINMWQEVGKAMYA)(SEQ ID NO:131)的序列。
术语“固有无序tau蛋白”是指缺乏任何确定3D结构的正常/生理形式的tau蛋白。其存在于健康脑中(Kovacech等,2010)。
“错误无序tau蛋白”是指构象不同于正常/生理性固有无序tau蛋白，且不具有牢固/确定3D结构的tau蛋白形式。错误无序截短tau蛋白能够体内诱导神经原纤维变性。其不存在于健康脑中(Kovacech等,2010)。“错序tau蛋白”是指装配成形成NFT的PHF的聚合物的结构化病理性形式的tau蛋白。错序tau蛋白不存在于健康脑中(Kovacech等,2010)。
“SHR24”是指表达IIB型tau蛋白(151-391/R3)的转基因大鼠品系。转基因大鼠在皮质脑区域中显现进行性年龄依赖性神经原纤维变性。SHR24大鼠中的神经原纤维缠结(NFT)满足用于鉴定人阿尔茨海默病中的神经原纤维变性的若干关键组织学准则，包括嗜银性、刚果红双折射和硫代黄素S反应性。这些准则可用于分析接受本发明的任何实施方案的受试者中的神经原纤维变性。也用用于检测人脑中的病理性tau蛋白的抗体(包括识别异常tau蛋白构象的DC11)和对过度磷酸化形式的tau蛋白具有特异性的抗体鉴定神经原纤维缠结。此外，神经原纤维变性的特征在于广泛形成由大鼠内源性和截短tau蛋白种类组成的肌氨酰不溶性tau蛋白复合物(Filipcik等,2010)。
“SHR72”是指在若干脑区域和脊髓中表达根据国际专利申请PCT WO2004/007547)的人截短tauΔ(1-150；392-441)/4R的转基因大鼠。这个大鼠品系的产生由Zilka等,2006加以描述，且tau蛋白病理学描述于Koson等,2008中。
“IA型Tau蛋白”是指N末端和C末端双重截短的tau蛋白，其截短含有4个重复序列的tau43的至少前236个N末端氨基酸和至少最后45个C末端氨基酸。所述分子可在阿尔茨海默病患病脑组织中检测而所述分子不可在正常健康脑组织中检测(WO2004/007547A2)。
“IB型Tau蛋白”是指N末端和C末端双重截短的tau蛋白，其截短含有3个重复序列的tau44的至少前236个N末端氨基酸和至少最后45个C末端氨基酸。所述分子可在阿尔茨海默病患病脑组织中检测而所述分子不可在正常健康脑组织中检测(WO2004/007547A2)。
“IIA型Tau蛋白”是指N末端和C末端双重截短的tau蛋白，其截短含有4个重复序列的tau43的至少前68个N末端氨基酸和至少最后40个C末端氨基酸。所述分子可在阿尔茨海默病患病脑组织中检测而所述分子不可在正常健康脑组织中检测(WO2004/007547A2)。
“IIB型Tau蛋白”是指N末端和C末端双重截短的tau蛋白，其截短含有3个重复序列的tau44的至少前68个N末端氨基酸和至少最后20个C末端氨基酸。所述分子可在阿尔茨海默病患病脑组织中检测而所述分子不可在正常健康脑组织中检测(WO2004/007547A2)。
如本文所用，术语“治疗”等是指获得所需药理学和/或生理学作用。所述作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可为防治性的和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于所述疾病的不利影响而言可为治疗性的。如本文所用的“治疗”也涵盖对哺乳动物，特别是人的AD或相关tau蛋白病变的任何治疗，且包括：(a)预防疾病在可易患疾病或处于获得疾病的风险下但尚未诊断为患有所述疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即遏止其发展；以及(c)减轻疾病，即导致疾病消退。以下进一步论述“治疗”的优选实施方案。在一些实施方案中，“治疗”是指向怀疑罹患或已罹患AD或另一tau蛋白病变的患者施用治疗剂。其也可指减轻、消除或至少部分遏止疾病和/或与疾病和/或其并发症相关的一种或多种症状，也指对所述一种或多种症状施加任何有益作用。
“预防”是指向易感特定疾病或另外处于特定疾病的风险下的患者施用。总人口中的任何人都处于AD的风险下。一些个体具有增加的AD遗传风险。预防可消除或降低风险或延迟疾病发作。延迟发作或进展可基于类似群体或个体中的标准疾病进展时间加以测量。
“Tau蛋白病变”是指与形成病理性tau蛋白相关的疾病。
“生理性tau蛋白”是指正常人tau蛋白的6种亚型的任一者，即：
2N4R(SEQ ID NO:102)
1N4R(SEQ ID NO:103)
2N3R(SEQ ID NO:104)
0N4R(SEQ ID NO:105)
1N3R(SEQ ID NO:106)
0N3R(SEQ ID NO:107)
自这个定义排除携带与阿尔茨海默病和其它tau蛋白病变相关的任一磷酸化的那些tau蛋白。
“病理性tau蛋白”包括病理性tau蛋白构象异构体和结构且涵盖以下全部：IA、IB、IIA和IIB型Tau蛋白、错序tau蛋白、错误无序tau蛋白(单体、二聚体、三聚体、寡聚物)、错误无序可溶性tau蛋白、肌氨酰不溶性tau蛋白、细胞外tau蛋白沉积物、tau蛋白聚集体、成对螺旋纤维、神经原纤维病变(包括神经原纤维病变、缠结、线、纤维、轴突球状体)、高度磷酸化形式的截短tau蛋白和全长tau蛋白、或与AD或另一tau蛋白病变相关的任何其它形式的tau蛋白。
“连接”是指某一部分连接于肽、抗体或化合物。所述部分可被偶合或复合或共价或非共价连接。所述部分可以与肽或抗体的融合物形式化学交联或表达或合成。
“部分”是指能够连接于肽、抗体或结合蛋白，但不是所要求保护的肽、抗体或结合蛋白自身的任何化合物、有机物、肽、蛋白质、核酸、载体、佐剂。
“免疫原性”是指可引发免疫反应的某些性质。免疫反应可由抗体或细胞或两者介导。
“佐剂”是指能够增加、增大或调节对伴随肽的免疫反应的物质。
“其它疗法”是指主题患者可接受的额外疗法。
“清除”是指降低病理性tau蛋白和/或病理性tau蛋白结构的水平或检测。清除不必使病理性tau蛋白完全消失，即病理性tau蛋白可为部分消失。
术语“促进”涵盖诱导、提高或增加。
“脑组织”是指例如来自脑、脑干和脊髓的任何神经元组织。
术语“特异性结合”和“高亲和力”分别指抗体结合预定抗原，即以上定义的tau表位。通常，抗体结合的解离常数(KD)是10-6M或更小，且结合预定抗原的KD比其结合除预定抗原以外的非特定抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其它指定多肽)的KD小至少2倍。词语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。如本文所用，“高度特异性”结合意味抗体对错误无序tau蛋白的相对KD比抗体对其它配体或正常全长tau蛋白的结合KD小至少4倍。
术语“原核生物”意欲包括可用用于表达本发明抗体或一个或多个相应免疫球蛋白链的DNA或RNA分子转化或转染的所有细菌。原核宿主可包括革兰氏阴性以及革兰氏阳性细菌，例如像大肠杆菌(E.coli)、鼠沙门氏伤寒杆菌(S.typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。术语“真核生物”意图包括酵母、高等植物、昆虫和例如哺乳动物细胞，主要例如HEK293、NSO和CHO细胞。
术语“化学衍生物”描述含有通常不是基础分子的一部分的额外化学部分的分子。所述部分可提高基础分子的溶解性、半衰期、吸收等。或者，所述部分可减弱基础分子的不合需要副作用或降低基础分子的毒性。
术语“核酸”、“核酸序列”、“聚核苷酸”、“寡核苷酸”、“聚核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本说明书中可互换使用，且指修饰或未修饰的准确核苷酸序列，所述序列界定核酸的片段或区域，含有或不含有非天然核苷酸，且是双链DNA、单链DNA或所述DNA的转录产物。
如本文所用的术语“分离的聚核苷酸”或“分离的核酸”将意味基因组、cDNA或合成来源或其某一组合的聚核苷酸，所述聚核苷酸根据其来源(1)不与“分离的聚核苷酸”见于自然界中所处的聚核苷酸的全部或一部分缔合，(2)可操作地连接于其在自然界中不连接的聚核苷酸，或(3)不作为较大序列的一部分存在于自然界中。
用于诊断、被动免疫、药物递送和AD疗法的抗体
本文描述对一种或多种由病理性形式的tau蛋白显示的tau表位具有特异性的新型分离的抗体。这些表位位于tau蛋白的首次指定在病理性tau蛋白聚集中具有作用的区域内，即在以下内：267-KHQPGGG-273(SEQ IDNO:98)(即1号表位位于属于tau蛋白的第1重复结构域的267-KHQPGGG-273内)、298-KHVPGGG-304(SEQ ID NO:99)(2号表位，在tau蛋白的第2重复结构域内)、329-HHKPGGG-335(SEQ ID NO:100)(3号表位，在tau蛋白的第3重复结构域内)和361-THVPGGG-367(SEQ ID NO:101)(4号表位，在tau蛋白的第4重复结构域内)。这些抗体能够识别人AD脑中以及AD和相关tau蛋白病变的转基因大鼠模型中的错序和错误无序tau蛋白，所述大鼠模型表达人错误无序截短tauΔ(1-150；392-441)/3R或tauΔ(1-150；392-441)/4R。分离的抗体也能够干扰促进AD病变的多种tau蛋白介导的活性的一者或数者，所述活性包括：(i)自错序或自生理性tau蛋白转变成错误无序tau蛋白；(ii)形成“病理性tau蛋白”单体、二聚体、三聚体和其它tau蛋白多聚体；(iii)形成不溶性tau蛋白聚集体；和(iv)促进细胞外tau蛋白清除。
本公开的发明是部分基于发现特异性结合tau蛋白的四个先前未鉴定功能区之一的抗体能够抑制病理性tau蛋白聚集体形成以及检测各种病理性形式的tau蛋白(其中一些是最早在疾病中形成的形式(例如病理性单体))，所述未鉴定功能区选自267-KHQPGGG-273(SEQ ID NO:98)(在tau蛋白的第1重复结构域内)、298-KHVPGGG-304(SEQ ID NO:99)(在tau蛋白的第2重复结构域内)、329-HHKPGGG-335(SEQ ID NO:100)(在tau蛋白的第3重复结构域内)和361-THVPGGG-367(SEQ ID NO:101)(在tau蛋白的第4重复结构域内)。通过免疫组织化学(IHC)与酶联免疫测定(ELISA)两者筛选能够产生对人PHF具有特异性的单克隆抗体的针对在本申请中也称为tauΔ(1-150；392-441)/4R的人错误无序tau蛋白II(151-391/4R)产生的杂交瘤。所得组包括具有IgG1子类的小鼠单克隆抗体(mAb)DC8E8。对DC8E8的表位定位揭示其结合人tau蛋白上的四个先前未鉴定的表位。此外，对DC8E8的进一步功能分析揭示各表位代表tau蛋白内的不同功能区。现在可描述为AD诊断和疗法的新型靶标，且因此称为“治疗表位”的这些区域包含在267-KHQPGGG-273(SEQ ID NO:98)(在tau蛋白的第1重复结构域内)、298-KHVPGGG-304(SEQ ID NO:99)(在tau蛋白的第2重复结构域内)、329-HHKPGGG-335(SEQ ID NO:100)(在tau蛋白的第3重复结构域内)和361-THVPGGG-367(SEQ ID NO:101)(在tau蛋白的第4重复结构域内)内。在一些实施方案中，治疗表位的一者或多者包含在268-HQPGGG-273(SEQ IDNO:223)(在tau蛋白的第1重复结构域内)、299-HVPGGG-304(SEQ IDNO:154)(在tau蛋白的第2重复结构域内)、330-HKPGGG-335(SEQ IDNO:224)(在tau蛋白的第3重复结构域内)和362-HVPGGG-367(SEQ IDNO:154)(在tau蛋白的第4重复结构域内)内。在一些实施方案中，至少一个治疗表位包含在299-HVPGGG-304(SEQ ID NO:154)(在tau蛋白的第2重复结构域内)内。在一些实施方案中，治疗表位的一者或多者是299-HVPGGG-304(SEQ ID NO:154)。
实际上，DC8E8能够区分病理性tau蛋白与正常tau蛋白，表明这四种表位的至少一者是构象表位。换句话说，DC8E8揭示由四种治疗表位各自涵盖的区域的至少一者在病理性tau蛋白中显示不同于其在固有无序tau蛋白(正常tau蛋白)中采用的形状的构象。DC8E8能够感知或检测变化，因为其结合病理性tau蛋白的亲和力高于其结合生理性tau蛋白的亲和力。此外，结合tau蛋白的DC8E8能够抑制导致形成病理性tau蛋白聚集体的tau蛋白-tau蛋白相互作用，如通过DC8E8能够体外抑制不溶性tau蛋白聚集体形成所衡量。举例而言，结合正常tau蛋白的DC8E8能够防止涵盖治疗表位的区域的一种或多种以上论述的构象/形状变化。
此外，DC8E8在这些区域或治疗表位的一者或多者处结合正常tau蛋白会在分子中其它地方阻碍为产生病理性tau蛋白所需的某些其它构象变化。在不受任何特定机理束缚下，意图tau蛋白内由DC8E8识别的这些表位/区域的一者或多者在tau蛋白内充当tau蛋白-tau蛋白聚集的促进剂。举例而言，这些表位的一者或多者的结构/形状/构象会影响邻近区域的结构，以使通过DC8E8与其结合来固定其在tau蛋白分子内的形状会干扰邻近区域(例如274-281)形成β折叠的能力或趋势，其中形成β折叠为tau蛋白-tau蛋白聚集所需。因此，意图DC8E8与正常tau蛋白内的这四个区域之一结合能够防止tau蛋白中迄今为止鉴定的一个最早病理性变化：即为促进在tau蛋白内形成β折叠所需或其自身促进或允许在tau蛋白内形成β折叠的变化。此外，也意图DC8E8与错误无序/病理性tau蛋白内的这四个区域之一结合(即在四个区域的一者或多者已变成病理性构象之后)仍然能够抑制病理性tau蛋白-tau蛋白聚集，至少因为其仍然抑制β折叠形成、阻断tau蛋白-tau蛋白物理相互作用，或两者。
因此，使用DC8E8作为鉴定tau蛋白内的新型靶标或功能区的工具，指定tau蛋白上的四个特定DC8E8结合位点在阿尔茨海默病中具有作用。这是通过认识到这些tau蛋白位点的一者或多者至少因为DC8E8与它们中的一者或多者结合能够抑制那些过程而涉及于病理性tau蛋白单体和多聚体的形成中来进行。此外，结合这些治疗表位的一者或多者的抗体(例如DC8E8)能够促进病理性tau蛋白自细胞外环境清除，至少因为它们能够体外介导由小神经胶质细胞对病理性tau蛋白的摄取和降解；体内降低脑中的细胞外和细胞内tau蛋白；或两者。换句话说，这些抗体能够帮助降低所述病理性形式的tau蛋白对脑引起的损伤。
因此，本文描述特异性结合tau蛋白上的一种或多种治疗表位的抗体，其中所述治疗表位各自分别位于氨基酸残基267-KHQPGGG-273(SEQ IDNO:98)(1号表位，在tau蛋白的第1重复结构域内)、298-KHVPGGG-304(SEQID NO:99)(2号表位，在tau蛋白的第2重复结构域内)、329-HHKPGGG-335(SEQ ID NO:100)(3号表位，在tau蛋白的第3重复结构域内)和361-THVPGGG-367(SEQ ID NO:101)(4号表位，在tau蛋白的第4重复结构域内)内。在一些实施方案中，1至4号治疗表位包含在268-HQPGGG-273(SEQ ID NO:223)(在tau蛋白的第1重复结构域内)、299-HVPGGG-304(SEQ ID NO:154)(在tau蛋白的第2重复结构域内)、330-HKPGGG-335(SEQ ID NO:224)(在tau蛋白的第3重复结构域内)和362-HVPGGG-367(SEQ ID NO:154)(在tau蛋白的第4重复结构域内)内。抗体可为单克隆或多克隆的。也包括抗原结合抗体部分、抗体片段、抗体变体、工程改造蛋白质和聚合物骨架。这些包括包含免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或含肽分子，所述至少一部分如但不限于至少一个重链或轻链互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分。
作为一非限制性实例，如由本发明提供的适合抗体、抗体部分、片段或变体可结合至少一种所述治疗表位。术语“抗体”也包括抗体消化片段、指定抗体部分及其变体，包括抗体模拟物或模拟抗体或其指定片段或部分的结构和/或功能的抗体的部分，包括单链抗体及其片段。功能性片段包括结合一种或多种治疗表位的抗原结合片段。举例而言，能够结合治疗表位的抗体片段包括但不限于由本发明提供的Fab(例如通过木瓜蛋白酶消化获得)、Fab'(例如通过胃蛋白酶消化和部分还原获得)和F(ab')2(例如通过胃蛋白酶消化获得)、facb(例如通过血纤维蛋白溶酶消化获得)、pFc'(例如通过胃蛋白酶或血纤维蛋白溶酶消化获得)、Fd(例如通过胃蛋白酶消化、部分还原和再聚集获得)、Fv或scFv(例如通过分子生物学技术获得)片段。也参见William E.Paul(编)Fundamental Immunology,第6版,Lippincott Williams&Wilkins,NY,N.Y.(2008)，所述参考书目整体并入本文。某些片段可通过如本领域中常规已知或如本文提供的酶促裂解、合成或重组技术产生。亦可使用已在天然终止位点的上游引入一个或多个终止密码子的抗体基因以多种截短形式产生抗体。举例而言，编码F(ab')2重链部分的组合基因可被设计来包括编码重链的CH1结构域和/或铰链区的DNA序列。抗体的各种部分可通过常规技术以化学方式接合在一起，或可使用常规遗传工程技术制备成邻接蛋白质。
已知基本抗体结构单位包含四聚体。各四聚体主要由两对相同多肽链组成，各对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包括具有约100至110个或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。各链的羧基末端部分界定主要负责效应子功能的恒定区。人轻链分类为κ和λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区与恒定区是通过具有约12个或更多个氨基酸的“J”区加以接合，其中重链也包括具有另外约10个氨基酸的“D”区。大体上参见Fundamental Immunology第7章(Paul,W.编,第2版Raven Press,N.Y.(1989))(出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。各轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体具有两个结合位点。除在双功能或双特异性抗体中之外，两个结合位点相同。所有链都展现相对保守的框架区(FR)由三个高变区(也称为互补决定区或CDR)接合的相同一般性结构。来自各对的两个链的CDR通过框架区对准，从而使得能够结合特定表位。自N末端至C末端，轻链与重链两者均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。对各结构域指定氨基酸是根据IMGT的定义。替代性定义也为本领域普通技术人员所知。参见例如Kabat Sequencesof Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987和1991))或Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等Nature342:878-883(1989)。
在一些实施方案中，主题抗体包含包括与SEQ ID NO:141、143、152和153的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括与SEQ ID NO:141、143、152和153的任一者仅有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸不同的氨基酸序列的轻链。本领域普通技术人员可确定轻链可变区中的哪些氨基酸可被改变。举例而言，通过比较具有相同特异性的抗体的轻链可变区的氨基酸序列，本领域技术人员可确定哪些氨基酸可被改变而不改变特异性。对于示例性DC8E8抗体轻链的CDR氨基酸序列的比较，参见实施例。此外，可使用抗原结合测定来确定特异性是否改变。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ IDNO:141、143、152和153的任一者中所述的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，主题抗体包含包括与SEQ ID NO:138、140、147和148的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括与SEQ ID NO:138、140、147和148的任一者仅有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸不同的氨基酸序列的重链。本领域普通技术人员可确定重链可变区中的哪些氨基酸可被改变。举例而言，通过比较具有相同特异性的抗体的重链可变区的氨基酸序列，本领域技术人员可确定哪些氨基酸可被改变而不改变特异性。对于示例性DC8E8抗体重链的CDR氨基酸序列的比较，参见例如图3E和25B。此外，可使用抗原结合测定来确定特异性是否改变。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:138、140、147和148的任一者中所述的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:141中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ ID NO:138中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:141中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ ID NO:140中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:141中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ ID NO:147中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:141中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ IDNO:148中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:143中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ ID NO:138中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQID NO:143中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ ID NO:140中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:143中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ ID NO:147中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:143中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ ID NO:148中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:152中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ ID NO:138中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:152中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ ID NO:140中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:152中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQID NO:147中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:152中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ ID NO:148中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQID NO:153中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ ID NO:138中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:153中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ ID NO:140中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:153中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ ID NO:147中所述的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，主题抗体包含包括如SEQ ID NO:153中所述的氨基酸序列的轻链和包括如SEQ ID NO:148中所述的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中，主题抗体包含包括至少一个、至少两个、或三个选自SEQ ID NO.117-119的CDR的轻链可变区。在一些实施方案中，主题抗体包含包括至少一个、至少两个、或三个选自SEQ ID NO.120-122的CDR的重链可变区。也提供这六个CDR的任一者如实施例14中所述加以改变的实施方案。在一些实施方案中，轻链中至少一个改变的CDR选自用于CDR1的SEQ ID NO:247、用于CDR2的SEQ ID NO:253、和用于CDR3的SEQ IDNO:255、257、258、259和260的任一者。在一些实施方案中，重链中至少一个改变的CDR选自用于CDR1的SEQ ID NO:261或SEQ ID NO:262、用于CDR2的SEQ ID NO:264或SEQ ID NO:265、和用于CDR3的SEQ IDNO:266、SEQ ID NO:267或SEQ ID NO:269。
双特异性或双功能抗体是具有两对不同重链/轻链和两个不同结合位点的人工杂交抗体。可通过包括杂交瘤融合或连接Fab'片段的多种方法产生双特异性抗体。参见例如Songsivilai和Lachmann Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)、Kostelny等J.Immunol.148:1547-1553(1992)。相较于产生常规抗体，产生双特异性抗体可为一种相对劳动密集型过程，且双特异性抗体的产率和纯度通常较低。双特异性抗体不以具有单一结合位点的片段(例如Fab、Fab'和Fv)形式存在。
本发明不涉及呈天然形式的抗体，即它们不取自它们的天然环境而是通过纯化自天然来源分离和获得，或通过遗传重组或化学合成获得，且因此它们可携带非天然氨基酸。因此，如本文所用，20种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-A Synthesis(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren编,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文。20种常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸Nle、Nva、Cha、Orn、Hle、Chg、Hch或Har)、非天然氨基酸(如α-,α-双取代氨基酸、N-烷基氨基酸)、乳酸和其它非常规氨基酸也可为适于本发明多肽的组分。非常规氨基酸的实例包括(即不限于)4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-Ν,Ν,Ν-三甲基赖氨酸、ε-Ν-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它类似氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文使用的多肽记法中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向且右手方向是羧基末端方向。
类似地，本公开不涉及在其天然染色体环境中，即呈天然状态的核苷酸序列。本发明序列已经分离和纯化，即它们直接或例如通过拷贝间接被取样，其中它们的环境已至少部分被改动。也提供例如借助于宿主细胞利用重组遗传学获得或通过化学合成获得的分离的核酸。
关于本公开，两个核酸或氨基酸序列之间的“同一性百分比”意味在最优比对之后获得的在待比较的两个序列之间相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比，其中这个百分比仅为统计性的且两个序列之间的差异是沿其长度随机分布的。传统上通过在使两个核酸或氨基酸序列最优对准之后比较序列来进行两个核酸或氨基酸序列的比较，其中所述比较能够通过分段或通过使用“比对窗”来进行。除手工比较之外，供比较的序列的最优比对可借助于Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math.2:482]的局部同源性算法、借助于Neddleman和Wunsch(1970)[J.Mol.Biol.48:443]的局部同源性算法、借助于Pearson和Lipman(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444]的类似性搜索法或借助于使用这些算法的电脑软件(Wisconsin Genetics SoftwarePackage(Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，或通过比较软件BLAST NR或BLAST P)来进行。
通过比较两个最优对准序列来确定两个核酸或氨基酸序列之间的同一性百分比，其中待比较的核酸或氨基酸序列相较于参照序列可具有添加或缺失以达成两个序列之间的最优比对。通过确定在两个序列之间，例如在两个完全序列之间相同的氨基酸或核苷酸残基所处的位置的数目，用比对窗中的位置的总数目除相同位置的数目且用100乘以结果以获得两个序列之间的同一性百分比来计算同一性百分比。
举例而言，可在站点http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html获得的BLAST程序“BLAST2sequences”(Tatusova等,“Blast2sequences-a new toolfor comparing protein and nucleotide sequences”,FEMS Microbiol.,1999,Lett.174:247-250)可以缺省参数(特别是针对参数“开放空位罚分”：5和“延伸空位罚分”：2；所选矩阵例如是由程序推荐的“BLOSUM62”矩阵)加以使用；待比较的两个序列之间的同一性百分比由程序直接计算。
对于展现与参照氨基酸序列至少80％，例如85％、90％、95％和98％同一性的氨基酸序列，优选实例包括含有参照序列、某些修饰(特别是缺失、添加或取代至少一个氨基酸)、截短部分或延伸部分的那些。在取代一个或多个连续或非连续氨基酸的情况下，取代的氨基酸经“等效”氨基酸置换的取代是优选的。此处，表述“等效氨基酸”意图指示可能取代一个结构氨基酸，然而不改变相应抗体和以下定义的那些特定实例的生物活性的任何氨基酸。
等效氨基酸可根据其与其所取代的氨基酸的结构同源性或根据在可能产生的各种抗体之间进行的生物活性的比较测试的结果来确定。作为一非限制性实例，下表概述可能进行而不导致显著改变相应修饰的抗体的生物活性的可能取代；在相同条件下反向取代是天然可能的。
原始残基 取代
Ala(A) Val，Gly，Pro
Arg(R) Lys，His
Asn(N) Gln
Asp(D) Glu
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala
His(H) Arg
lle(l) Leu
Leu(L) lle，Val，Met
Lys(K) Arg
Met(M) Leu
Phe(F) Tyr
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr，Cys
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Phe，Trp
Val(V) Leu，Ala
本发明提供一种由于2011年7月13日以ATCC专利保藏编号PTA-11994(2011年7月29日颁予)保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801University Blvd,Manassas,VA,USA)的小鼠杂交瘤细胞系产生的抗体，如实施例1-2中所述。其它适合抗体可由如本领域中已知的细胞系、混合细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群体产生。参见例如Ausubel等(编),Current Protocols in Molecular Biology,(John Wiley&Sons,Inc.,New York,N.Y.(1987-2001))；Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,(Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))和Sambrook等,Molecular Cloning-ALaboratory Manual(第3版),第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,N.Y.,2000(总称为“Sambrook”)；Harlow和Lane,Antibodies,ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))；Colligan等(编),CurrentProtocols in Immunology,(John Wiley&Sons,Inc.,N.Y.(1994-2001))；Colligan等,Current Protocols in Protein Science,(John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001))，各自以引用的方式整体并入本文。
在一种用于产生由本发明提供的抗体的方法中，通过使适合永生细胞系(例如骨髓瘤细胞系)与多种抗体产生性细胞之一融合来产生杂交瘤。适合永生细胞系包括但不限于Sp2/0、Sp2/0-AG14、P3/NS1/Ag4-1、NSO、P3X63Ag8.653、MCP-11、S-194、异源骨髓瘤、其融合产物或由其产生的任何细胞或融合细胞或如本领域中已知和/或可出于这个目的商购(例如ATCC)的任何其它适合细胞系。适合抗体产生性细胞包括但不限于分离的或克隆的脾细胞、外周血液细胞、淋巴细胞、扁桃腺细胞或其它免疫细胞或含有B细胞的细胞或表达呈内源性或异源性核酸形式的重链或轻链恒定或可变或框架或CDR序列的任何其它细胞，所述核酸呈重组或内源性病毒、细菌、藻类、原核生物、两栖动物、昆虫、爬行动物、鱼、哺乳动物、啮齿动物、马科动物、羊科动物、山羊、绵羊、灵长类动物、真核生物、基因组DNA、cDNA、rDNA、线粒体DNA或RNA、叶绿体DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、单链、双链或三链、杂交等或其任何组合形式。参见例如Ausubel(上文)和Colligan,Immunology(上文),第2章，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。
用于产生上述各种实施方案的抗体的其它方法包括但不限于自肽或蛋白质文库选择重组抗体的方法，所述文库包括可商购自Cambridge antibodyTechnologies,Cambridgeshire,UK；MorphoSys,Martinsreid/Planegg,Del.；Biovation,Aberdeen,Scotland,UK；Biolnvent,Lund,Sweden；Dyax Corp.,Enzon,Affymax/Biosite；Xoma,Berkeley,Calif.；Ixsys；Applied MolecularEvolution等的那些；依赖使能够产生多组可选择人抗体的转基因动物免疫的方法(通常，这些小鼠包含至少一种包含来自至少一个功能重排或可经受功能性重排的人免疫球蛋白基因座的DNA的转基因；所述小鼠中的内源性免疫球蛋白基因座可被破坏或缺失以消除动物产生由内源性基因编码的抗体的能力)；选择方法，包括核糖体展示、单细胞抗体产生技术(例如选择淋巴细胞抗体方法(“SLAM”))和B细胞选择；使用环磷酸胺处理的消减免疫；以及本领域中任何其它常规方法，包括但不限于美国公布申请号2005/0142609中所述的那些，所述方法以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，抗体是可通过如例如以下中所列和所例证的已知技术的任一者或组合产生的最优全长嵌合或人源化抗体：“由James Shirvill于2010年所著的Business Insights,Preclinical Development of MonoclonalAntibodies and Related Biologicals-Emerging technologies and new therapeuticcandidates”的第3、4和5章，其整个内容以引用的方式并入本文，所述技术如：CDR移植，如UBC的SLAM技术、PDL的SMART技术、AranaTherapeutics plc的超级人源化、框架拼凑、用于制备复合人抗体的技术、BioAtla LLC的ATLAb平台、人工程化、突变谱系指导(MLG)策略、去免疫策略、人化策略、人工程学(例如XOMA的HE技术)、FcX、Biolex TherapeuticsInc(Pittsboro,NC,US)LEX系统、Potelligent方法(例如BioWa)、Complegent技术、BestMAb、ImmunoBody、EB66、Synageva表达平台、Xencor Inc.XmAb、糖工程改造抗体(例如Seattle Genetics Inc(Bothell,WA,US))、“Wox”(色氨酸氧化)抗体(例如InNexus Biotechnology Inc(Vancouver,BC,Canada))等。在一些实施方案中，抗体是完全人单克隆抗体，且可通过如例如以下中所列和所例证的技术平台之一或组合产生：“由James Shirvill于2010年所著的Business Insights,Preclinical Development of Monoclonal Antibodie and RelatedBiologicals-Emerging technologies and new therapeutic candidates”的第4章，且所述技术平台包括但不限于：噬菌体展示(例如PDL、Dyax Corp；Cambridge,MA,US)；分子基抗体筛选(MBAS)(例如像EP0547201和US6,730,483中所述的Affitech A/S)；基于细胞的抗体选择(CBAS)平台；人组合抗体文库(HuCAL；例如MorphoSys AG)；MAbstract平台(例如Crucell NV)，包括用PER.C6细胞系的那些；Adimab平台；XenoMouse；UltiMAb平台；SEBVI平台；Veloclmmune平台、开放单克隆技术平台、Xenerex平台；克隆人反应平台(例如IQ Therapeutics)和“即时免疫性抗体”；Viventia平台(例如Fusogenics、UnLock、ImmunoMine)；“天然人抗体”平台(例如OncoMab、Patrys、Acceptys)；MablgX(例如Kenta Biotech)；逆翻译医药平台(例如Neuimmune Therapeutics)；I-STAR(例如Theraclone Sciences)；CellSpot(例如Trellis Bioscience)；iBioLaunch(例如iBio Inc.)等。
在一些实施方案中，通过使用如以下中所述的一种或多种技术平台和方法使抗体连接于非抗体试剂来修饰所述抗体：“由James Shirvill于2010年所著的Business Insights,Preclinical Development of Monoclonal Antibodie andRelated Biologicals-Emerging technologies and new therapeutic candidates”的第5章，所述技术平台和方法包括：抗体药物缀合物(例如ADC，SeattleGenetics)；靶向抗体载荷(TAP；Immunogen Inc)；蛋白水解激活抗体(Probody)(例如CytomX Therapeutics)；抗体掩饰(例如BioTransformations)；靶向光动力疗法(例如PhotoBiotics)；AlbudAb(例如GSK)；hyFc(例如Genexine)；配体陷阱(Ligand trap)(例如BioLogix)；CovX-Body(例如CovX)；动态交联(例如InNexus Biotechnology)；LEC技术(例如Pivotal Biosciences,Morphotek)等。
在一些实施方案中，抗体或其编码cDNA可进一步被修饰。因此，在另一实施方案中，本发明提供产生各种实施方案的抗体的方法，其中所述方法包括产生嵌合抗体、人源化抗体或那些抗体的任一者的类似物的任一步骤。在一些实施方案中，嵌合抗体的产生是如国际申请WO89/09622中所述。用于产生人源化抗体的方法例如描述于美国专利号6,548,640或加拿大专利号1340879(CDR移植)中。
此外，抗体或其编码cDNA可进一步被修饰。因此，在另一实施方案中，本发明提供包括产生单链抗体、Fab片段、双特异性抗体、融合抗体、标记的抗体或那些抗体的任一者的类似物的任一步骤的方法。如上所论述，除完全抗体之外，本发明抗体也可以多种形式存在；包括例如Fv、Fab和F(ab)2以及呈单链形式。参见例如国际申请WO88/09344。此外，双链抗体和V样结构域结合分子为本领域技术人员所熟知；参见例如美国专利号7,166,697。
在一些实施方案中，抗体(例如DC8E8)被修饰或充当用于制备具有一种或多种对于DC8E8抗体所述的抗原结合性质的结合分子的基础。这些结合蛋白可通过一种或多种例如于以下中所列和所例证的技术制备：“由JamesShirvill于2010年所著的Business Insights,Preclinical Development ofMonoclonal Antibodies and Related Biologicals-Emerging technologies and newtherapeutic candidates”的第6章，所述技术包括：Fab、TetraMAB(例如GalileoOncologics)；scFv；Immuna(例如ESBA Tech AG)；[scFv]2，包括结合DC8E8的四种治疗表位的任何两者的结合分子；BiTE(Affitech,Micromet AG)；亲合抗体(例如Avipep Pty)；TandAb(例如Affimed Therapeutics)；柔性抗体(例如Affirmed)；V-NAR(例如AdAlta)；纳米抗体(Ablynx NV)；结构域抗体(例如Diversys Ltd.GSK，美国专利号6,248,516和EP0368684)；杂聚物(例如ElusysTherapeutics Inc.)；单抗体(Unibody)(例如GenMab A/S)；结构域交换抗体(例如Calmune Corporation，Science.2003年6月27日；300(5628):2065-71)；小模块免疫医药(SMIP)和SCORPION分子(例如Trubion Pharmaceuticals)；双可变结构域免疫球蛋白DVD-Ig(Abbott Laboratories)等。
可使用本领域中已知的常规技术，例如通过单独或组合使用氨基酸缺失、插入、取代、添加和/或重组和/或本领域中已知的任何其它修饰来进一步修饰本发明抗体或其相应免疫球蛋白链。参见例如以下进一步提供的实施例。用于在潜伏在免疫球蛋白链的氨基酸序列下的DNA序列中引入所述修饰的方法为本领域技术人员所知。参见例如Sambrook(上文)和Ausubel(上文)。对本发明抗体的修饰包括在一个或多个组成性氨基酸处进行化学和/或酶促衍生，包括侧链修饰、骨架修饰以及N末端和C末端修饰，包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化和连接或移除碳水化合物或脂质部分、辅因子等。同样，本发明涵盖产生包含在氨基末端处的融合于在羧基末端处的异源分子(如免疫刺激性配体)的所述抗体或其某一片段的嵌合蛋白质。对于相应技术细节，参见例如以引用的方式整体并入本文的国际申请WO00/30680。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于产生抗体或其结合片段或免疫球蛋白链的方法，所述方法包括
(a)培养如上所述的细胞；以及
(b)自培养物分离所述抗体或其结合片段或免疫球蛋白链。
在一些实施方案中，分离包括使含抗体样本与所述抗体与之结合的由本发明提供的一种肽接触。
转化的宿主可在发酵罐中生长且根据本领域中已知的技术加以培养以实现最优细胞生长。一旦表达，本发明的完整抗体、其二聚体、个别轻链和重链或其它免疫球蛋白形式即可根据本领域的标准程序加以纯化，所述标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱、凝胶电泳等；参见Scopes,“ProteinPurification”,Springer Verlag,N.Y.(1982)。抗体或其相应免疫球蛋白链可接着自生长培养基、细胞溶解产物或细胞膜部分分离。对例如由本发明提供的重组表达抗体或免疫球蛋白链的分离和纯化可通过任何常规手段来进行，所述手段例如像制备型色谱分离和免疫分离，如涉及使用针对本发明抗体的恒定区的单克隆或多克隆抗体的那些。
具有至少约90％至95％均质性的大致上纯净免疫球蛋白是优选的，且98％至99％或以上均质性最优选用于医药用途。一旦部分纯化或纯化至如所需的均质性，抗体即可接着加以治疗性(包括体外)使用或用于开发和进行测定程序。
本发明也提供出于如药物靶向和成像应用的目的偶合于其它部分的抗体。所述偶合可在抗体表达之后以化学方式对连接位点进行或偶合产物可在DNA层面上工程改造至本发明抗体中。DNA接着在适合宿主系统中表达，且必要时收集和复原表达的蛋白质。
本发明也涉及一种用于产生能够表达本发明抗体或其相应免疫球蛋白链的细胞的方法，所述方法包括用本发明的聚核苷酸或载体遗传工程改造细胞。可通过本发明方法获得的细胞可例如用于测试本发明抗体与其抗原的相互作用。
本发明也提供抗体产生性细胞系和重组细胞作为由本发明提供的抗体的来源。本发明进一步涉及包括由本发明提供的抗体或等效结合分子的诊断测定和试剂盒且涉及基于其的治疗方法。
本发明也提供用于产生能够与DC8E8竞争且也能够抑制病理性tau蛋白-tau蛋白相互作用的抗体的方法。那些抗体可通过其充分与DC8E8竞争结合tau蛋白以及结合一种、两种、三种或全部四种本文鉴定的“治疗表位”的能力来筛选。
本发明也涉及编码一种或多种由本发明提供的基于抗体的药剂的聚核苷酸。在某些情况下，核苷酸例如编码上述抗体的免疫球蛋白链的至少结合结构域或可变区。通常，由聚核苷酸编码的所述可变区包含所述抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。本领域技术人员了解抗体的各可变结构域(重链VH和轻链VL)包含由四个相对保守的框架区或“FR”侧接的三个高变区，有时称为互补决定区或“CDR”，且指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。根据Kabat编号系统，抗体的人IgG亚型的高变区或CDR包含轻链可变结构域中残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)的氨基酸残基，如由Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)所述；和/或来自高变环的那些残基，即轻链可变结构域中残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)，如由Chothia等,J.Mol.Biol.196(1987),901-917所述。在IMGT独特编号系统中，保守氨基酸始终具有相同位置，例如半胱氨酸23(第1CYS)、色氨酸41(保守TRP)、疏水性氨基酸89、半胱氨酸104(第2CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。参见例如Lefranc M.-P.,Immunology Today18,509(1997)；LefrancM.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L,Thouvenin-Contet,V.和Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)。IMGT独特编号提供框架区(FR1-IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：39至55，FR3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128)和互补决定区：CDR1-IMGT：27至38、CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117的标准化界限。IMGT独特编号用于指定为IMGTColliers de Perles的2D图解表示中。参见例如Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)；Kaas,Q.和Lefranc,M.-P.,CurrentBioinformatics,2,21-30(2007)。其也用于表示3D结构。参见例如IMGT/3Dstructure-DB Kaas,Q.,Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,T cell receptor andMHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)。框架或FR残基是除高变区以外且托住高变区的那些可变结构域残基。
因此，本发明也涉及一种特征在于其是在以下核酸(包括任何简并遗传密码)之中选择的分离的核酸：
a)编码本发明抗体的核酸、DNA或RNA；
b)互补于如a)中定义的核酸的核酸；
c)具有至少18个核苷酸的能够在高度严格条件下与至少一个选自SEQID NO.117-122以及SEQ ID NO.247、253、255、257-259、122、261、262、264、265-267和269的CDR杂交的核酸；和
d)具有至少18个核苷酸的能够在高度严格条件下至少与具有核酸序列SEQ ID165的轻链和/或具有核酸序列SEQ ID No.170的重链、或在最优比对之后与序列SEQ ID No.165和/或SEQ ID170具有至少80％，例如85％、90％、95％和98％同一性的序列，例如与至少一个来自SEQ ID No.165和/或SEQ ID170的根据IMGT编号的CDR杂交的核酸。
在最优比对之后展现与优选序列至少80％，例如85％、90％、95％和98％同一性百分比的核酸序列意味关于参照核酸序列展现某些修饰，如特定言之缺失、截短、延伸、嵌合融合和/或取代，特别是准时(punctual)修饰的核酸序列。在一些实施方案中，这些序列是编码与参照序列相同的氨基酸序列的序列，这与遗传密码的简并或可能与参照序列例如在高度严格条件(特别是以下定义的那些条件)下特异性杂交的互补性序列相关。
在高度严格条件下的杂交意味以以下方式选择与温度和离子强度相关的条件：所述条件允许两个互补性DNA片段之间的杂交得以维持。仅说明而言，出于定义上述聚核苷酸片段的目的的杂交步骤的高度严格条件有利地如下所示。
DNA-DNA或DNA-RNA杂交是以两步进行：(1)在42℃下于含有5XSSC(1X SSC对应于0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠的溶液)、50％甲酰胺、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、10X登哈特氏溶液(Denhardt's)、5％硫酸葡聚糖和1％鲑鱼精液DNA的磷酸盐缓冲液(20mM，pH7.5)中预杂交3小时；(2)在取决于探针长度的温度(即：42℃用于长度>100个核苷酸的探针)下初级杂交20小时，随后进行2次在20℃下于2X SSC+2％SDS中的20分钟洗涤、1次在20℃下于0.1X SSC+0.1％SDS中的20分钟洗涤。对于长度>100个核苷酸的探针，在60℃下于0.1X SSC+0.1％SDS中进行末次洗涤30分钟。用于确定大小的聚核苷酸的上述高度严格杂交条件可由本领域技术人员根据Sambrook等(Molecular cloning:a laboratory manual,Cold Spring HarborLaboratory；第3版,2001)中所述的程序针对较长或较短寡核苷酸加以改适。
可使用任何适合方法以实验方式测定抗体对抗原的亲和力或亲合力(avidity)；参见例如Pope ME,Soste MV,Eyford BA,Anderson NL,PearsonTW.(2009)J Immunol Methods.341(1-2):86-96和本文所述的方法。如果在不同条件(例如盐浓度、pH)下测量，那么特定抗体-抗原相互作用的测量亲和力可变化。因此，用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液对亲和力和其它抗原结合参数(例如KD、IC50)进行测量。
本发明也规定具有上述可变结构域的抗体的可变结构域可用于构建具有所需特异性和生物功能的其它多肽或抗体。因此，本发明也涵盖包含上述可变结构域的至少一个CDR且有利地具有与随附实例中所述的抗体大致上相同或类似的结合性质的多肽和抗体。本领域技术人员将了解使用本文所述的可变结构域或CDR，可根据本领域中已知的方法，例如如欧洲专利申请EP 0 451 216 A1和EP 0 549 581 A1中所述的方法构建抗体。此外，本领域技术人员了解结合亲和力可通过在CDR内或在部分与如由Kabat定义的CDR重叠的高变环内(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196(1987),901-917)进行氨基酸取代来增强。因此，本发明也涉及一个或多个提及的CDR包含一个或多个，例如不超过两个氨基酸取代的抗体。在一些实施方案中，本发明抗体在其一个或两个免疫球蛋白链中包含如图3B和3E中所述的可变区的两个或全部三个CDR。在一些实施方案中，本发明抗体在其一个或两个免疫球蛋白链中包含如图25B中所述的两个或全部三个CDR。
编码上述抗体的聚核苷酸或核酸可为例如包含那些聚核苷酸的任一者(单独或组合)的DNA、cDNA、RNA或合成产生的DNA或RNA或重组产生的嵌合核酸分子。在一些实施方案中，聚核苷酸是载体的一部分。所述载体可包含其它基因，如允许在适合宿主细胞中和在适合条件下选择所述载体的标记基因。
在一些实施方案中，聚核苷酸可操作地连接于一种或多种表达控制序列，从而允许在原核或真核细胞中表达。所述聚核苷酸的表达包括使聚核苷酸转录成可翻译mRNA。确保在例如哺乳动物细胞的真核细胞中表达的调控元件为本领域技术人员所知。它们通常包含确保转录启始的调控序列和任选确保转录终止和转录物稳定化的聚A信号。其它调控元件可包括转录增强子以及翻译增强子和/或天然缔合或异源启动子区域。
在这个方面，本领域技术人员将了解至少编码轻链和/或重链的可变结构域的聚核苷酸可编码两个或仅一个免疫球蛋白链的可变结构域。同样，所述聚核苷酸可受同一启动子控制或可被分别控制以进行表达。允许在原核宿主细胞中表达的可能调控元件包括例如大肠杆菌中的PL、lac、trp或tac启动子，且允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其它动物细胞中的CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、CMV增强子、SV40增强子或球蛋白内含子。
除负责启始转录的元件之外，所述调控元件也可包括在聚核苷酸下游的转录终止信号，如SV40聚A位点或tk聚A位点。此外，视所用表达系统而定，能够将多肽引导至细胞区室或使其分泌至培养基中的前导序列可添加至聚核苷酸的编码序列中且在本领域中是已知的。前导序列以适当相位与翻译、启始和终止序列、以及任选能够引导翻译的蛋白质或其部分分泌至周质间隙或细胞外培养基中的前导序列一起装配。在一些实施方案中，异源序列可编码包括C末端或N末端鉴定肽的融合蛋白，所述鉴定肽赋予所需特征，例如使表达的重组产物稳定化或纯化简化。在这个情形下，适合表达载体在本领域中是已知的，且不加限制地包括Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)和pSPORT1(GIBCO BRL)。
在一些实施方案中，表达控制序列可为能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，但也可使用原核宿主的控制序列。一旦载体已并入适当宿主中，即在适于高水平表达核苷酸序列的条件下维持宿主，且根据需要可继之以收集和纯化免疫球蛋白轻链、重链、轻链/重链二聚体或完整抗体、结合片段或其它免疫球蛋白形式。参见例如Beychok,Cells ofImmunoglobulin Synthesis,Academic Press,N.Y.,(1979)。
此外，本发明提供常规用于遗传工程中的包含编码本发明抗体的免疫球蛋白链的可变结构域的聚核苷酸；任选以及编码本发明抗体的其它免疫球蛋白链的可变结构域的本发明聚核苷酸的载体，特别是质粒、粘粒、病毒和噬菌体。在一些实施方案中，所述载体是表达载体和/或基因转移或靶向载体。源于如反转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头状瘤病毒的病毒的表达载体可用于将本发明的聚核苷酸或载体递送至靶细胞群体中。为本领域技术人员所知的任何方法都可用于构建重组病毒载体。参见例如Sambrook(上文)和Ausubel(上文)中所述的技术。或者，由本发明提供的聚核苷酸和载体可重构至脂质体中以达成递送至靶细胞。可通过视细胞宿主的类型而变化的已知方法将含有由本发明提供的聚核苷酸(例如免疫球蛋白链编码序列的重链和/或轻链可变结构域和表达控制序列)的载体转移至宿主细胞中。举例而言，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主。
此外，本发明涉及用由本发明提供的聚核苷酸或载体转化的宿主细胞。宿主细胞可为原核或真核细胞。存在于宿主细胞中的聚核苷酸或载体可整合入宿主细胞的基因组中或其可维持在染色体外。宿主细胞可为任何原核或真核细胞，如细菌、昆虫、真菌、植物、动物或人细胞。优选真菌细胞是例如酵母属(Saccharomyces)的那些真菌细胞，特别是酿酒酵母(S.cerevisiae)种类的那些真菌细胞。视重组产生程序中采用的宿主而定，由本发明的聚核苷酸编码的抗体或免疫球蛋白链可被糖基化或可为非糖基化的。由本发明提供的某些抗体或相应免疫球蛋白链也可包括初始甲硫氨酸氨基酸残基。本发明的聚核苷酸可用于使用通常为本领域普通技术人员所知的任何技术转化或转染宿主。此外，用于制备融合可操作地连接的基因以及在例如哺乳动物细胞和细菌中表达它们的方法在本领域中是熟知的。参见例如Sambrook。其中所述的遗传构建体和方法可用于在真核或原核宿主中表达由本发明提供的抗体或其相应免疫球蛋白链。一般而言，含有有助于插入聚核苷酸高效转录的启动子序列的表达载体与宿主联合使用。表达载体通常含有复制起点、启动子和终止子、以及能够提供对转化的细胞进行表型选择的特定基因。用于免疫球蛋白表达和分泌的DNA序列和宿主细胞的适合来源细胞可自许多来源，如美国典型培养物保藏中心(“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”,第5版(1985)Manassas,VA,U.S.A.和其它可用版本，所述目录以引用的方式并入本文)获得。此外，包含本发明细胞的转基因动物(例如哺乳动物)可用于大规模产生本发明抗体。
另外，本发明涵盖小肽，包括含有如上所述的结合分子，例如含有任一提及的抗体的可变区的CDR3区的那些，所述CDR3区特别是重链的CDR3，因为已常常观察到对于某些抗体，重链CDR3(HCDR3)是具有较大可变度且主要参与抗原-抗体相互作用的区域。所述肽可被合成或通过重组手段产生以产生根据本发明适用的结合剂。所述方法为本领域普通技术人员所知。可例如使用可商购的自动肽合成仪来合成肽。肽也可利用重组技术，通过将表达肽的DNA并入表达载体中且用所述表达载体转化细胞以产生肽来产生。
上述融合蛋白可进一步包含可称为间隔子部分的蛋白酶可裂解接头或裂解位点。这些间隔子部分又可为不溶性或可溶性的(Diener等,Science231(1986),148)且可被选择来使得药物能够在靶部位处自抗体释放。可偶合于用于免疫疗法的本发明抗体的治疗剂的实例是药物、放射性同位素、凝集素和毒素。可缀合于本发明抗体和抗原的药物包括经典地称为药物的化合物，如丝裂霉素C(mitomycin C)、道诺霉素(daunorubicin)和长春花碱(vinblastine)。在使用用于例如免疫疗法的放射性同位素缀合的本发明抗体或抗原时，视如白细胞分布以及同种型稳定性和发射的因素而定，某些同位素可比其它同位素更优选。视自体免疫反应而定，一些发射体可优于其它发射体。一般而言，α和β粒子发射性放射性同位素在免疫疗法中是优选的。在某些优选情况下，放射性同位素是短程高能量α发射体，如212Bi。可出于治疗目的结合于本发明抗体或抗原的放射性同位素的实例是125I、131I、90Y、67Cu、212Bi、212At、211Pb、47Sc、109Pd和188Re。在某些情况下，放射性标记是64Cu。可偶合于本发明抗体或抗原的其它治疗剂以及离体和体内治疗方案是已知的，或可由本领域普通技术人员确定。只要在适当时，本领域技术人员可使用编码上述抗体、抗原或相应载体的任一者(且作为其来源)的本发明聚核苷酸而非其自身蛋白质性物质。
本发明也涉及如本文提供的结合分子或抗体制备用于体内抑制受试者中形成错误无序和/或错序tau蛋白或用于另外降低受试者中的错误无序和/或错序tau蛋白的水平的组合物；或用于体外自体液提取病理性tau蛋白化合物或其前体的用途。这些方法可用于提高认知或减缓或逆转与疾病相关的认知衰退。由本发明提供的抗体或结合分子或其化学衍生物可直接向血液或CSF施用且在随后步骤中通过亲和力捕捉自血液或CSF加以螯合，藉此错序和错误无序tau蛋白连同以上提及的结合分子一起被螯合。因此，本发明也涉及一种治疗或预防受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的发作或进展的方法，所述方法包括自所述受试者的身体移除血液或CSF，检试所述血液和CSF且分别使所述血液和CSF返回至所述受试者中，因此获得所述治疗或预防。
含有本发明的抗体、肽或结合分子/蛋白质的分子和粒子也具有诊断效用。本发明提供识别且区分在阿尔茨海默病的不同阶段存在的不同形式的tau蛋白的抗体。这些抗体在体外和在体内均能够检测tau蛋白(及其各种构象变化)。抗体可在多种测定中区分生理性tau蛋白与病理性tau蛋白，所述测定包括生物化学、免疫沉淀、ELISA、蛋白质印迹和免疫组织化学测定(例如新鲜、固定、冷冻、石蜡包埋)、以及使用例如会区分生理性tau蛋白与病理性tau蛋白的放射性标记的DC8E8(包括DC8E8的片段，如单链DC8E8)的体内成像(参见实施例)。它们能够在固体和流体(例如血液、血浆、CSF、组织匀浆)动物(例如啮齿动物、人)样本和活检中这样做。这些检测测定的一些描述于以下实施例中。用于检测蛋白质的其它常规方法为本领域技术人员所知，且因此可常规地适合于由本发明提供的抗体、肽和tau蛋白结合分子。本发明抗体可被标记(例如荧光、放射性、酶、核磁、重金属标记)且用于体内或体外检测特定靶标，包括体外免疫化学样测定(参见例如下述实施例)。此外，在体内，它们可以与核医学成像技术类似的方式用于检测具有错误无序tau蛋白及其沉积物的组织、细胞或其它材料。用可通过MRI或PET检测的诊断成像探针靶向细胞内和细胞外错误无序tau蛋白和神经原纤维病变将提供一种更明确死前诊断AD的生物标记物以及用于监测靶向tau蛋白的疗法的功效的手段。因此，本发明提供本文所述的抗体制备用于tau蛋白检测和/或使诊断剂靶向脑的病理性tau蛋白和神经原纤维病变以达成AD诊断的组合物的用途和本文所述的抗体在tau蛋白检测和/或使诊断剂靶向脑的病理性tau蛋白和神经原纤维病变以达成AD诊断的方法中的用途。这些组合物和方法可用作AD和相关tau蛋白病变治疗方案的一部分。
本发明提供适用于免疫测定中的抗体，在所述免疫测定中，所述抗体可以液相加以利用或结合于固相载体。可利用本发明抗体的免疫测定的实例是呈直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫测定。所述免疫测定的实例是放射免疫测定(RIA)、夹心式免疫测定(免疫计量测定)、流动式细胞测量术和蛋白质印迹测定。本发明抗体可结合于许多不同载体之一且用于分离与其特异性结合的细胞。已知载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。出于本发明的目的，载体可为可溶性的或不溶性的。存在为本领域普通技术人员所知的许多不同标记和标记方法。
可用于本发明中的各类型标记的实例包括酶、放射性同位素和放射性核素、胶态金属、荧光化合物、化学发光化合物、生物素基基团、由二级报道子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)、和化学/电化学/生物发光化合物。酶包括过氧化酶(例如HRP)、荧光素酶、碱性磷酸酶、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡萄糖-6磷酸脱氢酶。或者，标记是生物素、地高辛(digoxigenin)或5-溴-脱氧尿苷。荧光标记也可与由本发明提供的抗体和tau蛋白结合蛋白组合，所述标记包括若丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体、荧光素及其衍生物、荧光染料、若丹明及其衍生物、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)和其它荧光蛋白、丹磺酰、伞形酮。在所述缀合物中，本发明的抗体/结合蛋白可通过为本领域技术人员所知的方法制备。它们可接着直接；通过间隔子基团或键联基团，如聚醛、戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)或二乙三胺五乙酸(DPTA)；或在如本领域中常规已知的那些结合剂的其它结合剂存在下与酶或荧光标记结合。携带荧光素标记的缀合物可通过例如与异硫氰酸酯反应来制备。在某些情形下，标记或标记物也可为治疗性的。
其它缀合物可包括化学发光标记，如鲁米诺(luminol)和二氧杂环丁烷；生物发光标记，如荧光素酶和荧光素；或放射性标记，如碘123、碘125、碘126、碘133,131、溴77、锝99m、铟111、铟113m、镓67、镓68、钌95、钌97、钌103、钌105、汞107、汞203、铼99m、铼101、铼105、钪47、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、氟18、钇199和碘131。为本领域技术人员所知用于用放射性同位素直接或通过以上提及的如EDTA或DTPA的螯合剂标记抗体的现存方法可如同诊断放射性同位素一样加以使用。参见例如通过氯胺-T技术用[I125]Na标记[Hunter W.M.和Greenwood F.C.(1962)Nature194:495]；如由Crockford等(美国专利4,424,200)所述用锝99m标记；以及如由Hnatowich(美国专利4,479,930)所述通过DTPA结合。
本发明也提供也可用于诊断个体的病症的方法中的抗体和其它tau蛋白结合分子，所述方法是通过自所述个体获得可为血液样本、淋巴样本或任何其它体液样本的体液样本，且使所述体液样本与本发明抗体在使得能够形成抗体-抗原复合物的条件下接触来进行。接着通过本领域中已知的方法测定所述复合物的存在和/或量，水平显著高于对照样本中形成的水平指示在所测试个体中存在疾病。因此，本发明涉及一种包括本发明抗体的体外免疫测定。
此外，本发明涉及采用本发明的任一tau蛋白结合分子的体内成像技术。举例而言，会产生身体部分的三维图像的医学成像技术正电子发射断层摄影法(PET)是基于对来自正电子发射的辐射的检测。通常，生物分子被放射性标记，例如其合并有放射性示踪同位素。在通常通过向血液循环中注射来向受试者施用标记的生物分子后，放射性标记的生物分子变得在目标组织中富集。接着将受试者置放在检测正电子发射的成像扫描器中。在一个实施方案中，向受试者施用标记的(例如64Cu标记的)结合分子(如抗体)且通过将所述受试者置放在成像扫描器中且检测正电子发射来对所述结合分子及因此错误无序或错序tau蛋白进行检测，由此如果检测到发射，那么指示神经病症。因此，本发明涵盖一种用于PET成像的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的64Cu标记或等效物标记的结合分子的步骤。
本发明也提供一种如医药和诊断包装或试剂盒的制品，所述制品包括一个或多个用一种或多种如由本发明提供的上述成分(即结合分子、抗体或其结合片段、聚核苷酸、载体或细胞)填充的容器。与所述容器相伴的可为由管制医药或生物产品的制造、使用或销售的政府机构开具的呈表格形式的报告书，所述报告书反映由制造、使用或销售的机构核准供人施用。此外或或者，试剂盒包括用于适当诊断测定中的试剂和/或说明书。本发明的组合物或试剂盒适于诊断、预防和治疗阿尔茨海默病和相关tau蛋白病变。
由本发明提供的例如抗体的结合分子的生物活性表明它们具有足以使其成为用于达成向细胞或组织的药物定位/药物递送的候选物的亲和力。靶向和结合于错误无序tau蛋白沉积物可适用于递送治疗或诊断活性药剂和基因疗法/基因递送。因此，本发明提供本文所述的抗体制备用于检测和/或使治疗剂或诊断剂靶向脑的病理性tau蛋白和神经原纤维病变的组合物的用途和本文所述的抗体在检测和/或使治疗剂或诊断剂靶向脑的病理性tau蛋白和神经原纤维病变的方法中的用途。这些组合物和方法可用作AD和相关tau蛋白病变治疗方案的一部分。
因此，本发明涉及组合物，所述组合物包含一种或多种以上提及的化合物，包括结合分子、抗体、结合片段；其化学衍生物；聚核苷酸、载体和细胞。某些组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的载体和一种或多种药学上可接受的稀释剂。某些化学衍生物包含通常不是基础分子或细胞的(例如抗体、结合分子、聚核苷酸、载体和细胞的)一部分但通过常规方法与它们连接的化学部分。所述部分可起例如以下作用：提高基础分子或细胞的溶解性、半衰期、可视化、可检测性和/或吸收等。或者，部分可减弱基础分子的不合需要副作用或降低基础分子的毒性。
本发明也提供医药组合物，视医药组合物的预定用途而定，所述医药组合物包含本文提供的抗体与其它药剂，如与白介素或干扰素的组合。举例而言，对于用于治疗阿尔茨海默病，额外药剂可选自由小有机分子、抗tau蛋白抗体、抗β-淀粉状蛋白抗体、及其组合组成的组。其它药剂包括但不限于乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂、过渡金属螯合剂、生长因子、激素、非类固醇消炎药物(NSAID)、抗氧化剂、脂质降低剂、选择性磷酸二酯酶抑制剂、tau蛋白聚集抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂、抗淀粉状蛋白被动和主动免疫试剂、抗淀粉状蛋白聚集抑制剂和分泌酶抑制剂。因此，在一实施方案中，本发明涉及本发明的结合分子、抗体或结合片段或具有与其任一者大致上相同的结合特异性的结合分子、本发明的聚核苷酸、载体或细胞用于制备医药或诊断组合物的用途，所述组合物用于治疗阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变或预防其进展；改善与阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状；针对阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的存在性诊断或筛选受试者以确定受试者显现阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的风险。
用于诊断、主动免疫和AD疗法的肽
本发明是部分基于发现当注射至AD的大鼠模型中时，tau蛋白的某些片段在诱导对病理性tau蛋白的免疫反应方面具有活性，且将被预期在人中也会这样做。发现包含一个或多个以上通过DC8E8鉴定为AD显现和进展的促进者或至少参与者的tau蛋白区域的这些免疫原性tau蛋白片段能够(i)促进AD脑内的细胞外tau蛋白沉积物清除(大鼠模型)；(ii)在动物模型中诱导产生针对AD的保护性抗体；和/或(iii)减缓AD在接受性受试者中的进展，如通过在动物模型中进行的一种或多种生物化学和神经学测定所测量。它们也可直接以物理方式干扰tau蛋白沿这些区域形成病理性tau蛋白-tau蛋白相互作用的能力。
本发明提供源于新近鉴定的tau蛋白区域的免疫原或免疫原性肽，所述区域对于形成PHF的核心而言是重要的且促进体外PHF装配。策略地靶向这些区域(“治疗表位”)可导致成功治疗AD和相关tau蛋白病变。可在如下述转基因大鼠模型的动物模型中筛选具有治疗功效的免疫原。
在本发明的一实施方案中，tau肽例如涵盖一个以下氨基酸序列，在所述氨基酸序列内分别包含四种治疗表位的各者：a)SEQ ID NO:98tau蛋白267-KHQPGGG-273，b)SEQ ID NO:99tau蛋白298-KHVPGGG-304，c)SEQID NO:100tau蛋白329-HHKPGGG-335，和d)SEQ ID NO:101tau蛋白361-THVPGGG-367(根据长度是441个残基的最长人tau蛋白亚型tau蛋白2N4R加以编号，参见SEQ ID NO:102)。在另一实施方案中，tau肽包含至少一个治疗表位，其中所述治疗表位选自SEQ ID NO:223tau蛋白268-HQPGGG-273、SEQ ID NO:154tau蛋白299-HVPGGG-304、SEQ IDNO:224tau蛋白330-HKPGGG-335和SEQ ID NO:154tau蛋白362-HVPGGG-367。
本发明提供长度是30个氨基酸的免疫原，如表1中所示的任一SEQ IDNO。表1中包括的每个免疫原都是tau蛋白的含有一个治疗表位的分离的片段，所述治疗表位位于SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101内。
表1：各自携带一个治疗表位的Tau蛋白30聚体肽
SEQ ID NO 免疫原 序列
SEQ ID NO：1 Tau251-280 PDLKNVKSKIGS TENLKHQPGGGKVQIINK
SEQ ID NO：2 Tau256-285 VKSKIGSTENLKHQP GGGKVQIINK KLDLS
SEQ ID NO：3 Tau259-288 KIGSTENLKHQP GGGKVQIINK KLDLSNVQ
SEQ ID NO：4 Tau275-304 VQIINKKLDL SNVQSKCGSK DNIKHVPGGG
SEQ ID NO：9 Tau244-273 QTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGG
SEQ ID NO：10 Tau245-274 TAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGK
SEQ ID NO：11 Tau246-275 APVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKV
SEQ ID NO：12 Tau247-276 PVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQ
SEQ ID NO：13 Tau248-277 VPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQI
SEQ ID NO：14 Tau249-278 PMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQII
SEQ ID NO：15 Tau250-279 MPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIIN
SEQ ID NO：16 Tau252-281 DLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKK
SEQ ID NO：17 Tau253-282 LKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKL
SEQ ID NO：18 Tau254-283 KNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLD
SEQ ID NO：19 Tau255-284 NVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDL
SEQ ID NO：20 Tau257-286 KSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSN
SEQ ID NO：21 Tau258-287 SKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNV
SEQ ID NO：22 Tau260-289 IGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQS
SEQ ID NO：23 Tau261-290 GSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSK
SEQ ID NO：24 Tau262-291 STENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKC
SEQ ID NO：25 Tau263-292 TENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCG
SEQ ID NO：26 Tau264-293 ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGS
SEQ ID NO：27 Tau265-294 NLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSK
SEQ ID NO：28 Tau266-295 LKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKD
SEQ ID NO：29 Tau267-296 KHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDN
SEQ ID NO：30 Tau276-305 QIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS
SEQ ID NO：31 Tau277-306 IINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSV
SEQ ID NO：32 Tau278-307 INKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQ
SEQ ID NO：33 Tau279-308 NKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQI
SEQ ID NO：34 Tau280-309 KKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIV
SEQ ID NO：35 Tau281-310 KLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVY
SEQ ID NO：36 Tau282-311 LDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYK
SEQ ID NO：37 Tau283-312 DLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKP
SEQ ID NO：38 Tau284-313 LSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPV
SEQ ID NO：39 Tuu285-314 SNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVD
SEQ ID NO：40 Tau286-315 NVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDL
SEQ ID NO：41 Tau287-316 VQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLS
SEQ ID NO：42 Tau288-317 QSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSK
SEQ ID NO：43 Tau289-318 SKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKV
SEQ ID NO：44 Tau290-319 KCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVT
SEQ ID NO：45 Tau292-321 GSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSK
SEQ ID NO：46 Tau293-322 SKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKC
SEQ ID NO：47 Tau294-323 KDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG
SEQ ID NO：48 Tau295-324 DNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGS
SEQ ID NO：49 Tau296-325 NIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSL
SEQ ID NO：50 Tau297-326 IKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLG
SEQ ID NO：51 Tau298-327 KHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGN
SEQ ID NO：52 Tau307-336 QIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQ
SEQ ID NO：53 Tau308-337 IVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQV
SEQ ID NO：54 Tau309-338 VYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVE
SEQ ID NO：55 Tau310-339 YKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEV
SEQ ID NO：56 Tau311-340 KPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVK
SEQ ID NO：57 Tau312-341 PVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKS
SEQ ID NO：58 Tau313-342 VDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSE
SEQ ID NO：59 Tau314-343 DLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEK
SEQ ID NO：60 Tau315-344 LSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKL
SEQ ID NO：61 Tau316-345 SKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLD
SEQ ID NO：62 Tau317-346 KVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDF
SEQ ID NO：63 Tau318-347 VTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFK
SEQ ID NO：64 Tau319-348 TSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKD
SEQ ID NO：65 Tau320-349 SKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDR
SEQ ID NO：66 Tau321-350 KCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRV
SEQ ID NO：67 Tau322-351 CGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQ
SEQ ID NO：68 Tau323-352 GSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQS
SEQ ID NO：69 Tau324-353 SLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSK
SEQ ID NO：70 Tau325-354 LGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKI
SEQ ID NO：71 Tau326-355 GNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIG
SEQ ID NO：72 Tau327-356 NIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGS
SEQ ID NO：73 Tau328-357 IHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSL
SEQ ID NO：74 Tau329-358 HHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLD
SEQ ID NO：75 Tau339-368 VKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGN
SEQ ID NO：76 Tau340-369 KSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNK
SEQ ID NO：77 Tau341-370 SEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKK
SEQ ID NO：78 Tau342-371 EKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKXI
SEQ ID NO:79 Tau343-372 KLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIE
SEQ ID NO：80 Tau344-373 LDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIET
SEQ ID NO:81 Tau345-374 DFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETH
SEQ ID NO：82 Tau346-375 FKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHK
SEQ ID NO：83 Tau347-376 KDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKL
SEQ ID NO:84 Tau348-377 DRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLT
SEQ ID NO：85 Tau349-378 RVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTF
SEQ ID NO:86 Tau350-379 VQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFR
SEQ ID NO：87 Tau351-380 QSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRE
SEQ ID NO:110 Tau352-381 SKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFREN
SEQ ID NO：89 Tau353-382 KIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENA
SEQ ID NO:90 Tau354-383 IGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAK
SEQ ID NO：91 Tau355-384 GSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAi
SEQ ID NO:92 Tau356-385 SLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAK
SEQ ID NO：93 Tau357-386 LDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKT
SEQ ID NO:94 Tau358-387 DNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTD
SEQ ID NO：95 Tau359-388 NITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDH
SEQ ID NO:96 Tau360-389 ITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHG
SEQ ID NO:97 Tau361-390 THVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGA
在一些实施方案中，免疫原性肽选自SEQ ID NO:1tau蛋白251-PDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINK-280；SEQ ID NO:2tau蛋白256-VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLS-285；SEQ ID NO:3tau蛋白259-KIGSTENLKHQPGGGKVQIINK KLDLSNVQ-288；和SEQ ID NO:4tau蛋白275-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304。
本发明也规定用于本发明中的含有氨基酸序列SEQ ID NO:98267-KHQPGGG-273、或氨基酸SEQ ID NO:99298-KHVPGGG-304、或氨基酸SEQ ID NO:100329-HHKPGGG-335或氨基酸SEQ ID NO:101361-THVPGGG-367的一者或多者的较短和较长免疫原性肽可源于6种人tau蛋白亚型的任一者。在一个实施方案中，免疫原性肽包含至少一个治疗表位，其中所述治疗表位选自SEQ ID NO:223tau蛋白268-HQPGGG-273、SEQ IDNO:154tau蛋白299-HVPGGG-304、SEQ ID NO:224tau蛋白330-HKPGGG-335和SEQ ID NO:154tau蛋白362-HVPGGG-367。在一个实施方案中，免疫原性肽包含选自SEQ ID NO:109Tau蛋白314-DLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSE-342；SEQ ID NO:110Tau蛋白352-SKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFREN-380；SEQ ID NO:111Tau蛋白325-LGNIHHKPGGGQ-336；SEQ ID NO:112Tau蛋白357-LDNITHVPGGGN-368；SEQ ID NO:108Tau蛋白294-305KDNIKHVPGGGS的序列。在一些实施方案中，至少一种免疫原性肽选自以下任一者：SEQ ID NO:1-4、SEQ ID NO:9-101和SEQ ID NO:108-112、NIKAVPGGGS(SEQ ID NO:200)、NIKHVPGGGS(SEQ ID NO:201)、IKHVPGGGS(SEQ ID NO:202)、KHVPGGGSV(SEQ ID NO:203)、HVPGGGSVQ(SEQ ID NO:204)、VPGGGSVQ(SEQ ID NO:205)、GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)和SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)、ANIKHVPGGGS(SEQ ID NO:144)、DAIKHVPGGGS(SEQ ID NO:146)、DNAKHVPGGGS(SEQ ID NO:149)、DNIAHVPGGGS(SEQ ID NO:151)、DNIKAVPGGGS(SEQ ID NO:159)、DNIKHAPGGGS(SEQ ID NO:161)以及DNIKHVPGGGS(SEQ ID NO:171)。
对应于人tau蛋白亚型的氨基酸序列在SEQ ID NO:102-107中给出。
SEQ ID NO:102(2N4R)：
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD
AGLKESPLQT PTEDGSEEPG SETSDAKSTP TAEDVTAPLV
DEGAPGKQAA AQPHTEIPEG TTAEEAGIGD TPSLEDEAAG
HVTQARMVSK SKDGTGSDDK KAKGADGKTK IATPRGAAPP
GQKGQANATR IPAKTPPAPK TPPSSGEPPK SGDRSGYSSP
GSPGTPGSRS RTPSLPTPPT REPKKVAVVR TPPKSPSSAK
SRLQTAPVPM PDLKNVKSKI GSTENLKHQP GGGKVQIINK KLDLSNVQSK
CGSKDNIKHV PGGGSVQIVY KPVDLSKVTS KCGSLGNIHH
KPGGGQVEVK SEKLDFKDRV QSKIGSLDNI THVPGGGNKK IETHKLTFRE
NAKAKTDHGA EIVYKSPVVS GDTSPRHLSN VSSTGSIDMV DSPQLATLAD
EVSASLAKQGL
SEQ ID NO:103(1N4R)：
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD
AGLKESPLQT PTEDGSEEPG SETSDAKSTP TAEAEEAGIG DTPSLEDEAA
GHVTQARMVS KSKDGTGSDD KKAKGADGKT KIATPRGAAP
PGQKGQANAT RIPAKTPPAP KTPPSSGEPP KSGDRSGYSS
PGSPGTPGSR SRTPSLPTPP TREPKKVAVV RTPPKSPSSA
KSRLQTAPVP MPDLKNVKSK IGSTENLKHQ PGGGKVQIIN KKLDLSNVQS
KCGSKDNIKH VPGGGSVQIV YKPVDLSKVT SKCGSLGNIH
HKPGGGQVEV KSEKLDFKDR VQSKIGSLDN ITHVPGGGNK KIETHKLTFR
ENAKAKTDHG AEIVYKSPVV SGDTSPRHLS NVSSTGSIDM VDSPQLATLA
DEVSASLAKQ GL
SEQ ID NO:104(2N3R)：
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD
AGLKESPLQT PTEDGSEEPG SETSDAKSTP TAEDVTAPLV
DEGAPGKQAA AQPHTEIPEG TTAEEAGIGD TPSLEDEAAG
HVTQARMVSK SKDGTGSDDK KAKGADGKTK IATPRGAAPP
GQKGQANATR IPAKTPPAPK TPPSSGEPPK SGDRSGYSSP
GSPGTPGSRS RTPSLPTPPT REPKKVAVVR TPPKSPSSAK
SRLQTAPVPM PDLKNVKSKI GSTENLKHQP GGGKVQIVYK PVDLSKVTSK
CGSLGNIHHK PGGGQVEVKS EKLDFKDRVQ SKIGSLDNIT HVPGGGNKKI
ETHKLTFREN AKAKTDHGAE IVYKSPVVSG DTSPRHLSNV SSTGSIDMVD
SPQLATLADE VSASLAKQGL
SEQ ID NO:105(0N4R)：
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD
AGLKAEEAGI GDTPSLEDEA AGHVTQARMV SKSKDGTGSD
DKKAKGADGK TKIATPRGAA PPGQKGQANA TRIPAKTPPA PKTPPSSGEP
PKSGDRSGYS SPGSPGTPGS RSRTPSLPTP PTREPKKVAV
VRTPPKSPSS AKSRLQTAPV PMPDLKNVKS KIGSTENLKH QPGGGKVQII
NKKLDLSNVQ SKCGSKDNIK HVPGGGSVQI VYKPVDLSKV TSKCGSLGNI
HHKPGGGQVE VKSEKLDFKD RVQSKIGSLD NITHVPGGGN KKIETHKLTF
RENAKAKTDH GAEIVYKSPV VSGDTSPRHL SNVSSTGSID MVDSPQLATL
ADEVSASLAK QGL
SEQ ID NO:106(1N3R)：
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD
AGLKESPLQT PTEDGSEEPG SETSDAKSTP TAEAEEAGIG DTPSLEDEAA
GHVTQARMVS KSKDGTGSDD KKAKGADGKT KIATPRGAAP
PGQKGQANAT RIPAKTPPAP KTPPSSGEPP KSGDRSGYSS
PGSPGTPGSR SRTPSLPTPP TREPKKVAVV RTPPKSPSSA
KSRLQTAPVP MPDLKNVKSK IGSTENLKHQ PGGGKVQIVY KPVDLSKVTS
KCGSLGNIHH KPGGGQVEVK SEKLDFKDRV QSKIGSLDNI
THVPGGGNKK IETHKLTFRE NAKAKTDHGA EIVYKSPVVS GDTSPRHLSN
VSSTGSIDMV DSPQLATLAD EVSASLAKQG L
SEQ ID NO:107(0N3R)：
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD
AGLKAEEAGI GDTPSLEDEA AGHVTQARMV SKSKDGTGSD
DKKAKGADGK TKIATPRGAA PPGQKGQANA TRIPAKTPPA PKTPPSSGEP
PKSGDRSGYS SPGSPGTPGS RSRTPSLPTP PTREPKKVAV
VRTPPKSPSS AKSRLQTAPV PMPDLKNVKS KIGSTENLKH QPGGGKVQIV
YKPVDLSKVT SKCGSLGNIH HKPGGGQVEV KSEKLDFKDR VQSKIGSLDN
ITHVPGGGNK KIETHKLTFR ENAKAKTDHG AEIVYKSPVV SGDTSPRHLS
NVSSTGSIDM VDSPQLATLA DEVSASLAKQ GL
基于肽的疫苗用于在尚无常规疫苗可用的疾病中引发免疫反应是具有吸引力的(Brown,1994；BenYedidia等,1997)。然而，在许多情况下，小肽是不良的免疫原，因为它们充当缺乏必要Th细胞表位和/或由抗原递呈细胞(APC)以低效率捕集的半抗原。在本发明的一个实施方案中，免疫原性表位可为包括tau肽的保护性表位或连同其它氨基酸一起的类似物的较长多肽。
本文所述的用于诱导免疫反应的一些药剂含有适于诱导针对病理性tau蛋白和tau蛋白沉积物的免疫反应的表位，但太小以致不具有免疫原性。在这个情况下，肽免疫原可连接于适合载体以帮助引发免疫反应。在某些实施方案中，适合载体包括血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风类毒素或来自如白喉、大肠杆菌、霍乱或幽门螺旋杆菌(H.pylori)的其它病原细菌的类毒素或减弱的毒素衍生物。用于刺激或增强免疫反应的其它载体包括细胞因子，如IL-1、IL-1α和β肽、IL-2、γINF、IL-10、GM-CSF；和趋化因子，如M1P1α和M1P1β以及RANTES。免疫原性剂也可连接于会增强跨组织转运的肽，如O'Mahony,WO97/17613和WO97/17614中所述。
免疫原性剂可通过化学交联连接于载体。用于使免疫原连接于载体的技术包括使用3-(2-吡啶基-硫基)丙酸N-丁二酰亚胺酯(SPDP)和4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸丁二酰亚胺酯(SMCC)形成二硫键(如果肽缺乏硫氢基，这可通过添加半胱氨酸残基来提供)。这些试剂在其自身与一种蛋白质上的肽半胱氨酸残基之间产生二硫键且通过赖氨酸上的ε-氨基或其它氨基酸中的其它游离氨基产生酰胺键。多种所述二硫化物/酰胺形成剂由Immun.Rev.62,185(1982)加以描述。其它双官能偶合剂形成硫醚而非二硫键。许多这些硫醚形成剂可商购且包括6-顺丁烯二酰亚胺基己酸、2-溴乙酸和2-碘乙酸、4-(N-顺丁烯二酰亚胺基-甲基)环己烷-1-甲酸的反应性酯。羧基可通过使它们与丁二酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸钠盐化合来活化。
免疫原性肽也可与载体一起表达成融合蛋白。免疫原性肽可在氨基末端、羧基末端或在肽内任何地方的位点(内部)连接于载体。在一些实施方案中，免疫原性肽的多个重复序列可存在于融合蛋白中。
举例而言，也提供包括融合蛋白的免疫原，所述融合蛋白包含携带连接于混杂非天然Pan DR Th细胞表位的保护性B细胞表位的tau肽，所述细胞表位诱导针对所述保护性表位的B细胞反应。在另一替代方案中，本发明提供可设计成聚合物(Jackson等,1997)、多抗原肽系统(MAP)(Tam和Recent,1996)、免疫刺激性复合物(ISCOM)(Barr,I.G.和Mitchell,1996)以及可能其它分支两性多肽(Wilkinson等,1998)或通过表位的共线性化产生的嵌合肽(Marussig等,1997)的免疫原。
在某些实施方案中，治疗肽可单独或以组合方式，结合或不结合于药学上可接受的载体(包括KLH、破伤风类毒素、白蛋白结合蛋白、牛血清白蛋白、树状体(MAP；Biol.Chem.358:581))以及例如O'Hagan等(2003)中(特别是内源性免疫增强性化合物以及其中所述的配制系统)和Wilson-Welderer等(2009)(特别是所述文档的表2和3中指示的那些)中所述的佐剂物质或它们的组合、或其混合物来施用。
在某些实施方案中，本发明的免疫原性剂可通过化学交联结合或连接于适合载体以增加针对包括tau蛋白沉积物的病理性tau蛋白的免疫反应。在某些实施方案中，结合或连接的药学上可接受的载体是匙孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素、牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白(Ig)分子、甲状腺球蛋白或卵球蛋白。用于刺激免疫反应的其它载体包括细胞因子(如IL-1、IL-2、IL-10IFNγ、GM-CSF)和趋化因子(如M1P1α和M1P1β)。
Tau肽或类似物可通过固相肽合成或重组表达来合成，或可自天然来源获得。自动肽合成仪可商购自众多供应商，如Applied Biosystems、EZBiolab或Antagene。重组表达系统可包括细菌(如大肠杆菌)、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。用于操作DNA和制备用于重组表达的DNA构建体的程序由Sambrook等(1989)加以描述，用于产生重组蛋白的方法详细描述于CurrentProtocols in Protein Science(第5章“Production of Recombinant Proteins”,5.1-5.24单元,DOI:10.1002/0471140864，也可在onlinelibrary.wiley.com/book/10.1002/0471140864/toc处在线获得)中。
本发明的免疫原性剂可由作为载体(vector/carrier)的病毒或细菌表达。使编码免疫原性肽的核酸并入病毒或细菌的基因组或游离体中。最终，免疫原性肽可表达成分泌蛋白质或与病毒的外表面蛋白质的融合蛋白或可以细菌的跨膜蛋白质形式展示。用于所述方法中的病毒或细菌通常是非病原性的或减弱的。适合病毒包括腺病毒、HSV、委内瑞拉马脑炎病毒和其它α病毒、水泡性口膜炎病毒和其它弹状病毒、牛痘和禽痘。适合细菌包括沙门氏菌(Salmonella)和志贺氏菌(Shigella)。或者，免疫原性肽与HBV的HBsAg的融合是适合的。
本发明的另一方面涉及也可为各种实施方案中所述的各种肽(例如SEQID No:1-4；9-97)或其片段的类似物的治疗剂或免疫原。
本发明也是基于发现在本申请中称为设计治疗表位的新型肽。尽管具有不同于tau蛋白和tau蛋白片段的一级序列的一级序列，但本发明的特征在于设计治疗表位能够具有模拟一种或多种上述tau蛋白“治疗表位”的形状的形状(例如固有无序结构、三级结构、构象)。通过模拟这些区域的一者或多者，这些设计治疗表位可适用于产生针对它们的抗体，如与DC8E8竞争的抗体。这些肽能够与tau蛋白或tau蛋白片段竞争结合以上公开的DC8E8抗体。
也包括当注射至AD的大鼠模型中时，能够诱导对病理性tau蛋白的免疫反应且将被预期在人中这样做的免疫原性设计治疗表位。此外，也公开反应于用一种或多种设计治疗表位进行免疫所产生的，且能够(i)识别一种或多种作为DC8E8的那些表位或模拟DC8E8的那些表位的表位；(ii)区分病理性tau蛋白与正常tau蛋白；和/或(iii)识别人AD脑中和/或AD的转基因大鼠模型中的神经原纤维病变的小鼠抗体/抗血清。
本发明也提供用于预防、治疗和/或诊断阿尔茨海默病的组合物，其中所述组合物包含(i)用于通过抑制tau蛋白-tau蛋白聚集来治疗受试者的阿尔茨海默病的手段；和(2)药学上可接受的载体和/或稀释剂。本发明也提供用于预防、治疗和/或诊断阿尔茨海默病的组合物，其中所述组合物包含(i)用于通过结合病理性tau蛋白中的一种或多种“治疗表位”来治疗受试者的阿尔茨海默病的手段；和(2)药学上可接受的载体和/或稀释剂。本发明也提供用于预防、治疗和/或诊断阿尔茨海默病的组合物，其中所述组合物包含(i)用于通过结合病理性tau蛋白中的一种或多种“治疗表位”来降低tau蛋白-tau蛋白聚集的手段；和(2)药学上可接受的载体和/或稀释剂。
制剂
本发明药剂可以包含治疗剂(例如如上所述的抗体或肽)和一种或多种其它药学上可接受的组分的医药制剂形式施用。参见Remington'sPharmaceutical Science(第15版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1980)。这些制剂包括例如粉末、糊剂、软膏剂、胶状物、蜡状物、油剂、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)囊泡(如LIPOFECTIN)、DNA缀合物、无水吸附糊剂、水包油和油包水乳剂、碳蜡(具有各种分子量的聚乙二醇)乳剂、半固体凝胶剂和含有碳蜡的半固体混合物。任何上文混合物都可适于根据本发明的治疗和疗法，前提是制剂中的活性成分不因配制而失活且制剂与施用途径生理相容且可耐受。对于与为医药化学家所知的制剂、赋形剂和载体相关的额外信息，也参见Baldrick P.“Pharmaceutical excipient development:theneed for preclinical guidance.”Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2):210-8(2000)、Wang W.“Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.”lnt.J.Pharm.203(1-2):1-60(2000)、Charman W N“Lipids,lipophilic drugs,and oraldrug delivery-some emerging concepts.”J.Pharm Sci.89(8):967-78(2000)、Powell等“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA JPharm Sci Technol.52:238-311(1998)和其中的引用。
广泛多种药学上可接受的赋形剂在本领域中是已知的且无需在本文中详细论述。药学上可接受的赋形剂已充分描述于多种出版物中，所述出版物包括例如A.Gennaro(2000)“Remington:The Science and Practice ofPharmacy,”第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins；Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等编,第7版,Lippincott,Williams,&Wilkins；和Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等编,第3版Amer.Pharmaceutical Assoc。
所选制剂取决于预定施用模式和治疗应用。制剂也可包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其定义为通常用于配制供动物或人施用的医药组合物的媒介物。选择稀释剂以便不影响组合的生物活性。所述稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液和亨克氏溶液(Hank's solution)。医药组合物或制剂也可包括其它载体、佐剂或无毒非治疗性非免疫原性稳定剂等。然而，适于向动物施用的一些试剂，如完全弗氏佐剂(Complete Freund's adjuvant)通常不包括在供人使用的组合物中。
适合医药载体的实例在本领域中是已知的且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂(如油/水乳剂)、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。包含所述载体的组合物可通过已知常规方法加以配制。以下进一步描述更多载体。
佐剂
本发明的治疗剂、免疫原可与佐剂组合施用，所述佐剂即自身不引起适应性免疫反应，但增大或调节对伴随抗原的反应的物质。多种佐剂可与治疗肽和抗体组合用于本发明中以引发免疫反应。优选佐剂增大对免疫原的固有反应而不导致免疫原中的将影响反应的定性形式的构象变化。
在某些实施方案中，佐剂是铝盐(明矾)，如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝(Hunter,2002)。所述佐剂可与或不与其它特定免疫刺激性试剂一起使用，所述试剂如3去-O-酰化单磷酰基脂质A(MPL)或3-DMP、聚合或单体氨基酸，如聚谷氨酸或聚赖氨酸。所述佐剂可与或不与其它特定免疫刺激性试剂一起使用，所述试剂如胞壁酰基肽(N-乙酰基胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰基-sn--甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)、N-乙酰基葡萄糖胺基-N-乙酰基胞壁酰基-L-AI-D-异glu-L-Ala-二棕榈酰氧基丙基酰胺(DTP-DPP)theramideTM)或其它细菌细胞壁组分。其它佐剂是水包油乳剂且包括(a)MF59(属于Van Nest等的WO90/14837，其据此以引用的方式整体并入本文)，含有5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％斯潘85(任选含有各种量的MTP-PE)，使用如110Y型微射流机(Microfluidics,Newton Mass.)的微射流机配制成亚微粒子，(b)SAF，含有10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普洛尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，微射流化成亚微乳剂或涡旋以产生粒度较大的乳剂，和(c)Ribi.TM.佐剂系统(RAS)(Ribi InunoChem,Hamilton,Mont.)，含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种来自由单磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨骼(CWS)组成的组的细菌细胞壁组分，例如MPL+CWS(Detox.TM.)。在一些实施方案中，佐剂是皂素(saponin)，如StimulonTM(QS21，Aquila,Worcester,Mass.)或由其产生的粒子，如ISCOM(免疫刺激性复合物)和ISCOMATRIX。其它佐剂包括完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)、细胞因子，如白介素(IL-1、IL-2和IL-12)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF)。
或者，tau肽及其免疫原性类似物可偶合于佐剂。举例而言，如对于乙型肝炎抗原疫苗接种所述(Livingston,J.Immunol.159,1383-1392(1997))，脂肽形式的tau肽“A”可通过使棕榈酸或其它脂质直接偶合于“A”的N末端来制备。然而，所述偶合不应实质上改变tau肽“A”的构象以致影响对其的免疫反应的性质。
佐剂可与免疫原一起以单一组合物形式施用，或可在施用免疫原之前、与之同时或之后施用。免疫原和佐剂可包装且供应于同一小瓶中或可包装在单独小瓶中且在使用之前混合。免疫原和佐剂通常与指示预定治疗应用的标签一起包装。如果免疫原和佐剂分开包装，那么包装通常包括针对在使用之前的混合的说明书。对佐剂和/或载体的选择取决于含有佐剂的免疫原性制剂的稳定性、施用途径、给药时程、佐剂对所接种物种的功效，且在人中，药学上可接受的佐剂是已由或可由相关管理团体核准供人施用。举例而言，完全弗氏佐剂不适于人施用。然而，单独或任选与明矾、QS21和MPL及其所有组合的任一者组合的明矾、MPL或不完全弗氏佐剂(Chang等,AdvancedDrug Delivery Reviews32:173-186(1998)，其据此以引用的方式整体并入本文)适于人施用。
医药组合物也可包括大型缓慢代谢的巨分子，如蛋白质、多糖(如聚葡萄胺糖)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如乳胶官能化琼脂糖、琼脂糖、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。另外，这些载体可充当免疫刺激性试剂(即佐剂)。
组合
本发明提供组合本文所述的抗体和肽与用于AD和相关tau蛋白病变的其它治疗剂的组合物和治疗方法。举例而言，当前，tau蛋白相关治疗策略主要集中在抑制tau蛋白激酶或活化磷酸酶的药物(Iqbal和Grundke-Iqbal，2004、2005、2007；Noble等2005)、使微管稳定的药物(Zhang等2005)、促进错误折叠tau蛋白的蛋白水解降解的药物(Dickey等2005；Dickey和Petrucelli,2006；Dickey等2006)、防止或逆转tau蛋白聚集的化合物(Wischik等1996；Pickhardt等2005；Taniguchi等2005；Necula等2005；Larbig等2007)或疫苗介导的聚集tau蛋白清除(Asuni等2007)。因此，本发明规定多重靶向(例如靶向tau蛋白与β-淀粉状蛋白两者)可实质上增加治疗效率。
在病理性可溶性tau蛋白和不溶性tau蛋白(tau蛋白沉积物)存在于脑中的阿尔茨海默病和相关tau蛋白病变的情况下，本发明药剂也可连同增加本发明药剂跨过血脑屏障的其它药剂一起施用。
施用方法
用于诱导免疫反应(被动或主动)、用于降低tau蛋白水平或用于任何本文所述的预防、治疗或诊断(体内)方法的药剂可通过胃肠外、局部、皮内、静脉内、经口、皮下、腹膜内、鼻内或肌肉内手段施用以达成防治性和/或治疗性治疗。典型施用途径是皮下途径，但其它途径可同样有效。另一典型途径是肌肉内注射。这个类型的注射最通常在手臂或腿肌肉中进行。静脉内注射以及腹膜内注射、动脉内、颅内或皮内注射也有效产生免疫反应。在一些方法中，将药剂直接注射至沉积物已积累的特定组织中。
如经鼻喷雾制剂的气雾剂制剂包括活性药剂与防腐剂和等张剂的纯净水溶液或其它溶液。所述制剂被例如调整至可与鼻粘膜相容的pH和等张状态。用于经直肠或经阴道施用的制剂可呈现为具有适合载体的栓剂。
对于胃肠外施用，本发明的治疗肽可以可注射剂量的溶液或混悬液形式施用，所述溶液或混悬液是物质于具有医药载体的可为无菌液体(如水、油、生理食盐水、甘油或乙醇)的生理可接受的稀释剂中的溶液或混悬液。另外，组合物中可存在辅助物质，如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等。医药组合物的其它组分是石油、动物、植物或合成来源的那些。花生油、大豆油和矿物油是适用物质的所有实例。一般而言，如丙二醇或聚乙二醇的二醇是优选液体载体，特别是对于可注射溶液而言。本发明药剂也可以可以允许活性成分持续释放的方式配制的储槽注射液或植入制剂形式施用。示例性组合物包含于由50mM L-组氨酸、150mM NaCl组成，用HCl调整至pH6.0的水性缓冲液中配制的5mg/mL单克隆抗体。
用于胃肠外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、混悬液和乳剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或混悬液，包括生理盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
通常，组合物被制备成呈液体溶液或混悬液形式的可注射物；也可制备适于在注射之前溶解或混悬于液体媒介物中的固体形式。如上所论述，制剂也可于脂质体或微粒(如聚交酯、聚乙醇酸交酯或共聚物)中乳化或囊封以达成佐剂作用增强(参见Langer,Science249,1527(1990)和Hanes,AdvancedDrug Delivery Reviews28,97-119(1997))。本发明药剂可以可以允许活性成分持续或脉动释放的方式配制的储槽注射液或植入制剂形式施用。
适于其它施用模式的其它制剂包括经口、鼻内和经肺制剂、栓剂和经皮敷剂。
对于栓剂，粘合剂和载体包括例如聚亚烷基二醇或三酸甘油酯；所述栓剂可由含有在0.5％至10％，例如1％-2％的范围内的活性成分的混合物形成。经口制剂包括赋形剂，如医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物采用溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末形式且含有10％-95％，例如25％-70％的活性成分。
局部敷药可导致经皮或皮内递送。局部施用可通过共施用药剂与霍乱毒素或其去毒衍生物或亚基或其它类似细菌毒素来促进(参见Glenn等,Nature391,851(1998))。可通过以混合物形式或以通过化学交联或以融合蛋白形式表达所获得的连接分子形式使用组分实现共施用。
或者，可使用皮肤贴片或使用转移体实现经皮递送(Paul等,Eur.J.Immunol.25,3521-24(1995)；Cevc等,Biochem.Biophys.Acta1368,201-15(1998))。皮下施用主题抗体、肽或化合物是使用标准方法和装置，例如针和注射器、皮下注射口递送系统等来达成。肌肉内施用是通过标准装置，例如针和注射器、连续递送系统等来达成。在一些实施方案中，通过连续递送系统递送主题抗体、肽和/或化合物。术语“连续递送系统”在本文中可与“控制递送系统”互换使用且涵盖与导管、注射装置等(其广泛多种在本领域中是已知的)组合的连续(例如控制)递送医学装置(例如泵)。机械或电机输注泵也可适于与本发明一起使用。所述装置的实例包括例如描述于美国专利号4,692,147；4,360,019；4,487,603；4,360,019；4,725,852；5,820,589；5,643,207；6,198,966等中的那些。一般而言，本发明的药物递送方法可使用多种可再填充泵系统的任一者来达成。泵提供随时间的一致控制释放。
药剂也可通过目前在颅骨中钻凿小孔以施用药物的标准程序来施用。在一优选方面，允许静脉内或经口施用的结合分子，尤其本发明的抗体或基于抗体的药物可跨越血脑屏障。
在医药剂型中，药剂(由本发明提供的抗体、肽、化合物)可以其药学上可接受的盐形式施用，或其也可单独或与其它医药活性化合物适当联合以及组合加以使用。本文所述的方法和赋形剂仅具有示例性且决不具有限制性。可通过将主题抗体、肽或化合物溶解、混悬或乳化于水性或非水性溶剂，如植物油或其它类似油、合成脂族酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇中；且必要时与常规添加剂，如增溶剂、等张剂、混悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂一起来将它们配制成用于注射的制剂。用于注射或静脉内施用的单位剂型可以组合物形式包含活性药剂，所述组合物呈于无菌水、生理盐水或另一药学上可接受的载体中的溶液形式。如本文所用的术语“单位剂型”或“剂量”是指适合作为用于人和动物受试者的单一剂量的物理个别单元，各单元含有预定量的主题抗体以及药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物，所述预定量是以足以产生所需作用的量加以计算。本发明的单位剂型的规格取决于所用特定化合物和待实现的作用以及在宿主中与各化合物相关的药效动力学。
针对病理性tau蛋白和tau蛋白沉积物的免疫反应也可通过施用编码治疗性tau肽的核酸来诱导。所述核酸可为DNA或RNA。使编码免疫原的核酸区段连接于允许所述DNA区段在患者的预定靶细胞中表达的调控元件，如启动子和增强子。通常，来自免疫球蛋白基因(轻链或重链)的启动子和增强子元件或CMV主要中早期启动子和增强子适于指导在血细胞中的表达，所述血细胞是合乎诱导免疫反应需要的靶标。常将连接的调控元件和编码序列克隆至载体中。
可用许多病毒载体系统，包括反转录病毒系统(参见例如Lawrie等,Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109(1993)，其据此以引用的方式整体并入本文)；腺病毒载体(Bett等,J.Virol.67:5911(1993)，其据此以引用的方式整体并入本文)；腺相关病毒载体(Zhou等,J.Exp.Med.179:1867(1994)，其据此以引用的方式整体并入本文)；来自痘家族的病毒载体，包括牛痘病毒和禽痘病毒；来自α病毒属的病毒载体，如源于辛德毕斯和塞姆利基森林病毒(Sindbisand Semliki Forest Virus)的那些(Dubensky等,J.Virol70:508-519(1996)，其据此以引用的方式整体并入本文)；委内瑞拉马脑炎病毒(参见属于Johnston等的美国专利号5,643,576，其据此以引用的方式整体并入本文)和弹状病毒，如水泡性口膜炎病毒(参见属于Rose的WO96/34625，其据此以引用的方式整体并入本文)和乳头状瘤病毒(Ohe等,Human Gene Therapy6:325-333(1995)；属于Woo等的WO94/12629；以及Xiao和Brandsma,NucleicAcids.Res.24:2630-2622(1996)，其据此以引用的方式整体并入本文)。
编码免疫原的DNA或含有其的载体可被包装至脂质体中。适合脂质和相关类似物由美国专利号5,208,036、5,264,618、5,279,833和5,283,185加以描述。编码免疫原的载体和DNA也可吸附至颗粒载体或与颗粒载体缔合，所述载体的实例包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和聚交酯以及聚(丙交酯-共-乙交酯)，参见例如McGee等,J.Micro Encap.(1996)。
基因疗法载体或裸露DNA可通过向个别患者施用来体内递送，所述施用通常通过全身性施用(例如静脉内、腹膜内、经鼻、经胃、皮内、肌肉内、真皮下或颅内输注)或局部敷药来进行(参见例如美国专利号5,399,346)。也可使用基因枪来施用DNA(参见美国专利号6,436,709)。在本申请中，使编码免疫原的DNA沉淀于显微金属珠粒的表面上。微粒用冲击波或扩张氦气加速，且穿透组织直至数个细胞层的深度(综述于Haynes等,1996中)。举例而言，由Agacetus,Inc.(Middleton,WI)制造的AccelTM基因递送装置或由Bio-Rad Laboratories,Inc.(Hercules,CA)制造的Helios基因枪是适合的。出于治疗目的，DNA也可通过电穿孔来递送(例如如Trollet等,2008和其中参考文献中所述)。或者，可仅通过用化学或机械刺激(参见WO95/05853)或纹身法(例如如由van den Berg等,2009所述)将DNA点样于皮肤上来使裸露DNA穿过皮肤进入血流中。
在一不同变化形式中，编码免疫原的DNA或载体可离体递送至细胞(如自个别患者外植的细胞(例如淋巴细胞、骨髓吸出物、组织活检)或万能供者造血干细胞)中，随后例如在验证免疫原表达之后且通常在选择已并有载体的细胞之后，将细胞再植入患者中。
用于人治疗的另一有希望但潜在风险较大的方法已在于转染树突状细胞(DC，通过直接DNA递送或使用病毒策略)以产生其自身抗原(Xing等,2005)，由此提供通过MHC I递呈的完整抗原的连续供应。
可经受治疗的受试者
可经受治疗的受试者包括处于阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变风险下但未显示症状的个体以及已显示症状的患者。在阿尔茨海默病的情况下，如果他或她生活足够长久，那么实际上任何人都处于罹患阿尔茨海默病的风险下。因此，本发明治疗或疗法可甚至在不对主题患者的风险进行任何评估下向总人口防治性施用。本专利中提供的疫苗可尤其适用于具有已知阿尔茨海默病遗传风险的个体。所述个体包括具有罹患这个疾病的亲戚的那些和因存在遗传或生物化学标记物而被确定风险那些。早期发作家族性阿尔茨海默病的风险遗传标记物包括APP基因、早老素基因PS1和PS2中的突变以及ApoE4基因中关于晚期发作阿尔茨海默病的标记物(近来由Bertram和Tanzi,2008综述)。其它风险因素包括AD家族史、高胆固醇血症或动脉粥样硬化。目前罹患阿尔茨海默病的个体可根据特征性痴呆以及存在上述风险因素来认定。此外，许多诊断测试可用于鉴定患有AD的个体。这些测试包括测量CSF中的总tau蛋白、磷酸tau蛋白和淀粉状蛋白β(1-42)水平。tau蛋白和/或磷酸tau蛋白水平升高以及淀粉状蛋白β(1-42)水平降低指示存在AD。罹患阿尔茨海默病的个体也可通过MMSE、ADRDA或其它准则加以诊断。
在无症状患者中，治疗可在任何年龄(例如10、20、30岁)时开始。然而，直至患者达到40、50、60或70岁可能才必须开始治疗。治疗可需要历经一段时期施用多次剂量。治疗可通过随时间测定抗体、或T细胞或B细胞对治疗剂(例如tau肽)的反应被活化来监测。如果反应下降，那么指示需要增效剂量。在处于AD或相关tau蛋白病变较高风险下的潜在唐氏综合征(Down'ssyndrome)患者的情况下，治疗可通过向母亲施用治疗剂而在产前或在出生之后不久开始。
在一些实施方案中，DC8E8(或其嵌合、人源化、人或其它衍生物/部分/片段)是意图在显示T细胞上的共刺激分子CD28的水平显著降低的老年免疫衰老性阿尔茨海默病(AD)患者中使用的抗体或被动疫苗。共刺激分子CD28降低指示免疫反应受损(Saurwein-Teissl等,2002)。常常是CD45RA+的CD8+CD28-T细胞克隆(免疫表型：CD8+CD28-CD45RA+)产生大量促炎性细胞因子IFN-γ和少量IL-5。这些克隆在正常老化期间积累且诱导不平衡产生Th1细胞因子和Th2细胞因子。因此，积累中的CD8+CD28-CD45RA+T细胞克隆连同衰退中的天然B细胞群体一起(Siegrist和Aspinall,2009)是影响约1/3年长人口的免疫功能衰退的主要促成者(Weng等,2009、Saurwein-Teissl等,2002)。
因此，被动免疫疗法(例如用DC8E8(或其嵌合、人源化、人或其它衍生物/部分/片段))提供一种绕过一大群AD患者的免疫系统衰退且靶向导致神经原纤维变性的病理性tau蛋白的手段。
在一些实施方案中，一种tau蛋白治疗表位(或包含一种本文所述的tau蛋白治疗表位的肽)用作意图在老年免疫活性阿尔茨海默病患者中使用的主动疫苗。免疫活性患者的免疫表型是CD8+CD28+CD45RA+。因此，CD8+T细胞上的共刺激分子CD28的水平将被测定且用作主动疫苗接种的患者的选择标记物。
此外，在治疗之前，将测试取自患者的CSF和血液中针对包柔氏螺旋体(Borrelia)、密螺旋体(Treponema)、衣原体(Chlamydia)、疱疹病毒(Herpesvirus)和其它脑病原体的抗体以排除患有可模拟或恶化AD症状的慢性感染性和炎性CNS病症的个体(Balin等,2008；Itzhaki和Wozniak,2008；Miklossy,2008；Andreasen,2010)。CNS感染常损害血脑屏障(BBB)的功能，尤其衣原体感染脑内皮细胞，此可导致单核细胞向脑实质中的流入增加且因此可影响局部免疫反应(Balin等,2008)。也已显示针对巨细胞病毒(CMV)的IgG的水平较高的年长受试者遭受较快认知衰退速率(Itzhaki和Wozniak,2008)。因此，为防止在用一种由本发明提供的药剂免疫之后的不利作用(例如对正常tau蛋白的免疫反应不受控制)，具有CNS感染的阿尔茨海默病患者或针对以上提及的病原体的抗体的测试呈阳性的那些将用高度选择性疫苗治疗。
在治疗之前，可测试取自患者的CSF和血液中针对包柔氏螺旋体、密螺旋体、衣原体、疱疹病毒和其它脑病原体的抗体以排除患有可模拟或恶化AD症状的慢性感染性和炎性CNS病症的个体(Balin等,2008；Itzhaki和Wozniak,2008；Miklossy,2008；Andreasen,2010)。为防止由各种慢性感染促成的可能的不利作用，这组患者将用更多选择性的抗体或含有治疗表位的疫苗治疗。在一些情况下，主动疫苗是诱导产生靶向病理性tau蛋白上的治疗表位的严格选择性抗体的设计表位(例如参见实施例)。在一些实施方案中，疫苗不含有与正常/生理性tau蛋白共有的任何氨基酸序列。
治疗方案
在防治性应用中，以足以消除或降低疾病风险或延迟疾病发作的量向易感特定疾病或另外处于特定疾病风险下的的患者施用医药组合物或药剂。在治疗性应用中，组合物或药剂以足以治愈或至少部分遏止疾病及其并发症的症状的量向怀疑或已罹患所述疾病的患者施用。足以达成这个作用的量定义为治疗或医药有效剂量。在防治性方案与治疗性方案两者中，通常以若干剂量施用药剂直至已实现足够免疫反应。通常，监测免疫反应且如果免疫反应开始消退，那么给与重复剂量。
本发明的组合物用于治疗上述病状的有效剂量视许多因素而变化，所述因素包括施用手段、靶部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其它药物以及治疗是防治性的还是治疗性的。通常，患者是人。需要滴定治疗剂量以使安全性和功效最优化。因此，用抗体或tau蛋白结合蛋白的治疗将通常需要历经一段时期施用多次剂量。对于用抗体的被动免疫，剂量在每kg宿主体重约0.0001至100mg，且更通常0.01至5mg的范围内。在一些应用中，可在以下剂量下施用所述量的抗体或tau蛋白结合蛋白：每kg体重至少0.1mg、至少0.5mg、1mg或在每kg体重0.1mg与10mg之间的剂量的任何组合。在一些方法中，抗体或tau蛋白结合蛋白可历经至少1个月、至少3个月或至少6个月的时期以多次剂量(相等或不同)施用。历经任一治疗时期的剂量总数可为例如在4与6之间，但其它数目可视以上论述的因素而使用。可通过任何以下进一步所述的方法来监测治疗。
免疫原的量取决于是否也施用佐剂，其中在不存在佐剂下需要较高剂量。供施用的免疫原的量有时对于每个患者而言自1μg-500μg变化且更通常对于人施用而言每次注射5-500μg。有时，每次注射使用1-2mg的较高剂量。通常，各次人注射使用约10、20、50或100μg。注射的时间选择可自一天一次至一年一次至十年一次显著变化。在给与一定剂量的免疫原的任何给定日，如果也施用佐剂，那么剂量大于1μg/患者且通常大于10μg/患者，且在不存在佐剂下，剂量大于10μg/患者且通常大于100μg/患者。一典型方案由免疫、随后在6个每周一次间隔下进行增效注射组成。另一方案由免疫、随后在1、2和12个月后进行增效注射组成。另一方案需要每两个月持续终身进行注射。或者，增效注射可不定期进行，如通过监测免疫反应所指示。在一些实施方案中，主动疫苗将与适合载体(优先KLH)和作为佐剂的氢氧化铝一起配制。优先地，100μg肽/剂/患者(但1μg、10μg、100μg和1mg也将应用于临床前时期中且10μg、100μg、200μg应用于I期毒性研究中)将在每4周1次，总计5次剂量下加以应用。
编码免疫原的核酸的剂量在每个患者约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg、或30-300μg DNA的范围内。感染性病毒载体的剂量自每剂10-109个或更多个病毒体变化。治疗可通过随时间测定抗体、或T细胞或B细胞对治疗剂的反应被活化来监测。如果反应下降，那么可指示需要增效剂量。
最后，剂量方案将由主治医师且由临床因素决定。如医学领域中所知，用于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身材、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其它药物。典型剂量可例如在0.001至1000mg的范围内；然而，设想低于或高于这个示例性范围的剂量，尤其在考虑以上提及的因素下。通常，呈定期施用医药组合物形式的方案应在每天1mg至10mg单位的范围内。如果方案是连续输注，那么其也应相应地在每千克体重1mg至10mg的范围内。可通过定期评估来监测进展。
此外，共施用或依序施用其它药剂可为合乎需要的。在一些实施方案中，治疗有效剂量或有效量是指活性成分足以改善症状或病状的量。所述化合物的治疗功效和毒性可通过标准医药程序在细胞培养物或实验动物中确定，例如ED50(在50％群体中具有治疗有效性的剂量)和LD50(致死50％群体的剂量)。治疗性作用与毒性作用之间的剂量比率是治疗指数，且其可表示为比率LD50/ED50。在一些实施方案中，组合物中的治疗剂是以在阿尔茨海默病和相关tau蛋白病变的情况下，足以恢复正常行为和/或认知属性的量存在。
本发明提供可被用由本发明提供的任何药剂评估治疗有效性所依赖的不同量度。实例包括但不限于一种或多种病理性tau蛋白形式(例如脑内)的水平降低、病理性tau蛋白自脑和/或CSF的清除增加；如认知功能的认知性能量度(通过例如临床痴呆评定-CDR、阿尔茨海默病评估量表-认知子量表-ADAS-Cog小型精神状态测验-MMSE来测试)提高；运动功能测试(例如握力测试、起立及行走计时(TUG)测试、TUG手册、步行时交谈测试、统一帕金森氏病评定量表-UPDRS)提高；基本日常生活活动(ADL)表现测试(例如卫生、穿衣、自制、吃食、制备餐食、打电话、外出、财务和通信；痴呆失能评估测试)提高；AD损害的握力、行动和精神性运动不能(其与以下在实施例中所述的动物模型和测定直接相关)、记忆衰退、失语、认识不能、在时间和空间方面的定向障碍、和抑郁的严重性/评级降低。
出于评估治疗有效性的目的，tau蛋白(在脑内和在体液中)的水平和分布可通过本文所述的任何方法和/或通过可用于检测tau蛋白的任何其它方法来测定。举例而言，可使用新型成像放射性示踪剂18F-THK523体内测量(正电子发射断层摄影法)tau蛋白的水平，所述放射性示踪剂在体外、离体(组织切片)和在体内(转基因小鼠)选择性结合tau蛋白和tau蛋白病变(Fodero-Tavoletti等,2011,Brain)。可使用识别总tau蛋白或磷酸tau蛋白的ELISA试剂盒鉴定脑脊髓液以及血液中的Tau蛋白。
实际上，转基因大鼠中的神经行为损伤与阿尔茨海默病患者中的运动损伤相似，此对于用本文提供的任何治疗剂(包括但不限于用于主动疫苗接种的药剂)的临床试验和治疗方案具有启示。在人中，阿尔茨海默病的临床表征在于进行性记忆损伤和认知衰退、行为变化和心理症状(情绪、情感、食欲、醒来睡眠循环、慌乱、激动和抑郁方面的紊乱)以及运动功能受损(精神性运动不能、肌阵挛、步态受损、肌肉力量降低、锥体束外特征，如运动徐缓、僵硬和静止性震颤)(Goldman等,1999；Boyle等,2009)。许多研究已报道运动征象通常在阿尔茨海默病(AD)中被观察到且随疾病进展而变得更突出(Goldman等,1999；Wilson等,2003；Louis等,2004；Pettersson等,2005；Scarmeas等,2004；Scarmeas等,2005；Waite等,2005；Alfaro-Acha等,2006；Wang等,2006；Buchman等,2007a；Boyle等,2009)。值得注意的是运动征象可先于认知损伤且预测阿茲海默病中的认知性和功能性衰退、收容入院以及死亡(Morris等,1989；Soininen等,1992；Kraemer等,1994；Chui等,1994；Scarmeas等,2004；Scarmeas等,2005)。已显示肌肉力量降低先于认知损伤显现(Buchman等,2007b；Boyle等,2009)。
AD中的运动征象的显现已与脑干中的神经变性和神经损失相关联(Zarow等2003；Burns等2005；Grudzien等2007；Simic等,2009；Wai等,2009；Braak和DelTredici,2011)。此外，若干研究已表明神经原纤维变性起源于脑干中且先于皮质神经变性(Hertz,1989；Simic等,2009；Braak和DelTredici,2011)。
这些研究结果显示运动损伤代表AD发病机制中的一关键标志。此外，一些运动结构域的功能性损伤可先于痴呆且预测认知衰退。用本文所述的肽(包括治疗表位)的主动免疫疗法可改进表达人病理性tau蛋白的转基因大鼠的运动损伤。因此，通过主动免疫疗法直接靶向脑干病变可预防、减缓或延迟人AD患者中的运动以及认知损伤。因此，运动功能的测试可包括在可用于评估本文所述的药剂(例如tau蛋白清除剂、主动和被动疫苗)的临床功效的成套测试中。
此外，本领域普通技术人员了解病理性tau蛋白(例如皮质/海马中的NFT)的水平和分布与疾病进展之间的明确确定的关联。病理性tau蛋白(NFT病变)的密度已与认知缺陷和阿尔茨海默病的严重性相关联(Braak和Braak,1991；Bierer等,1995；Berg等,1998；Duyckaerts等,1998；Giannakopoulos等,1998、2003)。内嗅皮质和海马中的病理性tau蛋白(例如NFT、神经原纤维网线)与纵向记忆变化呈负相关(Reitz等,2009)。类似地，在脑干中，病理性tau蛋白(NFT)在极早期存在于背侧中缝核中；随后另一中缝核受影响。这些病变解释AD中所见的血清素激活性缺陷(Duykaerts等,2009)。锥体束外症状已与黑质tau蛋白病变相关联(Liu等,1997)。因此，可影响这些AD分布样式的一者或多者的治疗剂将可能在AD中具有有益作用。
实施例
实施例1：制备重组人TAU蛋白
人全长tau蛋白(2N4R、2N3R)和tau蛋白缺失突变体：自克隆T40(Goedert,1989)产生Tau蛋白重组蛋白(图1和6)，所述克隆被亚克隆至表达质粒pET-17b(Novagen)中且在细菌中表达。通过DNA测序来验证各tau蛋白缺失突变体。所有tau蛋白缺失突变体和tau肽都根据最长人tau蛋白亚型2N4R来编号，所述亚型的长度是441个氨基酸且因此也称为tau441(D'Souza,2005)。源于亚型2N3R的Tau蛋白缺失突变体和肽由“3R”标记以指示缺失第二微管结合重复序列(2N4R的氨基酸275-305)。tau蛋白的产生涉及以下步骤：a)在细菌中表达tau蛋白；b)通过离子交换色谱进行tau蛋白纯化；c)通过凝胶过滤进行tau蛋白纯化；d)浓缩并储存分离的tau蛋白；以及e)免疫亲和纯化(这是仅对于用于小神经胶质细胞摄取实验中的tauΔ(1-150；392-441)/4R采用的例外，参见实施例10，图17)。
a)细菌表达人全长tau蛋白(2N4R或2N3R)和重组tau蛋白缺失突变体：使人tau蛋白(以上)表达质粒转化至大肠杆菌(E.coli)产生菌株BL21(DE3)中。如由Sambrook和Russell(2001)所著的“Molecular Cloning:A LaboratoryManual”中所述培养且诱导含有适当表达质粒的细菌细胞。使用驱动tau蛋白或其片段表达的pET-17b质粒转化的单一BL21(DE3)细菌菌落在37℃下在300rpm下于500ml具有100μg/ml氨苄青霉素的Luria肉汤培养基中生长且通过添加异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)直至最终浓度0.4mM加以诱导。在37℃下再孵育3小时之后，通过在4℃下在3,000xg下离心15分钟来收集细菌。
b)基本上如先前所述(Krajciova等,2008)对碱性和中性tau蛋白(全长tau蛋白亚型tauΔ358-441、tauΔ306-400、tauΔ421-441、tauΔ300-312、tauΔ134-168、tauΔ1-220、tauΔ1-126、tauΔ(1-150；392-441)/4R、tauΔ(1-150；392-441)/3R和tauΔ(1-296；392-441)/4R)进行阳离子交换色谱纯化。在表达之后，将细菌团块再混悬于10ml溶解缓冲液(50mM1,4-哌嗪二乙烷磺酸(PIPES)(pH6.9)、50mM氯化钠(NaCl)、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、5mM二硫苏糖醇(DTT)、0.1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)、5％(v/v)甘油)中，在液氮中快速冷冻，且储存在-80℃下直至用于tau蛋白纯化。对于tau蛋白纯化，将冷冻细菌混悬液快速解冻且置放在冰上。通过使用Sonopuls HD2200，尖端TT-13(Bandelin,Germany)(设置成50％工作循环，50W功率输出，30s6次，暂停30s)在冰上进行超声处理来破坏细菌细胞壁。通过离心(在4℃下，21,000xg，持续15分钟)来使溶解产物澄清且上清液经0.45μm膜过滤器过滤。使用工作站(Amersham Biosciences,Sweden)在6℃下对重组tau蛋白进行大规模纯化。在3ml/min流速下将过滤的溶解产物装载于用溶解缓冲液平衡的5ml HiTr ap SP HP管柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上，且用60ml溶解缓冲液广泛洗涤直至在280nm下基线变得稳定。通过一定梯度(在15ml内0-30％)的缓冲液B(补充有1M NaCl的溶解缓冲液)来洗脱结合的tau蛋白。收集个别1ml级分且通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)加以分析。为移除与带正电荷的tau蛋白共纯化的核酸，汇合含有tau蛋白的级分且使用5ml HiTrap SP HP管柱(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)，利用陡峭度较小的缓冲液B梯度(在45ml内0-30％)，通过第二阳离子交换色谱步骤加以纯化。
c)如先前所述(Csokova等2004)对酸性tau蛋白(tauΔ222-427、tauΔ228-441、tauΔ257-400、tauΔ137-441、tauΔ283-441)进行阴离子交换色谱纯化。在表达之后，将细菌团块再混悬于10ml组氨酸溶解缓冲液(20mM组氨酸(pH6.0)、50mM NaCl、1mM EDTA、5mM DTT、0.1mM PMSF和5％(v/v)甘油)中。通过使用Sonopuls HD2200，尖端TT-13(Bandelin,Germany)(设置成50％工作循环，50W功率输出，30s6次，暂停30s)在冰上进行超声处理来破坏细菌细胞壁。通过离心(在4℃下，21,000xg，持续15分钟)来使溶解产物澄清。通过1％硫酸链霉素(Medexport,Russia)来使细菌溶解产物沉淀，在冰上孵育5分钟，通过离心(在4℃下，21,000xg，持续15分钟)加以澄清，且经0.45μm膜过滤器过滤。在3ml/min流速下将过滤的链霉素沉淀溶解产物装载于5ml HiTrap QSepharose HP管柱(Amersham Biosciences,Sweden)上且用30-50ml组氨酸溶解缓冲液广泛洗涤直至A280基线变得稳定。Tau蛋白用于组氨酸溶解缓冲液中的两步盐梯度(在40ml内0.05-0.5MNaCl，随后在20ml内0.5-1M NaCl)洗脱。
d)在最后一步凝胶过滤纯化(对于所有tau蛋白都相同)中，在3ml/min下将通过离子交换色谱获得的汇合tau蛋白级分注射于凝胶过滤管柱(HiLoad26/60Superdex200制备级管柱，GE Healthcare)上，对于碱性/中性或酸性tau蛋白而言，所述级分是分别在补充有100mM NaCl的PIPES或组氨酸溶解缓冲液中。汇合洗脱的tau蛋白。
e)对于在凝胶过滤纯化之后的tau蛋白浓缩，汇合的级分用1.5体积的2.5％甘油稀释，且再次装载于HiTrap SP HP管柱(碱性和中性tau蛋白)或HiTrap Q HP管柱(酸性tau蛋白)上。接着用1M NaCl阶跃梯度自管柱洗脱浓缩重组tau蛋白。最后，使用5ml HiTrap脱盐管柱(GE Healthcare)，使缓冲液交换成用氩气饱和的磷酸盐缓冲盐水(PBS，8.09mM磷酸二钠(Na2HPO4)、1.47mM磷酸二氢钾(KH2PO4)、136.89mM NaCl、2.7mM氯化钾(KCl))。使用二喹啉甲酸(BCA)定量试剂盒(Pierce,USA)，用牛血清白蛋白(BSA)作为标准，对纯化样本进行蛋白质定量。将Tau蛋白等分成工作等分试样，快速冷冻于液氮中，且储存在-70℃下。
f)为自用于测量由小神经胶质细胞对tau蛋白的摄取(实施例10，图17)的重组tauΔ(1-150；392-441)/4R移除可能的细菌污染物，通过如下改进方法纯化重组tau蛋白。在第一阳离子交换色谱步骤之后，汇合含有tau蛋白的级分且在搅拌下添加1/20体积的冰冷5％聚乙烯亚胺。在冰上再继续搅拌30分钟。在4℃下在20,000xg下离心样本15分钟。收集上清液且在3ml/min下将其于补充有100mM NaCl，但缺乏DTT或任何其它还原剂的PIPES溶解缓冲液中注射于HiLoad26/60Superdex200制备级管柱(GE Healthcare)上。在凝胶过滤之后，汇合具有tau蛋白的级分且将其装载于含有固定在CNBr活化琼脂糖上的DC25抗体(2N4R tau蛋白的表位347-353，AxonNeuroscience,Vienna,Austria)的免疫亲和柱(在流速0.5ml/min下)上。管柱于20mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、0.1％吐温20(TBS-吐温)中预平衡。在结合之后，管柱用5管柱体积的TBS-吐温洗涤且结合的tau蛋白用0.1M甘氨酸(pH2.7)洗脱。通过添加1/30体积的1M Tris-HCl(pH8.8)来中和收集的级分且加以汇合。最后，使用5ml HiTrap脱盐管柱(GE Healthcare)，使缓冲液交换成PBS(用氩气饱和)。使用二喹啉甲酸(BCA)定量试剂盒(Pierce,USA)，用BSA作为标准，对纯化样本进行蛋白质定量。将蛋白质等分成工作等分试样，快速冷冻于液氮中，且储存在-70℃下。
如下制备用于DC25亲和柱(上文)的纯化DC25抗体(Axon Neuroscience,Vienna,Austria)。通过添加0.2体积的PBS来调整无血清DC25杂交瘤培养物上清液至pH7.5，通过在4℃下在20,000xg下离心10分钟加以预澄清，且上清液经0.2μm过滤器过滤。在1ml/min下将预澄清的DC25杂交瘤培养物上清液装载于PBS平衡的HiTrap蛋白质G HP管柱(5ml，GE Healthcare)上。在装载完成之后，管柱用4管柱体积的PBS洗涤，且结合的抗体用100mM甘氨酸(pH2.7)洗脱。洗脱的级分用1M Tris-HCl(pH9)中和，汇合，且使用HiTrap脱盐管柱(5ml，GE Healthcare)，使缓冲液交换成PBS。纯化DC25抗体以小等分试样储存在-70℃下。
实施例2：制备产生针对人TAUΔ(1-150:392-441)/4R的单克隆抗体的杂交瘤细胞系、通过ELISA筛选单克隆抗体以及初始表征单克隆抗体DC8E8
6周龄Balb/c小鼠用含50μg重组tauΔ(1-150；392-441)/4R(如实施例1中所述制备)的完全弗氏佐剂(SIGMA)皮下致敏，且在5周间隔下用含50μg相同抗原的不完全弗氏佐剂增效5次。在融合之前3天，小鼠用含50μg相同抗原的PBS静脉内注射。根据Kontsekova等(1988)的方法使来自免疫小鼠的脾细胞与NS/0骨髓瘤细胞融合。使脾细胞(108)与2x107个NS/0骨髓瘤细胞混合(比率5:1)且于1ml含50％聚乙二醇(PEG)1550(Serva)的补充有10％二甲亚砜的无血清杜贝卡氏改良依格氏培养基(Dulbecco's modified Eagle'smedium，DMEN)中融合1分钟。将融合细胞在96孔板上每孔2.5x105个脾细胞的密度下再混悬于含有20％马血清、L-谷氨酰胺(2mM)、次黄嘌呤(0.1mM)、氨基蝶呤(0.04mM)、胸苷(0.016mM)和庆大霉素(40U/ml)的DMEM中。在37℃下孵育细胞10天且通过酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选产生抗tauΔ(1-150；392-441)/4R特异性单克隆抗体的生长杂交瘤。
ELISA用于检测杂交瘤培养物上清液中的针对tauΔ(1-150；392-441)/4R(一种错误无序形式的tau蛋白)的单克隆抗体。在37℃下用含tauΔ(1-150；392-441)/4R(5μg/ml，50μl/孔)的PBS将微量滴定板涂布过夜。在用1％脱脂奶粉阻断以降低非特异性结合之后，将板用PBS-0.05％吐温20洗涤且在37℃下与50μl/孔的杂交瘤培养物上清液一起孵育1小时。用与辣根过氧化物酶(HRP，DAKO)缀合的绵羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)检测结合的单克隆抗体。反应用邻苯二胺溶液作为过氧化酶底物加以显色且用50μl2M H2SO4终止。使用Multiscan MCC/340ELISA读取器(Labsystems)测量492nm下的吸光度。吸光度数值是阴性对照(PBS)的数值至少两倍的读数被视为阳性。通过免疫组织化学法(根据Zilka等,2003的方法)进一步测试阳性杂交瘤培养物且根据Kontsekova等(1991)中所述的程序于软琼脂中亚克隆。
在如此产生和选择的阳性杂交瘤培养物中鉴定出单克隆抗体DC8E8(由在2011年7月13日以ATCC专利保藏编号PTA-11994保藏在美国典型培养物保藏中心的小鼠杂交瘤细胞系产生)。如下所述进一步表征DC8E8。使用小鼠Ig同种型分析试剂盒(ISO-2，SIGMA)通过ELISA确定抗体同种型是鼠类IgG1。
实施例3：对DC8E8及其通过CDR移植获得的人源化形式的可变区的测序
a)测定DC8E8的轻链和重链可变区的核苷酸和氨基酸序列(图3)。通过对使用自小鼠杂交瘤细胞系PTA-11994(ATCC)提取的总RNA合成的cDNA进行DNA测序来测定DC8E8的可变区核苷酸序列(图3A和3D)，所述细胞系表达DC8E8单克隆抗体。使用试剂(Invitrogen,USA)提取总RNA。根据制造商的方案(Applied Biosystems,USA)使用“高容量cDNA反转录”试剂盒对第一链cDNA进行合成。2x反转录主要混合物的试剂组成如下(每20μL反应的量)：2μL10x RT缓冲液；0.8μL25x dNTP混合物(100mM)；2μl10x RT随机引物(50μΜ)；1μL MultiScribeTM反转录酶(50U/μL)；4.2μL无核酸酶H2O。对于反转录，使10μL2x反转录主要混合物与RNA样本(2μg/10μL)混合且在以下条件下合成cDNA：在25℃下10分钟，在37℃下120分钟，在85℃下5分钟，以及最终冷却至4℃。通过使用高保真DNA聚合酶(Finnzymes,Finland)进行聚合酶链反应(PCR)来对编码轻链和重链的可变区的基因进行扩增。根据DC8E8轻链(DIVMSQSPSS)(SEQ IDNO:134)和重链(QVQLQQSGPE)(SEQ ID NO:135)的N末端的蛋白质序列，设计正向引物(8E8L-正义5'-ACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCC-3'(SEQ ID NO:132)和8E8H-正义5'-CTCCTCCAATTGCAGCAGTCTGG-3'(SEQ ID NO:133))。使用埃德曼(Edman)降解(轻链)和MALDI源内衰减(重链)测定N末端蛋白质序列。使用这个信息，在Genebank中根据它们的相应核苷酸序列鉴定出与轻链和重链最类似的蛋白质。接着在IMGT/LIGM-DB数据库(www.imgt.org)中鉴定出小鼠V基因(轻和重)的最可能核苷酸序列。这些基因用于设计正向引物(使用DC8E8的N末端蛋白质序列进行修正)。轻链和重链的逆向引物(κ-反义5'-GGAATTCGTTGAAGCTCTTGACAATGGGTG-3'(SEQ ID NO:136)和G1-反义5'-GGAATTCACATATGCAAGGCTTACAACCAC-3(SEQ ID NO:137))分别源于κ和IgG1链恒定区。
对PCR产物测序且DC8E8的轻链和重链的可变区的所得DNA序列分别显示于图3A和3D中。DC8E8与最密切小鼠生殖系轻链IGKV8-21*01和重链IGHV1-81*01的比对分别显示于图3C和3F中。在DC8E8轻链和重链蛋白质序列中对互补决定区(CDR)加下划线(分别图3B和3E)。根据免疫遗传学(IMGT)编号系统鉴定CDR和框架区(FR)(参见例如Lefranc MP.TheIMGT unique numbering for immunoglobulins,T-cell receptors,and Ig-likedomains.The Immunologist7,132-136,1999(1999))。
b)DC8E8的人源化。为鉴定适于通过移植小鼠DC8E8互补决定区(CDR)来产生人源化DC8E8的候选人免疫球蛋白，针对自IMGT/LIGM-DB平面文件版本201112-6(www.imgt.org)提取的一组选择的人免疫球蛋白基因，使用ClustalX2对DC8E8核苷酸序列进行成对比对来确定与DC8E8具有最高序列同一性的人生殖系基因。IgKv4-1*01被鉴定为DC8E8轻链的最密切人生殖系基因(图4)，且IgHVI-69*10被鉴定为DC8E8重链的最密切生殖系基因(图5)。以下方法(方法1和方法2)被设计且可用于制备一种或多种人源化形式的DC8E8抗体。在于适当抗体表达系统(例如用于体外(例如HEK293细胞)或体内(转基因动物)抗体表达的哺乳动物表达载体)中表达之后，可根据用于表征DC8E8的活性的任何方法测试所得人源化重组抗体的活性(例如生物化学和治疗活性)。
方法1：CDR移植和必要时框架区(FR)中的突变(CDR用粗体加下划线表示，FR突变用粗体表示)：
方法2：得到与DC8E8具有最高序列同一性的小鼠(图3)和人(图4和5)生殖系免疫球蛋白且与DC8E8蛋白质序列比对。遵循IMGT编号系统鉴定CDR区。基于MacCallum等,J.Mol.Biol.1996的研究鉴定DC8E8结合位点内最可能的抗原接触残基。
基于以下组合准则鉴定人源化形式的DC8E8中的各种氨基酸突变候选者：
i.它们存在于CDR中且可能与抗原接触
ii.它们存在于游标区域中
iii.是否它们在小鼠生殖系中突变
根据以上准则鉴定突变候选者的两个层次：
X型残基(用粗体表示)：
-在DC8E8与最密切小鼠生殖系之间不同的残基(非类似氨基酸)
-在CDR中且接触抗原的残基。在以下DC8E8序列中，CDR用小写粗斜体表示。
型残基(用粗体加下划线表示)：
-在DC8E8与最密切小鼠生殖系之间相同，但在最密切人生殖系中不同且位于游标区域中的残基(非类似氨基酸)
-在DC8E8与最密切小鼠生殖系之间不同的残基(类似/保守氨基酸)
鉴定各链的具有预测会影响DC8E8的活性的突变的两个人源化序列：
SEQ ID No.147、152：仅X型残基将突变
SEQ ID No.148、153：X型残基与型残基两者均将突变
实施例4：使用重组TAU蛋白缺失突变体和TAU蛋白源性肽定位DC8E8表位
人tau蛋白2N4R的缺失突变体以及tau蛋白源性肽(Antagene,Inc.(Sunnyvale,CA)和EZBiolab,(USA))用于使用ELISA对DC8E8的表位定位(图6、7和8)。如实施例1中所述制备重组人tau蛋白亚型(2N4R；2N3R)和tau蛋白缺失突变体(图6A、6B)。通过EZBiolabs(USA)合成纯度高于85％的肽(图7A、7B)。
在37℃下用重组tau蛋白或tau肽(5μg/ml于PBS中，50μl/孔)将微量滴定板涂布过夜。在用1％脱脂奶粉阻断以降低非特异性结合之后，将板用PBS-0.05％吐温20洗涤且在37℃下与50μl/孔的DC8E8杂交瘤培养物上清液一起孵育1小时。用HRP缀合的绵羊抗小鼠Ig(DAKO)检测结合的单克隆抗体。反应用邻苯二胺溶液作为过氧化酶底物加以显色且用50μl2M H2SO4终止。使用Multiscan MCC/340ELISA读取器(Labsystems)在492nm下测量吸光度。吸光度数值是阴性对照(PBS)的数值至少两倍的读数被视为阳性。
DC8E8识别以下人tau蛋白：Δ358-441、Δ421-441、Δ134-168、Δ1-220、Δ1-126、Δ(1-296；392-441)/4R和Δ(1-150；392-441)/4R，但未能识别具有缺失Δ222-427、Δ306-400、Δ228-441、Δ300-312、Δ257-400、Δ137-441和Δ283-441的tau蛋白(图6B、6C)。DC8E8识别生理性tau蛋白亚型2N4R和2N3R的程度小于其识别病理性/错误无序tauΔ(1-296；392-441)/4R、tauΔ(1-150；392-441)/4R和tau蛋白2N4R的tau蛋白缺失突变体(Δ358-441、Δ421-441、Δ134-168、Δ1-220、Δ1-126)(图6C)。使用tau肽进行的更详细表位定位揭示DC8E8不识别tau肽240-270、270-300和301-330(图7A、7B、7C)。总之，这些研究结果表明DC8E8具有人tau蛋白上的四个结合位点或表位，其各自位于tau蛋白的微管结合重复结构域中，且所述表位各自分别位于一个以下tau蛋白序列内：267-KHQPGGG-273(SEQ ID NO:98)(tau蛋白的第1重复结构域)、298-KHVPGGG-304(SEQ ID NO:99)(tau蛋白的第2重复结构域)、329-HHKPGGG-335(SEQ ID NO:100)(tau蛋白的第3重复结构域)和361-THVPGGG-367(SEQ ID NO:101)(tau蛋白的第4重复结构域)(图7D)。此外，因为DC8E8对截短形式的tau蛋白的结合优于对全长3重复序列和4重复序列tau蛋白的结合，所以这些结果也表明DC8E8对疾病形式的tau蛋白的结合优于对生理性tau蛋白(tau39(2N3R)和tau40(2N4R))的结合。此外，因为tau蛋白被认为构象自生理性tau蛋白(固有无序)变化至疾病tau蛋白(错误无序和错序，Kovacech等,2010)，所以这些结果表明DC8E8的一个或多个结合位点(DC8E8表位)在生理性tau蛋白中的构象不同于其在疾病tau蛋白中的构象，且DC8E8能够检测那个构象变化。
因为这些tau蛋白重复结构域在物种间保守(图8A)，所以DC8E8可能与来自如大鼠、小鼠、母牛、黑猩猩、蛙和其它物种的不同物种的tau蛋白反应。使用软件ClustalW2(可例如在www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/处获得)对各种动物物种的tau蛋白进行比对。人tau蛋白由在人脑神经元中表达的最长tau蛋白亚型(2N4R，441个氨基酸)表示。其它物种的Tau蛋白选自公共数据库。对由DC8E8抗体识别的四个表位的各者位于其内的序列加框。
对某些tau蛋白源性肽(8聚体、9聚体和10聚体)进行其它点突变和缺失以进一步确定DC8E8表位，如通过各肽与tauΔ(1-150；392-441/4R)竞争结合DC8E8的能力所评估。通过EZBiolabs(USA)合成纯度高于85％的肽。根据以下标准方案进行竞争ELISA。在4℃下用100μl/孔的含5μg/ml重组纯化tauΔ(1-150；392-441/4R)的PBS将ELISA板(IWAKI高结合板，#3801-096，Bertoni GmbH,Austria)涂布过夜。IWAKI高结合板用PBS/吐温20(0.05％v/v)洗涤4次，且在25℃下用PBS/吐温20阻断2小时。将各肽在最终浓度5mM下分别溶解于PBS中。于具有锥形孔底部的聚丙烯板(Greiner，#651201)中制备肽于PBS/吐温20中的连续稀释液(2倍)(浓度范围80μΜ、40μΜ、20μΜ、10μΜ、5μΜ和2.5μΜ)。每孔添加100μl各稀释液。于PBS/吐温20中将纯化DC8E8单克隆抗体(如下于实施例5中所述进行纯化)稀释至浓度2μg/ml且使100μl这个稀释抗体与肽的各连续稀释液混合，从而产生200μl混合物，其中在浓度40μΜ、20μΜ、10μΜ、5μΜ、2.5μΜ和1.25μΜ下含有各相应测试肽的100μl中具有100ng抗体。在25℃下于设置成250rpm的旋转平台上孵育抗体/肽混合物1小时。将100微升(100μl)抗体/肽混合物自聚丙烯板转移至tauΔ(1-150；392-441/4R)涂布且PBS/吐温20阻断的IWAKI高结合板中，且在25℃下于设置成250rpm的旋转平台上孵育1小时。将板用PBS/吐温20洗涤4次。在25℃下于旋转平台(设置成250rpm)上将样本(于板中)与100μl于PBS/吐温20中1:4,000稀释的多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白/HRP(Dako，#P0447)一起孵育1小时。将板用PBS/吐温洗涤4次。接着在25℃下在黑暗中将样本/板与100μl o-PDA(邻苯二胺，SIGMA，P1526)于补充有1.5μl/2ml30％H2O2(SIGMA，H-0904)的0.1M乙酸钠(pH6.0)(Roth，#6779)中的1.5mg/2ml溶液一起孵育10分钟。通过添加100μl2M H2SO4(Merck，1.00731.1000)来终止反应。通过读取样本/板在490nm下的吸光度(例如使用Victor Multilabel Counter(Wallac))来追踪反应程度。
图8B显示用以下六种肽进行的竞争ELISA的结果：NIKAVPGGGS(SEQID NO:200)、NIKHVPGGGS(SEQ ID NO:201)、IKHVPGGGS(SEQ IDNO:202)、KHVPGGGSV(SEQ ID NO:203)、HVPGGGSVQ(SEQ ID NO:204)和VPGGGSVQ(SEQ ID NO:205)。涵盖2号tau蛋白治疗表位的肽KHVPGGGSV(SEQ ID NO:203)和HVPGGGSVQ(SEQ ID NO:204)与存在于tauΔ(1-150；392-441/4R)上的至少一种原始治疗表位竞争。自SEQ ID NO:204的表位移除加下划线的组氨酸导致竞争活性损失(参见肽VPGGGSVQ，SEQID NO:205)。使组氨酸变化成丙氨酸的点突变(在“2号表位”中的相应tau蛋白位置299处)导致竞争活性损失(肽NIKAVPGGGS，SEQ ID NO:200)。在“组氨酸299”之前(朝向N末端)含有2或3个氨基酸的肽也与原始表位竞争(分别为肽IKHVPGGGS(SEQ ID NO:202)和NIKHVPGGGS(SEQ ID NO:201))。这些结果表明DC8E8的属于第二tau蛋白重复序列(2号表位)的最小表位在6聚体序列，即HVPGGG(SEQ ID NO:154)内。
以上提及的定位实验表明在DC8E8抗体的一种或多种表位内存在氨基酸序列PGGG。此外，这个氨基酸序列存在于tau蛋白上由DC8E8结合的全部四个表位中(参见SEQ ID NO:98、99、100、101)。为确定DC8E8表位的N末端区域中的残基，对tau肽295-DNIKHVPGGGS-305进行丙氨酸扫描实验，所述tau肽包含属于tau蛋白的第2重复结构域的DC8E8表位(在298-KHVPGGG-304，SEQ ID NO:99内)。
通过各肽与tauΔ(1-150；392-441/4R)竞争结合DC8E8的能力来评估突变肽对DC8E8的结合能力。通过EZBiolabs(USA)合成纯度高于85％的七种肽：ANIKHVPGGGS(SEQ ID NO:144)、DAIKHVPGGGS(SEQ ID NO:146)、DNAKHVPGGGS(SEQ ID NO:149)、DNIAHVPGGGS(SEQ ID NO:151)、DNIKAVPGGGS(SEQ ID NO:159)、DNIKHAPGGGS(SEQ ID NO:161)和具有原始序列的肽DNIKHVPGGGS(SEQ ID NO:171)。根据以下标准方案进行竞争ELISA。在4℃下用100μl/孔的含5μg/ml重组纯化tauΔ(1-150；392-441/4R)的PBS将ELISA板(IWAKI高结合板，#3801-096，Bertoni GmbH,Austria)涂布过夜。IWAKI高结合板用PBS/吐温20(0.05％v/v)洗涤4次，且在25℃下用PBS/吐温20阻断2小时。将各肽在最终浓度5mM下分别溶解于PBS中。于具有锥形孔底部的聚丙烯板(Greiner，#651201)中制备肽于PBS/吐温20中的连续稀释液(2倍)(浓度范围320μΜ、160μΜ、80μΜ、40μΜ、20μΜ、10μΜ、5μΜ和2.5μΜ)。每孔添加100μl各稀释液。于PBS/吐温20中将纯化DC8E8单克隆抗体(如下于实施例5中所述进行纯化)稀释至浓度2μg/ml且使100μl这个稀释抗体与肽的各连续稀释液混合，从而产生200μl混合物，其中在浓度160μΜ、80μΜ、40μΜ、20μΜ、10μΜ、5μΜ、2.5μΜ和1.25μΜ下含有各相应测试肽的100μl中具有100ng抗体。在25℃下于设置成250rpm的旋转平台上孵育抗体/肽混合物1小时。将100微升(100μl)抗体/肽混合物自聚丙烯板转移至tauΔ(1-150；392-441/4R)涂布且PBS/吐温20阻断的IWAKI高结合板中，且在25℃下于设置成250rpm的旋转平台上孵育1小时。将板用PBS/吐温20洗涤4次。在25℃下于旋转平台(设置成250rpm)上将样本(于板中)与100μl于PBS/吐温20中1:4,000稀释的多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白/HRP(Dako，#P0447)一起孵育1小时。将板用PBS/吐温洗涤4次。接着在25℃下在黑暗中将样本/板与100μl o-PDA(邻苯二胺，SIGMA，P1526)于补充有1.5μl/2ml30％H2O2(SIGMA，H-0904)的0.1M乙酸钠(pH6.0)(Roth，#6779)中的1.5mg/2ml溶液一起孵育10分钟。通过添加100μl2M H2SO4(Merck，1.00731.1000)来终止反应。通过读取样本/板在490nm下的吸光度(例如使用Victor Multilabel Counter(Wallac))来追踪反应程度。
图8C显示用以下七种肽进行的竞争ELISA的结果：ANIKHVPGGGS(SEQ ID NO:144)、DAIKHVPGGGS(SEQ ID NO:146)、DNAKHVPGGGS(SEQ ID NO:149)、DNIAHVPGGGS(SEQ ID NO:151)、DNIKAVPGGGS(SEQ ID NO:159)、DNIKHAPGGGS(SEQ ID NO:161)和DNIKHVPGGGS(SEQ ID NO:171)。使组氨酸变化成丙氨酸的点突变(在“2号表位”中的相应tau蛋白位置299处)导致与tauΔ(1-150；392-441/4R)竞争结合DC8E8的活性完全损失(肽DNIKAVPGGGS，SEQ ID NO:159)。使氨基酸D、N、I、K和V变化成丙氨酸的突变不消除相应突变肽(肽ANIKHVPGGGS(SEQID NO:144)、DAIKHVPGGGS(SEQ ID NO:146)、DNAKHVPGGGS(SEQ IDNO:149)、DNIAHVPGGGS(SEQ ID NO:151)、DNIKHAPGGGS(SEQ IDNO:161))的竞争活性。这些结果表明DC8E8的属于第二tau蛋白重复序列(2号表位)的最小表位在6聚体序列，即HVPGGG(SEQ ID NO:154)内，且DC8E8结合HXPGGG(SEQ ID NO:164)。
实施例5：DC8E8识别错误无序TAUΔ(1-150；151-391)/4R，如通过表面等离子体共振所评估
表面等离子体共振(SPR)可用于检测蛋白质结合且通过实时直接监测结合事件来测定蛋白质复合物(例如抗体-抗原复合物)的热力学参数。这个技术常规用于表征诊断抗体与治疗抗体两者(参见例如Karlsson和Larsson,Affinity Measurement Using Surface Plasmon Resonance,Methods in MolecularBiology,第248卷:Antibody Engineering:Methods and Protocols.由B.K.C.Lo编Humana Press Inc.,Totowa,NJ,(2008))。
对于SPR实验，如下在蛋白质G亲和柱上自无血清杂交瘤上清液纯化DC8E8单克隆抗体(mAb)。调整杂交瘤上清液至pH7.5，通过离心使溶液预澄清，经0.45μm膜过滤器过滤，且装载于5ml蛋白质G琼脂糖管柱上。用0.1M盐酸甘氨酸(pH2.7)自管柱洗脱DC8E8mAb。洗脱的级分即刻用1MTris-HCl(pH9.0)中和。针对PBS透析汇合的级分，通过超滤浓缩，且储存在-70℃下。通过测量280nm下的吸光度，使用公式c(mg/ml)＝A280nm/1.43确定抗体浓度。
具有CM5传感器芯片的BIACORE3000仪器(Biacore AB,Uppsala)用于SPR测定。自Biacore AB获得胺偶合试剂(EDC、NHS、乙醇胺(pH8.5))、P20清洁剂和10mM乙酸钠(pH5.0)。在25℃下于作为操作缓冲液的具有0.005％P20的PBS(pH7.4)(PBS-P)中进行这些实验。通常，在pH5.0下通过伯胺同时在两个流动池中偶合5,000RU(反应单位)的多克隆抗小鼠抗体(Z0420号；DakoCytomation,Glostrup,Denmark)，其中一个池用作参照测量。
在各分析循环中，在分析流动池中捕集纯化DC8E8以达到固定化水平230-250RU。对于KA测定以及对于动力学速率常数(k缔合和k解离)的测定，在流速50μl/min下在传感器芯片上注射tau蛋白(测试DC8E8亲和力所针对的tau蛋白)的两倍连续稀释液或作为对照的PBS-P。根据Myszka,1999使动力学结合数据经受双重参照且通过BIA评估软件4.1(Biacore AB)相对于两相反应模型加以拟合。整体估计动力学速率常数，局部拟合最大反应，且容积反应设置为零。
为定量DC8E8对各测试tau蛋白的亲和力，测定DC8E8结合四重复tau蛋白亚型2N4R、三重复tau蛋白亚型2N3R以及错误无序tauΔ(1-150；392-441)/4R和错误无序tauΔ(1-150；392-441)/3R的缔合平衡结合常数(KA)。用于SPR的所有tau蛋白都根据实施例1加以制备。DC8E8对四重复tauΔ(1-150；392-441)/4R的亲和力最高，随后是对全长四重复tau蛋白亚型2N4R的亲和力，接着是对三重复tauΔ(1-150；392-441)/3R的亲和力，且最后是对三重复全长tau蛋白亚型2N3R的亲和力(图9A、B)。确认这些结果：(1)DC8E8对错误无序形式的tau蛋白具有特异性，和(2)DC8E8对错误无序tau蛋白(即疾病或病理性tau蛋白)的选择性大于对全长tau蛋白(即正常或生理性tau蛋白)的选择性。
使用SPR实时监测结合事件使得能够测量DC8E8与若干tau蛋白之间的缔合(k缔合)和解离(k解离)动力学速率。DC8E8的结合动力学揭示当相较于生理性2N4R tau蛋白时，错误无序tauΔ(1-150；392-441)/4R和tauΔ(1-150；392-441)/3R的构象改变，此由错误无序tau蛋白中的DC8E8表位更易于到达所指示。这由错误无序tau蛋白相较于它们的全长对应物的结合更快以及k缔合更高所反映。此外，在四重复tau蛋白种类上存在DC8E8的额外结合位点导致4R tau蛋白种类自与DC8E8的复合物的解离减慢10倍以及k解离降低相应10倍(图10A、B；虚线是通过使用电脑程序BIAEvaluation v4.1自测量数据进行动力学参数计算加以内插)。
实施例6：DC8E8识别人阿尔茨海默病脑中的所有神经原纤维变性发展阶段
自荷兰脑库获得人脑组织(在石蜡块体上)。在切片机上切割块体。在室温(25℃)下用99％冷(+4℃)甲酸处理来自阿尔茨海默病脑(布拉克氏第VI阶段)和非痴呆对照(布拉克氏第I和III阶段)的海马-内嗅皮质的石蜡切片(8μm)1分钟。组织切片于阻断溶液(含5％BSA、0.3％Triton X-100的50nMTris-HCl)中孵育且接着与于阻断溶液中1:2,000稀释的纯化一级抗体DC8E8(7.8mg/ml；如实施例5中所述制备)一起孵育过夜。随后，在室温下使切片与生物素化二级抗体(Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector Laboratories)一起孵育1小时且接着与亲和素-生物素过氧化酶复合物反应60分钟(Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector Laboratories)，两者均在室温(25℃)下。用过氧化酶底物试剂盒(Vector VIP，Vector laboratories,Ca,USA)观察免疫反应且用甲基绿(Vector Laboratories)对比染色。用Olympus BX71显微镜检查切片。
单克隆抗体DC8E8会区分临床前AD、临床初期AD和充分发展的末期AD。免疫组织化学研究显示DC8E8检测处于人临床前AD布拉克氏第I阶段的早期阶段(tau蛋白单体、二聚体)的病理性tau蛋白。(图11A)。脑在内嗅皮质中仅含有有限数目的神经原纤维缠结(NFT)且在海马中不含有NFT(布拉克氏第I阶段)。在于海马中发现少许NFT的临床初期AD脑(布拉克氏第III阶段)中，DC8E8mAb识别以下两种阶段：病理性tau蛋白寡聚物(箭号)和病理性tau蛋白聚合物(缠结)(图11B)。在存在广泛神经原纤维变性的充分发展的阿尔茨海默病脑中，DC8E8主要识别呈神经原纤维缠结、神经炎斑块和神经炎线形式的病理性tau蛋白聚合物(图11C)。因此，mAb DC8E8识别人阿尔茨海默病脑组织中的所有神经原纤维病变发展阶段，包括单体、二聚、早期寡聚阶段(图11D1)和晚期寡聚缠结前阶段(图11D2)、以及病理性tau蛋白聚合物-细胞内(图11D3)和细胞外神经原纤维缠结(图11D4)的晚期发展阶段。因此，mAb DC8E8的这个反应性适用于这个抗体的诊断应用与治疗应用两者。
实施例7：如人阿尔茨海默病中所见，DC8E8识别转基因大鼠SHR72的脑中的所有神经原纤维变性发展阶段
SHR24转基因大鼠品系：这个品系表达国际专利申请PCT WO2004/007547中所述的蛋白质tauΔ(1-150；392-441)/3R。这个转基因品系的产生和表征已描述于Filipcik等,2010中。这些转基因大鼠在皮质脑区域中显现进行性年龄依赖性神经原纤维变性。神经原纤维缠结(NFT)满足用于鉴定人阿尔茨海默病中的神经原纤维变性的若干关键组织学准则，包括嗜银性、刚果红双折射和硫代黄素S反应性。也用用于检测人脑中的病理性tau蛋白的抗体鉴定神经原纤维缠结，所述抗体包括识别疾病tau蛋白构象的DC11(Vechterova等2003；Kovacech等2010)和对过度磷酸化形式的tau蛋白具有特异性的抗体。此外，神经原纤维变性的特征在于广泛形成由大鼠内源性和转基因截短tau蛋白种类组成的肌氨酰不溶性tau蛋白复合物(Filipcik等,2010)。这些转基因大鼠的最突出组织病理学特征是皮质中存在广泛神经原纤维病变-神经原纤维缠结。转基因大鼠的中值存活时间是222.5天(SD＝43.56)且最长存活时期达到475天(Filipcik等,2010)。
SHR72转基因大鼠品系：这些转基因大鼠在若干脑区域和脊髓中表达根据国际专利申请PCT WO2004/007547)的人截短tauΔ(1-150；392-441)/4R。这个大鼠品系的产生由Zilka等,2006加以描述，且tau蛋白病理学描述于Koson等,2008中。这些转基因大鼠的最突出组织病理学特征是存在广泛神经原纤维病变，例如神经原纤维缠结。NFT的外部特征满足用于鉴定人AD中的神经原纤维变性的若干组织学准则，包括嗜银性、刚果红双折射和硫代黄素S反应性。也用用于检测人脑中的病理性tau蛋白的抗体鉴定NFT，所述抗体包括识别异常tau蛋白构象的DC11(参见美国专利号7,446,180)和对过度磷酸化形式的tau蛋白具有特异性的抗体。此外，神经原纤维变性的特征在于广泛形成由大鼠内源性和人截短tau蛋白种类组成的肌氨酰不溶性tau蛋白复合物。在这个模型的一异型接合子品系中，在脑干和脊髓中观察到最广泛神经原纤维病变(Zilka等,2006)。先前已测定转基因表达水平、NFT载荷和大鼠的寿命。转基因大鼠(品系SHR72)的中值存活时间是222.5天(SD＝24.48)(Koson等,2008)。
转基因大鼠品系SHR24(表达tauΔ(1-150；392-441)/3R))和SHR72(表达tauΔ(1-150；392-441)/4R)在脑和脊髓中显现广泛神经原纤维变性。转基因大鼠品系SHR24在同形皮质、脑干和脊髓中显示重度神经变性，而SHR72转基因大鼠主要在脑干和脊髓中而非在皮质中显现NFT。在两种转基因品系中，感觉运动和神经损伤的进展类似；然而，SHR72转基因大鼠显示寿命较短。
在本申请中呈现的转基因大鼠研究中，使用半合子转基因大鼠(SHR24和SHR72)。所有大鼠都在标准实验室条件下在自由获取水和食物下舍饲且保持在昼行性光照条件(12小时光照/黑暗循环，其中光照在上午7:00开始)下。努力使所利用的大鼠数目最小且限定它们的不适、疼痛和受苦。
用DC8E8对大鼠脑组织的免疫组织化学分析：转基因大鼠(7月龄)在深度麻醉下用PBS穿心灌注1分钟，随后用100ml4％多聚甲醛(pH7.4)灌注。在灌注之后，截断头部且快速移除脑。使用一次性解剖刀片将脑径向切割成两个大小相等的半球。将脑组织后固定于4％多聚甲醛中，包埋于石蜡中，且在切片机上切割成切片。对8μm石蜡包埋的组织切片进行免疫组织化学和组织病理学分析。在室温(25℃)下，组织切片用抗原修复溶液(Vectorlaboratories,CA,USA)预处理20分钟且用90％冷(+4℃)甲酸(Applichem,Germany)处理1分钟。在阻断之后，将切片与于阻断溶液(含5％牛血清白蛋白、0.3％Triton X100的50nM Tris-HCl)中1:2000稀释的纯化单克隆抗体DC8E8(7.8mg/ml)一起孵育过夜。在洗涤之后，在室温下使切片与生物素化二级抗体(Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector Laboratories)一起孵育1小时，且接着在室温(25℃)下与亲和素-生物素过氧化酶复合物溶液反应60分钟(Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector Laboratories)。用过氧化酶底物试剂盒(Vector VIP，Vector laboratories,Ca,USA)观察免疫反应且用甲基绿(VectorLaboratories)对切片进行对比染色。用Olympus BX71显微镜检查切片。
在转基因大鼠脑(SHR72)中，mAb DC8E8识别疾病阶段病理性tau蛋白寡聚物(箭号)和疾病阶段病理性tau蛋白聚合物(缠结)(图12A)。此外，DC8E8与位于轴索纤维中的错误折叠tau蛋白反应。在年龄匹配的对照大鼠脑中，抗体不染色神经元胞体或轴索过程(图12B)。
当在人阿尔茨海默病脑中时(参见上文)，mAb DC8E8识别SHR72转基因大鼠的脑中的所有神经原纤维病变发展阶段，包括患病单体、二聚和早期寡聚阶段(图12C)、和晚期寡聚缠结前阶段tau蛋白(图12D)、以及病理性tau蛋白聚合物-细胞内(图12E)和细胞外神经原纤维缠结(图12F)的晚期发展阶段。
DC8E8也识别表达tauΔ(1-150；392-441)/3R)的转基因大鼠的脑中的神经原纤维缠结(SHR24，图13A；SHR72，图13B)。
实施例8：DC8E8识别人阿尔茨海默病中和TAU蛋白转基因大鼠的脑中的可溶性错误无序TAU蛋白与不溶性TAU蛋白种类两者
使用肌氨酰方法(Greenberg和Davies,1990)，自人AD脑或自疾病tau蛋白转基因大鼠脑(实施例7中所述的SHR24和SHR72品系)分离可溶性tau蛋白和不溶性tau蛋白复合物。对于蛋白质提取，将冷冻人AD脑组织(异型皮质，自荷兰脑库获得的布拉克第V和VI阶段样本)和来自转基因SHR24大鼠(同型皮质，10、12和14月龄)和来自转基因SHR72大鼠(脑干，7.5月龄)的组织于10体积的冷提取缓冲液(10mM Tris(pH7.4)、0.8M NaCl、1mMEGTA和10％蔗糖)中均质化。在20,000xg下离心组织匀浆20分钟且50μl上清液用于分析可溶性tau蛋白。
为制备肌氨酰不溶性tau蛋白，剩余上清液补充以N-月桂酰基肌氨酸(SIGMA)至最终浓度1％且在室温下在振荡下孵育1小时。在100,000xg下离心1小时之后，丢弃所得上清液，且团块包含肌氨酰不溶性tau蛋白部分。
通过免疫印迹分析可溶性tau蛋白和肌氨酰不溶性tau蛋白部分。可溶性tau蛋白部分用相等体积的2x SDS样本装载缓冲液(具有β-巯基乙醇)(Laemmli,1970)稀释且每个泳道装载15μg蛋白质。对于肌氨酰不溶性tau蛋白部分，将团块溶解于体积是用于制备不溶性tau蛋白部分的可溶性部分的1/50的1x SDS样本装载缓冲液中。接着，相等体积的可溶性tau蛋白和肌氨酰不溶性tau蛋白部分用于免疫印迹分析，此对应于可溶性部分中的15μg总蛋白(参见Filipcik等2010)。在95℃下加热样本5分钟，装载于5-20％梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶上，且在25mA下于Tris-甘氨酸-SDS缓冲系统中电泳40分钟。将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜中(在150mA下于10mM CAPS(pH12)中1小时)。在转移之后，膜在室温下于含5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲盐水(PBS；136.89mM NaCl、2.7mM KCl、8.09mM Na2HPO4、1.47mM KH2PO4)中阻断1小时，且接着与用TBST-牛奶(20mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、0.1％吐温20、5％脱脂奶粉)1:1稀释的DC8E8杂交瘤培养物上清液一起孵育1小时，随后用大体积的PBS洗涤3次。将膜与用PBS1:4,000稀释的作为二级抗体的HRP缀合的山羊抗小鼠Ig(DAKO,Denmark)一起孵育(在室温下1小时)。这个孵育继之以用含0.2％IgepalCA-630(SIGMA)的PBS洗涤(3次)。印迹用SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce,U.S.A)显色，且使用LAS3000成像系统(FUJI Photo Film Co.,Japan)检测蛋白质信号。使用AIDA(Advanced Image Data Analyzer,Raytest,Straubenhardt,Germany)软件对化学发光信号强度定量。
DC8E8识别可溶性人tauΔ(1-150；392-441)/3R与SHR24转基因大鼠中的生理性大鼠tau蛋白亚型两者(图14A)。此外，DC8E8识别tauΔ(1-150；392-441)/3R和来自SHR24大鼠脑的肌氨酰不溶性tau蛋白部分中的病理性大鼠tau蛋白(图14B)。重要的是DC8E8强烈识别人AD脑中的肌氨酰不溶性tau蛋白部分中的病理性人tau蛋白(布拉克第V和VI阶段，图14B和14C)。DC8E8识别可溶性人tauΔ(1-150；392-441)/4R与SHR72转基因大鼠中的全长(生理性)大鼠tau蛋白亚型两者(图14D)。显著的是DC8E8特异性识别病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R和来自SHR72大鼠脑的肌氨酰不溶性tau蛋白部分中的病理性形式的大鼠tau蛋白(图14D)。
实施例9：DC8E8抑制病理性TAU蛋白-TAU蛋白相互作用
tau蛋白纤维化测定。体外tau蛋白纤维化测定用于确定DC8E8是否对病理性tau蛋白-tau蛋白相互作用具有抑制作用。所述测定是基于tau蛋白的固有性质，即它们能够在与如硫酸化糖胺聚糖肝素的聚阴离子相互作用后经受构象变化。一个tau蛋白分子上的这个改变构象进一步导致其与另一tau蛋白分子发生病理性相互作用，通过在相互作用性tau蛋白分子的微管结合区中形成交叉β折叠结构来稳定化tau蛋白-tau蛋白复合物，以及最后形成阿尔茨海默病样成对螺旋纤维(PHF)(Skrabana等,2006)。可通过如硫代黄素T的荧光染料来检测富含β折叠的结构的形成。
用以测量DC8E8对病理性tau蛋白-tau蛋白相互作用的影响的测定设置于PBS(经0.2μm过滤器过滤)中，所述PBS含有：20μΜ(最终浓度)的一种如实施例1中所述纯化的测试重组tau蛋白(tauΔ(1-150；392-441)/4R或tauΔ(1-296；392-441)/4R)；5μΜ肝素(来自猪肠粘膜的肝素钠盐，≥150IU/mg，干基准，来自SIGMA)；和12.5μΜ(最终浓度)硫代黄素T。在37℃下在密封黑色固体聚苯乙烯板(384孔，Greiner BioOne)中孵育各反应(80μl最终体积)20小时。使用荧光读取器(Fluoroskan Ascent FL(Labsystems))，在激发波长450nm、在510nm下发射以及200ms测量时间下测量硫代黄素T荧光。对于测定mAb DC8E8对病理性tau蛋白-tau蛋白相互作用的抑制活性，在37℃下孵育之前，在20μΜ最终浓度下添加纯化DC8E8(实施例5)至反应混合物中。两种抗体用作对照：DC51(识别狂犬病病毒的包膜蛋白；Macikova等,1992)和DC11(识别某些截短构象改变形式的tau蛋白，美国专利号7,446,180)。
通过在不存在(“对照”)和存在(“DC8E8”)DC8E8下的硫代黄素T荧光来测量构象改变和纤维化tau蛋白的量(图15A和15B)。在20μΜ最终浓度下添加的mAb DC8E8防止两种错误无序tau蛋白的病理性构象变化和纤维化，使tauΔ(1-150；392-441)/4R和tauΔ(1-296；392-441)/4R的纤维化病理性tau蛋白形式的量分别降低至小于5％和16％。当通过非参数t检验分析时，DC8E8的这个抑制活性具有统计显著性(“DC8E8”，图15A和15B中分别p<0.001和p p<0.01)。不结合tau蛋白的无关抗体Rab50(Macikova等,1992)不防止tau蛋白构象变化，从而导致硫代黄素T荧光不变(“Rab50”)。识别tau蛋白的某些病理性改变构象的抗体DC11(Vechterova等,2003和美国专利号7,446,180)进一步促进纤维化tau蛋白形成；这个作用可反映由DC11达成的tau蛋白的病理性构象的稳定化，所述病理性构象为异常tau蛋白-tau蛋白相互作用和纤维形成所需。
DC8E8也抑制由错误无序tauΔ(1-296；392-441/4R)形成tau蛋白二聚体、三聚体和寡聚物(图16)。如上对于纤维化测定所述，在存在或不存在DC8E8下孵育重组tauΔ(1-296；392-441)/4R1、4和20小时。在指示的时间点，通过添加SDS样本装载缓冲液来终止反应。对于蛋白质分析，将10μl各纤维化反应装载于5-20％梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶上且在25mA下于Tris-甘氨酸-SDS缓冲系统中电泳40分钟。在蛋白质转移至PVDF膜中(在150mA下于10mM CAPS(pH12)中1小时)之后，膜在室温下于含5％脱脂奶粉的PBS中阻断1小时，且接着与于PBS中1:1,000稀释的HRP缀合的DC25(Skrabana等(2006))一起孵育1小时，随后用大体积的PBS洗涤3次。印迹用SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce,U.S.A)显色，且使用LAS3000成像系统(FUJI Photo Film Co.,Japan)检测化学发光信号。使用AIDA(AdvancedImage Data Analyzer,Raytest,Straubenhardt,Germany)软件对化学发光信号强度定量。
这些结果揭示人tau蛋白中由DC8E8识别/结合的四个结合位点的一者或多者涉及于单体tau蛋白构象变化、tau蛋白纤维化和tau蛋白聚集体(二聚体、三聚体和其它寡聚物)形成中。换句话说，tau蛋白的由残基267-KHQPGGG-273(SEQ ID NO:98)(tau蛋白的第1重复结构域)、298-KHVPGGG-304(SEQ ID NO:99)(tau蛋白的第2重复结构域)、329-HHKPGGG-335(SEQ ID NO:100)(tau蛋白的第3重复结构域)和361-THVPGGG-367(SEQ ID NO:101)(tau蛋白的第4重复结构域)涵盖的四个区域的一者或多者促进和/或涉及tau蛋白纤维化和tau蛋白聚集体(二聚体、三聚体和其它寡聚物)形成。
实施例10：DC8E8介导的错误无序TAU蛋白摄取和降解
小鼠BV2小神经胶质细胞于6孔板中用单独1μΜ重组tauΔ(1-150；392-441)/4R，或用tauΔ(1-150；392-441)/4R和DC8E8的混合物/复合物处理不同时期。收集培养基且首先用PBS洗涤细胞，且接着用弱酸洗涤溶液(0.5M NaCl、0.2M乙酸，pH3)洗涤1分钟。洗涤的细胞接着于TTL缓冲液(20mM Tris(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、0.5％Triton X-100、50mM NaF、1mM Na3VO4、Roche蛋白酶完全抑制剂)中溶解且快速冷冻于液氮中。在12％SDS-PAGE凝胶上分析所得细胞提取物且如先前所述进行蛋白质印迹(Koson等,2008)。简言之，将蛋白质转移于硝酸纤维素膜(Millipore,Billerica,MA,USA)上且用丽春红S(Ponceau S)染色以确认蛋白质转移均一，且接着用识别tau蛋白残基347-353，且称为全tau蛋白抗体的DC25杂交瘤培养物上清液(Axon Neuroscience,Vienna,Austria)探测膜。用抗GADPH抗体(1:1,000，Abeam)进行的蛋白质印迹用作蛋白质装载对照。与DC25一级抗体一起孵育继之以洗涤和与缀合有HRP的多克隆山羊抗小鼠IgG二级抗体(1:3,000；Dako,Glostrup,Denmark)一起孵育。印迹用SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce,U.S.A)显色，且使用LAS3000成像系统(FUJI Photo Film Co.,Japan)检测化学发光信号。
如先前段落中所述，TauΔ(1-150；392-441)/4R在浓度1μΜ下单独或与1μΜmAb DC8E8一起添加至小鼠BV2细胞培养物中。在孵育2、4、6和12小时之后，提取细胞蛋白质，且通过蛋白质印迹分析内化tau蛋白的水平。全tau蛋白抗体DC25显示在小神经胶质细胞内部存在错误无序tau蛋白。蛋白质印迹分布揭示在DC8E8存在下，错误无序tau蛋白的降解较快(图17A)。
也发现DC8E8抗体自身存在于BV2细胞内部。图17A。此外，DC8E8降低可溶性错误无序tau蛋白在细胞培养基中的载荷，此可反映细胞外蛋白水解机构的活化(图17B)。
实施例11：DC8E8在37℃下稳定
将DC8E8(如实施例5中所述纯化)于PBS中稀释至浓度2mg/ml且在37℃下孵育等分试样(100μl)。在各种1个月间隔下，将等分试样冷冻在-20℃下。在整个实验持续时间期间保持储存在-20℃下的DC8E8等分试样(2mg/ml)用作“对照”。在4个月之后(此时收集所有样本)，如实施例2中所述，通过ELISA对DC8E8活性(结合作为固相的重组tauΔ(1-150；392-441)/4R)，因此在37℃下的保存期限稳定性进行分析。将各DC8E8等分试样稀释2,000倍(即2,000x或1:2,000)、4,000x、8,000x、16,000x、32,000x、64,000x、128,000x、256,000x和512,000x。相较于“对照”，甚至在37℃下孵育4个月之后，DC8E8也具有活性(如通过其能够结合tauΔ(1-150；392-441)/4R所量度)且因此稳定(图18)。
实施例12：DC8E8能够在天然离体样条件下结合且免疫沉淀来自人AD脑和来自SHR72大鼠的脑的可溶性TAU蛋白与不溶性TAU蛋白两者
使用肌氨酰方法(Greenberg和Davies,1990)，自人AD脑或自tau蛋白转基因大鼠脑(实施例7中所述的品系SHR72)生物化学分离肌氨酰不溶性错误折叠tau蛋白。对于蛋白质提取，将未固定冷冻人AD脑(横嗅皮质，布拉克第V阶段，自荷兰脑库(Netherlands)获得)和SHR72转基因大鼠(同型皮质，7.5月龄动物)组织于10体积的冰冷提取缓冲液[10mM Tris(pH7.4)、0.8MNaCl、1mM EGTA和10％蔗糖(补充有50mM NaF、1mM Na3VO4和无EDTA的蛋白酶抑制剂的混合物(来自Roche))]中均质化。在20,000xg下离心组织匀浆20分钟以移除膜物质。为制备肌氨酰不溶性tau蛋白部分，上清液补充以N-月桂酰基肌氨酸(SIGMA)至最终浓度1％且在室温下在振荡下孵育1小时。在100,000xg下离心1小时之后，丢弃所得上清液且团块于3ml磷酸盐缓冲盐水(PBS，8.09mM Na2HPO4、1.47mM KH2PO4、136.89mMNaCl、2.7mM(KCl))中洗涤一次。接着通过使用配备有MS72探针的BandelinSonopuls HD2200/UW2200(Bandelin Electronic,Germany)，在20％工作循环下，在输出设置在20％下，在冰上超声处理2分钟来将代表富含寡聚和聚合错误折叠tau蛋白种类(即疾病tau蛋白)的脑蛋白质部分的团块再混悬于1mlPBS(补充有50mM NaF、1mM Na3VO4和无EDTA的蛋白酶抑制剂的混合物(来自Roche)))中。
将富含疾病tau蛋白的所得混悬液(来自人AD脑和来自大鼠AD模型的脑的两者)分成两个500μl部分且各部分接受25μg的两种纯化抗体之一：DC8E8或对照抗体Rab50(识别狂犬病病毒的包膜蛋白；Macikova等,1992)。在6℃下在上下旋转下使混悬液与抗体一起孵育2小时。为分离形成的抗体-疾病tau蛋白复合物，添加50μl于PBS中平衡的蛋白质G Mag琼脂糖珠粒(GE Healthcare)的50％混悬液至各混悬反应中，在6℃下再孵育所述反应1小时。收集具有结合的抗体-tau蛋白复合物的珠粒且用PBS(补充有50mMNaF、1mM Na3VO4、0.02％IGEPAL CA-630(SIGMA)和无EDTA的蛋白酶抑制剂的混合物(Roche))洗涤3次。通过于100μl200mM甲酸(pH2.7)中进行3次单独5分钟孵育来自珠粒洗脱结合的抗体复合物。汇合100μl洗脱物，冻干，将蛋白质溶解于SDS-PAGE样本装载缓冲液(Laemmli,1970)中，在12％SDS-PAGE凝胶上分离，转移于硝酸纤维素膜上，且通过与如上缀合有HRP(Kementec,Denmark)的全tau蛋白抗体DC25(2N4Rtau蛋白的表位347-353，Axon Neuroscience,Vienna,Austria)一起孵育来检测tau蛋白。孵育(在室温下1小时)继之以用含0.2％Igepal CA-630(SIGMA)的PBS洗涤(3次)。印迹用SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce,U.S.A)显色，且使用LAS3000成像系统(FUJI Photo Film Co.,Japan)检测信号。
DC8E8识别、靶向且结合阿尔茨海默病患者的脑中存在的所有形式的疾病tau蛋白：寡聚和聚合错误折叠tau蛋白种类(图19A)。图19A中的泳道1显示自人AD脑生物化学提取的病理性tau蛋白种类。泳道3显示由DC8E8识别、由DC8E8结合且用DC8E8免疫沉淀分离的tau蛋白种类。DC8E8结合/免疫沉淀的疾病tau蛋白种类的样式是生物化学提取的tau蛋白的样式。这些结果显示由DC8E8对人脑中，即蛋白质呈体内样未修饰形式所处的提取物中的病理性tau蛋白种类的高效离体识别，从而显示DC8E8具有适用治疗性质，即能够体内靶向疾病tau蛋白种类。对照抗体Rab50(“模拟抗体”，泳道2)不识别脑提取物中存在的任何tau蛋白，从而确认DC8E8与tau蛋白的结合具有特异性。
图19B显示模拟抗体(Rab50)和用于免疫纯化tau蛋白的DC8E8的量(分别泳道2和3)。DC8E8的重链和轻链的位置也标记在图19A的泳道3中。较高量的抗体链的存在使疾病tau蛋白的样式扭曲。
DC8E8也识别且靶向阿尔茨海默病的SHR72大鼠模型的脑中的所有形式的错误折叠(患病)tau蛋白。图20A泳道1显示自转基因大鼠的脑生物化学提取的疾病tau蛋白种类。与转基因大鼠脑提取物一起孵育DC8E8抗体允许免疫纯化脑中存在的疾病tau蛋白种类(图20A，泳道3)。DC8E8纯化的tau蛋白种类显示样式与生物化学分离的tau蛋白的样式(图20A泳道1)相同，此确认DC8E8识别且结合转基因大鼠脑中存在的所有病理性tau蛋白种类。tau蛋白条带样式的略微扭曲由存在DC8E8抗体重链和轻链(标记于图20A泳道3中)引起。模拟抗体Rab50(图20A，泳道2)不结合任何tau蛋白。
图20B显示模拟抗体(Rab50)和用于自阿尔茨海默病的大鼠转基因模型的脑提取物免疫纯化tau蛋白的DC8E8的量(分别泳道2和3)。DC8E8的重链和轻链的位置也标记在图20A的泳道3中。较高量的抗体链的存在使疾病tau蛋白的样式略微扭曲。
实施例13：DC8E8单克隆抗体自转基因大鼠SHR72的脑移除病理性TAU蛋白
在含有10％NHS和1％谷氨酰胺的DMEM中培养产生DC8E8或Rab50(阴性对照抗体，识别狂犬病病毒)的杂交瘤细胞。在Bürker计数室中对细胞计数。在100xg下短暂离心每毫升含有500,000个细胞的细胞混悬液5分钟且将团块再混悬于1ml PBS中。在100xg下再次短暂离心细胞混悬液5分钟，且将团块再混悬于5μl PBS中。
转基因大鼠SHR72(6月龄)用于这些实验(每组3只大鼠)。在手术之前至少1小时，向大鼠皮下施用免疫抑制药物-山地明(Sandimmun)(15mg/kg)。通过腹膜内注射3:5比率的替来他明(Tiletamine)-唑拉西泮(Zolazepam)(100mg/ml)/甲苯噻嗪(Xylazine)(20mg/ml)的混合物来使转基因大鼠麻醉。麻醉剂的给药如下：舒泰(Zoletil)(30mg/kg)和赛拉姆(Xylariem)(10mg/kg)。通过将固定臂置放至各动物的耳道中来将麻醉大鼠的头部固定在立体定向装置(David Kopf Instruments,Tujunga,CA,USA)中。使用手术钻机，根据所选立体定向坐标(侧向5mm；前-后4mm；背腹-5mm，相对于前囟)在各动物的头上钻孔。将产生DC8E8(105个细胞)或Rab50(105个细胞)的杂交瘤细胞混悬液双向注射至大鼠的脑的海马伞中。在操作之后不久，肌肉内施用科那尔(Ketonal)(5mg/kg)。在施用之后持续8天皮下施用山地明(15mg/kg)。持续10天将恩罗西(Enroxil)(20mg/kg/24h)于饮用水中加以施用。
在手术程序之后两周，用舒泰(30mg/kg)与赛拉姆(10mg/kg)的混合物使大鼠麻醉。在2-5分钟之后，将大鼠固定在解剖台上，且打开它们的腹腔。在灌注之前，收集血液以分析血清中的tau蛋白和抗体水平。将灌注针置放入左心室中，且使用蠕动泵(Zalimp pp1-05型，速度-10x，7-22ml/1min程度的灌注液体)用PBS灌注大鼠2分钟。割去各大鼠的头部，通过paean打开它的头颅，且小心移除脑(连同一部分脊髓)。将脑径向切割成两部分：右侧于4％PFA(4℃)中固定过夜。切割左侧且将脑干和两个皮质区域快速冷冻在液氮中。
如下在实施例19中所述，使用tauΔ(1-150；392-441)4R作为固相，通过ELISA测定处理动物的血清中的DC8E8抗体的量。将各动物(A、B、C)的血清自100x连续稀释至12,800x(图21A)。使用纯化DC8E8作为标准测定DC8E8抗体的血清浓度。DC8E8在处理动物中达到浓度466、200和273ng/ml(分别DC8E8处理组的A、B、C)。
也测定各处理动物的血清中的tau蛋白浓度。这是根据制造商的方案，使用Innotest hTAU ELISA试剂盒(Innogenetics,Belgium)来进行。用DC8E8处理导致抗体-tau蛋白复合物转运至血液中，在血液中，tau蛋白达到平均浓度350pg/ml。DC8E8的这个作用有助于自脑消除病理性tau蛋白。另一方面，在用识别狂犬病病毒的包膜蛋白的模拟抗体(Rab50)(Macikova等,1992)处理的动物的血清中未检测到tau蛋白。图显示连同标准平均误差(SEM)的平均值(图21B)。
将固定脑组织包埋在石蜡中且在切片机上切割。对8μm石蜡包埋的切片进行免疫组织化学分析。组织切片用沸腾抗原修复溶液(VectorLaboratories,Burlingame,CA,USA)预处理20分钟且用85％甲酸(Applichem,Darmstadt,Germany)处理1分钟。在阻断之后，将组织切片与mAb DC8E8一起孵育过夜，随后洗涤且与生物素化二级抗体(Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector Laboratories)一起孵育(在室温下1小时)。在洗涤之后，在室温下使切片与亲和素-生物素过氧化酶复合物(Vectastain Elite ABC试剂盒，VectorLaboratories)反应60分钟。用过氧化酶底物试剂盒VIP(Vector VIP,VectorLaboratories,Burlingame,CA,USA)观察免疫反应。上橄榄复合体用于定量DC8E8神经元内信号。定量个别运动神经元(每个切片至少15个神经元)中的总信号。使用AIDA(Advanced Image Data Analyzer,Raytest,Straubenhardt,Germany)软件进行图像分析。对所有处理动物的切片进行计数且接着使用非参数曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)进行统计评估。
对来自模拟处理(图22A，右版面)和DC8E8处理(图22A，左版面)动物的切片的上橄榄复合体中的病理性tau蛋白的量的定量(图22B)显示相较于模拟处理动物，用DC8E8处理的所有3个动物中的测试脑区域中的病理性tau蛋白的量都降低(p<0.0001)(图22A和22B)。
实施例14：定位DC8E8结合位点内影响DC8E8识别TAU蛋白的治疗表位的残基
a)单链DC8E8抗体的克隆和抗体结合位点的突变诱发。制备全长DC8E8mAb的功能性单链形式(scDC8E8v)以帮助定位mAb DC8E8的为识别tau蛋白所必需的氨基酸残基。这是使用如实施例3中所述制备的DC8E8的轻链和重链的cDNA来进行。
使用携带NcoI(正向引物：5'-ATATTACCATGGACATTGTGATGTCACAG-3'(SEQ ID NO:155))和XhoI(反向引物：5'-ATATTATTCTCGAGGGAGACGGTGACTGAGGT-3'(SEQ ID NO:156))限制酶的限制位点和用于接合重链和轻链可变区的寡核苷酸接头序列(VH-LINK-F：5'-GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCCATGCAGGTCCAATTGCAGCAG-3'(SEQ ID NO:157)；VL-LINK-R：5'-GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCCCGTTTG ATGTCCAGCTTGGTGCC-3'(SEQ ID NO:158))(接头序列是根据Krebber等1997来设计)的克隆引物，通过PCR进一步扩增DC8E8的可变区。在消化分离的PCR产物(使用NcoI和XhoI酶)和通过琼脂糖凝胶电泳纯化之后，使用T4DNA连接酶(Fermentas,Germany)将片段克隆至NcoI和XhoI消化的pET22b质粒中。细菌菌株DH5α用于扩增所得质粒且通过限制酶分析来验证所选克隆中的正确插入位置。通过使用3130遗传分析器(AppliedBiosystems,USA)进行DNA测序来验证所得单链DC8E8构建体(scDC8E8v)的序列正确性。
b)通过丙氨酸扫描突变诱发来鉴定DC8E8结合位点中影响DC8E8识别病理性tau蛋白的残基。对于鉴定影响DC8E8结合tau蛋白的残基，对scDC8E8v的所选位点(用粗体且加下划线表示，参见下文)进行Ala扫描突变诱发。基于MacCallum等(Mol.Biol.1996)的研究来鉴定选择用于Ala取代的氨基酸。通过利用由Sambrook和Russell(2001)所著的“Molecular Cloning:ALaboratory manual”中所述的标准程序，在PCR中使用突变寡核苷酸进行重叠延伸法来对scDC8E8v进行突变诱发。
以下相对于各原始DC8E8序列列出突变单链。突变残基用粗体且加下划线表示。突变单链的名称由构建体的编号、可变重链或轻链首字母缩写(VH或VL)、DC8E8中的原始氨基酸的单字母代码继之以它在轻链和重链序列(分别SEQ ID No.141和SEQ ID No.138)中的位置、且接着对于取代性丙氨酸而言的A组成。举例而言，突变1-VL-N31A对应于单链突变体编号1，其中通过用丙氨酸(A))置换天冬酰胺31(N31)，可变轻链在位置31(相对于DC8E8)处被突变：
DC8E8轻链可变区(CDR加下划线)：
[SEQ ID NO.141]：
1        10        20       30         40        50
DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLL
      60        70        80         90       100
IYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSFYLRTFGGG
110
TKLDIK
CDR1[SEQ ID NO.117]中的突变(突变的残基用粗体和加下划线表示)：QSLLSRTRKN(SEQ ID NO:117)(CDR1的原始DC8E8序列)
1-VL-N31A[SEQ ID NO.247]
2-VL-R33A[SEQ ID NO.248]
3-VL-Y38A[SEQ ID NO.249]
先于CDR2的框架区FR2中的突变：LAWYQQKPGQSPKLLI(SEQ ID NO:160)(框架区FR2的原始DC8E8序列)
4-VL-Y55A[SEQ ID NO.252]
CDR2[SEQ ID NO.118]中的突变：AS(SEQ ID NO:118)(CDR2的原始DC8E8序列)
5-VL-W56A[SEQ ID NO.253]
CDR3[SEQ ID NO.119]中的突变：T(SEQ ID NO:119)(CDR3的原始DC8E8序列)
6-VL-K95A[SEQ ID NO.254]
7-VL-Q96A[SEQ ID NO.255]
8-VL-S97A[SEQ ID NO.256]
9-VL-F98A[SEQ ID NO.257]
10-VL-Y99A[SEQ ID NO.258]
11-VL-L100A[SEQ ID NO.259]
12-VL-R101A[SEQ ID NO.260]
DC8E8重链可变区(CDR加下划线)：
[SEQ ID No.138]:
1        10        20       30         40        50
QVQLQQSGPELVKPGTSVKMPCKASGYIFTDYVISWVKQRTGQGLEWIGEIFP
      60        70        80         90      100
RSGSTYYNEKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSVTSEDSAYFCARDYYGTSFA
110
MDYWGQGTSVTVSS
CDR1[SEQ ID NO.120]中的突变(突变的残基用粗体和加下划线表示)：GYIFTDIS(SEQ ID NO:120)(CDR1的原始DC8E8序列)
14-VH-Y32A[SEQ ID NO.261]
15-VH-V33A[SEQ ID NO.262]
先于CDR2的框架区FR2中的突变：WVKQRTGQGLEWIG(SEQ IDNO:162)(框架区FR2的原始DC8E8序列)
16-VH-E50A[SEQ ID NO.263]
CDR2[SEQ ID NO.121]中的突变：IPRSGT(SEQ ID NO:121)(CDR2的原始DC8E8序列)
17-VH-F52A[SEQ ID NO.264]
18-VH-S57A[SEQ ID NO.265]
CDR3[SEQ ID NO.122]中的突变：ARTSFAMDY(SEQ IDNO:122)(CDR3的原始DC8E8序列)
19-VH-D99A[SEQ ID NO.266]
20-VH-Y100A[SEQ ID NO.267]
21-VH-Y101A[SEQ ID NO.268]
22-VH-G102A[SEQ ID NO.269]
重组DC8E8抗体变体的分析性和制备性表达：将野生型抗体及其突变体(其都用His标记)的pET22b-scDC8E8v DNA构建体转化至大肠杆菌产生菌株BL21(DE3)细胞中。首先针对重组scDC8E8v的产生来验证所得克隆。将在转化之后获得的个别菌落接种至2ml补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中且在37℃下在恒定搅拌下生长5小时(Sambrook和Russell2001)。移除各培养物的100μl等分试样，与2/3体积的100％甘油混合且在-80℃下冷冻储存以供随后使用。通过添加异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至最终浓度1mM来诱导重组蛋白表达且再继续孵育3小时。通过在4℃下在10,000xg下在台式离心机中离心1分钟来收集细胞，丢弃上清液，将细胞团块再混悬于1x SDS样本缓冲液(Laemmli1970)中并煮沸5分钟。在10,000xg下离心样本5分钟且通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析上清液(细菌溶解产物)。通过用考马斯亮蓝R250(SIGMA)染色来观察分离的蛋白质。
对于各scDC8E8v抗体(天然和突变)的制备性表达，如由Sambrook和Russell(2001)所著的“Molecular Cloning:A Laboratory manual”中所述培养且诱导含有相应表达质粒的细菌细胞。使转化的细胞在37℃下在230rpm下于100-500ml具有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中生长。当在600nm下的培养物吸光度达到0.8-1.0时，添加IPTG至最终浓度1mM以诱导scDC8E8v表达。在37℃下再孵育3小时之后，通过在4℃下在3,000g下离心15分钟来收集细胞。将细胞团块再混悬于10ml溶解缓冲液(50mMPIPES(pH6.9)、50mM NaCl、0.1mM PMSF)中且使用TT-13尖端(50％工作循环，50W功率输出，Sonopuls HD2200，Bandelin,Germany)在冰上超声处理6次30s，其中暂停30s。通过离心(在4℃下，21,000xg，持续15分钟)来使溶解产物澄清。溶解产物经0.45μm膜过滤器过滤且储存在-80℃下直至使用。对于成功诱导和表达水平的检查，收集1ml诱导的培养物，通过如上离心收集细胞，再混悬于100μl1x SDS样本缓冲液中，在95℃下煮沸5分钟，且接着通过SDS-PAGE加以分析(图23A)。细胞质溶解产物用于结合/检测tau蛋白(通过蛋白质印迹分析)且用于SPR测定重组抗体对tau蛋白的亲和力，所述两者均是天然和突变scDC8E8v抗体的活性的量度。
实施例15：单克隆抗体DC8E8的重组scFV片段(scDC8E8V)识别病理性TAU蛋白(TAUΔ(1-150；392-441)/4R)
对于测定scDC8E8v对病理性形式的tau蛋白的结合性质，将来自表达scDC8E8v的细菌的蛋白质溶解产物16倍稀释至TBS-T缓冲液(20mMTris(pH7.4)、150mM NaCl、0.1％吐温20)中且用于上覆盖含有500、250和125ng重组截短tau蛋白(tauΔ(1-150；392-441)/4R)和重组C末端截短tau蛋白(tauΔ228-441)的硝酸纤维素膜(蛋白质的丽春红S染色，图23B)。通过用抗6xhis标签(SEQ ID NO:163)抗体(A00174号；GenScript,Piscataway,NJ,USA)进行免疫印迹来检测结合的scDC8E8v且用抗兔HRP缀合的抗体(DAKOCytomation,Denmark)进行观察(图23C)。印迹用SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce,U.S.A)显色，所述底物是使用LAS3000成像系统(FUJI PhotoFilm Co.,Japan)来检测。
蛋白质印迹分析显示重组单链抗体(scDC8E8v)检测到截短tau蛋白[tauΔ(1-150；392-441)/4R]。结合具有特异性，因为scDC8E8v不识别不含有由完整DC8E8识别的四种治疗表位的任一者的对照截短tau蛋白tauΔ228-441(图23C泳道4)。用来自不表达scDC8E8v的对照细菌的溶解产物探测含有tau蛋白的硝酸纤维素膜(如图23B中所示装载)不产生任何信号(图23D)。
实施例16：单克隆抗体DC8E8的重组SCFV片段(scDC8E8V)展现与DC8E8抗体类似的TAU蛋白结合性质-选择性识别病理性TAU蛋白(TAUΔ(1-150；392-441)/4R)且显著区分它与生理性天然TAU蛋白(TAU2N4R)。
为定量重组单链抗体scDC8E8v的tau蛋白结合性质，通过SPR(Biacore3000，Biacore,Sweden)进行动力学亲和力测定以测量scDC8E8v与病理性截短tau蛋白(tauΔ(1-150；392-441)/4R)的结合(图24A)和与正常人四重复tau蛋白亚型2N4R的结合(图24B)。为此，将11,000RU的兔多克隆抗His标签抗体(A00174号；GenScript,Piscataway,NJ,USA)固定在CM5传感器芯片上。所有实验都在25℃下于作为操作缓冲液的具有0.005％P20的PBS(pH7.4)(PBS-P)中进行。在分析流动池中捕集重组His标记的scDC8E8v以达到固定化水平60RU，且在流速100μl/min下在传感器芯片上注射已知浓度的各tau蛋白或PBS-P对照样本。使动力学结合数据经受双重参照且通过BIA评估软件4.1(Biacore AB)相对于1:1相互作用模型加以拟合。整体估计动力学速率常数，局部拟合最大反应，且容积反应设置为零。
动力学测量结果显示相较于对正常tau蛋白2N4R，scDC8E8v对病理性AD tauΔ(1-150；392-441)/4R的缔合速率常数较高且解离速率常数较低(图24C)。因此，scDC8E8v对截短AD tau蛋白的亲和力高于对全长tau蛋白亚型2N4R的亲和力(平衡缔合常数KA值较高)。这些测量结果确认像亲本全长DC8E8抗体一样，单链形式的DC8E8抗体(scDC8E8v)显示对构象改变的病理性tau蛋白具有结合优先性。因此，重组scDC8E8v适于鉴定DC8E8抗体结合位点内负责其结合性质的氨基酸残基。
实施例17：鉴定scDC8E8v结合位点中影响scDC8E8v/DC8E8识别病理性TAU表位的残基。
已通过scDC8E8v结合位点残基的丙氨酸扫描突变诱发确定影响DC8E8-抗原相互作用的若干氨基酸残基。基于MacCallum等(J.Mol.Biol.1996)的研究鉴定轻链和重链中的潜在抗原接触残基且如实施例14中所述使其突变成丙氨酸。随后在BL21大肠杆菌菌株中表达突变形式的scDC8E8v(图25A，单链蛋白质用星号指示)。通过蛋白质印迹分析突变scDC8E8v的结合性质(图25B-C)。图25B显示丽春红S对含有各种量的截短tauΔ(1-150；392-441)/4R蛋白质的硝酸纤维素膜的染色。相同膜用于通过各种突变单链抗体来检测截短tau蛋白(图25C)。
基于这些结果，DC8E8的可变区中的氨基酸残基被分类成如下三个主要种类：
种类1：这个种类中所列的残基(用粗体表示)最大程度促进scDC8E8v结合病理性截短AD tau蛋白(tauΔ(1-150；392-441)/4R)。这些残基的任一者突变成丙氨酸都最大程度阻止识别tau蛋白上的DC8E8表位。
DC8E8轻链中的种类1残基：
CDRL1[SEQ ID NO.117]中在位置31处的天冬酰胺
CDRL1[SEQ ID NO.117]中在位置38处的酪氨酸
CDRL3[SEQ ID NO.119]中在位置97处的丝氨酸
DC8E8重链中的种类1残基：
先于CDRH2[SEQ ID NO.121]的FRH2中在位置50处的谷氨酸
CDRH3[SEQ ID NO.122]中在位置101处的酪氨酸
种类2：这个种类中所列的残基促进scDC8E8v结合病理性tau蛋白(tauΔ(1-150；392-441)/4R)。这些残基的任一者突变成丙氨酸会降低scDC8E8v对截短AD tau蛋白(tauΔ(1-150；392-441)/4R)的反应性，但阻止scDC8E8v的程度小于种类1残基的突变：
DC8E8轻链中的种类2残基：
先于CDRL2[SEQ ID NO.118]的框架区FRL2中在位置55处的酪氨酸
CDRL3[SEQ ID NO.119]中在位置95处的赖氨酸
DC8E8重链中的种类2残基：
CDRH2[SEQ ID NO.121]中在位置57处的丝氨酸
CDRH3[SEQ ID NO.122]中在位置100处的酪氨酸
CDRH3[SEQ ID NO.122]中在位置102处的甘氨酸
种类3：这个最后种类中所列的残基最小程度促进scDC8E8v结合病理性AD tau蛋白(tauΔ(1-150；392-441)/4R)。这些残基突变成丙氨酸不改变scDC8E8v对截短tau蛋白(tauΔ(1-150；392-441)/4R)的反应性：
轻链中的种类3残基：
CDRL1[SEQ ID NO.117]中在位置33处的精氨酸
CDRL2[SEQ ID NO.118]中在位置56处的色氨酸
CDRL3[SEQ ID NO.119]中在位置96处的谷氨酰胺
CDRL3[SEQ ID NO.119]中在位置98处的苯丙氨酸
CDRL3[SEQ ID NO.119]中在位置99处的酪氨酸
CDRL3[SEQ ID NO.119]中在位置100处的亮氨酸
CDRL3[SEQ ID NO.119]中在位置101处的精氨酸
重链中的种类3残基：
CDRH1[SEQ ID NO.120]中在位置32处的酪氨酸
CDRH1[SEQ ID NO.121]中在位置33处的缬氨酸
CDRH2[SEQ ID NO.121]中在位置52处的苯丙氨酸
CDRH3[SEQ ID NO.122]中在位置99处的天冬氨酸
实施例18：用治疗性TAU表位进行主动疫苗接种：基于TAU蛋白上的一种DC8E8结合表位制备疫苗的免疫原和疫苗施用
a.肽：由Antagene,Inc.(Sunnyvale,CA)和EZBiolab,USA合成由人tau蛋白2N4R的合成片段组成的纯度高于95％的肽免疫原。各肽序列被设计来涵盖至少一种被认为涉及和/或促进tau蛋白纤维化/聚集的序列(新型靶标“治疗表位”)，且所述表位在上文中且通过实施例1-11中所述的测定被鉴定为DC8E8的结合位点。参见图26A。这四种序列在本文中也称为“治疗表位”(参见下文)。这些表位代表对tau蛋白纤维化/PHF装配重要的tau蛋白-tau蛋白相互作用基元(聚集表位)。因此，靶向这些策略性治疗表位可导致成功治疗AD和相关tau蛋白病变。此外，使用所述特异性抗tau蛋白疗法将证明比广泛指向的依赖随机选择的tau表位的疗法更安全，因为靶向一些tau表位已被认为会激起自体免疫性反应且潜在地使疾病恶化(Furlan等,2003；Gruden等,2004)。
因此，为进一步确定基于tau蛋白的免疫疗法的治疗潜力，若干组tau肽被设计用作免疫原。所有残基是指具有441个氨基酸残基的全长tau蛋白2N4R的那些残基。第一组免疫原由SEQ ID NO:1tau蛋白251-PDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINK-280；SEQ ID NO:2tau蛋白256-VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLS-285；SEQ ID NO:3tau蛋白259-KIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQ-288；SEQ ID NO:4tau蛋白275-VQIINKKLDL SNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304；SEQ IDNO:5tau蛋白201-GSPGTPGSRS RTPSLPTPPTREPKKVAWR-230；SEQ IDNO:6tau蛋白379-RENAKAKTDHGAEI VYKSPWSGDTSPRHL-408；SEQID NO:7tau蛋白181-TPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRS-210；SEQID NO:8tau蛋白300-VPGGGSVQIVYKPVDLSK-317；和SEQ ID NO:108tau蛋白294-KDNIKHVPGGGS-305构成。这些序列中的一些携带先前见于ADtau蛋白病变中的磷酸化表位。因此，tau肽SEQ ID NO:5在位置217处含有磷酸化苏氨酸，tau肽SEQ ID NO:6在位置396和404处含有磷酸化丝氨酸残基，且tau肽SEQ ID NO:7在位置202处含有磷酸化丝氨酸且在位置205处含有苏氨酸。以未磷酸化和磷酸化形式合成Tau肽SEQ ID NO:2。磷酸化形式在位置262处含有磷酸化丝氨酸残基。
在这组内，一个子组的免疫原(tau肽SEQ ID NO:1-4和108)涵盖由SEQID NO:98(tau蛋白267-KHQPGGG-273)或SEQ ID NO:99(tau蛋白298-KHVPGGG-304)代表的治疗表位之一。另一子组的tau肽(SEQ ID NO:5-7)涵盖见于阿尔茨海默病和其它tau蛋白病变中的磷酸化位点。Tau肽SEQ IDNO:8不携带任何提及的表位且用作对照。(图26)
第二组肽由代表跨越人tau蛋白2N4R的残基244-390的重叠序列的SEQID NO:9至97构成。这些肽各自包含不同基于tau蛋白的环境中的一种tau蛋白治疗表位序列。换句话说，在各子组中，1号至4号表位各自由其N末端与C末端两者上的不同tau蛋白残基围绕。(图26)。
b.用作疫苗的缀合：通过半胱氨酸连接使Tau肽SEQ ID NO:2、4、7和108缀合于匙孔血蓝蛋白(KLH)。
为此，以具有额外N末端定位的半胱氨酸残基的半胱氨酸化肽形式合成目的在于在KLH蛋白表面上获得定向肽连接的tau肽SEQ ID NO:2、4、7和108。通过双官能交联剂N-[γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基]丁二酰亚胺酯(GMBS)使肽偶合于KLH载体。为准备缀合反应，通过温和混合10分钟来将20mg KLH(Calbiochem)溶解于缀合缓冲液(具有0.9M NaCl、10mMEDTA的PBS)中以获得浓度10mg/ml。对于制备顺丁烯二酰亚胺活化的KLH，将2mg活性双官能交联剂GMBS溶解于50μl无水二甲基甲酰胺中且在室温下与2ml KLH溶液混合1小时。随后，在于缀合缓冲液中平衡的5ml HiTrap脱盐管柱(GE Healthcare)上移除未反应GMBS。在室温(25℃)下在肽与顺丁烯二酰亚胺活化的KLH的比率1:1(w/w，20mg肽)下进行缀合2小时。相对于100倍过量的PBS来透析所得缀合物，进行4次透析缓冲液变化以移除未缀合肽。在透析之后，在2℃下在21,000xg下离心缀合物15分钟。通过使用LC-MS/MS测量的在透析缓冲液中不存在游离肽来确认缀合完成。将缀合物等分且储存在-20℃下直至使用。
c.疫苗制备：为用铝/明矾佐剂AdjuPhos(Brenntag Biosector,Denmark)制备免疫剂量，将200μg各相应tau肽缀合物(溶解于150μl PBS中)在1:1(体积/体积)比率下与AdjuPhos佐剂一起以最终剂量体积300μl加以乳化。将各混悬液/乳剂在4℃下在旋转下孵育过夜以使肽吸附于磷酸铝粒子上。
为用完全弗氏佐剂制备免疫剂量，将200μg各相应tau肽缀合物(溶解于150μl PBS中)与完全弗氏佐剂一起以最终剂量体积300μl加以1:1(体积/体积)乳化。对于随后增效剂量，类似地制备免疫原，但用不完全弗氏佐剂乳化。
d.疫苗施用：将制备的疫苗剂量注射至携带人截短tau蛋白转基因的tau蛋白转基因大鼠(以上在实施例7中所述的表达的tauΔ(1-150；392-441)/4R的SHR72品系(Zilka等,2006))中。大鼠在年龄2个月时接受最终体积300μl的首次皮下200μg免疫原注射，随后在3周后进行第2次注射，且此后按照每月时程进行注射。对照转基因大鼠接受与PBS1:1混合的佐剂。免疫疗法的功效评估描述于实施例19中。
分离和纯化用作定量分析疫苗处理的大鼠中的不溶性tau蛋白的内部标准的胎大鼠tau蛋白：基本上如Ivanovova等,2008中所述，使用1％高氯酸进行胎大鼠tau蛋白纯化。使自1-7天龄的大鼠幼仔获得的脑组织在冰冷1％高氯酸(每5ml高氯酸(PCA)对应1.5g组织)中均质化且使其在冰上静置20分钟。使用Amicon超离心过滤装置(Millipore)在15,000xg下旋转组织匀浆20分钟，且浓缩澄清上清液并同时使缓冲液改变成洗涤缓冲液(20mMTris(pH7.4)、150mM NaCl、0.1％吐温20)。将含有约10mg总蛋白的过滤的PCA脑提取物在流速0.2ml/min下装载于装填有携带固定化全tau蛋白mAb DC25(参见上文)的琼脂糖的Poly-Prep管柱C10/10(GE Healthcare)上。未结合蛋白质用10-15ml洗涤缓冲液洗除直至洗脱部分的吸光度(在280nm下)变得稳定。结合于mAb DC25的胎tau蛋白用0.1M甘氨酸(pH2.6)洗脱。洗脱的0.5ml部分即刻用50μl1M Tris-HCl(pH9)中和，且通过SDS-PAGE加以测定。使用Amicon超离心过滤装置(Millipore)浓缩含有胎tau蛋白的部分，同时使缓冲液交换成PBS。根据Chen等,(2005)，通过添加4体积的含有10％三氯乙酸的冰冷丙酮使通过亲和色谱纯化的胎tau蛋白沉淀。在-20℃下孵育混合物2小时且在2℃下在15,000xg下离心20分钟。丢弃上清液且将沉淀再混悬于1ml冰冷丙酮中，使其在冰上静置20分钟且再次如上加以离心。在室温下干燥所得团块且将其溶解于与沉淀之前体积相等体积的PBS中。
实施例19：在阿尔茨海默病的转基因大鼠模型中评估TAU肽疫苗的一般性方法
通过以下方法评估主动疫苗：(a)生物化学方法，通过使用以磷酸化特异性单克隆抗体AT270、DC209、DC217和AT8对大鼠脑样本进行的免疫印迹分析评估它们的施用对磷酸化形式的不溶性tau蛋白的水平的影响，以及使用全tau蛋白单克隆抗体DC25对大鼠脑样本进行的免疫印迹分析评估它们的施用对不溶性tau蛋白的总量的影响；(b)神经行为方法，使用神经量表评估；(c)免疫组织化学方法，包括NFT定量；和(d)通过分析诱导的抗体反应。也可在临床前用尤其这些方法的一者或多者评估被动疫苗。
(a).生物化学分析：使用肌氨酰方法(Greenberg和Davies,1990)自用测试肽免疫的转基因(SHR72)大鼠的脑干以及自如实施例8中所述的模拟处理的SHR72大鼠(仅用佐剂注射(对照))制备不溶性tau蛋白部分。通过使用如下所述的各种单克隆抗体进行免疫印迹来分析肌氨酰不溶性tau蛋白样本。对免疫原性肽SEQ ID NO1-8和108的这个分析的结果概述于图26B中。不溶性tau蛋白的水平已显示与SHR72转基因大鼠中的tau蛋白病变的进展相关。Koson等,2008。
免疫印迹分析：将肌氨酰不溶性tau蛋白部分的样本溶解于体积是可溶性部分的1/50的1x十二烷基硫酸钠(SDS)样本装载缓冲液(Laemmli,1970)中(参见Filipcik等2010)且在95℃下加热5分钟。接着将6μl各者装载于5-20％梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶上且在25mA下于Tris-甘氨酸-SDS缓冲系统中电泳40分钟。将蛋白质转移至PVDF膜中(在150mA下于10mMCAPS(pH12)中1小时)。在转移之后，膜在室温下于含5％脱脂奶粉的PBS中阻断1小时，且接着与一级(tau蛋白特异性)单克隆抗体(对于各抗体的更详细描述，参见下文)一起孵育1小时，随后用大体积的PBS洗涤3次。在洗涤之后，用PBS1:4000稀释的HRP缀合的山羊抗小鼠Ig(DAKO,Denmark)用作二级抗体。孵育(在室温下1小时)继之以用含0.2％Igepal的PBS洗涤(3次)。印迹用SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce,U.S.A)显色，且使用LAS3000成像系统(FUJI Photo Film Co.,Japan)检测信号。使用AIDA软件(Advanced Image Data Analyzer,Raytest,Straubenhardt,Germany)对信号强度定量。胎tau蛋白(0.6μg/泳道)用作定量分析的内部标准。
单克隆抗体AT8和AT270自Innogenetics(Belgium)购买且两者均用于免疫印迹分析。AT8也用于免疫组织化学分析。AT8识别位于tau蛋白的脯氨酸富集结构域中的磷酸化丝氨酸202和苏氨酸205，所述结构域促成tau蛋白的微管结合亲和力的主要部分。AT270识别也位于脯氨酸富集结构域中的磷酸化苏氨酸181。两种抗体均结合可溶性和不溶性tau蛋白。用于这个研究中的磷酸化特异性单克隆抗体DC209(识别pT231)、DC217(识别pT217)是通过Axon Neuroscience,GmbH(Vienna,Austria)制备。全tau蛋白抗体DC25(Axon Neuroscience,GmbH)识别所有形式的可溶性和不溶性tau蛋白中的在tau蛋白的C末端处的第四微管结合重复序列中的表位(347-353)。DC25抗体不依赖于tau蛋白的磷酸化水平来识别所述tau蛋白。
(b).神经行为评估：在最终疫苗剂量之后10天，使用神经量表评估大鼠中的神经行为反应，所述神经量表是一套最初设计用于表达人截短tau蛋白的转基因大鼠的行为测试(Korenova等,2009)。神经量表由富含基本观察评估的感觉运动(横杆行走测试)、神经肌肉(抓握牵引测试)和神经学任务(置放、翻正、姿势、耳廓、惊恐和后肢逃逸伸展反射)构成。
一般性观察涉及评估姿势和肢功能；神经学检查包括基本反射反应，其都根据1分量表分级(正常反应0分；延迟或不完全反应1分)。评估后肢逃逸伸展反射是根据3分量表来分级(正常反应0-1分；缺陷2-3分)。
对于横杆行走测试，使用3类横向区段(3x3cm、4x2cm和直径3.5cm的圆形横杆)。最大分数是10(针对潜伏时间的5分+针对后肢在一种类型的横杆上滑动的5分)。自横杆行走测试获得的评分越低，测试动物的感觉运动调协能力越好。有可能实现的分数总和是30。
对于抓握牵引测试，使大鼠用其前爪抓住悬吊于缓冲表面以上76cm的水平钢丝(直径3mm)。测量自丝线掉落的潜伏时间。可判给的最大分数是5，反映神经肌肉功能性严重损伤和肌肉脆弱。掉落的潜伏时间越长，自任务获得的反映测试动物的前肢肌肉力量和灵活性的评分越低。
由在个别测试中获得的评分计算神经量表评分。通过累加观察评估、神经学检查、3个系列的横杆行走测试和抓握牵引测试的贡献，有可能获得最大总评分49分。神经行为损伤越严重，神经量表评分越高。
(c).免疫组织化学分析：对于收集脑样本，在深度麻醉下用PBS穿心灌注大鼠2分钟。在灌注之后，移除大鼠脑和径向切割成两个大小相等的半球。收集右半球的脑干和小脑用于生物化学分析。左半球用4％多聚甲醛在4℃下固定过夜，随后用25％蔗糖处理48小时以提供低温保护。接着将材料于冷2-甲基丁烷(-42℃)中冷冻30s且在低温切片机上切片。在低温恒温器中在-18℃下切割径向切片(40μm)。自由浮动切片用于免疫组织化学研究。
对处理大鼠和对照大鼠的冷冻脑切片进行免疫组织化学染色。Koson等,2008已显示SHR72转基因大鼠的脑中的NFT数目与动物的死亡时间相关(即NFT越多，动物死亡越早)。为分析大鼠脑中的神经原纤维变化，制备径向脑切片。在室温(25℃)下用冷(+4℃)80％甲酸处理自由浮动组织切片30s。在室温下于含有0.3％Triton X-100和1％H2O2的PBS中孵育脑切片20分钟，随后于阻断溶液(含有0.3％Triton X-100、1％马血清的PBS)中孵育30分钟，接着在4℃下与纯化AT8抗体(0.2μg/ml于阻断缓冲液中)或杂交瘤培养物上清液DC217(1:100于阻断缓冲液中)一起孵育过夜。两种抗体在转基因大鼠的脑干中显示类似免疫染色样式。在洗涤之后，使用标准亲和素生物素过氧化酶方法(ABC Elite,Vector Laboratories,Burlingame,CA)将切片免疫染色。使用亲和素-生物素系统和作为色原体的Vector VIP(Vector Laboratories)观察反应产物。接着用Olympus BX51显微镜检查切片。
(d).抗体反应：在开始研究之前(即在首次注射之前)且在末次注射之后2周对转基因大鼠放血。通过使用连续稀释的血浆样本进行ELISA来测定对施用的免疫原/疫苗的抗体反应。在37℃下将肽免疫原、重组tau蛋白tauΔ(1-150；392-441)/4R和重组全长tau蛋白亚型2N4R在于PBS中的浓度10μg/ml下分别涂布于96孔板(IWAKI,Japan)上过夜。在用含1％脱脂奶粉的PBS阻断之后，将板用PBS-0.05％吐温20洗涤且在37℃下与50μl/孔的连续血浆稀释液(1:200-1:128,000于阻断缓冲液中)一起孵育1小时。在孵育和洗涤之后，1:1000稀释过氧化酶缀合的二级抗体(兔抗大鼠Ig，DAKO,Denmark)且在37℃下施加于孔(50μl/孔)中，持续1小时。反应用含邻苯二胺的过氧化酶底物溶液(0.1M磷酸盐缓冲液)显色且用50μl2M H2SO4终止。使用Multiscan MCC/340ELISA读取器(Labsystems)测量492nm下的吸光度。吸光度读数是阴性对照的数值至少两倍被视为阳性。
如上在实施例5中所述，使用SPR进行亲和力测量。简言之，在25℃下于作为操作缓冲液的具有0.005％P20的磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)(PBS-P)中进行实验。同时在两个流动池中通过伯胺在浓度5μg/ml(通过于10mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中40倍稀释200μg/ml0.5xPBS储备物来制备)下偶合3000RU(反应单位)的多克隆抗小鼠抗体(Z0420号；DakoCytomation,Glostrup,Denmark)，其中一个池在测量中用作参照。在各分析循环中，在分析流动池中捕集1000倍稀释的血清以达到接近饱和的固定化水平约850RU。对于KA测定以及对于动力学速率常数的测定，在流速100μl/min下在传感器芯片上注射100nM tau蛋白免疫原性肽或tau蛋白的溶液。PBS-P注射用于双重参照程序中的背景信号减除(Myszka J Mol Rec1999)。通过BIA评估软件4.1(Biacore AB)相对于1:1反应模型对动力学数据进行拟合。整体估计动力学速率常数，局部拟合最大反应，且容积反应设置为零。
实施例20：包含四种治疗表位序列的至少一者的TAU肽疫苗在模拟人阿尔茨海默病的转基因大鼠中有益
a.SEQ ID NO:1tau蛋白251-PDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINK-280。转基因大鼠(SHR72)用与Adju-phos佐剂一起配制的tau肽SEQ ID NO:1免疫。
tau蛋白自可溶性形式转化成肌氨酰不溶性病理性形式被视为tau蛋白病变发展的重要步骤且似乎取决于若干因素，如tau蛋白的浓度、tau蛋白的截短和tau蛋白磷酸化程度(Alonso等2001；Koson等2008；Kovacech和Novak2010)。对自一组用tau肽SEQ ID NO:1免疫的大鼠和自对照组收集的肌氨酰不溶性脑部分中的不溶性tau蛋白的免疫印迹定量分析的结果显示于图26C中。相较于接受单独佐剂的对照大鼠，疫苗接种降低用tau蛋白251-280(SEQ ID NO.1)免疫的大鼠中的不溶性tau蛋白的量(图26C)。对于不溶性tau蛋白的总水平(如用识别残基347-353的DC25全tau蛋白抗体所评估)以及对于图26B和26C中所述且已知存在于肌氨酰不溶性部分中的所有其它测试的AD相关tau表位(AD的替代标记物)均观察到这个降低。实际上，用tau肽SEQ ID NO:1免疫诱导不溶性tau蛋白统计显著(p<0.001)降低，此是使用全tau蛋白单克隆抗体DC25在总不溶性tau蛋白层面(71％)上被观察到(图26B、26C)。用DC217(pThr217)、AT270(pThr181)进行的分析揭示相较于对照大鼠，在免疫的大鼠中的不溶性tau蛋白的Thr217(42％)和pThr181(58％)处的磷酸化水平有降低趋势。观察到在不溶性tau蛋白磷酸表位pThr231下的治疗作用较弱(11％)(图26B)。这些结果表明疫苗使负责抑制tau蛋白聚集的机制和/或涉及降低倾向于tau蛋白-tau蛋白相互作用的tau蛋白的水平的机制激活。
用tau肽免疫原SEQ ID NO:1处理的大鼠相较于对照大鼠显示在横杆行走测试中的逃逸潜伏时间统计显著降低(*p＝0.045)(图27A)。类似地，相较于对照，在接种组中，后肢滑动次数降低；然而，这个差异具有微小统计显著性(p＝0.059，图27B)。由在横杆行走测试、抓握牵引测试和神经学检查(基本反射、后肢逃逸伸展反射)中获得的数值计算神经量表评分(以上在实施例19中所述)。相较于对照组，免疫使用肽SEQ ID NO:1处理的大鼠的神经量表评分提高，但这个提高不具有统计显著性(p＝0.065，图27C)。总神经量表评分确认处理的大鼠相较于未处理大鼠具有神经行为改进。所有统计数据都是使用非参数曼-惠特尼U检验获得。
神经行为参数与脑干中的不溶性tau蛋白水平相关。具有低水平的不溶性tau蛋白的处理的大鼠相较于对照显示逃逸潜伏时间和后肢滑动较低。这些研究结果指示高度不溶性错误折叠tau蛋白降低导致免疫的大鼠中的功能性改进，此可具有治疗价值。用tau肽SEQ ID NO:1的免疫疗法导致处理的大鼠的神经行为参数提高。这个作用在免疫的大鼠的脑中的不溶性tau蛋白水平降低之后。这些研究结果指示降低不溶性tau蛋白水平具有治疗益处。
在免疫组织化学层面上进一步测试用tau肽SEQ ID NO:1的免疫疗法的功效(图28)。使用识别病理性tau蛋白上的磷酸化表位的抗tau蛋白抗体AT8、DC217分析处理的转基因大鼠SHR72和模拟处理的仅接受佐剂/PBS的对照转基因大鼠SHR72的脑干中的神经原纤维缠结(NFT)。使用半定量方法测定NFT的数目。指定3个定量水平：1)无或少数神经原纤维缠结(在脑干中多达3个)；2)中度(主要在脑干的网状构造中有许多NFT)；和3)重度(在脑干的所有区域中都有许多NFT)。“广泛”意味神经原纤维性神经变性的中度至重度阶段。免疫组织化学分析显示疫苗处理组的转基因动物中的神经原纤维缠结载荷降低50％。
生物化学测量的不溶性tau蛋白水平的降低与免疫组织化学分析结果相关。来自用SEQ ID NO:1免疫的数据显示含有DC8E81号表位的这个肽的治疗能力。
b.SEQ ID NO:2tau蛋白256-VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLS-285。转基因大鼠(SHR72)用缀合于载体KLH(如上所述)的tau肽SEQ ID NO:2免疫。
免疫印迹分析揭示相较于接受单独佐剂的对照大鼠，疫苗降低免疫的大鼠中的不溶性tau蛋白的量。图29显示不溶性/聚集tau蛋白中存在的所有监测的表位都降低。对全tau蛋白DC25免疫反应性的定量分析揭示相较于接受单独佐剂的对照大鼠，免疫的大鼠中的不溶性tau蛋白降低41％(统计显著，p<0.001)(图26B)。同样，识别不溶性tau蛋白上的磷酸化AD特异性表位的其它抗体的免疫反应性降低(图26B和图29)。另外，处理对由两个磷酸残基Ser202/Thr205产生且称为AD病变的标记物的另一tau蛋白磷酸表位的水平具有影响。相较于非处理动物，疫苗在免疫的转基因大鼠中诱导这个表位降低80％。类似地，磷酸化tau表位Thr217、Thr231和Thr181的水平分别降低72％(p<0.001)、64％和74％(p<0.01)。这些结果表明疫苗诱导负责抑制tau蛋白聚集的机制和/或降低倾向于病理性tau蛋白-tau蛋白相互作用的tau蛋白种类的机制。
使大鼠经受行为分析，且图30显示在横杆行走测试(图30A)、后肢滑动测试(图30B)和神经量表分析(图30C，*p,0.05)中获得的结果。在一组用tau肽SEQ ID NO:2处理的大鼠中观察到横杆行走逃逸潜伏时间有正性趋势(p＝0.096)。免疫使横向横杆测试中的后肢滑动的次数降低；然而，相较于对照组，差异不具有统计显著性(p＝0.25)。运动损伤测试连同抓握牵引测试和神经学检查一起概述至神经量表评分中。图30显示相较于对照组，用tau肽SEQ ID NO:2处理的大鼠的神经量表评分统计显著提高(*p＝0.036)。一般而言，用tau肽SEQ ID NO:2免疫使总体运动表现提高。相较于对照，神经行为水平的提高与免疫的动物中的不溶性tau蛋白(AD模板tau蛋白)的量降低相关。这些研究结果指示降低不溶性tau蛋白水平可具有治疗益处。
在免疫组织化学层面上进一步测试用tau肽SEQ ID NO:2的免疫疗法的功效(图31)。出于这个目的，使用识别磷酸化可溶性tau蛋白与不溶性tau蛋白两者的两种不同抗tau蛋白抗体(AT8、DC217)。这些大鼠(SHR72)中的神经原纤维病变主要位于脑干和脊髓中且部分位于小脑中(数据未显示)。使用半定量方法测定NFT的数目。指定3个定量水平：1)无或少数神经原纤维缠结(在脑干中多达3个)；2)中度(主要在脑干的网状构造中有许多NFT)；和3)重度(在脑干的所有区域中都有许多NFT)。“广泛”意味神经原纤维性神经变性的中度至重度阶段。用肽SEQ ID NO:2的免疫疗法使在脑干中具有广泛NFT的转基因大鼠的数目降低几乎60％(图31)。
这些结果说明用tau肽SEQ ID NO:2疫苗接种显示若干合乎需要的疫苗结果：1)在生物化学层面上，免疫的转基因大鼠的脑中的不溶性tau蛋白降低；2)在行为层面上，免疫的转基因大鼠中的感觉运动缺陷减轻；和3)在免疫组织化学层面上，神经原纤维病变的数目降低。
具有磷酸化Ser262的SEQ ID NO:2tau蛋白256-VKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLS-285。使在位置262处含有磷酸化丝氨酸的SEQ ID NO:2缀合于KLH。
用DC25抗体获得的大鼠脑肌氨酰不溶性tau蛋白部分的免疫印迹揭示相较于接受单独佐剂的对照转基因大鼠，疫苗使免疫的动物中的不溶性tau蛋白的总量统计显著降低46％(p<0.01)(图32和图26B，基于DC25的测量结果(“347-353”数据))。同样，对DC209(pThr231)、DC217(pThr217)、AT8(pSer202、pThr205)和AT270(pT181)的信号的定量显示相较于对照，免疫组动物中的不溶性磷酸化tau蛋白的水平较低(图26B)。然而，在pThr217(p<0.001；73％)、pThr231(84％)、pSer202/pThr205(82％)和pThr181(p<0.01；82％)处的磷酸化不溶性tau蛋白的水平降低比观察到的总不溶性tau蛋白的降低更显著。AD tau蛋白错误折叠级联中涉及的磷酸表位的水平的这些变化是治疗作用的适用指标。AD相关tau表位的降低显示疫苗使负责抑制tau蛋白聚集的机制和/或降低倾向于与内源性tau蛋白病理性相互作用的tau蛋白的水平的机制激活。
免疫组织化学分布(图33)显示用磷酸肽SEQ ID NO:2的免疫疗法导致在脑干中具有广泛NFT的转基因大鼠的数目降低。观察到当相较于对照非免疫组时，在免疫组中，具有广泛NFT的转基因大鼠的数目降低78％。免疫使免疫的动物中的脑tau蛋白病变的发展停止。在生物化学层面上获得类似作用，其中关于分析的AD相关表位的不溶性tau蛋白降低(图26B和32)。
这些结果说明用tau蛋白磷酸肽SEQ ID NO:2/pSer262疫苗接种激起：
1)在生物化学层面上，免疫的转基因大鼠的脑中的不溶性tau蛋白降低；和
2)在免疫组织化学层面上，对神经原纤维病变的数目的正性治疗作用。
d.SEQ ID NO:3tau蛋白259-KIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQ-288。转基因大鼠(SHR72品系)用与明矾佐剂(AdjuPhos)一起配制的tau肽SEQ ID NO:3免疫。
图34说明相较于接受单独佐剂的对照大鼠，免疫疗法使免疫的大鼠中的不溶性tau蛋白降低。对于所有分析的tau表位(亦即对于347-353/DC25抗体、pT217/DC217抗体、pT231/DC209抗体、pS202/pT205/AT8抗体和pT181/AT270抗体)都检测到不溶性tau蛋白水平降低。总不溶性tau蛋白的水平降低40％，如通过用全tau蛋白抗体DC25进行免疫检测所揭示。类似地，疫苗诱导在pT217处磷酸化的tau蛋白降低30％，如图26B和图34中所示。相较于非免疫大鼠，处理对免疫的大鼠中在Thr231(63％)、Thr181(74％)和Ser202/Thr205(61％)处磷酸化的不溶性tau蛋白形式的水平具有更大影响(图26B和图34)。这些研究结果显示降低不溶性tau蛋白可导致引起病变的tau蛋白的水平的额外改变，且因此可具有治疗意义。AD相关tau表位的降低显示疫苗使负责抑制tau蛋白聚集的机制和/或降低倾向于与内源性tau蛋白病理性相互作用的tau蛋白的水平的机制激活。
图35A-C显示通过神经行为评估获得的结果。在一组用肽SEQ ID NO:3处理的大鼠中，观察到横杆行走逃逸潜伏时间有正性趋势；然而，肽处理的大鼠与非处理/对照大鼠之间的差异不具有统计显著性(图35A；p＝0.21)。类似地，相较于非处理大鼠，处理导致免疫大鼠组中的后肢滑动的次数降低，但这个作用不具有统计显著性(图35B，p＝0.15)。相较于未处理大鼠，总神经量表评分确认用tau肽SEQ ID NO:3处理的大鼠中的神经行为改进(两种情况下p＝0.11)。然而，神经量表评分的差异不具有统计显著性(p＝0.19)。用tau肽SEQ ID NO:3的免疫疗法导致处理的大鼠相较于对照大鼠在横杆行走测试中以及在后肢滑动测试中的感觉运动调协更好；这些结果由神经量表评分确认。
此外，免疫组织化学分布揭示用磷酸肽SEQ ID NO:3的免疫疗法导致疫苗处理的动物的脑干中的NFT降低58％(图36)。这些结果显示用含有DC8E81号表位的SEQ ID NO:3的免疫显著降低病理性聚合tau蛋白装配成NFT。此外，这个正性治疗作用也在由不溶性病理性tau蛋白统计显著降低表示的生物化学层面上加以显示。
e.SEQ ID NO:4tau蛋白275-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304。使Tau肽SEQ ID NO:4缀合于KLH且用于与明矾佐剂(AdjuPhos)一起进行免疫。
图37和图26B显示用SEQ ID NO:4的免疫疗法导致相较于接受单独佐剂的对照大鼠，免疫的大鼠中的不溶性tau蛋白的量降低。数据显示对于所有分析的tau表位都检测到不溶性tau蛋白水平降低。总不溶性tau蛋白水平降低63％，如与全tau蛋白抗体DC25的免疫反应性所揭示。类似地，疫苗诱导在pThr217(92％)、Thr231(95％)、Thr181(87％)和Ser202/Thr205(95％)处磷酸化的tau蛋白降低，如图26B中所示。先前已显示不溶性tau蛋白的水平与tau蛋白病变的进展相关(Zilka等,2006)。当前结果显示针对包含在SEQID NO:99内的治疗性tau表位的免疫疗法可降低不溶性tau蛋白的水平且延迟tau蛋白病变的进展。
通过与综合评分神经量表中的神经学检查组合的一组标准运动测试来测量复合运动损伤。在6.5月龄时，使用tau肽SEQ ID NO:4处理的转基因大鼠SHR72经受目的在于确定这个免疫疗法的作用的行为测试。相较于接受单独佐剂的转基因大鼠(对照)，用tau肽免疫原SEQ ID NO:4处理的大鼠显示在横杆行走测试中的逃逸潜伏时间降低(图38A)。类似地，相较于转基因处理对照，观察到接种组中的后肢滑动的次数具有正性结果(图38B)。由在横杆行走测试、抓握牵引测试和神经学检查(基本反射、后肢逃逸伸展反射)中获得的数据计算总神经量表评分。相较于对照处理组，免疫使用肽SEQID NO:4处理的大鼠的神经量表评分提高(图38C)。总神经量表评分确认当相较于未处理转基因大鼠时，处理的转基因大鼠的神经行为改进。
在免疫组织化学层面上进一步测试用tau肽SEQ ID NO:4的免疫疗法的功效(图39)。使用识别疫苗处理的SHR72大鼠和佐剂处理的SHR72大鼠(对照)的脑干中的病理性tau蛋白上的磷酸化表位的抗tau蛋白抗体AT8和DC217分析神经原纤维缠结(NFT)。来自仅接受佐剂的动物的脑组织在脑干的所有区域中以及主要在脑干的网状构造中仅含有AT8和DC217阳性NFT。免疫组织化学分析显示疫苗处理的转基因大鼠SHR72中的神经原纤维病变降低66％(图39)。
转基因大鼠品系SHR72的脑干中的不溶性tau蛋白水平的变化是治疗作用的灵敏指标。通过用tau肽SEQ ID NO:4处理，脑干中的不溶性总tau蛋白以及磷酸化tau蛋白水平(病理性单体、二聚体、寡聚物和聚合物)均有效降低(63％-95％降低；图26B)。生物化学测量的不溶性tau蛋白水平的降低与自免疫组织化学分析获得的结果相关。这个分析显示疫苗注射的转基因大鼠的脑干中的神经原纤维病变降低超过60％(图38)。来自用SEQ ID NO:4免疫的数据显示含有DC8E82号表位的这个肽的治疗能力。
f.在位置217处携带磷酸化苏氨酸的SEQ ID NO:5tau蛋白201-GSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVR-230。使用明矾佐剂(AdjuPhos)，向SHR72转基因大鼠施用在苏氨酸位置217处磷酸化的tau肽SEQ ID NO:5。
免疫印迹分析显示相较于接受单独佐剂的对照Tg大鼠，用磷酸肽SEQID NO:5免疫不影响总不溶性tau蛋白(用DC25抗体检测)的量(图40和图26B)。然而，用抗体DC209和AT270的分析揭示不溶性tau蛋白部分中的磷酸tau蛋白pThr231和pThr181水平降低约30％(图26B)。另一方面，相较于对照转基因大鼠，处理诱导在苏氨酸217处磷酸化的不溶性tau蛋白(增加11％)和携带磷酸位点Ser202/Thr205的tau蛋白(增加31％)中度增加。这个研究结果将表明用磷酸肽SEQ ID NO:5免疫对评估的AD相关标记物的不明确或中立疫苗作用，所述肽不涵盖以上(实施例1至11)鉴定为治疗表位的1号至4号tau蛋白聚集表位的任一者。
对用磷酸化tau肽SEQ ID NO:5处理的大鼠的神经行为分析显示当相较于对照组时，在横杆行走测试中，处理组中的神经行为功能(图41A，p＝0.19)或后肢滑动的次数(图41B)不存在显著改进。总神经量表评分(图41C)确认处理的大鼠相较于模拟免疫的大鼠无神经行为改进(p＝0.28)。
根据免疫组织化学分析，当相较于对照转基因大鼠时，用tau蛋白磷酸肽SEQ ID NO:5的免疫疗法不降低在脑干中具有广泛NFT的转基因大鼠(SHR72)的数目(图42)。
这些结果显示用缺乏所有治疗表位(SEQ NO:98-101)的tau肽SEQ IDNO:5pT217疫苗接种不导致在免疫组织化学层面上神经行为功能统计显著提高且导致神经原纤维病变的数目仅降低约11％。如由DC25抗体所评估，观察到对就不溶性tau蛋白的降低而言的生物化学层面无影响。
g.在位置396和404处携带磷酸化丝氨酸残基的SEQ ID NO:6tau蛋白379-RENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHL-408。使用明矾佐剂(AdjuPhos)，向SHR72施用在位置396和404处磷酸化的Tau肽。SEQ IDNO:6/pS396/pS404缺乏由SEQ NO:98-101表示的任何治疗表位，但含有在AD脑tau蛋白中过度表达(over-represented)的磷酸表位(Greenberg等1992；Otvos等1994)。
与用肽SEQ ID NO.1-4观察到的肌氨酰不溶性tau蛋白的量降低不同，用磷酸化肽SEQ ID NO.6免疫导致相较于接受单独佐剂的对照大鼠，免疫的大鼠中的不溶性tau蛋白的量增加。免疫印迹分析揭示不溶性磷酸tau蛋白水平有总体增加趋势(图43和图26B)。免疫导致不溶性tau蛋白部分中的总tau蛋白水平增加，如由全tau蛋白mAb DC25所揭示。也在tau表位pT217(增加33％)、Thr231(增加44％)和Thr181(增加7％)下观察到增加。然而，AD相关表位pS202/pT205是例外(图26B)。相较于对照大鼠，携带这个磷酸表位的tau蛋白的水平降低19％。多种疾病相关病理性不溶性tau蛋白的水平增加指示这个疫苗对大鼠的不合需要的负性作用。
评估用tau肽SEQ ID NO:6/pS396/pS404和对照处理的大鼠的神经行为反应(图44A、B和C)。免疫疗法显示在横杆行走逃逸潜伏时间(p＝0.82)方面或在后肢滑动的次数(p＝0.75)方面，在处理的大鼠与对照大鼠之间无统计显著差异。这些结果由神经量表评分(p＝0.96)确认，其中在免疫的大鼠与对照大鼠之间未观察到总体神经行为表现方面的统计显著差异。因此，用肽SEQ ID NO:6/pS396/pS404处理对测试大鼠的横杆行走测试逃逸潜伏时间、后肢滑动的次数或总体运动表现不具有统计显著影响。
图45显示具有广泛tau蛋白病变的转基因大鼠的百分比，如通过用AT8进行免疫组织化学分析所评估。相对于对照组，用tau肽SEQ IDNO:6/pS396/pS404的免疫疗法使缠结载荷增加9％。因此，SEQ IDNO:6/pS396/pS404在免疫组织化学层面上的负性作用在生物化学和神经行为层面上得以确认。
这些结果说明用缺乏SEQ ID NO:98-101中描绘的任何治疗性tau表位的tau蛋白磷酸肽SEQ ID NO:6/pS396/pS404疫苗接种显示：1)对免疫的大鼠的脑中的不溶性tau蛋白无治疗作用；2)在行为层面上无作用；和3)缠结载荷不降低而是增加9％。因此，已报道具有AD特异性(Greenberg等1992；Otvos等1994)的这个磷酸表位不诱导治疗作用。
h.携带在位置202处的磷酸化丝氨酸残基和在位置205处磷酸化苏氨酸残基的SEQ ID NO:7tau蛋白181-TPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRS-210。所得tau肽SEQ IDNO:7/pS202/pT205缺乏SEQ ID NO:98-101中呈现的任何治疗表位。使磷酸肽缀合于KLH且于弗氏佐剂中向转基因大鼠(SHR72品系)施用。
通过免疫印迹对脑干中的tau蛋白免疫反应性的定量分析不显示任何治疗作用。(图46)。相较于对照，免疫大鼠中的总tau蛋白(DC25表位，增加6％)和在疾病相关tau表位pT217(增加3％)、Thr231(增加11％)和Thr181(增加7％)上磷酸化的tau蛋白的水平略微增加(图46和26B)。免疫诱导在Ser202/Thr205处磷酸化的不溶性tau蛋白增加更多(增加41％)。
用磷酸化肽SEQ ID NO:7的免疫疗法不显著影响大鼠的感觉运动功能(图47)。免疫的大鼠相较于对照显示神经行为参数明显提高。然而，各组无统计差异，因为在横杆行走逃逸潜伏时间(p＝0.47，图47A)方面以及在后肢滑动的次数(p＝0.54，图47B)和神经量表评分(p＝0.3，图47C)方面，在处理的大鼠与对照之间未观察到统计显著差异。
肽SEQ ID NO:7携带不含有任何DC8E8表位的磷酸化tau表位。对处理的SHR72大鼠的脑干的检查揭示用tau肽SEQ ID NO:7的免疫疗法不能降低神经原纤维缠结载荷(图48)。来自接种和对照动物的脑组织在脑干的所有区域中，主要在网状构造中含有近乎相同数目的AT8和DC217阳性NFT。含有SEQ ID NO:7，缺乏DC8E8表位的疫苗在处理的动物中不显示任何有益作用。
这些结果说明用tau蛋白磷酸肽SEQ ID NO:7/pS202/pT205疫苗接种产生：1)在生物化学层面上，免疫的大鼠的脑中的不溶性tau蛋白的水平无变化；和2)在行为层面上无作用。这个磷酸肽提供由pS202/pThr205表示的磷酸位点不足以引发消除病理性tau蛋白和/或正性影响大鼠的神经行为状态的免疫反应的额外证据。相反，治疗性tau表位(SEQ ID NO:98-101)实现这个作用。
i.SEQ ID NO:8tau蛋白300-VPGGGSVQIVYKPVDLSK-317。进行用因为其不携带四种tau蛋白“治疗表位”之一可存在于其内部的完整tau蛋白6聚体，也不携带磷酸化表位而用作对照的较短tau肽的免疫疗法以测定其影响脑中的病理性不溶性tau蛋白和神经原纤维沉积物的水平的能力。相较于接受单独佐剂的对照，免疫的大鼠中由全tau蛋白mAb DC25检测的总不溶性tau蛋白的水平显著增加(82％)(图49和图26B)。类似地，免疫疗法诱导在T231处磷酸化的不溶性tau蛋白的水平增加(60％)且在位置T181处磷酸化的不溶性tau蛋白较小增加(10％)。用一组不同抗体DC217(pT217)和AT8(pS202/pT205)的定量分析未揭示对不溶性tau蛋白中的这些表位的任何作用(图26B)。
使动物经受行为分析(图50A、B、C)。相较于对照，用肽SEQ ID NO:8处理的大鼠显示横杆行走测试中的逃逸潜伏时间的差异不具有统计显著性(p＝0.6)。相较于对照，后肢滑动的次数的差异也不具有统计显著性(p＝0.49)。类似地，在神经量表评分方面不存在统计显著差异(p＝0.9)。因此，施用肽SEQ ID NO:8不统计显著影响大鼠的运动表现。
这些结果说明用缺乏所有治疗表位(在SEQ ID NO:98-101内)的tau肽SEQ ID NO:8疫苗接种产生：1)在生物化学层面上，免疫的大鼠的脑中的不溶性tau蛋白无变化；和2)在神经行为层面上无作用。
通过免疫组织化学分析来评估肽疫苗对处理的动物和模拟对照动物(仅接受佐剂)的脑干中的NFT载荷的影响。结果显示用tau肽SEQ ID NO:8的免疫疗法不降低神经原纤维缠结的量(图51)。处理的动物和模拟对照动物在脑干的所有区域中，主要在脑干的网状构造中显现近乎相同数目的神经变性变化，如通过AT8和DC217染色所揭示。
用不涵盖任何完整治疗表位(SEQ ID NO:98-101)的SEQ ID NO:8疫苗接种在处理的动物中不显示任何有益作用。因此，用肽SEQ ID NO:5-8免疫的结果显示实现疫苗减轻tau蛋白病变的所需正性作用和提高至少一种神经行为参数需要存在至少一种完整治疗表位(位于SEQ ID NO:98-101内)。
j.SEQ ID NO:108tau蛋白294-KDNIKHVPGGGS-305。SHR72大鼠用与明矾佐剂一起配制且以每个动物100μg的剂量施用的缀合于载体KLH的tau肽SEQ ID NO:108免疫。
用tau肽SEQ ID NO:108对转基因大鼠SHR72疫苗接种统计显著降低不溶性病理性tau蛋白(p<0.001)。因为SHR72中的阿茲海默病病变是由病理性不溶性tau蛋白形式(由病理性tau蛋白的单体、二聚体、寡聚物和聚合物表示)引起，所以分析用12聚体被动疫苗SEQ ID NO:108处理对不溶性tau蛋白水平的影响。用相应免疫原免疫的转基因动物和用单独佐剂免疫的对照组的脑干用于提取肌氨酰不溶性病理性tau蛋白(如上所述)。来自一组用tau肽SEQ ID NO:108免疫的转基因大鼠和对照组的定量免疫印迹分析的结果显示于图52和26B中。相较于接受单独佐剂的对照转基因大鼠，疫苗接种统计显著降低免疫的动物中的病理性不溶性tau蛋白(图52)。在所有分析的AD相关tau表位下都观察到这个降低。用tau肽SEQ ID NO:108免疫诱导不溶性病理性tau蛋白显著降低(p<0.001；70％)，所述降低是通过用全tau蛋白单克隆抗体DC25测量所揭示(图52)。此外，用磷酸依赖性mAbDC217(pThr217)和AT8(pSer202/pThr205)分析揭示相较于对照，免疫的大鼠的不溶性tau蛋白中在Thr217处(p<0.001；96％)和在Ser202/pThr205处(p<0.05；98％)磷酸化的病理性tau蛋白种类的水平显著降低(图52)。也在携带pThr231(p<0.05；97％)和pThr181(p<0.05；94％)的不溶性病理性tau蛋白的层面上观察到统计显著降低。这些结果显示疫苗诱导的免疫反应导致早期形式的病理性tau蛋白(由单体、二聚体、寡聚物表示)和晚期形式的病理性tau蛋白聚合物(由PHF表示)统计显著降低。
用tau肽SEQ ID NO:108对转基因大鼠SHR72疫苗接种统计显著提高神经行为参数(p<0.05)。通过与综合评分神经量表中的神经学检查组合的一组标准运动测试来测量运动损伤。在6.5月龄时，使用tau肽SEQ ID NO:108处理的转基因大鼠SHR72经受目的在于确定免疫疗法的作用的行为测试。相较于接受单独佐剂的转基因大鼠(对照)，用tau肽免疫原SEQ ID NO:108处理的大鼠显示在横杆行走测试中的逃逸潜伏时间显著降低(*p＝0.04)(图53)。类似地，相较于转基因处理对照，观察到接种组中的后肢滑动的次数有正性趋势，这个差异是显著的(*p＝0.045，图53)。由在横杆行走测试、抓握牵引测试和神经学检查(基本反射、后肢逃逸伸展反射)中获得的数据计算总神经量表评分。相较于对照处理组，免疫显著提高用肽SEQ ID NO:108处理的大鼠的神经量表评分(*p＝0.047)(图53C)。总神经量表评分确认当相较于未处理转基因大鼠时，处理的转基因大鼠的神经行为改进。所有统计数据都是使用非参数曼-惠特尼U检验获得。
神经行为参数与处理的转基因动物的脑干中的不溶性病理性tau蛋白水平相关。用疫苗肽SEQ ID NO:108处理的动物展现低水平的不溶性病理性tau蛋白，这与相较于对照处理动物，逃逸潜伏时间较低和后肢滑动的次数较低相关。这些研究结果显示降低不溶性病理性tau蛋白导致用12聚体肽(SEQ IDNO:108)疫苗免疫的转基因动物组中的神经行为缺陷统计显著改善，从而显示所述肽的治疗价值。
用tau肽SEQ ID NO:108对转基因大鼠SHR72疫苗接种导致神经原纤维缠结(NFT)载荷降低60％。对脑干中的神经原纤维tau蛋白病变(神经原纤维缠结，NFT)的免疫组织化学分析显示在疫苗处理的SHR72大鼠中实现NFT降低(图54)。相较于佐剂处理的动物，在脑干中具有广泛NFT的免疫的转基因大鼠的数目降低超过60％。免疫使用SEQ ID NO:108肽疫苗免疫的转基因动物的脑中的tau蛋白病变(病理性tau蛋白聚合物，PHF)减轻。
结果显示用tau肽SEQ ID NO:108的免疫疗法高效减轻SHR72大鼠中的tau蛋白病变。疫苗接种导致免疫的动物的脑中的不溶性病理性tau蛋白水平统计显著降低以及神经原纤维缠结载荷(PHF)降低。病理性tau蛋白的量降低导致处理的转基因大鼠的神经行为参数统计显著提高。因此，施用tau肽SEQ ID NO:108能够治疗AD。
实施例21：用AD治疗肽的免疫疗法具有免疫原性且诱导在转基因大鼠中产生疾病TAU蛋白特异性抗体
a.在5剂tau肽疫苗之后，对肽在处理的大鼠中的免疫原性进行分析。来自免疫的大鼠的血清用于抗体效价测定。来自用单独佐剂免疫的大鼠的血清用作对照。如实施例19中所述，通过ELISA测定特异性抗tau蛋白抗体的效价。相对于先前涂布于微量滴定孔板上的AD tauΔ(1-150；392-441)/4R和重组全长tau蛋白2N4R来测试各血清的连续稀释液。测定的免疫原诱导产生特异性抗tau蛋白抗体。
举例而言，在用275-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304(SEQ ID NO:4)免疫之后产生抗tau蛋白特异性抗体。由tau肽SEQ ID NO:4诱导的抗体展现对错误无序tauΔ(1-150；392-441)/4R的结合活性比对tau蛋白2N4R的结合活性高约3倍(图55；1:3,200稀释)。这些结果进一步表明这个疫苗诱导具有识别且消除/中和阿尔茨海默病中的病理性tau蛋白的治疗潜力的抗体。
此外，用tau肽SEQ ID NO:108对转基因大鼠SHR72疫苗接种诱导形成对病理性tau蛋白的结合优先于对生理性tau蛋白的结合的抗体。在5剂疫苗之后，对各接种的大鼠中的免疫原性进行分析。在末次增效剂量之后两周对动物放血且收集的血清用于几何平均抗体效价(GMT)测定。如实施例19中所述，通过ELISA测定特异性抗tau蛋白抗体的效价。针对用作固相的病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R和生理性tau蛋白2N4R来测试各血清的连续稀释液(1:100至1:51,200)。效价定义为产生半数最大光密度(吸光度)的血清的稀释度的倒数。为计算几何平均抗体效价，小于100的效价读数被指定为数值10。如图56中所示，针对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R的抗体效价(GMT12800)比针对全长tau蛋白2N4R的抗体效价(GMT4200)高3倍。也使用实施例19中所述的相同方法针对未缀合肽SEQ ID NO:108来测量抗体效价。图56显示针对tau肽SEQ ID NO:108产生最高抗体效价(GMT20800)。在仅用佐剂免疫的转基因大鼠中未观察到抗体反应(GMT10；数据未显示)。用携带DC8E82号表位(在SEQ ID NO:99内)的肽SEQ ID NO:108疫苗接种诱导优先识别病理性tau蛋白，由此区分病理性tauΔ(1-150；392-441/4R)与生理性tau蛋白2N4R的抗体。此外，结果显示SEQ ID NO:108具有免疫原性且因此具有阿尔茨海默病中的消除病理性tau蛋白的治疗潜力。
此外，用tau肽SEQ ID NO:108对转基因大鼠SHR72疫苗接种优先诱导形成对病理性tau蛋白具有特异性的IgG抗体同种型。为确定反应于肽SEQID NO:108产生的抗体的特定同种型，将来自免疫组和对照组大鼠的血清自1:100至1:12,800连续稀释，且通过ELISA(如实施例19中所述)针对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R一式两份测试。为检测大鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgM同种型，将抗大鼠子类特异性HRP缀合的二级抗体于PBS中1:5,000稀释(Pierce，抗IgG1-PA1-84708、抗IgG2a-PA1-84709、抗IgG2b-PA1-84710、抗IgG2c-PA1-84711和抗IgM-PA1-84712)。图57显示代表性1:800稀释度的结果。数据说明缀合于KLH的肽SEQ ID NO:108诱导广谱抗tau蛋白抗体同种型。疫苗产生高水平的被视为高亲和力抗体的抗体同种型(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG2c)。相反，同种型分布显示IgM抗体的水平极低。这些被视为对抗原具有低亲和力。存在高效价的对病理性tau蛋白具有优先亲和力的IgG抗体指示由疫苗诱导的免疫反应是针对病理性tau蛋白种类。自模拟免疫的大鼠(其接受单独佐剂)获得的对照血清是阴性的。
这些数据进一步用于确定免疫反应的极化(Th1/Th2表型)。由间接免疫诱导的IgG1和IgG2a同种型的水平表明Th1细胞因子相对于Th2细胞因子对免疫反应的贡献。一般而言，IgG1抗体的产生是由Th2细胞因子诱导且IgG2a抗体的产生是由Th1细胞因子诱导。因此，通过用IgG2a的OD数值除IgG1的OD数值来计算IgG1同种型与IgG2a同种型的比率。这些数据表明(比率＝0.625)免疫反应向Th1表型略微移动。
b.使用表面等离子体共振实时监测结合事件使得能够测量抗体的缔合(k缔合)和解离(k解离)的动力学速率，所述抗体来自用tau肽275-VQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGG-304(SEQ ID NO:4)免疫的大鼠的汇合血清。分析显示在识别tauΔ(1-150；392-441)/4R与生理性tau蛋白亚型2N4R之间的区分(图58)。由免疫诱导的抗体展现对tauΔ(1-150；392-441)/4R的优先亲和力，其中相较于它们对相应全长亚型2N4R的亲和力，对于截短AD tau蛋白而言，结合这个tau蛋白的亲和力高3倍。这个结合差异被确定部分地归因于对tauΔ(1-150；392-441)/4R的k缔合速率大近似5倍(数据未显示)。
c.为进一步确定在用治疗性tau肽免疫的大鼠中诱导的抗体的特异性，抗血清可用于对来自人AD脑的海马的冷冻切片进行免疫组织化学染色。举例而言，通过这个测定来评估在用SEQ ID NO:4免疫之后诱导的抗体。来自人AD脑的海马在4℃下用4％多聚甲醛固定2天，随后用25％蔗糖处理72小时以提供低温保护。接着将材料冷冻在冷2-甲基丁烷(-42℃)中30秒且在低温切片机上切片。在低温恒温器中在-18℃下切割冠状切片(40μm)。自由浮动切片用于免疫组织化学研究。在室温(25℃)下用冷(+4℃)99％甲酸处理自由浮动组织切片1分钟。在室温下于含有0.3％Triton X-100和1％H2O2的0.01M PBS(pH7.4)中孵育脑切片20分钟，随后于阻断溶液(0.01M PBS，含有0.3％Triton X-100、1％马血清)中孵育30分钟，接着与来自用含有肽SEQ ID NO:4的疫苗(1:1000稀释)免疫的转基因大鼠的血清一起在4℃下孵育过夜。在洗涤之后，使用标准亲和素生物素过氧化酶方法(ABC Elite,VectorLaboratories,Burlingame,CA)将切片免疫染色。使用亲和素-生物素和作为色原体的Vector VIP(Vector Laboratories)观察反应产物。接着用Olympus BX51显微镜检查切片。免疫组织化学染色显示由用肽SEQ ID NO:4免疫诱导的抗体特异性识别阿尔茨海默病脑的海马中的病理性tau蛋白结构，即神经原纤维病变(图59A、B)。来自接受单独佐剂的对照大鼠的血清用作阴性对照，且其不识别任何神经元病变(数据未显示)。
用tau肽SEQ ID NO:108对转基因大鼠SHR72疫苗接种诱导识别来自人阿尔茨海默病脑组织的切片中的病理性tau蛋白的抗体。为进一步确定在用治疗性tau肽SEQ ID NO:108免疫的大鼠中诱导的抗体的特异性，它们的血清用于在使用人AD脑(布拉克第VI阶段)的冷冻切片下对内嗅皮质进行免疫组织化学染色。使自由浮动组织切片与来自免疫的转基因大鼠的血清(1:1000稀释)一起在4℃下孵育。分别使用来自用SEQ ID NO:108接种的动物的个别血清，而使来自仅用佐剂接种的动物的血清汇合。在使用标准亲和素-生物素过氧化酶方法(ABC Elite,Vector Laboratories,Burlingame,CA)进行免疫染色之后，用Olympus BX51显微镜检查切片。免疫组织化学染色显示由用肽SEQ ID NO:108免疫诱导的抗体特异性识别阿尔茨海默病脑的内嗅皮质中的病理性tau蛋白结构，即神经原纤维病变。图60(A-E)显示用自5只接种的转基因大鼠SHR72收集的大鼠血清的代表性免疫染色。用SEQ IDNO:108接种的动物的血清极强烈染色神经原纤维病变，从而确认抗体高效靶向病理性tau蛋白。来自接受单独佐剂的对照大鼠的血清用作阴性对照。它们不识别任何神经原纤维病变(图60F)。
由SEQ ID NO:108疫苗诱导的抗体识别自SHR72的脑和自人AD脑提取的病理性tau蛋白。使用免疫印迹方法(如实施例19中所述)，进一步检查来自用tau肽SEQ ID NO:108免疫的大鼠的血清对病理性形式的可溶性和不溶性病理性tau蛋白的特异性。处于病变晚期的SHR72大鼠的脑干用于提取可溶性不溶性病理性tau蛋白。人AD脑(布拉克第VI阶段；自荷兰脑库(Netherlands)获得)的颞叶皮质用于提取人病理性AD tau蛋白。使用与实施例8中所述相同的方法制备可溶性和不溶性病理性tau蛋白。对于可溶性tau蛋白部分，每个泳道装载15μg总蛋白。对于不溶性tau蛋白部分，将团块溶解于体积是用于制备不溶性tau蛋白部分的可溶性部分的1/50的1x十二烷基硫酸钠(SDS)样本装载缓冲液(Laemmli,1970)中且将相等体积装载于SDS-PAGE上。将来自免疫的动物的汇合血清于PBS中1:1000稀释且用作一级抗体。与一级抗体一起孵育继之以与缀合于辣根过氧化物酶的多克隆兔抗大鼠免疫球蛋白(1:3000；Dako,Glostrup,Denmark)一起孵育。用LAS3000CCD成像系统(Fujifilm,Japan)使蛋白质印迹信号数字化。这个免疫印迹分析的结果显示于图61中。
结果(图61)显示针对携带DC8E8表位2(SEQ ID NO:99)的肽产生的抗体识别自SHR72和自AD脑组织提取的病理性tau蛋白。诱导的抗体识别单体形式的病理性tau蛋白(1号、2号和3号泳道)以及寡聚形式的病理性tau蛋白(2号和3号泳道)，包括AD特征性A68tau蛋白三重物。这些研究结果对使用阿尔茨海默病的这个大鼠模型的免疫疗法具有关键影响。通过疫苗产生的高亲和力抗体靶向所有形式的病理性tau蛋白。它们靶向单体形式的病理性tau蛋白且因此阻止病理性tau蛋白-tau蛋白相互作用(寡聚)，从而导致接种的大鼠中的不溶性tau蛋白水平降低且因此导致神经行为参数提高。产生的抗体也结合寡聚形式的病理性tau蛋白且靶向它们以达成例如由小神经胶质细胞进行降解，如实施例10中对于mAb DC8E8所述。
实施例22：用AD治疗肽的免疫疗法诱导在小鼠中产生疾病TAU蛋白特异性抗体
携带SEQ ID NO:100或101内的一种治疗表位的肽SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110(SEQ ID NO:88对应于SEQ ID NO:110加用于缀合的另一N末端Cys)、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112诱导在免疫的小鼠中产生抗体。所得抗体显示对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R的结合活性统计显著高于对生理性tau蛋白2N4R的结合活性。
SEQ ID NO:109Tau蛋白314-DLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSE-342
SEQ ID NO:110Tau蛋白352-SKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFREN-381
SEQ ID NO:111Tau蛋白325-LGNIHHKPGGGQ-336
SEQ ID NO:112Tau蛋白357-LDNITHVPGGGN-368
SEQ ID NO:100Tau蛋白329-HHKPGGG-335
SEQ ID NO:101Tau蛋白361-THVPGGG-367
实际上，以进一步确定携带一种或多种治疗性DC8E8表位(例如在7聚体：SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101内)的肽的免疫原性潜力为目的，设计携带一种DC8E8治疗表位的长度是12和30个氨基酸的肽(SEQ IDNO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112)。Tau肽SEQID NO:109(30个氨基酸)和SEQ ID NO:111(12个氨基酸)在它们内含有SEQID NO:100中的治疗表位。Tau肽SEQ ID NO:110(30个氨基酸)和SEQ IDNO:112(12个氨基酸)在它们内含有SEQ ID NO:101中的治疗表位。如实施例18-19中所述，使肽通过它们的N末端Cys残基缀合于KLH。用于100μlPBS中含有100μg缀合的肽且以最终剂量体积200μl与弗氏佐剂一起1:1(体积/体积)乳化的肽-KLH缀合物制备用于免疫的疫苗。每个处理组使用5只Balb/c小鼠。使用与弗氏完全佐剂一起配制的含肽缀合物的PBS进行首次免疫。使用与弗氏不完全佐剂一起配制的含肽缀合物的PBS在2周间隔下进行随后2次免疫。作为对照，使用仅含有佐剂的疫苗。在末次免疫之后10天收集血清且如实施例19中所述，通过ELISA来测量抗体反应。将来自个别小鼠的血清自1:100至1:12,800连续稀释且一式两份加以测试。为确定血清的特异性，病理性tauΔ(1-150；392-441/4R)和生理性tau蛋白2N4R用作固相。图62至65显示在1:800稀释度下的血清的结果概述。使用曼-惠特尼非参数检验来统计评估ELISA结果。
所有测试的肽都在免疫的小鼠中产生tau蛋白特异性抗体。由用tau肽SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112疫苗接种诱导的抗体展现对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R的结合活性统计显著高于对生理性tau蛋白2N4R的结合活性(图62-65)。此外，使肽自30个氨基酸(SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110)缩短至12个氨基酸(SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112)导致显著较高产生优先识别病理性tau蛋白的特异性抗体(SEQ ID NO:109，p＝0.0115；SEQ ID NO:110，p＝0.0029；SEQ ID NO:111，p＝0.0007；SEQ ID NO:112，p<0.001)。总之，这些结果显示肽SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:111(携带SEQ ID NO:100内的治疗表位)和肽SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:112(携带SEQ ID NO:101内的治疗表位)具有免疫原性且具有靶向罹患阿尔茨海默病的患者的脑中存在的病理性tau蛋白的治疗活性。
实施例23：鉴定能够与病理性TAU蛋白竞争结合至少一种DC8E8表位的设计肽(设计治疗表位)。
基于1号表位(在KHQPGGG内，SEQ ID NO:98)、2号表位(在KHVPGGG内，SEQ ID NO:99)、3号表位(在HHKPGGG内，SEQ ID NO:100)和4号表位(在THVPGGG内，SEQ ID NO:101)之间的保守氨基酸残基设计两种其它肽(11聚体)。在它们的设计中，促进DC8E8结合这些表位的5个残基保持固定：即序列HxPGGG(SEQ ID NO:164)中的组氨酸、脯氨酸和3个甘氨酸残基。通过EZBiolabs(USA)合成纯度高于85％的肽。两种设计治疗表位是GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)和SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)。
通过竞争ELISA分析这些肽与病理性tau蛋白竞争的能力。将ELISA板(IWAKI高结合板，#3801-096，Bertoni GmbH,Austria)在4℃下用100μl/孔的含5μg/ml重组纯化tauΔ(1-150；392-441)4R的PBS涂布过夜。涂布的ELISA板用PBS/吐温20(补充有0.05％v/v吐温20的磷酸盐缓冲盐水)洗涤4次，且在25℃下用PBS/吐温20阻断2小时。将各肽在最终浓度5mM下分别溶解于PBS中。于聚丙烯板(Greiner，#651201)中制备肽于PBS/吐温20中的连续2倍稀释液(浓度范围80μΜ、40μΜ、20μΜ、10μΜ、5μΜ和2.5μΜ)。使100μl各肽稀释液与100μl2μg/ml纯化DC8E8单克隆抗体(如实施例5中所述进行纯化)混合。于是所得200μl混合物含有1μg/ml DC8E8抗体和40μΜ、20μΜ、10μΜ、5μΜ、2.5μΜ和1.25μΜ肽。包括tauΔ(1-150；392-441)4R作为阳性对照。在25℃下于设置成250rpm的旋转平台上孵育抗体/肽混合物1小时。接着将100微升抗体/肽混合物转移至制备的ELISA板中且在25℃下于设置成250rpm的旋转平台上孵育1小时。ELISA板用PBS/吐温20洗涤4次。接着使ELISA板与100μl于PBS/吐温20中1:4000稀释的多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白/HRP(Dako，#P0447)一起孵育且在25℃下于设置成250rpm的旋转平台上孵育1小时。ELISA板用PBS/吐温20洗涤4次。接着在25℃下在黑暗中使ELISA板与100μl含1.5mg/2ml o-PDA(邻苯二胺，SIGMA，P1526)的补充有1.5μl/2ml30％H2O2(SIGMA，H-0904)的0.1M乙酸钠(pH＝6.0)(Roth，#6779)一起孵育10分钟。通过添加100μl2M H2SO4(Merck，1.00731.1000)来终止反应。通过在490nm下读取(例如使用Victor Multilabel Counter(Wallac))来测量产生的信号。
两种设计肽，即GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)和SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)均能够与tauΔ(1-150；392-44)4R竞争结合DC8E8(图66)。相较于tauΔ(1-150；392-441)4R，称为设计治疗表位1的肽GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)显示对DC8E8的最类似亲和力。称为设计治疗表位2的肽SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)对DC8E8的亲和力比疾病tau蛋白(tauΔ(1-150；392-441)4R对这个抗体的亲和力高大于1个数量级。
实施例24：体内测试设计治疗表位1和2的免疫原性和免疫反应特异性。
使设计治疗表位1(GWSIHSPGGGSC，SEQ ID NO:250)和设计治疗表位2(SVFQHLPGGGSC，SEQ ID NO:251)通过它们的C末端Cys残基缀合于KLH(如实施例18中所述)且用于使Balb/c小鼠免疫。3个小鼠用于各设计治疗表位。如下进行免疫。用于100μl PBS中含有100μg缀合的肽且以最终剂量体积200μl与弗氏佐剂一起1:1(体积/体积)乳化的设计治疗表位-KLH缀合物制备用于免疫的疫苗。使用与弗氏完全佐剂一起配制的含设计治疗表位-KLH缀合物的PBS进行首次免疫。使用与弗氏不完全佐剂一起配制的含设计治疗表位-KLH缀合物的PBS在4周间隔下进行随后4次免疫。对于对照免疫，使用PBS替代设计治疗表位缀合物。在末次免疫之后14天制备血清。
1.抗体区分病理性tau蛋白。为确定血清的特异性，使用两种tau蛋白：重组病理性tauΔ(1-150；392-441)4R和生理性Tau蛋白2N4R。将来自各小鼠的血清自1:100至1:12,800连续稀释且一式三份加以测试。使用1:4,000稀释的多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白/HRP(Dako，#P0447)测定抗体效价。图67显示1:3200稀释度的代表性结果。
两种设计治疗表位均在免疫的小鼠中产生高免疫反应。此外，两种测试的设计治疗表位均诱导相较于生理性Tau蛋白2N4R以较高亲和力识别病理性tauΔ(1-150；392-441)4R的抗体(图67)。对于来自所有免疫的动物的血清而言，这个区分都具有统计显著性。总之以及联合以用DC8E8观察的活性获得的结果，这些结果显示两种设计治疗表位1和2均具有免疫原性且诱导具有靶向阿尔茨海默病患者的脑中的病理性tau蛋白的治疗潜力的抗体反应。
2.抗体同种型：为确定反应于这些设计治疗表位1和2产生的抗体的特定同种型，汇合来自同一组小鼠的血清，自1:100至1:12,800连续稀释，且通过抗体同种型ELISA一式三份加以测试。为检测小鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3同种型，使用抗小鼠子类特异性HRP缀合的二级抗体(抗体自Lifespan Biosciences购买，抗IgG1-#LS-C59107、抗IgG2a-#LS-C59112、抗IgG2b-#LS-C59117、抗IgG3-#LS-C59125和抗IgM-#LS-C55875)。自对照小鼠获得的抗血清是阴性的。图68显示1:800稀释度的代表性结果。用汇合血清获得的数据说明用两种测试的设计治疗表位免疫均诱导广谱抗tau蛋白抗体同种型且同种型分布在所有测试中都极类似。相较于IgG2a、IgG2b和IgG3反应，两种设计治疗表位均主要产生IgG1抗体。(图68)。
3.设计治疗表位诱导统计高度显著区分病理性tau蛋白与生理性tau蛋白的抗体反应。如实施例5和19中所述，通过表面等离子体共振，在使用CM5传感器芯片的BIACORE3000(Biacore AB,Uppsala)上对针对设计治疗表位产生的抗体的亲和力进行分析。在各分析循环中，在分析流动池中捕集针对GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)设计治疗表位1(稀释100倍)或SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)设计治疗表位2(稀释100倍)的小鼠抗血清(来自3只小鼠的汇合抗血清)以达到接近饱和的固定化水平约950RU。作为参照，在参照流动池中捕集不结合tau蛋白的无关抗体Rab50(Macikova等,1992)。对于KA测定以及对于动力学速率常数k缔合和k解离的测定，在流速100μl/min下在传感器芯片上注射100nM病理性tauΔ(1-150；392-441)4R或生理性Tau蛋白2N4R的溶液。
由用设计治疗表位1和2疫苗接种诱导的抗体区分病理性tauΔ(1-150；392-441)4R与生理性Tau蛋白2N4R(图69A和69B)。相较于生理性tau蛋白，抗血清中存在的针对设计治疗表位1(GWSIHSPGGGSC，SEQID NO:250)的抗体的通过表面等离子体共振测量的亲和力展现对病理性tau蛋白的亲和力高近乎50倍，此具有高度统计显著性(p<0.001)。相较于生理性tau蛋白，抗血清中存在的针对设计治疗表位2(SVFQHLPGGGSC，SEQ IDNO:251)的抗体的通过表面等离子体共振测量的亲和力展现对病理性tau蛋白的亲和力高近乎15倍，此具有高度统计显著性(p<0.01)。
4.设计治疗表位诱导识别人AD脑中的病理性tau蛋白种类的抗体反应。为确定在用设计治疗表位免疫的小鼠中产生的抗体的特异性，对人AD脑的冷冻切片进行免疫组织化学染色。
人AD脑组织样本(内嗅皮质，AD布拉克VI，由荷兰脑库提供)用含4％多聚甲醛的PBS在4℃下固定2天且接着低温保护(25％蔗糖)，冷冻在冷2-甲基丁烷(-42℃)中且在低温切片机上切片。自由浮动组织切片(40μm)在室温(25℃)下用冷(4℃)99％甲酸处理1分钟。使用标准亲和素-生物素过氧化酶方法(ABC Elite,Vector Laboratories,Burlingame,CA)将切片免疫染色。将各自自3只免疫的小鼠汇合的针对设计治疗表位1(SEQ ID:250)和设计治疗表位2(SEQ ID NO:251)的小鼠抗血清于阻断溶液(含5％牛血清白蛋白、0.3％Triton X-100的PBS)中1:2000稀释。接着用Olympus BX51显微镜检查切片。
免疫组织化学染色显示针对两种设计治疗表位GWSIHSPGGGSC(SEQID NO:250)和SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)产生的小鼠免疫血清特异性识别阿尔茨海默病脑的内嗅皮质中的病理性tau蛋白结构，即神经原纤维缠结和神经原纤维网线(图70A-D)。针对设计治疗表位1和设计治疗表位2的抗血清不识别对照人脑中的正常tau蛋白。(图70E、F)。
5.设计治疗表位2(SVFQHLPGGGSC，SEQ ID NO:251)诱导识别阿尔茨海默病的转基因大鼠模型的脑中的病理性tau蛋白种类的抗体反应。为确定在用设计治疗表位免疫的小鼠中产生的抗体的特异性，对转基因大鼠SHR72的脑的石蜡包埋切片进行免疫组织化学染色。
SHR72品系的转基因大鼠(7月龄)在深度麻醉下用PBS穿心灌注1分钟，随后用100ml4％多聚甲醛(pH7.4)灌注。在灌注之后，截断头部且快速移除脑。使用一次性解剖刀片将脑径向切割成两个大小相等的半球。将脑组织后固定于4％多聚甲醛中，包埋于石蜡中，且在切片机上切割成切片。对8μm石蜡包埋的组织切片进行免疫组织化学和组织病理学分析。在室温(25℃)下，组织切片用抗原修复溶液(Vector laboratories,CA,USA)预处理20分钟且用90％冷(+4℃)甲酸(Applichem,Germany)处理1分钟。在阻断之后，使切片与于阻断溶液(含5％牛血清白蛋白、0.3％Triton X100的50nM Tris-HCl)中1:1000稀释的针对设计治疗表位2(SVFQHLPGGGSC，SEQ ID NO:251)产生的血清一起孵育过夜。在洗涤之后，在室温下使切片与生物素化二级抗体(Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector Laboratories)一起孵育1小时，且接着在室温(25℃)下与亲和素-生物素过氧化酶复合物溶液反应60分钟(Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector Laboratories)。用过氧化酶底物试剂盒(Vector VIP,Vector laboratories,Ca,USA)观察免疫反应。用Olympus BX71显微镜检查切片。
在转基因大鼠脑(SHR72)中，针对设计治疗表位2(SVFQHLPGGGSC，SEQ ID NO:251)产生的血清识别神经原纤维缠结(图70G)。在年龄匹配的对照大鼠脑中，抗体不染色神经元细胞(图70H)。
针对设计治疗表位2(SVFQHLPGGGSC，SEQ ID NO:251)产生的血清识别寡聚缠结前阶段tau蛋白(图70I)以及细胞内神经原纤维缠结(图70J)。
6.由设计治疗表位1和2诱导的抗体识别人AD脑中的可溶性和不溶性病理性tau蛋白：自患有人阿尔茨海默病的颞叶皮质(自荷兰脑库获得)分离肌氨酰可溶性和不溶性病理性tau蛋白且如实施例8中所述，通过免疫印迹加以分析。
使含有可溶性和不溶性病理性tau蛋白部分的膜与用含5％脱脂奶粉的PBST1:1稀释的DC8E8杂交瘤上清液一起或与针对设计治疗表位1(SEQ IDNO:250，GWSIHSPGGGSC)产生的汇合小鼠抗血清一起或与针对设计治疗表位2(SVFQHLPGGGSC，SEQ ID NO:251)产生的汇合小鼠抗血清一起孵育，借此两种汇合抗血清均于含5％脱脂奶粉的PBST中1:100稀释。洗涤膜且接着与1:4000稀释的过氧化酶缀合的山羊抗小鼠IgG(DAKO,Denmark)一起孵育。印迹用SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce,U.S.A)显色，所述底物是使用LAS3000成像系统(FUJI Photo Film Co.,Japan)来检测。使用AIDA软件(Advanced Image Data Analyzer,Raytest,Straubenhardt,Germany)对信号强度定量。
这个免疫印迹分析的结果显示于图71中。这些结果显示针对两种设计治疗表位1(即GWSIHSPGGGSC)(SEQ ID NO:250)和2(即SVFQHLPGGGSC)(SEQ ID NO:251)产生的抗体与DC8E8识别相同病理性tau蛋白。全部GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)抗血清、SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)抗血清和DC8E8抗体都特异性识别自AD脑组织分离的肌氨酰可溶性和不溶性tau蛋白部分中存在的病理性tau蛋白(图71)。
7.由设计治疗表位1和2诱导的抗体识别tau蛋白转基因大鼠的脑中的可溶性和不溶性病理性tau蛋白。如实施例8中所述自tau蛋白转基因大鼠(实施例7中所述的SHR72品系)的脑分离肌氨酰可溶性和不溶性病理性tau蛋白。
免疫印迹分析(描述于实施例8中)的结果显示于图72中。这些结果显示由设计治疗表位1(即GWSIHSPGGGSC)(SEQ ID NO:250)和2(即SVFQHLPGGGSC)(SEQ ID NO:251)诱导的抗体与DC8E8识别相同病理性tau蛋白(图72)。靶向单体和寡聚病理性tau蛋白会防止产生病理性tau蛋白聚集体，从而导致tau蛋白病变减轻，因而产生对人AD的治疗作用和治疗。
实施例25：设计治疗表位在模拟AD的转基因大鼠中的体内功效
用设计治疗表位的免疫疗法显示处理的大鼠的神经行为参数的提高。选择设计治疗表位2(SEQ ID NO:251)来在转基因大鼠SHR72中进行免疫疗法。大鼠用含有与Adju-phos佐剂组合的缀合于KLH的设计治疗表位2(SEQID NO:251)的疫苗剂量皮下免疫。如实施例18中所述制备疫苗。1剂含有100μg缀合的设计治疗表位2。通过与综合评分神经量表中的神经学检查组合的一组标准运动测试来测量复合运动损伤。在6.5月龄时，使用含有设计治疗表位2(SEQ ID NO:251)的疫苗处理的转基因大鼠SHR72经受目的在于确定免疫疗法的作用的行为测试。
用设计治疗表位2(SEQ ID NO:251)处理的大鼠显示横杆行走测试中的逃逸潜伏时间比接受单独佐剂的转基因对照大鼠降低27％(图73A)。相较于转基因对照，接种组中的后肢滑动的次数统计显著降低(p<0.05)44％(图73B)。由在横杆行走测试、抓握牵引测试和神经学检查(基本反射、后肢逃逸伸展反射)中获得的数值计算神经量表评分。相较于对照组，免疫使用肽SEQ IDNO:251处理的大鼠的神经量表评分显著提高26％(图73C)。总神经量表评分确认当相较于未处理转基因大鼠时，处理的转基因大鼠的神经行为改进。所有统计数据都是使用非参数曼-惠特尼U检验获得。
用设计治疗表位2的免疫疗法显示处理的阿茲海默转基因大鼠的脑中的病理性tau蛋白统计显著降低(p<0.05)。为确认用设计治疗表位2(SEQ IDNO:251)免疫对不溶性病理性tau蛋白的水平的影响，我们使用对大鼠脑样本的免疫印迹分析。用设计治疗表位2(SEQ ID NO:251)免疫的转基因动物和用单独佐剂免疫的转基因动物的对照组的脑组织(脑干)用于如实施例8中所述制备肌氨酰不溶性tau蛋白部分。如实施例19中所述进行免疫印迹分析。通过T检验进行统计分析。磷酸化依赖性单克隆抗体AT8、DC209、DC217和全tau蛋白单克隆抗体DC25用于研究中。
对来自一组用设计治疗表位2(SEQ ID NO:251)免疫的转基因大鼠和对照组的不溶性tau蛋白水平的免疫印迹定量分析的结果显示于图74中。相较于接受单独佐剂的对照转基因大鼠，免疫疗法统计显著降低免疫的动物中的不溶性tau蛋白的量。在所有分析的tau表位下都观察到不溶性tau蛋白降低。在347-353表位和磷酸tau表位下的降低具有统计显著性(P<0.05)。观察的降低如下：在347-353tau表位下降低46％(P<0.05)，在pT217tau表位下降低57％(P<0.05)，在p231-tau表位下降低55％(P<0.05)，在pS202/pT205tau表位下降低47％(P<0.05)。
这些结果显示疫苗诱导导致病理性tau蛋白降低的病理性tau蛋白特异性抗体。处理的阿尔茨海默病大鼠模型的脑中的病理性tau蛋白水平的降低与神经行为参数相关。用低水平的不溶性tau蛋白处理的动物相较于对照动物显示逃逸潜伏时间较短且后肢滑动的次数统计显著降低(p<0.05)。这些研究结果显示用设计治疗表位免疫导致处理的动物中的不溶性病理性tau蛋白降低和神经行为改进，此强调疫苗用于治疗人阿尔茨海默病和相关tau蛋白病变的治疗潜力。
实施例26：进一步表征DC8E8最小表位(针对治疗性核心单元)
为进一步表征DC8E8的最小表位，设计源于人tau蛋白2N4R的微管结合重复区域(MTBR1、MTBR2、MTBR3、MTBR4)的一组具有不同长度的tau肽(42聚体、19聚体、12聚体、7聚体、6聚体和5聚体)(图75A、B)。通过EZBiolabs(USA)合成纯度高于95％的肽。通过竞争ELISA分析所有肽的与病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R竞争结合DC8E8的能力。将ELISA板(Sarstedt，#821581001)在37℃下用50μl/孔的含5μg/ml重组纯化tauΔ(1-150；392-441)/4R)的PBS涂布过夜。涂布的板用PBS/吐温20(0.05％v/v)洗涤5次，且在25℃下用PBS/吐温20(0.05％v/v)阻断1小时。将各肽在最终浓度1mM下分别溶解于PBS中。于具有锥形孔底部的聚丙烯微量滴定板(Greiner，#651201)中在浓度范围200μΜ；80μΜ；32μΜ；12.8μΜ；5.12μΜ；2.048μΜ；0.8192μΜ；0.32768μΜ内制备肽于PBS/吐温20中的连续稀释液(2.5x)。将验证单克隆抗体DC8E8于PBS中稀释至浓度0.6μg/ml且添加60μl这个稀释抗体至各孔中以连续稀释肽，从而使每孔具有120μl混合物。在25℃下在设置成230rpm的旋转平台上孵育抗体/肽混合物1小时。将50μl/孔的抗体/肽混合物自聚丙烯板转移至tauΔ(1-150；392-441)/4R涂布且PBS/吐温20阻断的ELISA板中(一式两份)且在25℃下孵育1小时。将板用PBS/吐温20洗涤5次且在25℃下与50μl/孔的于PBS/吐温20中1:1000稀释的多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白/HRP(Dako，#P0447)一起孵育1小时。在洗涤之后，接着在25℃下在黑暗中使板与50μl/孔的含1mg/2ml o-PDA(邻苯二胺，Sigma，P1526)的补充有1.5μl/2ml30％H2O2(Sigma，H-0904)的0.1M乙酸钠(pH＝6.0)(Roth，#6779)一起孵育20分钟。通过添加50μl/孔的2MH2SO4(Merck，1.00731.1000)来终止反应，随后在492nm下读取(例如Powerwave HT，Bio-Tek)板。
图76显示用以下肽进行的竞争ELISA的结果：TENLKHQPGGGK(SEQID NO:270)、KHQPGGG(SEQ ID NO:271)、HQPGGG(SEQ ID NO:272)、HQPGG(SEQ ID NO:273)、QPGGG(SEQ ID NO:274)、ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS(SEQ IDNO:275)、KHVPGGG(SEQ ID NO:276)、HVPGGG(SEQ ID NO:277)、HVPGG(SEQ ID NO:278)、VPGGG(SEQ ID NO:279)、DNIKHVPGGGSVQIVYKPV(SEQ ID NO:280)、HHKPGGG(SEQ IDNO:281)、HKPGGG(SEQ ID NO:282)和THVPGGG(SEQ ID NO:283)。所有分析的涵盖tau蛋白治疗表位的肽都与病理性tauΔ(1-150；392-441/4R)竞争。如图76中所示，甚至6聚体肽(SEQ ID NO:272、SEQ ID NO:277和SEQ IDNO:282)也能够与tauΔ(1-150；392-441)/4R竞争结合DC8E8。然而，移除组氨酸(5聚体肽SEQ ID NO:274、279)或最后一个甘氨酸(5聚体肽SEQ IDNO:273、278)导致与tauΔ(1-150；392-441/4R)竞争结合DC8E8的活性损失(5聚体肽源于SEQ ID NO:272和SEQ ID NO:277，其中移除的氨基酸His和Gly加下划线，参见上文)。这些结果表明5聚体肽不产生由DC8E8在病理性tau蛋白上识别的治疗性3D结构。另一方面，包含6个氨基酸残基的肽产生造成通过竞争性ELISA测量的生物活性的治疗性3D结构且形成DC8E8的最小表位(治疗性核心单元)。在它们的设计中，5个氨基酸残基对DC8E8识别而言是重要的，所述残基是保守的(序列HxPGGG中的组氨酸、脯氨酸和3个甘氨酸残基)。
结论：数据表明人tau蛋白上的最小DC8E8表位由包含残基HQPGGG(位于MTBR1内)、HVPGGG(在MTBR2内)、HKPGGG(在MTBR3内)和HVPGGG(在MTBR4内)的6个氨基酸组成。因此，DC8E8结合位点(＝表位)在2N4R tau蛋白中存在4次且在2N3R tau蛋白中存在3次。这表明6聚体序列内的所需氨基酸是组氨酸和全部3个甘氨酸。
实施例27：确定携带DC8E8最小表位的肽的免疫原性
a)携带DC8E8的最小表位的肽具有免疫原性：以确定个别tau肽的免疫原性潜力为目的，使肽通过它们的N末端Cys残基缀合于KLH。
为此，以具有额外N末端定位的半胱氨酸残基的半胱氨酸化肽形式合成目的在于在KLH蛋白表面上获得定向肽连接的tau肽。通过双官能交联剂N-[γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基]丁二酰亚胺酯(GMBS)使肽偶合于KLH载体。为准备缀合反应，通过温和混合10分钟来将20mg KLH(Calbiochem)溶解于缀合缓冲液(具有0.9M NaCl、10mM EDTA的PBS)中以获得浓度10mg/ml。对于制备顺丁烯二酰亚胺活化的KLH，将2mg活性双官能交联剂GMBS溶解于50μl无水二甲基甲酰胺中且在室温下与2ml KLH溶液混合1小时。随后，在于缀合缓冲液中平衡的5ml HiTrap脱盐管柱(GE Healthcare)上移除未反应GMBS。在室温(25℃)下在肽与顺丁烯二酰亚胺活化的KLH的比率1:1(w/w，20mg肽)下进行缀合2小时。针对100倍过量的PBS来透析所得缀合物，进行4次透析缓冲液变化以移除未缀合肽。在透析之后，在2℃下在21,000×g下离心缀合物15分钟。将缀合物等分且储存在-20℃下直至使用。
用于100μl PBS中含有100μg缀合的肽且以最终剂量体积200μl与弗氏佐剂一起1:1(体积/体积)乳化的肽-KLH缀合物制备用于免疫的疫苗。每个处理组使用5只C57/BL小鼠。使用与弗氏完全佐剂一起配制的含肽缀合物的PBS进行首次免疫。使用与弗氏不完全佐剂一起配制的含肽缀合物的PBS在1周间隔下进行随后2次免疫。在末次增效剂量之后1周对动物放血且收集的血清用于抗体效价测定。如实施例19中所述，通过ELISA测定特异性抗tau蛋白抗体的效价。针对用作固相的病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R和生理性tau蛋白2N4R来测试各血清的连续稀释液(1:100至1:102400)。图77A-C显示在1:800稀释度下的血清的结果概述。使用曼-惠特尼非参数检验来统计评估ELISA结果。效价定义为产生半数最大OD的血清的稀释度的倒数且概述于图78中。
用tau肽TENLKHQPGGGK(SEQ ID NO:270)、KHQPGGG(SEQ IDNO:271)、ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS(SEQ ID NO:275)、KHVPGGG(SEQ ID NO:276)、HVPGGG(SEQ ID NO:277)、DNIKHVPGGGSVQIVYKPV(SEQ ID NO:280)、HHKPGGG(SEQ ID NO:281)和THVPGGG(SEQ ID NO:283)免疫小鼠在免疫的小鼠中诱导高水平的tau蛋白特异性抗体。此外，诱导的抗体展现对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R的亲和力高于对生理性tau蛋白2N4R的亲和力(图77A-C)。对于来自所有免疫的动物的血清而言，这个区分都具有统计显著性(SEQ ID NO:270，p<0.0079；SEQ ID NO:271，p<0.0052；SEQ ID NO:275，p<0.0079；SEQ ID NO:276，p<0.0079；SEQ ID NO:277，p<0.0379；SEQ IDNO:280，p<0.0159；SEQ ID NO:281，p<0.0379和SEQ ID NO:283，p<0.0286)。通常，对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R的几何平均抗体效价比对生理性tau蛋白2N4R的几何平均抗体效价高3至5倍(图78)。如图78中所示，对病理性tau蛋白的最高抗体效价由tau肽SEQ ID NO:275(GMT51200)、SEQ IDNO:280(GMT51200)、SEQ ID NO:270(GMT22286)和SEQ ID NO:276(GMT22286)所诱导。似乎缺乏治疗性3D结构的5聚体肽(SEQ ID NO:273、274、278、279)不能在免疫的动物中诱导tau蛋白特异性抗体。总之，这些结果显示携带最小治疗表位(治疗性核心单元)的肽(SEQ ID NO:270、271、272、275、276、277、280、281和283)具有免疫原性且诱导具有靶向阿尔茨海默病患者的脑中的病理性tau蛋白的治疗潜力的抗体。以上提及的表位定位实验显示肽SEQ ID NO:282产生治疗性3D结构(例如至少部分模拟最小DC8E8表位)，然而，其不在免疫的小鼠中诱导特异性抗体反应(病理性tau蛋白的GMT是174，图78)。
b)同种型分布：用tau肽SEQ ID NO:270、271、275、276、277、280、281和283对C57/BL小鼠疫苗接种优先诱导形成对病理性tau蛋白具有特异性的IgG1和IgG2b抗体同种型。为确定反应于肽产生的抗体的特定同种型，汇合来自小鼠的血清且自1:100至1:12,800稀释，并通过ELISA(如实施例19中所述)针对病理性tauΔ(1-150；392-441)/4R一式两份测试。为检测小鼠IgG1、IgG2b、IgG2c、IgG3和IgM同种型，于PBS中1:5,000稀释抗小鼠子类特异性HRP缀合的二级抗体(抗体自Lifespan Biosciences购买)。图79显示代表性1:800稀释度的结果。数据表明缀合于KLH的肽诱导广谱抗tau蛋白抗体同种型。一般而言，用肽疫苗接种产生最高水平的被视为高亲和力抗体的抗体同种型(IgG1、IgG2b)。存在高效价的对病理性tau蛋白具有优先亲和力的IgG1和IgG2b抗体指示由疫苗诱导的免疫反应是针对病理性tau蛋白种类。自模拟免疫的小鼠(其接受单独佐剂)获得的对照血清是阴性的(数据未显示)。
c)携带治疗表位的肽诱导区分病理性tau蛋白与生理性tau蛋白的抗体：使用表面等离子体共振实时监测结合事件使得能够测量抗体的缔合(k缔合)和解离(k解离)的动力学速率，所述抗体来自用个别tau肽TENLKHQPGGGK(SEQ ID NO:270)、KHQPGGG(SEQ ID NO:271)、HQPGGG(SEQ ID NO:272)、HQPGG(SEQ ID NO:273)、QPGGG(SEQ IDNO:274)、ENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGS(SEQ IDNO:275)、KHVPGGG(SEQ ID NO:276)、HVPGGG(SEQ ID NO:277)、HVPGG(SEQ ID NO:278)、VPGGG(SEQ ID NO:279)、DNIKHVPGGGSVQIVYKPV(SEQ ID NO:280)、HHKPGGG(SEQ IDNO:281)、HKPGGG(SEQ ID NO:282)和THVPGGG(SEQ ID NO:283)免疫的小鼠C57/BL的汇合血清。如实施例5和19中所述，通过表面等离子体共振，在使用CM5传感器芯片的BIACORE3000(Biacore AB,Uppsala)上进行分析。分析显示由用肽免疫诱导的抗体能够在识别tauΔ(1-150；392-441)/4R与生理性tau蛋白亚型2N4R之间区分(图80)。由用携带最小治疗表位的肽SEQ IDNO:270、271、272、275、276、277、280、281和283免疫诱导的抗体展现相较于它们对相应生理性tau蛋白2N4R的亲和力，优先对tauΔ(1-150；392-441)/4R具有亲和力。对于由以下肽获得的血清，这个区分具有统计显著性：SEQ ID NO:270(p＝0.0392)、SEQ ID NO:271(p＝0.0363)、SEQID NO:272(p＝0.0022)、SEQ ID NO:276(p＝0.0013)、SEQ ID NO:277(p＝0.0023)、SEQ ID NO:280(p＝0.0104)、SEQ ID NO:281(p＝0.0123)和SEQ IDNO:283(p＝0.0011)。获得的结果与概述于图77A-C和图78中的先前免疫原性实验一致。
d)根据蛋白质印迹，肽诱导的抗体识别病理性形式的tau蛋白：使用免疫印迹方法(如实施例19中所述)，针对病理性形式的tau蛋白检查由用个别tau肽免疫小鼠C57/BL诱导的抗体。处于神经原纤维病变晚期的SHR72大鼠的脑干用于提取不溶性病理性tau蛋白。人AD脑(布拉克第VI阶段；自荷兰脑库(Netherlands)获得)的颞叶皮质用于提取人病理性AD tau蛋白。根据肌氨酰方法(Greenberg和Davies1990)制备提取的tau蛋白。将来自免疫的动物的汇合血清于PBS中1:1000稀释且用作一级抗体。与一级抗体一起孵育继之以与缀合于辣根过氧化物酶的多克隆兔抗大鼠免疫球蛋白(1:3000；Dako,Glostrup,Denmark)一起孵育。接着使用SuperSignal West Pico化学发光底物(Thermo Scientific,Belgium)，通过化学发光来观察辣根过氧化物酶缀合的抗体。用LAS3000CCD成像系统(Fujifilm,Japan)使信号数字化。概述的结果提供于图81中。由用可能产生DC8E8表位的治疗性3D结构的肽(SEQ IDNO:270、271、272、275、276、277、280、281和283)疫苗接种引发的抗体识别自SHR72和自AD脑组织提取的所有病理性形式的tau蛋白，包括AD特征性A68tau蛋白三重物。然而，似乎产生治疗性3D结构的肽SEQ IDNO:282(与tauΔ(1-150；392-441)/4R竞争结合DC8E8)不在这个免疫的小鼠中诱导特异性抗体反应，因此反应性是阴性的。类似地，不能诱导tau蛋白特异性抗体反应的5聚体肽在这个分析中是阴性的。
e)肽诱导的抗体识别来自人阿尔茨海默病脑组织的切片中的病理性tau蛋白：在自荷兰脑库获得的人脑组织(石蜡块体)上测试用个别肽疫苗接种小鼠C57/BL所引发的Tau蛋白特异性抗体。在切片机上切割块体。在室温(25℃)下用冷(+4℃)99％甲酸处理来自阿尔茨海默病脑(布拉克第V阶段)的海马CA1区段的石蜡切片(8μm)1分钟。于阻断溶液(含5％BSA、0.3％TritonX-100的50nM Tris-HCl)中孵育组织切片且接着于阻断溶液中与1:1000稀释的血清一起孵育过夜。随后，在室温下使切片与生物素化二级抗体(VectastainElite ABC试剂盒，Vector Laboratories)一起孵育1小时且接着与亲和素-生物素过氧化酶复合物再反应1小时(Vectastain Elite ABC试剂盒，VectorLaboratories)，两者均在室温(25℃)下。用过氧化酶底物试剂盒(Vector VIP，Vector laboratories,Ca,USA)观察免疫反应且用甲基绿(Vector Laboratories)对比染色。用Olympus BX71显微镜检查切片。免疫组织化学染色(图82A-C、图83)表明由用肽SEQ ID NO:270、271、275、276、280、281和283免疫诱导的抗体特异性识别阿尔茨海默病脑组织的海马中的病理性tau蛋白结构，即神经原纤维缠结。用以上提及的肽接种的动物的血清强烈染色神经原纤维病变，从而确认抗体靶向病理性tau蛋白。由用肽SEQ ID NO:272和277疫苗接种诱导的抗体显示对脑组织中的病理性tau蛋白结构的染色强度较弱。诱导较低水平的tau蛋白特异性抗体反应或不诱导tau蛋白特异性抗体反应的肽(SEQ ID NO:273、274、278、279和282)在这个分析中是阴性的。来自接受单独佐剂的小鼠的血清用作阴性对照。它们不识别神经原纤维病变(图82C)。
本文中引用的所有参考文献(包括专利、专利申请、论文、教科书等)和其中引用的参考文献(就它们尚未被引用而言)据此以引用的方式整体并入本文。此外，先前段落中以更缩写形式引用的以下参考文献也以引用的方式整体并入本文，包括所述参考文献中引用的参考文献。
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Claims (116)

1.一种分离的抗体，其中所述抗体结合一种或多种tau表位且能够展现两种或更多种以下性质：
a)显示对病理性tau蛋白的亲和力高于对生理性tau蛋白的亲和力；
b)抑制tau蛋白-tau蛋白聚集；以及
c)介导由小神经胶质细胞对病理性tau蛋白的摄取和降解；且其中各tau表位包含tau蛋白的聚集促进区。
2.如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述一种或多种表位各自独立地选自以下位置内的表位：
i.相对于tau441的位置267-273或残基KHQPGGG(SEQ ID NO:98)；
ii.相对于tau441的位置298-304或残基KHVPGGG(SEQ ID NO:99)
iii.相对于tau441的位置329-335或残基HHKPGGG(SEQ ID NO:100)；和
iv.相对于tau441的位置361-367或残基THVPGGG(SEQ ID NO:101)。
3.如权利要求2所述的分离的抗体，其中所述一种或多种表位各自独立地选自以下位置内的表位：
i.相对于tau441的位置268-273或残基HQPGGG(SEQ ID NO:223)；
ii.相对于tau441的位置299-304或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)
iii.相对于tau441的位置330-335或残基HKPGGG(SEQ ID NO:224)；和
iv.相对于tau441的位置362-367或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)。
4.如权利要求1至3中的一项所述的分离的抗体，其中所述抗体能够结合选自以下的一种或多种形式的病理性tau蛋白：人阿尔茨海默病患者的脑活检中、来自阿尔茨海默病的动物模型的脑样本中、或两者中的错序tau蛋白、错误无序tau蛋白、肌氨酰不溶性tau蛋白、神经原纤维缠结、神经原纤维网线和神经炎斑块。
5.如权利要求1至4中的一项所述的分离的抗体，其中所述表位的至少一者是构象表位。
6.一种以构象特异性方式结合tau蛋白上的一种或多种表位的分离的抗体，其中：
a)所述一种或多种表位各自独立地选自以下位置内的表位：
i.相对于tau441的位置267-273或残基KHQPGGG(SEQ ID NO:98)；
ii.相对于tau441的位置298-304或残基KHVPGGG(SEQ ID NO:99)
iii.相对于tau441的位置329-335或残基HHKPGGG(SEQ ID NO:100)；和
iv.相对于tau441的位置361-367或残基THVPGGG(SEQ ID NO:101)；
b)所述表位的零者、一者、两者或三者是线性表位；以及
c)所述表位的一者、两者、三者或四者是构象表位。
7.一种以构象特异性方式结合tau蛋白上的一种或多种表位的分离的抗体，其中：
a)所述一种或多种表位各自独立地选自以下位置内的表位：
i.相对于tau441的位置268-273或残基HQPGGG(SEQ ID NO:223)；
ii.相对于tau441的位置299-304或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)
iii.相对于tau441的位置330-335或残基HKPGGG(SEQ ID NO:224)；和
iv.相对于tau441的位置362-367或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)。
b)所述表位的零者、一者、两者或三者是线性表位；以及
c)所述表位的一者、两者、三者或四者是构象表位。
8.如权利要求1和6中的一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是DC8E8，且其中DC8E8是一种由在美国典型培养物保藏中心专利保藏号PTA-11994下保藏的杂交瘤产生的抗体。
9.如权利要求1至7中的一项所述的分离的抗体，其中所述抗体结合tau蛋白上与由DC8E8结合的那些表位相同的表位的一者或多者。
10.如权利要求1至7中的一项所述的分离的抗体，其中所述抗体与单克隆抗体DC8E8竞争结合tau蛋白。
11.一种分离的抗体，所述抗体在其表位结合结构域中包含一种或多种选自以下的互补决定区(CDR)序列：
i.QSLLNSRTRKNY(SEQ ID NO:117)
ii.WAS(SEQ ID NO:118)
iii.KQSFYLRT(SEQ ID NO:119)
iv.GYIFTDYVIS(SEQ ID NO:120)
v.IFPRSGST(SEQ ID NO:121)；和
vi.ARDYYGTSFAMDY(SEQ ID NO:122)。
12.如权利要求1至7中的一项所述的分离的抗体，所述抗体在其表位结合结构域中包含一种或多种选自以下的CDR序列：
i.QSLLNSRTRKNY(SEQ ID NO:117)
ii.WAS(SEQ ID NO:118)
iii.KQSFYLRT(SEQ ID NO:119)
iv.GYIFTDYVIS(SEQ ID NO:120)
v.IFPRSGST(SEQ ID NO:121)；和
vi.ARDYYGTSFAMDY(SEQ ID NO:122)。
13.如权利要求11和12中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
a)抗体轻链可变区，所述抗体轻链可变区包含：
i.用于CDR1的QSLLNSRTRKNY(SEQ ID NO:117)或SEQ ID NO:247；
ii.用于CDR2的WAS(SEQ ID NO:118)或SEQ ID NO:253；和
iii.用于CDR3的KQSFYLRT(SEQ ID NO:119)或SEQ ID NO:255、257、258、259和260的任一者；以及
b)抗体重链可变区，所述抗体重链可变区包含：
i.用于CDR1的GYIFTDYVIS(SEQ ID NO:120)、SEQ ID NO:261或SEQID NO:262；
ii.用于CDR2的IFPRSGST(SEQ ID NO:121)、SEQ ID NO:264或SEQ IDNO:265；和
iii.用于CDR3的ARDYYGTSFAMDY(SEQ ID NO:122)、SEQ IDNO:266、SEQ ID NO:267或SEQ ID NO:269。
14.如权利要求11和12中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
a)抗体轻链可变区，所述抗体轻链可变区包含：
i.用于CDR1的QSLLNSRTRKNY(SEQ ID NO:117)；
ii.用于CDR2的WAS(SEQ ID NO:118)；和
iii.用于CDR3的KQSFYLRT(SEQ ID NO:119)；以及
b)抗体重链可变区，所述抗体重链可变区包含：
iv.用于CDR1的GYIFTDYVIS(SEQ ID NO:120)
v.用于CDR2的IFPRSGST(SEQ ID NO:121)；和
vi.用于CDR1的ARDYYGTSFAMDY(SEQ ID NO:122)。
15.如权利要求1至7中的一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
a)一种或多种来自所述单克隆抗体DC8E8的轻链CDR的序列或一种或多种在与这些轻链CDR之一最优比对之后具有至少80％同一性的序列；和
b)一种或多种来自所述单克隆抗体DC8E8的重链CDR的序列或一种或多种在与这些重链CDR之一最优比对之后具有至少80％同一性的序列；
且其中：
i.所述轻链CDR包含选自QSLLNSRTRKNY(SEQ ID NO:117)、WAS(SEQ ID NO:118)和KQSFYLRT(SEQ ID NO:119)的序列；以及
ii.所述重链CDR包含选自GYIFTDYVIS(SEQ ID NO:120)、IFPRSGST(SEQ ID NO:121)和ARDYYGTSFAMDY(SEQ ID NO:122)的序列。
16.如权利要求1至7中的一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含：
a)一种或多种来自所述单克隆抗体DC8E8的轻链CDR的序列或一种或多种在与这些轻链CDR之一最优比对之后具有至少80％同一性的序列；和
a)一种或多种来自所述单克隆抗体DC8E8的重链CDR的序列或一种或多种在与这些重链CDR之一最优比对之后具有至少80％同一性的序列；
且其中：
i.所述轻链CDR包含选自QSLLNSRTRKNY(SEQ ID NO:117)、WAS(SEQ ID NO:118)、KQSFYLRT(SEQ ID NO:119)、SEQ ID NO:247、SEQID NO:253、SEQ ID NO:255、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、SEQ IDNO:259和SEQ ID NO:260的序列；以及
ii.所述重链CDR包含选自GYIFTDYVIS(SEQ ID NO:120)、IFPRSGST(SEQ ID NO:121)、ARDYYGTSFAMDY(SEQ ID NO:122)；SEQ IDNO:261、SEQ ID NO:262、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:265、SEQ ID NO:266、SEQ ID NO:267和SEQ ID NO:269的序列。
17.一种分离的抗体，其中所述抗体是：
Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv片段、或任何其它抗原结合片段；或抗原结合抗体部分；且
其中所述抗体具有如权利要求1至7中的一项所述的抗体的一种或多种免疫结合特征。
18.一种分离的抗体，所述抗体与如权利要求1至17中的一项所述的分离的抗体竞争结合tau蛋白。
19.一种分离的抗体，所述抗体与如权利要求6所述的分离的DC8E8抗体竞争结合tau蛋白。
20.如权利要求1至7和10至19中的一项所述的分离的抗体，其中所述抗体选自：
a)单克隆抗体；
b)多克隆抗体；
c)重组抗体；
d)嵌合抗体；
e)人源化抗体；
f)人抗体；和
g)(a)至(f)的任一者的抗原结合片段或抗原结合部分。
21.如权利要求1至7和9至20中的一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是在哺乳动物中产生。
22.如权利要求1至7和9至20中的一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是由重组动物或由重组宿主细胞产生。
23.如权利要求1至22中的一项所述的分离的抗体，其中所述抗体用一种或多种标记剂可检测地标记。
24.如权利要求23所述的分离的抗体，其中至少一种标记剂选自酶、放射性同位素、荧光团、核磁共振标记物和重金属。
25.如权利要求1至24中的一项所述的抗体，所述抗体进一步包含至少一种连接于所述抗体的药物。
26.一种分离的核酸，所述核酸至少编码如权利要求1至7和9至20中的一项所述的抗体的免疫球蛋白链的所述结合结构域或可变区。
27.一种分离的载体，所述载体包含如权利要求21所述的核酸。
28.一种分离的宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求26所述的分离的核酸和/或如权利要求27所述的载体。
29.一种分离的细胞系，所述细胞系表达如权利要求1至7和9至20中的一项所述的分离的抗体。
30.如权利要求29所述的分离的细胞系，其中所述细胞系是杂交瘤。
31.如权利要求30所述的分离的细胞系，其中所述细胞系是自其产生单克隆抗体DC8E8的杂交瘤。
32.如权利要求1至7和9至20中的一项所述的分离的抗体，所述抗体用作药物或用于制造药剂以诊断、预防或治疗阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变。
33.如权利要求26所述的分离的核酸，所述核酸用作药物或用于制造药剂以治疗阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变。
34.一种医药组合物，所述医药组合物包含如权利要求1至25中的一项所述的抗体和药学上可接受的载体和/或稀释剂。
35.一种包含抗体和药学上可接受的载体和/或稀释剂的组合的医药组合物，其中所述组合包含至少两种不同抗体，且其中所述抗体各自独立地选自如权利要求1至25中的一项所述的抗体。
36.一种组合物，所述组合物包含至少一种如权利要求1至25所述的抗体和稀释剂或载体。
37.如权利要求36所述的组合物，所述组合物进一步包含至少一种选自以下的化合物或试剂：可检测标记、匙孔血蓝蛋白、破伤风类毒素或源于其它病原细菌的类毒素、血清白蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白分子或其片段、甲状腺球蛋白、卵球蛋白、通用T细胞表位、细胞因子、趋化因子、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-10、IFN-γ、GM-CSF、ΜΙΡ1α、ΜΙΡ1β和RANTES。
38.一种供医药或诊断使用的制品，所述制品包括包装材料和容器，所述容器包括冻干形式的如权利要求1至25中的一项所述的抗体的溶液。
39.如权利要求39所述的制品，其中所述容器是用于向受试者递送所述抗体的装置或系统的组成部分。
40.一种包括如权利要求1至25中的一项所述的抗体的医学装置，其中所述装置适于通过至少一种选自以下的模式接触或施用所述抗体：胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、鞘内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、推注、经阴道、经直肠、经颊、舌下、鼻内和经皮。
41.一种治疗受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变或预防其进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种如权利要求1至25中的一项所述的抗体。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述方法能够减轻运动损伤、提高运动功能、减轻认知损伤、提高认知功能或能够实现其组合效果。
43.一种改善至少一种与受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种如权利要求1至25中的一项所述的抗体。
44.一种针对受试者中存在阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变，或针对确定受试者显现阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的风险来诊断或筛选受试者的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者或所述受试者的细胞、组织、器官、流体或任何其它样本与有效量的至少一种如权利要求1至25中的一项所述的抗体接触；以及
b)确定包含病理性tau蛋白和所述抗体的复合物的存在，其中存在所述复合物是对与存在病理性tau蛋白相关的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的诊断。
45.一种针对受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的存在、进展、消退或稳定化，或针对确定受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的阶段来监测受试者的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者或所述受试者的细胞、组织、器官、流体或任何其它样本与有效量的至少一种如权利要求1至25中的一项所述的抗体接触；以及
b)确定包含病理性tau蛋白和所述抗体的复合物的存在，其中存在所述复合物是对与存在病理性tau蛋白相关的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的诊断。
46.如权利要求41至45中的一项所述的方法，其中所述抗体是静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、鼻内、脑室内、鞘内或以气雾剂形式施用。
47.如权利要求41至45中的一项所述的方法，其中各抗体的每剂所述有效量是所述受试者的每kg体重对应至少1mg。
48.如权利要求41至45中的一项所述的方法，其中各抗体的每剂所述有效量是所述受试者的每kg体重对应至少10mg。
49.如权利要求41至48中的一项所述的方法，其中历经至少6个月的时期以多次剂量施用所述抗体的至少一者。
50.如权利要求41至49中的一项所述的方法，其中向人受试者外周施用所述抗体以施加其有益作用。
51.如权利要求50所述的方法，其中在向人受试者外周施用时，所述抗体结合可溶性tau蛋白、肌氨酰不溶性tau蛋白或两者。
52.如权利要求50所述的方法，其中在向人受试者外周施用时，所述抗体结合tau蛋白，其中tau蛋白呈一种或多种选自以下的病理性形式：人阿尔茨海默病患者的脑活检中、来自阿尔茨海默病的动物模型的脑样本中的错序tau蛋白、错误无序tau蛋白、肌氨酰不溶性tau蛋白、神经原纤维缠结、神经原纤维网线和神经炎斑块。
53.如权利要求50至52中的一项所述的方法，其中在向人受试者外周施用时，所述抗体施加一种或多种效应子功能介导的对所述受试者的有益作用。
54.如权利要求1至25中任一项所述的抗体或如权利要求26所述的核酸，所述抗体或所述核酸用于治疗或诊断选自阿尔茨海默病和相关tau蛋白病变的疾病。
55.一种包含如权利要求1至25中任一项所述的抗体或如权利要求26所述的核酸的组合物，所述组合物用于治疗或诊断选自阿尔茨海默病和相关tau蛋白病变的疾病。
56.一种分离的肽，其中：
a)所述分离的肽是tau蛋白的长度是至少6个氨基酸残基、长度是至少7个氨基酸残基、长度是至少9个氨基酸残基、长度是至少10个氨基酸残基、长度是至少12个氨基酸残基或长度是30个氨基酸残基的片段；且其中
b)所述分离的肽包含至少一种tau蛋白治疗表位。
57.如权利要求56所述的分离的肽，其中所述治疗表位包括选自以下位置内的那些的治疗表位：
i.相对于tau441的位置267-273或残基KHQPGGG(SEQ ID NO:98)；
ii.相对于tau441的位置298-304或残基KHVPGGG(SEQ ID NO:99)
iii.相对于tau441的位置329-335或残基HHKPGGG(SEQ ID NO:100)；和
iv.相对于tau441的位置361-367或残基THVPGGG(SEQ ID NO:101)。
58.如权利要求56所述的分离的肽，其中所述治疗表位包括选自以下位置内的那些的治疗表位：
i.相对于tau441的位置268-273或残基HQPGGG(SEQ ID NO:223)；
ii.相对于tau441的位置299-304或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)
iii.相对于tau441的位置330-335或残基HKPGGG(SEQ ID NO:224)；和
iv.相对于tau441的位置362-367或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)。
59.如权利要求56至58中的一项所述的分离的肽，其中所述肽氨基酸序列是选自以下的序列：SEQ ID NO:1-4、SEQ ID NO:9-101、SEQ IDNO:108-112、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:223-224、NIKAVPGGGS(SEQ IDNO:200)、NIKHVPGGGS(SEQ ID NO:201)、IKHVPGGGS(SEQ ID NO:202)、KHVPGGGSV(SEQ ID NO:203)、HVPGGGSVQ(SEQ ID NO:204)、VPGGGSVQ(SEQ ID NO:205)、GWSIHSPGGGSC(SEQ ID NO:250)、SVFQHLPGGGSC(SEQ ID NO:251)、ANIKHVPGGGS(SEQ ID NO:144)、DAIKHVPGGGS(SEQ ID NO:146)、DNAKHVPGGGS(SEQ ID NO:149)、DNIAHVPGGGS(SEQ ID NO:151)、DNIKAVPGGGS(SEQ ID NO:159)、DNIKHAPGGGS(SEQ ID NO:161)和DNIKHVPGGGS(SEQ ID NO:171)。
60.如权利要求56至59中的一项所述的分离的肽，其中所述肽在至少一种选自测量所述肽的以下能力的测定的测定中具有活性：
a)与tau蛋白竞争结合所述单克隆抗体DC8E8的能力；
b)体内降低肌氨酰不溶性tau蛋白的水平的能力；
c)体内促进tau蛋白自脑清除的能力；
d)体内降低AD的至少一种生物化学标记物的水平的能力；
e)体内降低神经原纤维缠结(NFT)载荷的能力；
f)体内提高至少一种神经行为参数的能力；
g)有益改进受试者的AD的过程的能力；
h)降低脑中、脑脊髓液中或两者中的tau蛋白的水平的能力；
i)在制备能够与单克隆DC8E8竞争结合tau蛋白的抗体中充当免疫原的能力。
61.一种化合物，所述化合物包含如权利要求56至60中的一项所述的分离的肽和部分。
62.如权利要求61所述的化合物，其中所述部分在所述肽的N末端、C末端或连接于内部氨基酸，且其中所述部分选自以下一者或多者：半胱氨酸残基、磷酸基团、匙孔血蓝蛋白、破伤风类毒素或源于其它病原细菌的类毒素、血清白蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白分子或其片段、甲状腺球蛋白、卵球蛋白、通用T细胞表位、细胞因子、趋化因子、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-10、IFN-γ、GM-CSF、ΜΙΡ1α、ΜΙΡ1β和RANTES。
63.一种医药组合物，所述医药组合物包含如权利要求56至60中的一项所述的分离的肽和药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂。
64.一种医药组合物，所述医药组合物包含如权利要求61至62中的一项所述的化合物和药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂。
65.如权利要求63和64中的一项所述的医药组合物，所述医药组合物适合于提供每剂剂量在1ng与10mg之间的所述肽或所述化合物。
66.如权利要求63和64中的一项所述的医药组合物，所述医药组合物适合于提供每剂剂量大于10微克的所述肽或所述化合物。
67.一种供医药或诊断使用的制品，所述制品包括包装材料和容器，所述容器包括冻干形式的如权利要求56至60中的一项所述的肽或如权利要求61至62中的一项所述的化合物的溶液。
68.如权利要求67所述的制品，其中所述容器是用于向受试者递送所述肽或所述化合物的装置或系统的组成部分。
69.一种包括如权利要求56至60中的一项所述的肽或如权利要求61至62中的一项所述的化合物的医学装置，其中所述装置适于通过至少一种选自以下的模式接触或施用所述抗体：胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、鞘内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、推注、经阴道、经直肠、经颊、舌下、鼻内和经皮。
70.一种治疗受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变或预防其进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种如权利要求56至60中的一项所述的肽和/或至少一种如权利要求61至62中的一项所述的化合物。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述方法能够减轻运动损伤、提高运动功能、减轻认知损伤、提高认知功能或能够实现其组合效果。
72.一种改善至少一种与受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种如权利要求56至60中的一项所述的肽和/或至少一种如权利要求61至62中的一项所述的化合物。
73.如权利要求70至72中的一项所述的方法，所述方法包括向人患者施用如权利要求56至60中的一项所述的肽和/或如权利要求61至62中的一项所述的化合物和/或增大免疫反应的佐剂，所述方法实现包含针对病理性tau蛋白的抗体的免疫反应，由此治疗至少一种与所述人患者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状、预防其进展或改善所述至少一种症状。
74.一种产生能够与DC8E8竞争结合tau蛋白的抗体的方法，所述方法包括用如权利要求56至60中的一项所述的肽和/或用如权利要求61至62中的一项所述的化合物免疫受试者。
75.一种分离DC8E8或分离能够与DC8E8竞争结合tau蛋白的抗体的方法，所述方法包括使DC8E8或所述抗体与如权利要求56至60中的一项所述的肽和/或与如权利要求61至62中的一项所述的化合物接触。
76.一种针对受试者中存在阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变，或针对确定受试者显现阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的风险来诊断或筛选受试者的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者或所述受试者的细胞、组织、器官、流体或任何其它样本与有效量的至少一种如权利要求74所述的抗体接触；以及
b)确定包含病理性tau蛋白和所述抗体的复合物的存在，其中存在所述复合物是对与存在病理性tau蛋白相关的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的诊断。
77.一种针对受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的存在、进展、消退或稳定化，或针对确定受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的阶段来监测受试者的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者或所述受试者的细胞、组织、器官、流体或任何其它样本与有效量的至少一种如权利要求74所述的抗体接触；以及
b)确定包含病理性tau蛋白和所述抗体的复合物的存在，其中存在所述复合物是对与存在病理性tau蛋白相关的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变的诊断。
78.如权利要求76至77中的一项所述的方法，其中所述肽和/或化合物是静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、鼻内、脑室内、鞘内或以气雾剂形式施用。
79.如权利要求76至78中的一项所述的方法，其中各肽和/或化合物的所述有效量是每剂至少1μg、每剂至少10μg、每剂至少100μg。
80.如权利要求79所述的方法，其中各肽和/或化合物的所述有效量是在佐剂存在下每剂至少10μg，且在不存在佐剂下每剂至少100μg。
81.如权利要求70至73和76至80中的一项所述的方法，其中历经至少6个月的时期以多次剂量施用至少一种肽或化合物。
82.一种治疗受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变或预防其进展的方法，所述方法包括与至少一种选自以下的组合药剂组合向所述受试者施用有效量的至少一种如权利要求1至25中的一项所述的抗体和/或至少一种如权利要求56至60中的一项所述的肽和/或至少一种如权利要求61至62中的一项所述的化合物：乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂、过渡金属螯合剂、生长因子、激素、非类固醇消炎药物(NSAID)、抗氧化剂、脂质降低剂、选择性磷酸二酯酶抑制剂、tau蛋白聚集抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂、抗淀粉状蛋白被动和主动免疫试剂、抗淀粉状蛋白聚集抑制剂和分泌酶抑制剂。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述方法能够减轻运动损伤、提高运动功能、减轻认知损伤、提高认知功能或能够实现其组合效果。
84.一种改善至少一种与受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状的方法，所述方法包括与至少一种选自以下的组合药剂组合向所述受试者施用有效量的至少一种如权利要求1至25中的一项所述的抗体和/或至少一种如权利要求56至60中的一项所述的肽和/或至少一种如权利要求61至62中的一项所述的化合物：乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂、过渡金属螯合剂、生长因子、激素、非类固醇消炎药物(NSAID)、抗氧化剂、脂质降低剂、选择性磷酸二酯酶抑制剂、tau蛋白聚集抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂、抗淀粉状蛋白被动和主动免疫试剂、抗淀粉状蛋白聚集抑制剂和分泌酶抑制剂。
85.如权利要求83至84中的一项所述的方法，所述方法包括与至少一种选自以下的组合药剂组合向人患者施用有效量的至少一种如权利要求1至25中的一项所述的抗体、一种如权利要求56至60中的一项所述的肽和/或至少一种如权利要求61至62中的一项所述的化合物和/或增大免疫反应的佐剂：乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂、过渡金属螯合剂、生长因子、激素、非类固醇消炎药物(NSAID)、抗氧化剂、脂质降低剂、选择性磷酸二酯酶抑制剂、tau蛋白聚集抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂、抗淀粉状蛋白被动和主动免疫试剂、抗淀粉状蛋白聚集抑制剂和分泌酶抑制剂；其中所述方法实现包含针对病理性tau蛋白的抗体的免疫反应，由此治疗至少一种与所述人患者的AD相关的症状、预防其进展或改善所述至少一种症状。
86.如权利要求83至85中的一项所述的方法，其中所述组合药剂是在施用如权利要求1至25中的一项所述的抗体、如权利要求56至60中的一项所述的肽和/或如权利要求61至62中的一项所述的化合物之前、与之同时、或之后施用。
87.一种医药组合物，所述医药组合物包含药学上可接受的载体和/或稀释剂；和
a)如权利要求1至25中的一项所述的抗体；和/或
b)如权利要求56至60中的一项所述的肽；和/或
c)如权利要求61至62中的一项所述的化合物；
以及至少一种选自以下的组合药剂：乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂、过渡金属螯合剂、生长因子、激素、非类固醇消炎药物(NSAID)、抗氧化剂、脂质降低剂、选择性磷酸二酯酶抑制剂、tau蛋白聚集抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂、抗淀粉状蛋白被动和主动免疫试剂、抗淀粉状蛋白聚集抑制剂和分泌酶抑制剂。
88.一种分离的肽，其中：
a)所述分离的肽是tau蛋白的长度是6个氨基酸残基的片段且其中
b)所述分离的肽包含至少一种tau蛋白治疗表位。
89.如权利要求88所述的分离的肽，其中所述治疗表位包括选自以下的治疗表位：
i.相对于tau441的位置268-273或残基HQPGGG(SEQ ID NO:223)；
ii.相对于tau441的位置299-304或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)
iii.相对于tau441的位置330-335或残基HKPGGG(SEQ ID NO:224)；和
iv.相对于tau441的位置362-367或残基HVPGGG(SEQ ID NO:154)。
90.如权利要求88至89中的一项所述的分离的肽，其中所述分离的肽选自HQPGGG(SEQ ID NO:223)、HVPGGG(SEQ ID NO:154)、HKPGGG(SEQID NO:224)和HVPGGG(SEQ ID NO:154)。
91.如权利要求88至90中的一项所述的分离的肽，其中所述肽在至少一种选自测量所述肽的以下能力的测定的测定中具有活性：
j)与tau蛋白竞争结合所述单克隆抗体DC8E8的能力；
k)体内降低肌氨酰不溶性tau蛋白的水平的能力；
l)体内促进tau蛋白自脑清除的能力；
m)体内降低AD的至少一种生物化学标记物的水平的能力；
n)体内降低神经原纤维缠结(NFT)载荷的能力；
o)体内提高至少一种神经行为参数的能力；
p)有益改进受试者的AD的过程的能力；
q)降低脑中、脑脊髓液中或两者中的tau蛋白的水平的能力；
r)在制备能够与单克隆DC8E8竞争结合tau蛋白的抗体中充当免疫原的能力。
92.一种化合物，所述化合物包含如权利要求88至91中的一项所述的分离的肽和部分。
93.如权利要求92所述的化合物，其中所述部分在所述肽的N末端、C末端或连接于内部氨基酸，且其中所述部分选自以下一者或多者：半胱氨酸残基、磷酸基团、匙孔血蓝蛋白、破伤风类毒素或源于其它病原细菌的类毒素、血清白蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白分子或其片段、甲状腺球蛋白、卵球蛋白、通用T细胞表位、细胞因子、趋化因子、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-10、IFN-γ、GM-CSF、ΜΙΡ1α、ΜΙΡ1β和RANTES。
94.一种医药组合物，所述医药组合物包含如权利要求88至91中的一项所述的分离的肽和药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂。
95.一种医药组合物，所述医药组合物包含如权利要求92至93中的一项所述的化合物和药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂。
96.如权利要求94和95中的一项所述的医药组合物，所述医药组合物适合于提供每剂剂量在1ng与10mg之间的所述肽或所述化合物。
97.如权利要求94和95中的一项所述的医药组合物，所述医药组合物适合于提供每剂剂量大于10微克的所述肽或所述化合物。
98.一种供医药或诊断使用的制品，所述制品包括包装材料和容器，所述容器包括冻干形式的如权利要求88至91中的一项所述的肽或如权利要求92至93中的一项所述的化合物的溶液。
99.如权利要求98所述的制品，其中所述容器是用于向受试者递送所述肽或所述化合物的装置或系统的组成部分。
100.一种包括如权利要求88至91中的一项所述的肽或如权利要求92至93中的一项所述的化合物的医学装置，其中所述装置适于通过至少一种选自以下的模式接触或施用所述肽和/或所述化合物：胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、鞘内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、推注、经阴道、经直肠、经颊、舌下、鼻内和经皮。
101.一种治疗受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变或预防其进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种如权利要求88至91中的一项所述的肽和/或至少一种如权利要求92至93中的一项所述的化合物。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述方法能够减轻运动损伤、提高运动功能、减轻认知损伤、提高认知功能或能够实现其组合效果。
103.一种改善至少一种与受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种如权利要求88至91中的一项所述的肽和/或至少一种如权利要求92至93中的一项所述的化合物。
104.如权利要求101至103中的一项所述的方法，所述方法包括向人患者施用如权利要求88至91中的一项所述的肽和/或如权利要求92至93中的一项所述的化合物和/或增大免疫反应的佐剂，所述方法实现包含针对病理性tau蛋白的抗体的免疫反应，由此治疗至少一种与所述人患者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状、预防其进展或改善所述至少一种症状。
105.一种产生能够与DC8E8竞争结合tau蛋白的抗体的方法，所述方法包括用如权利要求88至91中的一项所述的肽和/或用如权利要求92至93中的一项所述的化合物免疫受试者。
106.一种分离DC8E8或分离能够与DC8E8竞争结合tau蛋白的抗体的方法，所述方法包括使DC8E8或所述抗体与如权利要求88至91中的一项所述的肽和/或与如权利要求92至93中的一项所述的化合物接触。
107.如权利要求101至104中的一项所述的方法，其中所述肽和/或化合物是静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、鼻内、脑室内、鞘内或以气雾剂形式施用。
108.如权利要求101至104和107中的一项所述的方法，其中各肽和/或化合物的所述有效量是每剂至少1μg、每剂至少10μg、每剂至少100μg。
109.如权利要求108所述的方法，其中各肽和/或化合物的所述有效量是在佐剂存在下每剂至少10μg，且在不存在佐剂下每剂至少100μg。
110.如权利要求101至104和107至109中的一项所述的方法，其中历经至少6个月的时期以多次剂量施用至少一种肽或化合物。
111.一种治疗受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变或预防其进展的方法，所述方法包括与至少一种选自以下的组合药剂组合向所述受试者施用有效量的至少一种如权利要求1至25中的一项所述的抗体和/或至少一种如权利要求88至91中的一项所述的肽和/或至少一种如权利要求92至93中的一项所述的化合物：乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂、过渡金属螯合剂、生长因子、激素、非类固醇消炎药物(NSAID)、抗氧化剂、脂质降低剂、选择性磷酸二酯酶抑制剂、tau蛋白聚集抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂、抗淀粉状蛋白被动和主动免疫试剂、抗淀粉状蛋白聚集抑制剂和分泌酶抑制剂。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述方法能够减轻运动损伤、提高运动功能、减轻认知损伤、提高认知功能或能够实现其组合效果。
113.一种改善至少一种与受试者的阿尔茨海默病或相关tau蛋白病变相关的症状的方法，所述方法包括与至少一种选自以下的组合药剂组合向所述受试者施用有效量的至少一种如权利要求1至25中的一项所述的抗体和/或至少一种如权利要求88至91中的一项所述的肽和/或至少一种如权利要求92至93中的一项所述的化合物：乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂、过渡金属螯合剂、生长因子、激素、非类固醇消炎药物(NSAID)、抗氧化剂、脂质降低剂、选择性磷酸二酯酶抑制剂、tau蛋白聚集抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂、抗淀粉状蛋白被动和主动免疫试剂、抗淀粉状蛋白聚集抑制剂和分泌酶抑制剂。
114.如权利要求111至113中的一项所述的方法，所述方法包括与至少一种选自以下的组合药剂组合向人患者施用有效量的至少一种如权利要求1至25中的一项所述的抗体、一种如权利要求88至91中的一项所述的肽和/或至少一种如权利要求92至93中的一项所述的化合物和/或增大免疫反应的佐剂：乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂、过渡金属螯合剂、生长因子、激素、非类固醇消炎药物(NSAID)、抗氧化剂、脂质降低剂、选择性磷酸二酯酶抑制剂、tau蛋白聚集抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂、抗淀粉状蛋白被动和主动免疫试剂、抗淀粉状蛋白聚集抑制剂和分泌酶抑制剂；其中所述方法实现包含针对病理性tau蛋白的抗体的免疫反应，由此治疗至少一种与所述人患者的AD相关的症状、预防其进展或改善所述至少一种症状。
115.如权利要求111至114中的一项所述的方法，其中所述组合药剂是在施用如权利要求1至25中的一项所述的抗体、如权利要求88至91中的一项所述的肽和/或如权利要求92至93中的一项所述的化合物之前、与之同时、或之后施用。
116.一种医药组合物，所述医药组合物包含药学上可接受的载体和/或稀释剂；和
d)如权利要求1至25中的一项所述的抗体；和/或
e)如权利要求88至91中的一项所述的肽；和/或
f)如权利要求92至93中的一项所述的化合物；
以及至少一种选自以下的组合药剂：乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂、过渡金属螯合剂、生长因子、激素、非类固醇消炎药物(NSAID)、抗氧化剂、脂质降低剂、选择性磷酸二酯酶抑制剂、tau蛋白聚集抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂、抗淀粉状蛋白被动和主动免疫试剂、抗淀粉状蛋白聚集抑制剂和分泌酶抑制剂。
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