JP6286590B2 - アルツハイマー病におけるタウ媒介性病理のタンパク質ベースの治療および診断 - Google Patents

アルツハイマー病におけるタウ媒介性病理のタンパク質ベースの治療および診断 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１１年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／５３６，３３９
号および２０１２年５月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／６５３，１１５号の
利益を主張し、これらの両出願の内容は本明細書において参照として援用される。
配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体
が本明細書によって参照により援用される。２０１２年９月１３日に作成された前記ＡＳ
ＣＩＩコピーは、ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔという名称であり、１５５
，４００バイトのサイズである。
分野
本発明は、アルツハイマー病における病理学的タウ−タウ凝集体の促進および／または
発生に関わるある特定の形態のタウの生成およびクリアランスを干渉するためのタンパク
質ベースの（例えば、抗体、ペプチド）方法および手段、ならびにアルツハイマー病の診
断および処置に有用な抗タウ抗体を作製するための方法を特徴とする。本発明はさらに、
アルツハイマー病を診断するための方法（処置の進行を段階付ける（ｓｔａｇｉｎｇ）た
めおよび評価するための方法を含む）および手段に関する。
背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は、高次脳構造（例えば、記憶および認知に関わる構造）を
破壊する進行性の神経変性障害である。この疾患は、認知機能の障害、ならびに記憶力、
学習、言語の低下、ならびに計画的および意図的動作を行う能力の低下に至る。ＡＤは、
同時に、行動上の、感情的な、対人性のおよび社会的な変質も伴う。これらの認知性およ
び行動性の障害は、生存を困難にする（Ｂｕｒｎｓら、２００２）。後期ＡＤの患者は、
話すこと、言語を理解することおよび自分自身の基本的な身の回りの世話を行うことがで
きないことが多く、最終的には、かかりっきりの世話および監視が必要となり、家族のメ
ンバーおよびナーシングホームに頼ることが多い。ＡＤは、老年痴呆の主な原因であり、
人口における高齢者の割合が伸びるにつれて有病率が高まると予想される。ＡＤを有する
人の総数は、２０００年から２０５０年の間だけで少なくとも３倍増加すると予想されて
おり、ＡＤは、世界的な公衆衛生問題になっている（Ｓｌｏａｎｅら、２００２）。ＡＤ
の臨床管理は、たいてい支持的なままである。つまり、患者は、ＡＤからの合併症および
副作用の予防、制御または軽減を目的とした処置、ならびに彼らの快適さおよび生活の質
を改善するための処置を受けている。その疾患プロセスを直接標的とする処置および疾患
を改変する効果を有する処置に対するニーズは満たされていないままである。
ＡＤは、脳における神経以外の斑（ｅｘｔｒａｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｌａｑｕｅｓ）な
らびに細胞内および細胞外の神経原線維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎ
ｇｌｅｓ）の存在によって組織学的に特徴付けられる。斑は、主にβアミロイド（Ａβ）
から構成されているのに対し、濃縮体は、病理学的形態のタウ（例えば、病理学的タウの
配座異性体）およびそれらの凝集体を含む。斑および濃縮体と疾患プロセスとの関係は不
明なままであるが、研究によって、アミロイドとタウの病原論との関連性が示唆されてい
る（Ｈａｒｄｙら、１９９８；Ｏｄｄｏら、２００４；Ｒａｐｏｐｏｒｔら、２００２；
Ｒｏｂｅｒｓｏｎら、２００７；Ｓｈｉｐｔｏｎら、２０１１）。ＡＤの病理においてＡ
βが果たす中心的役割は、Ａβの沈着の後に、タウのリン酸化および濃縮体の形成、次い
で、神経細胞死が続く「Ａβカスケード」と呼ばれる仮説において初めに提唱された（Ｈ
ａｒｄｙ ａｎｄ Ａｌｌｓｏｐ，１９９１；Ｈａｒｄｙ ａｎｄ Ｓｅｌｋｏｅ，２０
０２；概説として、Ｗａｌｓｈ ａｎｄ Ｓｅｌｋｏｅ，２００４を参照のこと；Ｓｅａ
ｂｒｏｏｋら、２００７も参照のこと）。したがって、ＡＤに対する最初の治療的アプロ
ーチは、第一に、Ａβの標的化に焦点が当てられた。しかしながら、ＡＤ患者における脳
Ａβ病理の程度とその疾患の臨床的進行との間に相関が無いことが実証されている（Ｂｒ
ａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ，１９９１）。さらに、無症候の個体は、剖検時に広範な（
しばしば散在性の）アミロイド沈着を示し（Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ，１９９１
）、少なくとも初期のＡＤでは、神経細胞脱落およびアミロイド沈着は、脳の種々の領域
で生じる（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｌｉｐｐａ，２００１）。ゆえに、Ａβだけの標的化
は、任意のまたはすべての患者における疾患プロセスを変更させるには足りない。それに
もかかわらず、ＡＤ患者において臨床試験を経ている最も進歩した疾患標的化治療は、Ａ
βの産生およびクリアランスを狙った治療のままである。これらの治療には、受動免疫療
法、例えば、ＢＡＰＩＮＥＵＺＵＭＡＢ、ＳＯＬＡＮＥＵＺＵＭＡＢおよびＰＯＮＥＺＵ
ＭＡＢ、ならびに小分子ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＳＥＭＡＧＡＣＥＳＴＡＴが含まれ
る（概説としてＣｉｔｒｏｎら、２０１０を参照のこと）。
ＡＤの病理においてタウが果たす認識されている役割は、数多くの研究において証明さ
れている。例えば、Ｂｒａａｋは、ＡＤの神経変性に対して最も密接な相互関係のあるも
のは、タウ濃縮体が存在することおよびアミロイド斑が存在しないことであることを示し
た（Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ，１９９１）。別の研究では、培養されたニューロ
ンにおけるＡβの神経毒性は、タウに依存するとみられた（Ｒａｐｏｐｏｒｔら、２００
２）。最近、内在性タウが減少することにより、高いＡβレベルが変更することなく、ヒ
トアミロイド前駆体タンパク質を発現するトランスジェニックマウスにおいて行動上の障
害が妨げられた（Ｒｏｂｅｒｓｏｎら、２００７）。タウの減少は、トランスジェニック
マウスと非トランスジェニックマウスの両方を興奮毒性から保護した。同上。Ｓａｎｔａ
ｃｒｕｚらは、タウの量の減少が、タウオパチーのモデルにおいて記憶機能を回復させる
ことを証明した（Ｓａｎｔａｃｒｕｚら、２００５）。したがって、タウを減少させるこ
とを狙った治療は、ＡＤおよび他のタウ関連疾患状態を処置するための有効なストラテジ
ーであり得る。
タウは、それらの生理学的環境において厳密な３次元構造が存在しないことを特徴とす
る天然無秩序（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ）タンパク質のファ
ミリーに属する（Ｚｉｌｋａら、２００８）。しかしながら、タウの切断および過剰リン
酸化は、天然無秩序状態から、複数の可溶性および不溶性の誤無秩序（ｍｉｓｄｉｓｏｒ
ｄｅｒｅｄ）構造（対らせん状細線維（ＰＨＦ）および他の凝集体を含む）への病理学的
変換を引き起こし得る（Ｗｉｓｃｈｉｋら、１９８８ａ；Ｗｉｓｃｈｉｋら、１９８８ｂ
；Ｎｏｖａｋら、１９９３；Ｓｋｒａｂａｎａら、２００６；Ｚｉｌｋａら、２００８；
Ｋｏｖａｃｅｃｈら、２０１０）。これらの構造的変化は、毒性の機能獲得、天然タンパ
ク質の生理学的機能の喪失、またはその両方をもたらす（Ｚｉｌｋａら、２００８；Ｋｏ
ｖａｃｅｃｈら、２０１０）。
タウの生理学的機能は、神経細胞の微小管ネットワークを構成する微小管へのチューブ
リン単量体の集合を媒介する際の機能である（Ｂｕｅｅら、２０００）。タウは、そのタ
ンパク質のＣ末端部分に位置する反復領域を通じて微小管に結合する。同上。これらのリ
ピートドメイン（Ｒ１〜Ｒ４）は、互いに同一ではないが、高度に保存された３１〜３２
アミノ酸を含む（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、２００５ｂ）。ヒトの脳には、タウの６つの独
特のアイソフォームが存在し、それらは、そのタンパク質のＣ末端における３つ（Ｒ１、
Ｒ３およびＲ４）または４つ（Ｒ１〜Ｒ４）のリピートドメインとともに、ある特定のア
ミノ酸がタウのＮ末端部分に存在する点または存在しない点において互いに異なる。６つ
のヒトアイソフォーム（２Ｎ４Ｒ、１Ｎ４Ｒ、２Ｎ３Ｒ、０Ｎ４Ｒ、１Ｎ３Ｒおよび０Ｎ
３Ｒ）を示している図１もまた参照のこと。微小管重合を誘導するタウの最も強力な部分
は、Ｒ１〜Ｒ２と一部重複する２７４−ＫＶＱＩＩＮＫＫ−２８１領域（配列番号１１３
）であることが提唱されている。同上。さらに、タウの病理学的機能および生理学的機能
は、完全長タンパク質アイソフォームおよびそれらのフラグメントがとる、特定の構造的
コンフォーメーションおよび天然無秩序構造に影響されるとみられる。例えば、Ｋｏｎｔ
ｓｅｋｏｖａらは、微小管の構築においてある特定の切断型タウ分子の機能に対して重要
な関係性を有するそれらの切断型タウ分子内のコンフォーメーションの領域（残基２９７
−ＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬ−３２５（配列番号１
１４）を含む）を記載した（ＷＯ２００４／００７５４７）。
タウリピートは、その生理学的役割に加えて、病理学的タウ凝集体および他の構造の形
成に関与すると考えられている。したがって、生理学的なリピート媒介性活性と病理学的
なリピート媒介性活性とを区別することができる、タウを標的にした治療および診断アプ
ローチが必要とされている。例えば、病理学的な対らせん状細線維（ＰＨＦ）のプロナー
ゼ耐性コアは、３−および４−リピートタウアイソフォームの微小管結合領域からなる（
Ｊａｋｅｓら、１９９１；Ｗｉｓｃｈｉｋら、１９８８ａ；Ｗｉｓｃｈｉｋら、１９８８
ｂ）。さらに、Ｎｏｖａｋらは、９３〜９５アミノ酸長であるＰＨＦのプロテアーゼ耐性
コアが３つのタンデムリピートに限定されることを示した（Ｎｏｖａｋら、１９９３）。
Ｖｏｎ Ｂｅｒｇｅｎらは、最小のタウペプチド／相互作用モチーフ（３０６−ＶＱＩＶ
ＹＫ−３１１；配列番号１１５）、ならびにベータシートを形成し、かつ病理学的タウ凝
集体であるＰＨＦの形成の開始に潜在的に関与すると記載されている、タウ上の第２の部
位（２７５−ＶＱＩＩＮＫ−２８０）（配列番号１１６）を決定した（Ｖｏｎ Ｂｅｒｇ
ｅｎら、２０００；ＥＰ１２１４５９８；ＷＯ２００１／１８５４６）。タウの機能マッ
プについては図２を参照のこと。その結果として、現在のストラテジーは、微小管の安定
化におけるタウの細胞内の役割を妨害しない抗凝集薬を作製することを目指している。
さらに、生理学的状況において、タウは、細胞内の細胞質タンパク質であると考えられ
ているが、細胞内のタウは、細胞外の空間に放出され得、神経変性に寄与し得る（Ｇｏｍ
ｅｚ−Ｒａｍｏｓら、２００６）。実際に、神経細胞の脱落は、ＡＤ脳において神経原線
維変化（タウタンパク質で構成されている）のトポグラフィック分布に関連している（Ｗ
ｅｓｔら、１９９４；Ｇｏｍｅｚ−Ｉｓｌａら、１９９６，１９９７）。さらに、総タウ
およびリン酸化タウのレベルは、ＡＤを有する患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中で上昇してお
り（Ｈａｍｐｅｌら、２０１０）、細胞外のタウは、脳において「ゴースト濃縮体」と記
載されており（Ｆｒｏｓｔ ａｎｄ Ｄｉａｍｏｎｄ，２００９）、それは、細胞内のタ
ウが細胞外の空間に放出されることを示唆している。さらに、細胞外のタウ凝集体は、細
胞に侵入し得、細胞内のタウの線維化を刺激し得、さらに、病理学的タウ凝集体を生成す
るためのタウ単量体を播種する（Ｆｒｏｓｔら、２００９）。そのような研究は、細胞外
の不溶性タウが、プリオン様の様式で脳全体にタウの病理を広げる伝播性の物質として作
用し得ることを強調した（Ｆｒｏｓｔら、２００９；Ｆｒｏｓｔ ａｎｄ Ｄｉａｍｏｎ
ｄ，２００９）。細胞外のタウ濃縮体のクリアランスは、タウに関連した細胞外および細
胞内の病理を減少させ得る。例えば、Ａｓｕｎｉら、２００７を参照のこと。ゆえに、そ
の形成を妨害すること、そのクリアランスを促進すること、またはその両方によって細胞
外のタウを減少させることができる処置、ならびに細胞内の疾患タウ（ｄｉｓｅａｓｅ
ｔａｕ）を減少させる処置が必要とされている。
概して言えば、タウは、ＡＤの臨床症状において病理学的な役割を果たすとみられるが
、タウに対して作用する薬物の開発は、生理学的な微小管の動態におけるタウの重要性お
よびその複合体の生物学的機能に部分的に起因して、手間取っている（Ｄｉｃｋｅｙ ａ
ｎｄ Ｐｅｔｒｕｃｅｌｌｉ，２００６）。しかしながら、タウの病理学的変換の基礎を
なす分子機序の理解の高まりは、治療目的のためにタウの病理学的改変を特異的に標的化
する可能性を開いた。結果として、タウカスケードを直接または間接的に標的化するいく
つかの治療的アプローチ（タウ凝集を妨げるかまたは逆転させる化合物（Ｗｉｓｃｈｉｋ
ら、１９９６；Ｎｅｃｕｌａら、２００５；Ｐｉｃｋｈａｒｄｔら、２００５；Ｔａｎｉ
ｇｕｃｈｉら、２００５ａ；Ｌａｒｂｉｇら、２００７）、タウキナーゼを阻害するかま
たはタウホスファターゼを活性化する小分子タイプの薬物（Ｉｑｂａｌ ａｎｄ Ｇｒｕ
ｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌ，２００４；Ｎｏｂｌｅら、２００５；Ｉｑｂａｌ ａｎｄ Ｇｒ
ｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌ，２００７）、微小管安定化薬（Ｚｈａｎｇら、２００５）、ミ
スフォールドされたタウタンパク質のタンパク分解性の分解を促す薬物（Ｄｉｃｋｅｙら
、２００５，Ｄｉｃｋｅｙら、２００６；Ｄｉｃｋｅｙ ａｎｄ Ｐｅｔｒｕｃｅｌｌｉ
，２００６）および免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｉｖｅ）薬（Ｚｉｌｋａら、
２００８）、ならびに能動免疫および受動免疫を含む免疫療法ストラテジー（Ｓｃｈｎｅ
ｉｄｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｄｅｌｋｏｗら、２００８；Ｚｉｌｋａら、２００８：Ｔａｂ
ｉｒａ，Ｔ．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ
ｄｉｓｅａｓｅ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｃｔｉｖ
ｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．，２２０：９５−１０６（２０１０）を含む）が出現した（総論として、例えば、
Ｄｉｃｋｅｙ ａｎｄ Ｐｅｔｒｕｃｅｌｌｉ，２００６；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ａｎｄ
Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ，２００８；Ｚｉｌｋａら、２００８を参照のこと）。
より一般的には、新規モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、２００７年以来、１年あたり
４０を超える割合で臨床研究に入っている。２０１０年の終わりには、少なくとも２５個
のｍＡｂおよび５つのＦｃ融合タンパク質が、米国において第２／３相または第３相臨床
研究中だった（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，２０１１）。この傾向は、受動免疫療法が、ＡＤを含
むヒト障害の処置において高まりつつあるアプローチであることを証明している。例えば
、Ｃｉｔｒｏｎら、２０１０を参照のこと。実際には、ＡＤの処置は、血液脳関門（ＢＢ
Ｂ）の克服の点でハードルに直面しているが、ますます多くの前臨床および臨床研究が、
抗体媒介性治療によってＡＤ凝集体が脳から取り除かれ得ることを報告しており、複数の
作用機序（例えば、（ｉ）ＡＤにおける変更されたＢＢＢ透過性、またはＢＢＢ漏出によ
る脳への抗体の取り込み；（ｉｉ）可溶性の斑形成アミロイド種に対して「末梢シンク（
ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｓｉｎｋ）」として作用する抗体；（ｉｉｉ）末梢から脳に抗体
を局所的に送達する抗体分泌細胞の進入；ならびに（ｉｖ）細胞内のおよび細胞を越えた
ＩｇＧの輸送）を提唱している。例えば、概説として、Ｃｉｔｒｏｎら、２０１０および
Ａｓｕｎｉら、２００７を参照のこと。したがって、疾患形態のタウを標的化する治療用
抗体は、ＡＤおよび他のタウオパチーの処置および／または診断に対して見込みのあるア
プローチである（ＷＯ２００４／００７５４７、ＵＳ２００８／００５０３８３）。
タウの病理を標的化する免疫療法アプローチのうちの１つは、抗タウ抗体が、タウ凝集
を妨げ得ること、タウ凝集体を取り除き得ること、またはその両方の概念に基づく。研究
によって、タウ配列に結合する抗体が報告されており、それらの抗体のいくつかが、タウ
の凝集およびクリアランスを干渉すると報告されているが（Ａｓｕｎｉら、２００７）、
未だに、ＡＤにおけるインビボの前臨床または臨床試験を行っているモノクローナル抗タ
ウ抗体は、報告されていない。実際は、１つのｍＡｂが、マウスのタウの微小管結合ドメ
インに（すなわち、Ｒ３、Ｒ４およびおそらくＲ１に）３つの結合部位を有すると予想さ
れたが、それは、微小管結合を阻止しなかった（Ｄｉｎｇｕｓら、１９９１）。Ｄｉｎｇ
ｕｓは、タウ凝集におけるこの抗体が果たす役割を記載しなかったので、そのＤｉｎｇｕ
ｓの抗体がタウ凝集を阻止すると考える理由はない。他の報告では、タウアイソフォーム
を区別するｍＡｂが作製されたが、再度、これらは、タウ凝集に対していかなる影響も有
しないと示唆されている（ＤｅＳｉｌｖａら、２００３；Ｕｅｎｏら、２００７）。Ｔａ
ｎｉｇｕｃｈｉらは、Ｒ１またはＲ２に対するある特定の抗タウｍＡｂが、タウによって
誘導されるチューブリンの集合を促進しつつ、インビトロにおいてＰＨＦへのタウ凝集を
阻害することを証明した（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、２００５ｂ）。Ｔａｎｉｇｕｃｈｉの
ＲＴＡ−１およびＲＴＡ−２抗体は、それぞれＲ１およびＲ２に特異的に結合した。どち
らの抗体も２つもしくはそれより多くのタウリピートには結合せず、タウの凝集またはク
リアランスに対するインビボにおける効果が試験されたとは報告されなかった。ＡＤの受
動免疫ベースの治療（すなわち、患者に抗体を投与する治療）のための臨床試験において
少なくとも３つの抗アミロイド抗体が存在したにもかかわらず、ＡＤに対するタウベース
の受動免疫療法に関する臨床試験の報告は未だ入手可能でない。
能動免疫アプローチ（すなわち、患者の身体自体が、標的に対する免疫を起こすアプロ
ーチ）が、ＡＤのいくつかのＡＰＰトランスジェニックマウス研究においてＡβ沈着物を
取り除く際および神経病理学的病変を逆転させる際に有効であると見出された（例えば、
Ｓｃｈｅｎｋら、１９９９；Ｊａｎｕｓら、２０００；Ｍｏｒｇａｎら、２０００；Ｓｉ
ｇｕｒｄｓｓｏｎら、２００１を参照のこと）。最近、リン酸化タウエピトープ（Ｔａｕ
３７９−４０８［Ｐ−Ｓｅｒ３９６、４０４］）を用いた能動免疫療法は、脳における凝
集されるタウの程度を低下させ、タウ濃縮体病理のマウスモデルにおいて行動上の表現型
の進行を遅らせた（Ａｓｕｎｉら、２００７；Ｂｏｕｔａｊａｎｇｏｕｔら、２０１０；
ＵＳ２００８／００５０３８３；ＵＳ／２０１０／００３１６５６４）。処置された動物
は、抗タウ抗体を産生し、その抗体は、脳において検出され、病理学的タウを認識する抗
体と共局在した（Ａｓｕｎｉら、２００７）。この免疫療法アプローチは、その動物にお
いて後期（８ヶ月）よりも初期（５ヶ月）の機能障害において実質的に有効だったことか
ら、初期の病理学的タウのクリアランスが治療的に有益であり得ることが示唆される（Ａ
ｓｕｎｉら、２００７；Ｚｉｌｋａら、２００８）。実際に、すべてのタウが、破壊およ
びクリアランスに感受性であるわけではないか、またはおそらくそれらに適してさえいな
いという認識が存在する。一部では、タウ凝集体の破壊によって、毒性の中間体種の存在
量が増加し得ると示唆されているが、他では、検出可能なタウ凝集体が、必ずしも毒性で
なく、保護的な役割をも果たし得ることが示唆されている（Ｌｅｅら、２００５）。した
がって、タウを標的化する免疫療法アプローチが、前臨床の裏付けを示したが、なおも、
初期の異常型のタウ（その消失は、永続する改善される利点をもたらす）を特異的に標的
化する治療法が必要とされている。それでもなお、免疫療法のための好適な標的であるタ
ウ種を同定することもまた必要とされている。
この目的を達成するために、タウに対するｍＡｂを開発するために考慮すべき別の点は
、標的化される、様々な構造形態のタウ（生理学的、初期疾患、後期疾患）およびタウの
病理のステージの同定および特徴付けである。Ｏｄｄｏらは、Ａβ免疫療法が、ＡＤのト
ランスジェニックマウスモデルにおけるＡβ斑および初期タウ病理を取り除くが、成熟タ
ウ凝集体はインタクトなままであることを観察した（Ｏｄｄｏら、２００４）。同様に、
神経原線維変化が蓄積し続けていたとしても、タウオパチーのＰ３０１Ｌタウモデルにお
けるタウ発現の遺伝的な（免疫療法によるものではない）減少が記憶を改善した（Ｓａｎ
ｔａｃｒｕｚら、２００５）。
その有病率にもかかわらず、ＡＤには、神経学の最も大きい満たされていない医学的ニ
ーズが残っている（Ｃｉｔｒｏｎ，２０１０；非特許文献１）。最も広く行われている医
学的アプローチは、処置の数年後には効果的でなくなる対症療法を提供することである。
ＡＤに対する新しい治療的アプローチおよびストラテジーは、認知低下を防ぎ、かつその
疾患の基本的な病理学的プロセスを抑制するために、症状の処置を上回る必要がある。特
に、単独でまたはＡＤを標的とする他の薬物と併用して、その疾患の最も早いステージの
少なくともいくつかを干渉する分子を開発する必要がある。そのような分子は、ＡＤの早
期診断（それ自体が処置の成果を改善し得る）、予防および処置において新しい有利な選
択肢を提供するだろう。
Citron, M. (2010). Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nature Rev Drug Discovery 9, 387-398.
発明の要旨
１つの実施形態において、本発明は、単離された抗体を提供し、ここで、その抗体は、
１つもしくは複数のタウエピトープに結合し、以下：
ａ）生理学的タウよりも病理学的タウに対してより高い親和性を示すこと；
ｂ）タウ−タウ凝集を阻害すること；ならびに
ｃ）ミクログリアによる病理学的タウタンパク質の取り込みおよび分解を媒介すること
のうちの２つもしくはそれより多くが可能であり；
各タウエピトープは、タウの凝集促進領域を含む。
ある実施形態において、この単離された抗体は、１つもしくは複数のエピトープの各々
が、独立して、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６７〜２７３位または残基ＫＨＱＰＧＧＧ（配列番号９８）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９８〜３０４位または残基ＫＨＶＰＧＧＧ（配列番号９９
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３２９〜３３５位または残基ＨＨＫＰＧＧＧ（配列番号１
００）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６１〜３６７位または残基ＴＨＶＰＧＧＧ（配列番号１０
１）
内のエピトープから選択されるような抗体である。
ある特定の実施形態において、先のパラグラフの実施形態に記載された特性を有する単
離された抗体は、ヒトアルツハイマー病患者の脳生検材料、アルツハイマー病の動物モデ
ル由来の脳サンプル、またはその両方における、誤秩序（ｍｉｓｏｒｄｅｒｅｄ）タウ、
誤無秩序タウ、サルコシル不溶性タウ、神経原線維変化、糸屑状構造物（ｎｅｕｒｏｐｉ
ｌ ｔｈｒｅａｄｓ）および老人斑から選択される病理学的タウの１つもしくは複数の形
態に結合することができる。ある特定の実施形態において、単離された抗体は、それが認
識するエピトープの少なくとも１つがコンフォーメーションエピトープであるような抗体
である。
１つの実施形態において、本発明は、単離された抗体を提供し、ここで、その抗体は、
１つもしくは複数のタウエピトープに結合し、以下：
ａ）生理学的タウよりも病理学的タウに対してより高い親和性を示すこと；
ｂ）タウ−タウ凝集を阻害すること；ならびに
ｃ）ミクログリアによる病理学的タウタンパク質の取り込みおよび分解を媒介すること
のうちの２つもしくはそれより多くが可能であり；
各タウエピトープは、タウの凝集促進領域を含む。
ある実施形態において、この単離された抗体は、１つもしくは複数のエピトープの各々
が、独立して、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６８〜２７３位または残基ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９９〜３０４位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３３０〜３３５位または残基ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２
４）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６２〜３６７位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
内のエピトープから選択されるような抗体である。
ある実施形態において、この単離された抗体は、それが結合する１つもしくは複数のエ
ピトープの各々が、独立して、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６８〜２７３位または残基ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９９〜３０４位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３３０〜３３５位または残基ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２
４）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６２〜３６７位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
内のエピトープから選択されるような抗体であり；その抗体は：
ａ）
ｉ．ＣＤＲ１に対してＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号１１７）または配列番号２４
７；
ｉｉ．ＣＤＲ２に対してＷＡＳ（配列番号１１８）または配列番号２５３；および
ｉｉｉ．ＣＤＲ３に対してＫＱＳＦＹＬＲＴ（配列番号１１９）または配列番号２５５、
２５７、２５８、２５９および２６０のうちのいずれか１つ
を含む抗体軽鎖可変領域；ならびに
ｂ）
ｉｖ．ＣＤＲ１に対してＧＹＩＦＴＤＹＶＩＳ（配列番号１２０）、配列番号２６１また
は配列番号２６２；
ｖ．ＣＤＲ２に対してＩＦＰＲＳＧＳＴ（配列番号１２１）、配列番号２６４または配列
番号２６５；および
ｖｉ．ＣＤＲ３に対してＡＲＤＹＹＧＴＳＦＡＭＤＹ（配列番号１２２）、配列番号２６
６、配列番号２６７または配列番号２６９
を含む抗体重鎖可変領域
を含む。
本発明は、コンフォーメーションに特異的な様式でタウ上の１つもしくは複数のエピト
ープに結合する単離された抗体も提供し、ここで：
ａ）その１つもしくは複数のエピトープの各々は、独立して、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６７〜２７３位または残基ＫＨＱＰＧＧＧ（配列番号９８）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９８〜３０４位または残基ＫＨＶＰＧＧＧ（配列番号９９
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３２９〜３３５位または残基ＨＨＫＰＧＧＧ（配列番号１
００）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６１〜３６７位または残基ＴＨＶＰＧＧＧ（配列番号１０
１）
内のエピトープから選択され；
ｂ）それらのエピトープの０、１、２または３個は、線状エピトープであり；
ｃ）それらのエピトープの１、２、３または４個は、コンフォーメーションエピトープで
ある。
本発明は、コンフォーメーションに特異的な様式でタウ上の１つもしくは複数のエピト
ープに結合する単離された抗体も提供し、ここで：
ａ）その１つもしくは複数のエピトープの各々は、独立して、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６８〜２７３位または残基ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９９〜３０４位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３３０〜３３５位または残基ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２
４）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６２〜３６７位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
内のエピトープから選択され、
ｂ）それらのエピトープの０、１、２または３個は、線状エピトープであり；
ｃ）それらのエピトープの１、２、３または４個は、コンフォーメーションエピトープで
ある。
１つの実施形態において、この抗体は、ＤＣ８Ｅ８であり、ここで、ＤＣ８Ｅ８は、Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｄ
ｅｐｏｓｉｔ ｎｏ．ＰＴＡ−１１９９４として寄託されたハイブリドーマによって産生
される抗体である。
ある特定の実施形態において、単離された抗体は、ＤＣ８Ｅ８によって結合されるエピ
トープと同じタウ上のエピトープの１つもしくは複数に結合する。ある実施形態において
、単離された抗体は、タウへの結合についてモノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８と競合する。
本発明は、単離された抗体であって、
ｉ．ＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号１１７）
ｉｉ．ＷＡＳ（配列番号１１８）
ｉｉｉ．ＫＱＳＦＹＬＲＴ（配列番号１１９）
ｉｖ．ＧＹＩＦＴＤＹＶＩＳ（配列番号１２０）
ｖ．ＩＦＰＲＳＧＳＴ（配列番号１２１）；および
ｖｉ．ＡＲＤＹＹＧＴＳＦＡＭＤＹ（配列番号１２２）
から選択される１つもしくは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を該抗体のエピトープ
結合ドメインに含む単離された抗体も提供する。
本発明は、前述のパラグラフに記載されたいずれかの実施形態に記載されたいずれの抗
体も、単離された抗体が、
ａ）
ｉ．ＣＤＲ１に対してＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号１１７）；
ｉｉ．ＣＤＲ２に対してＷＡＳ（配列番号１１８）；および
ｉｉｉ．ＣＤＲ３に対してＫＱＳＦＹＬＲＴ（配列番号１１９）
を含む抗体軽鎖可変領域；ならびに
ｂ）
ｉｖ．ＣＤＲ１に対してＧＹＩＦＴＤＹＶＩＳ（配列番号１２０）
ｖ．ＣＤＲ２に対してＩＦＰＲＳＧＳＴ（配列番号１２１）；および
ｖｉ．ＣＤＲ３に対してＡＲＤＹＹＧＴＳＦＡＭＤＹ（配列番号１２２）
を含む抗体重鎖可変領域
を含むような抗体であり得ることも提供する。
本発明は、先の実施形態に記載されたいずれの抗体も、単離された抗体が
ａ）モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８由来の軽鎖ＣＤＲの１つもしくは複数の配列、または
これらの軽鎖ＣＤＲのうちの１つとの最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、９
０％または９５％の同一性を有する１つもしくは複数の配列；および
ｂ）モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８由来の重鎖ＣＤＲの１つもしくは複数の配列、または
これらの重鎖ＣＤＲのうちの１つとの最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、９
０％または９５％の同一性を有する１つもしくは複数の配列
を含み；
ｉ．その軽鎖ＣＤＲは、ＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号１１７）、ＷＡＳ（配列番
号１１８）およびＫＱＳＦＹＬＲＴ（配列番号１１９）から選択される配列を含み；
ｉｉ．その重鎖ＣＤＲは、ＧＹＩＦＴＤＹＶＩＳ（配列番号１２０）、ＩＦＰＲＳＧＳＴ
（配列番号１２１）およびＡＲＤＹＹＧＴＳＦＡＭＤＹ（配列番号１２２）から選択され
る配列を含む
ような抗体であり得ることも提供する。
本発明は、先の実施形態に記載されたいずれの抗体も、以下の免疫学的結合特性：
１．その抗体は、コンフォーメーションに特異的な様式で１つもしくは複数のタウエピト
ープに結合する（ここで：
ａ）その１つもしくは複数のタウエピトープの各々は、独立して、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６７〜２７３位または残基ＫＨＱＰＧＧＧ（配列番号９８）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９８〜３０４位または残基ＫＨＶＰＧＧＧ（配列番号９９
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３２９〜３３５位または残基ＨＨＫＰＧＧＧ（配列番号１
００）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６１〜３６７位または残基ＴＨＶＰＧＧＧ（配列番号１０
１）
内のエピトープから選択され；
ｂ）それらのエピトープの０、１、２または３個は、線状エピトープであり；
ｃ）それらのエピトープの１、２、３または４個は、コンフォーメーションエピトープで
ある）；
２．その抗体は、２つもしくはそれより多くのタウエピトープに結合し、生理学的タウよ
りも病理学的タウに対してより高い親和性を示すことができる（ここで、その２つのタウ
エピトープは、
ｖ．ｔａｕ４４１に対して２６７〜２７３位または残基ＫＨＱＰＧＧＧ（配列番号９８）
；
ｖｉ．ｔａｕ４４１に対して２９８〜３０４位または残基ＫＨＶＰＧＧＧ（配列番号９９
）
ｖｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３２９〜３３５位または残基ＨＨＫＰＧＧＧ（配列番号１
００）；および
ｖｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３６１〜３６７位または残基ＴＨＶＰＧＧＧ（配列番号
１０１）
内のエピトープから選択される）
のうちの１つもしくは複数を有する、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆ
ｖフラグメント、他の任意の抗原結合フラグメント；またはその抗原結合抗体部分からな
り得るかまたはそれらを含み得ることも提供する。
本発明は、先の実施形態に記載されたいずれの抗体も、以下の免疫学的結合特性：
１．その抗体は、コンフォーメーションに特異的な様式で１つもしくは複数のタウエピト
ープに結合する（ここで：
ａ）その１つもしくは複数のタウエピトープの各々は、独立して、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６８〜２７３位または残基ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９９〜３０４位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３３０〜３３５位または残基ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２
４）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６２〜３６７位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
内のエピトープから選択され、
ｂ）それらのエピトープの０、１、２または３個は、線状エピトープであり；
ｃ）それらのエピトープの１、２、３または４個は、コンフォーメーションエピトープで
ある）；
２．その抗体は、２つもしくはそれより多くのタウエピトープに結合し、生理学的タウよ
りも病理学的タウに対してより高い親和性を示すことができる（ここで、その２つのタウ
エピトープは、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６８〜２７３位または残基ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９９〜３０４位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３３０〜３３５位または残基ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２
４）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６２〜３６７位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
内のエピトープから選択される）
のうちの１つもしくは複数を有する、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆ
ｖフラグメント、他の任意の抗原結合フラグメント；またはその抗原結合抗体部分からな
り得るかまたはそれらを含み得ることも提供する。
本発明は、先の実施形態に記載された任意の単離された抗体に対して競合してタウに結
合する任意の単離された抗体にも関する。１つの実施形態において、その単離された抗体
は、タウへの結合について単離されたＤＣ８Ｅ８に対して試験されたとき、競合してタウ
に結合する。
いくつかの実施形態において、上記抗体は、配列番号１４１を含む軽鎖を含む。いくつ
かの実施形態において、上記抗体は、配列番号１３８を含む軽鎖を含む。いくつかの実施
形態において、上記抗体は、配列番号１４１を含む軽鎖および配列番号１３８を含む軽鎖
を含む。
本発明は、本発明によって提供される抗体が、
ａ）モノクローナル抗体；
ｂ）ポリクローナル抗体；
ｃ）組換え抗体；
ｄ）キメラ抗体；
ｅ）ヒト化抗体；
ｆ）ヒト抗体；および
ｇ）（ａ）から（ｆ）のいずれか１つの抗原結合フラグメントまたは抗原結合部分
から選択され得ることを提供する。
本発明によって提供される任意の単離された抗体は、哺乳動物において産生され得る。
ある特定の実施形態において、単離された抗体は、組換え動物または組換え宿主細胞によ
って産生される。
本発明は、本明細書中に提供される任意の単離された抗タウ抗体が、それらが１つもし
くは複数の標識剤で検出可能に標識されるような抗体であり得ることを提供する。ある特
定の実施形態において、少なくとも１つの標識剤は、酵素、放射性同位体、フルオロフォ
ア、核磁気共鳴マーカーおよび重金属から選択される。
いくつかの実施形態において、上記抗体は、その抗体分子に結合された少なくとも１つ
の薬物（併用剤（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ））を含む。
本発明は、少なくとも１つのＣＤＲ、または少なくとも、先の実施形態に記載された任
意の抗タウ抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメインもしくは可変領域をコードする単離さ
れた核酸も提供する。それらの任意の核酸を含む単離されたベクターも提供される。いく
つかの実施形態において、本発明は、これらの単離された核酸およびベクターの１つもし
くは複数を含む単離された宿主細胞を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、先の実施形態に記載された任意の抗タウ抗体
を発現する単離された細胞系を提供する。１つの実施形態において、単離された細胞系は
、ハイブリドーマである。１つの実施形態において、単離された細胞系は、モノクローナ
ル抗体ＤＣ８Ｅ８を産生するハイブリドーマであり、その細胞系は、２０１１年７月１３
日にＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＰＴＡ−１１
９９４としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍ
ａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡに寄託されている。
本発明は、薬物としての、またはアルツハイマー病もしくは関連タウオパチーの診断、
予防もしくは処置のための医薬の製造における、本明細書中に提供される任意の抗タウ抗
体、核酸および細胞の使用を提供する。
いくつかの実施形態において、上記抗体は、薬学的に許容され得るキャリアおよび／ま
たは希釈剤をさらに含む薬学的組成物中に含められる。１つの実施形態において、その薬
学的組成物は、抗体の組み合わせ、ならびに薬学的に許容され得るキャリアおよび／また
は希釈剤を含み、ここで、その組み合わせは、少なくとも２つの異なる抗体を含み、それ
らの抗体の各々は、独立して、先の実施形態に記載された抗体から選択される。１つの実
施形態において、上記抗体の少なくとも１つは、ＤＣ８Ｅ８またはＤＣ８Ｅ８のヒトバー
ジョンまたはＤＣ８Ｅ８のヒト化バージョンである。
いくつかの実施形態において、上記抗体は、希釈剤および／またはキャリアをさらに含
む組成物中に含められる。その組成物は、薬学的組成物、診断用組成物または他の任意の
組成物であり得る。いくつかの実施形態において、その組成物は、検出可能な標識、キー
ホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイドまたは他の病原菌に由来するトキソイ
ド、血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン分子またはそのフラグメント
、チログロブリン、オボグロブリン、ユニバーサルＴ細胞エピトープ、サイトカイン、ケ
モカイン、インターロイキン１−アルファ（ＩＬ−１α）、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ
−１０、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激
因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ１α）、Ｍ
ＩＰ１βおよびＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，
ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）から選
択される少なくとも１つの化合物または剤（ａｇｅｎｔ）をさらに含み得る。
本発明は、包装材料、および凍結乾燥された形態の本明細書中に提供される抗タウ抗体
のいずれか１つもしくは複数の溶液を含む容器を備える、薬学的にまたは診断に使用する
ための製造品（例えば、キット）も提供する。ある特定の実施形態において、その容器は
、被験体にその抗体を送達するためのデバイスまたはシステムの構成要素である。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中に提供されるような抗タウ抗体（
上記を参照のこと）を備える医療用デバイスを提供し、ここで、そのデバイスは、非経口
、皮下、筋肉内、静脈内、関節内（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）、気管支内、腹腔内（
ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）
、体腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、髄腔内、結腸内、頸管内、胃内
、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）
、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液包内、胸内、子宮内
、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内および経皮から選択される
少なくとも１つの様式によるその抗体の接触または投与に適している。
１つの実施形態において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病または関連タウ
オパチーの進行を処置するまたは予防する方法に関し、その方法は、有効量の本明細書中
に提供される抗タウ抗体の少なくとも１つを前記被験体に投与する工程を包含する。いく
つかの実施形態において、その方法は、運動障害（ｍｏｔｏｒ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）
を減少させることができる、運動機能を改善することができる、認知障害を減少させるこ
とができる、認知機能を改善することができる、またはそれらの組み合わせが可能である
。
ある特定の実施形態において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病または関連
タウオパチーに関連する症状の少なくとも１つを回復させる方法に関し、その方法は、有
効量の本明細書中に提供される抗タウ抗体の少なくとも１つを前記被験体に投与する工程
を包含する。
なおも別の実施形態において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病もしくは関
連タウオパチーの存在について被験体を診断するもしくはスクリーニングする方法、また
はアルツハイマー病もしくは関連タウオパチーの発症についての被験体のリスクを測定す
るための方法を提供し、その方法は：
ａ）その被験体、またはその被験体の細胞、組織、器官、体液もしくは他の任意のサンプ
ルを、有効量の本明細書中に提供されるような少なくとも１つの抗タウ抗体と接触させる
工程；および
ｂ）病理学的タウおよびその抗体を含む複合体の存在を判定する工程（ここで、その複合
体の存在は、病理学的タウの存在に関連するアルツハイマー病または関連タウオパチーの
診断となる）
を包含する。
関連する実施形態において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病もしくは関連
タウオパチーの存在、進行、後退もしくは安定化について被験体をモニターする方法、ま
たは被験体におけるアルツハイマー病もしくは関連タウオパチーのステージを判定するた
めの方法を提供し、その方法は：
ａ）その被験体、またはその被験体の細胞、組織、器官、体液もしくは他の任意のサンプ
ルを、有効量の本明細書中に提供される抗タウ抗体の少なくとも１つと接触させる工程；
および
ｂ）病理学的タウおよびその抗体を含む複合体の存在および／または特徴を判定する工程
（ここで、その複合体の存在は、病理学的タウの存在に関連するアルツハイマー病または
関連タウオパチーの診断となる）
を包含する。
いくつかの実施形態において、上記抗体は、静脈内に、筋肉内に、皮下に、腹腔内に、
鼻腔内に、脳室内に、髄腔内に、またはエアロゾルとして、投与される。
被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーの進行を処置するまたは予防
する方法、および被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーに関連する症
状の少なくとも１つを回復させる方法のいくつかの実施形態において、各抗体の有効量は
、１投薬あたり被験体の体重１ｋｇあたり少なくとも１ｍｇである。いくつかの実施形態
において、各抗体の有効量は、１投薬あたり被験体の体重１ｋｇあたり少なくとも１０ｍ
ｇである。いくつかの実施形態において、上記抗体の少なくとも１つは、少なくとも６ヶ
月間にわたって複数の投薬量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓａｇｅｓ）で投与される。いく
つかの実施形態において、上記抗体は、その有益な効果を発揮するためにヒト被験体の末
梢に投与される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、ヒト被験体の末梢に投与さ
れたとき、可溶性タウ、サルコシル不溶性タウまたはその両方に結合する。いくつかの実
施形態において、上記抗体は、ヒト被験体の末梢に投与されたとき、タウに結合し、ここ
で、タウは、ヒトアルツハイマー病患者の脳生検材料おける、アルツハイマー病の動物モ
デル由来の脳サンプルおける、誤秩序タウ、誤無秩序タウ、サルコシル不溶性タウ、神経
原線維変化、糸屑状構造物および老人斑から選択される１つもしくは複数の病理学的形態
である。いくつかの実施形態において、上記抗体は、ヒト被験体の末梢に投与されたとき
、その被験体に対して１つもしくは複数の、エフェクター機能によって媒介される有益な
効果を発揮する。いくつかの実施形態において、上記抗体は、被験体の脳への抗体発現細
胞の注射／埋め込みによって末梢に送達される。いくつかの実施形態において、その抗体
発現細胞は、ハイブリドーマ細胞である。いくつかの実施形態において、そのハイブリド
ーマ細胞は、ＤＣ８Ｅ８を発現するハイブリドーマである。
ある特定の関連する実施形態において、本発明は、単離されたペプチドを提供し、ここ
で：
ａ）その単離されたペプチドは、少なくとも６アミノ酸残基長、少なくとも７アミノ酸残
基長、少なくとも９アミノ酸残基長、少なくとも１０アミノ酸残基長、少なくとも１２ア
ミノ酸残基長または３０アミノ酸残基長であるタウのフラグメントであり；
ｂ）その単離されたペプチドは、タウ治療用エピトープを含む。
いくつかの関連する実施形態において、上記治療用エピトープは、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６７〜２７３位または残基ＫＨＱＰＧＧＧ（配列番号９８）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９８〜３０４位または残基ＫＨＶＰＧＧＧ（配列番号９９
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３２９〜３３５位または残基ＨＨＫＰＧＧＧ（配列番号１
００）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６１〜３６７位または残基ＴＨＶＰＧＧＧ（配列番号１０
１）
内のエピトープから選択される治療用エピトープを含む。
ある特定の関連する実施形態において、本発明は、単離されたペプチドを提供し、ここ
で：
ａ）その単離されたペプチドは、少なくとも６アミノ酸残基長、少なくとも７アミノ酸残
基長、少なくとも９アミノ酸残基長、少なくとも１０アミノ酸残基長、少なくとも１２ア
ミノ酸残基長または３０アミノ酸残基長であるタウのフラグメントであり；
ｂ）その単離されたペプチドは、タウ治療用エピトープを含む。
いくつかの関連する実施形態において、上記治療用エピトープは、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６８〜２７３位または残基ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９９〜３０４位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３３０〜３３５位または残基ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２
４）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６２〜３６７位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
内のエピトープから選択される治療用エピトープを含む。
いくつかの関連する実施形態において、上記治療用エピトープは、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６８〜２７３位または残基ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９９〜３０４位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３３０〜３３５位または残基ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２
４）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６２〜３６７位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
から選択される。
他の実施形態において、単離されたペプチドは、配列番号１〜４、配列番号９〜１０１
および配列番号１０８〜１１２、ＮＩＫＡＶＰＧＧＧＳ（配列番号２００）、ＮＩＫＨＶ
ＰＧＧＧＳ（配列番号２０１）、ＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号２０２）、ＫＨＶＰＧＧ
ＧＳＶ（配列番号２０３）、ＨＶＰＧＧＧＳＶＱ（配列番号２０４）、ＶＰＧＧＧＳＶＱ
（配列番号２０５）、ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５０）、ＳＶＦＱＨＬＰＧ
ＧＧＳＣ（配列番号２５１）、ＡＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４４）、ＤＡＩＫＨ
ＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４６）、ＤＮＡＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４９）、ＤＮＩ
ＡＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１５１）、ＤＮＩＫＡＶＰＧＧＧＳ（配列番号１５９）、Ｄ
ＮＩＫＨＡＰＧＧＧＳ（配列番号１６１）およびＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１７
１）から選択される配列である。
他の実施形態において、単離されたペプチドは、配列番号２７０（ＴＥＮＬＫＨＱＰＧ
ＧＧＫ）；配列番号２７１（ＫＨＱＰＧＧＧ）、配列番号２７２（ＨＱＰＧＧＧ）；配列
番号２７５（ＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩ
ＫＨＶＰＧＧＧＳ）、配列番号２７６（ＫＨＶＰＧＧＧ）、配列番号２７７（ＨＶＰＧＧ
Ｇ）、配列番号２８０（ＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶ）、配列番号２８１（
ＨＨＫＰＧＧＧ）、配列番号２８２（ＨＫＰＧＧＧ）および配列番号２８３（ＴＨＶＰＧ
ＧＧ）から選択される配列である。
他の実施形態において、単離されたペプチドは、配列番号２７０（ＴＥＮＬＫＨＱＰＧ
ＧＧＫ）；配列番号２７１（ＫＨＱＰＧＧＧ）、配列番号２７２（ＨＱＰＧＧＧ）；配列
番号２７５（ＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩ
ＫＨＶＰＧＧＧＳ）、配列番号２７６（ＫＨＶＰＧＧＧ）、配列番号２７７（ＨＶＰＧＧ
Ｇ）、配列番号２８０（ＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶ）、配列番号２８１（
ＨＨＫＰＧＧＧ）、配列番号２８２（ＨＫＰＧＧＧ）および配列番号２８３（ＴＨＶＰＧ
ＧＧ）から選択される配列であり；上記治療用エピトープは、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６８〜２７３位または残基ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９９〜３０４位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３３０〜３３５位または残基ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２
４）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６２〜３６７位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
から選択される。
他の実施形態において、単離されたペプチドは、配列番号２７２（ＨＱＰＧＧＧ）およ
び配列番号２７７（ＨＶＰＧＧＧ）から選択される配列である。
ある特定の実施形態において、単離されたペプチドは、そのペプチドの：
ａ）モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８への結合についてタウと競合する能力；
ｂ）インビボにおいてサルコシル不溶性タウのレベルを減少させる能力；
ｃ）インビボにおいて脳からのタウのクリアランスを促進する能力；
ｄ）インビボにおいてＡＤの少なくとも１つの生化学的マーカーのレベルを減少させる能
力；
ｅ）インビボにおいて神経原線維変化（ＮＦＴ）の量（ｌｏａｄ）を減少させる能力；
ｆ）インビボにおいて少なくとも１つの神経行動学的パラメータを改善する能力；
ｇ）被験体におけるＡＤの経過を有利に改変する能力；
ｈ）脳、脳脊髄液もしくはその両方におけるタウのレベルを減少させる能力；および／ま
たは
ｉ）タウへの結合についてモノクローナルＤＣ８Ｅ８と競合することができる抗体の作製
において免疫原として働く能力
を測定するアッセイから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて活性である。
本発明は、本明細書中に提供される任意の単離されたペプチドおよびある部分を含む化
合物にも関する。ある特定の実施形態において、その部分は、上記ペプチドのＮ末端であ
るか、Ｃ末端であるか、または該ペプチドの内部のアミノ酸に連結されており、その部分
は、システイン残基、ホスホ基、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイド
または他の病原菌に由来するトキソイド、血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、免疫グ
ロブリン分子またはそのフラグメント、チログロブリン、オボグロブリン、ユニバーサル
Ｔ細胞エピトープ、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン１−アルファ（ＩＬ−
１α）、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）
、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ炎症性タン
パク質１アルファ（ＭＩＰ１α）、ＭＩＰ１βおよびＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）のうちの１つもしくは複数から選択される。
本発明によって提供される単離されたペプチドおよび／または化合物の１つもしくは複
数、ならびに薬学的に許容され得るキャリアおよび／または希釈剤および／またはアジュ
バントを含む薬学的組成物も提供される。いくつかの実施形態において、その薬学的組成
物は、１ｎｇ〜１０ｍｇの投与量のペプチドまたは化合物を提供するように適合されてい
る。ある特定の実施形態において、その薬学的組成物は、１０マイクログラムより多い投
与量のペプチドまたは化合物を提供するように適合されている。
本発明は、包装材料、ならびに凍結乾燥された形態の本発明によって提供されるペプチ
ドおよび／または化合物の溶液を含む容器を備える、薬学的にまたは診断に使用するため
の製造品（例えば、キット）にも関する。いくつかの実施形態において、その容器は、被
験体にそのペプチドまたは化合物を送達するためのデバイスまたはシステムの構成要素で
ある。
本発明によって提供されるようなペプチド、化合物および／またはペプチド／化合物組
成物を備える医療用デバイスも提供され、ここで、そのデバイスは、非経口、皮下、筋肉
内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内
、髄腔内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸
膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液包内、胸内、子宮内、膀
胱内、病巣内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内および経皮から選択される少な
くとも１つの様式によるその抗体の接触または投与に適している。
関連する実施形態において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病または関連タ
ウオパチーの進行を処置するまたは予防する方法を提供し、その方法は、有効量の本発明
によって提供されるような少なくとも１つのペプチドおよび／または少なくとも１つの化
合物を前記被験体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その方法は
、運動障害を減少させることができる、運動機能を改善することができる、認知障害を減
少させることができる、認知機能を改善することができる、またはそれらの組み合わせが
可能である。
関連する実施形態において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病または関連タ
ウオパチーに関連する症状の少なくとも１つを回復させる方法を提供し、その方法は、有
効量の本発明によって提供されるような少なくとも１つのペプチドおよび／または少なく
とも１つの化合物を前記被験体に投与する工程を包含する。
被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーに関連する症状の少なくとも
１つを回復させる方法に関連する症状の少なくとも１つの処置、予防または回復のこれら
の方法のいくつかにおいて、その方法は、本発明によって提供されるようなペプチドおよ
び／または化合物、および／または免疫応答を増強するアジュバントをヒト患者に投与す
る工程を包含し、その方法は、病理学的タウに対する抗体を含む免疫応答をもたらし、そ
れにより、そのヒト患者におけるＡＤに関連する症状の少なくとも１つを処置するか、そ
の進行を予防するか、または回復させる。
本発明は、タウへの結合についてＤＣ８Ｅ８と競合することができる抗体を作製する方
法も提供し、その方法は、本発明によって提供されるような少なくとも１つのペプチドお
よび／または少なくとも１つの化合物で被験体を免疫する工程を包含する。いくつかの実
施形態において、少なくとも１つのペプチドは、配列番号１〜４、配列番号９〜１０１お
よび配列番号１０８〜１１２、ＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号２０１）、ＩＫＨＶＰＧ
ＧＧＳ（配列番号２０２）、ＫＨＶＰＧＧＧＳＶ（配列番号２０３）、ＨＶＰＧＧＧＳＶ
Ｑ（配列番号２０４）、ＶＰＧＧＧＳＶＱ（配列番号２０５）、ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳ
Ｃ（配列番号２５０）、ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）、ＡＮＩＫＨＶＰ
ＧＧＧＳ（配列番号１４４）、ＤＡＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４６）、ＤＮＡＫＨ
ＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４９）、ＤＮＩＡＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１５１）、ＤＮＩ
ＫＡＶＰＧＧＧＳ（配列番号１５９）、ＤＮＩＫＨＡＰＧＧＧＳ（配列番号１６１）およ
びＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１７１）のうちのいずれか１つから選択されるペプ
チドである。１つの実施形態において、そのペプチドは、配列番号１〜４から選択される
。別の実施形態において、そのペプチドは、配列番号１０８である。１つの実施形態にお
いて、そのペプチドは、ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５０）である。ある特定
の実施形態において、そのペプチドは、ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）で
ある。ある特定の実施形態において、そのペプチドは、配列番号２７０（ＴＥＮＬＫＨＱ
ＰＧＧＧＫ）；配列番号２７１（ＫＨＱＰＧＧＧ）、配列番号２７２（ＨＱＰＧＧＧ）；
配列番号２７５（ＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤ
ＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ）、配列番号２７６（ＫＨＶＰＧＧＧ）、配列番号２７７（ＨＶＰ
ＧＧＧ）、配列番号２８０（ＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶ）、配列番号２８
１（ＨＨＫＰＧＧＧ）、配列番号２８２（ＨＫＰＧＧＧ）および配列番号２８３（ＴＨＶ
ＰＧＧＧ）から選択される。他の実施形態において、そのペプチドは、配列番号２７２（
ＨＱＰＧＧＧ）および配列番号２７７（ＨＶＰＧＧＧ）から選択される。
ＤＣ８Ｅ８を単離する方法またはタウへの結合についてＤＣ８Ｅ８と競合することがで
きる抗体を単離する方法も提供され、その方法は、ＤＣ８Ｅ８またはその抗体を本発明に
よって提供されるようなペプチドおよび／または化合物と接触させる工程を包含する。
関連する実施形態において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病もしくは関連
タウオパチーの存在について被験体を診断するもしくはスクリーニングする方法、または
アルツハイマー病もしくは関連タウオパチーの発症についての被験体のリスクを測定する
ための方法を提供し、その方法は、
ａ）その被験体、またはその被験体の細胞、組織、器官、体液もしくは他の任意のサンプ
ルを、有効量の本発明によって提供されるような少なくとも１つの抗体と接触させる工程
；および
ｂ）病理学的タウおよびその抗体を含む複合体の存在を判定する工程（ここで、その複合
体の存在は、病理学的タウの存在に関連するアルツハイマー病または関連タウオパチーの
診断となる）
を包含する。
ある特定の実施形態において、本発明は、アルツハイマー病もしくは関連タウオパチー
の存在、進行、後退もしくは安定化について被験体をモニターする方法、または被験体に
おけるアルツハイマー病もしくは関連タウオパチーのステージを判定するための方法を提
供し、その方法は、
ａ）その被験体、またはその被験体の細胞、組織、器官、体液もしくは他の任意のサンプ
ルを、有効量の本発明の少なくとも１つの実施形態によって提供されるような少なくとも
１つの抗体と接触させる（例えば、投与する）工程；および
ｂ）病理学的タウおよびその抗体を含む複合体の存在および／または特徴を判定する工程
（ここで、その複合体の存在は、病理学的タウの存在に関連するアルツハイマー病または
関連タウオパチーの診断となる）
を包含する。
アルツハイマー病もしくは関連タウオパチーの存在、進行、後退もしくは安定化につい
て被験体をモニターする方法、または被験体におけるアルツハイマー病もしくは関連タウ
オパチーのステージを判定するための方法のいくつかの実施形態において、その抗体、ペ
プチドおよび／または化合物は、静脈内に、筋肉内に、皮下に、腹腔内に、鼻腔内に、脳
室内に、髄腔内に、またはエアロゾルとして、投与される。いくつかの実施形態において
、各ペプチドおよび／または化合物の有効量は、１投薬あたり少なくとも１μｇ、１投薬
あたり少なくとも１０μｇ、１投薬あたり少なくとも１００μｇである。いくつかの実施
形態において、各ペプチドおよび／または化合物の有効量は、アジュバントの存在下にお
いて１投薬あたり少なくとも１０μｇ、およびアジュバントの非存在下において１投薬あ
たり少なくとも１００μｇである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのペプ
チドまたは化合物は、少なくとも６ヶ月間にわたって複数の投薬量で投与される。
関連する実施形態によると、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病または関連タ
ウオパチーの進行を処置するまたは予防する方法を提供し、その方法は、有効量の本発明
によって提供されるような少なくとも１つの抗体および／または少なくとも１つのペプチ
ドおよび／または少なくとも１つの化合物を、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ−
メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプターアンタゴニスト、遷移金属キレート
剤、成長因子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤、脂質低
下剤、選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナーゼの阻
害剤、熱ショックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫、抗アミロイド
凝集阻害剤、ならびにセクレターゼ阻害剤から選択される少なくとも１つの併用剤と組み
合わせて該被験体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その方法は
、運動障害を減少させることができる、運動機能を改善することができる、認知障害を減
少させることができる、認知機能を改善することができる、またはそれらの組み合わせが
可能である。
関連する実施形態において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病または関連タ
ウオパチーに関連する症状の少なくとも１つを回復させる方法を提供し、その方法は、有
効量の本発明によって提供されるような少なくとも１つの抗体、少なくとも１つのペプチ
ドおよび／または少なくとも１つの化合物を、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭ
ＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属キレート剤、成長因子、ホルモン、非ステロイ
ド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤、脂質低下剤、選択的ホスホジエステラーゼ阻
害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナーゼの阻害剤、熱ショックタンパク質の阻害剤
、抗アミロイド受動および能動免疫試薬、抗アミロイド凝集阻害剤、ならびにセクレター
ゼ阻害剤から選択される少なくとも１つの併用剤と組み合わせて該被験体に投与する工程
を包含する。
被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーに関連する症状の少なくとも
１つの処置、予防または回復の方法のいくつかの実施形態において、その方法は、有効量
の本発明によって提供されるような少なくとも１つの抗体、少なくとも１つのペプチドお
よび／または少なくとも１つの化合物、および／または免疫応答を増強するアジュバント
を；アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属
キレート剤、成長因子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤
、脂質低下剤、選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナ
ーゼの阻害剤、熱ショックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫、抗ア
ミロイド凝集阻害剤、ならびにセクレターゼ阻害剤から選択される少なくとも１つの併用
剤と組み合わせてヒト患者に投与する工程を包含し；ここで、その方法は、病理学的タウ
に対する抗体を含む免疫応答をもたらし、それにより、そのヒト患者におけるＡＤに関連
する症状の少なくとも１つを処置するか、その進行を予防するか、または回復させる。
被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーに関連する症状の少なくとも
１つの処置、予防または回復の方法のいくつかの実施形態において、上記併用剤は、本発
明によって提供されるような抗体、ペプチドおよび／または化合物の投与の前、その投与
と同時、またはその投与の後に投与される。
関連する実施形態において、本発明は、薬学的に許容され得るキャリアおよび／または
希釈剤；ならびに
ａ）本発明によって提供されるような抗体；および／または
ｂ）本発明によって提供されるようなペプチド；および／または
ｃ）本発明によって提供されるような化合物；
を、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属
キレート剤、成長因子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤
、脂質低下剤、選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナ
ーゼの阻害剤、熱ショックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫試薬、
抗アミロイド凝集阻害剤、ならびにセクレターゼ阻害剤から選択される少なくとも１つの
併用剤と組み合わせて含む薬学的組成物も提供する。いくつかの実施形態において、上記
抗体は、ＤＣ８Ｅ８である。ある特定の実施形態において、上記抗体は、ＤＣ８Ｅ８由来
の少なくとも１つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、上記抗体は、ＤＣ８Ｅ
８由来の少なくとも１つの可変鎖（軽鎖または重鎖）を含む。ある特定の実施形態におい
て、ＤＣ８Ｅ８のヒト化バージョンまたはヒトバージョンが使用され得る。いくつかの実
施形態において、少なくとも１つのペプチドは、配列番号１〜４、配列番号９〜１０１お
よび配列番号１０８〜１１２、ＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号２０１）、ＩＫＨＶＰＧ
ＧＧＳ（配列番号２０２）、ＫＨＶＰＧＧＧＳＶ（配列番号２０３）、ＨＶＰＧＧＧＳＶ
Ｑ（配列番号２０４）、ＶＰＧＧＧＳＶＱ（配列番号２０５）、ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳ
Ｃ（配列番号２５０）、ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）、ＡＮＩＫＨＶＰ
ＧＧＧＳ（配列番号１４４）、ＤＡＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４６）、ＤＮＡＫＨ
ＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４９）、ＤＮＩＡＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１５１）、ＤＮＩ
ＫＡＶＰＧＧＧＳ（配列番号１５９）、ＤＮＩＫＨＡＰＧＧＧＳ（配列番号１６１）なら
びにＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１７１）のいずれか１つから選択される。１つの
実施形態において、上記ペプチドは、配列番号１〜４から選択される。別の実施形態にお
いて、上記ペプチドは、配列番号１０８である。１つの実施形態において、上記ペプチド
は、ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５０）である。ある特定の実施形態において
、上記ペプチドは、ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）である。ある特定の実
施形態において、上記ペプチドは、配列番号２７０（ＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫ）；配列
番号２７１（ＫＨＱＰＧＧＧ）、配列番号２７２（ＨＱＰＧＧＧ）；配列番号２７５（Ｅ
ＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧ
Ｓ）、配列番号２７６（ＫＨＶＰＧＧＧ）、配列番号２７７（ＨＶＰＧＧＧ）、配列番号
２８０（ＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶ）、配列番号２８１（ＨＨＫＰＧＧＧ
）、配列番号２８２（ＨＫＰＧＧＧ）および配列番号２８３（ＴＨＶＰＧＧＧ）から選択
される。他の実施形態において、上記ペプチドは、配列番号２７２（ＨＱＰＧＧＧ）およ
び配列番号２７７（ＨＶＰＧＧＧ）から選択される。
実施形態のさらなる目的および利点は、以下の説明に部分的に示され、部分的にその説
明から明らかであるか、または実施形態の実施によって知ることができる。実施形態の目
的および利点は、添付の請求項において特段指摘されるエレメントおよび組み合わせを用
いて実現され、達成されるだろう。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
単離された抗体であって、該抗体は、１つもしくは複数のタウエピトープに結合し、以下
：
ａ）生理学的タウよりも病理学的タウに対してより高い親和性を示すこと；
ｂ）タウ−タウ凝集を阻害すること；ならびに
ｃ）ミクログリアによる病理学的タウタンパク質の取り込みおよび分解を媒介すること
のうちの２つもしくはそれより多くが可能であり；各タウエピトープは、タウの凝集促進
領域を含む、単離された抗体。
（項目２）
前記１つもしくは複数のエピトープの各々が、独立して、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６７〜２７３位または残基ＫＨＱＰＧＧＧ（配列番号９８）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９８〜３０４位または残基ＫＨＶＰＧＧＧ（配列番号９９
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３２９〜３３５位または残基ＨＨＫＰＧＧＧ（配列番号１
００）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６１〜３６７位または残基ＴＨＶＰＧＧＧ（配列番号１０
１）
内のエピトープから選択される、項目１に記載の単離された抗体。
（項目３）
前記１つもしくは複数のエピトープの各々が、独立して、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６８〜２７３位または残基ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９９〜３０４位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３３０〜３３５位または残基ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２
４）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６２〜３６７位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）内のエピトープから選択される、項目２に記載の単離された抗体。
（項目４）
前記抗体が、ヒトアルツハイマー病患者の脳生検材料、アルツハイマー病の動物モデル由
来の脳サンプル、またはその両方における、誤秩序タウ、誤無秩序タウ、サルコシル不溶
性タウ、神経原線維変化、糸屑状構造物および老人斑から選択される病理学的タウの１つ
もしくは複数の形態に結合することができる、項目１〜３の１項に記載の単離された抗体
。
（項目５）
前記エピトープの少なくとも１つが、コンフォーメーションによるものである、項目１〜
４の１項に記載の単離された抗体。
（項目６）
コンフォーメーションに特異的な様式でタウ上の１つもしくは複数のエピトープに結合す
る、単離された抗体であって、ここで：
ａ）該１つもしくは複数のエピトープの各々は、独立して、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６７〜２７３位または残基ＫＨＱＰＧＧＧ（配列番号９８）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９８〜３０４位または残基ＫＨＶＰＧＧＧ（配列番号９９
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３２９〜３３５位または残基ＨＨＫＰＧＧＧ（配列番号１
００）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６１〜３６７位または残基ＴＨＶＰＧＧＧ（配列番号１０
１）
内のエピトープから選択され；
ｂ）該エピトープの０、１、２または３個は、線状エピトープであり；
ｃ）該エピトープの１、２、３または４個は、コンフォーメーションエピトープである、
単離された抗体。
（項目７）
コンフォーメーションに特異的な様式でタウ上の１つもしくは複数のエピトープに結合す
る、単離された抗体であって、ここで：
ａ）該１つもしくは複数のエピトープの各々は、独立して、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６８〜２７３位または残基ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９９〜３０４位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３３０〜３３５位または残基ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２
４）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６２〜３６７位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
内のエピトープから選択され、
ｂ）該エピトープの０、１、２または３個は、線状エピトープであり；
ｃ）該エピトープの１、２、３または４個は、コンフォーメーションエピトープである、
単離された抗体。
（項目８）
前記抗体が、ＤＣ８Ｅ８であり、ＤＣ８Ｅ８が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｎｏ．ＰＴＡ−１１９
９４として寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体である、項目１および６の
うちの１項に記載の単離された抗体。
（項目９）
前記抗体が、ＤＣ８Ｅ８によって結合されるエピトープと同じタウ上のエピトープの１つ
もしくは複数に結合する、項目１〜７の１項に記載の単離された抗体。
（項目１０）
前記抗体が、タウへの結合についてモノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８と競合する、項目１〜
７の１項に記載の単離された抗体。
（項目１１）
単離された抗体であって、
ｉ．ＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号１１７）
ｉｉ．ＷＡＳ（配列番号１１８）
ｉｉｉ．ＫＱＳＦＹＬＲＴ（配列番号１１９）
ｉｖ．ＧＹＩＦＴＤＹＶＩＳ（配列番号１２０）
ｖ．ＩＦＰＲＳＧＳＴ（配列番号１２１）；および
ｖｉ．ＡＲＤＹＹＧＴＳＦＡＭＤＹ（配列番号１２２）
から選択される１つもしくは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を該抗体のエピトープ
結合ドメインに含む、単離された抗体。
（項目１２）
単離された抗体であって、
ｉ．ＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号１１７）
ｉｉ．ＷＡＳ（配列番号１１８）
ｉｉｉ．ＫＱＳＦＹＬＲＴ（配列番号１１９）
ｉｖ．ＧＹＩＦＴＤＹＶＩＳ（配列番号１２０）
ｖ．ＩＦＰＲＳＧＳＴ（配列番号１２１）；および
ｖｉ．ＡＲＤＹＹＧＴＳＦＡＭＤＹ（配列番号１２２）
から選択される１つもしくは複数のＣＤＲ配列を該抗体のエピトープ結合ドメインに含む
、項目１〜７の１項に記載の単離された抗体。
（項目１３）
前記抗体が、
ａ）ｉ．ＣＤＲ１に対してＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号１１７）または配列番号
２４７；
ｉｉ．ＣＤＲ２に対してＷＡＳ（配列番号１１８）または配列番号２５３；および
ｉｉｉ．ＣＤＲ３に対してＫＱＳＦＹＬＲＴ（配列番号１１９）または配列番号２５５、
２５７、２５８、２５９および２６０のうちのいずれか１つ
を含む抗体軽鎖可変領域；ならびに
ｂ）ｉ．ＣＤＲ１に対してＧＹＩＦＴＤＹＶＩＳ（配列番号１２０）、配列番号２６１ま
たは配列番号２６２；
ｉｉ．ＣＤＲ２に対してＩＦＰＲＳＧＳＴ（配列番号１２１）、配列番号２６４または配
列番号２６５；および
ｉｉｉ．ＣＤＲ３に対してＡＲＤＹＹＧＴＳＦＡＭＤＹ（配列番号１２２）、配列番号２
６６、配列番号２６７または配列番号２６９
を含む抗体重鎖可変領域
を含む、項目１１および１２のうちのいずれか１項に記載の単離された抗体。
（項目１４）
前記抗体が：
ａ）ｉ．ＣＤＲ１に対してＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号１１７）；
ｉｉ．ＣＤＲ２に対してＷＡＳ（配列番号１１８）；および
ｉｉｉ．ＣＤＲ３に対してＫＱＳＦＹＬＲＴ（配列番号１１９）
を含む抗体軽鎖可変領域；ならびに
ｂ）ｉｖ．ＣＤＲ１に対してＧＹＩＦＴＤＹＶＩＳ（配列番号１２０）
ｖ．ＣＤＲ２に対してＩＦＰＲＳＧＳＴ（配列番号１２１）；および
ｖｉ．ＣＤＲ１に対してＡＲＤＹＹＧＴＳＦＡＭＤＹ（配列番号１２２）
を含む抗体重鎖可変領域
を含む、項目１１および１２のうちのいずれか１項に記載の単離された抗体。
（項目１５）
前記抗体が：
ａ）前記モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８由来の軽鎖ＣＤＲの１つもしくは複数の配列、ま
たはこれらの軽鎖ＣＤＲのうちの１つとの最適なアラインメントの後に少なくとも８０％
の同一性を有する１つもしくは複数の配列；および
ｂ）該モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８由来の重鎖ＣＤＲの１つもしくは複数の配列、また
はこれらの重鎖ＣＤＲのうちの１つとの最適なアラインメントの後に少なくとも８０％の
同一性を有する１つもしくは複数の配列
を含み；
ｉ．該軽鎖ＣＤＲは、ＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号１１７）、ＷＡＳ（配列番号
１１８）およびＫＱＳＦＹＬＲＴ（配列番号１１９）から選択される配列を含み；
ｉｉ．該重鎖ＣＤＲは、ＧＹＩＦＴＤＹＶＩＳ（配列番号１２０）、ＩＦＰＲＳＧＳＴ（
配列番号１２１）およびＡＲＤＹＹＧＴＳＦＡＭＤＹ（配列番号１２２）から選択される
配列を含む、
項目１〜７の１項に記載の単離された抗体。
（項目１６）
前記抗体が：
ａ）前記モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８由来の軽鎖ＣＤＲの１つもしくは複数の配列、ま
たはこれらの軽鎖ＣＤＲのうちの１つとの最適なアラインメントの後に少なくとも８０％
の同一性を有する１つもしくは複数の配列；および
ｂ）該モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８由来の重鎖ＣＤＲの１つもしくは複数の配列、また
はこれらの重鎖ＣＤＲのうちの１つとの最適なアラインメントの後に少なくとも８０％の
同一性を有する１つもしくは複数の配列
を含み；
ｉ．該軽鎖ＣＤＲは、ＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号１１７）、ＷＡＳ（配列番号
１１８）、ＫＱＳＦＹＬＲＴ（配列番号１１９）、配列番号２４７、配列番号２５３、配
列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９および配列番号２６０
から選択される配列を含み；
ｉｉ．該重鎖ＣＤＲは、ＧＹＩＦＴＤＹＶＩＳ（配列番号１２０）、ＩＦＰＲＳＧＳＴ（
配列番号１２１）、ＡＲＤＹＹＧＴＳＦＡＭＤＹ（配列番号１２２）；配列番号２６１、
配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７お
よび配列番号２６９から選択される配列を含む、
項目１〜７の１項に記載の単離された抗体。
（項目１７）
単離された抗体であって、ここで、該抗体は、
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖフラグメントもしくは他の任意の抗
原結合フラグメント；または抗原結合抗体部分であり；
該抗体は、項目１〜７の１項に記載の抗体の免疫学的結合特性のうちの１つもしくは複数
を有する、単離された抗体。
（項目１８）
項目１〜１７の１項に記載の単離された抗体と競合してタウに結合する、単離された抗体
。
（項目１９）
単離された前記ＤＣ８Ｅ８抗体と競合してタウに結合する、項目６に記載の単離された抗
体。
（項目２０）
前記抗体が：
ａ）モノクローナル抗体；
ｂ）ポリクローナル抗体；
ｃ）組換え抗体；
ｄ）キメラ抗体；
ｅ）ヒト化抗体；
ｆ）ヒト抗体；および
ｇ）（ａ）から（ｆ）のいずれか１つの抗原結合フラグメントまたは抗原結合部分
から選択される、項目１〜７および１０〜１９の１項に記載の単離された抗体。
（項目２１）
前記抗体が、哺乳動物において産生される、項目１〜７および９〜２０の１項に記載の単
離された抗体。
（項目２２）
前記抗体が、組換え動物または組換え宿主細胞によって産生される、項目１〜７および９
〜２０の１項に記載の単離された抗体。
（項目２３）
前記抗体が、１つもしくは複数の標識剤で検出可能に標識される、項目１〜２２の１項に
記載の単離された抗体。
（項目２４）
少なくとも１つの標識剤が、酵素、放射性同位体、フルオロフォア、核磁気共鳴マーカー
および重金属から選択される、項目２３に記載の単離された抗体。
（項目２５）
前記抗体に結合された少なくとも１つの薬物をさらに含む、項目１〜２４の１項に記載の
抗体。
（項目２６）
項目項目１〜７および９〜２０の１項に記載の抗体の免疫グロブリン鎖の少なくとも結合
ドメインまたは可変領域をコードする、単離された核酸。
（項目２７）
項目２１に記載の核酸を含む、単離されたベクター。
（項目２８）
項目２６に記載の単離された核酸および／または項目２７に記載のベクターを含む、単離
された宿主細胞。
（項目２９）
項目１〜７および９〜２０の１項に記載の単離された抗体を発現する、単離された細胞系
。
（項目３０）
前記細胞系が、ハイブリドーマである、項目２９に記載の単離された細胞系。
（項目３１）
前記細胞系が、前記モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８を産生するハイブリドーマである、項
目３０に記載の単離された細胞系。
（項目３２）
薬物として使用するための、またはアルツハイマー病もしくは関連タウオパチーの診断、
予防もしくは処置のための医薬の製造において使用するための、項目１〜７および９〜２
０の１項に記載の単離された抗体。
（項目３３）
薬物として使用するための、またはアルツハイマー病または関連タウオパチーの処置のた
めの医薬の製造において使用するための、項目２６に記載の単離された核酸。
（項目３４）
項目１〜２５の１項に記載の抗体、ならびに薬学的に許容され得るキャリアおよび／また
は希釈剤を含む、薬学的組成物。
（項目３５）
抗体の組み合わせ、ならびに薬学的に許容され得るキャリアおよび／または希釈剤を含む
薬学的組成物であって、ここで、該組み合わせは、少なくとも２つの異なる抗体を含み、
前記抗体の各々は、独立して、項目１〜２５の１項に記載の抗体から選択される、薬学的
組成物。
（項目３６）
項目１〜２５に記載の少なくとも１つの抗体および希釈剤またはキャリアを含む、組成物
。
（項目３７）
検出可能な標識、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイドまたは他の病原
菌に由来するトキソイド、血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン分子ま
たはそのフラグメント、チログロブリン、オボグロブリン、ユニバーサルＴ細胞エピトー
プ、サイトカイン、ケモカイン、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦ
Ｎ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１βおよびＲＡＮＴＥＳから選択される少な
くとも１つの化合物または剤をさらに含む、項目３６に記載の組成物。
（項目３８）
包装材料、および凍結乾燥された形態の項目１〜２５の１項に記載の抗体の溶液を含む容
器を備える、薬学的にまたは診断に使用するための製造品。
（項目３９）
前記容器が、被験体に前記抗体を送達するためのデバイスまたはシステムの構成要素であ
る、項目３９に記載の製造品。
（項目４０）
項目１〜２５の１項に記載の抗体を備える医療用デバイスであって、該デバイスは、非経
口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内、体腔内、
小脳内、脳室内、髄腔内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜
内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液包内、胸
内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内および経皮（ｔ
ｒａｎｓｄｅｒｒｎａｌ）から選択される少なくとも１つの様式による前記抗体の接触ま
たは投与に適している、医療用デバイス。
（項目４１）
被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーの進行を処置するまたは予防す
る方法であって、該方法は、有効量の項目１〜２５の１項に記載の少なくとも１つの抗体
を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目４２）
前記方法は、運動障害を減少させることができる、運動機能を改善することができる、認
知障害を減少させることができる、認知機能を改善することができる、またはそれらの組
み合わせが可能である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーに関連する症状の少なくとも１
つを回復させる方法であって、該方法は、有効量の項目１〜２５の１項に記載の少なくと
も１つの抗体を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目４４）
被験体におけるアルツハイマー病もしくは関連タウオパチーの存在について被験体を診断
するもしくはスクリーニングする方法、またはアルツハイマー病もしくは関連タウオパチ
ーの発症についての被験体のリスクを測定するための方法であって、該方法は：
ａ）該被験体、または該被験体の細胞、組織、器官、体液もしくは他の任意のサンプルを
、有効量の項目１〜２５の１項に記載の少なくとも１つの抗体と接触させる工程；および
ｂ）病理学的タウおよび該抗体を含む複合体の存在を判定する工程であって、ここで、該
複合体の存在は、病理学的タウの存在に関連するアルツハイマー病または関連タウオパチ
ーの診断となる、工程
を包含する、方法。
（項目４５）
被験体におけるアルツハイマー病もしくは関連タウオパチーの存在、進行、後退もしくは
安定化について被験体をモニターする方法、または被験体におけるアルツハイマー病もし
くは関連タウオパチーのステージを判定するための方法であって、該方法は：
ａ）該被験体、または該被験体の細胞、組織、器官、体液もしくは他の任意のサンプルを
、有効量の項目１〜２５の１項に記載の少なくとも１つの抗体と接触させる工程；および
ｂ）病理学的タウおよび該抗体を含む複合体の存在を判定する工程であって、ここで、該
複合体の存在は、病理学的タウの存在に関連するアルツハイマー病または関連タウオパチ
ーの診断となる、工程
を包含する、方法。
（項目４６）
前記抗体が、静脈内に、筋肉内に、皮下に、腹腔内に、鼻腔内に、脳室内に、髄腔内に、
またはエアロゾルとして、投与される、項目４１〜４５の１項に記載の方法。
（項目４７）
各抗体の前記有効量が、１投薬あたり前記被験体の体重１ｋｇあたり少なくとも１ｍｇで
ある、項目４１〜４５の１項に記載の方法。
（項目４８）
各抗体の前記有効量が、１投薬あたり前記被験体の体重１ｋｇあたり少なくとも１０ｍｇ
である、項目４１〜４５の１項に記載の方法。
（項目４９）
前記抗体の少なくとも１つが、少なくとも６ヶ月間にわたって複数の投薬量で投与される
、項目４１〜４８の１項に記載の方法。
（項目５０）
前記抗体が、その有益な効果を発揮するためにヒト被験体の末梢に投与される、項目４１
〜４９の１項に記載の方法。
（項目５１）
前記抗体が、ヒト被験体の末梢に投与されたとき、可溶性タウ、サルコシル不溶性タウま
たはその両方に結合する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記抗体が、ヒト被験体の末梢に投与されたとき、タウに結合し、ここで、タウは、ヒト
アルツハイマー病患者の脳生検材料おける、アルツハイマー病の動物モデル由来の脳サン
プルにおける、誤秩序タウ、誤無秩序タウ、サルコシル不溶性タウ、神経原線維変化、糸
屑状構造物および老人斑から選択される１つもしくは複数の病理学的形態である、項目５
０に記載の方法。
（項目５３）
前記抗体が、ヒト被験体の末梢に投与されたとき、該被験体に対して１つもしくは複数の
、エフェクター機能によって媒介される有益な効果を発揮する、項目５０〜５２の１項に
記載の方法。
（項目５４）
アルツハイマー病および関連タウオパチーから選択される疾患の処置または診断において
使用するための、項目１〜２５のいずれか１項に記載の抗体または項目２６に記載の核酸
。
（項目５５）
アルツハイマー病および関連タウオパチーから選択される疾患の処置または診断において
使用するための、項目１〜２５のいずれか１項に記載の抗体または項目２６に記載の核酸
を含む、組成物。
（項目５６）
単離されたペプチドであって、ここで：
ａ）該単離されたペプチドは、少なくとも６アミノ酸残基長、少なくとも７アミノ酸残基
長、少なくとも９アミノ酸残基長、少なくとも１０アミノ酸残基長、少なくとも１２アミ
ノ酸残基長または３０アミノ酸残基長であるタウのフラグメントであり；
ｂ）該単離されたペプチドは、少なくとも１つのタウ治療用エピトープを含む、
単離されたペプチド。
（項目５７）
前記治療用エピトープが、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６７〜２７３位または残基ＫＨＱＰＧＧＧ（配列番号９８）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９８〜３０４位または残基ＫＨＶＰＧＧＧ（配列番号９９
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３２９〜３３５位または残基ＨＨＫＰＧＧＧ（配列番号１
００）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６１〜３６７位または残基ＴＨＶＰＧＧＧ（配列番号１０
１）；
内のエピトープから選択される治療用エピトープを含む、項目５６に記載の単離されたペ
プチド。
（項目５８）
前記治療用エピトープが、
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６８〜２７３位または残基ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９９〜３０４位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３３０〜３３５位または残基ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２
４）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６２〜３６７位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
内のエピトープから選択される治療用エピトープを含む、項目５６に記載の単離されたペ
プチド。
（項目５９）
前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１〜４、配列番号９〜１０１、配列番号１０８
〜１１２、配列番号１５４、配列番号２２３〜２２４、ＮＩＫＡＶＰＧＧＧＳ（配列番号
２００）、ＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号２０１）、ＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号２
０２）、ＫＨＶＰＧＧＧＳＶ（配列番号２０３）、ＨＶＰＧＧＧＳＶＱ（配列番号２０４
）、ＶＰＧＧＧＳＶＱ（配列番号２０５）、ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５０
）、ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）、ＡＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号
１４４）、ＤＡＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４６）、ＤＮＡＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列
番号１４９）、ＤＮＩＡＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１５１）、ＤＮＩＫＡＶＰＧＧＧＳ（
配列番号１５９）、ＤＮＩＫＨＡＰＧＧＧＳ（配列番号１６１）およびＤＮＩＫＨＶＰＧ
ＧＧＳ（配列番号１７１）から選択される配列である、項目５６〜５８の１項に記載の単
離されたペプチド。
（項目６０）
前記ペプチドが、該ペプチドの：
ａ）前記モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８への結合についてタウと競合する能力；
ｂ）インビボにおいてサルコシル不溶性タウのレベルを減少させる能力；
ｃ）インビボにおいて脳からのタウのクリアランスを促進する能力；
ｄ）インビボにおいてＡＤの少なくとも１つの生化学的マーカーのレベルを減少させる能
力；
ｅ）インビボにおいて神経原線維変化（ＮＦＴ）の量を減少させる能力；
ｆ）インビボにおいて少なくとも１つの神経行動学的パラメータを改善する能力；
ｇ）被験体におけるＡＤの経過を有利に改変する能力；
ｈ）脳、脳脊髄液またはその両方におけるタウのレベルを減少させる能力；
ｉ）タウへの結合についてモノクローナルＤＣ８Ｅ８と競合することができる抗体の作製
において免疫原として働く能力
を測定するアッセイから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて活性である、項目
５６〜５９の１項に記載の単離されたペプチド。
（項目６１）
項目５６〜６０の１項に記載の単離されたペプチドおよびある部分を含む化合物。
（項目６２）
前記部分が、前記ペプチドのＮ末端であるか、Ｃ末端であるか、または該ペプチドの内部
のアミノ酸に連結されており、該部分は、システイン残基、ホスホ基、キーホールリンペ
ットヘモシアニン、破傷風トキソイドまたは他の病原菌に由来するトキソイド、血清アル
ブミン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン分子またはそのフラグメント、チログロブ
リン、オボグロブリン、ユニバーサルＴ細胞エピトープ、サイトカイン、ケモカイン、Ｉ
Ｌ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ１α
、ＭＩＰ１βおよびＲＡＮＴＥＳのうちの１つもしくは複数から選択される、項目６１に
記載の化合物。
（項目６３）
項目５６〜６０の１項に記載の単離されたペプチド、ならびに薬学的に許容され得るキャ
リアおよび／または希釈剤および／またはアジュバントを含む、薬学的組成物。
（項目６４）
項目６１〜６２の１項に記載の化合物、ならびに薬学的に許容され得るキャリアおよび／
または希釈剤および／またはアジュバントを含む、薬学的組成物。
（項目６５）
１投薬あたり１ｎｇ〜１０ｍｇの投与量の前記ペプチドまたは前記化合物を提供するよう
に適合させた、項目６３および６４のうちの１項に記載の薬学的組成物。
（項目６６）
１投薬あたり１０マイクログラムより多い投与量の前記ペプチドまたは前記化合物を提供
するように適合させた、項目６３および６４のうちの１項に記載の薬学的組成物。
（項目６７）
包装材料、および凍結乾燥された形態の項目５６〜６０の１項に記載のペプチドの溶液ま
たは項目６１〜６２の１項に記載の化合物の溶液を含む容器を備える、薬学的にまたは診
断に使用するための製造品。
（項目６８）
前記容器が、被験体に前記ペプチドまたは前記化合物を送達するためのデバイスまたはシ
ステムの構成要素である、項目６７に記載の製造品。
（項目６９）
項目５６〜６０の１項に記載のペプチドまたは項目６１〜６２の１項に記載の化合物を備
える医療用デバイスであって、ここで、該デバイスは、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、
関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、髄腔内、結
腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺
内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、病巣内
、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内および経皮から選択される少なくとも１つの
様式による前記抗体の接触または投与に適している、医療用デバイス。
（項目７０）
被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーの進行を処置するまたは予防す
る方法であって、該方法は、有効量の項目５６〜６０の１項に記載の少なくとも１つのペ
プチドおよび／または項目６１〜６２の１項に記載の少なくとも１つの化合物を該被験体
に投与する工程を包含する、方法。
（項目７１）
前記方法は、運動障害を減少させることができる、運動機能を改善することができる、認
知障害を減少させることができる、認知機能を改善することができる、またはそれらの組
み合わせが可能である、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーに関連する症状の少なくとも１
つを回復させる方法であって、該方法は、有効量の項目５６〜６０の１項に記載の少なく
とも１つのペプチドおよび／または項目６１〜６２の１項に記載の少なくとも１つの化合
物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目７３）
項目７０〜７２の１項に記載の方法であって、該方法は、項目５６〜６０の１項に記載の
ペプチドおよび／または項目６１〜６２の１項に記載の化合物および／または免疫応答を
増強するアジュバントをヒト患者に投与する工程を包含し、該方法は、病理学的タウに対
する抗体を含む免疫応答をもたらし、それにより、該ヒト患者におけるアルツハイマー病
または関連タウオパチーに関連する症状の少なくとも１つを処置する、その進行を予防す
る、または回復させる、方法。
（項目７４）
タウへの結合についてＤＣ８Ｅ８と競合することができる抗体を作製する方法であって、
該方法は、項目５６〜６０の１項に記載のペプチドおよび／または項目６１〜６２の１項
に記載の化合物で被験体を免疫する工程を包含する、方法。
（項目７５）
ＤＣ８Ｅ８を単離する方法、またはタウへの結合についてＤＣ８Ｅ８と競合することがで
きる抗体を単離する方法であって、該方法は、ＤＣ８Ｅ８または前記抗体を項目５６〜６
０の１項に記載のペプチドおよび／または項目６１〜６２の１項に記載の化合物と接触さ
せる工程を包含する、方法。
（項目７６）
被験体におけるアルツハイマー病もしくは関連タウオパチーの存在について被験体を診断
するもしくはスクリーニングする方法、またはアルツハイマー病もしくは関連タウオパチ
ーの発症についての被験体のリスクを測定するための方法であって、該方法は：
ａ）該被験体、または該被験体の細胞、組織、器官、体液もしくは他の任意のサンプルを
、有効量の項目７４に記載の少なくとも１つの抗体と接触させる工程；および
ｂ）病理学的タウおよび該抗体を含む複合体の存在を判定する工程であって、ここで、該
複合体の存在は、病理学的タウの存在に関連するアルツハイマー病または関連タウオパチ
ーの診断となる、工程
を包含する、方法。
（項目７７）
被験体におけるアルツハイマー病もしくは関連タウオパチーの存在、進行、後退もしくは
安定化について被験体をモニターする方法、または被験体におけるアルツハイマー病もし
くは関連タウオパチーのステージを判定するための方法であって、該方法は：
ａ）該被験体、または該被験体の細胞、組織、器官、体液もしくは他の任意のサンプルを
、有効量の項目７４に記載の少なくとも１つの抗体と接触させる工程；および
ｂ）病理学的タウおよび該抗体を含む複合体の存在を判定する工程であって、ここで、該
複合体の存在は、病理学的タウの存在に関連するアルツハイマー病または関連タウオパチ
ーの診断となる、工程
を包含する、方法。
（項目７８）
前記ペプチドおよび／または化合物が、静脈内に、筋肉内に、皮下に、腹腔内に、鼻腔内
に、脳室内に、髄腔内に、またはエアロゾルとして、投与される、項目７６〜７７の１項
に記載の方法。
（項目７９）
各ペプチドおよび／または化合物の前記有効量が、１投薬あたり少なくとも１μｇ、１投
薬あたり少なくとも１０μｇ、１投薬あたり少なくとも１００μｇである、項目７６〜７
８の１項に記載の方法。
（項目８０）
各ペプチドおよび／または化合物の前記有効量が、アジュバントの存在下において１投薬
あたり少なくとも１０μｇ、およびアジュバントの非存在下において１投薬あたり少なく
とも少なくとも１００μｇである、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
少なくとも１つのペプチドまたは化合物が、少なくとも６ヶ月間にわたって複数の投薬量
で投与される、項目７０〜７３および７６〜８０の１項に記載の方法。
（項目８２）
被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーの進行を処置するまたは予防す
る方法であって、該方法は、有効量の項目１〜２５の１項に記載の少なくとも１つの抗体
および／または項目５６〜６０の１項に記載の少なくとも１つのペプチドおよび／または
項目６１〜６２の１項に記載の少なくとも１つの化合物を、アセチルコリンエステラーゼ
阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属キレート剤、成長因子、ホルモン
、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤、脂質低下剤、選択的ホスホジエ
ステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナーゼの阻害剤、熱ショックタンパ
ク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫、抗アミロイド凝集阻害剤、ならびにセ
クレターゼ阻害剤から選択される少なくとも１つの併用剤と組み合わせて該被験体に投与
する工程を包含する、方法。
（項目８３）
前記方法は、運動障害を減少させることができる、運動機能を改善することができる、認
知障害を減少させることができる、認知機能を改善することができる、またはそれらの組
み合わせが可能である、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーに関連する症状の少なくとも１
つを回復させる方法であって、該方法は、有効量の項目１〜２５の１項に記載の少なくと
も１つの抗体および／または項目５６〜６０の１項に記載の少なくとも１つのペプチドお
よび／または項目６１〜６２の１項に記載の少なくとも１つの化合物を、アセチルコリン
エステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属キレート剤、成長因
子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤、脂質低下剤、選択
的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナーゼの阻害剤、熱シ
ョックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫試薬、抗アミロイド凝集阻
害剤、ならびにセクレターゼ阻害剤から選択される少なくとも１つの併用剤と組み合わせ
て該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目８５）
項目８３〜８４の１項に記載の方法であって、該方法は、有効量の項目１〜２５の１項に
記載の少なくとも１つの抗体、項目５６〜６０の１項に記載の１つのペプチドおよび／ま
たは項目６１〜６２の１項に記載の少なくとも１つの化合物および／または免疫応答を増
強するアジュバントを；アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタ
ゴニスト、遷移金属キレート剤、成長因子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡ
ＩＤ）、酸化防止剤、脂質低下剤、選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害
剤、タンパク質キナーゼの阻害剤、熱ショックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受動お
よび能動免疫、抗アミロイド凝集阻害剤、ならびにセクレターゼ阻害剤から選択される少
なくとも１つの併用剤と組み合わせてヒト患者に投与する工程を包含し；該方法は、病理
学的タウに対する抗体を含む免疫応答をもたらし、それにより、該ヒト患者におけるＡＤ
に関連する症状の少なくとも１つを処置する、その進行を予防する、または回復させる、
方法。
（項目８６）
前記併用剤が、項目１〜２５の１項に記載の抗体、項目５６〜６０の１項に記載のペプチ
ドおよび／または項目６１〜６２の１項に記載の化合物の投与の前、該投与と同時、また
は該投与の後に投与される、項目８３〜８５の１項に記載の方法。
（項目８７）
薬学的に許容され得るキャリアおよび／または希釈剤；ならびに
ａ）項目１〜２５の１項に記載の抗体；および／または
ｂ）項目５６〜６０の１項に記載のペプチド；および／または
ｃ）項目６１〜６２の１項に記載の化合物；
を、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属
キレート剤、成長因子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤
、脂質低下剤、選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナ
ーゼの阻害剤、熱ショックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫試薬、
抗アミロイド凝集阻害剤ならびにセクレターゼ阻害剤から選択される少なくとも１つの併
用剤と組み合わせて含む、薬学的組成物。
（項目８８）
単離されたペプチドであって、ここで：
ａ）該単離されたペプチドは、６アミノ酸残基長であるタウのフラグメントであり、
ｂ）該単離されたペプチドは、少なくとも１つのタウ治療用エピトープを含む、
単離されたペプチド。
（項目８９）
前記治療用エピトープが：
ｉ．ｔａｕ４４１に対して２６８〜２７３位または残基ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）
；
ｉｉ．ｔａｕ４４１に対して２９９〜３０４位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
ｉｉｉ．ｔａｕ４４１に対して３３０〜３３５位または残基ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２
４）；および
ｉｖ．ｔａｕ４４１に対して３６２〜３６７位または残基ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４
）
から選択される治療用エピトープを含む、項目８８に記載の単離されたペプチド。
（項目９０）
前記単離されたペプチドが、ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）、ＨＶＰＧＧＧ（配列番号
１５４）、ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２４）およびＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４）から
選択される、項目８８〜８９の１項に記載の単離されたペプチド。
（項目９１）
前記ペプチドが、該ペプチドの：
ｊ）前記モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８への結合についてタウと競合する能力；
ｋ）インビボにおいてサルコシル不溶性タウのレベルを減少させる能力；
ｌ）インビボにおいて脳からのタウのクリアランスを促進する能力；
ｍ）インビボにおいてＡＤの少なくとも１つの生化学的マーカーのレベルを減少させる能
力；
ｎ）インビボにおいて神経原線維変化（ＮＦＴ）の量を減少させる能力；
ｏ）インビボにおいて少なくとも１つの神経行動学的パラメータを改善する能力；
ｐ）被験体におけるＡＤの経過を有利に改変する能力；
ｑ）脳、脳脊髄液またはその両方におけるタウのレベルを減少させる能力；
ｒ）タウへの結合についてモノクローナルＤＣ８Ｅ８と競合することができる抗体の作製
において免疫原として働く能力
を測定するアッセイから選択される少なくとも１つのアッセイにおいて活性である、項目
８８〜９０の１項に記載の単離されたペプチド。
（項目９２）
項目８８〜９１の１項に記載の単離されたペプチドおよびある部分を含む、化合物。
（項目９３）
前記部分が、前記ペプチドのＮ末端であるか、Ｃ末端であるか、または該ペプチドの内部
のアミノ酸に連結されており、該部分は、システイン残基、ホスホ基、キーホールリンペ
ットヘモシアニン、破傷風トキソイドまたは他の病原菌に由来するトキソイド、血清アル
ブミン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン分子またはそのフラグメント、チログロブ
リン、オボグロブリン、ユニバーサルＴ細胞エピトープ、サイトカイン、ケモカイン、Ｉ
Ｌ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ１α
、ＭＩＰ１βおよびＲＡＮＴＥＳのうちの１つもしくは複数から選択される、項目９２に
記載の化合物。
（項目９４）
項目８８〜９１の１項に記載の単離されたペプチド、ならびに薬学的に許容され得るキャ
リアおよび／または希釈剤および／またはアジュバントを含む、薬学的組成物。
（項目９５）
項目９２〜９３の１項に記載の化合物、ならびに薬学的に許容され得るキャリアおよび／
または希釈剤および／またはアジュバントを含む、薬学的組成物。
（項目９６）
１投薬あたり１ｎｇ〜１０ｍｇの投与量の前記ペプチドまたは前記化合物を提供するよう
に適合させた、項目９４および９５のうちの１項に記載の薬学的組成物。
（項目９７）
１投薬あたり１０マイクログラムより多い投与量の前記ペプチドまたは前記化合物を提供
するように適合させた、項目９４および９５のうちの１項に記載の薬学的組成物。
（項目９８）
包装材料、および凍結乾燥された形態の項目８８〜９１の１項に記載のペプチドの溶液ま
たは項目９２〜９３の１項に記載の化合物の溶液を含む容器を備える、薬学的にまたは診
断に使用するための製造品。
（項目９９）
前記容器が、被験体に前記ペプチドまたは前記化合物を送達するためのデバイスまたはシ
ステムの構成要素である、項目９８に記載の製造品。
（項目１００）
項目８８〜９１の１項に記載のペプチドまたは項目９２〜９３の１項に記載の化合物を備
える医療用デバイスであって、ここで、該デバイスは、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、
関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、髄腔内、結
腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺
内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、病巣内
、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内および経皮から選択される少なくとも１つの
様式による前記ペプチドおよび／または前記化合物の接触または投与に適している、医療
用デバイス。
（項目１０１）
被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーの進行を処置するまたは予防す
る方法であって、該方法は、有効量の項目８８〜９１の１項に記載の少なくとも１つのペ
プチドおよび／または項目９２〜９３の１項に記載の少なくとも１つの化合物を該被験体
に投与する工程を包含する、方法。
（項目１０２）
項目１０１に記載の方法であって、該方法は、運動障害を減少させることができる、運動
機能を改善することができる、認知障害を減少させることができる、認知機能を改善する
ことができる、またはそれらの組み合わせが可能である、方法。
（項目１０３）
被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーに関連する症状の少なくとも１
つを回復させる方法であって、該方法は、項目８８〜９１の１項に記載の有効量の少なく
とも１つのペプチドおよび／または項目９２〜９３の１項に記載の少なくとも１つの化合
物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１０４）
項目１０１〜１０３の１項に記載の方法であって、該方法は、項目８８〜９１の１項に記
載のペプチドおよび／または項目９２〜９３の１項に記載の化合物および／または免疫応
答を増強するアジュバントをヒト患者に投与する工程を包含し、該方法は、病理学的タウ
に対する抗体を含む免疫応答をもたらし、それにより、該ヒト患者におけるアルツハイマ
ー病または関連タウオパチーに関連する症状の少なくとも１つを処置する、その進行を予
防する、または回復させる、方法。
（項目１０５）
タウへの結合についてＤＣ８Ｅ８と競合することができる抗体を作製する方法であって、
該方法は、項目８８〜９１の１項に記載のペプチドおよび／または項目９２〜９３の１項
に記載の化合物で被験体を免疫する工程を包含する、方法。
（項目１０６）
ＤＣ８Ｅ８を単離する方法、またはタウへの結合についてＤＣ８Ｅ８と競合することがで
きる抗体を単離する方法であって、該方法は、ＤＣ８Ｅ８または該抗体を、項目８８〜９
１の１項に記載のペプチドおよび／または項目９２〜９３の１項に記載の化合物と接触さ
せる工程を包含する、方法。
（項目１０７）
前記ペプチドおよび／または化合物が、静脈内に、筋肉内に、皮下に、腹腔内に、鼻腔内
に、脳室内に、髄腔内に、またはエアロゾルとして、投与される、項目１０１〜１０４の
１項に記載の方法。
（項目１０８）
各ペプチドおよび／または化合物の前記有効量が、１投薬あたり少なくとも１μｇ、１投
薬あたり少なくとも１０μｇ、１投薬あたり少なくとも１００μｇである、項目１０１〜
１０４および１０７の１項に記載の方法。
（項目１０９）
各ペプチドおよび／または化合物の前記有効量が、アジュバントの存在下において１投薬
あたり少なくとも１０μｇ、およびアジュバントの非存在下において１投薬あたり少なく
とも少なくとも１００μｇである、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
少なくとも１つのペプチドまたは化合物が、少なくとも６ヶ月間にわたって複数の投薬量
で投与される、項目１０１〜１０４および１０７〜１０９の１項に記載の方法。
（項目１１１）
被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーの進行を処置するまたは予防す
る方法であって、該方法は、有効量の項目１〜２５の１項に記載の少なくとも１つの抗体
および／または項目８８〜９１の１項に記載の少なくとも１つのペプチドおよび／または
項目９２〜９３の１項に記載の少なくとも１つの化合物を、アセチルコリンエステラーゼ
阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属キレート剤、成長因子、ホルモン
、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤、脂質低下剤、選択的ホスホジエ
ステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナーゼの阻害剤、熱ショックタンパ
ク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫、抗アミロイド凝集阻害剤、ならびにセ
クレターゼ阻害剤から選択される少なくとも１つの併用剤と組み合わせて該被験体に投与
する工程を包含する、方法。
（項目１１２）
前記方法は、運動障害を減少させることができる、運動機能を改善することができる、認
知障害を減少させることができる、認知機能を改善することができる、またはそれらの組
み合わせが可能である、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーに関連する症状の少なくとも１
つを回復させる方法であって、該方法は、有効量の項目１〜２５の１項に記載の少なくと
も１つの抗体および／または項目８８〜９１の１項に記載の少なくとも１つのペプチドお
よび／または項目９２〜９３の１項に記載の少なくとも１つの化合物を、アセチルコリン
エステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属キレート剤、成長因
子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤、脂質低下剤、選択
的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナーゼの阻害剤、熱シ
ョックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫試薬、抗アミロイド凝集阻
害剤、ならびにセクレターゼ阻害剤から選択される少なくとも１つの併用剤と組み合わせ
て該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１１４）
項目１１１〜１１３の１項に記載の方法であって、該方法は、有効量の項目１〜２５の１
項に記載の少なくとも１つの抗体、項目８８〜９１の１項に記載の１つのペプチドおよび
／または項目９２〜９３の１項に記載の少なくとも１つの化合物および／または免疫応答
を増強するアジュバントを；アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡレセプターア
ンタゴニスト、遷移金属キレート剤、成長因子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（Ｎ
ＳＡＩＤ）、酸化防止剤、脂質低下剤、選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の
阻害剤、タンパク質キナーゼの阻害剤、熱ショックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受
動および能動免疫、抗アミロイド凝集阻害剤、ならびにセクレターゼ阻害剤から選択され
る少なくとも１つの併用剤と組み合わせてヒト患者に投与する工程を包含し；該方法は、
病理学的タウに対する抗体を含む免疫応答をもたらし、それにより、該ヒト患者における
ＡＤに関連する症状の少なくとも１つを処置する、その進行を予防する、または回復させ
る、方法。
（項目１１５）
前記併用剤が、項目１〜２５の１項に記載の抗体、項目８８〜９１の１項に記載のペプチ
ドおよび／または項目９２〜９３の１項に記載の化合物の投与の前、該投与と同時、また
は該投与の後に投与される、項目１１１〜１１４の１項に記載の方法。
（項目１１６）
薬学的に許容され得るキャリアおよび／もしくは希釈剤；ならびに
ｄ）項目１〜２５の１項に記載の抗体；および／または
ｅ）項目８８〜９１の１項に記載のペプチド；および／または
ｆ）項目９２〜９３の１項に記載の化合物；
を、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属
キレート剤、成長因子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤
、脂質低下剤、選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナ
ーゼの阻害剤、熱ショックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫試薬、
抗アミロイド凝集阻害剤、ならびにセクレターゼ阻害剤から選択される少なくとも１つの
併用剤と組み合わせて含む、薬学的組成物。
前述の全般的な説明と以下の詳細な説明の両方が単に例示的および説明的であって、主
張されるように実施形態を限定しないことも理解されるべきである。
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成するものであって、いく
つかの実施形態を図示し、その説明とともに、実施形態の原理を説明するように働く。本
明細書中で論じられる刊行物は、単に、本願の出願日より前のそれらの開示を提供してい
るだけである。それらはすべて、それらの全体がすべての目的のために参照により援用さ
れる。先行発明を理由に本発明がそのような刊行物に先行する権利がないことを自認する
ものとして、本明細書中のいかなる記載も解釈されるべきでない。さらに、提供される刊
行物の日付は、実際の刊行日と異なることがあり、それは独立して確認される必要があり
得る。
ヒトタウの６つのアイソフォームの概略図。
ヒトタウ（２Ｎ４Ｒ）の概略の機能マップ。図２は、配列番号１１６および１１５としてそれぞれ「ＶＱＩＩＮＫ」および「ＶＱＩＶＹＫ」を開示している。
ＤＣ８Ｅ８可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、ならびに最も近いマウス生殖細胞系列配列に対するそれらのアラインメント。この図は、ＤＣ８Ｅ８の可変軽鎖（ＶＬ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１６５）（Ａ）およびアミノ酸配列（Ｂ）（掲載順にそれぞれ、配列番号１４１（可変軽鎖に対して）および１１７〜１１９（ＩＭＧＴに従ってそのＣＤＲの各々に対して））；（アラインメントは、掲載順にそれぞれ配列番号１６６および１６８を開示している）；および（Ｃ）ＤＣ８Ｅ８の可変軽鎖Ｖ遺伝子と最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＫＶ８−２１＊０１とのアラインメント（アラインメントは、掲載順にそれぞれ配列番号１６６および１６７を開示している）に続いてＤＣ８Ｅ８のＶＬ Ｊ遺伝子（配列番号１６８）と最も近いマウスＪ遺伝子ＩＧＫＪ１＊０１（配列番号１６９）とのアラインメントを示している。この図は、ＤＣ８Ｅ８の可変重鎖配列およびその３つのＣＲＤ配列のヌクレオチド配列（配列番号１７０）（Ｄにおいて）ならびにアミノ酸配列（掲載順にそれぞれ配列番号１７１および１２０〜１２２）を示している。（Ｆ）には、ＤＣ８Ｅ８に対する以下のアラインメントが示されている：第１に、最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＨＶ１−８１＊０１（配列番号１７２）とのＤＣ８Ｅ８の可変重（ＶＨ）鎖Ｖ遺伝子（配列番号１７２）；第２に、最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＨＤ２−１４＊０１（配列番号１７５）とのＤＣ８Ｅ８の可変重（ＶＨ）鎖Ｄ遺伝子（配列番号１７４）；および最後に、最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号１７７）とのＤＣ８Ｅ８の可変重（ＶＨ）鎖Ｊ遺伝子（配列番号１７６）。ＤＣ８Ｅ８カッパー軽鎖定常領域の配列（配列番号１７８）（Ｇ）および重鎖定常領域の配列（配列番号１７９）（Ｈ）も示されている。タンパク質配列（Ｂ）および（Ｅ）では相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれており、それは、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って特定された。 ＤＣ８Ｅ８可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、ならびに最も近いマウス生殖細胞系列配列に対するそれらのアラインメント。この図は、ＤＣ８Ｅ８の可変軽鎖（ＶＬ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１６５）（Ａ）およびアミノ酸配列（Ｂ）（掲載順にそれぞれ、配列番号１４１（可変軽鎖に対して）および１１７〜１１９（ＩＭＧＴに従ってそのＣＤＲの各々に対して））；（アラインメントは、掲載順にそれぞれ配列番号１６６および１６８を開示している）；および（Ｃ）ＤＣ８Ｅ８の可変軽鎖Ｖ遺伝子と最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＫＶ８−２１＊０１とのアラインメント（アラインメントは、掲載順にそれぞれ配列番号１６６および１６７を開示している）に続いてＤＣ８Ｅ８のＶＬ Ｊ遺伝子（配列番号１６８）と最も近いマウスＪ遺伝子ＩＧＫＪ１＊０１（配列番号１６９）とのアラインメントを示している。この図は、ＤＣ８Ｅ８の可変重鎖配列およびその３つのＣＲＤ配列のヌクレオチド配列（配列番号１７０）（Ｄにおいて）ならびにアミノ酸配列（掲載順にそれぞれ配列番号１７１および１２０〜１２２）を示している。（Ｆ）には、ＤＣ８Ｅ８に対する以下のアラインメントが示されている：第１に、最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＨＶ１−８１＊０１（配列番号１７２）とのＤＣ８Ｅ８の可変重（ＶＨ）鎖Ｖ遺伝子（配列番号１７２）；第２に、最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＨＤ２−１４＊０１（配列番号１７５）とのＤＣ８Ｅ８の可変重（ＶＨ）鎖Ｄ遺伝子（配列番号１７４）；および最後に、最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号１７７）とのＤＣ８Ｅ８の可変重（ＶＨ）鎖Ｊ遺伝子（配列番号１７６）。ＤＣ８Ｅ８カッパー軽鎖定常領域の配列（配列番号１７８）（Ｇ）および重鎖定常領域の配列（配列番号１７９）（Ｈ）も示されている。タンパク質配列（Ｂ）および（Ｅ）では相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれており、それは、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って特定された。 ＤＣ８Ｅ８可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、ならびに最も近いマウス生殖細胞系列配列に対するそれらのアラインメント。この図は、ＤＣ８Ｅ８の可変軽鎖（ＶＬ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１６５）（Ａ）およびアミノ酸配列（Ｂ）（掲載順にそれぞれ、配列番号１４１（可変軽鎖に対して）および１１７〜１１９（ＩＭＧＴに従ってそのＣＤＲの各々に対して））；（アラインメントは、掲載順にそれぞれ配列番号１６６および１６８を開示している）；および（Ｃ）ＤＣ８Ｅ８の可変軽鎖Ｖ遺伝子と最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＫＶ８−２１＊０１とのアラインメント（アラインメントは、掲載順にそれぞれ配列番号１６６および１６７を開示している）に続いてＤＣ８Ｅ８のＶＬ Ｊ遺伝子（配列番号１６８）と最も近いマウスＪ遺伝子ＩＧＫＪ１＊０１（配列番号１６９）とのアラインメントを示している。この図は、ＤＣ８Ｅ８の可変重鎖配列およびその３つのＣＲＤ配列のヌクレオチド配列（配列番号１７０）（Ｄにおいて）ならびにアミノ酸配列（掲載順にそれぞれ配列番号１７１および１２０〜１２２）を示している。（Ｆ）には、ＤＣ８Ｅ８に対する以下のアラインメントが示されている：第１に、最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＨＶ１−８１＊０１（配列番号１７２）とのＤＣ８Ｅ８の可変重（ＶＨ）鎖Ｖ遺伝子（配列番号１７２）；第２に、最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＨＤ２−１４＊０１（配列番号１７５）とのＤＣ８Ｅ８の可変重（ＶＨ）鎖Ｄ遺伝子（配列番号１７４）；および最後に、最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号１７７）とのＤＣ８Ｅ８の可変重（ＶＨ）鎖Ｊ遺伝子（配列番号１７６）。ＤＣ８Ｅ８カッパー軽鎖定常領域の配列（配列番号１７８）（Ｇ）および重鎖定常領域の配列（配列番号１７９）（Ｈ）も示されている。タンパク質配列（Ｂ）および（Ｅ）では相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれており、それは、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って特定された。 ＤＣ８Ｅ８可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、ならびに最も近いマウス生殖細胞系列配列に対するそれらのアラインメント。この図は、ＤＣ８Ｅ８の可変軽鎖（ＶＬ）領域のヌクレオチド配列（配列番号１６５）（Ａ）およびアミノ酸配列（Ｂ）（掲載順にそれぞれ、配列番号１４１（可変軽鎖に対して）および１１７〜１１９（ＩＭＧＴに従ってそのＣＤＲの各々に対して））；（アラインメントは、掲載順にそれぞれ配列番号１６６および１６８を開示している）；および（Ｃ）ＤＣ８Ｅ８の可変軽鎖Ｖ遺伝子と最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＫＶ８−２１＊０１とのアラインメント（アラインメントは、掲載順にそれぞれ配列番号１６６および１６７を開示している）に続いてＤＣ８Ｅ８のＶＬ Ｊ遺伝子（配列番号１６８）と最も近いマウスＪ遺伝子ＩＧＫＪ１＊０１（配列番号１６９）とのアラインメントを示している。この図は、ＤＣ８Ｅ８の可変重鎖配列およびその３つのＣＲＤ配列のヌクレオチド配列（配列番号１７０）（Ｄにおいて）ならびにアミノ酸配列（掲載順にそれぞれ配列番号１７１および１２０〜１２２）を示している。（Ｆ）には、ＤＣ８Ｅ８に対する以下のアラインメントが示されている：第１に、最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＨＶ１−８１＊０１（配列番号１７２）とのＤＣ８Ｅ８の可変重（ＶＨ）鎖Ｖ遺伝子（配列番号１７２）；第２に、最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＨＤ２−１４＊０１（配列番号１７５）とのＤＣ８Ｅ８の可変重（ＶＨ）鎖Ｄ遺伝子（配列番号１７４）；および最後に、最も近いマウス生殖細胞系列配列ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号１７７）とのＤＣ８Ｅ８の可変重（ＶＨ）鎖Ｊ遺伝子（配列番号１７６）。ＤＣ８Ｅ８カッパー軽鎖定常領域の配列（配列番号１７８）（Ｇ）および重鎖定常領域の配列（配列番号１７９）（Ｈ）も示されている。タンパク質配列（Ｂ）および（Ｅ）では相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれており、それは、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って特定された。
ＤＣ８Ｅ８可変軽（ＶＬ）鎖配列（それぞれ配列番号１６６（Ｖ遺伝子）および１６８（Ｊ遺伝子））と最も近いヒト生殖細胞系列ＶＬ遺伝子（掲載順にそれぞれ配列番号１８０〜１８１）とのアラインメント。
ＤＣ８Ｅ８可変重（ＶＨ）鎖配列（Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子に対してそれぞれ配列番号１７２、１７４および１７６）と最も近いヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子（掲載順にそれぞれ配列番号１８２〜１８３および１８５）とのアラインメント。 ＤＣ８Ｅ８可変重（ＶＨ）鎖配列（Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子に対してそれぞれ配列番号１７２、１７４および１７６）と最も近いヒト生殖細胞系列ＶＨ遺伝子（掲載順にそれぞれ配列番号１８２〜１８３および１８５）とのアラインメント。
ＥＬＩＳＡを使用したタウ欠失変異体によるＤＣ８Ｅ８のエピトープマッピング。（Ａ）ＤＣ８Ｅ８エピトープマッピングのために使用されたタウタンパク質の概略図および（Ｂ）それらのアミノ酸配列（掲載順にそれぞれ配列番号１８６〜１９７、１０２、１０４および１９８〜１９９）。（Ｃ）ＥＬＩＳＡの読取値。ＤＣ８Ｅ８は、以下のタウタンパク質を認識する：Δ３５８−４４１、Δ４２１−４４１、Δ１３４−１６８、Δ１−２２０、Δ１−１２６、２Ｎ４Ｒ、２Ｎ３Ｒ、Δ（１−２９６；３９２−４４１）およびΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ。ＤＣ８Ｅ８は、以下のタウタンパク質を認識しない：Δ２２２−４２７、Δ３０６−４００、Δ２２８−４４１、Δ３００−３１２、Δ２５７−４００、Δ１３７−４４１、Δ２８３−４４１。 ＥＬＩＳＡを使用したタウ欠失変異体によるＤＣ８Ｅ８のエピトープマッピング。（Ａ）ＤＣ８Ｅ８エピトープマッピングのために使用されたタウタンパク質の概略図および（Ｂ）それらのアミノ酸配列（掲載順にそれぞれ配列番号１８６〜１９７、１０２、１０４および１９８〜１９９）。（Ｃ）ＥＬＩＳＡの読取値。ＤＣ８Ｅ８は、以下のタウタンパク質を認識する：Δ３５８−４４１、Δ４２１−４４１、Δ１３４−１６８、Δ１−２２０、Δ１−１２６、２Ｎ４Ｒ、２Ｎ３Ｒ、Δ（１−２９６；３９２−４４１）およびΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ。ＤＣ８Ｅ８は、以下のタウタンパク質を認識しない：Δ２２２−４２７、Δ３０６−４００、Δ２２８−４４１、Δ３００−３１２、Δ２５７−４００、Δ１３７−４４１、Δ２８３−４４１。 ＥＬＩＳＡを使用したタウ欠失変異体によるＤＣ８Ｅ８のエピトープマッピング。（Ａ）ＤＣ８Ｅ８エピトープマッピングのために使用されたタウタンパク質の概略図および（Ｂ）それらのアミノ酸配列（掲載順にそれぞれ配列番号１８６〜１９７、１０２、１０４および１９８〜１９９）。（Ｃ）ＥＬＩＳＡの読取値。ＤＣ８Ｅ８は、以下のタウタンパク質を認識する：Δ３５８−４４１、Δ４２１−４４１、Δ１３４−１６８、Δ１−２２０、Δ１−１２６、２Ｎ４Ｒ、２Ｎ３Ｒ、Δ（１−２９６；３９２−４４１）およびΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ。ＤＣ８Ｅ８は、以下のタウタンパク質を認識しない：Δ２２２−４２７、Δ３０６−４００、Δ２２８−４４１、Δ３００−３１２、Δ２５７−４００、Δ１３７−４４１、Δ２８３−４４１。 ＥＬＩＳＡを使用したタウ欠失変異体によるＤＣ８Ｅ８のエピトープマッピング。（Ａ）ＤＣ８Ｅ８エピトープマッピングのために使用されたタウタンパク質の概略図および（Ｂ）それらのアミノ酸配列（掲載順にそれぞれ配列番号１８６〜１９７、１０２、１０４および１９８〜１９９）。（Ｃ）ＥＬＩＳＡの読取値。ＤＣ８Ｅ８は、以下のタウタンパク質を認識する：Δ３５８−４４１、Δ４２１−４４１、Δ１３４−１６８、Δ１−２２０、Δ１−１２６、２Ｎ４Ｒ、２Ｎ３Ｒ、Δ（１−２９６；３９２−４４１）およびΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ。ＤＣ８Ｅ８は、以下のタウタンパク質を認識しない：Δ２２２−４２７、Δ３０６−４００、Δ２２８−４４１、Δ３００−３１２、Δ２５７−４００、Δ１３７−４４１、Δ２８３−４４１。 ＥＬＩＳＡを使用したタウ欠失変異体によるＤＣ８Ｅ８のエピトープマッピング。（Ａ）ＤＣ８Ｅ８エピトープマッピングのために使用されたタウタンパク質の概略図および（Ｂ）それらのアミノ酸配列（掲載順にそれぞれ配列番号１８６〜１９７、１０２、１０４および１９８〜１９９）。（Ｃ）ＥＬＩＳＡの読取値。ＤＣ８Ｅ８は、以下のタウタンパク質を認識する：Δ３５８−４４１、Δ４２１−４４１、Δ１３４−１６８、Δ１−２２０、Δ１−１２６、２Ｎ４Ｒ、２Ｎ３Ｒ、Δ（１−２９６；３９２−４４１）およびΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ。ＤＣ８Ｅ８は、以下のタウタンパク質を認識しない：Δ２２２−４２７、Δ３０６−４００、Δ２２８−４４１、Δ３００−３１２、Δ２５７−４００、Δ１３７−４４１、Δ２８３−４４１。
（Ａ）および（Ｂ）それぞれ、エピトープマッピング用の合成ペプチド（掲載順にそれぞれ配列番号２０６、２０７、２０８、２、２１０、２１１、２１２、３、２１４、２１５、４、２１７、２６、２１９、３６、２２１、２２２、１０９および８８）の概略図およびそれらの配列。（Ｃ）合成ペプチドを用いたＥＬＩＳＡによるＤＣ８Ｅ８のエピトープマッピング。（Ｄ）ＤＣ８Ｅ８が結合することができる、タウ内のエピトープの概略図。ＤＣ８Ｅ８は、４つの別個の結合領域（それらの各々は、エピトープ１から４という名称の別個のエピトープである）のいずれか１つに結合することができる。その４つのエピトープの各々は、タンパク質タウの第１（エピトープ＃１）、第２（エピトープ＃２）、第３（エピトープ＃３）および第４（エピトープ＃４）リピートドメイン内に別々に位置する。示されているように、その４つのＤＣ８Ｅ８エピトープの各々は、それぞれ以下のアミノ酸配列の各々の１つの中に包含される：それぞれ、２６７−ＫＨＱＰＧＧＧ−２７３（配列番号９８）（タウタンパク質の第１リピートドメイン内）、２９８−ＫＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号９９）（タウタンパク質の第２リピートドメイン内）、３２９−ＨＨＫＰＧＧＧ−３３５（配列番号１００）（タウタンパク質の第３リピートドメイン内）および３６１−ＴＨＶＰＧＧＧ−３６７（配列番号１０１）（タウタンパク質の第４リピートドメイン内）。 （Ａ）および（Ｂ）それぞれ、エピトープマッピング用の合成ペプチド（掲載順にそれぞれ配列番号２０６、２０７、２０８、２、２１０、２１１、２１２、３、２１４、２１５、４、２１７、２６、２１９、３６、２２１、２２２、１０９および８８）の概略図およびそれらの配列。（Ｃ）合成ペプチドを用いたＥＬＩＳＡによるＤＣ８Ｅ８のエピトープマッピング。（Ｄ）ＤＣ８Ｅ８が結合することができる、タウ内のエピトープの概略図。ＤＣ８Ｅ８は、４つの別個の結合領域（それらの各々は、エピトープ１から４という名称の別個のエピトープである）のいずれか１つに結合することができる。その４つのエピトープの各々は、タンパク質タウの第１（エピトープ＃１）、第２（エピトープ＃２）、第３（エピトープ＃３）および第４（エピトープ＃４）リピートドメイン内に別々に位置する。示されているように、その４つのＤＣ８Ｅ８エピトープの各々は、それぞれ以下のアミノ酸配列の各々の１つの中に包含される：それぞれ、２６７−ＫＨＱＰＧＧＧ−２７３（配列番号９８）（タウタンパク質の第１リピートドメイン内）、２９８−ＫＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号９９）（タウタンパク質の第２リピートドメイン内）、３２９−ＨＨＫＰＧＧＧ−３３５（配列番号１００）（タウタンパク質の第３リピートドメイン内）および３６１−ＴＨＶＰＧＧＧ−３６７（配列番号１０１）（タウタンパク質の第４リピートドメイン内）。 （Ａ）および（Ｂ）それぞれ、エピトープマッピング用の合成ペプチド（掲載順にそれぞれ配列番号２０６、２０７、２０８、２、２１０、２１１、２１２、３、２１４、２１５、４、２１７、２６、２１９、３６、２２１、２２２、１０９および８８）の概略図およびそれらの配列。（Ｃ）合成ペプチドを用いたＥＬＩＳＡによるＤＣ８Ｅ８のエピトープマッピング。（Ｄ）ＤＣ８Ｅ８が結合することができる、タウ内のエピトープの概略図。ＤＣ８Ｅ８は、４つの別個の結合領域（それらの各々は、エピトープ１から４という名称の別個のエピトープである）のいずれか１つに結合することができる。その４つのエピトープの各々は、タンパク質タウの第１（エピトープ＃１）、第２（エピトープ＃２）、第３（エピトープ＃３）および第４（エピトープ＃４）リピートドメイン内に別々に位置する。示されているように、その４つのＤＣ８Ｅ８エピトープの各々は、それぞれ以下のアミノ酸配列の各々の１つの中に包含される：それぞれ、２６７−ＫＨＱＰＧＧＧ−２７３（配列番号９８）（タウタンパク質の第１リピートドメイン内）、２９８−ＫＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号９９）（タウタンパク質の第２リピートドメイン内）、３２９−ＨＨＫＰＧＧＧ−３３５（配列番号１００）（タウタンパク質の第３リピートドメイン内）および３６１−ＴＨＶＰＧＧＧ−３６７（配列番号１０１）（タウタンパク質の第４リピートドメイン内）。 （Ａ）および（Ｂ）それぞれ、エピトープマッピング用の合成ペプチド（掲載順にそれぞれ配列番号２０６、２０７、２０８、２、２１０、２１１、２１２、３、２１４、２１５、４、２１７、２６、２１９、３６、２２１、２２２、１０９および８８）の概略図およびそれらの配列。（Ｃ）合成ペプチドを用いたＥＬＩＳＡによるＤＣ８Ｅ８のエピトープマッピング。（Ｄ）ＤＣ８Ｅ８が結合することができる、タウ内のエピトープの概略図。ＤＣ８Ｅ８は、４つの別個の結合領域（それらの各々は、エピトープ１から４という名称の別個のエピトープである）のいずれか１つに結合することができる。その４つのエピトープの各々は、タンパク質タウの第１（エピトープ＃１）、第２（エピトープ＃２）、第３（エピトープ＃３）および第４（エピトープ＃４）リピートドメイン内に別々に位置する。示されているように、その４つのＤＣ８Ｅ８エピトープの各々は、それぞれ以下のアミノ酸配列の各々の１つの中に包含される：それぞれ、２６７−ＫＨＱＰＧＧＧ−２７３（配列番号９８）（タウタンパク質の第１リピートドメイン内）、２９８−ＫＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号９９）（タウタンパク質の第２リピートドメイン内）、３２９−ＨＨＫＰＧＧＧ−３３５（配列番号１００）（タウタンパク質の第３リピートドメイン内）および３６１−ＴＨＶＰＧＧＧ−３６７（配列番号１０１）（タウタンパク質の第４リピートドメイン内）。
（Ａ）ヒトタウアミノ酸配列（配列番号２２５）と他の種由来のタウタンパク質配列（掲載順にそれぞれ配列番号２２６〜２４５）とのアラインメント。完全長のヒトタウタンパク質をアラインメントのために使用した；そのアラインメントからヒトタウのアミノ酸２６５〜３６８だけが示されている。ヒトタウ上の４つの別個のＤＣ８Ｅ８エピトープを含む領域およびアラインメントされた配列を四角で囲んでおり、太字で示している。（Ｂ）６つのタウペプチド（掲載順にそれぞれ配列番号２０１〜２０５および２００）が抗体ＤＣ８Ｅ８への結合についてタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ（配列番号１９９）と競合する能力を示している競合ＥＬＩＳＡ。（Ｃ）７つのタウペプチド（配列番号１４４、１４６、１４９、１５１、１５９、１６１および１７１）が、タウ−タウ凝集に関わるタウエピトープの少なくとも１つを認識するタウ−タウ凝集に関わるタウエピトープの少なくとも１つを認識することができる抗体ＤＣ８Ｅ８への結合についてタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと競合する能力を示している競合ＥＬＩＳＡ。 （Ａ）ヒトタウアミノ酸配列（配列番号２２５）と他の種由来のタウタンパク質配列（掲載順にそれぞれ配列番号２２６〜２４５）とのアラインメント。完全長のヒトタウタンパク質をアラインメントのために使用した；そのアラインメントからヒトタウのアミノ酸２６５〜３６８だけが示されている。ヒトタウ上の４つの別個のＤＣ８Ｅ８エピトープを含む領域およびアラインメントされた配列を四角で囲んでおり、太字で示している。（Ｂ）６つのタウペプチド（掲載順にそれぞれ配列番号２０１〜２０５および２００）が抗体ＤＣ８Ｅ８への結合についてタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ（配列番号１９９）と競合する能力を示している競合ＥＬＩＳＡ。（Ｃ）７つのタウペプチド（配列番号１４４、１４６、１４９、１５１、１５９、１６１および１７１）が、タウ−タウ凝集に関わるタウエピトープの少なくとも１つを認識するタウ−タウ凝集に関わるタウエピトープの少なくとも１つを認識することができる抗体ＤＣ８Ｅ８への結合についてタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと競合する能力を示している競合ＥＬＩＳＡ。 （Ａ）ヒトタウアミノ酸配列（配列番号２２５）と他の種由来のタウタンパク質配列（掲載順にそれぞれ配列番号２２６〜２４５）とのアラインメント。完全長のヒトタウタンパク質をアラインメントのために使用した；そのアラインメントからヒトタウのアミノ酸２６５〜３６８だけが示されている。ヒトタウ上の４つの別個のＤＣ８Ｅ８エピトープを含む領域およびアラインメントされた配列を四角で囲んでおり、太字で示している。（Ｂ）６つのタウペプチド（掲載順にそれぞれ配列番号２０１〜２０５および２００）が抗体ＤＣ８Ｅ８への結合についてタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ（配列番号１９９）と競合する能力を示している競合ＥＬＩＳＡ。（Ｃ）７つのタウペプチド（配列番号１４４、１４６、１４９、１５１、１５９、１６１および１７１）が、タウ−タウ凝集に関わるタウエピトープの少なくとも１つを認識するタウ−タウ凝集に関わるタウエピトープの少なくとも１つを認識することができる抗体ＤＣ８Ｅ８への結合についてタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと競合する能力を示している競合ＥＬＩＳＡ。
（Ａ）タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒおよび２Ｎ４ＲへのＤＣ８Ｅ８の結合を特徴付ける表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）。（Ｂ）タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／３Ｒおよび２Ｎ３ＲへのＤＣ８Ｅ８の結合を特徴付ける表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）。 （Ａ）タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒおよび２Ｎ４ＲへのＤＣ８Ｅ８の結合を特徴付ける表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）。（Ｂ）タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／３Ｒおよび２Ｎ３ＲへのＤＣ８Ｅ８の結合を特徴付ける表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）。
（Ａ）ＳＰＲによって測定された、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒおよびタウ２Ｎ４ＲへのＤＣ８Ｅ８の結合の会合速度および解離速度。（Ｂ）ＳＰＲによって測定された、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／３Ｒおよびタウ２Ｎ３ＲへのＤＣ８Ｅ８の結合の会合速度および解離速度。その測定において使用された濃度は、プロットに示されており、動態パラメータの計算のために、測定されたデータからコンピュータプログラムＢＩＡ評価ソフトウェア４．１（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）によって破線が内挿された。 （Ａ）ＳＰＲによって測定された、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒおよびタウ２Ｎ４ＲへのＤＣ８Ｅ８の結合の会合速度および解離速度。（Ｂ）ＳＰＲによって測定された、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／３Ｒおよびタウ２Ｎ３ＲへのＤＣ８Ｅ８の結合の会合速度および解離速度。その測定において使用された濃度は、プロットに示されており、動態パラメータの計算のために、測定されたデータからコンピュータプログラムＢＩＡ評価ソフトウェア４．１（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）によって破線が内挿された。
モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８は、前臨床ＡＤと臨床的に初発のＡＤと完全に発症した最終段階のＡＤとを区別することができる。ＤＣ８Ｅ８は、ヒト前臨床ＡＤ−ＢｒａａｋステージＩにおける初期の段階（タウ単量体、二量体）の病理学的タウの染色を示す（Ａ）。その抗体は、病理学的タウオリゴマーの段階（矢印）および病理学的タウポリマー（濃縮体）の段階（矢頭）を認識する（Ｂ）。完全に発症したアルツハイマー病（最終段階−ＢｒａａｋステージＶＩ）において、ＤＣ８Ｅ８は、主に、神経原線維変化の形態の病理学的タウポリマー（矢頭）、老人斑（円の中）および糸屑状構造物（ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｔｈｒｅａｄｓ）（五角形の中）を認識する（Ｃ）。スケールバー：１００μｍ。モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８は、アルツハイマー病におけるすべての発症段階の濃縮体形成を認識する（Ｄ）。ＤＣ８Ｅ８は、初期発症段階の濃縮体形成−単量体、二量体および初期オリゴマー段階（Ｄ１）ならびに後期オリゴマープレ濃縮体段階（Ｄ２）、ならびに後期発症段階の病理学的タウポリマー−細胞内の神経原線維変化（Ｄ３）および細胞外の神経原線維変化（Ｄ４）を認識する。矢頭は、錐体海馬（ｐｙｒａｍｉｄａｌ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ）ニューロンの内部の小さいオリゴマータウ凝集体を指し示している（Ｄ１）。スケールバー：１０μｍ モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８は、前臨床ＡＤと臨床的に初発のＡＤと完全に発症した最終段階のＡＤとを区別することができる。ＤＣ８Ｅ８は、ヒト前臨床ＡＤ−ＢｒａａｋステージＩにおける初期の段階（タウ単量体、二量体）の病理学的タウの染色を示す（Ａ）。その抗体は、病理学的タウオリゴマーの段階（矢印）および病理学的タウポリマー（濃縮体）の段階（矢頭）を認識する（Ｂ）。完全に発症したアルツハイマー病（最終段階−ＢｒａａｋステージＶＩ）において、ＤＣ８Ｅ８は、主に、神経原線維変化の形態の病理学的タウポリマー（矢頭）、老人斑（円の中）および糸屑状構造物（ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｔｈｒｅａｄｓ）（五角形の中）を認識する（Ｃ）。スケールバー：１００μｍ。モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８は、アルツハイマー病におけるすべての発症段階の濃縮体形成を認識する（Ｄ）。ＤＣ８Ｅ８は、初期発症段階の濃縮体形成−単量体、二量体および初期オリゴマー段階（Ｄ１）ならびに後期オリゴマープレ濃縮体段階（Ｄ２）、ならびに後期発症段階の病理学的タウポリマー−細胞内の神経原線維変化（Ｄ３）および細胞外の神経原線維変化（Ｄ４）を認識する。矢頭は、錐体海馬（ｐｙｒａｍｉｄａｌ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ）ニューロンの内部の小さいオリゴマータウ凝集体を指し示している（Ｄ１）。スケールバー：１０μｍ
（Ａ）モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８は、トランスジェニックラットＳＨＲ７２において神経原線維変性を認識する。ＤＣ８Ｅ８は、タウオリゴマー段階（矢印）および濃縮体段階（矢頭）のタウ神経変性を認識する。さらに、その抗体は、軸索線維（長方形の内部）に位置するミスフォールドされたタウと反応する。（Ｂ）同齢のコントロールラット脳において、その抗体は、神経細胞内染色を示さない。スケールバー：２０μｍ。ＤＣ８Ｅ８は、ヒトアルツハイマー病におけるように、トランスジェニックラット脳（ＳＨＲ７２）において、すべての発症段階の濃縮体形成も認識する。ＤＣ８Ｅ８は、初期発症段階の濃縮体形成−単量体、二量体および初期オリゴマー段階（Ｃ）ならびに後期オリゴマープレ濃縮体段階（Ｄ）、ならびに後期発症段階の病理学的タウポリマー−細胞内の神経原線維変化（Ｅ）および細胞外の神経原線維変化（核を欠損）（Ｆ）を認識する。（Ｃ）における矢頭は、ニューロン（Ａ）内の小さなオリゴマータウ凝集体を指し示している。スケールバー：１０μｍ （Ａ）モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８は、トランスジェニックラットＳＨＲ７２において神経原線維変性を認識する。ＤＣ８Ｅ８は、タウオリゴマー段階（矢印）および濃縮体段階（矢頭）のタウ神経変性を認識する。さらに、その抗体は、軸索線維（長方形の内部）に位置するミスフォールドされたタウと反応する。（Ｂ）同齢のコントロールラット脳において、その抗体は、神経細胞内染色を示さない。スケールバー：２０μｍ。ＤＣ８Ｅ８は、ヒトアルツハイマー病におけるように、トランスジェニックラット脳（ＳＨＲ７２）において、すべての発症段階の濃縮体形成も認識する。ＤＣ８Ｅ８は、初期発症段階の濃縮体形成−単量体、二量体および初期オリゴマー段階（Ｃ）ならびに後期オリゴマープレ濃縮体段階（Ｄ）、ならびに後期発症段階の病理学的タウポリマー−細胞内の神経原線維変化（Ｅ）および細胞外の神経原線維変化（核を欠損）（Ｆ）を認識する。（Ｃ）における矢頭は、ニューロン（Ａ）内の小さなオリゴマータウ凝集体を指し示している。スケールバー：１０μｍ
（Ａ）タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／３Ｒを発現するＳＨＲ２４トランスジェニックラットの皮質における神経原線維変化のＤＣ８Ｅ８染色。（Ｂ）ＤＣ８Ｅ８は、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを発現するトランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳幹における神経原線維変化を認識した。組織切片をメチルグリーンで対比染色した。矢印−神経原線維変化。スケールバー：５０μｍ
モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８は、トランスジェニックラットモデルＳＨＲ２４（等皮質）およびアルツハイマー病患者（海馬、嗅内および側頭皮質を含む不等皮質組織）から単離された脳サンプル中の可溶性タウタンパク質（Ａ）と不溶性タウタンパク質（Ｂ）の両方を認識する。矢頭−ヒト切断型タウ、矢印−ラット内在性タウ。可溶性タウ画分の場合、１レーンあたり１５μｇのタンパク質を充填した。不溶性タウ画分の場合、ペレットを、１Ｓの１／５０体積の１×ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルローディング緩衝液に溶解し、可溶性画分の場合と同じ体積を充填した。モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８は、アルツハイマー病患者（海馬、嗅内皮質および側頭皮質を含む不等皮質組織）（Ｃ）およびトランスジェニックラットモデルＳＨＲ７２（脳幹）（Ｄ）から単離された脳サンプル中の可溶性タウタンパク質と不溶性タウタンパク質の両方を認識する。矢印−生理学的ヒトタウタンパク質（Ａ）およびラット内在性タウ（Ｂ）、矢頭−ＳＨＲ７２ラットのニューロンにおいて導入遺伝子として発現されたヒト切断型タウ（タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ）（Ｄ）。可溶性タウ画分の場合、１レーンあたり１５μｇの総タンパク質を充填した。不溶性タウ画分の場合、ペレットを、１Ｓの１／５０体積の１×ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルローディング緩衝液に溶解し、可溶性画分の場合と同じ体積を充填した。 モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８は、トランスジェニックラットモデルＳＨＲ２４（等皮質）およびアルツハイマー病患者（海馬、嗅内および側頭皮質を含む不等皮質組織）から単離された脳サンプル中の可溶性タウタンパク質（Ａ）と不溶性タウタンパク質（Ｂ）の両方を認識する。矢頭−ヒト切断型タウ、矢印−ラット内在性タウ。可溶性タウ画分の場合、１レーンあたり１５μｇのタンパク質を充填した。不溶性タウ画分の場合、ペレットを、１Ｓの１／５０体積の１×ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルローディング緩衝液に溶解し、可溶性画分の場合と同じ体積を充填した。モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８は、アルツハイマー病患者（海馬、嗅内皮質および側頭皮質を含む不等皮質組織）（Ｃ）およびトランスジェニックラットモデルＳＨＲ７２（脳幹）（Ｄ）から単離された脳サンプル中の可溶性タウタンパク質と不溶性タウタンパク質の両方を認識する。矢印−生理学的ヒトタウタンパク質（Ａ）およびラット内在性タウ（Ｂ）、矢頭−ＳＨＲ７２ラットのニューロンにおいて導入遺伝子として発現されたヒト切断型タウ（タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ）（Ｄ）。可溶性タウ画分の場合、１レーンあたり１５μｇの総タンパク質を充填した。不溶性タウ画分の場合、ペレットを、１Ｓの１／５０体積の１×ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルローディング緩衝液に溶解し、可溶性画分の場合と同じ体積を充填した。
ＤＣ８Ｅ８は、蛍光ベースのタウ線維化アッセイにおいて病理学的タウ−タウ相互作用を阻害する。チオフラビンＴ蛍光によって測定されるとき、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ（図１５Ａ）またはタウΔ（１−２９６；３９２−４４１）／４Ｒ（図１５Ｂ）を、コンフォーメーション変化を起こすようにおよび線維化する（ｆｉｂｒｉｌｉｚｅ）ようにヘパリンによって誘導した；病理学的なコンフォーメーションの変化を妨げる能力についてｍＡｂ ＤＣ８Ｅ８、Ｒａｂ５０およびＤＣ１１を試験した。
ＨＲＰ結合体化ｍＡｂ ＤＣ２５を使用した免疫ブロット法による、切断型タウタンパク質タウΔ（１−２９６；３９２−４４１）／４Ｒによるタウ二量体、三量体およびオリゴマーの形成を妨げるＤＣ８Ｅ８の阻害性の能力の解析。
ミクログリアＢＶ２細胞によるタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒの取り込みおよび分解。タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを、マウスＢＶ２細胞に単独で（１μＭ）またはモノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８と組み合わせて（１μＭタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ＋１μＭ ＤＣ８Ｅ８）加えた。様々な長さの時間（２、４、６および１２時間）にわたるインキュベーションの後、ＢＶ２細胞を酸洗浄し、細胞タンパク質を抽出し、内部移行されたタウのレベルを、ｐａｎ−タウ抗体ＤＣ２５を用いたウエスタンブロッティングによって解析した。タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを、細胞溶解産物（細胞内タウ）（Ａ）および細胞培養培地（細胞外タウ）（Ｂ）において免疫標識した。ＤＣ８Ｅ８抗体を、抗マウスＨＲＰ結合体化抗体を用いて可視化した。１レーンあたり２０μｇのタンパク質を充填した。 ミクログリアＢＶ２細胞によるタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒの取り込みおよび分解。タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを、マウスＢＶ２細胞に単独で（１μＭ）またはモノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８と組み合わせて（１μＭタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ＋１μＭ ＤＣ８Ｅ８）加えた。様々な長さの時間（２、４、６および１２時間）にわたるインキュベーションの後、ＢＶ２細胞を酸洗浄し、細胞タンパク質を抽出し、内部移行されたタウのレベルを、ｐａｎ−タウ抗体ＤＣ２５を用いたウエスタンブロッティングによって解析した。タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを、細胞溶解産物（細胞内タウ）（Ａ）および細胞培養培地（細胞外タウ）（Ｂ）において免疫標識した。ＤＣ８Ｅ８抗体を、抗マウスＨＲＰ結合体化抗体を用いて可視化した。１レーンあたり２０μｇのタンパク質を充填した。
ＥＬＩＳＡによって試験されたときの、３７℃におけるＤＣ８Ｅ８の安定性（保管寿命）。その抗体は、数ヶ月（１、２、３および４ヶ月）の保管の後に、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを認識した。バーは、記載のとおりの抗体の段階希釈を表している。測定は、３つ組で行われた。
ＤＣ８Ｅ８は、ヒトアルツハイマー病の脳組織におけるミスフォールドされた（疾患）タウを認識し、標的化する。（Ａ）ｐａｎ−タウＤＣ２５抗体を用いたウエスタンブロット解析：１）ヒトアルツハイマー病の脳組織からの病理学的タウの生化学的抽出（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，１９８９）；２）Ｍｏｃｋ抗体（Ｒａｂ５０）は、タウを認識しない；３）ＤＣ８Ｅ８は、ヒトアルツハイマー病の脳組織におけるミスフォールドされた（疾患）タウを認識し、標的化する；および（Ｂ）ポンソーＳ染色：２）、３）実験において使用された抗体量のコントロール（Ｒａｂ５０およびＤＣ８Ｅ８）。
ＤＣ８Ｅ８は、ＡＤのＳＨＲ７２ラットモデルの脳組織におけるミスフォールドされた（疾患）タウを認識し、標的化する。（Ａ）ｐａｎ−タウＤＣ２５抗体を用いたウエスタンブロット解析：４）ヒトアルツハイマー病の脳組織からの病理学的タウの生化学的抽出（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，１９８９）；５）Ｍｏｃｋ抗体（Ｒａｂ５０）は、タウを認識しない；６）ＤＣ８Ｅ８は、ヒトアルツハイマー病の脳組織におけるミスフォールドされた（疾患）タウを認識し、標的化する；および（Ｂ）ポンソーＳ染色：２）、３）実験において使用された抗体量のコントロール（Ｒａｂ５０およびＤＣ８Ｅ８）。
インビボにおいて、ＤＣ８Ｅ８は、トランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）の脳における病理学的形態のタウを標的化し、脳から末梢血に病理学的タウを運搬する。（Ａ）ＤＣ８Ｅ８で処置された動物の血清中のＤＣ８Ｅ８抗体の濃度は、それぞれ４６６、２００および２７３μｇ／ｍｌに達した。（Ｂ）脳から末梢血へのＤＣ８Ｅ８−タウ複合体のインビボでの運搬が観察された。病理学的タウは、３５０ｐｇ／ｍｌ血清という平均濃度に達した。ＤＣ８Ｅ８によるタウの能動輸送は、脳から病理学的タウタンパク質を排除する。他方で、狂犬病ウイルスを認識する（Ｍａｃｉｋｏｖａら、１９９２）ｍｏｃｋ抗体（Ｒａｂ５０）で処置された動物の血清中においてタウタンパク質は検出されなかった。処置動物の血清中のタウの濃度は、Ｉｎｎｏｔｅｓｔ ｈＴＡＵ ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって測定された。このグラフは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）とともに平均値を示している。ラットＡ〜Ｃに対する８本のバーの各々は、異なる連続血清希釈（左から右へ１００倍から１２，８００倍）を示している。
ＤＣ８Ｅ８モノクローナル抗体は、トランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）の脳から病理学的タウを除去する。（Ａ）ＤＣ８Ｅ８の脳内適用（左パネル）は、ｍｏｃｋ処置動物（右パネル）と比較して、ニューロンから（矢印）病理学的タウを除去する。（Ｂ）ｍｏｃｋ処置動物およびＤＣ８Ｅ８処置動物のニューロンにおける病理学的タウの量の定量は、ＤＣ８Ｅ８で処置された動物における病理学的タウの量の激減を示した（ｐ＜０．０００１）。 ＤＣ８Ｅ８モノクローナル抗体は、トランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）の脳から病理学的タウを除去する。（Ａ）ＤＣ８Ｅ８の脳内適用（左パネル）は、ｍｏｃｋ処置動物（右パネル）と比較して、ニューロンから（矢印）病理学的タウを除去する。（Ｂ）ｍｏｃｋ処置動物およびＤＣ８Ｅ８処置動物のニューロンにおける病理学的タウの量の定量は、ＤＣ８Ｅ８で処置された動物における病理学的タウの量の激減を示した（ｐ＜０．０００１）。
細菌において発現されたモノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８の組換えｓｃＦｖフラグメント（ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ）は、病理学的な誤無秩序タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを認識する。（Ａ）１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された、コントロールＢＬ２１細菌およびｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ発現プラスミドを内部に有する細菌の粗溶解産物のクマシーブリリアントブルー染色：レーン１、コントロールＢＬ２１細菌の粗溶解産物；レーン２、ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖを発現しているＢＬ２１細菌の粗溶解産物；およびレーンＭ、タンパク質分子量マーカー（Ｐａｇｅ Ｒｕｌｌｅｒ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ＃ＳＭ０６７２，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ。（Ｂ）タウタンパク質を含む、ポンソーＳで染色されたニトロセルロース膜：レーン１、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ、５００ｎｇ；レーン２、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ、２５０ｎｇ；レーン３、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ、１２５ｎｇ；レーン４、タウΔ２２８−４４１、５０ｎｇ；およびレーンＭ、タンパク質分子量マーカー。（Ｃ）ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖを発現している細菌由来の溶解産物を用いて検出された、Ｂ）におけるように充填されたタウタンパク質を含むウエスタンブロット／ニトロセルロース膜。（Ｄ）ネガティブコントロール細菌溶解産物を用いて像を得た、Ｂ）におけるように充填されたタウタンパク質を含むウエスタンブロット／ニトロセルロース膜。 細菌において発現されたモノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８の組換えｓｃＦｖフラグメント（ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ）は、病理学的な誤無秩序タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを認識する。（Ａ）１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された、コントロールＢＬ２１細菌およびｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ発現プラスミドを内部に有する細菌の粗溶解産物のクマシーブリリアントブルー染色：レーン１、コントロールＢＬ２１細菌の粗溶解産物；レーン２、ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖを発現しているＢＬ２１細菌の粗溶解産物；およびレーンＭ、タンパク質分子量マーカー（Ｐａｇｅ Ｒｕｌｌｅｒ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ＃ＳＭ０６７２，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ。（Ｂ）タウタンパク質を含む、ポンソーＳで染色されたニトロセルロース膜：レーン１、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ、５００ｎｇ；レーン２、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ、２５０ｎｇ；レーン３、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ、１２５ｎｇ；レーン４、タウΔ２２８−４４１、５０ｎｇ；およびレーンＭ、タンパク質分子量マーカー。（Ｃ）ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖを発現している細菌由来の溶解産物を用いて検出された、Ｂ）におけるように充填されたタウタンパク質を含むウエスタンブロット／ニトロセルロース膜。（Ｄ）ネガティブコントロール細菌溶解産物を用いて像を得た、Ｂ）におけるように充填されたタウタンパク質を含むウエスタンブロット／ニトロセルロース膜。
モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８の組換えｓｃＦｖフラグメント（ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ）は、ＤＣ８Ｅ８抗体（タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを選択的に認識する）に類似のタウ結合特性を示す。（Ａ）ＳＰＲによる、ＡＤタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４ＲへのｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの結合の動態親和性の測定。（Ｂ）ＳＰＲによる、タウ２Ｎ４ＲへのｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの結合の動態親和性の測定。（Ｃ）ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの結合についての速度定数（ｋＯＮおよびｋＯＦＦ）および会合平衡定数。
誤無秩序タウのｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ／ＤＣ８Ｅ８の認識に影響する、ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ結合部位における残基の同定。（Ａ）ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ発現プラスミド（ｗｔ）およびその変異体型を内部に有するＢＬ２１細菌の粗溶解産物由来のタンパク質の分離後のポリアクリルアミドゲルのクマシーブリリアントブルー染色。ナンバリングされた各レーンは、それぞれのクローン番号に対応する（例えば、レーン２は、２−ＶＬ−Ｒ３３Ａに対応する）。発現された一本鎖タンパク質が、星印によって指し示されている。コントロール細菌培養物は、一本鎖タンパク質を発現しない。（Ｂ）タウタンパク質を含む、ポンソーＳ染色されたニトロセルロース膜：レーン１、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ，５００ｎｇ；レーン２、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ，２５０ｎｇ；レーン３、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ，１２５ｎｇ。（Ｃ）ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ（ｗｔゲル）またはその変異体型の１つ（ブロット１−ＶＬ−Ｎ３１Ａから２２−ＶＨ−Ｇ１０２Ａ）を発現している細菌由来の溶解産物を用いて検出された、Ｂ）におけるように充填されたタウタンパク質を含むニトロセルロース膜におけるウエスタンブロット。 誤無秩序タウのｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ／ＤＣ８Ｅ８の認識に影響する、ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ結合部位における残基の同定。（Ａ）ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ発現プラスミド（ｗｔ）およびその変異体型を内部に有するＢＬ２１細菌の粗溶解産物由来のタンパク質の分離後のポリアクリルアミドゲルのクマシーブリリアントブルー染色。ナンバリングされた各レーンは、それぞれのクローン番号に対応する（例えば、レーン２は、２−ＶＬ−Ｒ３３Ａに対応する）。発現された一本鎖タンパク質が、星印によって指し示されている。コントロール細菌培養物は、一本鎖タンパク質を発現しない。（Ｂ）タウタンパク質を含む、ポンソーＳ染色されたニトロセルロース膜：レーン１、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ，５００ｎｇ；レーン２、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ，２５０ｎｇ；レーン３、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ，１２５ｎｇ。（Ｃ）ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ（ｗｔゲル）またはその変異体型の１つ（ブロット１−ＶＬ−Ｎ３１Ａから２２−ＶＨ−Ｇ１０２Ａ）を発現している細菌由来の溶解産物を用いて検出された、Ｂ）におけるように充填されたタウタンパク質を含むニトロセルロース膜におけるウエスタンブロット。 誤無秩序タウのｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ／ＤＣ８Ｅ８の認識に影響する、ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ結合部位における残基の同定。（Ａ）ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ発現プラスミド（ｗｔ）およびその変異体型を内部に有するＢＬ２１細菌の粗溶解産物由来のタンパク質の分離後のポリアクリルアミドゲルのクマシーブリリアントブルー染色。ナンバリングされた各レーンは、それぞれのクローン番号に対応する（例えば、レーン２は、２−ＶＬ−Ｒ３３Ａに対応する）。発現された一本鎖タンパク質が、星印によって指し示されている。コントロール細菌培養物は、一本鎖タンパク質を発現しない。（Ｂ）タウタンパク質を含む、ポンソーＳ染色されたニトロセルロース膜：レーン１、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ，５００ｎｇ；レーン２、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ，２５０ｎｇ；レーン３、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ，１２５ｎｇ。（Ｃ）ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ（ｗｔゲル）またはその変異体型の１つ（ブロット１−ＶＬ−Ｎ３１Ａから２２−ＶＨ−Ｇ１０２Ａ）を発現している細菌由来の溶解産物を用いて検出された、Ｂ）におけるように充填されたタウタンパク質を含むニトロセルロース膜におけるウエスタンブロット。
（Ａ）残基２６１〜３７３（配列番号２４６）の拡大領域内の斜線の四角形に示されている４つのＤＣ８Ｅ８エピトープ：それぞれ配列番号９８〜１０１を含むタウ２Ｎ４Ｒ（配列番号１０２）の概略図。（１）能動ワクチンとして使用するためのまたはＤＣ８Ｅ８抗体などを精製するための、ＤＣ８Ｅ８抗体によって認識されるタウの４つの領域の少なくとも１つを含む一部重複しているタウ由来ペプチド免疫原の概略図；（２）自由選択の部分を含む、他の改変されたペプチドおよび化合物ならびにデザイナーペプチドおよび化合物に対する一般的な可能性。（Ｂ）ペプチド配列番号１〜８および１０８で処置されたトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを発現する）の脳幹から調製された不溶性タウの免疫ブロット解析の要約。以下のＡＤ関連エピトープの不溶性タウの減少を測定するために、様々なｍＡｂを用いて免疫ブロット解析を行った：ｍＡｂ ＤＣ２５（タウ３４７−３５３）、ｍＡｂ ＤＣ２１７（タウｐＴｈｒ２１７）、ｍＡｂ ＤＣ２０９（タウｐＴｈｒ２３１）、ｍＡｂ ＡＴ８（タウｐＳｅｒ２０２／ｐＴｈｒ２０５）およびｍＡｂ ＡＴ２７０（タウｐＴｈｒ１８１）。（Ｃ）アジュバントと組み合わせてタウ２５１−ＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫ−２８０（配列番号１）で処置されたラットの脳幹およびアジュバントだけで処置されたコントロールラットから調製された不溶性タウのデンシトメトリーによる免疫ブロット解析。平均値は、平均値の標準誤差とともに提示されている。 （Ａ）残基２６１〜３７３（配列番号２４６）の拡大領域内の斜線の四角形に示されている４つのＤＣ８Ｅ８エピトープ：それぞれ配列番号９８〜１０１を含むタウ２Ｎ４Ｒ（配列番号１０２）の概略図。（１）能動ワクチンとして使用するためのまたはＤＣ８Ｅ８抗体などを精製するための、ＤＣ８Ｅ８抗体によって認識されるタウの４つの領域の少なくとも１つを含む一部重複しているタウ由来ペプチド免疫原の概略図；（２）自由選択の部分を含む、他の改変されたペプチドおよび化合物ならびにデザイナーペプチドおよび化合物に対する一般的な可能性。（Ｂ）ペプチド配列番号１〜８および１０８で処置されたトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを発現する）の脳幹から調製された不溶性タウの免疫ブロット解析の要約。以下のＡＤ関連エピトープの不溶性タウの減少を測定するために、様々なｍＡｂを用いて免疫ブロット解析を行った：ｍＡｂ ＤＣ２５（タウ３４７−３５３）、ｍＡｂ ＤＣ２１７（タウｐＴｈｒ２１７）、ｍＡｂ ＤＣ２０９（タウｐＴｈｒ２３１）、ｍＡｂ ＡＴ８（タウｐＳｅｒ２０２／ｐＴｈｒ２０５）およびｍＡｂ ＡＴ２７０（タウｐＴｈｒ１８１）。（Ｃ）アジュバントと組み合わせてタウ２５１−ＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫ−２８０（配列番号１）で処置されたラットの脳幹およびアジュバントだけで処置されたコントロールラットから調製された不溶性タウのデンシトメトリーによる免疫ブロット解析。平均値は、平均値の標準誤差とともに提示されている。 （Ａ）残基２６１〜３７３（配列番号２４６）の拡大領域内の斜線の四角形に示されている４つのＤＣ８Ｅ８エピトープ：それぞれ配列番号９８〜１０１を含むタウ２Ｎ４Ｒ（配列番号１０２）の概略図。（１）能動ワクチンとして使用するためのまたはＤＣ８Ｅ８抗体などを精製するための、ＤＣ８Ｅ８抗体によって認識されるタウの４つの領域の少なくとも１つを含む一部重複しているタウ由来ペプチド免疫原の概略図；（２）自由選択の部分を含む、他の改変されたペプチドおよび化合物ならびにデザイナーペプチドおよび化合物に対する一般的な可能性。（Ｂ）ペプチド配列番号１〜８および１０８で処置されたトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを発現する）の脳幹から調製された不溶性タウの免疫ブロット解析の要約。以下のＡＤ関連エピトープの不溶性タウの減少を測定するために、様々なｍＡｂを用いて免疫ブロット解析を行った：ｍＡｂ ＤＣ２５（タウ３４７−３５３）、ｍＡｂ ＤＣ２１７（タウｐＴｈｒ２１７）、ｍＡｂ ＤＣ２０９（タウｐＴｈｒ２３１）、ｍＡｂ ＡＴ８（タウｐＳｅｒ２０２／ｐＴｈｒ２０５）およびｍＡｂ ＡＴ２７０（タウｐＴｈｒ１８１）。（Ｃ）アジュバントと組み合わせてタウ２５１−ＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫ−２８０（配列番号１）で処置されたラットの脳幹およびアジュバントだけで処置されたコントロールラットから調製された不溶性タウのデンシトメトリーによる免疫ブロット解析。平均値は、平均値の標準誤差とともに提示されている。
タウ２５１−ＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫ−２８０（配列番号１）で処置された、ＡＤをモデル化しているトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）の神経行動学的評価。免疫原の５回目の投与の１０日後に、トランスジェニックラットを行動試験のために使用した。図は、平均値±ＳＥＭを表している。すべての統計データは、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーＵ検定を用いて得られた。（Ａ）梁歩行試験（３．５梁）。（Ｂ）後肢のスリップ回数（３．５梁）。（Ｃ）Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅ。
タウペプチド配列番号１をトランスジェニックラットＳＨＲ７２にワクチン接種することによって、神経原線維変化（ＮＦＴ）の量が４９％減少した。抗体ＡＴ８を、トランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳組織におけるＮＦＴの評価のために使用した。
アジュバントとともにタウ２５６−ＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳ−２８５（配列番号２）で処置されたトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）またはアジュバントだけで処置されたコントロールラットの脳幹から調製された不溶性タウの定量的免疫ブロット解析。平均値は、平均値の標準誤差とともに提示されている。
タウ２５６−ＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳ−２８５（配列番号２）で処置されたトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）の神経行動学的評価。すべての統計データは、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーＵ検定を用いて得られた。（Ａ）梁歩行試験（３．５梁）。（Ｂ）後肢のスリップ回数（３．５梁）。（Ｃ）Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅ。
タウペプチド配列番号２をトランスジェニックラットＳＨＲ７２にワクチン接種することによって、神経原線維変化（ＮＦＴ）の量が６０％減少した。抗体ＡＴ８をトランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳組織におけるＮＦＴの評価のために使用した。
アジュバントとともにリン酸化Ｓｅｒ２６２を有するタウ２５６−ＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳ−２８５（配列番号２）で処置されたトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）またはアジュバントだけで処置されたコントロールラットの脳幹から調製された不溶性タウの定量的免疫ブロット解析。平均値は、平均値の標準誤差とともに提示されている。
タウペプチド配列番号２／ホスホをトランスジェニックラットＳＨＲ７２にワクチン接種することによって、神経原線維変化（ＮＦＴ）の量が７７％減少した。抗体ＡＴ８をトランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳組織におけるＮＦＴの評価のために使用した。
アジュバントとともにタウ２５９−ＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱ−２８８（配列番号３）で処置されたトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）またはアジュバントだけで処置されたコントロールラットの脳幹から調製された不溶性タウの定量的免疫ブロット解析。平均値は、平均値の標準誤差とともに提示されている。
タウ２５９−ＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱ−２８８（配列番号３）で処置されたトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）の神経行動学的評価。すべての統計データは、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーＵ検定を用いて得られた。（Ａ）梁歩行試験（３．５梁）。（Ｂ）後肢のスリップ回数（３．５梁）。（Ｃ）Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅ。
タウペプチド配列番号３をトランスジェニックラットＳＨＲ７２にワクチン接種することによって、神経原線維変化（ＮＦＴ）の量が５８％減少した。抗体ＡＴ８をトランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳組織におけるＮＦＴの評価のために使用した。
タウ２７５−ＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号４）で処置されたトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）またはアジュバントだけで処置されたコントロールラットの脳幹から調製された不溶性タウの定量的免疫ブロット解析。平均値は、平均値の標準誤差とともに提示されている。
タウペプチド配列番号４によるトランスジェニックラットＳＨＲ７２のワクチン接種は、神経行動学的パラメータの中程度の改善を示した。（Ａ）梁歩行試験（３．５ｃｍ梁）。（Ｂ）後肢のスリップ回数（３．５ｃｍ梁）。（Ｃ）Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅ。データは、平均値の標準誤差を伴う平均値として提示されている。
タウペプチド配列番号４をトランスジェニックラットＳＨＲ７２にワクチン接種することによって、神経原線維変化（ＮＦＴ）の量が６６％減少した。抗体ＡＴ８をトランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳組織におけるＮＦＴの評価のために使用した。
アジュバントとともに、２１７位にリン酸化トレオニンを有するタウ２０１−ＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴ ＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲ−２３０（配列番号５）で免疫されたトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）、またはアジュバントだけで処置されたコントロールラットの脳幹から調製された不溶性タウの免疫ブロット解析。平均値は、平均値の標準誤差とともに提示されている。
２１７位にリン酸化トレオニンを有するタウ２０１−ＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲ−２３０（配列番号５）で処置されたトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）の神経行動学的評価。すべての統計データは、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーＵ検定を用いて得られた。（Ａ）梁歩行試験（３．５梁）。（Ｂ）後肢のスリップ回数（３．５梁）。（Ｃ）Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅ。
タウペプチド配列番号５によるトランスジェニックラットＳＨＲ７２のワクチン接種は、神経原線維変化（ＮＦＴ）の量に対する効果を示さなかった。抗体ＡＴ８をトランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳組織におけるＮＦＴの評価のために使用した。
３９６位および４０４位にリン酸化セリン残基を有するタウ３７９−ＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶ ＳＧＤＴＳＰＲＨＬ−４０８（配列番号６）およびアジュバントで免疫されたトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）またはアジュバントだけで処置されたコントロールラットの脳幹から調製された不溶性タウの免疫ブロット解析。平均値は、平均値の標準誤差とともに提示されている。
Ｓｅｒ３９６／Ｓｅｒ４０４においてリン酸化されているタウ配列番号６で処置されたトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）の神経行動学的評価。すべての統計データは、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーＵ検定を用いて得られた。（Ａ）梁歩行試験（３．５梁）。（Ｂ）後肢のスリップ回数（３．５梁）。（Ｃ）Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅ。
タウペプチド配列番号６によるトランスジェニックラットＳＨＲ７２のワクチン接種は、神経原線維変化（ＮＦＴ）の量の減少を示さなかった。抗体ＡＴ８をトランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳組織におけるＮＦＴの評価のために使用した。
アジュバントとともに２０２位にリン酸化セリン残基および２０５位にトレオニン残基を有するタウ１８１−ＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳ−２１０（配列番号７）で免疫されたラット（ＳＨＲ７２）またはアジュバントだけで処置されたコントロールラットの脳幹から調製された不溶性タウの免疫ブロット解析。平均値は、平均値の標準誤差とともに提示されている。
２０２位にリン酸化セリン残基および２０５位にトレオニン残基を有するタウ１８１−ＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳ−２１０（配列番号７）で処置されたＳＨＲ７２ラットの神経行動学的評価。すべての統計データは、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーＵ検定を用いて得られた。（Ａ）梁歩行試験（３．５梁）。（Ｂ）後肢のスリップ回数（３．５梁）。（Ｃ）Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅ。
タウペプチド配列番号７によるトランスジェニックラットＳＨＲ７２のワクチン接種は、神経原線維変化（ＮＦＴ）の量に対して効果を示さなかった。抗体ＡＴ８をトランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳組織におけるＮＦＴの評価のために使用した。
アジュバントとともにタウ３００−ＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫ−３１７（配列番号８）で免疫されたラット（ＳＨＲ７２）またはアジュバントだけで処置されたコントロールラットの脳幹から調製された不溶性タウの免疫ブロット解析。平均値は、平均値の標準誤差とともに提示されている。
タウ３００−ＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫ−３１７（配列番号８）で処置されたトランスジェニックＡＤラット（ＳＨＲ７２）の神経行動学的評価。すべての統計データは、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーＵ検定を用いて得られた。（Ａ）梁歩行試験（３．５梁）。（Ｂ）後肢のスリップ回数（３．５梁）。（Ｃ）Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅ。
タウペプチド配列番号８によるトランスジェニックラットＳＨＲ７２のワクチン接種は、神経原線維変化（ＮＦＴ）の量の減少を示さなかった。抗体ＡＴ８をトランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳組織におけるＮＦＴの評価のために使用した。
タウペプチド（配列番号１０８）によるトランスジェニックラットＳＨＲ７２のワクチン接種は、不溶性の病理学的タウを統計学的に有意に減少させた（ｐ＜０．００１）。病理学的不溶性タウを、タウペプチドで免疫されたトランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳から抽出し、免疫ブロット法によって解析した。平均値は、平均値の標準誤差とともに提示されている。
タウペプチド（配列番号１０８）によるトランスジェニックラットＳＨＲ７２のワクチン接種は、神経行動学的パラメータを統計学的に有意に改善した（ｐ＜０．０５）。（Ａ）梁歩行試験（３．５ｃｍ梁）。（Ｂ）後肢のスリップ回数（３．５ｃｍ梁）。（Ｃ）Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅ。データは、平均値の標準誤差を伴う平均値として提示されている。
タウペプチド（配列番号１０８）をトランスジェニックラットＳＨＲ７２にワクチン接種することによって、神経原線維変化（ＮＦＴ）の量が６０％減少した。抗体ＡＴ８をトランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳組織におけるＮＦＴの評価のために使用した。
ペプチドタウ２７５−ＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号４）によるトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）の免疫から産生された抗血清のＥＬＩＳＡは、ヒト病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒおよびヒト生理学的タウ２Ｎ４Ｒに対する抗血清の結合の差を示す。
タウペプチド配列番号１０８をトランスジェニックラットＳＨＲ７２にワクチン接種することによって、病理学的タウタンパク質に優先的に結合する抗体の形成が誘導された。ＥＬＩＳＡを用いて測定された幾何平均抗体価は、タウペプチド配列番号１０８のワクチン接種によって誘発された抗体が、免疫原（配列番号１０８ペプチド）および病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対して最も高い結合活性を示したことを示している。コントロールとして使用された生理学的タウ（タウ２Ｎ４Ｒ）は、より弱く認識された。
タウペプチド配列番号１０８をトランスジェニックラットＳＨＲ７２にワクチン接種することによって、病理学的タウに特異的なＩｇＧ抗体アイソタイプの形成が優先的に誘導された。タウペプチド配列番号１０８によって誘導された抗体のアイソタイププロファイルが示されている。個々のラット由来の血清を１：８００希釈し、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対する結合活性をＥＬＩＳＡによって解析した。
ヒトタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒおよびヒトタウ２Ｎ４Ｒへの結合についての、ペプチドタウ２７５−ＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号４）によるＳＨＲ７２ラットの免疫から産生された抗血清のＳＰＲ親和性測定。
タウ２７５−ＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号４）によるトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）の免疫から産生されたラット抗体を用いた、ヒトＡＤ患者由来の脳の免疫組織化学的染色。（Ａ）抗血清は、アルツハイマー病脳の海馬における神経原線維病変を認識した。（Ｂ）より高い拡大率は神経原線維変化を示した。スケールバー：１００μｍ（Ａ）、１０μｍ（Ｂ）。
タウペプチド配列番号１０８をトランスジェニックラットＳＨＲ７２にワクチン接種することによって、ヒトアルツハイマー病脳組織由来の切片において病理学的タウタンパク質を認識する抗体が誘導された。ラット血清Ｎｏ．３（Ａ）、５（Ｂ）、６（Ｃ）、７（Ｄ）および８（Ｅ）の代表的な免疫染色は、試験されたすべてのラット血清抗体が、アルツハイマー病患者の嗅内皮質のＰｒｅ−α層における神経原線維変化を認識したことを示している。アジュバントのみで免疫されたラット由来のプールされた血清を、ネガティブコントロールとして使用した（Ｆ）。嗅内皮質由来の連続脳組織切片を使用した。スケールバー：５０μｍ。
タウペプチド配列番号１０８をトランスジェニックラットＳＨＲ７２にワクチン接種することによって、ヒトアルツハイマー病脳ならびにトランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳における病理学的タウタンパク質を認識する特異的抗体が誘導された。病理学的タウを、ヒトおよびラット脳組織から抽出し、ペプチド配列番号１０８で免疫されたトランスジェニックラットＳＨＲ７２由来のプールされた血清を用いる免疫ブロット法によって解析した。その血清抗体は、ＡＤに特徴的なＡ６８病理学的タウを含む、単量体（レーンＮｏ．１、２およびＮｏ．３）およびオリゴマー（レーンＮｏ．２およびＮｏ．３）病理学的タウを認識した。
タウペプチド配列番号１０９でマウスを免疫することによって、生理学的タウ２Ｎ４Ｒよりも病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対して統計学的に有意に高い結合活性を有する抗体が誘導された（ｐ＝０．０１１５）。このグラフは、１：８００希釈された個々の血清に対するＥＬＩＳＡの結果の統計学的評価を表している。平均値は、平均値の標準誤差とともに示されている。
タウペプチド配列番号１１０でマウスを免疫することによって、生理学的タウ２Ｎ４Ｒよりも病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対して統計学的に有意に高い結合活性を示す抗体が誘導された（ｐ＝０．００２９）。このグラフは、１：８００希釈された個々の血清に対するＥＬＩＳＡの結果の統計学的評価を表している。平均値は、平均値の標準誤差とともに示されている。
タウペプチド配列番号１１１でマウスを免疫することによって、生理学的タウ２Ｎ４Ｒよりも病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対して統計学的に有意に高い結合活性を示す抗体が誘導された（ｐ＝０．０００７）。このグラフは、１：８００希釈された個々の血清に対するＥＬＩＳＡの結果の統計学的評価を表している。平均値は、平均値の標準誤差とともに示されている。
タウペプチド配列番号１１２でマウスを免疫することによって、生理学的タウ２Ｎ４Ｒよりも病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対して統計学的に有意に高い結合活性を示す抗体が誘導された（ｐ＜０．００１）。このグラフは、１：８００希釈された個々の血清に対するＥＬＩＳＡの結果の統計学的評価を表している。平均値は、平均値の標準誤差とともに示されている。
デザイナー治療用エピトープＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５０）およびＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）は、抗体ＤＣ８Ｅ８への結合について病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）４Ｒと競合した。
デザイナー治療用エピトープＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５０）およびＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）は、ＥＬＩＳＡによってアッセイされたとき、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）４Ｒと生理学的タウ２Ｎ４Ｒとを統計学的に有意に区別する抗体の産生を誘導した。ペプチド２５０および２５１の一方で免疫されたマウス由来の血清（１：３２００希釈）を、タウタンパク質：病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）４Ｒおよび生理学的タウ２Ｎ４Ｒに特異的な抗体についてＥＬＩＳＡによって試験した。
デザイナー治療用エピトープＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５０）およびＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）で免疫することによって、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体の最も堅調な産生が誘導された。
定量的ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）測定は、デザイナー治療用エピトープ１（ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５０）（図６９Ａ）およびデザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５１）（図６９Ｂ）によって誘導された抗体が、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと生理学的２Ｎ４Ｒタウとを統計学的に有意に（それぞれｐ＜０．００１およびｐ＜０．０１）区別したことを示している。 定量的ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）測定は、デザイナー治療用エピトープ１（ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５０）（図６９Ａ）およびデザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５１）（図６９Ｂ）によって誘導された抗体が、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと生理学的２Ｎ４Ｒタウとを統計学的に有意に（それぞれｐ＜０．００１およびｐ＜０．０１）区別したことを示している。
デザイナー治療用エピトープ１（ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５０）およびデザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５１）に対して産生された血清を用いたヒトＡＤ病脳組織の免疫組織化学的染色。（Ａ）デザイナー治療用エピトープ１に対する抗血清は、ＡＤ患者の脳における神経原線維病理を認識した。（Ｃ）高拡大率の神経原線維変化および糸屑状構造物（矢印）。（Ｂ）デザイナー治療用エピトープ２に対する抗血清は、ＡＤ患者の脳における神経原線維病理を認識した。（Ｄ）高拡大率の染色された神経原線維変化および糸屑状構造物（矢印）。デザイナー治療用エピトープ１およびデザイナー治療用エピトープ２に対する抗血清は、コントロールヒト脳における正常タウを認識しなかった（Ｅ、Ｆ）。スケールバー：５０μｍ（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）、２０μｍ（Ｃ、Ｄ）。（Ｇ）デザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５１）に対して産生された血清は、トランスジェニックラットＳＨＲ７２における神経原線維病変を認識する。（Ｈ）同齢のコントロールラット脳において、その抗体は、神経細胞内染色を示さない。その血清は、オリゴマープレ濃縮体段階（Ｉ）ならびに細胞内（Ｊ）を認識する。スケールバー：２０μｍ（Ａ、Ｂ）、１０μｍ（Ｃ、Ｄ）。 デザイナー治療用エピトープ１（ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５０）およびデザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５１）に対して産生された血清を用いたヒトＡＤ病脳組織の免疫組織化学的染色。（Ａ）デザイナー治療用エピトープ１に対する抗血清は、ＡＤ患者の脳における神経原線維病理を認識した。（Ｃ）高拡大率の神経原線維変化および糸屑状構造物（矢印）。（Ｂ）デザイナー治療用エピトープ２に対する抗血清は、ＡＤ患者の脳における神経原線維病理を認識した。（Ｄ）高拡大率の染色された神経原線維変化および糸屑状構造物（矢印）。デザイナー治療用エピトープ１およびデザイナー治療用エピトープ２に対する抗血清は、コントロールヒト脳における正常タウを認識しなかった（Ｅ、Ｆ）。スケールバー：５０μｍ（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）、２０μｍ（Ｃ、Ｄ）。（Ｇ）デザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５１）に対して産生された血清は、トランスジェニックラットＳＨＲ７２における神経原線維病変を認識する。（Ｈ）同齢のコントロールラット脳において、その抗体は、神経細胞内染色を示さない。その血清は、オリゴマープレ濃縮体段階（Ｉ）ならびに細胞内（Ｊ）を認識する。スケールバー：２０μｍ（Ａ、Ｂ）、１０μｍ（Ｃ、Ｄ）。
デザイナー治療用エピトープ１（ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５０）およびデザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５１）によって誘導された抗体は、ヒトアルツハイマー病脳組織から単離された可溶性およびサルコシル不溶性の病理学的タウを認識した。
デザイナー治療用エピトープ１（ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５０）およびデザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５１）によって誘導された抗体は、アルツハイマー病ラットモデル（ＳＨＲ７２）の脳から単離された可溶性（レーン１、３、５）および不溶性（レーン２、４、６）病理学的タウを認識した。
デザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５１）による免疫療法は、処置されたＳＨＲ７２ラットの神経行動学的パラメータ（Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅ）の有意な改善を示した。（Ａ）梁歩行試験。（Ｂ）後肢のスリップ回数（ｐ＜０．０５）。（Ｃ）Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅ。デザイナー治療用エピトープ２（配列番号２５１）で処置されたラットは、アジュバントだけを投与されたトランスジェニックコントロールラットよりも、ａ）梁歩行試験における逃避潜時の２７％減少、ｂ）後肢のスリップ回数の４４％減少（ｐ＜０．０５）、およびｃ）Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅスコアの２６％減少を示した。すべての統計データは、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーＵ検定を用いて得られた。
デザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５１）による免疫療法は、免疫されたアルツハイマートランスジェニックＳＨＲ７２ラットの脳における病理学的タウの統計学的に有意な減少を示した。免疫療法は、アジュバントだけを投与されたコントロールトランスジェニックラットと比べて、免疫された動物における病理学的不溶性タウの量を統計学的に有意に（ｐ＜０．０５）減少させた。病理学的不溶性タウの減少は、解析されたすべてのタウエピトープにおいて観察された（Ｐ＜０．０５）。
（Ａ）ＤＣ８Ｅ８の最小エピトープ（治療用コアユニット）のさらなる評価および免疫原性の効力の測定のために使用された合成ペプチドの概略図、ならびに（Ｂ）それらのアミノ酸配列。 （Ａ）ＤＣ８Ｅ８の最小エピトープ（治療用コアユニット）のさらなる評価および免疫原性の効力の測定のために使用された合成ペプチドの概略図、ならびに（Ｂ）それらのアミノ酸配列。
競合ＥＬＩＳＡによる、合成ペプチドを使用したＤＣ８Ｅ８最小エピトープ（治療用コアユニット）の測定。ＤＣ８Ｅ８認識配列の少なくとも６アミノ酸を含む１０個のタウペプチド（配列番号２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２７７、２８０、２８１、２８２および２８３）は、抗体ＤＣ８Ｅ８への結合について病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと競合することができる。ＤＣ８Ｅ８認識配列の５アミノ酸のみを含むタウペプチド（配列番号２７３、２７４、２７８および２７９）は、抗体ＤＣ８Ｅ８への結合についてタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ（配列番号１９９）と競合しない。
タウペプチドでＣ５７ＢＬマウスを免疫した後の、タウ特異的抗体の誘導。（Ａ）１２−ｍｅｒ、７−ｍｅｒおよび６−ｍｅｒペプチド（それぞれ配列番号２７０、２７１および２７２）は免疫原性である。免疫によって誘導された抗体は、生理学的タウ２Ｎ４Ｒよりも病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対して統計学的に有意に高い結合活性を示す（それぞれｐ＜０．００７９；ｐ＜０．００５２；ｐ＜０．００７９）。５−ｍｅｒペプチド配列番号２７３および２７４は、免疫原性でない。（Ｂ）４２−ｍｅｒ、１９−ｍｅｒ、７−ｍｅｒおよび６−ｍｅｒペプチド（それぞれ配列番号２７５、２８０、２７６および２７７）は、免疫原性である。これらのペプチドによって誘導された抗体は、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと生理学的タウ２Ｎ４Ｒとを統計学的に有意に（それぞれｐ＜０．００７９，ｐ＜０．０１５９，ｐ＜０．００７９およびｐ＜０．０３７９）区別した。５−ｍｅｒペプチド配列番号２７８および２７９は、免疫原性でない。（Ｃ）７−ｍｅｒペプチド（配列番号２８１および２８３）は、免疫原性である。これらのペプチドに対する抗血清は、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと生理学的タウ２Ｎ４Ｒとを統計学的に有意に（それぞれｐ＜０．０３７９およびｐ＜０．０２８６）区別した。６−ｍｅｒペプチド配列番号２８２によって誘導された、病理学的タウおよび生理学的タウに対する抗体のレベルは、非常に低かった。これらのグラフは、１：８００希釈された個々の血清に対するＥＬＩＳＡの結果の統計学的評価を表している。平均値は、平均値の標準誤差とともに示されている。 タウペプチドでＣ５７ＢＬマウスを免疫した後の、タウ特異的抗体の誘導。（Ａ）１２−ｍｅｒ、７−ｍｅｒおよび６−ｍｅｒペプチド（それぞれ配列番号２７０、２７１および２７２）は免疫原性である。免疫によって誘導された抗体は、生理学的タウ２Ｎ４Ｒよりも病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対して統計学的に有意に高い結合活性を示す（それぞれｐ＜０．００７９；ｐ＜０．００５２；ｐ＜０．００７９）。５−ｍｅｒペプチド配列番号２７３および２７４は、免疫原性でない。（Ｂ）４２−ｍｅｒ、１９−ｍｅｒ、７−ｍｅｒおよび６−ｍｅｒペプチド（それぞれ配列番号２７５、２８０、２７６および２７７）は、免疫原性である。これらのペプチドによって誘導された抗体は、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと生理学的タウ２Ｎ４Ｒとを統計学的に有意に（それぞれｐ＜０．００７９，ｐ＜０．０１５９，ｐ＜０．００７９およびｐ＜０．０３７９）区別した。５−ｍｅｒペプチド配列番号２７８および２７９は、免疫原性でない。（Ｃ）７−ｍｅｒペプチド（配列番号２８１および２８３）は、免疫原性である。これらのペプチドに対する抗血清は、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと生理学的タウ２Ｎ４Ｒとを統計学的に有意に（それぞれｐ＜０．０３７９およびｐ＜０．０２８６）区別した。６−ｍｅｒペプチド配列番号２８２によって誘導された、病理学的タウおよび生理学的タウに対する抗体のレベルは、非常に低かった。これらのグラフは、１：８００希釈された個々の血清に対するＥＬＩＳＡの結果の統計学的評価を表している。平均値は、平均値の標準誤差とともに示されている。 タウペプチドでＣ５７ＢＬマウスを免疫した後の、タウ特異的抗体の誘導。（Ａ）１２−ｍｅｒ、７−ｍｅｒおよび６−ｍｅｒペプチド（それぞれ配列番号２７０、２７１および２７２）は免疫原性である。免疫によって誘導された抗体は、生理学的タウ２Ｎ４Ｒよりも病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対して統計学的に有意に高い結合活性を示す（それぞれｐ＜０．００７９；ｐ＜０．００５２；ｐ＜０．００７９）。５−ｍｅｒペプチド配列番号２７３および２７４は、免疫原性でない。（Ｂ）４２−ｍｅｒ、１９−ｍｅｒ、７−ｍｅｒおよび６−ｍｅｒペプチド（それぞれ配列番号２７５、２８０、２７６および２７７）は、免疫原性である。これらのペプチドによって誘導された抗体は、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと生理学的タウ２Ｎ４Ｒとを統計学的に有意に（それぞれｐ＜０．００７９，ｐ＜０．０１５９，ｐ＜０．００７９およびｐ＜０．０３７９）区別した。５−ｍｅｒペプチド配列番号２７８および２７９は、免疫原性でない。（Ｃ）７−ｍｅｒペプチド（配列番号２８１および２８３）は、免疫原性である。これらのペプチドに対する抗血清は、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと生理学的タウ２Ｎ４Ｒとを統計学的に有意に（それぞれｐ＜０．０３７９およびｐ＜０．０２８６）区別した。６−ｍｅｒペプチド配列番号２８２によって誘導された、病理学的タウおよび生理学的タウに対する抗体のレベルは、非常に低かった。これらのグラフは、１：８００希釈された個々の血清に対するＥＬＩＳＡの結果の統計学的評価を表している。平均値は、平均値の標準誤差とともに示されている。
タウペプチドでＣ５７ＢＬマウスを免疫した後のタウ特異的抗体の幾何平均抗体価。タウペプチド配列番号２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２７７、２８０、２８１および２８３によるＣ５７ＢＬマウスのワクチン接種は、タウ特異的抗体の形成を誘導した。ＥＬＩＳＡを用いて測定された幾何平均抗体価は、タウペプチド配列番号２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２７７、２８０、２８１および２８３によるワクチン接種によって誘発された抗体が、生理学的タウ（タウ２Ｎ４Ｒ）よりも病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対してより高い結合活性を示したことを示す。タウペプチド配列番号２７３、２７４、２７８、２７９および２８２でマウスを免疫した後に、タウ特異的抗体のより低い力価が検出された。
タウペプチドによって誘導された抗体のアイソタイププロファイルが示されている。最小ＤＣ８Ｅ８エピトープを有するタウペプチドによるＣ５７／ＢＬマウスの免疫は、病理学的タウに特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ抗体アイソタイプの形成を優先的に誘導した。個々のマウス由来のプールされた血清を１：８００希釈し、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対する結合活性をＥＬＩＳＡによって解析した。 タウペプチドによって誘導された抗体のアイソタイププロファイルが示されている。最小ＤＣ８Ｅ８エピトープを有するタウペプチドによるＣ５７／ＢＬマウスの免疫は、病理学的タウに特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ抗体アイソタイプの形成を優先的に誘導した。個々のマウス由来のプールされた血清を１：８００希釈し、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対する結合活性をＥＬＩＳＡによって解析した。
タウペプチドで免疫されたマウスＣ７５ＢＬにおいて誘導された抗体の、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒおよび２Ｎ４Ｒに対する結合能の定量的評価。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定は、タウペプチド配列番号２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２７７、２８０、２８１および２８３に対する抗体が、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと生理学的２Ｎ４Ｒタウとを統計学的に有意に（＊＊．．．ｐ＜０．００１および＊．．．ｐ＜０．０１）区別することを示した。ＫＡ−会合平衡結合定数。
タウペプチドで免疫されたマウスにおいて誘導された抗体は、ウエスタンブロッティングにおいて病理学的形態のタウを認識する。タウペプチド配列番号２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２７７、２８０、２８１および２８３によるＣ５７ＢＬマウスのワクチン接種は、ヒトアルツハイマー病脳組織ならびにトランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳幹から単離された病理学的タウタンパク質を認識する特異的抗体を誘導した。ペプチド配列番号２７３、２７４、２７８、２７９および２８２でマウスを免疫した後の抗血清は、病理学的タウ型を認識しなかった。
ヒトＡＤ脳組織における、タウペプチドによって誘導された抗体によって認識された神経原線維変化。タウペプチド配列番号２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２７７、２８０、２８１および２８３によるＣ５７ＢＬマウスのワクチン接種は、アルツハイマー病脳の海馬における神経原線維病変を認識する抗体を誘導した。アジュバントのみで免疫されたマウス由来の血清をネガティブコントロールとして使用した。海馬ＣＡ１由来の脳組織切片を使用した。スケールバー：１００μｍ。 ヒトＡＤ脳組織における、タウペプチドによって誘導された抗体によって認識された神経原線維変化。タウペプチド配列番号２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２７７、２８０、２８１および２８３によるＣ５７ＢＬマウスのワクチン接種は、アルツハイマー病脳の海馬における神経原線維病変を認識する抗体を誘導した。アジュバントのみで免疫されたマウス由来の血清をネガティブコントロールとして使用した。海馬ＣＡ１由来の脳組織切片を使用した。スケールバー：１００μｍ。 ヒトＡＤ脳組織における、タウペプチドによって誘導された抗体によって認識された神経原線維変化。タウペプチド配列番号２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２７７、２８０、２８１および２８３によるＣ５７ＢＬマウスのワクチン接種は、アルツハイマー病脳の海馬における神経原線維病変を認識する抗体を誘導した。アジュバントのみで免疫されたマウス由来の血清をネガティブコントロールとして使用した。海馬ＣＡ１由来の脳組織切片を使用した。スケールバー：１００μｍ。
タウペプチド配列番号２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２および２８３によるＣ５７ＢＬマウスの免疫から産生された血清抗体を用いた、ヒトＡＤ患者由来の脳組織の免疫組織化学的染色（およびそれぞれの相対強度）の要約。
発明の詳細な説明
用語「抗体」とは、遺伝的に操作されているか、天然であるか、または完全にもしくは
部分的に合成的にもしくは組換え的に生成されているかに関係なく、免疫グロブリンのこ
とを指す。抗原結合特性および本発明に係るタウに関連する特徴的な特性の少なくとも１
つを維持しているすべてのその誘導体、一部およびフラグメントもまた、この用語に含め
られる。この用語は、免疫グロブリン結合ドメインと相同または広く相同である結合ドメ
インを有する任意のタンパク質も包含する。これらのタンパク質は、天然の起源に由来し
得るか、または部分的にもしくは完全に合成的にもしくは組換え的に生成され得る。抗体
は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、任意のヒトクラス：Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラスのメンバー
であり得る。ＩｇＧクラスの誘導体が、本発明のいくつかの実施形態において好ましい。
用語「単離された抗体」および「単離されたペプチド」とは、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ
もしくは他の任意の合成起源またはそれらのいくつかの組み合わせから生成されたタンパ
ク質またはペプチド；ならびにそれらの起源または誘導の起源を理由に、（１）天然に見
られるタンパク質と関連しないか、（２）同じ起源由来の他のタンパク質を含まない、例
えば、マウスタンパク質を含まないか、（３）異なる種由来の細胞によって発現されてい
るか、または（４）天然には存在しない、タンパク質およびペプチドのことを指す。
本発明に係る抗体は、さらに、本発明に係る抗体の上述の特徴に影響しないかまたは上
述の特徴を変更しないヌクレオチド配列改変およびアミノ酸配列改変である「保存的な配
列改変」を有するような抗体を含む。改変は、当該分野で公知の標準的な手法（例えば、
部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発）によって導入され得る。保存
的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置
換を含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義され
ている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジ
ン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、
グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、ト
リプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プ
ロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリ
ン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプト
ファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。したがって、抗タウ抗体内の予測さ
れる可欠アミノ酸残基は、例えば、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えら
れ得る。
「抗体フラグメント」および「抗体部分」は、完全長抗体の一部、通常、少なくとも抗
原結合部分／ドメインまたはその可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、抗体
フラグメントから形成される、ダイアボディ、一本鎖抗体分子、免疫毒素および多重特異
性抗体が挙げられる。さらに、抗体フラグメントは、病理学的タウに結合する（すなわち
、ＶＬ鎖と集合することができる）ＶＨ鎖、または病理学的タウに結合する（すなわち、
ＶＨ鎖と集合することができることにより、機能的な抗原結合ポケットを形成し、それに
より、病理学的タウに結合する特性を提供する）ＶＬ鎖の特徴を有する一本鎖ポリペプチ
ドを含む。これらの用語は、それ自体はエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ）
を提供することができないが、適切な抗体定常ドメインと組み合わされた後にこの機能を
提供することができるフラグメントも包含する。
用語「キメラ抗体」とは、通常、組換えＤＮＡ手法によって調製される、１つの起源ま
たは種由来の可変領域、すなわち結合領域、および異なる起源または種に由来する定常領
域の少なくとも一部を含むモノクローナル抗体のことを指す。マウス可変領域およびヒト
定常領域を含むキメラ抗体が、特に好ましい。そのようなマウス／ヒトキメラ抗体は、マ
ウス免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントおよびヒト免疫グロブリン定
常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む発現された免疫グロブリン遺伝子の産物であ
る。本発明によって包含される「キメラ抗体」の他の形態は、そのクラスまたはサブクラ
スが、改変されているか、または元の抗体のクラスもしくはサブクラスから変更されてい
る形態である。そのような「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」とも称される。キ
メラ抗体を作製するための方法は、当該分野で現在公知である従来の組換えＤＮＡ法およ
び遺伝子トランスフェクション法を含む。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）６８５１−６８５５；米
国特許第５，２０２，２３８号および同第５，２０４，２４４号を参照のこと。
用語「ヒト化抗体」とは、フレームワーク領域（ＦＲ）および／または相補性決定領域
（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンの特異性と比べて異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤ
Ｒを含むように改変された抗体のことを指す。１つの実施形態において、マウスＣＤＲが
、ヒト抗体のフレームワーク領域に移植されることにより「ヒト化抗体」が調製される。
例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３−３２
７；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４（１９８５）２６８
−２７０を参照のこと。特に好ましいＣＤＲは、タウ上の「治療用エピトープ」として本
明細書中に記載される抗原およびエピトープを認識する配列に相当するＣＤＲに対応する
。
用語「ヒト抗体」は、本明細書中で使用されるとき、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン
配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むと意図されている。その抗体
の定常領域は、例えば、ヒトＩｇＧ１型の定常領域であり得る。そのような領域は、アロ
タイプであり得、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．，ａｎｄ Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２０００）２１４−２１８およびその中で参照されて
いるデータベースに記載されており、本発明に係るＡＤＣＣおよび例えばＣＤＣの誘導の
特性が保持されている限り、それらはいくつかの実施形態にとって優先的に有用である。
用語「組換えヒト抗体」は、本明細書中で使用されるとき、組換え手段によって調製さ
れた、発現された、作製されたまたは単離されたすべてのヒト抗体（例えば、ヒト免疫グ
ロブリン遺伝子についてトランスジェニックである宿主細胞（例えば、ＮＳＯまたはＣＨ
Ｏ細胞）もしくは動物（例えば、マウス、例えば、ヒト抗体のアミノ酸配列、例えば、ヒ
トフレームワーク（ＦＲ）およびヒト定常領域アミノ酸配列を有する抗体を産生する遺伝
的に改変されたマウスであるＸＥＮＯＭＯＵＳＥ）から単離された抗体または宿主細胞に
トランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体）を含むと意図さ
れている。そのような組換えヒト抗体は、再配列された形態において、ヒト生殖細胞系列
免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。本発明に係る組換えヒ
ト抗体は、インビボ体細胞超変異を受けたことがある。したがって、その組換え抗体のＶ
ＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、そ
れらに関係するが、インビボにおいてヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然には存
在し得ない、配列である。
用語「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃレセ
プター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；および
細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションを
含むが、これらに限定されない。
用語「エピトープ」は、結合タンパク質または抗体によって認識される結合部位のこと
を指すために本明細書中で使用される。エピトープは、任意の分子またはそのグループ（
アミノ酸、アミノ酸側鎖、糖および脂質を含むがこれらに限定されない）であり得、特定
の３次元構造またはコンフォーメーションを有し得る。したがって、エピトープは、それ
らの用語が当該分野で広く公知であるように、一次、二次、三次または四次構造を含むタ
ウペプチド／タンパク質分子の任意の部分を含み得る。「線状エピトープ」は、アミノ酸
残基の連続した配列で構成されている。線状エピトープは、生理学的タウ上に存在する（
例えば、タウ２Ｎ／４Ｒに存在する）エピトープである。「コンフォーメーションエピト
ープ」は、抗体または結合タンパク質がコンフォーメーション特異的様式で結合するエピ
トープである。タンパク質ベースのエピトープの場合、その結合は、そのエピトープを有
するタンパク質の二次、三次または四次構造に依存し得る。換言すれば、その抗体は、構
造特異的様式、三次構造特異的様式または四次構造特異的様式で結合する。コンフォーメ
ーションエピトープは、病理学的タウに存在する（例えば、タウΔ（１−１５０；３９２
−４４１）／４Ｒ）に存在する）エピトープである。
用語「治療用エピトープ」とは、本明細書中で特定され、ある特定のコンフォーメーシ
ョン（ＤＣ８Ｅ８抗体によって認識される）であるときタウ−タウ凝集を促進すると見出
されたタウ内の領域のことを指す。これらの領域の１つもしくは複数に結合する抗体（お
よび他の結合タンパク質）は、初期および後期のタウ凝集（タウ単量体から二量体への変
換およびより高次の凝集体の形態への変換を含む）を阻害する；すなわち、それらの抗体
は、生理学的タウから病理学的タウへの変換を阻害する。タウ内のこれらの領域は、タウ
の隣接領域内でベータシートの形成を促進することによって対らせん状細線維（ＰＨＦ）
へのタウの線維化の促進に関わり得る。治療用エピトープは、２６７−ＫＨＱＰＧＧＧ−
２７３（タウタンパク質の第１リピートドメイン内）、２９８−ＫＨＶＰＧＧＧ−３０４
（タウタンパク質の第２リピートドメイン内）、３２９−ＨＨＫＰＧＧＧ−３３５（タウ
タンパク質の第３リピートドメイン内）および３６１−ＴＨＶＰＧＧＧ−３６７（タウタ
ンパク質の第４リピートドメイン内）内に含まれる。いくつかの実施形態において、治療
用エピトープは各々、それぞれ２６８−ＨＱＰＧＧＧ−２７３（タウタンパク質の第１リ
ピートドメイン内）、２９９−ＨＶＰＧＧＧ−３０４（タウタンパク質の第２リピートド
メイン内）、３３０−ＨＫＰＧＧＧ−３３５（タウタンパク質の第３リピートドメイン内
）および３６２−ＨＶＰＧＧＧ−３６７内に含まれる。
用語「生理学的タウよりも病理学的タウに対してより高い親和性を示す」とは、抗体と
生理学的タウの少なくとも１つの形態との相互作用よりも抗体と病理学的タウの少なくと
も１つの形態との相互作用のより高い程度のことを指す。その相互作用は、下記の実施例
に記載されるような、例えば、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって
測定され得る。
用語「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」、「特異的に結
合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」、および「〜に特異的な」は、相互
交換可能であり、抗体またはその抗原結合フラグメント（または他の結合タンパク質）が
、抗原またはエピトープと、生理学的条件下において比較的安定である複合体を形成する
ことを意味する。特異的結合は、約１×１０−６Ｍまたはそれ以下、例えば、約１００ｎ
Ｍ未満、最たる例として、１０ｎＭ未満の解離定数によって特徴付けられ得る。２つの分
子が特異的に結合するかを判定するための方法は、当該分野で公知であり、その方法とし
ては、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などが挙げられ得る。代表的には、本発明
によって提供される抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも約１×１０−６
Ｍまたはそれ以下のような解離定数で抗原またはエピトープに結合するがそのような解離
定数で他の分子には結合しない分子である。
「優先的に結合する」とは、生理学的タウよりも病理学的タウに対するより高い親和性
での結合、例えば、２Ｎ４ＲよりもタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対す
るより高い親和性での結合のことを指す。
「ユニバーサルＴ細胞エピトープ」は、インフルエンザ赤血球凝集素（Ｈｅｍａｇｌｕ
ｔｔｉｎｉｎ）：ＨＡ３０７−３１９（ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ）（配列番号１２３
）；ＰＡＤＲＥ（ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ）（配列番号１２４）；マラリアＣＳ：Ｔ
３エピトープ（ＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶ）（配列番号１２５）；Ｂ型肝炎表面
抗原：ＨＢｓＡ９１９＿２８（ＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩ）（配列番号１２６）；熱ショック
タンパク質６５：ｈｓｐ６５１５３＿１７１（ＤＱＳＩＧＤＬｌＡＥＡＭＤＫＶＧＮＥＧ
）（配列番号１２７）；Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ桿菌（ＱＶＨＦＱＰＬＰＰＡＶ
ＶＫＬ）（配列番号１２８）；破傷風トキソイド：ＴＩ８３０−８４４（ＱＹＩＫＡＮＳ
ＫＦＩＧＩＴＥＬ）（配列番号１２９）；破傷風トキソイド：ＴＩ９４７−９６７（ＦＮ
ＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ）（配列番号１３０）；およびＨＩＶ ｇｐ１
２０ Ｔ１（ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡ）（配列番号１３１）から選択される配
列である。
用語「天然無秩序タウ」とは、任意の明確な３Ｄ構造を欠く正常な／生理学的な形態の
タウタンパク質のことを指す。それは、健常な脳に存在する（Ｋｏｖａｃｅｃｈら、２０
１０）。
「誤無秩序タウ」とは、正常な／生理学的な天然無秩序タウとコンフォーメーションで
異なりかつ確固たる／明確な３Ｄ構造を有しない形態のタウのことを指す。誤無秩序切断
型タウは、インビボにおいて神経原線維変性を誘導することができる。それは、健常な脳
には存在しない（Ｋｏｖａｃｅｃｈら、２０１０）。「誤秩序タウ」とは、ＰＨＦのポリ
マーに組み立てられ、ＮＦＴを形成する、構築された病理学的形態のタウのことを指す。
誤秩序タウは、健常な脳には存在しない（Ｋｏｖａｃｅｃｈら、２０１０）。
「ＳＨＲ２４」とは、タウタイプＩＩＢ（１５１−３９１／Ｒ３）を発現するトランス
ジェニックラットの系統のことを指す。そのトランスジェニックラットは、皮質脳領域に
おいて進行性の加齢依存的な神経原線維変性を発症した。ＳＨＲ２４ラットにおける神経
原線維変化（ＮＦＴ）は、ヒトアルツハイマー病における神経原線維変性を識別するため
に使用されるいくつかの重要な組織学的基準（銀親和性、コンゴーレッド複屈折およびチ
オフラビンＳ反応性を含む）を満たす。これらの基準は、本発明の任意の実施形態を受け
ている被験体における神経原線維変性の解析のために使用され得る。神経原線維変化は、
異常なタウコンフォーメーションを認識してヒト脳における病理的タウを検出するために
使用される抗体（ＤＣ１１を含む）、および過剰リン酸化型のタウタンパク質に特異的な
抗体を用いても識別された。さらに、神経原線維変性は、ラット内在性および切断型タウ
種からなるサルコシル不溶性タウタンパク質複合体の広範な形成によって特徴付けられた
（Ｆｉｌｉｐｃｉｋら、２０１０）。
「ＳＨＲ７２」とは、いくつかの脳領域および脊髄において、国際特許出願ＰＣＴ Ｗ
Ｏ２００４／００７５４７）に係るヒト切断型タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／
４Ｒを発現するトランスジェニックラットのことを指す。このラット系統の作出は、Ｚｉ
ｌｋａら、２００６によって記載され、タウの病理は、Ｋｏｓｏｎら、２００８に記載さ
れた。
「タウタイプＩＡ」とは、４リピート含有タウ４３の少なくとも最初の２３６個のＮ末
端アミノ酸および少なくとも最後の４５個のＣ末端アミノ酸が切断された、ＮおよびＣ末
端二重切断型タウタンパク質のことを指す。これらの分子は、アルツハイマー病の脳組織
において検出可能であるのに対し、これらの分子は、正常な健常な脳組織では検出可能で
ない（ＷＯ２００４／００７５４７Ａ２）。
「タウタイプＩＢ」とは、３リピート含有タウ４４の少なくとも最初の２３６個のＮ末
端アミノ酸および少なくとも最後の４５個のＣ末端アミノ酸が切断された、ＮおよびＣ末
端二重切断型タウタンパク質のことを指す。これらの分子は、アルツハイマー病の脳組織
において検出可能であるのに対し、これらの分子は、正常な健常な脳組織では検出可能で
ない（ＷＯ２００４／００７５４７Ａ２）。
「タウタイプＩＩＡ」とは、４リピート含有タウ４３の少なくとも最初の６８個のＮ末
端アミノ酸および少なくとも最後の４０個のＣ末端アミノ酸が切断された、ＮおよびＣ末
端二重切断型タウタンパク質のことを指す。これらの分子は、アルツハイマー病の脳組織
において検出可能であるのに対し、これらの分子は、正常な健常な脳組織では検出可能で
ない（ＷＯ２００４／００７５４７Ａ２）。
「タウタイプＩＩＢ」とは、３リピート含有タウ４４の少なくとも最初の６８個のＮ末
端アミノ酸および少なくとも最後の２０個のＣ末端アミノ酸が切断された、ＮおよびＣ末
端二重切断型タウタンパク質のことを指す。これらの分子は、アルツハイマー病の脳組織
において検出可能であるのに対し、これらの分子は、正常な健常な脳組織では検出可能で
ない（ＷＯ２００４／００７５４７Ａ２）。
本明細書中で使用されるとき、用語「処置」、「処置する」などは、所望の薬理学的お
よび／または生理学的な効果を得ることを指す。その効果は、疾患もしくはその症状を完
全にもしくは部分的に予防することに関して予防的であり得、かつ／または疾患および／
もしくはその疾患に起因する悪影響の部分的もしくは完全な治癒に関して治療的であり得
る。「処置」は、本明細書中で使用されるとき、哺乳動物、特に、ヒトにおけるＡＤまた
は関連タウオパチーの任意の処置も網羅し、（ａ）疾患にかかりやすいまたは疾患にかか
るリスクがある可能性があるがそれを有するとまだ診断されていない被験体にその疾患が
生じるのを防ぐこと；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を停止すること；
および（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、その疾患の後退を引き起こすことを包含す
る。「処置」の好ましい実施形態は、下記でさらに論じられる。いくつかの実施形態にお
いて、「処置する」とは、ＡＤまたは別のタウオパチーに罹患していると疑われるまたは
すでに罹患している患者に治療薬を投与することを指す。それは、疾患の１つもしくは複
数の症状ならびに／またはその疾患および／もしくはその合併症に関連する１つもしくは
複数の症状を減少させること、排除すること、または少なくとも部分的に停止すること、
ならびにそれらに対して任意の有益な効果を発揮することも指し得る。
「予防」とは、特定の疾患にかかりやすい患者または別途そのリスクのある患者への投
与のことを指す。一般集団の誰もがＡＤのリスクがある。一部の個体は、ＡＤに対して高
い遺伝的リスクを有する。予防は、疾患のリスクを排除し得るかもしくは低下させ得るか
、またはその疾患の発生を遅延させ得る。発生または進行の遅延は、類似の集団または個
体における疾患進行の標準的な時間に基づいて測定され得る。
「タウオパチー」とは、病理学的タウの形成に関連する疾患のことを指す。
「生理学的タウ」とは、正常なヒトタウの６つのアイソフォーム、すなわち：
２Ｎ４Ｒ（配列番号１０２）
１Ｎ４Ｒ（配列番号１０３）
２Ｎ３Ｒ（配列番号１０４）
０Ｎ４Ｒ（配列番号１０５）
１Ｎ３Ｒ（配列番号１０６）
０Ｎ３Ｒ（配列番号１０７）のうちのいずれか１つのことを指す。アルツハイマー病およ
び他のタウオパチーに関連するリン酸化のいずれか１つを有するものは、この定義から除
外される。
「病理学的タウ」には、病理学的タウの配座異性体および構造が含まれ、以下のすべて
が包含される：タウタイプＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡおよびＩＩＢ、誤秩序、誤無秩序タウ（単
量体、二量体、三量体、オリゴマー）、誤無秩序可溶性タウ、サルコシル不溶性タウ、細
胞外タウ沈着物、タウ凝集体、対らせん状細線維、神経原線維の病理（神経原線維の病変
、濃縮体、糸状構造、原線維、軸索球状物（ａｘｏｎａｌ ｓｐｈｅｒｉｏｄｓ）、切断
型タウおよび完全長タウの高度にリン酸化された形態を含む）、またはＡＤもしくは別の
タウオパチーに関連する他の任意の形態のタウ。
「連結された」とは、ペプチド、抗体または化合物に対するある部分の結合のことを指
す。その部分は、結合され得るか、または複合体化され得るか、または共有結合的にもし
くは非共有結合的に結合され得る。その部分は、ペプチドまたは抗体との融合物として、
化学的に架橋され得るか、または発現され得るか、または合成され得る。
「部分」とは、ペプチド、抗体または結合タンパク質に結合され得るが、主張されるペ
プチド、抗体または結合タンパク質自体ではない、任意の化合物、有機物、ペプチド、タ
ンパク質、核酸、キャリア、アジュバントのことを指す。
「免疫原性」とは、免疫応答を誘発し得るもののことを指す。その免疫応答は、抗体媒
介性もしくは細胞媒介性、またはその両方であり得る。
「アジュバント」とは、付随のペプチドに対する免疫応答を増加させること、増幅する
こと、または調節することができる物質のことを指す。
「他の治療」とは、被験体患者が受け得るさらなる治療のことを指す。
「クリアランス」とは、病理学的タウおよび／または病理学的タウ構造のレベルまたは
検出の減少のことを指す。クリアランスは、病理学的タウの完全な消失である必要はなく
、すなわち、クリアランスは、部分的な消失であり得る。
用語「促進する」は、誘導すること、改善することまたは増加することを包含する。
「脳組織」とは、例えば、脳、脳幹および脊髄由来の、任意の神経組織のことを指す。
用語「特異的結合」および「高親和性」はそれぞれ、所定の抗原、すなわち、上で定義
されたタウエピトープへの抗体の結合のことを指す。代表的には、抗体は、１０−６Ｍ以
下の解離定数（ＫＤ）で結合し、所定の抗原以外の非特異的な抗原（例えば、ＢＳＡ、カ
ゼインまたは他の任意の特定のポリペプチド）に対する結合に対するＫＤより少なくとも
２倍低いＫＤで所定の抗原に結合する。句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的
な抗体」は、本明細書中において用語「抗原に特異的に結合する抗体」と交換可能に使用
される。本明細書中で使用されるとき、「高度に特異的な」結合は、誤無秩序タウに対す
る抗体の相対的なＫＤが、他のリガンドまたは正常な完全長タウへのその抗体の結合のＫ
Ｄよりも少なくとも４倍低いことを意味する。
用語「原核生物」は、本発明の抗体または対応する免疫グロブリン鎖の１つもしくは複
数の発現のためにＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換され得るかまたはトランスフェクト
され得るすべての細菌を含むように意味される。原核生物宿主は、グラム陰性菌ならびに
グラム陽性菌、例えば、大腸菌、ネズミチフス菌、霊菌および枯草菌を含み得る。用語「
真核生物」は、酵母、高等植物、昆虫、ならびに例えば哺乳動物細胞、最たる例として、
ＨＥＫ２９３、ＮＳＯおよびＣＨＯ細胞を含むように意味される。
用語「化学的誘導体」は、通常、基礎分子（ｂａｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の一部では
ないさらなる化学的部分を含む分子のことを記載する。そのような部分は、基礎分子の溶
解性、半減期、吸収などを改善し得る。あるいは、それらの部分は、その基礎分子の望ま
しくない副作用を弱め得るか、またはその基礎分子の毒性を低減させ得る。
用語「核酸」、「核配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「核酸配列」、「
ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌク
レオチド配列」は、本記載において交換可能に使用され、それらは、改変されているかま
たはされておらず、核酸のフラグメントまたは領域を定義し、非天然ヌクレオチドを含む
かまたは含まず、かつ二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは前記ＤＮＡの転写産物である、
ヌクレオチドの正確な配列のことを指す。
本明細書中で使用される用語「単離されたポリヌクレオチド」または「単離された核酸
」は、その起源を理由に、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見られるポリ
ヌクレオチドの全部または一部に関連しない、（２）それが天然では連結されていないポ
リヌクレオチドに作動可能に連結されている、または（３）天然ではそれより大きい配列
の一部として存在しない、ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成起源のポリヌクレオチドまたは
それらのいくつかの組み合わせのことを意味するものとする。
診断、受動免疫、薬物送達およびＡＤ治療のための抗体
病理学的形態のタウによって提示される１つもしくは複数のタウエピトープに特異的な
新規の単離された抗体が本明細書中に記載される。これらのエピトープは、病理学的タウ
の凝集における役割を初めて割り当てられたタウの領域内、すなわち、２６７−ＫＨＱＰ
ＧＧＧ−２７３（配列番号９８）（すなわち、エピトープ＃１は、タウタンパク質の第１
リピートドメインに含まれる２６７−ＫＨＱＰＧＧＧ−２７３内に位置する）、２９８−
ＫＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号９９）（エピトープ＃２，タウタンパク質の第２リピ
ートドメイン内）、３２９−ＨＨＫＰＧＧＧ−３３５（配列番号１００）（エピトープ＃
３，タウタンパク質の第３リピートドメイン内）および３６１−ＴＨＶＰＧＧＧ−３６７
（配列番号１０１）（エピトープ＃４，タウタンパク質の第４リピートドメイン内）内に
位置する。これらの抗体は、誤無秩序切断型ヒトタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）
／３ＲまたはタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを発現している、ヒトＡＤ脳
ならびにＡＤおよび関連タウオパチーのトランスジェニックラットモデルにおいて、誤秩
序および誤無秩序タウを認識することができる。その単離された抗体は、（ｉ）誤秩序タ
ウまたは生理学的タウから誤無秩序タウへの移行；（ｉｉ）「病理学的タウ」の単量体、
二量体、三量体および他のタウ多量体の形成；（ｉｉｉ）不溶性タウ凝集体の形成；なら
びに（ｉｖ）細胞外タウのクリアランスの促進を含むＡＤの病理に寄与する複数のタウ媒
介性活性の１つまたはいくつかを干渉することもできる。
開示される本発明は、２６７−ＫＨＱＰＧＧＧ−２７３（配列番号９８）（タウタンパ
ク質の第１リピートドメイン内）、２９８−ＫＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号９９）（
タウタンパク質の第２リピートドメイン内）、３２９−ＨＨＫＰＧＧＧ−３３５（配列番
号１００）（タウタンパク質の第３リピートドメイン内）および３６１−ＴＨＶＰＧＧＧ
−３６７（配列番号１０１）（タウタンパク質の第４リピートドメイン内）から選択され
るタウのこれまで同定されていなかった４つの機能的領域のうちの１つに特異的に結合す
る抗体が、病理学的タウ凝集体の形成を阻害することおよび様々な病理学的形態のタウ（
そのうちのいくつかは、その疾患において最も早期に形成される（例えば、病理学的単量
体））を検出することができるという発見に部分的に基づく。本願においてタウΔ（１−
１５０；３９２−４４１）／４Ｒとも称される、誤無秩序ヒトタウＩＩ（１５１−３９１
／４Ｒ）に対して作製されるハイブリドーマを、免疫組織化学（ＩＨＣ）と酵素結合イム
ノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の両方によって、ヒトＰＨＦに特異的なモノクローナル抗体の
産生についてスクリーニングした。得られたセットは、ＩｇＧ１サブクラスであるマウス
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＤＣ８Ｅ８を含んだ。ＤＣ８Ｅ８のエピトープマッピング
から、それが、ヒトタウ上のこれまで同定されていなかった４つのエピトープに結合する
ことが明らかになった。さらに、ＤＣ８Ｅ８のさらなる機能解析から、各エピトープがタ
ウ内の異なる機能的領域に相当することが明らかになった。本明細書中でＡＤの診断およ
び治療に対する新規標的と記載され得、ゆえに「治療用エピトープ」と称されるこれらの
領域は、２６７−ＫＨＱＰＧＧＧ−２７３（配列番号９８）（タウタンパク質の第１リピ
ートドメイン内）、２９８−ＫＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号９９）（タウタンパク質
の第２リピートドメイン内）、３２９−ＨＨＫＰＧＧＧ−３３５（配列番号１００）（タ
ウタンパク質の第３リピートドメイン内）および３６１−ＴＨＶＰＧＧＧ−３６７（配列
番号１０１）（タウタンパク質の第４リピートドメイン内）内に含まれている。いくつか
の実施形態において、それらの治療用エピトープのうちの１つもしくは複数は、２６８−
ＨＱＰＧＧＧ−２７３（配列番号２２３）（タウタンパク質の第１リピートドメイン内）
、２９９−ＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号１５４）（タウタンパク質の第２リピートド
メイン内）、３３０−ＨＫＰＧＧＧ−３３５（配列番号２２４）（タウタンパク質の第３
リピートドメイン内）および３６２−ＨＶＰＧＧＧ−３６７（配列番号１５４）（タウタ
ンパク質の第４リピートドメイン内）内に含まれている。いくつかの実施形態において、
治療用エピトープのうちの少なくとも１つは、２９９−ＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号
１５４）（タウタンパク質の第２リピートドメイン内）内に含まれている。いくつかの実
施形態において、それらの治療用エピトープのうちの１つもしくは複数は、２９９−ＨＶ
ＰＧＧＧ−３０４（配列番号１５４）である。
実際に、ＤＣ８Ｅ８は、病理学的タウタンパク質と正常タウタンパク質とを区別するこ
とができることから、これらの４つのエピトープの少なくとも１つがコンフォーメーショ
ンによるものであることが示唆される。換言すれば、ＤＣ８Ｅ８は、その４つの治療用エ
ピトープの各々によって包含される領域のうちの少なくとも１つが、天然無秩序タウ（正
常タウ）において想定される形状と異なるコンフォーメーションを病理学的タウにおいて
示すことが明らかになった。ＤＣ８Ｅ８は、それが生理学的タウに結合するよりも高い親
和性でそれが病理学的タウに結合するという変化を検知することまたは検出することがで
きる。さらに、タウへのＤＣ８Ｅ８の結合は、インビトロにおいて不溶性タウ凝集体の形
成を阻害するＤＣ８Ｅ８の能力によって測定されるとき、病理学的タウ凝集体の形成に至
るタウ−タウ相互作用を阻害することができる。例えば、正常タウへのＤＣ８Ｅ８の結合
は、治療用エピトープを包含する領域について上で論じたコンフォーメーション／形状の
変化のうちの１つもしくは複数を妨げることができる。
さらに、これらの領域または治療用エピトープの１つもしくは複数における正常タウへ
のＤＣ８Ｅ８の結合は、病理学的タウの生成に必要なその分子内のいずれか箇所における
ある特定の他のコンフォーメーション変化を妨害する。いかなる特定の機序にも拘束され
るものではないが、ＤＣ８Ｅ８によって認識されるタウ内のこれらのエピトープ／領域の
１つもしくは複数が、タウ−タウ凝集の促進物質としてタウ内で機能することが企図され
る。例えば、これらのエピトープのうちの１つもしくは複数の構造／形状／コンフォーメ
ーションは、それへのＤＣ８Ｅ８の結合によってタウ分子内のその形状が固定されること
により、ベータシートを形成するという隣接領域（例えば、２７４−２８１）の能力また
は傾向が干渉されるように、隣接領域の構造に影響する（ここで、ベータシートの形成は
、タウ−タウ凝集に必要である）。したがって、正常タウ内のこれらの４つの領域のうち
の１つへのＤＣ８Ｅ８の結合が、これまでに同定されたタウにおける最も早い病理学的変
化の１つ：タウ内でのベータシートの形成を促進するために必要な変化またはそれ自体が
その形成を促進するもしくは可能にする変化を妨げることができると企図される。さらに
、誤無秩序／病理学的タウ内の（すなわち、既にそれらの４つのうちの１つもしくは複数
が病理学的なコンフォーメーションへと変化した後の）これらの４つの領域のうちの１つ
へのＤＣ８Ｅ８の結合でさえも、病理学的タウ−タウ凝集を阻害することができることも
企図される。その理由は、少なくとも、そのような結合がなおもベータシートの形成を阻
害するから、タウ−タウ物理的相互作用を阻止するから、またはその両方であるからであ
る。
したがって、タウ内の新規の標的または機能的領域を同定するツールとしてＤＣ８Ｅ８
を使用して、タウ上の４つの特異的なＤＣ８Ｅ８結合部位にアルツハイマー病における役
割が割り当てられた。これは、これらのタウ部位の１つもしくは複数が病理学的タウ単量
体および多量体の形成に関わるという認識によって行われた。その理由は、少なくとも、
それらのうちの１つもしくは複数へのＤＣ８Ｅ８の結合がそれらのプロセスを阻害するこ
とができるからである。さらに、これらの治療用エピトープの１つもしくは複数に結合す
る抗体（例えば、ＤＣ８Ｅ８）は、細胞外の環境からの病理学的タウのクリアランスを促
進することができる。その理由は、少なくとも、それらの抗体がインビトロではミクログ
リアによる病理学的タウの取り込みおよび分解；インビボでは脳における細胞外および細
胞内のタウの減少；またはその両方を媒介することができるからである。換言すれば、こ
れらの抗体は、そのような病理学的形態のタウが脳に対して引き起こす損傷を減少させる
ことを助ける能力を有する。
したがって、タウ上の１つもしくは複数の治療用エピトープに特異的に結合する抗体が
本明細書中に記載され、ここで、それらの治療用エピトープの各々は、アミノ酸残基２６
７−ＫＨＱＰＧＧＧ−２７３（配列番号９８）（エピトープ＃１，タウタンパク質の第１
リピートドメイン内）、２９８−ＫＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号９９）（エピトープ
＃２，タウタンパク質の第２リピートドメイン内）、３２９−ＨＨＫＰＧＧＧ−３３５（
配列番号１００）（エピトープ＃３，タウタンパク質の第３リピートドメイン内）および
３６１−ＴＨＶＰＧＧＧ−３６７（配列番号１０１）（エピトープ＃４，タウタンパク質
の第４リピートドメイン内）内に別々に位置する。いくつかの実施形態において、治療用
エピトープ＃１〜４は、２６８−ＨＱＰＧＧＧ−２７３（配列番号２２３）（タウタンパ
ク質の第１リピートドメイン内）、２９９−ＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号１５４）（
タウタンパク質の第２リピートドメイン内）、３３０−ＨＫＰＧＧＧ−３３５（配列番号
２２４）（タウタンパク質の第３リピートドメイン内）および３６２−ＨＶＰＧＧＧ−３
６７（配列番号１５４）（タウタンパク質の第４リピートドメイン内）内に含まれる。上
記抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗原結合抗体部分、抗体フ
ラグメント、抗体バリアント、操作されたタンパク質およびポリマー骨格も含まれる。こ
れらは、免疫グロブリン分子の少なくとも一部（例えば、重鎖もしくは軽鎖の少なくとも
１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそれらのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可
変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域、あるいはそれらの任意の部分
であるがこれらに限定されない）を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む
。
非限定的な例として、本発明によって提供されるような好適な抗体、抗体部分、フラグ
メントまたはバリアントは、記載される治療用エピトープのうちの少なくとも１つに結合
し得る。用語「抗体」は、抗体消化フラグメント、特定の抗体部分およびそれらのバリア
ント（抗体またはその特定のフラグメントもしくは一部（一本鎖抗体およびそのフラグメ
ントを含む）の構造および／または機能を模倣する抗体模倣物または抗体の一部を含む）
も含む。機能的フラグメントには、１つもしくは複数の治療用エピトープに結合する抗原
結合フラグメントが含まれる。例えば、治療用エピトープに結合することができる抗体フ
ラグメントとしては、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化によるもの）、Ｆａｂ’（例えば、
ペプシン消化および部分的還元によるもの）およびＦ（ａｂ’）２（例えば、ペプシン消
化によるもの）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化によるもの）、ｐＦｃ’（例えば、
ペプシンまたはプラスミン消化によるもの）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分的還元
および再凝集によるもの）、ＦｖまたはｓｃＦｖ（例えば、分子生物学的手法によるもの
）フラグメントが挙げられるが、これらに限定されず、それらは本発明によって提供され
る。Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｐａｕｌ（ｅｄ．）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉ
ｌｋｉｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（２００８）（その全体が本明細書に援用される）も参照の
こと。ある特定のフラグメントは、当該分野で日常的に公知であるようなまたは本明細書
中に提供されるような、酵素的切断、合成または組換えの手法によって生成され得る。抗
体は、１つもしくは複数の終止コドンが天然の停止部位の上流に導入された抗体遺伝子を
使用して、種々の切断型としても作製され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコー
ドする組み合わせ遺伝子は、ＣＨ１ドメインおよび／または重鎖のヒンジ領域をコードす
るＤＮＡ配列を含むようにデザインされ得る。抗体の様々な部分は、従来の手法によって
化学的に互いに結合され得るか、または日常的な遺伝子操作法を使用して連続したタンパ
ク質として調製され得る。
基本的な抗体の構造単位は、四量体を構成すると知られている。各四量体は、ポリペプ
チド鎖の２つの同一の対から構成される（各対が、１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）およ
び１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する）。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗
原認識に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖の
カルボキシル末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。ヒト軽
鎖は、カッパーおよびラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、
アルファまたはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、Ｉｇ
Ｄ、ＩｇＡおよびＩｇＥと定義する。軽鎖および重鎖の中で、可変領域および定常領域は
、約１２またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖は、さらに約１
０アミノ酸の「Ｄ」領域も含む。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ
．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１
９８９））（その全体がすべての目的のために参照により援用される）を広く参照のこと
。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、インタクトな抗
体は、２つの結合部位を有する。二機能性または二重特異性の抗体を除いては、その２つ
の結合部位は、同じである。それらの鎖はすべて、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ば
れる３つの超可変領域に連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）という
同じ一般構造を示す。各対の２本の鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列され
ることにより、特定のエピトープへの結合が可能になる。軽鎖と重鎖の両方が、Ｎ末端か
らＣ末端に向かって、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３
およびＦＲ４を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割当は、ＩＭＧＴの定義に従う。代
替の定義もまた当業者に公知である。例えば、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９
８７および１９９１））またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７
８−８８３（１９８９）を参照のこと。
いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１４１、１４３、１５２および
１５３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約
９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のアミノ酸
配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、主題
の抗体は、配列番号１４１、１４３、１５２および１５３のいずれか１つとわずか１、２
、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖を
含む。当業者は、軽鎖可変領域内のどのアミノ酸が変更され得るかを決定できる。例えば
、同じ特異性を有する抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を比較することによって、当業
者は、どのアミノ酸がその特異性を変化させずに変更され得るかを決定できる。例示的な
ＤＣ８Ｅ８抗体軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列の比較についての実施例を参照のこと。さらに
、特異性が変更されているか否かは、抗原結合アッセイを使用して判定され得る。いくつ
かの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１４１、１４３、１５２および１５３の
いずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１３８、１４０、１４７および
１４８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約
９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のアミノ酸
配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、主題
の抗体は、配列番号１３８、１４０、１４７および１４８のいずれか１つとわずか１、２
、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖を
含む。当業者は、重鎖可変領域内のどのアミノ酸が変更され得るかを決定できる。例えば
、同じ特異性を有する抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を比較することによって、当業
者は、どのアミノ酸がその特異性を変化させずに変更され得るかを決定できる。例えば、
例示的なＤＣ８Ｅ８抗体重鎖のＣＤＲアミノ酸配列の比較についての図３Ｅおよび２５Ｂ
を参照のこと。さらに、特異性が変更されているか否かは、抗原結合アッセイを使用して
判定され得る。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１３８、１４０、
１４７および１４８のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１４１に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１３８に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１４１に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１４０に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１４１に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１４７に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１４１に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１４８に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１４３に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１３８に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１４３に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１４０に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１４３に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１４７に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１４３に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１４８に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１５２に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１３８に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１５２に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１４０に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１５２に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１４７に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１５２に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１４８に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１５３に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１３８に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１５３に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１４０に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１５３に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１４７に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１５３に示されるようなアミノ
酸配列を含む軽鎖および配列番号１４８に示されるようなアミノ酸配列を含む重鎖を含む
。
いくつかの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１１７〜１１９から選択される
少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。いくつ
かの実施形態において、主題の抗体は、配列番号１２０〜１２２から選択される少なくと
も１つ、少なくとも２つまたは３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む。これらの６つの
ＣＤＲのうちのいずれか１つが実施例１４に記載されるように変更される実施形態も提供
される。いくつかの実施形態において、軽鎖中の変更されるＣＤＲのうちの少なくとも１
つは、ＣＤＲ１に対して配列番号２４７、ＣＤＲ２に対して配列番号２５３、ならびにＣ
ＤＲ３に対して配列番号２５５、２５７、２５８、２５９および２６０のうちのいずれか
１つから選択される。いくつかの実施形態において、重鎖中の変更されるＣＤＲのうちの
少なくとも１つは、ＣＤＲ１に対して配列番号２６１または配列番号２６２、ＣＤＲ２に
対して配列番号２６４または配列番号２６５、およびＣＤＲ３に対して配列番号２６６、
配列番号２６７または配列番号２６９から選択される。
二重特異性または二機能性の抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結
合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの
融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む種々の方法によって作製され得る。例えば
、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．７９：３１５−３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４
８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。二重特異性抗体の作製は、従来の抗
体の作製と比べて比較的大きな労働力を要するプロセスであり得、収率および純度は、通
常、二重特異性抗体の場合、より低い。二重特異性抗体は、単一の結合部位を有するフラ
グメントの形態（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦｖ）では存在しない。
本発明は、天然の形態の抗体に関するものではなく、すなわち、それらの抗体は、それ
らの天然の環境から得られず、天然の起源からの精製によって単離されて得られるか、ま
たは遺伝的組換えもしくは化学合成によって得られ、ゆえに、それらは、非天然のアミノ
酸を保有し得る。したがって、本明細書中で使用されるとき、２０種の従来のアミノ酸お
よびそれらの省略形は、従来の使用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅ
ｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（
１９９１））（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。２０種の従来のアミノ
酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｃｈａ、Ｏｒｎ、Ｈｌｅ、Ｃ
ｈｇ、ＨｃｈまたはＨａｒ）、非天然のアミノ酸（例えば、．アルファ．−，．アルファ
．−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸および他の非従来のアミノ酸）もまた
、本発明のポリペプチドに適した構成要素であり得る。非従来のアミノ酸の例としては（
すなわち、以下に限定されない）：４−ヒドロキシプロリン、ガンマ．−カルボキシグル
タメート、イプシロン．−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、．イプシロン．−Ｎ−アセチ
ルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチ
ルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、．シグマ．−Ｎ−メチルアルギニンならびに他の
同様のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明
細書中で使用されるポリペプチドの表記では、標準的な使用法および慣習に従って、左側
の方向は、アミノ末端の方向であり、右側の方向は、カルボキシ末端の方向である。
同様に、本開示は、それらの天然の染色体の環境の、すなわち、天然の状態のヌクレオ
チド配列に関するものではない。本発明の配列は、単離および精製されており、すなわち
、それらは、直接または間接的に、例えば、複製によってサンプリングされたものであり
、それらの環境は、少なくとも部分的に改変されている。組換え遺伝学によって（例えば
、宿主細胞を用いて）得られたまたは化学合成によって得られた、単離された核酸も提供
される。
本開示に関して、核酸またはアミノ酸の２つの配列間の「パーセンテージ同一性」は、
最適なアラインメントの後に得られる、比較される２つの配列の間で同一のヌクレオチド
またはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは、純粋に統計学的
なものであり、その２つの配列間の差は、それらの長さにわたってランダムに分布されて
いる。２つの核酸配列またはアミノ酸配列の比較は、従来より、それらを最適にアライン
メントした後にそれらの配列を比較することによって行われており、前記比較は、セグメ
ントによってまたは「アラインメント範囲」を使用することによって、行うことができる
。比較のための配列の最適なアラインメントは、手作業による比較に加えて、Ｓｍｉｔｈ
ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）［Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２：４８２］のロ
ーカルホモロジーアルゴリズムを用いて、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（
１９７０）［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３］のローカルホモロジーアルゴリズム
を用いて、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４］の類似性検索法を用いて、またはこれらの
アルゴリズムを使用するコンピュータソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒ
ｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥ
ＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウェアＢＬＡＳＴ ＮＲ
もしくはＢＬＡＳＴ Ｐによって）を用いて、行われ得る。
２つの核酸配列またはアミノ酸配列の間のパーセンテージ同一性は、２つの最適にアラ
インメントされた配列を比較することによって測定され、ここで、比較する核酸配列また
はアミノ酸配列は、それらの２つの配列間の最適なアラインメントのために参照配列と比
べて付加または欠失を有し得る。パーセンテージ同一性は、アミノ酸、ヌクレオチドまた
は残基が２つの配列の間（例えば、２つの完全な配列の間）で同一である位置の数を測定
し、その同一の位置の数をアラインメント範囲内の位置の総数で除算し、その結果に１０
０を乗算することによって計算され、それにより、それらの２つの配列間のパーセンテー
ジ同一性が得られる。
例えば、サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ
／ｂｌ２．ｈｔｍｌにおいて利用可能なＢＬＡＳＴプログラムである「ＢＬＡＳＴ２配列
」（Ｔａｔｕｓｏｖａら、“Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ ｎｅｗ ｔｏｏ
ｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９，Ｌｅｔｔ．１７４：
２４７−２５０）が、デフォルトのパラメータ（とりわけ、パラメータ「オープンギャッ
プペナルティ」：５および「伸長ギャップペナルティ」：２；選択される行列は、例えば
、そのプログラムが提案する「ＢＬＯＳＵＭ６２」行列である）を用いて使用され得る；
比較する２つの配列間のパーセンテージ同一性は、そのプログラムによって直接計算され
る。
参照アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％および
９８％の同一性を示すアミノ酸配列の場合、好ましい例としては、その参照配列、ある特
定の改変、とりわけ、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、切断または
伸長を含むものが挙げられる。１つもしくは複数の連続したまたは連続していないアミノ
酸の置換の場合、置換されるアミノ酸が「等価な」アミノ酸によって置き換えられる置換
が好ましい。本明細書において、表現「等価なアミノ酸」は、構造的なアミノ酸のうちの
１つの代わりに用いられる可能性があるがしかしながら対応する抗体および下記で定義さ
れる特定の例の生物学的活性を改変しない、任意のアミノ酸のことを示すと意味される。
等価なアミノ酸は、置換するアミノ酸との構造的相同性、または作製される可能性があ
る様々な抗体間の生物学的活性の比較試験の結果に対して決定され得る。非限定的な例と
して、下記の表は、対応する改変された抗体の生物学的活性の重大な改変をもたらさずに
行われる可能性がある可能な置換を要約している；逆の置換も当然、同じ条件下で可能で
ある。
本発明は、実施例１〜２に記載されるようにＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ
Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＰＴＡ−１１９９４（２０１１年７月２９日発行）として２
０１１年７月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ（ＡＴＣＣ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖ
Ａ，ＵＳＡ）に寄託されたマウスハイブリドーマ細胞系によって産生される抗体を提供す
る。他の好適な抗体は、当該分野で公知であるような細胞系、混合細胞系、不死化細胞ま
たは不死化細胞のクローン集団によって産生され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｅｄ
．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（
１９８７−２００１））；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅ
ｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０００（ひとまとめにして「
Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．
Ｙ．（１９８９））；Ｃｏｌｌｉｇａｎら（Ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ
．，Ｎ．Ｙ．（１９９４−２００１））；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７−２００１））（各々その全体が参照により本明
細書に援用される）を参照のこと。
本発明によって提供される抗体を作製するための１つのアプローチにおいて、ハイブリ
ドーマは、好適な不死細胞系（例えば、ミエローマ細胞系）を種々の抗体産生細胞のうち
の１つと融合することによって作製される。好適な不死細胞系としては、Ｓｐ２／０、Ｓ
ｐ２／０−ＡＧ１４、Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１、ＮＳＯ、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、
ＭＣＰ−１１、Ｓ−１９４、ヘテロミエローマ、その融合産物またはそれらから得られる
任意の細胞もしくは融合細胞、あるいはこの目的のために当該分野で公知および／または
商業的に入手可能（例えば、ＡＴＣＣ）であるような他の任意の好適な細胞系が挙げられ
るがこれらに限定されない。好適な抗体産生細胞としては、単離されたもしくはクローン
化された脾臓、末梢血、リンパ、扁桃または他の免疫細胞もしくはＢ細胞を含む細胞、あ
るいは内在性核酸もしくは異種核酸として、組換えもしくは内在性、ウイルス、細菌、藻
類、原核生物、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳動物、げっ歯類、ウマ、ヒツジ（ｏｖ
ｉｎｅ）、ヤギ、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、霊長類、真核生物の、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ
、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡもしくはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｈｎ
ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖、二本鎖もしくは三本鎖、ハイブリダイズしたもの
などとして、またはそれらの任意の組み合わせとして、重鎖または軽鎖の定常または可変
またはフレームワークまたはＣＤＲ配列を発現している他の任意の細胞が挙げられるが、
これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，前出およびＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ，前出，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（それらの全体が参照により本明細書に援用
される）を参照のこと。
上に記載された様々な実施形態の抗体を作製するための他のアプローチとしては、ペプ
チドライブラリーまたはタンパク質ライブラリー（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ；ＭｏｒｐｈｏＳ
ｙｓ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ，Ｄｅｌ．；Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ，Ａｂ
ｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ；ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ
；Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．，Ｅｎｚｏｎ，Ａｆｆｙｍａｘ／Ｂｉｏｓｉｔｅ；Ｘｏｍａ，Ｂ
ｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆ．；Ｉｘｓｙｓ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅ
ｖｏｌｕｔｉｏｎ；などから商業的に入手可能なライブラリーを含む）から組換え抗体を
選択する方法；選択可能なヒト抗体セットを産生することができるトランスジェニック動
物の免疫に依存する方法（一般に、これらのマウスは、機能的に再配列されるかまたは機
能的な再配列を起こし得る少なくとも１つのヒト免疫グロブリン遺伝子座由来のＤＮＡを
含む少なくとも１つの導入遺伝子を含み；そのようなマウスは、内在性遺伝子によってコ
ードされる抗体を産生する能力を削除するためにその動物における内在性の免疫グロブリ
ン遺伝子座が破壊され得るかまたは欠失され得る）；リボソームディスプレイ、単一細胞
抗体産生技術（例えば、選択リンパ球抗体法（ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｔｈｏｄ）（「ＳＬＡＭ」））およびＢ細胞選択を含む選択方
法；シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓａｍｉｄｅ）処理を用いるサブトラクティ
ブ免疫法；ならびに当該分野において日常的な他の任意の方法（米国出願公開番号２００
５／０１４２６０９に記載されている方法を含むがこれらに限定されない）（これらの方
法は、その全体が参照により本明細書に援用される）が挙げられるが、これらに限定され
ない。
いくつかの実施形態において、上記抗体は、最適化された、キメラまたはヒト化完全長
抗体であり、それらは、例えば、“Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｐｒｅｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ−Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ，
ｂｙ Ｊａｍｅｓ Ｓｈｉｒｖｉｌｌ，２０１０”のＣｈａｐｔｅｒ ３、４および５（
この全体の内容が参照により援用される）に列挙されているおよび例証されているような
公知の手法（例えば：ＣＤＲ移植、例えば、ＵＢＣのＳＬＡＭ技術、ＰＤＬのＳＭＡＲＴ
技術、Ａｒａｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｐｌｃの超ヒト化（Ｓｕｐｅｒｈｕｍａ
ｎｉｚａｔｉｏｎ）、フレームワークパッチ、混成の（ｃｏｍｐｏｓｉｔ）ヒト抗体を作
製するための手法、ＢｉｏＡｔｌａ ＬＬＣのＡＴＬＡｂプラットフォーム、ヒューマニ
アリング（ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ）、Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｇｕｉ
ｄｅｄ（ＭＬＧ）ストラテジー、脱免疫（ｄｅｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ）ストラテジー
、ヒューマネーション（ｈｕｍａｎａｔｉｏｎ）ストラテジー、ヒト操作（ｈｕｍａｎ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）（例えば、ＸＯＭＡのＨＥ技術）、ＦｃＸ、Ｂｉｏｌｅｘ Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ（Ｐｉｔｔｓｂｏｒｏ，ＮＣ，ＵＳ）ＬＥＸシステム、
Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔアプローチ（例えば、ＢｉｏＷａ）、Ｃｏｍｐｌｅｇｅｎｔ技術
、ＢｅｓｔＭＡｂ、ＩｍｍｕｎｏＢｏｄｙ、ＥＢ６６、Ｓｙｎａｇｅｖａ Ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ、Ｘｅｎｃｏｒ Ｉｎｃ．ＸｍＡｂ、糖操作抗体（Ｓｕｇ
ａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（例えば、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ，ＵＳ））、「Ｗｏｘ」（トリプトファン
が酸化された）抗体（例えば、ＩｎＮｅｘｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ（
Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ））；などのいずれか１つまたは組み合わせに
よって作製され得る。いくつかの実施形態において、上記抗体は、完全ヒトモノクローナ
ル抗体であり、例えば、“Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ
ｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ−Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ，ｂｙ Ｊ
ａｍｅｓ Ｓｈｉｒｖｉｌｌ，２０１０”のＣｈａｐｔｅｒ ４に列挙されているおよび
例証されているような、ならびに：ファージディスプレイ（例えば、ＰＤＬ，Ｄｙａｘ
Ｃｏｒｐ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳ）；分子ベースの抗体スクリーニング（ＭＢ
ＡＳ）（例えば、ＥＰ０５４７２０１およびＵＳ６，７３０，４８３に記載されている、
例えば、Ａｆｆｉｔｅｃｈ Ａ／Ｓ）；細胞ベースの抗体選択（ＣＢＡＳ）プラットフォ
ーム；ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー（ＨｕＣＡＬ；例えば、ＭｏｒｐｈｏＳｙ
ｓ ＡＧ）；ＭＡｂｓｔｒａｃｔプラットフォーム（例えば、Ｃｒｕｃｅｌｌ ＮＶ）（
ＰＥＲ．Ｃ６細胞系を用いるものを含む）；Ａｄｉｍａｂプラットフォーム；ＸｅｎｏＭ
ｏｕｓｅ；ＵｌｔｉＭＡｂプラットフォーム；ＳＥＢＶＩプラットフォーム；Ｖｅｌｏｃ
Ｉｍｍｕｎｅプラットフォーム、Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙプラットフォーム、Ｘｅｎｅｒｅｘプラットフォーム；Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｕ
ｍａｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅプラットフォーム（例えば、ＩＱ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ
）および「Ｉｎｓｔａｎｔ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ抗体」；Ｖｉｖｅｎｔｉａプラットフォー
ム（例えば、Ｆｕｓｏｇｅｎｉｃｓ，ＵｎＬｏｃｋ，ＩｍｍｕｎｏＭｉｎｅ）；「Ｎａｔ
ｕｒａｌ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」プラットフォーム（例えば、ＯｎｃｏＭ
ａｂ，Ｐａｔｒｙｓ，Ａｃｃｅｐｔｙｓ）；ＭａｂＩｇＸ（例えば、Ｋｅｎｔａ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ）；Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅプラット
フォーム（例えば、Ｎｅｕｉｍｍｕｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；Ｉ−ＳＴＡＲ（
例えば、Ｔｈｅｒａｃｌｏｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＣｅｌｌＳｐｏｔ（例えば、Ｔｒ
ｅｌｌｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；ｉＢｉｏＬａｕｎｃｈ（例えば、ｉＢｉｏ Ｉｎ
ｃ．）；などを含むがこれらに限定されない、プラットフォーム技術のうちの１つまたは
組み合わせによって作製され得る。
いくつかの実施形態において、上記抗体は、“Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，
Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ−Ｅｍｅｒｇｉｎ
ｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃａｎｄｉ
ｄａｔｅｓ，ｂｙ Ｊａｍｅｓ Ｓｈｉｒｖｉｌｌ，２０１０”のＣｈａｐｔｅｒ ５に
記載されているようなプラットフォーム技術および方法（抗体薬結合体（例えば、ＡＤＣ
，Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）；標的化抗体ペイロード（ｔａｒｇｅｔｅｄ ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ ｐａｙｌｏａｄ）（ＴＡＰ；Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ Ｉｎｃ）；プロボデ
ィ（Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ）（例えば、ＣｙｔｏｍＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；抗体
クローキング（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｌｏａｋｉｎｇ）（例えば、ＢｉｏＴｒａｎｓｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎｓ）；標的化光線力学的療法（例えば、ＰｈｏｔｏＢｉｏｔｉｃｓ；Ａｌ
ｂｕｄＡｂ（例えば、ＧＳＫ）；ｈｙＦｃ（例えば、Ｇｅｎｅｘｉｎｅ）；リガンド捕捉
（例えば、ＢｉｏＬｏｇｉｘ）；ＣｏｖＸ−Ｂｏｄｙ（例えば、ＣｏｖＸ）；Ｄｙｎａｍ
ｉｃ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（例えば、ＩｎＮｅｘｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ）；ＬＥＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（例えば、Ｐｉｖｏｔａｌ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃ
ｅｓ，Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ）；などを含む）のうちの１つもしくは複数を使用して、それ
らを非抗体物質に連結することによって改変される。
いくつかの実施形態において、上記抗体またはそのコードｃＤＮＡは、さらに改変され
得る。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、様々な実施形態の抗体を作製
する方法を提供し、ここで、その方法は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはそれらのいずれ
か１つのアナログを作製する工程のうちのいずれか１つを包含する。いくつかの実施形態
において、キメラ抗体の作製は、国際出願ＷＯ８９／０９６２２に記載されているとおり
である。ヒト化抗体を作製するための方法は、例えば、米国特許第６，５４８，６４０号
またはカナダ特許第１３４０８７９号（ＣＤＲ移植）に記載されている。
さらに、上記抗体またはそのコードｃＤＮＡは、さらに改変され得る。したがって、さ
らなる実施形態において、本発明は、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、二重特異的抗体
、融合抗体、標識抗体またはそれらのいずれか１つのアナログを作製する工程のうちのい
ずれか１つを包含する方法を提供する。上で論じたように、本発明の抗体は、完全な抗体
に加えて、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２ならびに一本鎖を含む種々の形態で
存在し得る。例えば、国際出願ＷＯ８８／０９３４４を参照のこと。さらに、ダイアボデ
ィおよびＶ様ドメイン結合分子も当業者に周知である；例えば、米国特許第７，１６６，
６９７号を参照のこと。
いくつかの実施形態において、上記抗体（例えば、ＤＣ８Ｅ８）は、改変されるか、ま
たはＤＣ８Ｅ８抗体に対して記載された抗原結合特性の１つもしくは複数を有する結合分
子を作製するための根拠となる。これらの結合タンパク質は、例えば、“Ｂｕｓｉｎｅｓ
ｓ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌｓ−Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ，ｂｙ Ｊａｍｅｓ Ｓｈｉｒｖｉｌｌ，２０１０”
のＣｈａｐｔｅｒ ６に列挙されているおよび例証されている手法の１つもしくは複数に
よって作製され得、その結合タンパク質には、Ｆａｂ，ＴｅｔｒａＭＡＢ（例えば、Ｇａ
ｌｉｌｅｏ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃｓ）；ｓｃＦｖ；Ｉｍｍｕｎａ（例えば、ＥＳＢＡ Ｔ
ｅｃｈ ＡＧ）；［ｓｃＦｖ］２（ＤＣ８Ｅ８の４つの治療用エピトープのうちの任意の
２つに結合する結合分子を含む）；ＢｉＴＥ（Ａｆｆｉｔｅｃｈ，Ｍｉｃｒｏｍｅｔ Ａ
Ｇ）；アビボディ（Ａｖｉｂｏｄｉｅｓ）（例えば、Ａｖｉｐｅｐ Ｐｔｙ）；Ｔａｎｄ
Ａｂ（例えば、Ａｆｆｉｍｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；フレキシボディ（Ｆｌｅ
ｘｉｂｏｄｙ）（例えば、Ａｆｆｉｍｅｄ）；Ｖ−ＮＡＲ（例えば、ＡｄＡｌｔａ）；ナ
ノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）（Ａｂｌｙｎｘ ＮＶ）；ドメイン抗体（Ｄｏｍａｉｎ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（例えば、Ｄｉｖｅｒｓｙｓ Ｌｔｄ．ＧＳＫ，米国特許第６，
２４８，５１６号および欧州特許第０３６８６８４号）；ヘテロポリマー（Ｈｅｔｅｒｏ
ｐｏｌｙｍｅｒ）（例えば、Ｅｌｕｓｙｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）；ユ
ニボディ（Ｕｎｉｂｏｄｙ）（例えば、ＧｅｎＭａｂ Ａ／Ｓ）；ドメイン交換抗体（Ｄ
ｏｍａｉｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（例えば、Ｃａｌｍｕｎｅ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３ Ｊｕｎ ２７；３００（５６２８
）：２０６５−７１）；小モジュール免疫薬（Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎ
ｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＳＭＩＰ）およびＳＣＯＲＰＩＯＮ分子（例えば
、Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；二重可変ドメイン免疫グロブリ
ン（Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，ＤＶ
Ｄ−Ｉｇ）（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；などが含まれる。
本発明の抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖は、例えば、アミノ酸の欠失、
挿入、置換、付加および／もしくは組換えならびに／または当該分野で公知の他の任意の
改変を単独でまたは組み合わせて使用することによって、当該分野で公知の従来の手法を
使用してさらに改変され得る。例えば、下記にさらに提供される実施例を参照のこと。そ
のような改変を、免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎をなすＤＮＡ配列に導入するた
めの方法は、当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）およびＡｕｓｕｂ
ｅｌ（前出）を参照のこと。本発明の抗体の改変は、１つもしくは複数の構成アミノ酸に
おける化学的および／または酵素的な誘導体化（側鎖の改変、骨格の改変、ならびにＮお
よびＣ末端の改変（アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化および炭水化物ま
たは脂質部分、コファクターの結合または除去を含む）を含む）などを含む。同様に、本
発明は、カルボキシル末端において異種分子（例えば、免疫賦活性リガンド）に融合され
た、記載される抗体またはいくつかのそのフラグメントをアミノ末端に含むキメラタンパ
ク質の作製を包含する。対応する技術的詳細については、例えば、国際出願ＷＯ００／３
０６８０（その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
１つの実施形態において、本発明は、抗体またはその結合フラグメントもしくは免疫グ
ロブリン鎖を作製するための方法に関し、その方法は、
（ａ）上に記載されたような細胞を培養する工程；および
（ｂ）その培養物から前記抗体またはその結合フラグメントもしくは免疫グロブリン鎖を
単離する工程
を包含する。いくつかの実施形態において、上記単離は、抗体を含むサンプルを、本発明
によって提供される、その抗体が結合するペプチドのうちの１つと接触させることを包含
する。
形質転換された宿主は、当該分野で公知の手法に従って、発酵槽において生育され、培
養されることにより、最適な細胞の成長を達成することができる。いったん発現されたら
、本発明のホール抗体、その二量体、個別の軽鎖および重鎖または他の免疫グロブリン形
態は、当該分野の標準的な手順（硫安塩析、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動などを含む）に従って精製され得る；Ｓｃｏｐｅｓ，“Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９
８２）を参照のこと。次いで、その抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖は、成長培
地、細胞溶解産物または細胞膜画分から単離され得る。例えば、本発明によって提供され
る組換え的に発現された抗体または免疫グロブリン鎖の単離および精製は、任意の従来の
手段（例えば、本発明の抗体の定常領域に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗
体の使用を含むもののような、分取クロマトグラフィー分離および免疫学的分離）によっ
て行われ得る。
少なくとも約９０〜９５％の均一性という実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、
９８〜９９％またはそれ以上の均一性が、薬学的用途にとって最も好ましい。部分的にま
たは所望のとおりの均一性に精製されたら、次いで、その抗体は、治療的に（体外的（ｅ
ｘｔｒａｃｏｒｐｏｒａｌｌｙ）を含む）、またはアッセイ手順を開発するおよび実施す
る際に、使用され得る。
本発明は、薬物標的化およびイメージングの用途などの目的のために他の部分に結合さ
れた抗体も提供する。そのような結合は、その抗体を発現させた後に結合部位に対して化
学的に行われ得るか、または本発明の抗体になるようにＤＮＡレベルで結合産物が操作さ
れ得る。次いで、そのＤＮＡが、好適な宿主系において発現され、発現されたタンパク質
が、回収され、必要であれば再生される。
本発明は、本発明の抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖を発現することができる
細胞を作製するための方法も含み、その方法は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクタ
ーで細胞を遺伝的に操作する工程を包含する。本発明の方法によって入手可能な細胞は、
例えば、本発明の抗体とその抗原との相互作用を試験するために使用され得る。
本発明は、本発明によって提供される抗体の供給源として、抗体を産生する細胞系およ
び組換え細胞も提供する。本発明はさらに、本発明によって提供される抗体または等価な
結合分子を含む診断アッセイおよびキット、ならびにそれらに基づく治療方法に関する。
本発明は、ＤＣ８Ｅ８と競合することができ、病理学的タウ−タウ相互作用を阻害する
こともできる抗体を作製するための方法も提供する。それらの抗体は、タウへの結合およ
び本明細書中で同定される「治療用エピトープ」の１、２、３つまたは４つすべてへの結
合についてＤＣ８Ｅ８と十分に競合する能力によってスクリーニングされ得る。
本発明は、本発明によって提供される抗体ベースの物質の１つもしくは複数をコードす
るポリヌクレオチドにも関する。ある特定の場合において、そのヌクレオチドは、例えば
、少なくとも、上に記載された抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメインまたは可変領域を
コードする。代表的には、ポリヌクレオチドによってコードされる前記可変領域は、前記
抗体の可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）
を含む。当業者は、抗体の各可変ドメイン（重鎖ＶＨおよび軽鎖ＶＬ）が、４つの比較的
保存されたフレームワーク領域または「ＦＲ」に隣接される３つの超可変領域（時折、相
補性決定領域または「ＣＤＲ」と呼ばれる）を含み、それが抗原結合に関与する抗体のア
ミノ酸残基のことを指すことを承知している。Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによる
と、ヒトＩｇＧサブタイプの抗体の超可変領域またはＣＤＲは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒ
ｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１
）によって記載されているように、軽鎖可変ドメインに残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜
５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインに３１〜３５（Ｈ１）
、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）のアミノ酸残基、ならびに／またはＣ
ｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１−９１７によって
記載されているように、超可変ループの残基、すなわち、軽鎖可変ドメインに残基２６〜
３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン
に２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）を含む。ＩＭＧ
Ｔユニークナンバリングシステムでは、保存されたアミノ酸は常に、同じ位置、例えば、
システイン２３（第１ＣＹＳ）、トリプトファン４１（保存ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８
９、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎ）１０４（第２ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリ
プトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）を有する。例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ
Ｍ．−Ｐ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １８，５０９（１９９７）；Ｌｅｆｒ
ａｎｃ Ｍ．−Ｐ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９
９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｐｏｍｍｉｅ，Ｃ．，Ｒｕｉｚ，Ｍ．，Ｇｉｕｄｉ
ｃｅｌｌｉ，Ｖ．，Ｆｏｕｌｑｕｉｅｒ，Ｅ．，Ｔｒｕｏｎｇ，Ｌ．，Ｔｈｏｕｖｅｎｉ
ｎ−Ｃｏｎｔｅｔ，Ｖ．ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
，２７，５５−７７（２００３）を参照のこと。ＩＭＧＴユニークナンバリングは、フレ
ームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６位、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５位、Ｆ
Ｒ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４位およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８位）および相
補性決定領域：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８位、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５位
およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７位の標準化された境界を提供する。ＩＭＧＴ
ユニークナンバリングは、ＩＭＧＴ Ｃｏｌｌｉｅｒｓ ｄｅ Ｐｅｒｌｅｓと命名され
た２Ｄグラフ表示において使用される。例えば、Ｒｕｉｚ，Ｍ．ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ
，Ｍ．−Ｐ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５３，８５７−８８３（２００２）；Ｋ
ａａｓ，Ｑ．ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｉｎｆｏｒ
ｍａｔｉｃｓ，２，２１−３０（２００７）を参照のこと。それは、３Ｄ構造を表示する
ためにも使用される。例えば、ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ Ｋａａｓ，Ｑ
．，Ｒｕｉｚ，Ｍ．ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ ａｎｄ ＭＨＣ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄａｔａ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．，３２，Ｄ２０８−Ｄ２１０（２００４）を参照のこと。フレームワークまたはＦＲ
残基は、超可変領域以外の、および超可変領域を考慮の対象外に置いた、可変ドメイン残
基である。
したがって、本発明は、以下の核酸（任意の縮重遺伝暗号を含む）：
ａ）本発明に係る抗体をコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ；
ｂ）ａ）において定義されたような核酸に相補的な核酸；
ｃ）配列番号１１７〜１２２ならびに配列番号２４７、２５３、２５５、２５７〜２５９
、１２２、２６１、２６２、２６４、２６５〜２６７および２６９から選択されるＣＤＲ
の少なくとも１つと高度にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることが
できる少なくとも１８ヌクレオチドの核酸；および
ｄ）少なくとも配列番号１６５の核酸配列の軽鎖および／もしくは配列番号１７０の核酸
配列の重鎖、または配列番号１６５および／もしくは配列番号１７０の配列との最適なア
ラインメントの後に少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％および９８％の
同一性を有する配列、例えば、ＩＭＧＴナンバリングに従うそれらからのＣＤＲの少なく
とも１つと高度にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができる少
なくとも１８ヌクレオチドの核酸
から選択されることを特徴とする単離された核酸にも関する。
好ましい配列との最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、例えば、８５％、９
０％、９５％および９８％のパーセンテージ同一性を示す核配列は、参照核配列に関して
、とりわけ規則的な、ある特定の改変（例えば、特に、欠失、切断、伸長、キメラ融合お
よび／または置換）を示す核配列のことを意味する。いくつかの実施形態において、これ
らは、参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列（これは、遺伝暗号の縮重に関する
）、または例えば、高度にストリンジェントな条件（とりわけ下記で定義される条件）下
において、参照配列と特異的にハイブリダイズする可能性がある相補性配列である。
高度にストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションは、温度およびイオ
ン強度に関する条件が、２つの相補性ＤＮＡフラグメント間でのハイブリダイゼーション
の維持を可能にするような方法で選択されることを意味する。純粋に例証的に、上に記載
されたポリヌクレオチドフラグメントを定義する目的のハイブリダイゼーション工程の高
度にストリンジェントな条件は、以下のとおりの条件であることが好都合である。
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、２つの工程において
行われる：（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエ
ン酸ナトリウムの溶液に対応する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５％デキストラン硫酸および１％サケ精子Ｄ
ＮＡを含むリン酸緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ７．５）中、４２℃での３時間にわたるプレハ
イブリダイゼーション；（２）プローブの長さに応じた温度（すなわち：＞１００ヌクレ
オチド長のプローブの場合、４２℃）における２０時間にわたる第１のハイブリダイゼー
ションに続く、２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中、２０℃での２回の２０分間の洗浄、０．１×
ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、２０℃での１回の２０分間の洗浄。最後の洗浄は、＞１００
ヌクレオチド長のプローブの場合、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、６０℃において
３０分間行われる。規定のサイズのポリヌクレオチドに対する上に記載された高度にスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件は、それよりも長いまたは短いオリゴヌクレ
オチドに対して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ；３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）に記載されている手順に従って、当業
者によって適合され得る。
抗原に対する抗体の親和性またはアビディティーは、任意の好適な方法；例えば、Ｐｏ
ｐｅ ＭＥ，Ｓｏｓｔｅ ＭＶ，Ｅｙｆｏｒｄ ＢＡ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＮＬ，Ｐｅａ
ｒｓｏｎ ＴＷ．（２００９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．３４１（１−２）
：８６−９６を参照のことおよび本明細書中に記載される方法を使用して実験的に測定さ
れ得る。特定の抗体抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件下、例えば、塩濃度
、ｐＨにおいて測定された場合、変動し得る。したがって、親和性および他の抗原結合パ
ラメータ、例えば、Ｋ ｓｕｂ Ｄ、ＩＣ５０の測定は、例えば、抗体および抗原の標準
液ならびに標準化された緩衝液を用いて行われる。
本発明は、上に記載された可変ドメインを有する抗体の可変ドメインが、所望の特異性
および生物学的機能の他のポリペプチドまたは抗体の構築のために使用され得ることも提
供する。したがって、本発明は、上に記載された可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲ
を含み、添付の実施例に記載される抗体と実質的に同じまたは類似の結合特性を有利に有
する、ポリペプチドおよび抗体も包含する。当業者は、本明細書中に記載される可変ドメ
インまたはＣＤＲを使用して、当該分野で公知の方法に従って、例えば、欧州特許出願Ｅ
Ｐ０４５１２１６Ａ１およびＥＰ０５４９５８１Ａ１に記載されているように抗体が構築
され得ることを認識するだろう。さらに、当業者は、結合親和性が、Ｋａｂａｔによって
定義されたようなＣＤＲと部分的に一部重複する、ＣＤＲ内または超可変ループ内（Ｃｈ
ｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１−
９１７）でアミノ酸置換を行うことによって高められ得ることを承知している。したがっ
て、本発明は、言及されたＣＤＲの１つもしくは複数が、１つもしくは複数の（例えば、
多くとも２つの）アミノ酸置換を含む抗体にも関する。いくつかの実施形態において、本
発明の抗体は、図３Ｂおよび３Ｅに示されるような可変領域の２つまたは３つすべてのＣ
ＤＲをその免疫グロブリン鎖の一方または両方に含む。いくつかの実施形態において、本
発明の抗体は、図２５Ｂに示されるような２つまたは３つすべてのＣＤＲをその免疫グロ
ブリン鎖の一方または両方に含む。
上に記載された抗体をコードするポリヌクレオチドまたは核酸は、例えば、ＤＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成的に生成されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、あるいは任意のそれ
らのポリヌクレオチドを単独でまたは組み合わせて含む組換え的に生成されたキメラ核酸
分子であり得る。いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドは、ベクターの一
部である。そのようなベクターは、さらなる遺伝子（例えば、好適な宿主細胞においてお
よび好適な条件下において前記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子）を含み得る
。
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞内で
の発現を可能にする１つもしくは複数の発現調節配列に作動可能に連結される。前記ポリ
ヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドから翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。真核
細胞、例えば、哺乳動物細胞内での発現を確実にする調節エレメントは、当業者に公知で
ある。それらは通常、転写の開始を確実にする制御配列、ならびに必要に応じて、転写の
終結および転写物の安定化を確実にするポリ−Ａシグナルを含む。さらなる調節エレメン
トは、転写エンハンサーならびに翻訳エンハンサー、および／または天然に関連するもし
くは異種のプロモーター領域を含み得る。
この点において、当業者は、少なくとも軽鎖および／または重鎖の可変ドメインをコー
ドするポリヌクレオチドが、両方の免疫グロブリン鎖または一方だけの可変ドメインをコ
ードし得ることを認識するだろう。同様に、前記ポリヌクレオチドは、同じプロモーター
の支配下であり得るか、または発現について別々に制御され得る。原核生物宿主細胞内で
の発現を可能にする可能性のある調節エレメントは、例えば、大腸菌におけるＰＬ、ｌａ
ｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターを含み、真核生物宿主細胞内での発現を可能にする
調節エレメントに対する例は、酵母におけるＡＯＸ１もしくはＧＡＬ１プロモーター、ま
たは哺乳動物細胞および他の動物細胞におけるＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモー
ター、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサーもしくはグロビンイントロンであ
る。
転写の開始に関与するエレメントに加えて、そのような調節エレメントは、そのポリヌ
クレオチドの下流に転写終結シグナル（例えば、ＳＶ４０−ポリ−Ａ部位またはｔｋ−ポ
リ−Ａ部位）も含み得る。さらに、使用される発現系に応じて、ポリペプチドを細胞内コ
ンパートメントに向かわせることができるかまたはそれを培地に分泌することができるリ
ーダー配列が、そのポリヌクレオチドのコード配列に付加され得、そのリーダー配列は、
当該分野で公知である。そのリーダー配列は、適切な段階において、翻訳開始配列および
翻訳終結配列、ならびに必要に応じて、翻訳されたタンパク質またはその一部を細胞周辺
腔または細胞外の培地に分泌することを指示することができるリーダー配列とともに、構
築される。いくつかの実施形態において、異種配列が、所望の特徴、例えば、発現された
組換え産物の安定化または簡易化された精製を付与する、ＣまたはＮ末端の識別ペプチド
を含む融合タンパク質をコードし得る。この文脈において、好適な発現ベクターは、当該
分野で公知であり、それらとしては、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクター
ｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃ
ＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）が挙げ
られるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態において、発現調節配列は、真核生物宿主細胞を形質転換すること
またはトランスフェクトすることができるベクター内の真核生物のプロモーター系であり
得るが、原核生物宿主に対する調節配列も使用できる。いったん、ベクターが適切な宿主
に組み込まれると、その宿主は、そのヌクレオチド配列の高レベルの発現に適した条件下
で維持され、所望であれば、免疫グロブリン軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二量体またはインタ
クトな抗体、結合フラグメントまたは他の免疫グロブリンの形態の回収および精製がその
後に続き得る。例えば、Ｂｅｙｃｈｏｋ，Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌ
ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（１９７９）を
参照のこと。
さらに、本発明は、本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードするポリ
ヌクレオチドを；必要に応じて、本発明の抗体の他方の免疫グロブリン鎖の可変ドメイン
をコードする本発明のポリヌクレオチドと組み合わせて含む、遺伝子操作において従来使
用されている、ベクター、特に、プラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファ
ージを提供する。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、発現ベクターおよび／
または遺伝子導入ベクターもしくはターゲティングベクターである。ウイルス（例えば、
レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスまたはウ
シパピローマウイルス）に由来する発現ベクターは、標的化された細胞集団への本発明の
ポリヌクレオチドまたはベクターの送達のために使用され得る。当業者に公知の任意の方
法が、組換えウイルスベクターを構築するために使用され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ（前出）およびＡｕｓｕｂｅｌ（前出）に記載されている手法を参照のこと。あるいは
、本発明によって提供されるポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞への送達用の
リポソームに再構成され得る。本発明によって提供されるポリヌクレオチド（例えば、配
列および発現調節配列をコードする免疫グロブリン鎖の重鎖および／または軽鎖可変ドメ
イン）を含むベクターは、細胞宿主のタイプに応じて変化する公知の方法によって宿主細
胞に移され得る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが、原核細胞に対して通
常利用されるのに対し、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが、他の細
胞宿主に対して使用され得る。
本発明はさらに、本発明によって提供されるポリヌクレオチドまたはベクターで形質転
換された宿主細胞に関する。その宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。その
宿主細胞内に存在するポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞のゲノムにインテグ
レートされ得るか、または染色体外に維持され得る。宿主細胞は、任意の原核細胞または
真核細胞（例えば、細菌、昆虫、真菌、植物、動物またはヒト細胞）であり得る。好まし
い真菌細胞は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の細胞、特に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ種の細胞である。組換え作製手順において使用される宿主に応じて、本発明のポ
リヌクレオチドによってコードされる抗体または免疫グロブリン鎖は、グリコシル化され
得るか、またはグリコシル化され得ない。本発明によって提供されるある特定の抗体、ま
たは対応する免疫グロブリン鎖は、最初のメチオニンアミノ酸残基も含み得る。本発明の
ポリヌクレオチドは、当業者に一般に公知の任意の手法を使用して宿主を形質転換するた
めまたはトランスフェクトするために使用され得る。さらに、融合された作動可能に連結
された遺伝子を調製するための方法、ならびにそれらを例えば哺乳動物細胞および細菌に
おいて発現させるための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参
照のこと。それに記載されている遺伝的コンストラクトおよび方法は、本発明によって提
供される抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖を真核生物または原核生物の宿主
において発現させるために利用され得る。通常、挿入されたポリヌクレオチドの効率的な
転写を促すプロモーター配列を含む発現ベクターが、宿主とともに使用される。その発現
ベクターは、代表的には、複製起点、プロモーターおよびターミネーター、ならびに形質
転換された細胞の表現型選択を提供することができる特定の遺伝子を含む。ＤＮＡ配列に
対する好適な起源細胞ならびに免疫グロブリンの発現および分泌のための宿主細胞は、い
くつかの供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ（“Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａｓ”，Ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８５）Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，Ｕ．Ｓ
．Ａ．および参照により本明細書に援用される他の入手可能なバージョン）から得ること
ができる。さらに、本発明の細胞を含むトランスジェニック動物、例えば、哺乳動物が、
本発明の抗体の大規模作製のために使用され得る。
さらに、ある特定の抗体について、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）が、より高い程度の可
変性を有する領域であり、抗原抗体相互作用において主に関与することが頻繁に観察され
ているので、本発明は、小ペプチド（上に記載されたような結合分子を含む小ペプチド、
例えば、言及された抗体のいずれか１つの可変領域のＣＤＲ３領域、特に、重鎖のＣＤＲ
３を含む小ペプチドを含む）を包含する。そのようなペプチドは、合成されるかまたは組
換え手段によって生成されることにより、本発明に係る有用な結合物質を生成し得る。そ
のような方法は、当業者に公知である。ペプチドは、例えば、商業的に入手可能な自動ペ
プチド合成装置を使用して、合成され得る。それらのペプチドは、そのペプチドを発現す
るＤＮＡを発現ベクターに組み込み、その発現ベクターで細胞を形質転換してそのペプチ
ドを産生させることによる組換え手法によっても生成され得る。
上に記載された融合タンパク質はさらに、スペーサー部分と呼ばれ得る、切断可能なリ
ンカーまたはプロテイナーゼに対する切断部位を含み得る。これらのスペーサー部分はさ
らに、不溶性または可溶性であり得（Ｄｉｅｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１（１９８
６），１４８）、標的部位においてその抗体からの薬物の放出を可能にするように選択さ
れ得る。免疫療法のために本発明の抗体に結合され得る治療薬の例は、薬物、放射性同位
体、レクチンおよびトキシンである。本発明の抗体および抗原に結合体化され得る薬物に
は、古典的に薬物と称される化合物（例えば、マイトマイシンＣ、ダウノルビシンおよび
ビンブラスチン）が含まれる。例えば、免疫療法のための放射性同位体的に結合体化され
た本発明の抗体または抗原を使用する際、ある特定の同位体が、白血球分布ならびにアイ
ソタイプの安定性および放射のような因子に応じて他のものよりも好ましい場合がある。
自己免疫性応答に応じて、いくつかの放射体が他のものよりも好ましい場合がある。通常
、アルファおよびベータ粒子を放射する放射性同位体が、免疫療法において好ましい。あ
る特定の好ましい場合において、放射性同位体は、２１２Ｂｉなどの短距離高エネルギー
アルファ放射体である。治療目的のために本発明の抗体または抗原に結合され得る放射性
同位体の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１２Ａｔ、２１
１Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄおよび１８８Ｒｅである。ある特定の場合において、放射
標識は、６４Ｃｕである。本発明の抗体または抗原に結合され得る他の治療薬、ならびに
エキソビボおよびインビボにおける治療的プロトコルは、公知であるか、または当業者に
よって確かめられ得る。適切な場合には必ず、当業者は、タンパク質性材料自体の代わり
に、上に記載された抗体、抗原のいずれか１つをコードする本発明のポリヌクレオチド（
およびそれに対する供給源として）または対応するベクターを使用し得る。
本発明は、被験体内での誤無秩序タウおよび／もしくは誤秩序タウの形成を抑制するた
め、またはそれらのタウのレベルを別途低下させるためにインビボにおいて使用するため
の組成物の調製のため；あるいは体液からの病理学的タウ化合物またはそれらの前駆体を
体外抽出するための、本明細書中に提供されるような結合分子または抗体の使用にも関す
る。これらの方法は、認知を改善するため、または疾患に関連する認知低下を遅らせるか
もしくは逆転させるために使用され得る。本発明によって提供される抗体もしくは結合分
子またはそれらの化学的誘導体は、血液またはＣＳＦに直接投与され、その後の工程にお
いて、親和性捕捉によってその血液またはＣＳＦから隔離され得る（それにより、誤秩序
タウおよび誤無秩序タウは、上述の結合分子とともに隔離される）。それゆえ、本発明は
、被験体におけるアルツハイマー病または関連タウオパチーの発生または進行を処置する
または予防する方法にも関し、その方法は、血液またはＣＳＦを被験体の身体から取り出
す工程、その血液およびＣＳＦを曝す工程、およびそのように得られた血液およびＣＳＦ
をそれぞれその被験体に戻す工程を包含する。
本発明の抗体、ペプチドまたは結合分子／タンパク質を含む分子および粒子は、診断的
有用性も有する。本発明は、異なる段階のアルツハイマー病に存在する異なる形態のタウ
タンパク質を認識するおよび区別する抗体を提供する。これらの抗体は、インビトロとイ
ンビボの両方において、タウ（およびその様々なコンフォーメーション変化）を検出する
ことができる。それらの抗体は、生化学的、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッテ
ィングおよび免疫組織化学アッセイ（例えば、新鮮、固定、凍結、パラフィン包埋）をは
じめとした種々のアッセイ、ならびに例えば、生理学的タウを病理学的タウと区別する放
射性標識されたＤＣ８Ｅ８（一本鎖ＤＣ８Ｅ８などのＤＣ８Ｅ８のフラグメントを含む）
を使用するインビボイメージングにおいて生理学的タウと病理学的タウとを区別し得る（
実施例を参照のこと）。それらは、固体と流体の両方（例えば、血液、血漿、ＣＳＦ、ホ
モジネート）、動物（例えば、げっ歯類、ヒト）サンプルおよび生検材料において、その
ように行うことができる。これらの検出アッセイのいくつかは、下記の実施例に記載され
る。タンパク質を検出するための他の日常的な方法は、当業者に公知であり、ゆえに、本
発明によって提供される抗体、ペプチドおよびタウ結合分子に対して通例のとおり適合さ
れ得る。本発明の抗体は、標識され得（例えば、蛍光、放射性、酵素、核磁気、重金属）
、インビトロにおける免疫化学様アッセイを含むインビボまたはインビトロにおいて、特
定の標的を検出するために使用され得る（例えば、下に記載される実施例を参照のこと）
。また、インビボにおいて、それらは、誤無秩序タウおよびその沈着物を有する組織、細
胞または他の材料を検出する核医学イメージング法に類似の様式で使用され得る。ＭＲＩ
またはＰＥＴによって検出可能な診断的イメージングプローブを用いた細胞内および細胞
外の誤無秩序タウおよび神経原線維病変の標的化は、ＡＤのより決定的な死前（ｐｒｅｍ
ｏｒｔｅｍ）診断のための生物学的マーカー、ならびにタウタンパク質を標的化する治療
の有効性をモニターするための手段を提供し得る。したがって、本発明は、タウ検出のた
めの組成物を調製するための、およびタウ検出の方法における、ならびに／またはＡＤ診
断のために脳の病理学的タウおよび神経原線維病変に診断用薬剤を標的化するための、本
明細書中に記載される抗体の使用を提供する。これらの組成物および方法は、ＡＤおよび
関連タウオパチーに対する処置プロトコルの一部として使用され得る。
本発明は、抗体が液相において利用可能であり得るかまたは固相キャリアに結合され得
るイムノアッセイにおける使用に適した抗体を提供する。本発明の抗体を利用し得るイム
ノアッセイの例は、直接的または間接的な形式での競合および非競合イムノアッセイであ
る。そのようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ
（イムノメトリックアッセイ）、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットアッセ
イである。本発明の抗体は、多くの種々のキャリアのうちの１つに結合され得、それに特
異的に結合する細胞を単離するために使用され得る。公知のキャリアの例としては、ガラ
ス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート
、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミ
ド、アガロースならびに磁鉄鉱が挙げられる。そのキャリアは、本発明の目的のために可
溶性または不溶性であり得る。当業者に公知の多くの種々の標識および標識方法が存在す
る。
本発明において使用され得る標識のタイプの例としては、酵素、放射性同位体および放
射性核種、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物、ビオチニル基、二次レポーター
によって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、
二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、ならびに化学発光／
電気化学発光／生物発光化合物が挙げられる。それらの酵素には、ペルオキシダーゼ（例
えば、ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ
、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチル−コリンエ
ステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼまたはグルコース−６リン酸デヒド
ロゲナーゼが含まれる。あるいは、その標識は、ビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブ
ロモ−デスオキシウリジンである。蛍光標識（ローダミン、ランタニド発光体、フルオレ
セインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミンおよびその誘導体、緑色蛍光タンパク質
（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）ならびにその他、ダンシル、ウンベリフェロ
ンを含む）は、本発明によって提供される抗体およびタウ結合タンパク質とも組み合わさ
れ得る。そのような結合体において、本発明の抗体／結合タンパク質は、当業者に公知の
方法によって調製され得る。次いで、それらは、直接；スペーサー基もしくは連結基（例
えば、ポリアルデヒド、グルタルアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）また
はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ））を介して；または他の結合物質（例えば、
当該分野で日常的に公知のもの）の存在下において、酵素または蛍光標識と結合され得る
。フルオレセイン標識を有する結合体は、例えば、イソチオシアネートとの反応によって
調製され得る。ある特定の状況において、その標識またはマーカーも、治療的であり得る
。
他の結合体としては、化学発光標識（例えば、ルミノールおよびジオキセタン）、生物
発光標識（例えば、ルシフェラーゼおよびルシフェリン）または放射性標識（例えば、ヨ
ウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３３、１３１、臭素７７、テクネチ
ウム９９ｍ、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ル
テニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀１０７、水
銀２０３、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、スカンジウム４７、テル
ル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリ
ウム１６８、フッ素１８、イットリウム１９９およびヨウ素１３１）が挙げられ得る。直
接、または上で言及されたキレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはＤＴＰＡ）を介して、放
射性同位体（ｒａｄｉｏｉｓｏｔｙｐｅｓ）で抗体を標識するための当業者に公知の既存
の方法は、診断用の放射性同位体に対して使用され得る。例えば、クロラミン−Ｔ法によ
る［Ｉ１２５］Ｎａでの標識［Ｈｕｎｔｅｒ Ｗ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ Ｆ
．Ｃ．（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ １９４：４９５］；Ｃｒｏｃｋｆｏｒｄらによって記
載されているようなテクネチウム９９ｍでの標識（米国特許第４，４２４，２００号）；
およびＨｎａｔｏｗｉｃｈによって記載されているようなＤＴＰＡを介した結合（米国特
許第４，４７９，９３０号）を参照のこと。
本発明は、ある個体から血液サンプル、リンパサンプルまたは他の任意の体液サンプル
であり得る体液サンプルを得て、抗体抗原複合体の形成を可能にする条件下においてその
体液サンプルを本発明の抗体と接触させることによって、その個体における障害を診断す
るための方法においても使用され得る抗体および他のタウ結合分子も提供する。次いで、
そのような複合体の存在および／または量が、当該分野で公知の方法によって測定され、
コントロールサンプルにおいて形成されたレベルよりも有意に高いレベルは、試験された
個体における疾患の存在を示唆する。したがって、本発明は、本発明の抗体を含むインビ
トロイムノアッセイに関する。
さらに、本発明は、本発明のタウ結合分子のいずれか１つを使用するインビボイメージ
ング法に関する。例えば、身体の一部の３次元像を生成する医用画像法ポジトロン放出断
層撮影法（ＰＥＴ）は、陽電子放射による放射線の検出に基づく。代表的には、生体分子
を放射性標識し、例えば、生体分子に、放射性トレーサー同位体を組み込ませる。代表的
には血液循環に注入することによって被験体に標識された生体分子を投与すると、放射性
標識された生体分子は、目的の組織に集中する。次いで、陽電子放出を検出するイメージ
ングスキャナーに被験体を入れる。１つの実施形態において、標識された（例えば、６４
Ｃｕ標識された）結合分子（例えば、抗体）が被験体に投与され、その被験体をイメージ
ングスキャナーに入れて、陽電子放射を検出することによって、その結合分子およびひい
ては誤無秩序タウまたは誤秩序タウの検出が行われる（それにより、放出が検出された場
合、神経障害が示唆される）。したがって、本発明は、ＰＥＴイメージングのための方法
を包含し、その方法は、６４Ｃｕで標識されたまたは等価物で標識された本発明の結合分
子を被験体に投与する工程を包含する。
本発明は、上に記載された成分、すなわち、本発明によって提供されるような、結合分
子、抗体もしくはその結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞のうち
の１つもしくは複数で満たされた１つもしくは複数の容器を備える製造品（例えば、薬学
的および診断的パックまたはキット）も提供する。医薬品または生物製品の製造、使用ま
たは販売を規制する行政機関が指示する形態での警告が、そのような容器に付随され得、
その警告は、その機関による、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売の承認を反映
するものである。さらにまたはあるいは、そのキットは、適切な診断アッセイにおける使
用のための試薬および／または指示書を備える。本発明の組成物またはキットは、アルツ
ハイマー病および関連タウオパチーの診断、予防および処置に適している。
本発明によって提供される結合分子、例えば、抗体の生物学的活性は、それらが、それ
らを細胞または組織への薬物の局在化／薬物の送達のための候補にするのに十分な親和性
を有することを示唆する。誤無秩序タウ沈着物への標的化および結合は、治療的または診
断的に活性な物質の送達および遺伝子治療／遺伝子送達に有用であり得る。したがって、
本発明は、脳の病理学的タウおよび神経原線維病変の検出ならびに／またはそれらへの治
療用物質もしくは診断用物質の標的化のための組成物を調製するための、ならびにその検
出および／または標的化の方法における、本明細書中に記載される抗体の使用を提供する
。これらの組成物および方法は、ＡＤおよび関連タウオパチーに対する処置プロトコルの
一部として使用され得る。
したがって、本発明は、結合分子、抗体、結合フラグメント；それらの化学的誘導体；
ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞を含む上述の化合物の１つもしくは複数を含む組
成物に関する。ある特定の組成物はさらに、１つもしくは複数の薬学的に許容され得るキ
ャリアおよび１つもしくは複数の薬学的に許容され得る希釈剤を含み得る。ある特定の化
学的誘導体は、通常、基礎分子または細胞（例えば、抗体、結合分子、ポリヌクレオチド
、ベクターおよび細胞）の一部ではないが、日常的な方法によってそれらに連結された、
化学部分を含む。そのような部分は、例えば、基礎分子または細胞の溶解性、半減期、可
視化、検出性および／または吸収を改善するように機能し得る。あるいは、それらの部分
は、基礎分子の望ましくない副作用を減弱し得るか、または基礎分子の毒性を減少させ得
る。
本発明は、薬学的組成物の意図される使用に応じて、本明細書中に提供される抗体とさ
らなる物質（例えば、インターロイキンまたはインターフェロン）との組み合わせを含む
薬学的組成物も提供する。例えば、アルツハイマー病の処置において使用する場合、その
さらなる物質は、有機小分子、抗タウ抗体、抗ベータ−アミロイド（ａｍｌｙｏｉｄ）抗
体およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。他の物質としては、アセチル
コリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属キレート剤、
成長因子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤、脂質低下剤
、選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナーゼの阻害剤
、熱ショックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫試薬、抗アミロイド
凝集阻害剤、ならびにセクレターゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。それ
ゆえ、ある実施形態において、本発明は、アルツハイマー病または関連タウオパチーの進
行を処置するためまたは予防するための薬学的組成物または診断用組成物を調製するため
；アルツハイマー病または関連タウオパチーに関連する症状を回復させるため；アルツハ
イマー病または関連タウオパチーの発症についての被験体のリスクを測定するためにアル
ツハイマー病または関連タウオパチーの存在について被験体を診断するためまたはスクリ
ーニングするための、本発明の結合分子、抗体もしくは結合フラグメント、またはそれら
のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有する結合分子、本発明のポリヌクレオチド
、ベクターあるいは細胞の使用に関する。
診断、能動免疫およびＡＤ治療のためのペプチド
本発明は、タウのある特定のフラグメントが、ＡＤのラットモデルに注射されたときの
病理学的タウに対する免疫応答の誘導において活性であるという発見に部分的に基づき、
ヒトにおいてもそうであると予想され得る。これらの免疫原性タウフラグメント（ＤＣ８
Ｅ８を通じて、ＡＤの発症および進行における促進物質または少なくとも関与物質と上で
同定されたタウの領域の１つもしくは複数を含む）は、（ｉ）ＡＤ脳内の細胞外タウ沈着
物のクリアランスを促進することができる（ラットモデル）；（ｉｉ）動物モデルにおい
てＡＤに対する防御抗体の産生を誘導することができる；ならびに／または（ｉｉｉ）動
物モデルにおいて１つもしくは複数の生化学的アッセイおよび神経学的アッセイによって
測定されたとき、レシピエント被験体においてＡＤの進行を遅らせることができると見出
された。それらはまた、タウがこれらの領域に沿って病理学的タウ−タウ相互作用を形成
する能力を物理的に直接干渉し得る。
本発明は、ＰＨＦのコアの形成にとって重要でありかつインビトロにおけるＰＨＦの構
築を促進する、タウタンパク質の新規に同定された領域に由来する免疫原または免疫原性
ペプチドを提供する。これらの領域（「治療用エピトープ」）を戦略的に標的化すること
によって、ＡＤおよび関連タウオパチーの処置が成功し得る。免疫原は、動物モデル（例
えば、下に記載されるトランスジェニックラットモデル）において治療効果についてスク
リーニングされ得る。
本発明のある実施形態において、タウペプチドは、例えば、以下のアミノ酸配列（その
中に４つの治療用エピトープの各々を別々に含む）のうちの１つを含む：ａ）配列番号９
８タウ２６７−ＫＨＱＰＧＧＧ−２７３、ｂ）配列番号９９タウ２９８−ＫＨＶＰＧＧＧ
−３０４、ｃ）配列番号１００タウ３２９−ＨＨＫＰＧＧＧ−３３５およびｄ）配列番号
１０１タウ３６１−ＴＨＶＰＧＧＧ−３６７（４４１残基長である最も長いヒトタウアイ
ソフォームタウ２Ｎ４Ｒに従ってナンバリングされた。配列番号１０２を参照のこと）。
別の実施形態において、タウペプチドは、少なくとも１つの治療用エピトープを含み、こ
こで、その治療用エピトープは、配列番号２２３タウ２６８−ＨＱＰＧＧＧ−２７３、配
列番号１５４タウ２９９−ＨＶＰＧＧＧ−３０４、配列番号２２４タウ３３０−ＨＫＰＧ
ＧＧ−３３５および配列番号１５４タウ３６２−ＨＶＰＧＧＧ−３６７から選択される。
本発明は、表１に示される配列番号のいずれか１つなどの３０アミノ酸長の免疫原を提
供する。表１に含まれる免疫原の各１つは、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０
０および配列番号１０１の中に位置する治療用エピトープのうちの１つを含むタウの単離
されたフラグメントである。



いくつかの実施形態において、免疫原性ペプチドは、配列番号１タウ２５１−ＰＤＬＫ
ＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫ−２８０；配列番号２タウ２５
６−ＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳ−２８５；配列番
号３タウ２５９−ＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱ−２
８８；および配列番号４タウ２７５−ＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩ
ＫＨＶＰＧＧＧ−３０４から選択される。
本発明は、ヒトタウタンパク質の６つのアイソフォームのうちのいずれか１つに由来し
得る、アミノ酸配列配列番号９８ ２６７−ＫＨＱＰＧＧＧ−２７３またはアミノ酸配列
番号９９ ２９８−ＫＨＶＰＧＧＧ−３０４またはアミノ酸配列番号１００ ３２９−Ｈ
ＨＫＰＧＧＧ−３３５またはアミノ酸配列番号１０１ ３６１−ＴＨＶＰＧＧＧ−３６７
の１つもしくは複数を含む、本発明において使用するための、それより短いおよび長い免
疫原性ペプチドも提供する。１つの実施形態において、免疫原性ペプチドは、少なくとも
１つの治療用エピトープを含み、ここで、その治療用エピトープは、配列番号２２３タウ
２６８−ＨＱＰＧＧＧ−２７３、配列番号１５４タウ２９９−ＨＶＰＧＧＧ−３０４、配
列番号２２４タウ３３０−ＨＫＰＧＧＧ−３３５および配列番号１５４タウ３６２−ＨＶ
ＰＧＧＧ−３６７から選択される。１つの実施形態において、免疫原性ペプチドは、配列
番号１０９タウ３１４−ＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥ
−３４２；配列番号１１０タウ３５２−ＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴ
ＨＫＬＴＦＲＥＮ−３８０；配列番号１１１タウ３２５−ＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱ−３
３６；配列番号１１２タウ３５７−ＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮ−３６８；配列番号１０８
タウ２９４−３０５ＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳから選択される配列を含む。いくつかの実
施形態において、少なくとも１つの免疫原性ペプチドは、配列番号１〜４、配列番号９〜
１０１および配列番号１０８〜１１２、ＮＩＫＡＶＰＧＧＧＳ（配列番号２００）、ＮＩ
ＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号２０１）、ＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号２０２）、ＫＨＶ
ＰＧＧＧＳＶ（配列番号２０３）、ＨＶＰＧＧＧＳＶＱ（配列番号２０４）、ＶＰＧＧＧ
ＳＶＱ（配列番号２０５）、ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５０）およびＳＶＦ
ＱＨＬＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）、ＡＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４４）、
ＤＡＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４６）、ＤＮＡＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４９
）、ＤＮＩＡＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１５１）、ＤＮＩＫＡＶＰＧＧＧＳ（配列番号１
５９）、ＤＮＩＫＨＡＰＧＧＧＳ（配列番号１６１）およびＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配
列番号１７１）のうちのいずれか１つから選択される。
ヒトタウアイソフォームに対応するアミノ酸配列は、配列番号１０２〜１０７に与えら
れている。
配列番号１０２（２Ｎ４Ｒ）：
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQT PTEDGSEEPG SETSDAKS
TP TAEDVTAPLV DEGAPGKQAA AQPHTEIPEG TTAEEAGIGD TPSLEDEAAG HVTQARMVSK SKDG
TGSDDK KAKGADGKTK IATPRGAAPP GQKGQANATR IPAKTPPAPK TPPSSGEPPK SGDRSGYSSP
GSPGTPGSRS RTPSLPTPPT REPKKVAVVR TPPKSPSSAK SRLQTAPVPM PDLKNVKSKI GSTENLKH
QP GGGKVQIINK KLDLSNVQSK CGSKDNIKHV PGGGSVQIVY KPVDLSKVTS KCGSLGNIHH KPGG
GQVEVK SEKLDFKDRV QSKIGSLDNI THVPGGGNKK IETHKLTFRE NAKAKTDHGA EIVYKSPVVS
GDTSPRHLSN VSSTGSIDMV DSPQLATLAD EVSASLAKQG L
配列番号１０３（１Ｎ４Ｒ）：
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQT PTEDGSEEPG SETSDAKS
TP TAEAEEAGIG DTPSLEDEAA GHVTQARMVS KSKDGTGSDD KKAKGADGKT KIATPRGAAP PGQK
GQANAT RIPAKTPPAP KTPPSSGEPP KSGDRSGYSS PGSPGTPGSR SRTPSLPTPP TREPKKVAVV
RTPPKSPSSA KSRLQTAPVP MPDLKNVKSK IGSTENLKHQ PGGGKVQIIN KKLDLSNVQS KCGSKDNI
KH VPGGGSVQIV YKPVDLSKVT SKCGSLGNIH HKPGGGQVEV KSEKLDFKDR VQSKIGSLDN ITHV
PGGGNK KIETHKLTFR ENAKAKTDHG AEIVYKSPVV SGDTSPRHLS NVSSTGSIDM VDSPQLATLA
DEVSASLAKQ GL
配列番号１０４（２Ｎ３Ｒ）：
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQT PTEDGSEEPG SETSDAKS
TP TAEDVTAPLV DEGAPGKQAA AQPHTEIPEG TTAEEAGIGD TPSLEDEAAG HVTQARMVSK SKDG
TGSDDK KAKGADGKTK IATPRGAAPP GQKGQANATR IPAKTPPAPK TPPSSGEPPK SGDRSGYSSP
GSPGTPGSRS RTPSLPTPPT REPKKVAVVR TPPKSPSSAK SRLQTAPVPM PDLKNVKSKI GSTENLKH
QP GGGKVQIVYK PVDLSKVTSK CGSLGNIHHK PGGGQVEVKS EKLDFKDRVQ SKIGSLDNIT HVPG
GGNKKI ETHKLTFREN AKAKTDHGAE IVYKSPVVSG DTSPRHLSNV SSTGSIDMVD SPQLATLADE
VSASLAKQGL
配列番号１０５（０Ｎ４Ｒ）：
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKAEEAGI GDTPSLEDEA AGHVTQAR
MV SKSKDGTGSD DKKAKGADGK TKIATPRGAA PPGQKGQANA TRIPAKTPPA PKTPPSSGEP PKSG
DRSGYS SPGSPGTPGS RSRTPSLPTP PTREPKKVAV VRTPPKSPSS AKSRLQTAPV PMPDLKNVKS
KIGSTENLKH QPGGGKVQII NKKLDLSNVQ SKCGSKDNIK HVPGGGSVQI VYKPVDLSKV TSKCGSLG
NI HHKPGGGQVE VKSEKLDFKD RVQSKIGSLD NITHVPGGGN KKIETHKLTF RENAKAKTDH GAEI
VYKSPV VSGDTSPRHL SNVSSTGSID MVDSPQLATL ADEVSASLAK QGL
配列番号１０６（１Ｎ３Ｒ）：
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQT PTEDGSEEPG SETSDAKS
TP TAEAEEAGIG DTPSLEDEAA GHVTQARMVS KSKDGTGSDD KKAKGADGKT KIATPRGAAP PGQK
GQANAT RIPAKTPPAP KTPPSSGEPP KSGDRSGYSS PGSPGTPGSR SRTPSLPTPP TREPKKVAVV
RTPPKSPSSA KSRLQTAPVP MPDLKNVKSK IGSTENLKHQ PGGGKVQIVY KPVDLSKVTS KCGSLGNI
HH KPGGGQVEVK SEKLDFKDRV QSKIGSLDNI THVPGGGNKK IETHKLTFRE NAKAKTDHGA EIVY
KSPVVS GDTSPRHLSN VSSTGSIDMV DSPQLATLAD EVSASLAKQG L
配列番号１０７（０Ｎ３Ｒ）：
MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKAEEAGI GDTPSLEDEA AGHVTQAR
MV SKSKDGTGSD DKKAKGADGK TKIATPRGAA PPGQKGQANA TRIPAKTPPA PKTPPSSGEP PKSG
DRSGYS SPGSPGTPGS RSRTPSLPTP PTREPKKVAV VRTPPKSPSS AKSRLQTAPV PMPDLKNVKS
KIGSTENLKH QPGGGKVQIV YKPVDLSKVT SKCGSLGNIH HKPGGGQVEV KSEKLDFKDR VQSKIGSL
DN ITHVPGGGNK KIETHKLTFR ENAKAKTDHG AEIVYKSPVV SGDTSPRHLS NVSSTGSIDM VDSP
QLATLA DEVSASLAKQ GL
従来のワクチンがまだ利用可能でない疾患において免疫応答を誘発するためにペプチド
ベースのワクチンを使用することは、魅力的である（Ｂｒｏｗｎ，１９９４；ＢｅｎＹｅ
ｄｉｄｉａら、１９９７）。しかしながら、多くの場合、小ペプチドは、必要なＴｈ細胞
エピトープを欠くかつ／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって低効率で捕捉されるハプ
テンとして作用するので、それらは、不十分な免疫原である。本発明の１つの実施形態に
おいて、免疫原性エピトープは、他のアミノ酸とともにタウペプチドの防御的エピトープ
を含むより長いポリペプチドまたはアナログであり得る。
免疫応答を誘導するための本明細書中に記載される物質のいくつかは、病理学的タウお
よびタウ沈着物に対する免疫応答を誘導するために適切なエピトープを含むが、免疫原性
であるには小さすぎる。この場合、ペプチド免疫原は、免疫応答の誘発を助ける好適なキ
ャリアに連結され得る。ある特定の実施形態において、好適なキャリアとしては、血清ア
ルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、
オバルブミン、破傷風トキソイドもしくは他の病原菌（例えば、ジフテリア、大腸菌、コ
レラまたはピロリ菌）由来のトキソイド、または弱毒化トキシン誘導体が挙げられる。免
疫応答を刺激するためまたは増強するための他のキャリアとしては、サイトカイン（例え
ば、ＩＬ−１、ＩＬ−１αおよびβペプチド、ＩＬ−２、γＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＧＭ−
ＣＳＦ）およびケモカイン（例えば、Ｍ１Ｐ１αおよびβならびにＲＡＮＴＥＳ）が挙げ
られる。免疫原性物質は、Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ，ＷＯ９７／１７６１３およびＷＯ９７／１
７６１４に記載されているように、組織を横断した輸送を増強するペプチドにも連結され
得る。
免疫原性物質は、化学的架橋によってキャリアに連結され得る。キャリアに免疫原を連
結するための手法としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−チオ）プロピ
オネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を使用したジスルフィド結合の形成が挙げられ
る（そのペプチドが、スルフヒドリル基を欠く場合、これは、システイン残基の付加によ
って提供され得る）。これらの試薬は、それ自体と一方のタンパク質上のペプチドシステ
イン残基（ｒｅｓｉｄｅｓ）との間のジスルフィド結合、およびリジン上の．イプシロン
．−アミノまたは他のアミノ酸における他の遊離アミノ基を介したアミド結合を作る。種
々のそのようなジスルフィド／アミド形成物質は、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．６２，１８５（
１９８２）によって記載されている。他の二機能性カップリング剤は、ジスルフィド結合
ではなくチオエーテルを形成する。これらのチオエーテル形成物質の多くは、商業的に入
手可能であり、それらとしては、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸および２−
ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の反応性
エステルが挙げられる。カルボキシル基をスクシンイミドまたは１−ヒドロキシル−２−
ニトロ−４−スルホン酸，ナトリウム塩と結合することによって、それらのカルボキシル
基は、活性化され得る。
免疫原性ペプチドは、キャリアとの融合タンパク質としても発現され得る。免疫原性ペ
プチドは、アミノ末端、カルボキシル末端またはペプチド内のどこかの部位において（内
部的に）キャリアに連結され得る。いくつかの実施形態において、免疫原性ペプチドの複
数のリピートが、融合タンパク質に存在し得る。
例えば、防御的エピトープに対するＢ細胞応答を誘導するプロミスカスな（ｐｒｏｍｉ
ｓｃｕｏｕｓ）非天然Ｐａｎ ＤＲ Ｔｈ細胞エピトープに連結された防御的Ｂ細胞エピ
トープを有するタウペプチドを含む融合タンパク質を含む免疫原も提供される。さらなる
代替物において、本発明は、ポリマー（Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９７）、多重抗原ペプチ
ドシステム（ＭＡＰ）（Ｔａｍ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ，１９９６）、免疫賦活複合体（
ＩＳＣＯＭ）（Ｂａｒｒ，Ｉ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，１９９６）および他の可
能性のある分枝状の両性ポリペプチド（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９８）またはエピト
ープの共局在化によって生成されるキメラペプチド（Ｍａｒｕｓｓｉｇら、１９９７）と
してデザインされ得る免疫原を提供する。
ある特定の実施形態において、治療用ペプチドは、薬学的に許容され得るキャリア（Ｋ
ＬＨ、破傷風トキソイド、アルブミン結合タンパク質、ウシ血清アルブミン、デンドリマ
ー（ＭＡＰ；Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５８：５８１）、ならびに例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎ
ら（２００３）に記載されているアジュバント物質（特に、それに記載されている内在性
免疫増強化合物および分配システム）およびＷｉｌｓｏｎ−Ｗｅｌｄｅｒｅｒら（２００
９）に記載されているアジュバント物質（特に、前記文書の表２および３に示されている
もの）もしくはそれらの組み合わせ、またはそれらの混合物を含む）に結合されているか
または結合されていない状態で、単独でまたは組み合わせて、適用され得る。
ある特定の実施形態において、本発明の免疫原性物質は、化学的架橋によって好適なキ
ャリアに結合されるかまたは連結されることにより、タウ沈着物を含む病理学的タウに対
する免疫応答が増加し得る。ある特定の実施形態において、結合されるまたは連結される
薬学的に許容され得るキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷
風トキソイド、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、チログロ
ブリンまたはオボグロブリンである。免疫応答を刺激するための他のキャリアとしては、
サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ）お
よびケモカイン（例えば、Ｍ１Ｐ１αおよびβ）が挙げられる。
タウペプチドまたはアナログは、固相ペプチド合成もしくは組換え発現によって合成さ
れ得るか、または天然の起源から得ることができる。自動ペプチド合成装置が、数多くの
供給業者（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＥＺＢｉｏｌａｂまたはＡ
ｎｔａｇｅｎｅ）から商業的に入手可能である。組換え発現系としては、大腸菌などの細
菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられ得る。組換え発現のためのＤＮＡの操
作および調製ＤＮＡコンストラクトのための手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に
よって記載されており、組換えタンパク質を作製するための方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃｈａｐｔｅｒ ５“Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ＵＮＩＴ５．
１−５．２４，ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４０８６４（ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒ
ａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｂｏｏｋ／１０．１００２／０４７１１４０８６４／ｔｏ
ｃにおいてオンラインで入手可能でもある））に詳細に記載されている。
本発明の免疫原性物質は、ベクターまたは運搬体としてのウイルスまたは細菌によって
発現され得る。免疫原性ペプチドをコードする核酸は、そのウイルスまたは細菌のゲノム
またはエピソームに組み込まれる。最終的には、その免疫原性ペプチドは、分泌タンパク
質としてもしくはウイルスの外表面タンパク質との融合タンパク質として発現され得るか
、または細菌の膜貫通タンパク質として提示され得る。そのような方法において使用され
るウイルスまたは細菌は、通常、非病原性であるか、または減弱されている。好適なウイ
ルスとしては、アデノウイルス、ＨＳＶ、ベネズエラウマ脳炎ウイルスおよび他のアルフ
ァウイルス、水疱性口内炎ウイルスおよび他のラブドウイルス、ワクシニアならびに鶏痘
ウイルスが挙げられる。好適な細菌としては、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＳｈｉｇｅｌ
ｌａが挙げられる。あるいは、ＨＢＶのＨＢｓＡｇへの免疫原性ペプチドの融合が好適で
ある。
本発明のさらなる態様は、様々な実施形態に記載される様々なペプチド（例えば、配列
番号１〜４；９〜９７）またはそれらのフラグメントのアナログでもあり得る治療薬また
は免疫原に関する。
本発明は、本願においてデザイナー治療用エピトープと命名される新規ペプチドの発見
にも基づく。本発明は、タウおよびタウフラグメントの一次配列と異なる一次配列を有す
るにもかかわらず、上に記載されたタウ「治療用エピトープ」の１つもしくは複数の形状
を模倣する形状（例えば、天然無秩序構造、三次構造、コンフォーメーション）を有する
ことができるデザイナー治療用エピトープを特徴とする。これらの領域の１つもしくは複
数を模倣することによって、これらのデザイナー治療用エピトープは、それらに対する抗
体（例えば、ＤＣ８Ｅ８と競合する抗体）を作製するために有用であり得る。これらのペ
プチドは、上で開示されたＤＣ８Ｅ８抗体への結合についてタウまたはタウフラグメント
と競合することができる。
ＡＤのラットモデルに注射されたとき病理学的タウに対する免疫応答を誘導することが
でき、かつヒトにおいてもそうであると予想され得る、免疫原性のデザイナー治療用エピ
トープも含まれる。さらに、１つもしくは複数のデザイナー治療用エピトープによる免疫
に応答して産生され、（ｉ）ＤＣ８Ｅ８のエピトープであるかもしくはＤＣ８Ｅ８のエピ
トープを模倣している１つもしくは複数のエピトープを認識することができる；（ｉｉ）
病理学的タウと正常タウとを区別することができる；ならびに／または（ｉｉｉ）ヒトＡ
Ｄ脳および／もしくはＡＤのトランスジェニックラットモデルにおいて神経原線維病変を
認識することができる、マウス抗体／抗血清も開示される。
本発明は、アルツハイマー病の予防、処置および／または診断のための組成物も提供し
、ここで、その組成物は、（ｉ）タウ−タウ凝集を阻害することによって被験体における
アルツハイマー病を処置するための手段；ならびに（２）薬学的に許容され得るキャリア
および／または希釈剤を含む。本発明は、アルツハイマー病の予防、処置および／または
診断のための組成物も提供し、ここで、その組成物は、（ｉ）病理学的タウにおける１つ
もしくは複数の「治療用エピトープ」に結合することによって被験体におけるアルツハイ
マー病を処置するための手段；ならびに（２）薬学的に許容され得るキャリアおよび／ま
たは希釈剤を含む。本発明は、アルツハイマー病の予防、処置および／または診断のため
の組成物も提供し、ここで、その組成物は、（ｉ）病理学的タウにおける１つもしくは複
数の「治療用エピトープ」に結合することによってタウ−タウ凝集を減少させるための手
段；ならびに（２）薬学的に許容され得るキャリアおよび／または希釈剤を含む。
製剤
本発明の物質は、治療薬（例えば、上に記載されたような抗体またはペプチド）および
他の薬学的に許容され得る構成要素の１つもしくは複数を含む薬学的製剤として投与され
得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５
ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ
．，１９８０）を参照のこと。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリ
ー、ろう、油、脂質、脂質（陽イオン性または陰イオン性）含有ベシクル（例えば、ＬＩ
ＰＯＦＥＣＴＩＮ）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマル
ション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固
体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が含まれる。その製剤中の活性成分が
、その製剤によって不活性化されず、その製剤が、投与経路と生理的に適合性でありかつ
許容できるならば、前述の混合物のいずれもが、本発明に係る処置および治療において適
切であり得る。製薬化学者に公知の製剤、賦形剤およびキャリアに関連するさらなる情報
について、Ｂａｌｄｒｉｃｋ Ｐ．“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎ
ｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｇ
ｕｉｄａｎｃｅ．”Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２
１０−８（２０００）、Ｗａｎｇ Ｗ．“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌｓ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１−２）：１−６０（２０００）、Ｃｈａｒ
ｍａｎ Ｗ Ｎ“Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ ｏｒａｌ
ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”Ｊ
．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．８９（８）：９６７−７８（２０００）、Ｐｏｗｅｌｌら、“Ｃ
ｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆ
ｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２
３８−３１１（１９９８）およびそれらの引用もまた参照のこと。
多種多様の薬学的に許容され得る賦形剤が、当該分野で公知であり、本明細書中で詳細
に論じられる必要がない。薬学的に許容され得る賦形剤は、種々の刊行物（例えば、Ａ．
Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉ
ｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１
９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌら、ｅｄｓ．，７．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃ
ｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅら、
ｅｄｓ．，３ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．が挙げられ
る）に詳しく記載されている。
選択される製剤は、意図される投与様式および治療の用途に依存する。それらの製剤は
、動物またはヒトへの投与用の薬学的組成物を製剤化するために通常使用されるビヒクル
として定義される、薬学的に許容可能な無毒性のキャリアまたは希釈剤も含み得る。希釈
剤は、その組み合わせの生物学的活性に影響しないように選択される。そのような希釈剤
の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハ
ンクス液である。その薬学的組成物または製剤は、他のキャリア、アジュバントまたは無
毒性の非治療的な非免疫原性の安定剤なども含み得る。しかしながら、動物への投与に適
したいくつかの試薬（例えば、フロイント完全アジュバント）は、代表的には、ヒトにお
いて使用するための組成物に含められない。
好適な薬学的キャリアの例は、当該分野で公知であり、その例としては、リン酸緩衝食
塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水エマルション）、様々なタイプの湿潤剤、
滅菌された溶液などが挙げられる。そのようなキャリアを含む組成物は、公知の従来の方
法によって製剤化され得る。より多くのキャリアが、下記でさらに記載される。
アジュバント
本発明の治療薬である免疫原は、アジュバント、すなわち、それ自体は獲得免疫応答を
引き起こさないが付随の抗原に対する応答を増幅するかまたは調節する物質と組み合わせ
て投与され得る。種々のアジュバントが、免疫応答を誘発するために、本発明において治
療用のペプチドおよび抗体と組み合わせて使用され得る。好ましいアジュバントは、応答
の質的な形態に影響し得る免疫原のコンフォーメーション変化を引き起こさずに、その免
疫原に対する固有の応答を増強する。
ある特定の実施形態において、アジュバントは、アルミニウム塩（ミョウバン）、例え
ば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよび硫酸アルミニウムである（Ｈｕｎｔ
ｅｒ，２００２）。そのようなアジュバントは、他の特定の免疫賦活剤（例えば、３−Ｏ
−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−ＤＭＰ）、重合体または単量
体のアミノ酸（例えば、ポリグルタミン酸またはポリリジン）とともに、またはそれら無
しで、使用され得る。そのようなアジュバントは、他の特定の免疫賦活剤（例えば、ムラ
ミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（
ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（
ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−
アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−−グリセロ−３−ヒドロキシホスホ
リルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル（ａｃｅｔ
ｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソｇｌｕ−Ｌ
−Ａｌａ−ジパルミトオキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商
標））または他の細菌の細胞壁の構成要素とともに、またはそれら無しで、使用され得る
。他のアジュバントは、水中油型エマルションであり、それには、（ａ）Ｍｏｄｅｌ １
１０Ｙマイクロフルダイザー（ｍｉｃｒｏｆｕｉｄｉｚｅｒ）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉ
ｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ Ｍａｓｓ．）などのマイクロフルダイザーを使用してサブミクロン
粒子に製剤化された、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ
８５を含むＭＦ５９（Ｖａｎ Ｎｅｓｔらに対するＷＯ９０／１４８３７（その全体が参
照により援用される））（必要に応じて様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含む）、（ｂ）サブミ
クロンエマルションに顕微溶液化されたかまたはより大きな粒径のエマルションを生成す
るためにボルテックスされた、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロ
ニックブロック（ｂｌｏｅｋｅｄ）ポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ
、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリルリ
ピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）か
らなる群からの１つもしくは複数の細菌の細胞壁の構成要素、例えば、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（
Ｄｅｔｏｘ．ＴＭ．）を含む、Ｒｉｂｉ．ＴＭ．アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉ
ｂｉ ＩｎｕｎｏＣｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）が含まれる。いくつかの実
施形態において、アジュバントは、サポニン（例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（ＱＳ
２１，Ａｑｕｉｌａ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．）またはそれから生成された粒子
、例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫賦活性複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸである。他のア
ジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全ア
ジュバント（ＩＦＡ）、サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２
およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）および腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ）が挙げられる。
あるいは、タウペプチドおよびそれらの免疫原性アナログは、アジュバントに結合され
得る。例えば、リポペプチドバージョンのタウペプチド「Ａ」は、Ｂ型肝炎抗原のワクチ
ン接種について記載されているように（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
５９，１３８３−１３９２（１９９７））、パルミチン酸または他の脂質を、「Ａ」のＮ
末端に直接結合することによって調製され得る。しかしながら、そのような結合は、それ
に対する免疫応答の性質に影響するようなタウペプチド「Ａ」のコンフォーメーションを
実質的に変化させるべきでない。
アジュバントは、単一組成物として免疫原とともに投与され得るか、または免疫原の投
与の前、その投与と同時、もしくはその投与の後に投与され得る。免疫原およびアジュバ
ントは、同じバイアルに包装されて供給され得るか、または別個のバイアルに包装されて
使用前に混合され得る。免疫原およびアジュバントは、代表的には、意図される治療用途
を示す表示とともに包装される。免疫原およびアジュバントが、別個に包装される場合、
その包装は、代表的には、使用前に混合するための指示書を含む。アジュバントおよび／
またはキャリアの選択は、アジュバントを含む免疫原性製剤の安定性、投与経路、投薬ス
ケジュール、ワクチン接種される種に対するそのアジュバントの有効性に依存し、ヒトに
おいては、薬学的に許容され得るアジュバントは、承認されているか、または妥当な規制
機関によってヒトへの投与について承認可能であるアジュバントである。例えば、フロイ
ント完全アジュバントは、ヒトへの投与に適していない。しかしながら、ミョウバン、Ｍ
ＰＬまたはフロイント不完全アジュバント（Ｃｈａｎｇら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２：１７３−１８６（１９９８）（その全体が
参照により本明細書に援用される）は、単独でまたは必要に応じてミョウバン、ＱＳ２１
およびＭＰＬのいずれかならびにそれらのすべての組み合わせと組み合わせて、ヒトへの
投与に適している。
薬学的組成物は、ゆっくり代謝される大きな高分子（例えば、タンパク質、キトサンの
ような多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および共重合体（例えば、ラテックス官能化
セファロース、アガロース、セルロースなど））、アミノ酸の重合体、アミノ酸の共重合
体および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）も含み得る。さらに、これらのキ
ャリアは、免疫賦活剤（すなわち、アジュバント）としても機能し得る。
併用
本発明は、本明細書中に記載される抗体およびペプチドを、ＡＤおよび関連タウオパチ
ーのための他の処置と組み合わせる組成物および処置方法を提供する。例えば、現在、タ
ウに関連する治療ストラテジーは、主に、タウキナーゼを阻害するかもしくはホスファタ
ーゼを活性化する薬物（Ｉｑｂａｌ ａｎｄ Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌ，２００４，
２００５，２００７；Ｎｏｂｌｅら、２００５）、微小管を安定化する薬物（Ｚｈａｎｇ
ら、２００５）、ミスフォールドされたタウタンパク質のタンパク分解性の分解を促す薬
物（Ｄｉｃｋｅｙら、２００５；Ｄｉｃｋｅｙ ａｎｄ Ｐｅｔｒｕｃｅｌｌｉ，２００
６；Ｄｉｃｋｅｙら、２００６）、タウ凝集を妨げるかもしくは逆転させる化合物（Ｗｉ
ｓｃｈｉｋら、１９９６；Ｐｉｃｋｈａｒｄｔら、２００５；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、２
００５；Ｎｅｃｕｌａら、２００５；Ｌａｒｂｉｇら、２００７）または凝集したタウの
ワクチン媒介性のクリアランス（Ａｓｕｎｉら、２００７）に焦点が当てられている。ゆ
えに、本発明は、多重標的化（例えば、タウとベータ−アミロイドの両方の標的化）が、
処置の効率を実質的に高め得ることを提供する。
病理学的な可溶性タウおよび不溶性タウ（タウ沈着物）が脳に存在するアルツハイマー
病および関連タウオパチーの場合、本発明の物質は、本発明の物質の血液脳関門を越えた
通過を増加させる他の物質とともに投与され得る。
投与方法
タウのレベルを低下させるためまたは本明細書中に記載される予防、処置もしくは診断
の任意の方法（インビボ）のための、免疫応答（受動または能動）を誘導するための物質
は、予防的および／または治療的な処置のために、非経口、局所的、皮内、静脈内、経口
、皮下、腹腔内、鼻腔内または筋肉内の手段によって投与され得る。代表的な投与経路は
、皮下であるが、その他のものも等しく有効であり得る。別の代表的な経路は、筋肉内注
射である。このタイプの注射は、最も代表的には、腕または脚の筋肉において行われる。
静脈内注射、ならびに腹腔内注射、動脈内、頭蓋内または皮内注射もまた、免疫応答を生
じさせる際に有効である。いくつかの方法では、沈着物が蓄積している特定の組織に物質
が直接注射される。
点鼻製剤などのエアロゾル製剤は、保存剤および等張剤とともに活性な物質の精製され
た水溶液または他の溶液を含む。そのような製剤は、例えば、鼻の粘膜と適合性のｐＨお
よび等張状態に調整される。直腸または膣への投与用の製剤は、好適なキャリアを用いて
坐剤としてもたらされ得る。
非経口投与の場合、本発明の治療用ペプチドは、滅菌された液体（例えば、水、油、食
塩水、グリセロールまたはエタノール）であり得る薬学的キャリアとともに、生理的に許
容され得る希釈剤中の注射可能な投与量の上記物質の溶液または懸濁液として、投与され
得る。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性物質、ｐＨ緩衝物質な
ど）が組成物中に存在し得る。薬学的組成物の他の構成要素は、石油、動物、植物または
合成起源の構成要素である。落花生油、ダイズ油および鉱油はすべて、有用な材料の例で
ある。一般に、グリコール（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコー
ル）は、特に、注射可能な溶液にとって好ましい液体キャリアである。本発明の物質は、
活性成分の徐放を可能にするような様式で製剤化され得る蓄積注射または埋没調製物の形
態でも投与され得る。例示的な組成物は、ＨＣｌでｐＨ６．０に調整された、５０ｍＭ
Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌからなる水性緩衝液中に製剤化されたモノクロー
ナル抗体を５ｍｇ／ｍＬで含む。
非経口投与用の調製物には、滅菌された水性または非水性の溶液、懸濁液およびエマル
ションが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール
、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルであ
る。水性キャリアには、食塩水および緩衝媒質を含む、水、アルコール溶液／水溶液、エ
マルションまたは懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲ
ルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または固定
油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補給剤、電解質補給剤（例えば、リ
ンゲルデキストロースに基づく補給剤）などが含まれる。保存剤および他の添加物、例え
ば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどもまた、存在し得る。
代表的には、組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかとしての注射可能物として
調製され；注射前の液体ビヒクルにおける溶解または懸濁に適した固体の形態もまた調製
され得る。その調製物は、乳化され得るか、またはリポソームもしくはマイクロ粒子（例
えば、上で論じたような、アジュバント効果の増強のためのポリラクチド、ポリグリコリ
ドまたは共重合体）に被包され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，１５２７
（１９９０）およびＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅ
ｖｉｅｗｓ ２８，９７−１１９（１９９７）を参照のこと）。本発明の物質は、活性成
分の徐放もしくはパルス放出を可能にするような様式で製剤化され得る蓄積注射または埋
没調製物の形態で投与され得る。
他の投与様式に適したさらなる製剤としては、経口製剤、鼻腔内製剤および肺製剤、坐
剤ならびに経皮適用物が挙げられる。
坐剤の場合、結合剤およびキャリアとしては、例えば、ポリアルキレングリコールまた
はトリグリセリドが挙げられ；そのような坐剤は、０．５％〜１０％、例えば、１％〜２
％の範囲で活性成分を含む混合物から形成され得る。経口製剤は、賦形剤（例えば、薬学
的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカ
リンナトリウム、セルロースおよび炭酸マグネシウム）を含む。これらの組成物は、溶液
、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤または散剤の形態をとり、１０％〜９５％、
例えば、２５％〜７０％の活性成分を含む。
局所的適用は、経皮または皮内送達をもたらし得る。局所的投与は、上記物質と、コレ
ラ毒素またはそれらの解毒された誘導体もしくはサブユニットあるいは他の類似の細菌毒
素との同時投与によって促進され得る（Ｇｌｅｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８５１（
１９９８）を参照のこと）。同時投与は、その構成要素を、混合物として、または化学的
架橋もしくは融合タンパク質としての発現によって得られる連結された分子として使用す
ることによって達成され得る。
あるいは、経皮送達は、皮膚パッチを使用してまたはトランスファーソーム（ｔｒａｎ
ｓｆｅｒｏｓｏｍｅｓ）を使用して達成され得る（Ｐａｕｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．２５，３５２１−２４（１９９５）；Ｃｅｖｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ １３６８，２０１−１５（１９９８））。主題の抗体、ペプチドまたは化
合物の皮下投与は、標準的な方法およびデバイス、例えば、針および注射器、皮下注射口
送達系などを使用して達成される。筋肉内投与は、標準的な手段、例えば、針および注射
器、持続的送達系などによって達成される。いくつかの実施形態において、主題の抗体、
ペプチドおよび／または化合物は、持続的送達系によって送達される。用語「持続的送達
系」は、本明細書中において、「制御送達系」と交換可能に使用され、カテーテル、注射
デバイスなどと組み合わせた持続的（例えば、制御）送達医療用デバイス（例えば、ポン
プ）を包含する（多種多様のそれらが当該分野で公知である）。機械的または電気機械的
な注入ポンプもまた、本発明とともに使用するのに適し得る。そのようなデバイスの例と
しては、例えば、米国特許第４，６９２，１４７号；同第４，３６０，０１９号；同第４
，４８７，６０３号；同第４，３６０，０１９号；同第４，７２５，８５２号；同第５，
８２０，５８９号；同第５，６４３，２０７号；同第６，１９８，９６６号；などに記載
されているものが挙げられる。通常、薬物送達の現在の方法は、種々の詰め替え可能なポ
ンプシステムのいずれかを使用して達成され得る。ポンプは、一貫した放出制御を長い時
間をかけて提供する。
上記物質は、薬物を投与するために頭蓋に小さな穴を開けるという現在の標準的な手順
によっても投与され得る。好ましい態様において、本発明の結合分子、特に抗体または抗
体ベースの薬物は、血液脳関門を通過することができ、それにより、静脈内または経口投
与が可能である。
薬学的剤形において、上記物質（本発明によって提供される抗体、ペプチド、化合物）
はまた、それらの薬学的に許容され得る塩の形態で投与され得るか、または単独で、もし
くは他の薬学的に活性な化合物との適切な会合において、ならびに他の薬学的に活性な化
合物と組み合わせて、使用され得る。本明細書中に記載される方法および賦形剤は、単に
例示的であって、決して限定でない。主題の抗体、ペプチドまたは化合物は、それらを水
性溶媒または非水性溶媒（例えば、植物油または他の類似の油、合成脂肪族系酸グリセリ
ド、高次脂肪族系酸のエステルまたはプロピレングリコール）に；および所望であれば、
従来の添加物（例えば、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤および保存剤）とと
もに、溶解するか、懸濁するか、または乳化することによって、注射用の調製物に製剤化
され得る。注射用または静脈内投与用の単位剤形は、滅菌水、通常の食塩水または別の薬
学的に許容され得るキャリアにおける溶液としての組成物中に活性な物質を含み得る。用
語「単位剤形」または「用量」は、本明細書中で使用されるとき、ヒトおよび動物被験体
に対する単位投与量として適した物理的に別々の単位のことを指し、各単位は、薬学的に
許容され得る希釈剤、キャリアまたはビヒクルとともに所望の効果をもたらすのに十分な
量と計算された所定の量の主題の抗体を含む。本発明の単位剤形に対する詳述は、使用さ
れる特定の化合物および達成される効果ならびに宿主における各化合物に関連する薬力学
に依存する。
病理学的タウタンパク質およびタウ沈着物に対する免疫応答は、治療用タウペプチドを
コードする核酸の投与によっても誘導され得る。そのような核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ
であり得る。免疫原をコードする核酸セグメントは、患者の意図される標的細胞内でのそ
のようなＤＮＡセグメントの発現を可能にする調節エレメント（例えば、プロモーターお
よびエンハンサー）に連結される。通常、免疫グロブリン遺伝子（軽鎖または重鎖）由来
のプロモーターおよびエンハンサーエレメントまたはＣＭＶ主要中間初期（ｍａｊｏｒ
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）プロモーターおよびエンハンサーが、免疫応答
の誘導にとって望ましい標的である血液細胞内での発現を指示するのに適している。連結
された調節エレメントおよびコード配列は、ベクターにクローニングされることが多い。
レトロウイルス系（例えば、Ｌａｗｒｉｅら、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ
ｅｌｏｐ．３：１０２−１０９（１９９３）（その全体が参照により本明細書に援用され
る）を参照のこと）；アデノウイルスベクター（Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５
９１１（１９９３）（その全体が参照により本明細書に援用される））；アデノ随伴ウイ
ルスベクター（Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７（１９９４）（その
全体が参照により本明細書に援用される））、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウ
イルスを含むポックスファミリー由来のウイルスベクター、アルファウイルス属由来のウ
イルスベクター（例えば、シンドビスおよびセムリキ森林ウイルス由来のベクター）（Ｄ
ｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０：５０８−５１９（１９９６）（その全体が参
照により本明細書に援用される））、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら
に対する米国特許第５，６４３，５７６号（その全体が参照により本明細書に援用される
）を参照のこと）およびラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス（Ｒｏｓｅに対
するＷＯ９６／３４６２５（その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと
）およびパピローマウイルス（Ｏｈｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：
３２５−３３３（１９９５）；Ｗｏｏらに対するＷＯ９４／１２６２９；およびＸｉａｏ
＆ Ｂｒａｎｄｓｍａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２４：２６３０−２６
２２（１９９６）（それらの全体が参照により本明細書に援用される）を含むいくつかの
ウイルスベクター系が、利用可能である。
免疫原をコードするＤＮＡまたはそれを含むベクターは、リポソームに詰め込まれ得る
。好適な脂質および関連アナログは、米国特許第５，２０８，０３６号、同第５，２６４
，６１８号、同第５，２７９，８３３号および同第５，２８３，１８５号によって記載さ
れている。免疫原をコードするベクターおよびＤＮＡはまた、粒状キャリアに吸着され得
るか、またはそれに会合され得る（それらの例としては、ポリメタクリル酸メチルポリマ
ーおよびポリラクチドおよびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が挙げられ、例えば、
ＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏ Ｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと）。
遺伝子治療ベクターまたは裸のＤＮＡが、個々の患者への投与によって、代表的には、
全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、経鼻、胃、皮内、筋肉内、皮下または頭蓋内注入）
または局所的適用（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと）によって、
インビボにおいて送達され得る。ＤＮＡは、遺伝子銃を使用しても投与され得る（米国特
許第６，４３６，７０９号を参照のこと）。本願において、免疫原をコードするＤＮＡは
、微視的金属ビーズの表面上に沈殿される。衝撃波または膨張ヘリウムガスを用いて微小
発射体（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を加速させ、数細胞層の深さまで組織に透通
させる（Ｈａｙｎｅｓら、１９９６に概説されている）。例えば、Ａｇａｃｅｔｕｓ，Ｉ
ｎｃ．（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）によって製造されたＡｃｃｅｌ（商標）Ｇｅｎｅ
Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＤｅｖｉｃｅまたはＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって製造されたＨｅｌｉｏｓ Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ
が好適である。治療目的の場合、ＤＮＡは、エレクトロポレーション（例えば、Ｔｒｏｌ
ｌｅｔら、２００８およびその中の参考文献に記載されているような）によっても送達さ
れ得る。あるいは、裸のＤＮＡは、単純に、化学的もしくは機械的刺激とともにそのＤＮ
Ａを皮膚上に配置することによって（ＷＯ９５／０５８５３を参照のこと）または入れ墨
をすることによって（例えば、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、２００９によって記載され
ているように）、皮膚を通過して血流に達し得る。
異なるバリエーションでは、免疫原をコードするＤＮＡまたはベクターを細胞（例えば
、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検材料）また
は万能なドナー造血幹細胞）にエキソビボで送達し、それに続いて、例えば、免疫原の発
現を確認した後および通常、ベクターを組み込んだ細胞について選択した後に、その細胞
を患者に再移植し得る。
ヒトを処置するための別の有望であるが潜在的により危険なアプローチは、抗原自体を
産生するように樹状（ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ）細胞（ＤＣ，直接のＤＮＡ送達を介して、ま
たはウイルスストラテジーを使用して）をトランスフェクトすることであり（Ｘｉｎｇら
、２００５）、それにより、ＭＨＣ Ｉを通じて提示されるインタクトな抗原の連続した
供給が提供される。
処置の対象となる被験体
処置の対象となる被験体には、アルツハイマー病または関連タウオパチーのリスクがあ
るが症状を示していない個体、ならびにすでに症状を示している患者が含まれる。アルツ
ハイマー病の場合、長生きする場合、実質的に誰もがアルツハイマー病に罹患するリスク
がある。ゆえに、本処置または治療は、被験体患者のリスクのいかなる評価もなしに、一
般集団に予防的にも投与され得る。本特許においてもたらされるワクチンは、アルツハイ
マー病の公知の遺伝的リスクを有する個体に対して特に有用であり得る。そのような個体
には、この疾患に罹患した親類を有する個体および遺伝的または生化学的マーカーの存在
によってリスクを判定された個体が含まれる。早期発症型の家族性アルツハイマー病のリ
スクの遺伝的マーカーには、ＡＰＰ遺伝子、プレセニリン遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２にお
ける変異が含まれ、遅発型アルツハイマー病に対するマーカーには、ＡｐｏＥ４遺伝子に
おける変異が含まれる（最近、Ｂｅｒｔｒａｍ ａｎｄ Ｔａｎｚｉ，２００８によって
概説された）。さらなる危険因子には、ＡＤの家族歴、高コレステロール血症またはアテ
ローム性動脈硬化症が含まれる。現在アルツハイマー病に罹患している個体は、特徴的な
痴呆ならびに上に記載された危険因子の存在から認識され得る。さらに、ＡＤを有する個
体を識別するためのいくつかの診断テストが利用可能である。これらには、ＣＳＦ中の総
タウ、ホスホ−タウおよびアミロイドβ（１−４２）のレベルの測定が含まれる。上昇し
たタウおよび／またはホスホ−タウのレベルならびに減少したアミロイドβ（１−４２）
のレベルは、ＡＤの存在を示唆する。アルツハイマー病に罹患している個体は、ＭＭＳＥ
、ＡＤＲＤＡまたは他の基準によっても診断され得る。
無症候の患者では、任意の年齢において処置を開始することができる（例えば、１０、
２０、３０歳）。しかしながら、患者が４０、５０、６０または７０歳に達するまで処置
を開始する必要がないかもしれない。処置は、ある期間にわたって複数の投薬量の投薬を
必要とし得る。処置は、治療薬（例えば、タウペプチド）に対する抗体または活性化Ｔ細
胞もしくはＢ細胞の応答を経時的にアッセイすることによって、モニターされ得る。その
応答が低下したら、追加免疫の投与の必要が示される。ＡＤまたは関連タウオパチーのリ
スクがより高い潜在的なダウン症候群患者の場合、母体に治療薬を投与することによって
出生前にまたは生後まもなく処置を開始することができる。
いくつかの実施形態において、ＤＣ８Ｅ８（またはキメラ、ヒト化、ヒトまたはその他
の誘導体／一部／フラグメント）は、Ｔ細胞上の共刺激分子ＣＤ２８のレベルの有意な低
下を示す高齢の免疫老化アルツハイマー病（ＡＤ）患者における使用が意図された抗体ま
たは受動ワクチンである。共刺激分子ＣＤ２８の減少は、損なわれた免疫応答を示唆する
（Ｓａｕｒｗｅｉｎ−Ｔｅｉｓｓｌら、２００２）。ＣＤ４５ＲＡ＋であることが多いＣ
Ｄ８＋ＣＤ２８−Ｔ細胞クローン（免疫表現型：ＣＤ８＋ＣＤ２８−ＣＤ４５ＲＡ＋）は
、大量の炎症性サイトカインＩＦＮ−γおよびわずかな量のＩＬ−５を産生する。これら
のクローンは、正常な加齢の間は蓄積し、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカインの産生の不均
衡を誘導する。したがって、ナイーブＢ細胞の減少する集団とともに蓄積するＣＤ８＋Ｃ
Ｄ２８−ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞クローン（Ｓｉｅｇｒｉｓｔ ａｎｄ Ａｓｐｉｎａｌｌ
，２００９）は、高齢者人口の約３分の１に影響する免疫機能の低下に対する主要な寄与
物質である（Ｗｅｎｇら、２００９，Ｓａｕｒｗｅｉｎ−Ｔｅｉｓｓｌら、２００２）。
したがって、受動免疫療法（例えば、ＤＣ８Ｅ８（またはキメラ、ヒト化、ヒトもしく
はその他の誘導体／一部／フラグメントを用いたもの）は、大集団のＡＤ患者の免疫系の
不全を回避する手段および神経原線維変性を引き起こす病理学的タウタンパク質を標的化
する手段を提供する。
いくつかの実施形態において、タウ治療用エピトープの１つ（または本明細書中に記載
されるタウ治療用エピトープの１つを含むペプチド）が、高齢の免疫適格性のアルツハイ
マー病患者における使用が意図された能動ワクチンとして使用される。免疫適格性患者の
免疫表現型は、ＣＤ８＋ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＡ＋である。ゆえに、ＣＤ８＋Ｔ細胞上の
共刺激分子ＣＤ２８のレベルが測定され、能動ワクチン接種のための患者の選択マーカー
として使用される。
さらに、処置の前に、患者から採取されたＣＳＦおよび血液を、ボレリア属、トレポネ
ーマ属、クラミジア属、ヘルペスウイルスおよび他の脳病原体に対する抗体について試験
することにより、ＡＤの症状を模倣し得るかまたは悪化させ得る慢性の感染性および炎症
性のＣＮＳ障害を有する個体が除外されるだろう（Ｂａｌｉｎら、２００８；Ｉｔｚｈａ
ｋｉ ａｎｄ Ｗｏｚｎｉａｋ，２００８；Ｍｉｋｌｏｓｓｙ，２００８；Ａｎｄｒｅａ
ｓｅｎ，２０１０）。ＣＮＳ感染症、特に、脳内皮細胞のクラミジア属感染は、血液脳関
門（ＢＢＢ）の機能を損なうことが多く、それにより、脳実質への単球の流入が増加し得
、ゆえに、局所的な免疫応答に影響し得る（Ｂａｌｉｎら、２００８）。サイトメガロウ
イルス（ＣＭＶ）に対するより高いレベルのＩｇＧを有する高齢の被験体が、より速い速
度の認知低下に苦しむことも示されている（Ｉｔｚｈａｋｉ ａｎｄ Ｗｏｚｎｉａｋ，
２００８）。ゆえに、本発明によって提供される物質の１つによる免疫の後の有害作用（
例えば、正常タウに対する制御されない免疫反応）を防ぐために、ＣＮＳ感染症を有する
アルツハイマー病患者または上述の病原体に対する抗体について陽性と試験された患者は
、高度に選択的なワクチンで処置されることになる。
処置の前に、患者から採取されたＣＳＦおよび血液を、ボレリア属、トレポネーマ属、
クラミジア属、ヘルペスウイルスおよび他の脳病原体に対する抗体について試験すること
により、ＡＤの症状を模倣し得るかまたは悪化させ得る慢性の感染性および炎症性のＣＮ
Ｓ障害を有する個体が除外され得る（Ｂａｌｉｎら、２００８；Ｉｔｚｈａｋｉ ａｎｄ
Ｗｏｚｎｉａｋ，２００８；Ｍｉｋｌｏｓｓｙ，２００８；Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，２０
１０）。様々な慢性感染症によって促進される可能性のある有害作用を防ぐために、この
群の患者は、より選択的な、抗体または治療用エピトープを含むワクチンで処置されるこ
とになる。場合によっては、能動ワクチンは、病理学的タウタンパク質上の治療用エピト
ープを標的化する厳密に選択的な抗体の産生を誘導するデザイナーエピトープである（例
えば、実施例を参照のこと）。いくつかの実施形態において、そのワクチンは、正常／生
理学的タウタンパク質と共有されるいかなるアミノ酸配列も含まない。
処置レジメン
予防的な適用において、薬学的組成物または医薬は、特定の疾患に感受性であるかまた
は別途そのリスクがある患者に、その疾患を排除するまたはその疾患のリスクを低下させ
るまたはその疾患の発生を遅延させるのに十分な量で投与される。治療的な適用において
、組成物または医薬は、そのような疾患に罹患していると疑われる患者またはすでに罹患
している患者に、その疾患およびその合併症を治癒するまたはそれらの症状を少なくとも
部分的に停止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適した量は、治療有効
量または薬剤的有効量と定義される。予防的レジメンと治療的レジメンの両方において、
物質は通常、十分な免疫応答が達成されるまで、数回において投与される。代表的には、
免疫応答をモニターし、その免疫応答が衰弱し始めたら、反復投与を行う。
上に記載された状態の処置のための本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、
患者の生理学的状態、患者がヒトであるかまたは動物であるか、投与される他の薬剤、お
よび処置が予防的であるかまたは治療的であるかをはじめとした多くの因子に応じて変動
する。通常、患者は、ヒトである。安全性および有効性を最適化するために、処置投与量
は滴定される必要がある。したがって、抗体またはタウ結合タンパク質による処置は、代
表的には、ある期間にわたる複数の投薬量の投与を必要とし得る。抗体による受動免疫の
場合、投与量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、０．０１〜５ｍ
ｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。いくつかの適用において、抗体またはタウ結合タンパク
質の量は、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ体重の投与量、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ体重
、１ｍｇ／ｋｇ体重の投与量、または０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量の任意の組み
合わせで投与され得る。いくつかの方法において、抗体またはタウ結合タンパク質は、少
なくとも１ヶ月間、少なくとも３ヶ月間または少なくとも６ヶ月間の期間にわたる複数の
投薬量の投与（同じものまたは異なるもの）において投与され得る。任意の１つの処置期
間にわたる投与の総数は、例えば、４〜６回であり得るが、上で論じられた因子に応じて
他の回数も使用できる。処置は、下でさらに記載される任意の方法によってモニターされ
得る。
免疫原の量は、アジュバントも投与されるか否かに依存し、アジュバントの非存在下で
は、より多い投与量が必要とされる。投与するための免疫原の量は、時折、ヒトへの投与
の場合、患者１人あたり１μｇ〜５００μｇ、より一般的には、注射１回あたり５〜５０
０μｇで変動する。ときとして、注射１回あたり１〜２ｍｇというより多い用量が使用さ
れる。代表的には、約１０、２０、５０または１００μｇが、各ヒト注射のために使用さ
れる。注射のタイミングは、１日に１回から１年に１回まで、１０年に１回まで、著しく
変動し得る。ある投与量の免疫原が与えられる任意の所与の日において、その投与量は、
アジュバントも投与される場合、１μｇ／患者より多く、通常、１０μｇ／患者より多く
、アジュバントの非存在下では、１０μｇ／患者より多く、通常、１００μｇ／患者より
多い。代表的なレジメンは、免疫の後の、６回の毎週の間隔での追加免疫注射からなる。
別のレジメンは、免疫の後の、１、２および１２ヶ月間後の追加免疫注射からなる。別の
レジメンは、死ぬまで２ヶ月ごとの注射を必要とする。あるいは、追加免疫注射は、免疫
応答をモニターすることによって示されるとき、不規則に行われ得る。いくつかの実施形
態において、能動ワクチンは、アジュバントとして、好適なキャリア、優先的にはＫＬＨ
および水酸化アルミニウムとともに製剤化され得る。優先的には、１００μｇのペプチド
／回／患者（しかし、１μｇ、１０μｇ １００μｇおよび１ｍｇも前臨床段階では適用
され得、第Ｉ相毒性研究では１０μｇ １００μｇ ２００μｇも適用され得る）が、４
週間に１回、合計で５回適用され得る。
免疫原をコードする核酸に対する用量は、患者１人あたり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎ
ｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇまたは３０〜３００μｇのＤＮＡの範囲である。感染
性ウイルスベクターに対する用量は、１投薬あたり１０〜１０９またはそれ以上のビリオ
ンで変動する。処置は、治療薬に対する抗体または活性化Ｔ細胞もしくはＢ細胞応答を経
時的にアッセイすることによってモニターされ得る。その応答が低下する場合、追加免疫
の投与の必要が示され得る。
最終的には、投与レジメンは、主治医および臨床上の因子によって決定されることにな
る。医学分野において公知であるように、任意の１人の患者に対する投与量は、患者のサ
イズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全般的
な健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物をはじめとした多くの因子に依存する。
代表的な用量は、例えば、０．００１〜１０００ｍｇの範囲内であり得るが；しかしなが
ら、特に、上述の因子を考慮して、この例示的な範囲よりも低いまたは高い用量も考えら
れる。一般に、薬学的組成物の規則的な投与としてのレジメンは、１ｍｇ〜１０ｍｇの単
位／日の範囲内であるべきである。レジメンが持続注入である場合、それは、それぞれ１
ｍｇ〜１０ｍｇ／１キログラム体重／分の範囲内でもあるべきである。定期的な評価によ
って進捗がモニターされ得る。
さらに、他の物質の同時投与または連続投与が望ましい場合がある。いくつかの実施形
態において、治療的に有効な用量または量とは、症状または状態を回復させるのに十分な
活性成分の量のことを指す。そのような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養物また
は実験動物において標準的な薬学的手順によって測定され得る（例えば、ＥＤ５０（集団
の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性の
用量））。治療効果と毒性効果との用量比は、治療指数であり、それは、ＬＤ５０／ＥＤ
５０比として表現され得る。いくつかの実施形態において、組成物中の治療薬は、アルツ
ハイマー病および関連タウオパチーの場合、正常な行動特性および／または認知特性を回
復させるのに十分な量で存在する。
本発明は、本発明によって提供される任意の物質による処置の有効性の評価のために信
頼され得る種々の基準を提供する。例としては、１つもしくは複数の病理学的タウ形態の
レベルの低下（例えば、脳内）、脳および／またはＣＳＦからの病理学的タウのクリアラ
ンスの増加；認知能力の尺度の改善（例えば、認知機能（例えば、臨床認知症評価法（Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ）−ＣＤＲ、アルツハイマー病評価ス
ケール−認知サブスケール−ＡＤＡＳ−Ｃｏｇミニメンタルステート検査−ＭＭＳＥによ
って検査される）；運動機能検査（例えば、握力検査、タイムアップアンドゴー（Ｔｉｍ
ｅｄ Ｕｐ ＆ Ｇｏ）（ＴＵＧ）検査、ＴＵＧマニュアル、歩きながらの会話の検査（
Ｔａｌｋｉｎｇ ｗｈｉｌｅ Ｗａｌｋｉｎｇ ｔｅｓｔ）、パーキンソン病統一スケー
ル−ＵＰＤＲＳ）の改善；基本的な日常生活動作（ＡＤＬ）検査の成績の改善（例えば、
衛生、更衣動作、節制、摂食、食事の支度、電話、遠出、会計および対応）；痴呆におけ
る障害評価試験（Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｅｍｅｎｔｉ
ａ ｔｅｓｔｓ）；ならびにＡＤによって損なわれた握力、歩行運動および失行（下記の
実施例において記載される動物モデルおよびアッセイとの直接的な相関関係を有する）、
記憶力低下、失語、失認、時間および空間の失見当識、ならびに抑うつの重症度／格付け
の降格が挙げられるが、これらに限定されない。
処置の有効性を評価する目的で、タウのレベルおよび分布（脳内および体液中）が、本
明細書中に記載される任意の方法および／またはタウを検出するために利用可能な他の任
意の方法によってアッセイされ得る。例えば、タウのレベルは、インビトロ、エキソビボ
（組織切片）およびインビボ（トランスジェニックマウス）において選択的にタウおよび
タウ病理に結合する新規イメージング放射性トレーサー１８Ｆ−ＴＨＫ５２３を使用して
インビボで測定され得る（ポジトロン放出断層撮影法）（Ｆｏｄｅｒｏ−Ｔａｖｏｌｅｔ
ｔｉら、２０１１，Ｂｒａｉｎ）。タウは、総タウまたはホスホ−タウのいずれかを認識
するＥＬＩＳＡキットを使用して、脳脊髄液および血液においても同様に同定され得る。
実際に、トランスジェニックラットにおける神経行動障害は、アルツハイマー病患者に
おける運動障害と似ており、それは、本明細書中に提供される任意の治療薬（能動ワクチ
ン接種のための物質を含むがこれに限定されない）を用いた臨床試験および処置プロトコ
ルに対して意義がある。ヒトにおいて、アルツハイマー病は、臨床的には、進行性の記憶
障害および認知低下、行動変化および心理学的症状（気分の撹乱、情動、食欲、覚醒睡眠
サイクル、錯乱、激越および抑うつ）ならびに損なわれた運動機能（失行、ミオクローヌ
ス、歩行障害、筋力低下、錐体外路の特徴、例えば、運動緩徐、硬直および静止時振戦）
を特徴とする（Ｇｏｌｄｍａｎら、１９９９；Ｂｏｙｌｅら、２００９）。多くの研究が
、アルツハイマー病（ＡＤ）では運動徴候がよく観察され、疾患が進行するにつれてその
徴候が顕著になることを報告している（Ｇｏｌｄｍａｎら、１９９９；Ｗｉｌｓｏｎら、
２００３；Ｌｏｕｉｓら、２００４；Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎら、２００５；Ｓｃａｒｍｅ
ａｓら、２００４；Ｓｃａｒｍｅａｓら、２００５；Ｗａｉｔｅら、２００５；Ａｌｆａ
ｒｏ−Ａｃｈａら、２００６；Ｗａｎｇら、２００６；Ｂｕｃｈｍａｎら、２００７ａ；
Ｂｏｙｌｅら、２００９）。とりわけ、運動徴候は、認知障害より先に起き得、アルツハ
イマー病における認知および機能の低下、施設への収容（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌｉ
ｚａｔｉｏｎ）および死亡率を予測し得る（Ｍｏｒｒｉｓら、１９８９；Ｓｏｉｎｉｎｅ
ｎら、１９９２；Ｋｒａｅｍｅｒら、１９９４；Ｃｈｕｉら、１９９４；Ｓｃａｒｍｅａ
ｓら、２００４；Ｓｃａｒｍｅａｓら、２００５）。筋力の低下は、認知障害の発症より
先に起きることが示されている（Ｂｕｃｈｍａｎら、２００７ｂ；Ｂｏｙｌｅら、２００
９）。
ＡＤにおける運動徴候の発症は、脳幹における神経変性および神経細胞脱落に関連して
いる（Ｚａｒｏｗら、２００３；Ｂｕｒｎｓら、２００５；Ｇｒｕｄｚｉｅｎら、２００
７；Ｓｉｍｉｃら、２００９；Ｗａｉら、２００９；Ｂｒａａｋ ａｎｄ ＤｅｌＴｒｅ
ｄｉｃｉ，２０１１）。さらに、いくつかの研究は、神経原線維変性が、脳幹に由来し、
皮質の神経変性より先に起きることを示唆した（Ｈｅｒｔｚ，１９８９；Ｓｉｍｉｃら、
２００９；Ｂｒａａｋ ａｎｄ ＤｅｌＴｒｅｄｉｃｉ，２０１１）。
これらの知見は、運動障害が、ＡＤの病原論において重要な特徴であることを示してい
る。さらに、いくつかの運動領域の機能障害は、痴呆より先に起き得、認知低下を予測し
得る。本明細書中に記載されるペプチド（治療用エピトープを含む）による能動免疫療法
は、ヒト病理学的タウを発現するトランスジェニックラットの運動障害を改善し得る。し
たがって、能動免疫療法による脳幹の病理の直接的な標的化は、ヒトＡＤ患者における運
動障害ならびに認知障害を予防し得るか、遅らせ得るか、または遅延させ得る。したがっ
て、運動機能の試験は、本明細書中に記載される物質（例えば、タウクリアランス剤、能
動および受動ワクチン）の臨床的有効性の評価のために使用され得る一連の試験に含まれ
得る。
また、当業者は、病理学的タウ（例えば、皮質／海馬におけるＮＦＴ）のレベルおよび
分布と疾患進行との間の十分に確立した相関関係を承知している。病理学的タウ（ＮＦＴ
病理）の密度は、認知の障害およびアルツハイマー病の重症度と相関している（Ｂｒａａ
ｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒら、１９９５；Ｂｅｒｇら、１９９８
；Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓら、１９９８；Ｇｉａｎｎａｋｏｐｏｕｌｏｓら、１９９８，２
００３）。嗅内皮質および海馬における病理学的タウ（例えば、ＮＦＴ、糸屑状構造物）
は、反対に、記憶の長期的変化に関連する（Ｒｅｉｔｚら、２００９）。同様に、脳幹で
は、病理学的タウ（ＮＦＴ）は、非常に早い段階において背側縫線核に生じ；他方の縫線
核は、その後、影響される。これらの病変は、ＡＤに見られるセロトニン作動性の障害を
説明する（Ｄｕｙｋａｅｒｔｓら、２００９）。錐体外路の症状は、黒質タウ病理と相関
している（Ｌｉｕら、１９９７）。したがって、これらのＡＤ分布パターンの１つもしく
は複数に影響し得る処置剤は、おそらく、ＡＤにおいて有益な効果を有するだろう。
実施例１：組換えヒトタウタンパク質の調製
ヒト完全長タウ（２Ｎ４Ｒ、２Ｎ３Ｒ）およびタウ欠失変異体：タウ組換えタンパク質
（図１および６）をクローンτ４０（Ｇｏｅｄｅｒｔ，１９８９）から生成した（そのク
ローンを発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングし、細菌
において発現させた）。各タウ欠失変異体を、ＤＮＡ配列決定によって確かめた。すべて
のタウ欠失変異体およびタウペプチドは、４４１アミノ酸長であるがゆえにタウ４４１と
も呼ばれる（Ｄ’Ｓｏｕｚａ，２００５）最も長いヒトタウアイソフォーム２Ｎ４Ｒに従
ってナンバリングされる。アイソフォーム２Ｎ３Ｒに由来するタウ欠失変異体およびペプ
チドは、第２の微小管結合リピート（２Ｎ４Ｒのアミノ酸２７５〜３０５）が欠失してい
ることを示唆する「３Ｒ」によって記される。タウタンパク質の生成は、以下の工程を含
んだ：ａ）細菌におけるタウの発現；ｂ）イオン交換クロマトグラフィーによるタウの精
製；ｃ）ゲル濾過によるタウの精製；ｄ）単離されたタウの濃縮および保管；ならびにｅ
）免疫親和性精製（これは、ミクログリア取り込み実験において使用されたタウΔ（１−
１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対してのみ採用される例外であり、実施例１０、図１
７を参照のこと）。
ａ）ヒト完全長タウ（２Ｎ４Ｒまたは２Ｎ３Ｒ）および組換えタウ欠失変異体の細菌発
現：ヒトタウ（上記）発現プラスミドを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）
の産生株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。適切な発現プラスミドを含む細菌細胞を、
ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌによる“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（２００１）に記載されているように培養し
、誘導した。タウタンパク質またはそのフラグメントの発現を駆動するｐＥＴ−１７ｂプ
ラスミドで形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）細菌のシングルコロニーを、１００μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含む５００ｍｌのＬｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ培地中、３００ｒｐｍ、
３７℃において生育し、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ
）を０．４ｍＭの最終濃度まで加えることによって誘導した。３７℃での３時間のさらな
るインキュベーションの後、３，０００×ｇ、４℃における１５分間の遠心分離によって
細菌を回収した。
ｂ）塩基性および中性タウタンパク質（完全長タウアイソフォーム、タウΔ３５８−４
４１、タウΔ３０６−４００、タウΔ４２１−４４１、タウΔ３００−３１２、タウΔ１
３４−１６８、タウΔ１−２２０、タウΔ１−１２６、タウΔ（１−１５０；３９２−４
４１）／４Ｒ、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／３ＲおよびタウΔ（１−２９６
；３９２−４４１）／４Ｒ）の陽イオン交換クロマトグラフィー精製を、本質的に先に記
載されたように（Ｋｒａｊｃｉｏｖａら、２００８）行った。発現後、細菌のペレットを
、１０ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ １，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥ
Ｓ）ｐＨ６．９、５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）、５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１ｍＭフッ化フェニルメチル
スルホニル（ＰＭＳＦ）、５％（ｖ／ｖ）グリセロール）に再懸濁し、液体窒素中で急速
凍結し、タウタンパク質の精製のために使用するまで−８０℃において保管した。タウタ
ンパク質の精製のために、凍結された細菌懸濁液を急速解凍し、氷上に置いた。細菌細胞
壁を、５０％デューティサイクル、５０Ｗ電力出力に設定されたＳｏｎｏｐｕｌｓ ＨＤ
２２００，ｔｉｐ ＴＴ−１３（Ｂａｎｄｅｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用すること
によって、３０秒間作動３０秒間休止を６回行う氷上での超音波処理によって破壊した。
その溶解産物を遠心分離（２１，０００×ｇ、１５分間、４℃）によって浄化し、上清を
０．４５μｍメンブランフィルターで濾過した。組換えタウタンパク質の大規模精製を、
ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣワークステーション（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、６℃において行った。濾過された溶解産物を、溶解緩衝液で
平衡化された５ｍｌ ＨｉＴｒ ａｐ ＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ
，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に３ｍｌ／分の流速で充填し、２８０ｎｍにおけるベ
ースラインが安定するまで、６０ｍｌの溶解緩衝液で徹底的に洗浄した。結合したタウタ
ンパク質を、緩衝液Ｂ（１Ｍ ＮａＣｌが補充された溶解緩衝液）のグラジエント（１５
ｍｌ以内で０〜３０％）によって溶出した。個々の１ｍｌ画分を回収し、ドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって解析した。正
に帯電したタウタンパク質と同時精製する核酸を除去するために、タウタンパク質を含む
画分をプールし、緩衝液Ｂのそれほど急勾配でないグラジエント（４５ｍｌにおける０〜
３０％）とともに５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒ
ｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する第２の陽イオン交換クロマトグラフィー
工程によって精製した。
ｃ）酸性タウタンパク質（タウΔ２２２−４２７、タウΔ２２８−４４１、タウΔ２５
７−４００、タウΔ１３７−４４１、タウΔ２８３−４４１）の陰イオン交換クロマトグ
ラフィー精製を、先に記載されたように（Ｃｓｏｋｏｖａら、２００４）行った。発現後
、細菌のペレットを、１０ｍｌのヒスチジン溶解緩衝液（２０ｍＭヒスチジン，ｐＨ６．
０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦお
よび５％（ｖ／ｖ）グリセロール）に再懸濁した。細菌細胞壁を、５０％デューティサイ
クル、５０Ｗ電力出力に設定されたＳｏｎｏｐｕｌｓ ＨＤ ２２００，ｔｉｐ ＴＴ−
１３（Ｂａｎｄｅｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによって、３０秒間作動３０
秒間休止を６回行う氷上での超音波処理によって破壊した。その溶解産物を遠心分離（２
１，０００×ｇ、１５分間、４℃）によって浄化した。細菌溶解産物を、１％硫酸ストレ
プトマイシン（Ｍｅｄｅｘｐｏｒｔ，Ｒｕｓｓｉａ）によって沈殿させ、氷上で５分間イ
ンキュベートし、遠心分離（２１，０００×ｇ、１５分間、４℃）によって浄化し、０．
４５μｍメンブランフィルターで濾過した。濾過されたストレプトマイシン沈殿溶解産物
を、５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）に３ｍｌ／分の流速で充填し、Ａ２８０ベースラ
インが安定するまで、３０〜５０ｍｌのヒスチジン溶解緩衝液で徹底的に洗浄した。タウ
タンパク質を、ヒスチジン溶解緩衝液における２工程の塩グラジエント（４０ｍｌにおけ
る０．０５〜０．５Ｍ ＮａＣｌの後の、２０ｍｌにおける０．５〜１Ｍ ＮａＣｌ）で
溶出した。
ｄ）精製の最後のゲル濾過工程（すべてのタウタンパク質について同じ）では、イオン
交換クロマトグラフィーによって得られたプールされたタウタンパク質画分を、塩基性／
中性または酸性タウタンパク質に対してそれぞれＰＩＰＥＳまたはヒスチジン溶解緩衝液
（１００ｍＭ ＮａＣｌが補充されたもの）において、３ｍｌ／分でゲル濾過カラム（Ｈ
ｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｒｅｐグレードカラム，ＧＥ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。溶出したタウタンパク質をプールした。
ｅ）ゲル濾過精製後のタウタンパク質の濃縮のために、プールされた画分を、１．５体
積の２．５％グリセロールで希釈し、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（塩基性および中
性タウタンパク質）またはＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（酸性タウタンパク質）に再度
充填した。次いで、濃縮された組換えタウタンパク質を、１Ｍ ＮａＣｌのステップグラ
ジエントを用いてカラムから溶出した。最後に、緩衝液を、５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｄｅ
ｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、アルゴンで飽和され
たリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，８．０９ｍＭリン酸二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、１
．４７ｍＭリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１３６．８９ｍＭ ＮａＣｌ、２．
７ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ））に交換した。精製されたサンプルのタンパク質定量を、
標準物質としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）定
量キット（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）を使用して行った。タウタンパク質を使用アリコート
に等分し、液体窒素中で急凍し、−７０℃において保管した。
ｆ）ミクログリアによるタウ取り込みを測定するために使用される組換えタウΔ（１−
１５０；３９２−４４１）／４Ｒから、存在し得る細菌夾雑物を除去するために（実施例
１０，図１７）、組換えタウタンパク質を以下のとおり、改変された方法によって精製し
た。第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後、タウを含む画分をプールし、撹拌
しながら、１／２０体積の氷冷５％ポリエチレンイミンを加えた。撹拌をさらに３０分間
、氷上で続けた。そのサンプルを２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。上清を回
収し、１００ｍＭ ＮａＣｌが補充されているがＤＴＴまたは他の任意の還元剤を欠くＰ
ＩＰＥＳ溶解緩衝液において、３ｍｌ／分でＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅ
ｘ ２００ｐｒｅｐグレードカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。ゲル濾
過の後、タウタンパク質を含む画分をプールし、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上に
固定化されたＤＣ２５抗体（２Ｎ４Ｒタウのエピトープ３４７−３５３，Ａｘｏｎ Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を含むイムノアフィニティーカ
ラムに充填した（０．５ｍｌ／分の流速で）。そのカラムは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎ）で予め平衡化しておいた。結合の後、そのカラムを５カラム体積のＴＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎで洗浄し、結合したタウタンパク質を０．１Ｍグリシン，ｐＨ２．７で溶出した。回収
された画分を、１／３０体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８を加えることによっ
て中和し、プールした。最後に、ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム，５ｍｌ（Ｇ
Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して緩衝液をＰＢＳ（アルゴンで飽和されたもの）に
交換した。精製されたサンプルのタンパク質定量を、標準物質としてのＢＳＡとともにビ
シンコニン酸（ＢＣＡ）定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）を使用して行った。そのタ
ンパク質を使用アリコートに等分し、液体窒素中で急凍し、−７０℃において保管した。
ＤＣ２５アフィニティーカラム（前出）のために使用された、精製されたＤＣ２５抗体
（Ａｘｏｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を、以下のと
おり調製した。無血清ＤＣ２５ハイブリドーマ培養上清を、０．２体積のＰＢＳを加える
ことによってｐＨ７．５に調整し、２０，０００×ｇ、４℃での１０分間の遠心分離によ
って予め浄化し、上清を０．２μｍフィルターで濾過した。予め浄化されたＤＣ２５ハイ
ブリドーマ培養上清を、ＰＢＳで平衡化されたＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ
カラム（５ｍｌ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に１ｍｌ／分で充填した。充填が完了し
た後、そのカラムを４カラム体積のＰＢＳで洗浄し、結合した抗体を、１００ｍＭグリシ
ンｐＨ２．７を用いて溶出した。溶出した画分を、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９で中
和し、プールし、ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（５ｍｌ，ＧＥ Ｈｅａｌｔ
ｈｃａｒｅ）を使用して緩衝液をＰＢＳに交換した。精製されたＤＣ２５抗体を、小アリ
コートとして−７０℃において保管した。
実施例２：ヒトタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の調製、ＥＬＩＳＡによるモノクローナル抗体のス
クリーニング、およびモノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８の最初の特徴付け
６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に、フロイント完全アジュバント（ＳＩＧＭＡ）中の
５０μｇの組換えタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ（実施例１に記載された
ように調製されたもの）で初回刺激し、フロイント不完全アジュバント中の５０μｇの同
じ抗原を用いて５週間間隔で５回追加免疫した。融合の３日前に、ＰＢＳ中の５０μｇの
同じ抗原をマウスの静脈内に注射した。免疫されたマウスの脾臓細胞を、Ｋｏｎｔｓｅｋ
ｏｖａら（１９８８）の方法に従ってＮＳ／０ミエローマ細胞と融合した。脾細胞（１０
８個）を、１０％ジメチルスルホキシドが補充された無血清ダルベッコ改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ）中の１ｍｌの５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５５０（Ｓｅｒｖ
ａ）において、２×１０７個のＮＳ／０ミエローマ細胞と混合し（５：１比）、１分間融
合させた。融合された細胞を、２０％ウマ血清、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ヒポキサン
チン（０．１ｍＭ）、アミノプテリン（０．０４ｍＭ）、チミジン（０．０１６ｍＭ）お
よびゲンタマイシン（４０Ｕ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭに、９６ウェルプレートにおいて２
．５×１０５脾臓細胞／ウェルの密度で再懸濁した。それらの細胞を、３７℃で１０日間
インキュベートし、成長中のハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
によって抗タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ特異的モノクローナル抗体の産
生についてスクリーニングした。
ＥＬＩＳＡを使用することにより、ハイブリドーマ培養上清中の、タウΔ（１−１５０
；３９２−４４１）／４Ｒ（誤無秩序型のタウ）に対するモノクローナル抗体を検出した
。マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中、３７℃においてタウΔ（１−１５０；３９２
−４４１）／４Ｒ（５μｇ／ｍｌ，５０μｌ／ウェル）で一晩コーティングした。非特異
的結合を減少させるために１％脱脂粉乳でブロッキングした後、プレートをＰＢＳ−０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、５０μｌ／ウェルのハイブリドーマ培養上清とともに３
７℃で１時間インキュベートした。結合したモノクローナル抗体を、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ，ＤＡＫＯ）と結合体化されたヒツジ抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）
を用いて検出した。その反応物を、ペルオキシダーゼ基質としてオルトフェニレンジアミ
ン溶液を用いて発色させ、５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。４９２ｎｍにおけ
る吸光度を、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＭＣＣ／３４０ ＥＬＩＳＡリーダー（Ｌａｂｓｙｓ
ｔｅｍｓ）を使用して測定した。ネガティブコントロール（ＰＢＳ）の吸光度の値の少な
くとも２倍の値を有する読取値を、ポジティブと考えた。ポジティブハイブリドーマ培養
物をさらに、免疫組織化学によって（Ｚｉｌｋａら、２００３の方法に従って）試験し、
Ｋｏｎｔｓｅｋｏｖａら（１９９１）に記載されている手順に従って軟寒天においてサブ
クローン化した。
そのように作製され、選択されたポジティブハイブリドーマ培養物から、モノクローナ
ル抗体ＤＣ８Ｅ８（ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ
ＰＴＡ−１１９９４として２０１１年７月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されたマウスハイブリドーマ細胞系によって産
生されるもの）を同定した。ＤＣ８Ｅ８を、下に記載されるようにさらに特徴付けた。マ
ウスＩｇアイソタイピングキット（ＩＳＯ−２，ＳＩＧＭＡ）を使用するＥＬＩＳＡによ
って、抗体アイソタイプはマウスＩｇＧ１であると判定された。
実施例３：ＤＣ８Ｅ８の可変領域の配列決定およびＣＤＲ移植によるそのヒト化
ａ）ＤＣ８Ｅ８の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸
配列の決定（図３）。ＤＣ８Ｅ８の可変領域のヌクレオチド配列（図３Ａおよび３Ｄ）を
、ＤＣ８Ｅ８モノクローナル抗体を発現するマウスハイブリドーマ細胞系ＰＴＡ−１１９
９４（ＡＴＣＣ）から抽出された全ＲＮＡを使用して合成されたｃＤＮＡのＤＮＡ配列決
定によって決定した。全ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して抽出した。第１鎖（ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ）ｃＤ
ＮＡの合成を、「大容量ｃＤＮＡ逆転写」キットを製造者のプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）に従って使用して行った。２×逆転写マスターミック
ス用の試薬の組成は、以下のとおりだった（２０μＬ反応物あたりの量）：２μＬの１０
×ＲＴ緩衝液；０．８μＬの２５×ｄＮＴＰミックス（１００ｍＭ）；２μｌの１０×Ｒ
Ｔランダムプライマー（５０μＭ）；１μＬのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵
素（５０Ｕ／μＬ）；４．２μＬのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ。逆転写のために、１０μ
Ｌの２×逆転写マスターミックスをＲＮＡサンプルと混合し（２μｇ／１０μｌ）、以下
の条件下においてｃＤＮＡを合成した：２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５
分および最後に４℃に冷却。軽鎖および重鎖の可変領域をコードする遺伝子の増幅を、Ｐ
ｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
よって行った。順方向プライマー（８Ｅ８Ｌ−センス５’−ＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＴＣ
ＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣ−３’（配列番号１３２）および８Ｅ８Ｈ−センス５
‘−ＣＴＣＣＴＣＣＡＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧ−３‘（配列番号１３３））を、
ＤＣ８Ｅ８軽鎖（ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳ）（配列番号１３４）および重鎖（ＱＶＱＬＱＱ
ＳＧＰＥ）（配列番号１３５）のＮ末端のタンパク質配列に従ってデザインした。そのＮ
末端のタンパク質配列は、エドマン分解（軽鎖）およびＭＡＬＤＩインソース崩壊（重鎖
）を使用して決定された。この情報を使用して、軽鎖および重鎖と最も似ているタンパク
質を、それらの対応するヌクレオチド配列とともに、Ｇｅｎｅｂａｎｋにおいて同定した
。次いで、マウスＶ遺伝子（軽鎖および重鎖）の最も有望なヌクレオチド配列を、ＩＭＧ
Ｔ／ＬＩＧＭ−ＤＢデータベース（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）において同定した。これ
らの遺伝子を、順方向プライマーのデザインのために使用した（ＤＣ８Ｅ８のＮ末端のタ
ンパク質配列を使用して修正を行った）。軽鎖および重鎖に対する逆方向プライマー（カ
ッパー−アンチセンス５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴＧＧ
ＧＴＧ−３’（配列番号１３６）およびＧ１−アンチセンス５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＡ
ＴＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣ−３（配列番号１３７））を、それぞれカッ
パーおよびＩｇＧ１鎖の定常領域から得た。
ＰＣＲ産物を配列決定し、ＤＣ８Ｅ８の軽鎖および重鎖の可変領域の得られたＤＮＡ配
列を、それぞれ図３Ａおよび３Ｄに示す。最も近いマウス生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ８−
２１＊０１および重鎖ＩＧＨＶ１−８１＊０１に対するＤＣ８Ｅ８のアラインメントを、
それぞれ図３Ｃおよび３Ｆに示す。ＤＣ８Ｅ８軽鎖および重鎖タンパク質配列における相
補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引いている（それぞれ図３Ｂおよび３Ｅ）。ＣＤＲおよ
びフレームワーク領域（ＦＲ）を、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ナンバリ
ングシステムに従って特定した（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．Ｔｈｅ ＩＭＧＴ
ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｔ−ｃ
ｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｎｄ Ｉｇ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｔｈｅ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ７，１３２−１３６，１９９９（１９９９）を参照のこと）。
ｂ）ＤＣ８Ｅ８のヒト化。マウスＤＣ８Ｅ８相補性決定領域（ＣＤＲ）の移植によって
ヒト化ＤＣ８Ｅ８を作製するための好適な候補ヒト免疫グロブリンを特定するために、Ｄ
Ｃ８Ｅ８に対して最も高い配列同一性を有するヒト生殖細胞系列遺伝子を、ＩＭＧＴ／Ｌ
ＩＧＭ−ＤＢフラットファイルリリース（ｆｌａｔ ｆｉｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ）２０１
１１２−６（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）から抽出されたヒト免疫グロブリン遺伝子の選
択されたセットに対するＤＣ８Ｅ８ヌクレオチド配列のＣｌｕｓｔａｌＸ２ペアワイズア
ラインメントを使用して決定した。ＩｇＫｖ４−１＊０１を、ＤＣ８Ｅ８軽鎖に対して最
も近いヒト生殖細胞系列遺伝子として特定し（図４）、ＩｇＨＶ１−６９＊１０を、ＤＣ
８Ｅ８重鎖に対して最も近い生殖細胞系列遺伝子として特定した（図５）。以下のアプロ
ーチ（方法１および方法２）をデザインし、それを使用することにより、ＤＣ８Ｅ８抗体
の１つもしくは複数のヒト化バージョンを調製することができる。適切な抗体発現系（例
えば、インビトロ（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）またはインビボ（トランスジェニック動
物）での抗体発現のために使用される哺乳動物発現ベクター）における発現の後、得られ
たヒト化組換え抗体は、ＤＣ８Ｅ８の活性の特徴付けのために使用された任意の方法に従
って、活性（例えば、生化学的活性および治療活性）について試験され得る。
方法１：ＣＤＲ移植、および必要であればフレームワーク領域（ＦＲ）における変異（
ＣＤＲは、下線が引かれた太字であり、ＦＲの変異は、太字である）：
重鎖可変領域（掲載順にそれぞれ配列番号１３８〜１４０）：

軽鎖可変領域（掲載順にそれぞれ配列番号１４１〜１４３）：
方法２：ＤＣ８Ｅ８に対して最も高い配列同一性を有するマウス生殖細胞系列免疫グロ
ブリン（図３）およびヒト生殖細胞系列免疫グロブリン（図４および５）を見つけ出し、
ＤＣ８Ｅ８タンパク質配列とアラインメントした。ＣＤＲ領域を、ＩＭＧＴナンバリング
システムに従って特定した。ＤＣ８Ｅ８結合部位内の最も有望な抗原接触残基を、Ｍａｃ
Ｃａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６の成果に基づいて特定した。
ＤＣ８Ｅ８のヒト化バージョンにおける変異に対する様々なアミノ酸候補を、以下の複
合基準に基づいて特定した：
ｉ．ＣＤＲにおける存在および抗原との接触の確率
ｉｉ．バーニヤゾーン（Ｖｅｒｎｉｅｒ ｚｏｎｅ）における存在
ｉｉｉ．それらがマウス生殖細胞系列において変異しているか否か
２つのレベルの変異候補が、上記基準に従って特定された：
Ｘタイプ残基（太字）：
−ＤＣ８Ｅ８と最も近いマウス生殖細胞系列との間で異なる残基、非類似アミノ酸
−ＣＤＲおよび接触抗原における残基。ＣＤＲは、下記のＤＣ８Ｅ８配列において太字の
小文字の斜体である。
Ｙタイプ残基（下線が引かれた太字）：
−ＤＣ８Ｅ８と最も近いマウス生殖細胞系列との間で同一であるが最も近いヒト生殖細胞
系列において異なり、バーニヤゾーンに位置する残基（非類似アミノ酸）
−ＤＣ８Ｅ８と最も近いマウス生殖細胞系列との間で異なる残基（類似の／保存されたア
ミノ酸）
各鎖に対する２つのヒト化配列を、ＤＣ８Ｅ８の活性に影響すると予測される変異とと
もに特定した：
配列番号１４７、１５２：Ｘタイプの残基だけが変異され得る
配列番号１４８、１５３：ＸとＹの両方のタイプの残基が変異され得る重鎖可変領域（掲
載順にそれぞれ配列番号１３８、１４５、１３９）：

軽鎖可変領域（掲載順にそれぞれ配列番号１４１、１５０、１４２）：
実施例４：組換えタウ欠失変異体およびタウ由来ペプチドを使用したＤＣ８Ｅ８エピト
ープのマッピング
ヒトタウタンパク質２Ｎ４Ｒの欠失変異体ならびにタウ由来ペプチド（Ａｎｔａｇｅｎ
ｅ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）およびＥＺＢｉｏｌａｂ，（ＵＳＡ））を、
ＥＬＩＳＡを使用するＤＣ８Ｅ８のエピトープマッピングのために使用した（図６、７お
よび８）。組換えヒトタウアイソフォーム（２Ｎ４Ｒ；２Ｎ３Ｒ）およびタウ欠失変異体
（図６Ａ、６Ｂ）を、実施例１に記載したように調製した。ペプチド（図７Ａ、７Ｂ）は
、ＥＺＢｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）によって８５％より高い純度で合成された。
マイクロタイタープレートを、３７℃において組換えタウタンパク質またはタウペプチ
ドで一晩コーティングした（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）。非特異的結合
を減少させるために１％脱脂粉乳でブロッキングした後、プレートをＰＢＳ−０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、５０μｌ／ウェルのＤＣ８Ｅ８ハイブリドーマ培養上清ととも
に３７℃で１時間インキュベートした。結合したモノクローナル抗体を、ヒツジ抗マウス
Ｉｇ ＨＲＰ結合体（ＤＡＫＯ）を用いて検出した。その反応物を、ペルオキシダーゼ基
質としてオルトフェニレンジアミン溶液を用いて発色させ、５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４
で停止させた。吸光度を、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＭＣＣ／３４０ ＥＬＩＳＡリーダー（
Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して４９２ｎｍにおいて測定した。ネガティブコントロー
ル（ＰＢＳ）の吸光度の値の少なくとも２倍の値を有する読取値を、ポジティブと考えた
。
ＤＣ８Ｅ８は、以下のヒトタウタンパク質：Δ３５８−４４１、Δ４２１−４４１、Δ
１３４−１６８、Δ１−２２０、Δ１−１２６、Δ（１−２９６；３９２−４４１）／４
ＲおよびΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを認識したが、欠失Δ２２２−４２７
、Δ３０６−４００、Δ２２８−４４１、Δ３００−３１２、Δ２５７−４００、Δ１３
７−４４１およびΔ２８３−４４１を有するタウタンパク質を認識しなかった（図６Ｂ、
６Ｃ）。ＤＣ８Ｅ８は、タウ２Ｎ４Ｒの病理学的／誤無秩序タウΔ（１−２９６；３９２
−４４１）／４Ｒ、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒおよびタウ欠失変異体
（Δ３５８−４４１、Δ４２１−４４１、Δ１３４−１６８、Δ１−２２０、Δ１−１２
６）を認識するよりも低い程度で生理学的タウアイソフォーム２Ｎ４Ｒおよび２Ｎ３Ｒを
認識した（図６Ｃ）。タウペプチドを使用したより詳細なエピトープマッピングから、Ｄ
Ｃ８Ｅ８が、タウペプチド２４０−２７０、２７０−３００および３０１−３３０を認識
しないことが明らかになった（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ）。同時に、これらの知見は、ＤＣ８
Ｅ８が、ヒトタウ上に４つの結合部位またはエピトープを有することを示唆する（その各
々は、タウタンパク質の微小管結合リピートドメイン領域内に位置し、そのエピトープの
各々は、以下のタウ配列：２６７−ＫＨＱＰＧＧＧ−２７３（配列番号９８）（タウタン
パク質の第１リピートドメイン）、２９８−ＫＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号９９）（
タウタンパク質の第２リピートドメイン）、３２９−ＨＨＫＰＧＧＧ−３３５（配列番号
１００）（タウタンパク質の第３リピートドメイン）および３６１−ＴＨＶＰＧＧＧ−３
６７（配列番号１０１）（タウタンパク質の第４リピートドメイン）（図７Ｄ）のうちの
１つの中に別々に位置する）。さらに、ＤＣ８Ｅ８は、完全長３リピートおよび４リピー
トタウよりも良好に切断型のタウに結合するので、これらの結果は、ＤＣ８Ｅ８が、生理
学的タウ（タウ３９（２Ｎ３Ｒ）およびタウ４０（２Ｎ４Ｒ））よりも疾患型のタウによ
り良く結合することも示唆する。また、タウは、生理学的タウ（天然無秩序タウ）から疾
患タウ（誤無秩序および誤秩序タウ，Ｋｏｖａｃｅｃｈら、２０１０）にコンフォーメー
ションを変化させると考えられるので、これらの結果は、ＤＣ８Ｅ８に対する結合部位（
ＤＣ８Ｅ８エピトープ）の１つもしくは複数が、疾患タウと生理学的タウとで異なるコン
フォーメーションを有すること、およびＤＣ８Ｅ８がコンフォーメーション変化を検出で
きることを示唆する。
これらのタウリピートドメインは、種間で保存されているので（図８Ａ）、ＤＣ８Ｅ８
は、ラット、マウス、ウシ、チンパンジー（ｃｈｉｐａｎｚｅｅ）、カエルなどのような
多種多様な種由来のタウタンパク質と反応する可能性がある。様々な動物種のタウタンパ
ク質のアラインメントを、ソフトウェアＣｌｕｓｔａｌＷ２（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．
ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／において入手可能）を使用して
行った。ヒトタウは、ヒト脳ニューロンにおいて発現される最も長いタウアイソフォーム
（２Ｎ４Ｒ，４４１アミノ酸）によって代表される。他の種のタウタンパク質は、公的デ
ータベースから選択された。ＤＣ８Ｅ８抗体によって認識される４つのエピトープの各々
が位置する配列は四角で囲まれている。
さらなる点変異および欠失を、ある特定のタウ由来ペプチド（８−ｍｅｒ、９−ｍｅｒ
および１０−ｍｅｒ）に対して行うことにより、各ペプチドがＤＣ８Ｅ８への結合につい
てタウΔ（１−１５０；３９２−４４１／４Ｒ）と競合する能力によって評価される、Ｄ
Ｃ８Ｅ８エピトープをさらに定義した。ペプチドは、ＥＺＢｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）によ
って８５％より高い純度で合成された。競合ＥＬＩＳＡを、以下の標準的なプロトコルに
従って行った。ＥＬＩＳＡプレート（ＩＷＡＫＩ高結合プレート，＃３８０１−０９６，
Ｂｅｒｔｏｎｉ ＧｍｂＨ，Ａｕｓｔｒｉａ）を、１００μｌ／ウェルの、ＰＢＳ中の５
μｇ／ｍｌの組換え精製タウΔ（１−１５０；３９２−４４１／４Ｒ）で４℃において一
晩コーティングした。そのＩＷＡＫＩ高結合プレートを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．
０５％ｖ／ｖ）で４回洗浄し、２５℃において２時間、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０でブロッ
キングした。上記ペプチドの各々を別々に５ｍＭの最終濃度でＰＢＳに溶解した。ＰＢＳ
／Ｔｗｅｅｎ２０中のそれらのペプチドの段階希釈物（２倍）を、コニカルウェル底を有
するポリプロピレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，＃６５１２０１）において調製した（濃
度範囲８０μＭ、４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭおよび２．５μＭ）。１ウェル
あたり１００μｌの各希釈物を加えた。精製されたＤＣ８Ｅ８モノクローナル抗体（精製
は、下記の実施例５に記載されるように行った）を、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０中、２μｇ
／ｍｌの濃度に希釈し、１００μｌのこの希釈された抗体を、ペプチドの各段階希釈物と
混合して、４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、２．５μＭおよび１．２５μＭの濃
度でそれぞれの各試験ペプチドを含む１００μｌあたり１００ｎｇの抗体を含む２００μ
ｌの混合物を得た。その抗体／ペプチド混合物を、２５０ｒｐｍに設定された回転プラッ
トフォーム上で２５℃において１時間インキュベートした。１００マイクロリットル（１
００μｌ）の抗体／ペプチド混合物を、上記ポリプロピレンプレートから、タウΔ（１−
１５０；３９２−４４１／４Ｒ）でコーティングされ、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０でブロッ
キングされたＩＷＡＫＩ高結合プレートに移し、２５０ｒｐｍに設定された回転プラット
フォーム上で２５℃において１時間インキュベートした。そのプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅ
ｅｎ２０で４回洗浄した。それらのサンプル（プレート中）を、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０
において１：４，０００希釈された１００μｌのポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブ
リン／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ，＃Ｐ０４４７）とともに、回転プラットフォーム（２５０ｒｐ
ｍに設定）上で２５℃において１時間インキュベートした。そのプレートをＰＢＳ／Ｔｗ
ｅｅｎで４回洗浄した。次いで、サンプル／プレートを、１．５μｌ／２ｍｌの３０％Ｈ
２Ｏ２（ＳＩＧＭＡ，Ｈ−０９０４）が補充された０．１Ｍ酢酸Ｎａ ｐＨ６．０（Ｒｏ
ｔｈ，＃６７７９）中の、１００μｌの１．５ｍｇ／２ｍｌ ｏ−ＰＤＡ溶液（ｏ−フェ
ニレンジアミン，ＳＩＧＭＡ，Ｐ１５２６）とともに２５℃において１０分間、暗所にお
いてインキュベートした。１００μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４（Ｍｅｒｃｋ，１．００７３１
．１０００）を加えることによって反応を停止した。その反応の程度を、サンプル／プレ
ートの４９０ｎｍにおける吸光度を読むことによって追跡した（例えば、Ｖｉｃｔｏｒ
Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ）を使用して）。
図８Ｂは、以下の６つのペプチドを用いて行われた競合ＥＬＩＳＡの結果を示している
：ＮＩＫＡＶＰＧＧＧＳ（配列番号２００）、ＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号２０１）
、ＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号２０２）、ＫＨＶＰＧＧＧＳＶ（配列番号２０３）、Ｈ
ＶＰＧＧＧＳＶＱ（配列番号２０４）およびＶＰＧＧＧＳＶＱ（配列番号２０５）。タウ
治療用エピトープ＃２を含む、ペプチドＫＨＶＰＧＧＧＳＶ（配列番号２０３）およびＨ
ＶＰＧＧＧＳＶＱ（配列番号２０４）は、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１／４Ｒ）
上に存在する元の治療用エピトープの少なくとも１つと競合した。配列番号２０４のエピ
トープから、下線が引かれたヒスチジンが除去されることにより、競合活性が失われる（
ペプチドＶＰＧＧＧＳＶＱ，配列番号２０５を参照のこと）。ヒスチジンからアラニンに
変化させる点変異（「エピトープ＃２」中の、対応するタウの２９９位におけるもの）は
、競合活性を失わせる（ペプチドＮＩＫＡＶＰＧＧＧＳ，配列番号２００）。「ヒスチジ
ン２９９」の前に（Ｎ末端に向かって）２または３個のアミノ酸を含むペプチドも、元の
エピトープと競合した（それぞれペプチドＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号２０２）および
ＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号２０１））。これらの結果から、第２のタウリピート内
に含まれるＤＣ８Ｅ８の最小エピトープ（エピトープ＃２）が、６−ｍｅｒ配列、すなわ
ちＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４）内に存在することが示唆される。
上述のマッピング実験から、ＤＣ８Ｅ８抗体のエピトープの１つもしくは複数（ｏｎｅ
ｏｒｅ ｍｏｒｅ）の中のアミノ酸配列ＰＧＧＧの存在が示唆された。さらに、このア
ミノ酸配列は、ＤＣ８Ｅ８によって結合されるタウタンパク質上の４つすべてのエピトー
プに存在する（配列番号９８、９９、１００、１０１を参照のこと）。ＤＣ８Ｅ８エピト
ープのＮ末端領域における残基を決定するために、アラニンスキャニング実験を、タウの
第２リピートドメイン内に含まれるＤＣ８Ｅ８エピトープ（２９８−ＫＨＶＰＧＧＧ−３
０４内，配列番号９９）を含むタウペプチド２９５−ＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ−３０５に
おいて行った。
ＤＣ８Ｅ８に対する変異体ペプチドの結合能を、各ペプチドがＤＣ８Ｅ８への結合につ
いてタウΔ（１−１５０；３９２−４４１／４Ｒ）と競合する能力によって評価した。７
つのペプチドが、ＥＺＢｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）によって８５％より高い純度で合成され
た：ＡＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４４）、ＤＡＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１
４６）、ＤＮＡＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４９）、ＤＮＩＡＨＶＰＧＧＧＳ（配列番
号１５１）、ＤＮＩＫＡＶＰＧＧＧＳ（配列番号１５９）、ＤＮＩＫＨＡＰＧＧＧＳ（配
列番号１６１）、および元の配列ＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１７１）を有するペ
プチド。競合ＥＬＩＳＡを、以下の標準的なプロトコルに従って行った。ＥＬＩＳＡプレ
ート（ＩＷＡＫＩ高結合プレート，＃３８０１−０９６，Ｂｅｒｔｏｎｉ ＧｍｂＨ，Ａ
ｕｓｔｒｉａ）を、１００μｌ／ウェルの、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌの組換え精製タウΔ
（１−１５０；３９２−４４１／４Ｒ）で４℃において一晩コーティングした。そのＩＷ
ＡＫＩ高結合プレートを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％ｖ／ｖ）で４回洗浄し、
２５℃において２時間、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０でブロッキングした。上記ペプチドの各
々を別々に５ｍＭの最終濃度でＰＢＳに溶解した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０中のそれらの
ペプチドの段階希釈物（２倍）を、コニカルウェル底を有するポリプロピレンプレート（
Ｇｒｅｉｎｅｒ，＃６５１２０１）において調製した（濃度範囲３２０μＭ、１６０μＭ
、８０μＭ、４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭおよび２．５μＭ）。１ウェルあた
り１００μｌの各希釈物を加えた。精製されたＤＣ８Ｅ８モノクローナル抗体（精製は、
下記の実施例５に記載されるように行った）を、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０中、２μｇ／ｍ
ｌの濃度に希釈し、１００μｌのこの希釈された抗体を、ペプチドの各段階希釈物と混合
して、１６０μＭ、８０μＭ、４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、２．５μＭおよ
び１．２５μＭの濃度でそれぞれの各試験ペプチドを含む１００μｌあたり１００ｎｇの
抗体を含む２００μｌの混合物を得た。その抗体／ペプチド混合物を、２５０ｒｐｍに設
定された回転プラットフォーム上で２５℃において１時間インキュベートした。１００マ
イクロリットル（１００μｌ）の抗体／ペプチド混合物を、上記ポリプロピレンプレート
から、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１／４Ｒ）でコーティングされ、ＰＢＳ／Ｔｗ
ｅｅｎ２０でブロッキングされたＩＷＡＫＩ高結合プレートに移し、２５０ｒｐｍに設定
された回転プラットフォーム上で２５℃において１時間インキュベートした。そのプレー
トをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。それらのサンプル（プレート中）を、ＰＢ
Ｓ／Ｔｗｅｅｎ２０において１：４，０００希釈された１００μｌのポリクローナルヤギ
抗マウス免疫グロブリン／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ，＃Ｐ０４４７）とともに、回転プラットフ
ォーム（２５０ｒｐｍに設定）上で２５℃において１時間インキュベートした。そのプレ
ートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。次いで、サンプル／プレートを、１．５μｌ
／２ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２（ＳＩＧＭＡ，Ｈ−０９０４）が補充された０．１Ｍ酢酸Ｎａ
ｐＨ６．０（Ｒｏｔｈ，＃６７７９）中の、１００μｌの１．５ｍｇ／２ｍｌ ｏ−Ｐ
ＤＡ溶液（ｏ−フェニレンジアミン，ＳＩＧＭＡ，Ｐ１５２６）とともに２５℃において
１０分間、暗所においてインキュベートした。１００μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４（Ｍｅｒｃ
ｋ，１．００７３１．１０００）を加えることによって反応を停止した。その反応の程度
を、サンプル／プレートの４９０ｎｍにおける吸光度を読むことによって追跡した（例え
ば、Ｖｉｃｔｏｒ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ）を使用して
）。
図８Ｃは、以下の７つのペプチド：ＡＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４４）、ＤＡ
ＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４６）、ＤＮＡＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４９）、
ＤＮＩＡＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１５１）、ＤＮＩＫＡＶＰＧＧＧＳ（配列番号１５９
）、ＤＮＩＫＨＡＰＧＧＧＳ（配列番号１６１）およびＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番
号１７１）を用いて行われた競合ＥＬＩＳＡの結果を示している。ヒスチジンをアラニン
に変化させる点変異（「エピトープ＃２」内の対応するタウ２９９位におけるもの）は、
ＤＣ８Ｅ８への結合についてのタウΔ（１−１５０；３９２−４４１／４Ｒ）との競合活
性を完全に失わせる（ペプチドＤＮＩＫＡＶＰＧＧＧＳ、配列番号１５９）。アミノ酸Ｄ
、Ｎ、Ｉ、ＫおよびＶをアラニンに変化させた変異は、それぞれの変異体ペプチド（ペプ
チドＡＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４４）、ＤＡＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１
４６）、ＤＮＡＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号１４９）、ＤＮＩＡＨＶＰＧＧＧＳ（配列番
号１５１）、ＤＮＩＫＨＡＰＧＧＧＳ（配列番号１６１）の競合活性を無効にしなかった
。これらの結果は、第２のタウリピート内に含まれるＤＣ８Ｅ８の最小エピトープ（エピ
トープ＃２）が、６−ｍｅｒ配列、すなわちＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４）内に存在し
、ＤＣ８Ｅ８が、ＨＸＰＧＧＧ（配列番号１６４）に結合することを示唆している。
実施例５：ＤＣ８Ｅ８は、表面プラズモン共鳴によって評価されるとき、誤無秩序タウ
Δ（１−１５０；１５１−３９１）／４Ｒを認識する
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、結合事象をリアルタイムで直接モニタリングするこ
とによって、タンパク質結合を検出するため、およびタンパク質複合体（例えば、抗体抗
原複合体）の熱力学的パラメータを測定するために使用され得る。この技術は、診断用抗
体と治療用抗体の両方を特徴付けるために日常的に使用されている（例えば、Ｋａｒｌｓ
ｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓｓｏｎ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｕｓｉ
ｎｇ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ
編（著作権）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００８）
を参照のこと）。
ＳＰＲ実験のために、ＤＣ８Ｅ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、以下のとおり、プ
ロテインＧアフィニティーカラム上で無血清ハイブリドーマ上清から精製した。ハイブリ
ドーマ上清を、ｐＨ７．５に調整し、その溶液を遠心分離によって予め浄化し、０．４５
μｍメンブランフィルターで濾過し、５ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
カラムに充填した。ＤＣ８Ｅ８ ｍＡｂを、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．７を用
いてそのカラムから溶出した。溶出された画分を、直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
９．０で中和した。プールされた画分を、ＰＢＳに対して透析し、限外濾過によって濃縮
し、−７０℃で保管した。２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、式ｃ（ｍ
ｇ／ｍｌ）＝Ａ２８０ｎｍ／１．４３を使用して、抗体の濃度を決定した。
ＣＭ５センサーチップを備えたＢＩＡＣＯＲＥ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，
Ｕｐｐｓａｌａ）を、ＳＰＲアッセイのために使用した。アミンカップリング試薬（ＥＤ
Ｃ、ＮＨＳ、エタノールアミンｐＨ８．５）、Ｐ２０界面活性剤および１０ｍＭ酢酸ナト
リウムｐＨ５．０を、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢから入手した。これらの実験を、ランニング
緩衝液として、０．００５％のＰ２０を含むＰＢＳ ｐＨ７．４（ＰＢＳ−Ｐ）中、２５
℃において行った。代表的には、５，０００ＲＵ（応答単位）のポリクローナル抗マウス
抗体（Ｎｏ．Ｚ０４２０；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍ
ａｒｋ）を、ｐＨ５．０において１級アミンを介して、２つのフローセル（その一方を基
準測定として使用した）において同時に結合させた。
各解析サイクルにおいて、２３０〜２５０ＲＵの固定化レベルに達するように、精製さ
れたＤＣ８Ｅ８を分析フローセルに捕捉した。ＫＡ測定のために、ならびに動態速度定数
（ｋＯＮおよびｋＯＦＦ）の測定のために、タウタンパク質（それに対するＤＣ８Ｅ８親
和性が試験された）またはコントロールとしてＰＢＳ−Ｐの２倍段階希釈物を、５０μｌ
／分の流速でセンサーチップの上に注入した。動態結合データを、Ｍｙｓｚｋａ，１９９
９に従って二重参照（ｄｏｕｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ）し、ＢＩＡ評価ソフトウェ
ア４．１（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）によって２相反応モデルに当てはめた。動態速度定数
を全体的に近似させ、最大レスポンスを局所的に当てはめ、バルクレスポンスを０に設定
した。
試験されたタウタンパク質の各々に対してＤＣ８Ｅ８の親和性を定量するために、会合
平衡結合定数（ＫＡ）を、４リピートタウタンパク質アイソフォーム２Ｎ４Ｒ、３リピー
トタウタンパク質アイソフォーム２Ｎ３Ｒならびに誤無秩序タウΔ（１−１５０；３９２
−４４１）／４Ｒおよび誤無秩序タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／３Ｒに対する
ＤＣ８Ｅ８結合について測定した。ＳＰＲのために使用されたすべてのタウタンパク質は
、実施例１に従って調製された。ＤＣ８Ｅ８の親和性は、４リピートタウΔ（１−１５０
；３９２−４４１）／４Ｒに続いて、完全長４リピートタウアイソフォーム２Ｎ４Ｒ、次
いで、３リピートタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／３Ｒ、そして最後に３リピー
ト完全長タウアイソフォーム２Ｎ３Ｒに対して高かった（図９Ａ、Ｂ）。これらの結果は
、（１）誤無秩序形態のタウに対するＤＣ８Ｅ８の特異性、および（２）完全長タウ（す
なわち、正常または生理学的タウ）に優先して誤無秩序タウ（すなわち、疾患または病理
学的タウ）に対するＤＣ８Ｅ８の選択性を確証させた。
ＳＰＲを使用した結合事象のリアルタイムモニタリングは、ＤＣ８Ｅ８といくつかのタ
ウタンパク質との間の会合（ｋＯＮ）および解離（ｋＯＦＦ）の動態速度の測定を可能に
した。ＤＣ８Ｅ８の結合動態は、生理学的２Ｎ４Ｒタウと比べて、誤無秩序タウΔ（１−
１５０；３９２−４４１）／４ＲおよびタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／３Ｒの
変更されたコンフォーメーションを明らかにした（これは、誤無秩序（ｍｉｓｄｉｓｏｒ
ｄｅｒｄ）タウタンパク質におけるより容易に到達可能なＤＣ８Ｅ８エピトープによって
示唆される）。これは、完全長の対応物と比べて誤無秩序タウタンパク質へのより速い結
合およびより高いｋＯＮによって反映される。さらに、４リピートタウタンパク質種上の
、ＤＣ８Ｅ８に対する余分な結合部位の存在によって、ＤＣ８Ｅ８との複合体からの４Ｒ
タウ種の１０倍遅い解離およびそれに対応する１０倍低いｋＯＦＦがもたらされた（図１
０Ａ、Ｂ；コンピュータプログラムＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖ４．１を使用した動
態パラメータ計算によって、測定されたデータから破線が内挿された）。
実施例６：ＤＣ８Ｅ８は、ヒトアルツハイマー病脳におけるすべての発症段階の神経原
線維変性を認識する
ヒト脳組織（パラフィンブロック）を、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ ｂｒａｉｎ ｂａｎ
ｋから入手した。そのブロックをミクロトームにおいて切断した。アルツハイマー病脳（
ＢｒａａｋステージＶＩ）および非痴呆コントロール（ＢｒａａｋステージＩおよびＩＩ
Ｉ）の海馬嗅内皮質のパラフィン切片（８μｍ）を、室温（２５℃）において冷（＋４℃
）９９％ギ酸で１分間処理した。その組織切片をブロッキング溶液（５０ｎＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ中の、５％ＢＳＡ、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中でインキュベートし
、次いで、ブロッキング溶液で１：２，０００希釈された、精製された１次抗体ＤＣ８Ｅ
８（７．８ｍｇ／ｍｌ；実施例５に記載されたように調製された）とともに一晩インキュ
ベートした。続いて、それらの切片を、ビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅ
ｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに室温に
おいて１時間インキュベートし、次いで、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体と
両方とも室温（２５℃）において６０分間反応させた（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔ
ｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。免疫反応を、ペルオ
キシダーゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ ＶＩＰ，Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｃａ，ＵＳＡ）を用いて可視化し、メチルグリーン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）で対比染色した。それらの切片をＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ７１顕微鏡で検鏡し
た。
モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８は、前臨床ＡＤと、臨床的に初発のＡＤと、完全に発症
した最終段階のＡＤとを区別した。免疫組織化学的研究は、ＤＣ８Ｅ８が、ヒト前臨床Ａ
Ｄ−ＢｒａａｋステージＩにおける初期の段階（タウ単量体、二量体）の病理学的タウを
検出することを示した（図１１Ａ）。その脳は、限られた数の神経原線維変化（ＮＦＴ）
だけを嗅内皮質に含むが、海馬にはＮＦＴを含まない（ＢｒａａｋステージＩ）。海馬に
いくつかのＮＦＴが見られた臨床的に初発のＡＤ脳では（ＢｒａａｋステージＩＩＩ）、
ＤＣ８Ｅ８ ｍＡｂは、病理学的タウオリゴマーの段階（矢印）と病理学的タウポリマー
（濃縮体）の段階の両方を認識した（図１１Ｂ）。広範な神経原線維変性が存在する完全
に発症したアルツハイマー病脳では、ＤＣ８Ｅ８は、主に病理学的タウポリマーを神経原
線維変化、老人斑および糸屑状構造物（ｎｅｕｒｏｔｉｃ ｔｈｒｅａｄｓ）の形態で認
識する（図１１Ｃ）。したがって、ｍＡｂ ＤＣ８Ｅ８は、単量体、二量体、初期オリゴ
マー段階（図１１Ｄ１）および後期オリゴマープレ濃縮体段階（図１１Ｄ２）、ならびに
後期の発症段階の病理学的タウポリマー−細胞内（図１１Ｄ３）および細胞外の神経原線
維変化（図１１Ｄ４）を含む、ヒトアルツハイマー病脳組織におけるすべての発症段階の
神経原線維病変を認識する。ゆえに、このｍＡｂ ＤＣ８Ｅ８の反応性は、この抗体の診
断用途と治療用途の両方のために有用である。
実施例７：ＤＣ８Ｅ８は、ヒトアルツハイマー病で見られたように、トランスジェニッ
クラットＳＨＲ７２の脳におけるすべての発症段階の神経原線維変性を認識する
ＳＨＲ２４トランスジェニックラット系統：この系統は、国際特許出願ＰＣＴ ＷＯ２
００４／００７５４７に記載されているタンパク質であるタウΔ（１−１５０；３９２−
４４１）／３Ｒを発現する。このトランスジェニック系統の作出および特徴付けは、Ｆｉ
ｌｉｐｃｉｋら、２０１０に記載されている。これらのトランスジェニックラットは、皮
質脳の領域において進行性の加齢依存的な神経原線維変性を発症する。神経原線維変化（
ＮＦＴ）は、ヒトアルツハイマー病における神経原線維変性を識別するために使用される
いくつかの重要な組織学的基準（銀親和性、コンゴーレッド複屈折およびチオフラビンＳ
反応性を含む）を満たした。神経原線維変化は、ヒト脳における病理的タウを検出するた
めに使用される抗体（疾患タウコンフォーメーションを認識する（Ｖｅｃｈｔｅｒｏｖａ
ら、２００３；Ｋｏｖａｃｅｃｈら、２０１０）ＤＣ１１を含む）、および過剰リン酸化
型のタウタンパク質に特異的な抗体を用いても識別された。さらに、神経原線維変性は、
ラット内在性およびトランスジェニック切断型タウ種からなるサルコシル不溶性タウタン
パク質複合体の広範な形成によって特徴付けられた（Ｆｉｌｉｐｃｉｋら、２０１０）。
これらのトランスジェニックラットの最も顕著な病理組織学的特徴は、皮質における広範
な神経原線維病理（神経原線維変化）である。トランスジェニックラットの生存時間の中
央値は、２２２．５日（ＳＤ＝４３．５６）であり、最も長い生存期間は、４７５日に達
する（Ｆｉｌｉｐｃｉｋら、２０１０）。
ＳＨＲ７２トランスジェニックラット系統：これらのトランスジェニックラットは、い
くつかの脳領域および脊髄において、国際特許出願ＰＣＴ ＷＯ２００４／００７５４７
）に係るヒト切断型タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを発現する。このラッ
ト系統の作出は、Ｚｉｌｋａら、２００６に記載され、タウ病理は、Ｋｏｓｏｎら、２０
０８に記載された。これらのトランスジェニックラットの最も顕著な病理組織学的特徴は
、広範な神経原線維病理、例えば、神経原線維変化である。ＮＦＴの外観は、ヒトＡＤに
おける神経原線維変性を識別するために使用されるいくつかの組織学的基準（銀親和性、
コンゴーレッド複屈折およびチオフラビンＳ反応性を含む）を満たした。ＮＦＴは、異常
なタウコンフォーメーションを認識してヒト脳において病理的タウを検出するために使用
される抗体（ＤＣ１１を含む）（米国特許第７，４４６，１８０号を参照のこと）および
過剰リン酸化型のタウタンパク質に特異的な抗体を用いても識別された。さらに、神経原
線維変性は、ラット内在性およびヒト切断型タウ種からなるサルコシル不溶性タウタンパ
ク質複合体の広範な形成によって特徴付けられた。このモデルのヘテロ接合体系統では、
最も広範な神経原線維病理が、脳幹および脊髄において観察された（Ｚｉｌｋａら、２０
０６）。導入遺伝子発現のレベル、ＮＦＴの量、およびラットの寿命が、予め測定された
。このトランスジェニックラット（ＳＨＲ７２系統）に対する生存時間の中央値は、２２
２．５日だった（ＳＤ＝２４．４８）（Ｋｏｓｏｎら、２００８）。
トランスジェニックラット系統ＳＨＲ２４（タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／
３Ｒを発現する）およびＳＨＲ７２（タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを発
現する）は、脳および脊髄において広範な神経原線維変性を生じさせた。トランスジェニ
ックラット系統ＳＨＲ２４は、等皮質、脳幹および脊髄において重篤な神経変性を示す一
方で、ＳＨＲ７２トランスジェニックラットは、ＮＦＴを主に脳幹および脊髄において生
じさせるが皮質では生じさせない。感覚運動および神経の障害の進行は、両方のトランス
ジェニック系統において似ている；しかしながらＳＨＲ７２トランスジェニックラットは
、より短い寿命を示す。
本願に提示されるトランスジェニックラット研究では、ヘミ接合トランスジェニックラ
ットを使用した（ＳＨＲ２４およびＳＨＲ７２）。すべてのラットを、自由に水および食
糧を摂取できる標準的な実験室条件下で収容し、日周期性の照明条件（７：００ａ．ｍ．
に明期を開始する１２時間明／暗サイクル）下で維持した。使用されるラットの数を最小
限にするように、ならびに不快、疼痛および苦痛を限定するように努力した。
ＤＣ８Ｅ８を用いたラット脳組織の免疫組織化学的検査：トランスジェニックラット（
７ヶ月齢）に、深麻酔下において１分間、ＰＢＳを経心的に灌流した後、１００ｍｌの４
％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）を灌流した。灌流後、頭部を切断し、すみやかに
脳を取り出した。使い捨てメス刃を使用して、脳を矢状方向に２つの同じサイズの半球に
切断した。その脳組織を４％パラホルムアルデヒド中で後固定し、パラフィンに包埋し、
ミクロトームにおいて切片に切断した。８μｍパラフィン包埋組織切片において免疫組織
化学的検査および組織病理学的検査を行った。組織切片を、室温（２５℃）において、抗
原アンマスキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２
０分間前処理し、冷（＋４℃）９０％ギ酸（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で１
分間前処理した。ブロッキングの後、切片を、ブロッキング溶液（５０ｎＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ中の５％ウシ血清アルブミン、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）で１：２０００
希釈された精製されたモノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８（７．８ｍｇ／ｍｌ）とともに一晩
インキュベートした。洗浄した後、切片を室温において１時間、ビオチン化二次抗体（Ｖ
ｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）とともにインキュベートし、次いで、室温（２５℃）において、アビジン−ビオ
チンペルオキシダーゼ−複合体溶液と６０分間反応させた（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌ
ｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。免疫反応を、ペ
ルオキシダーゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ ＶＩＰ，Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｃａ，ＵＳＡ）を用いて可視化し、切片をメチルグリーン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で対比染色した。切片をＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ７１顕微鏡で検鏡
した。
トランスジェニックラット脳（ＳＨＲ７２）において、ｍＡｂ ＤＣ８Ｅ８は、疾患段
階の病理学的タウオリゴマー（矢印）および疾患段階の病理学的タウポリマー（濃縮体）
を認識した（図１２Ａ）。さらに、ＤＣ８Ｅ８は、軸索線維に位置するミスフォールドさ
れたタウと反応した。同齢のコントロールラット脳では、その抗体は、神経細胞体または
軸索突起を染色しなかった（図１２Ｂ）。
ヒトアルツハイマー病脳におけるように（前出を参照のこと）、ｍＡｂ ＤＣ８Ｅ８は
、ＳＨＲ７２トランスジェニックラットの脳において、疾患の単量体、二量体および初期
オリゴマー段階（図１２Ｃ）ならびに後期オリゴマーのプレ濃縮体段階のタウ（図１２Ｄ
）、ならびに後期発症段階の病理学的タウポリマー（細胞内（図１２Ｅ）および細胞外の
神経原線維変化（図１２Ｆ））を含むすべての発症段階の神経原線維病変を認識した。
ＤＣ８Ｅ８は、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／３Ｒ）を発現しているトラン
スジェニックラットの脳における神経原線維変化も認識した（ＳＨＲ２４、図１３Ａ；Ｓ
ＨＲ７２、図１３Ｂ）。
実施例８：ＤＣ８Ｅ８は、ヒトアルツハイマー病およびタウトランスジェニックラット
の脳において、可溶性の誤無秩序タウと不溶性のタウ種の両方を認識する
可溶性タウおよび不溶性タウ複合体を、サルコシル法（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ
Ｄａｖｉｅｓ，１９９０）を使用して、ヒトＡＤ脳または疾患タウトランスジェニックラ
ット脳（実施例７に記載されたＳＨＲ２４およびＳＨＲ７２系統）から単離した。タンパ
ク質抽出のために、凍結されたヒトＡＤ脳組織（不等皮質，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ ｂ
ｒａｉｎ ｂａｎｋから入手したＢｒａａｋステージＶおよびＶＩのサンプル）ならびに
トランスジェニックＳＨＲ２４ラット（等皮質、１０、１２および１４ヶ月齢）およびト
ランスジェニックＳＨＲ７２ラット（脳幹、７．５ヶ月齢）由来の組織を、１０体積の冷
抽出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ
および１０％スクロース）中でホモジナイズした。そのホモジネートを２０，０００×ｇ
で２０分間遠心し、５０μｌの上清を可溶性タウの解析のために使用した。
サルコシル不溶性タウを調製するために、残りの上清に、Ｎ−ラウロイルサルコシン（
ＳＩＧＭＡ）を１％の最終濃度になるように補充し、振盪しながら室温において１時間イ
ンキュベートした。１時間にわたる１００，０００×ｇでの遠心分離の後、得られた上清
を廃棄した（ペレットが、サルコシル不溶性タウ画分を含む）。
可溶性タウ画分およびサルコシル不溶性タウ画分を、免疫ブロット法によって解析した
。可溶性タウ画分を、等体積の２×ＳＤＳ−サンプルローディング緩衝液（β−メルカプ
トエタノールを含む）（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）で希釈し、１レーンあたり１５μｇ
のタンパク質を充填した。サルコシル不溶性タウ画分に対しては、ペレットを、不溶性タ
ウ画分の調製のために使用された可溶性画分の１／５０体積の１×ＳＤＳ−サンプルロー
ディング緩衝液に溶解した。次いで、等体積の可溶性タウ画分およびサルコシル不溶性タ
ウ画分を免疫ブロット解析のために使用した（それらは、可溶性画分中の１５μｇの総タ
ンパク質に対応した）（Ｆｉｌｉｐｃｉｋら、２０１０を参照のこと）。サンプルを９５
℃で５分間加熱し、５〜２０％のグラジエントＳＤＳポリアクリルアミドゲルに充填し、
Ｔｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳ緩衝液系において、２５ｍＡで４０分間、電気泳動した。タ
ンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた（１０ｍＭ ＣＡＰＳ，ｐ
Ｈ１２において、１５０ｍＡで１時間）。その移動の後、その膜をリン酸緩衝食塩水（Ｐ
ＢＳ；１３６．８９ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８．０９ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ
４、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）中の５％脱脂粉乳において室温で１時間ブロッキング
し、次いで、ＴＢＳＴ−乳（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５％脱脂粉乳）で１：１希釈されたＤＣ８Ｅ８ハイブ
リドーマ培養上清とともに１時間インキュベートした後、大量のＰＢＳで３回洗浄した。
その膜を、二次抗体として、ＰＢＳで１：４，０００希釈されたＨＲＰ結合体化ヤギ抗マ
ウスＩｇ（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とともにインキュベートした（室温において１時
間）。このインキュベーションの後、ＰＢＳ中の０．２％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０（
ＳＩＧＭＡ）で洗浄した（３回）。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈ
ｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用
いてそのブロットの像を得て、ＬＡＳ３０００イメージングシステム（ＦＵＪＩ Ｐｈｏ
ｔｏ Ｆｉｌｍ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を使用してタンパク質シグナルを検出した。化学
発光シグナル強度を、ＡＩＤＡ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍａｇｅ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙ
ｚｅｒ，Ｒａｙｔｅｓｔ，Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ソフトウェア
を使用して定量した。
ＤＣ８Ｅ８は、ＳＨＲ２４トランスジェニックラットにおける可溶性ヒトタウΔ（１−
１５０；３９２−４４１）／３Ｒと生理学的ラットタウアイソフォームの両方を認識した
（図１４Ａ）。さらに、ＤＣ８Ｅ８は、ＳＨＲ２４ラット脳由来のサルコシル不溶性タウ
画分中のタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／３Ｒおよび病理学的ラットタウタンパ
ク質を認識した（図１４Ｂ）。重要なことには、ＤＣ８Ｅ８は、ヒトＡＤ脳におけるサル
コシル不溶性タウ画分中の病理学的ヒトタウタンパク質を強く認識した（Ｂｒａａｋステ
ージＶおよびＶＩ、図１４Ｂおよび１４Ｃ）。ＤＣ８Ｅ８は、ＳＨＲ７２トランスジェニ
ックラットにおける可溶性ヒトタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと完全長（
生理学的）ラットタウアイソフォームの両方を認識した（図１４Ｄ）。重大なことに、Ｄ
Ｃ８Ｅ８は、ＳＨＲ７２ラット脳由来のサルコシル不溶性タウ画分中の病理学的タウΔ（
１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒおよび病理学的形態のラットタウを特異的に認識し
た（図１４Ｄ）。
実施例９：ＤＣ８Ｅ８は、病理学的タウ−タウ相互作用を阻害する
タウ線維化アッセイ。ＤＣ８Ｅ８が病理学的タウ−タウ相互作用に対して阻害効果を有
するか否かを判定するために、インビトロタウ線維化アッセイを使用した。このアッセイ
は、タウタンパク質の固有の特性、すなわち、硫酸グリコサミノグリカンヘパリンなどの
ポリアニオンとの相互作用においてコンフォーメーション変化を起こす能力に基づく。１
つのタウ分子におけるこの変化したコンフォーメーションは、別のタウ分子とそれとの病
理学的な相互作用をさらにもたらし、その相互作用しているタウ分子の微小管結合領域に
おけるクロスβシート構造の形成を介したタウ−タウ複合体の安定化をもたらし、そして
最後に、アルツハイマー病様対らせん状細線維（ＰＨＦ）の形成をもたらす（Ｓｋｒａｂ
ａｎａら、２００６）。ベータシートリッチ構造の形成は、チオフラビンＴなどの蛍光色
素によって検出され得る。
病理学的タウ−タウ相互作用に対するＤＣ８Ｅ８の効果を測定するアッセイを、２０μ
Ｍ（最終濃度）の、実施例１に記載されたように精製された、試験される組換えタウタン
パク質（タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４ＲまたはタウΔ（１−２９６；３９
２−４４１）／４Ｒ）のうちのいずれか１つ；５μＭヘパリン（ブタ腸管粘膜由来のヘパ
リンナトリウム塩，≧１５０ＩＵ／ｍｇ，乾燥量基準，ＳＩＧＭＡ製）；および１２．５
μＭ（最終濃度）チオフラビンＴを含むＰＢＳ（０．２μｍフィルターで濾過されたもの
）において設定した。各反応物（８０μｌの最終体積）を、密閉された黒色固体ポリスチ
レンプレート（３８４ウェル，Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ）において、３７℃で２０
時間インキュベートした。４５０ｎｍの励起波長、５１０ｎｍの発光および２００ｍｓの
測定時間とともに、蛍光リーダー（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ（Ｌａｂ
ｓｙｓｔｅｍｓ））を使用して、チオフラビンＴの蛍光を測定した。病理学的タウ−タウ
相互作用に対するｍＡｂ ＤＣ８Ｅ８の阻害活性を測定するために、精製されたＤＣ８Ｅ
８（実施例５）を、上記反応混合物に２０μＭの最終濃度で加えた後、３７℃でインキュ
ベーションした。２つの抗体をコントロールとして使用した：ＤＣ５１（狂犬病ウイルス
のエンベロープタンパク質を認識する；Ｍａｃｉｋｏｖａら、１９９２）およびＤＣ１１
（ある特定の切断型のコンフォーメーションに変化した形態のタウを認識する、米国特許
第７，４４６，１８０号）。
コンフォーメーションに変化し、原線維化した（ｆｉｂｒｉｌｉｚｅｄ）タウの量を、
ＤＣ８Ｅ８の非存在下（「Ｃｔｒｌ」）および存在下（「ＤＣ８Ｅ８」）におけるチオフ
ラビンＴの蛍光によって測定した（図１５Ａおよび１５Ｂ）。２０μＭの最終濃度で加え
られたｍＡｂ ＤＣ８Ｅ８は、両方の誤無秩序タウタンパク質の病理学的なコンフォーメ
ーション変化および線維化を妨げ、線維化した病理学的タウの形態の量を、タウΔ（１−
１５０；３９２−４４１）／４ＲおよびタウΔ（１−２９６；３９２−４４１）／４Ｒに
ついてそれぞれ５％未満および１６％未満に減少させた。このＤＣ８Ｅ８の阻害活性は、
ノンパラメトリックｔ検定によって解析されたとき、統計学的に有意だった（「ＤＣ８Ｅ
８」、それぞれ図１５Ａおよび１５Ｂにおいてｐ＜０．００１およびｐｐ＜０．０１）。
タウに結合しない無関係な抗体であるＲａｂ５０（Ｍａｃｉｋｏｖａら、１９９２）は、
タウのコンフォーメーション変化を妨げず、チオフラビンＴの蛍光を変化させなかった（
「Ｒａｂ５０」）。ある特定の病理学的に変化したコンフォーメーションのタウを認識す
る抗体ＤＣ１１（Ｖｅｃｈｔｅｒｏｖａら、２００３および米国特許第７，４４６，１８
０号）は、原線維化したタウの形成をさらに促進した；この効果は、ＤＣ１１による異常
なタウ−タウ相互作用および原線維形成に必要とされる病理学的なコンフォーメーション
のタウの安定化を反映し得る。
ＤＣ８Ｅ８は、誤無秩序タウΔ（１−２９６；３９２−４４１／４Ｒ）によるタウ二量
体、三量体およびオリゴマーの形成も阻害した（図１６）。組換えタウΔ（１−２９６；
３９２−４４１）／４Ｒを、線維化アッセイについて上に記載されたようにＤＣ８Ｅ８の
存在下または非存在下において１、４および２０時間インキュベートした。記載の時点に
おいて、ＳＤＳ−サンプルローディング緩衝液を加えることによって、反応を停止させた
。タンパク質の解析のために、１０μｌの各線維化反応物を５〜２０％グラジエントＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲルに充填し、Ｔｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳ緩衝液系において、２
５ｍＡで４０分間、電気泳動した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた後（１０ｍＭ
ＣＡＰＳ，ｐＨ１２において１５０ｍＡで１時間）、その膜を、ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳
において室温で１時間ブロッキングし、次いで、ＰＢＳで１：１，０００希釈されたＨＲ
Ｐ結合体化ＤＣ２５（Ｓｋｒａｂａｎａら（２００６）とともに１時間インキュベートし
た後、大量のＰＢＳで３回洗浄した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃ
ｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を
用いてそのブロットの像を得て、ＬＡＳ３０００イメージングシステム（ＦＵＪＩ Ｐｈ
ｏｔｏ Ｆｉｌｍ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を使用して化学発光シグナルを検出した。化学
発光シグナル強度を、ＡＩＤＡ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍａｇｅ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙ
ｚｅｒ，Ｒａｙｔｅｓｔ，Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ソフトウェア
を使用して定量した。
これらの結果は、ＤＣ８Ｅ８がヒトタウにおいて認識する／結合する４つの結合部位の
１つもしくは複数が、単量体タウのコンフォーメーション変化、タウの線維化およびタウ
凝集体（二量体、三量体および他のオリゴマー）の形成に関わることを明らかにしている
。換言すれば、残基２６７−ＫＨＱＰＧＧＧ−２７３（配列番号９８）（タウタンパク質
の第１リピートドメイン）、２９８−ＫＨＶＰＧＧＧ−３０４（配列番号９９）（タウタ
ンパク質の第２リピートドメイン）、３２９−ＨＨＫＰＧＧＧ−３３５（配列番号１００
）（タウタンパク質の第３リピートドメイン）および３６１−ＴＨＶＰＧＧＧ−３６７（
配列番号１０１）（タウタンパク質の第４リピートドメイン）によって包含されるタウの
４つの領域の１つもしくは複数が、タウの線維化およびタウ凝集体（二量体、三量体およ
び他のオリゴマー）の形成を促進するおよび／またはそれに関わる。
実施例１０：ＤＣ８Ｅ８は、誤無秩序タウの取り込みおよび分解を媒介する
マウスＢＶ２ミクログリア細胞を、１μＭ組換えタウΔ（１−１５０；３９２−４４１
）／４Ｒ単独またはタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４ＲとＤＣ８Ｅ８との混合
物／複合体とともに、種々の時間にわたって６ウェルプレートにおいて処理した。培地を
回収し、細胞を最初にＰＢＳで洗浄し、次いで、弱酸洗浄液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．
２Ｍ酢酸，ｐＨ３）で１分間洗浄した。次いで、洗浄された細胞をＴＴＬ緩衝液（２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ
、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４，Ｒｏ
ｃｈｅ−完全プロテアーゼ阻害剤）中で溶解し、すみやかに液体窒素中で凍結した。得ら
れた細胞抽出物を、先に記載されているように（Ｋｏｓｏｎら、２００８）１２％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲルおよびウエスタンブロットにおいて解析した。簡潔には、タンパク質をニ
トロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）上に移動
させ、ポンソーＳで染色することにより、均一なタンパク質の移動を確かめ、次いで、そ
の膜を、タウ残基３４７〜３５３を認識する、ｐａｎ−タウ抗体と称される（Ａｘｏｎ
Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）ＤＣ２５ハイブリドーマ培
養上清でプロービングした。抗ＧＡＤＰＨ抗体（１：１，０００，Ａｂｃａｍ）を用いた
ウエスタンブロッティングをタンパク質充填コントロールとして使用した。ＤＣ２５ １
次抗体とのインキュベーションに続いて、洗浄、およびＨＲＰに結合体化されたポリクロ
ーナルヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（１：３，０００；Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄ
ｅｎｍａｒｋ）とのインキュベーションを行った。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ
Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｕ
．Ｓ．Ａ）を用いてそのブロットの像を得て、ＬＡＳ３０００イメージングシステム（Ｆ
ＵＪＩ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を使用して化学発光シグナルを検
出した。
タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを、先のパラグラフに記載されたように
単独でまたは１μＭ ｍＡｂ ＤＣ８Ｅ８とともにマウスＢＶ２細胞の培養物に１μＭの
濃度で加えた。２、４、６および１２時間にわたるインキュベーションの後、細胞タンパ
ク質を抽出し、内部移行したタウのレベルをウエスタンブロッティングによって解析した
。Ｐａｎ−タウ抗体ＤＣ２５は、ミクログリア細胞内の誤無秩序タウの存在を示した。ウ
エスタンブロットプロファイルは、誤無秩序タウの分解がＤＣ８Ｅ８の存在下においてよ
り速いことを明らかにした（図１７Ａ）。
ＤＣ８Ｅ８抗体自体もまた、ＢＶ２細胞内に存在することが見出された。図１７Ａ。さ
らに、ＤＣ８Ｅ８は、細胞培地中の可溶性の誤無秩序タウの量を減少させた（これは、細
胞外のタンパク分解の機構の活性化を反映し得る）（図１７Ｂ）。
実施例１１：ＤＣ８Ｅ８は、３７℃において安定である
ＤＣ８Ｅ８（実施例５に記載されたように精製された）をＰＢＳで２ｍｇ／ｍｌの濃度
に希釈し、アリコート（１００μｌ）を３７℃においてインキュベートした。様々な１ヶ
月間隔で、アリコートを−２０℃において凍結した。実験の期間全体にわたって−２０℃
で維持して保管されたＤＣ８Ｅ８のアリコート（２ｍｇ／ｍｌ）を「コントロール」とし
て使用した。４ヶ月後（すべてのサンプルが回収されたとき）、ＤＣ８Ｅ８活性（固相と
しての組換えタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対する結合）、ゆえに３７
℃での保管寿命の安定性の解析を、実施例２に記載されたようにＥＬＩＳＡによって行っ
た。各ＤＣ８Ｅ８アリコートを、２，０００倍（すなわち、２，０００×または１：２，
０００）、４，０００×、８，０００×，１６，０００×、３２，０００×、６４，００
０×，１２８，０００×、２５６，０００×および５１２，０００×希釈した。ＤＣ８Ｅ
８は、活性であり（タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに結合する能力によっ
て測定されたとき）、ゆえに、「コントロール」と比べて、３７℃での４ヶ月間のインキ
ュベーションの後でさえ安定だった（図１８）。
実施例１２：ＤＣ８Ｅ８は、天然のエキソビボ様の条件下において、ヒトＡＤ脳由来お
よびＳＨＲ７２ラットの脳由来の可溶性タウと不溶性タウの両方に結合することおよびそ
れらを免疫沈降させることができる
サルコシル不溶性のミスフォールドされたタウタンパク質を、サルコシル法（Ｇｒｅｅ
ｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，１９９０）を用いて、ヒトＡＤ脳またはタウトラン
スジェニックラット脳（実施例７に記載された系統ＳＨＲ７２）から生化学的に単離した
。タンパク質抽出のために、未固定の凍結ヒトＡＤ脳（移行嗅内皮質（ｔｒａｎｓｅｎｔ
ｏｒｈｉｎａｌ ｃｏｒｔｅｘ），ＢｒａａｋステージＶ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂ
ｒａｉｎ Ｂａｎｋ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手したもの）およびＳＨＲ７２トラ
ンスジェニックラット（等皮質，７．５ヶ月齢動物）組織を、１０体積の氷冷抽出緩衝液
［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡおよび１０
％スクロース（５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、およびＥＤＴＡを含まないプ
ロテアーゼ阻害剤のカクテルＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ製）が補充され
たもの］中でホモジナイズした。そのホモジネートを２０，０００×ｇで２０分間遠心す
ることにより、膜材料を除去した。サルコシル不溶性タウ画分を調製するために、上清に
Ｎ−ラウロイルサルコシン（ＳＩＧＭＡ）を１％の最終濃度になるように補充し、振盪し
ながら室温において１時間インキュベートした。１時間にわたる１００，０００×ｇでの
遠心分離の後、得られた上清を廃棄し、ペレットを、３ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ
、８．０９ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３６．８９ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、２．７ｍＭ（ＫＣｌ））中で１回洗浄した。次いで、オリゴマーおよびポリマー
のミスフォールドされたタウ種（すなわち、疾患タウタンパク質）に濃縮された脳タンパ
ク質画分に相当するそのペレットを、２０％に設定された出力での２０％デューティサイ
クルにおける、ＭＳ７２プローブを備えたＢａｎｄｅｌｉｎ Ｓｏｎｏｐｕｌｓ ＨＤ２
２００／ＵＷ２２００（Ｂａｎｄｅｌｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を
使用した、氷上での２分間の超音波処理によって、１ｍｌのＰＢＳ（５０ｍＭ ＮａＦ、
１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、およびＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤のカクテルＣｏｍ
ｐｌｅｔｅ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）が補充されたもの）に再懸濁した。
疾患タウタンパク質が濃縮された得られた懸濁液（ヒトＡＤ脳とラットＡＤモデルの脳
の両方に由来）を２つの５００μｌの部分に分割し、各部分に、２５μｇの２つの精製さ
れた抗体：ＤＣ８Ｅ８またはコントロール抗体Ｒａｂ５０（狂犬病ウイルスのエンベロー
プタンパク質を認識する；Ｍａｃｉｋｏｖａら、１９９２）のうちの一方を加えた。その
懸濁液を、３６０度回転させながら（ｗｉｔｈ ｈｅａｄ−ｏｖｅｒ−ｔａｉｌ ｒｏｔ
ａｔｉｏｎ）６℃において２時間、その抗体とともにインキュベートした。形成された抗
体−疾患タウ複合体を単離するために、ＰＢＳ中で平衡化された５０μｌのＰｒｏｔｅｉ
ｎ Ｇ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の５０％懸
濁液を、各懸濁反応物に加え、それをさらに６℃において１時間インキュベートした。結
合した抗体−タウ複合体を有するビーズを回収し、ＰＢＳ（５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ
Ｎａ３ＶＯ４、０．０２％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０（ＳＩＧＭＡ）、およびＥＤＴＡ
を含まないプロテアーゼ阻害剤のカクテルＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）
が補充されたもの）で３回洗浄した。結合した抗体複合体を、１００μｌの２００ｍＭギ
酸ｐＨ２．７中での３回の別個の５分間のインキュベーションによってビーズから溶出し
た。１００μｌの溶出液をプールし、凍結乾燥し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプ
ルローディング緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）に溶解し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルにおいて分離し、ニトロセルロース膜上に移動させ、上記のようにＨＲＰ結合体化さ
れた（Ｋｅｍｅｎｔｅｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）ｐａｎ−タウ抗体ＤＣ２５（２Ｎ４Ｒタウの
エピトープ３４７−３５３，Ａｘｏｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕ
ｓｔｒｉａ）とのインキュベーションによってタウタンパク質を検出した。インキュベー
ション（室温での１時間）の後、ＰＢＳ中の０．２％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０（ＳＩ
ＧＭＡ）で洗浄した（３回）。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍ
ｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅシステム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ）
を用いてそのブロットの像を得て、ＬＡＳ３０００イメージングシステム（ＦＵＪＩ Ｐ
ｈｏｔｏ Ｆｉｌｍ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を使用してシグナルを検出した。
ＤＣ８Ｅ８は、すべての形態の疾患タウタンパク質：アルツハイマー病を有する患者の
脳に存在するオリゴマーおよびポリマーのミスフォールドされたタウ種を認識し、標的化
し、それに結合する（図１９Ａ）。図１９Ａにおけるレーン１は、ヒトＡＤ脳から生化学
的に抽出された病理学的タウ種を示している。レーン３は、ＤＣ８Ｅ８との免疫沈降によ
って認識され、結合され、単離されたタウ種を示している。ＤＣ８Ｅ８に結合された／免
疫沈降された疾患タウ種のパターンは、生化学的に抽出されたタウタンパク質のパターン
だった。これらの結果は、ヒト脳における、ＤＣ８Ｅ８による病理学的タウ種の効率的な
エキソビボ認識を示しており、すなわち、それらのタンパク質がインビボ様の未改変の形
態である抽出物において、ＤＣ８Ｅ８がインビボにおいて疾患タウ種を標的化することが
できるという有用な治療特性を有することを示している。コントロール抗体Ｒａｂ５０（
「Ｍｏｃｋ抗体」、レーン２）は、脳抽出物中に存在するいずれのタウタンパク質も認識
しないことから、タウタンパク質へのＤＣ８Ｅ８の結合が特異的であることが確かめられ
る。
図１９Ｂは、タウタンパク質の免疫精製のために使用されたｍｏｃｋ抗体（Ｒａｂ５０
）およびＤＣ８Ｅ８（それぞれレーン２および３）の量を示している。ＤＣ８Ｅ８の重鎖
および軽鎖の位置もまた、図１９Ａのレーン３に表示されている。より多い量の抗体鎖の
存在は、疾患タウのパターンを歪める。
ＤＣ８Ｅ８は、アルツハイマー病のＳＨＲ７２ラットモデルの脳において、すべての形
態のミスフォールドされた（疾患の）タウも認識し、標的化する。図２０Ａのレーン１は
、トランスジェニックラットの脳から生化学的に抽出された疾患タウ種を示している。ト
ランスジェニックラット脳抽出物とのＤＣ８Ｅ８抗体のインキュベーションによって、そ
の脳に存在する疾患タウ種の免疫精製が可能になった（図２０Ａ、レーン３）。ＤＣ８Ｅ
８によって精製されたタウ種は、生化学的に単離されたタウタンパク質（図２０Ａ、レー
ン１）のパターンと同一のパターンを示し、それは、ＤＣ８Ｅ８が、そのトランスジェニ
ックラット脳に存在するすべての病理学的タウ種を認識し、それに結合することを確証さ
せる。タウタンパク質のバンドパターンのわずかな歪みは、ＤＣ８Ｅ８抗体の重鎖および
軽鎖の存在によって引き起こされる（図２０Ａ、レーン３に表示されている）。Ｍｏｃｋ
抗体Ｒａｂ５０（図２０Ａ、レーン２）は、いずれのタウタンパク質にも結合しなかった
。
図２０Ｂは、ｍｏｃｋ抗体（Ｒａｂ５０）、およびアルツハイマー病のトランスジェニ
ックモデルのラットの脳抽出物からのタウタンパク質の免疫精製のために使用されたＤＣ
８Ｅ８（それぞれレーン２および３）の量を示している。ＤＣ８Ｅ８の重鎖および軽鎖の
位置は、図２０Ａのレーン３にも表示されている。より多い量の抗体鎖の存在は、疾患タ
ウのパターンをわずかに歪めた。
実施例１３：ＤＣ８Ｅ８モノクローナル抗体は、トランスジェニックラットＳＨＲ７２
の脳から病理学的タウを除去する
ＤＣ８Ｅ８またはＲａｂ５０（狂犬病ウイルス（ｖｉｒｕｓ ｒａｂｂｉｅｓ）を認識
するネガティブコントロール抗体）を産生するハイブリドーマ細胞を、１０％ＮＨＳおよ
び１％グルタミンを含むＤＭＥＭ中で培養した。それらの細胞をＢｕｅｒｋｅｒカウント
チャンバーにおいて計数した。１ミリリットルあたり５００，０００個の細胞を含む細胞
懸濁液を１００×ｇで５分間遠沈し、ペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。その細胞
懸濁液を再度、１００×ｇで５分間遠沈し、ペレットを５μｌのＰＢＳに再懸濁した。
トランスジェニックラットＳＨＲ７２（６ヶ月齢）をこれらの実験のために使用した（
１群あたり３匹のラット）。手術の少なくとも１時間前に、免疫抑制薬Ｓａｎｄｉｍｍｕ
ｎ（１５ｍｇ／ｋｇ）をラットの皮下に適用した。トランスジェニックラットを、Ｔｉｌ
ｅｔａｍｉｎｅ−Ｚｏｌａｚｅｐａｍ（１００ｍｇ／ｍｌ）／Ｘｙｌａｚｉｎｅ（２０ｍ
ｇ／ｍｌ）の３：５比での混合物の腹腔内注射によって麻酔した。麻酔薬の投与は、以下
のとおりだった：Ｚｏｌｅｔｉｌ（３０ｍｇ／ｋｇ）およびＸｙｌａｒｉｅｍ（１０ｍｇ
／ｋｇ）。麻酔されたラットの頭部を、各動物の外耳道に固定アームを留置することによ
って定位装置（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ
，ＵＳＡ）に固定した。選択された定位座標（ブレグマに対して、外側５ｍｍ；前後４ｍ
ｍ；背腹側−５ｍｍ）に従って、手術用ドリルを使用して各動物の頭に穴を開けた。ＤＣ
８Ｅ８（１０５細胞）またはＲａｂ５０（１０５細胞）を産生するハイブリドーマ細胞懸
濁液を、ラットの脳の海馬の海馬采に両側注射した。手術の直後に、Ｋｅｔｏｎａｌ（５
ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内投与した。Ｓａｎｄｉｍｍｕｎ（１５ｍｇ／ｋｇ）を、適用後８日
間、皮下に適用した。Ｅｎｒｏｘｉｌ（２０ｍｇ／ｋｇ／２４時間）を１０日間にわたっ
て飲料水において投与した。
外科手技の２週間後、ラットをＺｏｌｅｔｉｌ（３０ｍｇ／ｋｇ）およびＸｙｌａｒｉ
ｅｍ（１０ｍｇ／ｋｇ）との混合物によって麻酔した。２〜５分後、ラットを解剖用ステ
ージに載せ、開腹した。灌流の前に、血液血清中のタウおよび抗体のレベルの解析のため
に血液を回収した。灌流針を左心室に留置し、蠕動ポンプ（Ｔｙｐｅ ｐｐ１−０５、Ｚ
ａｌｉｍｐ、速度−１０×、程度７−２２ｍｌ／１分という灌流液体）を使用してＰＢＳ
をラットに２分間灌流した。各ラットを断頭し、その頭蓋をピーアンによって（ｂｙ ｐ
ａｅａｎ）開け、脳（脊髄の一部とともに）を慎重に取り出した。脳を矢状方向に（ｓａ
ｇｉｔａｌｌｙ）２つの部分に切断した；右側を４％ＰＦＡ（４℃）で一晩固定した。左
側を切断し、脳幹および２つの皮質領をすみやかに液体窒素中で凍結した。
処置された動物の血清中のＤＣ８Ｅ８抗体の量を、固相としてタウΔ（１−１５０；３
９２−４４１）４Ｒを使用する、下記の実施例１９に記載されるようなＥＬＩＳＡによっ
て測定した。各動物の血清（Ａ、Ｂ、Ｃ）を、１００×から１２，８００×まで段階希釈
した（図２１Ａ）。ＤＣ８Ｅ８抗体の血清濃度を、標準物質として、精製されたＤＣ８Ｅ
８を使用して測定した。ＤＣ８Ｅ８は、処置動物において４６６、２００および２７３ｎ
ｇ／ｍｌの濃度に達した（それぞれＤＣ８Ｅ８処置群のＡ、Ｂ、Ｃ）。
各処置動物の血清中のタウの濃度も測定した。これは、Ｉｎｎｏｔｅｓｔ ｈＴＡＵ
ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を製造者のプロトコル
に従って使用して行った。ＤＣ８Ｅ８による処置は、血液中への抗体−タウ複合体の運搬
を引き起こし、タウは、３５０ｐｇ／ｍｌの平均濃度に達した。このＤＣ８Ｅ８の効果は
、脳から病理学的タウタンパク質を排除するのを助ける。他方で、狂犬病ウイルスのエン
ベロープタンパク質を認識する（Ｍａｃｉｋｏｖａら、１９９２）ｍｏｃｋ抗体（Ｒａｂ
５０）で処置された動物の血清中においてタウタンパク質は検出されなかった。グラフは
、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）とともに平均値を示している（図２１Ｂ）。
固定した脳組織をパラフィンに包埋し、ミクロトームにおいて切断した。８μｍパラフ
ィン包埋切片において免疫組織化学検査を行った。組織切片を、沸騰している抗原アンマ
スキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ
，ＵＳＡ）で２０分間前処理し、８５％ギ酸（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ
，Ｇｅｒｍａｎｙ）で１分間処理した。ブロッキングした後、組織切片をｍＡｂ ＤＣ８
Ｅ８とともに一晩インキュベートした後、洗浄し、ビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔａｓｔ
ａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とと
もにインキュベーションした（１時間、室温）。洗浄した後、切片を室温において６０分
間、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ
ＡＢＣ Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と反応させた。免疫反応を
、ペルオキシダーゼ基質キットＶＩＰ（Ｖｅｃｔｏｒ ＶＩＰ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて可視化した。上オリ
ーブ複合体を、ＤＣ８Ｅ８神経細胞内シグナルの定量のために使用した。総シグナルを個
々の運動ニューロン（１切片あたり少なくとも１５個のニューロン）において定量した。
ＡＩＤＡ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍａｇｅ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｒａｙｔｅｓ
ｔ，Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ソフトウェアを使用して画像解析を
行った。すべての処置動物の切片においてカウントを行い、次いで、ノンパラメトリック
なマン・ホイットニー検定を用いて統計学的に評価した。
ｍｏｃｋで処置された（図２２Ａ，右パネル）およびＤＣ８Ｅ８で処置された（図２２
Ａ，左パネル）動物由来の切片の上オリーブ複合体における病理学的タウの量の定量（図
２２Ｂ）は、ｍｏｃｋで処置された動物と比べて、ＤＣ８Ｅ８で処置された３匹すべての
動物において、試験された脳領域における病理学的タウの量の減少を示した（ｐ＜０．０
００１）（図２２Ａおよび２２Ｂ）。
実施例１４：タウの治療用エピトープのＤＣ８Ｅ８の認識に影響するＤＣ８Ｅ８結合部
位内の残基のマッピング
ａ）一本鎖ＤＣ８Ｅ８抗体のクローニングおよび抗体結合部位の突然変異誘発。タウタ
ンパク質の認識に必須のｍＡｂ ＤＣ８Ｅ８のアミノ酸残基のマッピングを助けるために
、完全長ＤＣ８Ｅ８ ｍＡｂの機能的な一本鎖バージョン（ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ）を調製し
た。これは、実施例３に記載されたように調製されたＤＣ８Ｅ８の軽鎖および重鎖のｃＤ
ＮＡを用いて行われた。
ＤＣ８Ｅ８の可変領域を、ＮｃｏＩ（順方向プライマー：５’−ＡＴＡＴＴＡＣＣＡＴ
ＧＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＴＣＡＣＡＧ−３’（配列番号１５５））およびＸｈｏＩ（
逆方向プライマー：５’−ＡＴＡＴＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧ
ＡＧＧＴ−３’（配列番号１５６））制限酵素に対する制限酵素認識部位を有するクロー
ニングプライマー、ならびに重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結するために使用された
オリゴヌクレオチドリンカー配列（ＶＨ−ＬＩＮＫ−Ｆ：５’−ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧ
ＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＡＴＧＣＡＧＧＴＣＣＡＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧ
−３’（配列番号１５７）；ＶＬ−ＬＩＮＫ−Ｒ：５’−ＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣ
ＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧＴＴＴＧＡＴ
ＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３’（配列番号１５８））を使用するＰＣＲによって
さらに増幅した（このリンカー配列は、Ｋｒｅｂｂｅｒら、１９９７に従ってデザインさ
れた）。単離されたＰＣＲ産物の消化（ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ酵素を使用する）および
アガロースゲル電気泳動を介した精製の後、フラグメントを、Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼ（
Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化した
ｐＥＴ２２ｂプラスミドにクローニングした。細菌株ＤＨ５αを、得られたプラスミドの
増幅のために使用し、選択されたクローンにおける正確な挿入位置を制限酵素解析によっ
て確かめた。得られた一本鎖ＤＣ８Ｅ８コンストラクト（ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ）の配列の正
確さを、３１３０Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ，ＵＳＡ）を使用するＤＮＡ配列決定によって確かめた。
ｂ）アラニンスキャニング突然変異誘発による、病理学的タウのＤＣ８Ｅ８の認識に影
響するＤＣ８Ｅ８結合部位における残基の同定。タウへのＤＣ８Ｅ８の結合に影響する残
基を同定するために、ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの選択された部位（太字かつ下線、下記を参照の
こと）においてＡｌａスキャニング突然変異誘発を行った。Ａｌａ置換のために選択され
たアミノ酸は、ＭａｃＣａｌｌｕｍら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６）の成果に基づ
いて特定された。ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの突然変異誘発を、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓ
ｅｌｌによる“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａ
ｎｕａｌ”（２００１）に記載されている標準的な手順によるＰＣＲにおいて変異体オリ
ゴヌクレオチドを使用するオーバーラップ伸長法によって行った。
変異体一本鎖を、元の各ＤＣ８Ｅ８配列に対して下記に列挙する。変異された残基は、
太字かつ下線が引かれている。変異体一本鎖の名称は、コンストラクトの番号、可変重鎖
または軽鎖の頭字語（ＶＨまたはＶＬ）、ＤＣ８Ｅ８における元のアミノ酸の一文字コー
ドに続いて、軽鎖および重鎖配列のそれぞれ配列番号１４１および配列番号１３８におけ
るその位置、次いで、置換アラニンに対するＡからなる。例えば、変異体１−ＶＬ−Ｎ３
１Ａは、一本鎖変異体番号１に対応し、ここで、その可変軽鎖は、アスパラギン３１（Ｎ
３１）をアラニン（Ａ））で置き換えることによって、３１位（ＤＣ８Ｅ８に対して）に
おいて変異された：
ＤＣ８Ｅ８軽鎖可変領域（ＣＤＲに下線が引かれている）：
［配列番号１４１］：

ＣＤＲ１［配列番号１１７］（変異された残基は太字かつ下線が引かれている）：

（ＣＤＲ１の元のＤＣ８Ｅ８配列）における変異
１−ＶＬ−Ｎ３１Ａ［配列番号２４７］
２−ＶＬ−Ｒ３３Ａ［配列番号２４８］
３−ＶＬ−Ｙ３８Ａ［配列番号２４９］
ＣＤＲ２の前にあるフレームワーク領域ＦＲ２：

（フレームワーク領域ＦＲ２の元のＤＣ８Ｅ８配列）における変異。
４−ＶＬ−Ｙ５５Ａ［配列番号２５２］
ＣＤＲ２［配列番号１１８］：

（配列番号１１８）（ＣＤＲ２の元のＤＣ８Ｅ８配列）における変異
５−ＶＬ−Ｗ５６Ａ［配列番号２５３］
ＣＤＲ３［配列番号１１９］：

（配列番号１１９）（ＣＤＲ３の元のＤＣ８Ｅ８配列）における変異
６−ＶＬ−Ｋ９５Ａ［配列番号２５４］
７−ＶＬ−Ｑ９６Ａ［配列番号２５５］
８−ＶＬ−Ｓ９７Ａ［配列番号２５６］
９−ＶＬ−Ｆ９８Ａ［配列番号２５７］
１０−ＶＬ−Ｙ９９Ａ［配列番号２５８］
１１−ＶＬ−Ｌ１００Ａ［配列番号２５９］
１２−ＶＬ−Ｒ１０１Ａ［配列番号２６０］
ＤＣ８Ｅ８重鎖可変領域（ＣＤＲに下線が引かれている）：
［配列番号１３８］：

ＣＤＲ１［配列番号１２０］（変異された残基は太字かつ下線が引かれている）：

（配列番号１２０）（ＣＤＲ１の元のＤＣ８Ｅ８配列）における変異
１４−ＶＨ−Ｙ３２Ａ［配列番号２６１］
１５−ＶＨ−Ｖ３３Ａ［配列番号２６２］
ＣＤＲ２の前にあるフレームワーク領域ＦＲ２：

（配列番号１６２）（フレームワーク領域ＦＲ２の元のＤＣ８Ｅ８配列）における変異
１６−ＶＨ−Ｅ５０Ａ［配列番号２６３］
ＣＤＲ２［配列番号１２１］：

（配列番号１２１）（ＣＤＲ２の元のＤＣ８Ｅ８配列）における変異
１７−ＶＨ−Ｆ５２Ａ［配列番号２６４］
１８−ＶＨ−Ｓ５７Ａ［配列番号２６５］
ＣＤＲ３［配列番号１２２］：

（配列番号１２２）（ＣＤＲ３の元のＤＣ８Ｅ８配列）における変異
１９−ＶＨ−Ｄ９９Ａ［配列番号２６６］
２０−ＶＨ−Ｙ１００Ａ［配列番号２６７］
２１−ＶＨ−Ｙ１０１Ａ［配列番号２６８］
２２−ＶＨ−Ｇ１０２Ａ［配列番号２６９］
組換えＤＣ８Ｅ８抗体バリアントの解析用発現および予備発現：野生型抗体およびその
変異体（それらのすべてがＨｉｓタグ化されている）のｐＥＴ２２ｂ−ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ
ＤＮＡコンストラクトを、産生株ＢＬ２１（ＤＥ３）の大腸菌細胞に形質転換した。得
られたクローンを、まず、組換えｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの産生について確かめた。形質転換後
に得られた個々のコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが補充された２ｍｌのＬ
Ｂ培地に接種し、絶えず撹拌しながら３７℃で５時間生育した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎ
ｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ２００１）。各培養物の１００μｌアリコートを取り出し、その体
積の２／３の１００％グリセロールと混合し、後の使用のために−８０℃で凍結保存した
。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度
まで加え、さらに３時間インキュベーションを続けることによって、組換えタンパク質の
発現を誘導した。卓上遠心機における４℃、１０，０００×ｇでの１分間の遠心分離によ
って細胞を回収し、上清を廃棄し、細胞ペレットを１×ＳＤＳ−サンプル緩衝液（Ｌａｅ
ｍｍｌｉ １９７０）に再懸濁し、５分間煮沸した。そのサンプルを１０，０００×ｇで
５分間遠心し、上清（細菌溶解産物）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）によって解析した。分離されたタンパク質を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒ
ｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ２５０（ＳＩＧＭＡ）で染色することによって可視化した
。
各ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ抗体（天然および変異体）の予備発現のために、それぞれの発現プ
ラスミドを含む細菌細胞を培養し、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌによる“Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”（２００
１）に記載されているように誘導した。形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピ
シリンを含む１００〜５００ｍｌのＬＢ培地中で３７℃、２３０ｒｐｍにおいて生育した
。その培養物の６００ｎｍにおける吸光度が０．８〜１．０に達したら、ＩＰＴＧを１ｍ
Ｍの最終濃度まで加えて、ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの発現を誘導した。３７℃での３時間にわた
るさらなるインキュベーションの後、３，０００ｇ、４℃での１５分間の遠心分離によっ
て細胞を回収した。細胞ペレットを１０ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ
６．９、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）に再懸濁し、ＴＴ−１３チップ（
５０％デューティサイクル，５０Ｗ電力出力，Ｓｏｎｏｐｕｌｓ ＨＤ ２２００，Ｂａ
ｎｄｅｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、３０秒間作動３０秒間休止を６回行う氷上
での超音波処理を行った。溶解産物を遠心分離（２１，０００×ｇ、１５分間、４℃）に
よって浄化した。溶解産物を０．４５μｍメンブランフィルターで濾過し、使用するまで
−８０℃において保管した。誘導の成功および発現のレベルを調べるために、１ｍｌの誘
導された培養物を回収し、細胞を上記のように遠心分離によって回収し、１００μｌの１
×ＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁し、９５℃において５分間煮沸し、次いで、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって解析した（図２３Ａ）。細胞質溶解産物をタウタンパク質の結合／検出（
ウエスタンブロット解析によるもの）およびタウに対する組換え抗体の親和性のＳＰＲ測
定のために使用した（これらの両方ともが、天然および変異体ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ抗体の活
性の尺度である）。
実施例１５：モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８の組換えｓｃＦＶフラグメント（ｓｃＤＣ
８Ｅ８ｖ）は病理学的タウ（タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ）を認識する
病理学的形態のタウへのｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの結合特性を測定するために、ｓｃＤＣ８Ｅ
８ｖを発現している細菌由来のタンパク質溶解産物をＴＢＳ−Ｔ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）に１６倍希釈し、
それを使用して、５００、２５０および１２５ｎｇの組換え切断型タウタンパク質（タウ
Δ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ）および組換えＣ末端切断型タウタンパク質（
タウΔ２２８−４４１）を含むニトロセルロース膜の上にのせた（タンパク質のポンソー
Ｓ染色、図２３Ｂ）。結合したｓｃＤＣ８Ｅ８ｖを、抗６ｘｈｉｓＴａｇ（配列番号１６
３）抗体（Ｎｏ．Ａ００１７４；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，Ｕ
ＳＡ）を用いた免疫ブロット法によって検出し、抗ウサギＨＲＰ結合体化抗体（ＤＡＫＯ
Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて可視化した（図２３Ｃ）。ＬＡＳ３
０００イメージングシステム（ＦＵＪＩ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）
を使用して検出されるＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍ
ｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて、そのブ
ロットの像を得た。
ウエスタンブロット解析は、組換え一本鎖抗体（ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ）が切断型タウ［タ
ウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ］を検出することを示した。ｓｃＤＣ８Ｅ８
ｖは、インタクトなＤＣ８Ｅ８によって認識される４つの治療用エピトープのいずれも含
まないコントロール切断型タウタンパク質タウΔ２２８−４４１を認識しないので、その
結合は、特異的である（図２３Ｃ レーン４）。タウタンパク質を含むニトロセルロース
膜（図２３Ｂに示されるように充填されたもの）を、ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖを発現しないコン
トロール細菌由来の溶解産物でプロービングしても、いかなるシグナルも生成されなかっ
た（図２３Ｄ）。
実施例１６：モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８の組換えＳＣＦＶフラグメント（ｓｃＤＣ
８Ｅ８ｖ）は、ＤＣ８Ｅ８抗体に類似のタウ結合特性を示し、病理学的タウ（タウΔ（１
−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ）を選択的に認識し、それを生理学的な天然のタウ（
タウ２Ｎ４Ｒ）と有意に区別する
組換え一本鎖抗体ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖのタウ結合特性を定量するために、病理学的な切断
型タウ（タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ）（図２４Ａ）および正常なヒト
４リピートタウアイソフォーム２Ｎ４Ｒ（図２４Ｂ）に対するｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの結合を
測定するＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００，Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって
動態親和性の測定を行った。この目的を達成するために，１１，０００ＲＵのウサギポリ
クローナル抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｎｏ．Ａ００１７４；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔ
ａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）をＣＭ５センサーチップ上に固定化した。すべての実験を、ラ
ンニング緩衝液として、０．００５％のＰ２０を含むＰＢＳ ｐＨ７．４（ＰＢＳ−Ｐ）
中、２５℃において行った。組換えＨｉｓタグ化ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖを、６０ＲＵの固定化
レベルに達するように分析用フローセルにおいて捕捉し、既知濃度の各タウタンパク質ま
たはＰＢＳ−Ｐコントロールサンプルを、１００μｌ／分の流速でセンサーチップの上に
注入した。動態結合データを二重参照し、ＢＩＡ評価ソフトウェア４．１（Ｂｉａｃｏｒ
ｅ ＡＢ）によって１：１相互作用モデルに当てはめた。動態速度定数を全体的に近似さ
せ、最大レスポンスを局所的に当てはめ、バルクレスポンスを０に設定した。
動態測定は、正常タウ２Ｎ４Ｒよりも病理学的なＡＤタウΔ（１−１５０；３９２−４
４１）／４Ｒに対するｓｃＤＣ８Ｅ８ｖのより高い会合速度定数およびより低い解離速度
定数を示した（図２４Ｃ）。その結果として、切断型ＡＤタウに対するｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ
の親和性は、完全長タウアイソフォーム２Ｎ４Ｒよりも高い（平衡結合定数ＫＡのより高
い値）。これらの測定から、ＤＣ８Ｅ８抗体の一本鎖バージョン（ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ）が
、親の完全長ＤＣ８Ｅ８抗体と同様に、コンフォーメーションが変化した病理学的タウタ
ンパク質に対して結合優先性を示すことが確かめられた。したがって、組換えｓｃＤＣ８
Ｅ８ｖは、その結合特性に関与するＤＣ８Ｅ８抗体結合部位内のアミノ酸残基の同定に適
している。
実施例１７：病理学的タウエピトープのｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ／ＤＣ８Ｅ８の認識に影響す
るｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ結合部位における残基の同定
ＤＣ８Ｅ８−抗原相互作用に影響するいくつかのアミノ酸残基は、ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖ結
合部位の残基のアラニンスキャニング突然変異誘発によって決定された。軽鎖および重鎖
における潜在的な抗原接触残基を、ＭａｃＣａｌｌｕｍら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９
９６）の成果に基づいて特定し、実施例１４に記載されたようにアラニンに突然変異させ
た。続いて、ｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの変異体バージョンをＢＬ２１大腸菌株において発現させ
た（図２５Ａ，一本鎖タンパク質は星印によって示されている）。変異されたｓｃＤＣ８
Ｅ８ｖの結合特性を、ウエスタンブロッティングによって解析した（図２５Ｂ〜Ｃ）。図
２５Ｂは、様々な量の切断型タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒタンパク質を
含むニトロセルロース膜のポンソーＳ染色を示している。同一の膜を、様々な変異体一本
鎖抗体による切断型タウの検出のために使用した（図２５Ｃ）。
これらの結果に基づいて、ＤＣ８Ｅ８の可変領域におけるアミノ酸残基を以下のとおり
３つの主要なカテゴリーに分類した：
カテゴリー１：このカテゴリーに列挙される残基（太字）は、病理学的な切断型ＡＤタ
ウ（タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ）へのｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの結合に最も
寄与した。これらの残基のいずれか１つのアラニンへの変異は、タウタンパク質上のＤＣ
８Ｅ８エピトープの認識を最も妨げた。
ＤＣ８Ｅ８軽鎖におけるカテゴリー１残基：
ＣＤＲＬ１［配列番号１１７］における３１位のアスパラギン
ＣＤＲＬ１［配列番号１１７］における３８位のチロシン
ＣＤＲＬ３［配列番号１１９］における９７位のセリン
ＤＣ８Ｅ８重鎖におけるカテゴリー１残基：
ＣＤＲＨ２［配列番号１２１］の前にあるＦＲＨ２における５０位のグルタミン酸
ＣＤＲＨ３［配列番号１２２］における１０１位のチロシン
カテゴリー２：このカテゴリーに列挙される残基は、病理学的タウ（タウΔ（１−１５
０；３９２−４４１）／４Ｒ）へのｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの結合に寄与する。これらの残基の
いずれか１つのアラニンへの変異は、切断型ＡＤタウ（タウΔ（１−１５０；３９２−４
４１）／４Ｒ）に対するｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの反応性を低下させるが、その反応性をカテゴ
リー１残基に対する変異よりも低い程度にまで妨げる：
ＤＣ８Ｅ８軽鎖におけるカテゴリー２残基：
ＣＤＲＬ２［配列番号１１８］の前にあるフレームワーク領域ＦＲＬ２における５５位の
チロシン
ＣＤＲＬ３［配列番号１１９］における９５位のリジン
ＤＣ８Ｅ８重鎖におけるカテゴリー２残基：
ＣＤＲＨ２［配列番号１２１］における５７位のセリン
ＣＤＲＨ３［配列番号１２２］における１００位のチロシン
ＣＤＲＨ３［配列番号１２２］における１０２位のグリシン
カテゴリー３：この最後のカテゴリーに列挙される残基は、病理学的なＡＤタウ（タウ
Δ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ）へのｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの結合に最も寄与しな
い。これらの残基のアラニンへの変異は、切断型タウ（タウΔ（１−１５０；３９２−４
４１）／４Ｒ）に対するｓｃＤＣ８Ｅ８ｖの反応性を変化させない：
軽鎖におけるカテゴリー３残基：
ＣＤＲＬ１［配列番号１１７］における３３位のアルギニン
ＣＤＲＬ２［配列番号１１８］における５６位のトリプトファン
ＣＤＲＬ３［配列番号１１９］における９６位のグルタミン
ＣＤＲＬ３［配列番号１１９］における９８位のフェニルアラニン
ＣＤＲＬ３［配列番号１１９］における９９位のチロシン
ＣＤＲＬ３［配列番号１１９］における１００位のロイシン
ＣＤＲＬ３［配列番号１１９］における１０１位のアルギニン
重鎖におけるカテゴリー３残基：
ＣＤＲＨ１［配列番号１２０］における３２位のチロシン
ＣＤＲＨ１［配列番号１２１］における３３位のバリン
ＣＤＲＨ２［配列番号１２１］における５２位のフェニルアラニン
ＣＤＲＨ３［配列番号１２２］における９９位のアスパラギン酸
実施例１８：治療用タウエピトープによる能動ワクチン接種：タウ上のＤＣ８Ｅ８結合
エピトープの１つに基づくワクチン用の免疫原の調製およびワクチン投与
ａ．ペプチド：ヒトタウタンパク質２Ｎ４Ｒの合成フラグメントからなるペプチド免疫
原を、Ａｎｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）およびＥＺＢｉｏｌａ
ｂ，ＵＳＡが９５％より高い純度で合成した。各ペプチド配列を、タウ線維化／凝集に関
わるおよび／またはそれを促進すると考えられている配列の少なくとも１つを含むように
デザインした（新規標的「治療用エピトープ」）（そのエピトープは、実施例１〜１１に
記載されたアッセイによって、ＤＣ８Ｅ８への結合部位として上記で同定された）。図２
６Ａを参照のこと。これらの４つの配列は、本明細書中で「治療用エピトープ」とも称さ
れる（下記を参照のこと）。これらのエピトープは、タウ線維化／ＰＨＦ構築にとって重
要なタウ−タウ相互作用モチーフ（凝集エピトープ）に相当する。ゆえに、これらの戦略
的に重要な治療用エピトープの標的化は、ＡＤおよび関連タウオパチーの処置を成功させ
得る。さらに、いくつかのタウエピトープの標的化は、自己免疫性応答を誘発し、その疾
患を潜在的に悪化させると考えられているので（Ｆｕｒｌａｎら、２００３；Ｇｒｕｄｅ
ｎら、２００４）、上記のような特異的な抗タウ治療の使用は、ランダムに選択されたタ
ウエピトープに依存する、目標が広範な治療よりも安全であることを証明するだろう。
したがって、タウベースの免疫療法の治療的な可能性をさらに測定するために、タウペ
プチドのいくつかのセットを免疫原として使用するために指定した。それらの残基のすべ
てが、４４１アミノ酸残基を有する完全長タウ２Ｎ４Ｒの残基を参照する。免疫原の第１
セットは、配列番号１タウ２５１−ＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫ
ＶＱＩＩＮＫ−２８０；配列番号２タウ２５６−ＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧ
ＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳ−２８５；配列番号３タウ２５９−ＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰ
ＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱ−２８８；配列番号４タウ２７５−ＶＱＩＩＮＫ
ＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧ−３０４；配列番号５タウ２０１−
ＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲ−２３０；配列番号６
タウ３７９−ＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬ−４０８
；配列番号７タウ１８１−ＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳ
ＲＳ−２１０；配列番号８タウ３００−ＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫ−３１７
；および配列番号１０８タウ２９４−ＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ−３０５で構成された。
これらの配列のうちのいくつかは、以前にＡＤタウ病理に見られたリン酸化（ｐｈｏｓｈ
ｏｒｙｌａｔｅｄ）エピトープを有する。したがって、タウペプチド配列番号５は、２１
７位にリン酸化トレオニンを含み、タウペプチド配列番号６は、３９６位および４０４位
にリン酸化セリン残基を含み、タウペプチド配列番号７は、２０２位にリン酸化セリンお
よび２０５位にトレオニンを含む。タウペプチド配列番号２を非リン酸化型およびリン酸
化型で合成した。そのリン酸化型は、２６２位にリン酸化セリン残基を含む。
このセットのうち、免疫原の１つのサブセット（タウペプチド配列番号１〜４および１
０８）は、配列番号９８（タウ２６７−ＫＨＱＰＧＧＧ−２７３）または配列番号９９（
タウ２９８−ＫＨＶＰＧＧＧ−３０４）のいずれかによって表される治療用エピトープの
うちの１つを含む。タウペプチドの別のサブセット（配列番号５〜７）は、アルツハイマ
ー病および他のタウオパチーに見られるリン酸化部位を含む。タウペプチド配列番号８は
、述べられたエピトープのいずれも有さず、コントロールとして使用された（図２６）。
ペプチドの第２のセットは、配列番号９から９７で構成され、それらは、ヒトタウ２Ｎ
４Ｒの残基２４４〜３９０にわたって一部重複する配列である。これらのペプチドの各々
は、異なるタウベースの環境においてタウ治療用エピトープ配列のうちの１つを含む。換
言すれば、各サブセットにおいて、エピトープ＃１から＃４の各々は、そのＮ末端とＣ末
端の両方において異なるタウ残基によって囲まれている（図２６）。
ｂ．ワクチンとして使用するための結合体化：タウペプチド配列番号２、４、７および
１０８を、システイン結合を介してキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合
体化した。
この目的を達成するために、タウペプチド配列番号２、４、７および１０８を、ＫＬＨ
タンパク質の表面上にペプチドの配向結合を得る目的で、Ｎ末端に位置する余分なシステ
イン残基を有するシステイン付加（ｃｙｓｔｅｉｎａｔｅｄ）ペプチドとして合成した。
ペプチドを、二機能性架橋剤Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエス
テル（ＧＭＢＳ）を介してＫＬＨキャリアに結合させた。結合体化反応物を調製するため
に、２０ｍｇのＫＬＨ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、１０分間静かに混合することによっ
て結合体化緩衝液（０．９Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に溶解して
、１０ｍｇ／ｍｌの濃度にした。マレイミド活性化ＫＬＨを調製するために、２ｍｇの活
性な二機能性架橋剤ＧＭＢＳを５０μｌの無水ジメチルホルムアミドに溶解し、２ｍｌの
ＫＬＨ溶液と室温において１時間混合した。続いて、結合体化緩衝液において平衡化され
た５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に
おいて、未反応のＧＭＢＳを除去した。ペプチドとマレイミド活性化ＫＬＨとの１：１比
（ｗ／ｗ、２０ｍｇのペプチド）で室温（２５℃）において２時間、結合体化を行った。
得られた結合体を１００倍過剰のＰＢＳに対して透析し、４回の透析緩衝液の交換により
、未結合体化ペプチドを除去した。透析の後、結合体を２℃、２１，０００×ｇで１５分
間遠心した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して測定されるとき、透析緩衝液中に遊離ペプチド
が存在しないことによって、結合体化の完成度を確かめた。その結合体を等分し、使用す
るまで−２０℃で保管した。
ｃ．ワクチンの調製：アルミニウム／ミョウバンアジュバントＡｄｊｕＰｈｏｓ（Ｂｒ
ｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含む免疫用量を調製するために
、２００μｇの各それぞれのタウペプチド結合体（１５０μｌのＰＢＳに溶解されたもの
）を、３００μｌという最終的な投与体積において１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）比において
ＡｄｊｕＰｈｏｓアジュバントで乳化した。各懸濁液／エマルションを、回転させながら
４℃で一晩インキュベートすることにより、ペプチドをリン酸アルミニウム粒子に吸着さ
せた。
フロイント完全アジュバントを含む免疫用量を調製するために、２００μｇの各それぞ
れのタウペプチド結合体（１５０μｌのＰＢＳに溶解されたもの）を、３００μｌという
最終的な投与体積においてフロイント完全アジュバントで１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）乳化
した。その後の追加免疫の投与のために、免疫原を同様に調製したが、フロイント不完全
アジュバントで乳化した。
ｄ．ワクチン投与：調製されたワクチン用量を、ヒト切断型タウ導入遺伝子を有するタ
ウトランスジェニックラット（タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒを発現する
、上記の実施例７に記載されたＳＨＲ７２系統（Ｚｉｌｋａら、２００６）に注射した。
それらの２ヶ月齢のラットに、３００μｌという最終体積において２００μｇの免疫原の
最初の皮下注射を投与した後、３週間後に２回目の注射を行い、その後、毎月のスケジュ
ールで注射した。コントロールトランスジェニックラットには、ＰＢＳと１：１混合され
たアジュバントを投与した。この免疫療法の有効性の評価は、実施例１９に記載される。
ワクチン処置ラットにおける不溶性タウの定量的解析における内標準として使用するた
めの、胎仔ラットタウの単離および精製：胎仔ラットタウ精製を、１％過塩素酸を使用し
て、本質的にはＩｖａｎｏｖｏｖａら、２００８に記載されているように行った。１〜７
日齢のラット仔から得られた脳組織を氷冷１％過塩素酸中でホモジナイズし（５ｍｌの過
塩素酸，ＰＣＡあたり１．５ｇ組織）、氷上で２０分間静置した。そのホモジネートを１
５，０００×ｇで２０分間遠沈し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ
Ｆｉｌｔｅｒデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、透明な上清を濃縮し、同時
に緩衝液を洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．
１％Ｔｗｅｅｎ２０）に交換した。約１０ｍｇの総タンパク質を含む濾過されたＰＣＡ脳
抽出物を、固定化されたｐａｎ−タウｍＡｂ ＤＣ２５（上記を参照のこと）を有するＳ
ｅｐｈａｒｏｓｅが詰められたＰｏｌｙ−ＰｒｅｐカラムＣ１０／１０（ＧＥ Ｈｅａｌ
ｔｈｃａｒｅ）に０．２ｍｌ／分の流速で充填した。溶出画分の吸光度（２８０ｎｍ）が
安定になるまで、未結合のタンパク質を１０〜１５ｍｌの洗浄緩衝液で洗い流した。ｍＡ
ｂ ＤＣ２５に結合した胎仔タウを、０．１Ｍグリシン，ｐＨ２．６で溶出した。溶出さ
れた０．５ｍｌ画分を直ちに５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９で中和し、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによってアッセイした。胎仔タウを含む画分を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃
縮し、同時にＰＢＳに緩衝液交換した。アフィニティークロマトグラフィーによって精製
された胎仔タウを、Ｃｈｅｎら（２００５）に従って、１０％トリクロロ酢酸を含む４体
積の氷冷アセトンを加えることによって、沈殿させた。その混合物を−２０℃で２時間イ
ンキュベートし、２℃、１５，０００×ｇで２０分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿物を
１ｍｌの氷冷アセトンに再懸濁し、氷上で２０分間静置し、再度、上記のとおり遠心した
。得られたペレットを室温において乾燥し、沈殿前の体積と等しい体積のＰＢＳに溶解し
た。
実施例１９：アルツハイマー病のトランスジェニックラットモデルにおいてタウペプチ
ドワクチンを評価する一般的な方法
能動ワクチンを以下のアプローチによって評価した：（ａ）リン酸化特異的モノクロー
ナル抗体ＡＴ２７０、ＤＣ２０９、ＤＣ２１７およびＡＴ８を用いるラット脳サンプルの
免疫ブロット解析を使用してリン酸化型の不溶性タウのレベルならびにｐａｎ−タウモノ
クローナル抗体ＤＣ２５を使用して不溶性タウの総量に対するその投与の効果を評価する
ことによって生化学的に；（ｂ）ＮｅｕｒｏＳｃａｌｅ評価を使用して神経行動学的に；
（ｃ）ＮＦＴの定量を含む免疫組織化学的に；および（ｄ）誘導された抗体応答の解析に
よって。受動ワクチンもまた、とりわけこれらのアプローチの１つもしくは複数によって
前臨床的に評価され得る。
（ａ）生化学的解析：サルコシル法（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，１９
９０）を用いて、試験ペプチドで免疫されたトランスジェニック（ＳＨＲ７２）ラットの
脳幹、ならびに実施例８に記載されたような、ｍｏｃｋで処置されたＳＨＲ７２ラット（
アジュバントのみを注射された（コントロール））から、不溶性タウ画分を調製した。サ
ルコシル不溶性タウサンプルを、下に記載されるように、様々なモノクローナル抗体を使
用する免疫ブロット法によって解析した。免疫原性ペプチド配列番号１〜８および１０８
に対するこの解析の結果を図２６Ｂに要約する。不溶性タウのレベルは、ＳＨＲ７２トラ
ンスジェニックラットにおいてタウ病理の進行と相関すると示されている。Ｋｏｓｏｎら
、２００８。
免疫ブロット解析：サルコシル不溶性タウ画分のサンプルを、可溶性画分の１／５０体
積の１×ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルローディング緩衝液（Ｌａｅｍｍｌ
ｉ，１９７０）に溶解し（Ｆｉｌｉｐｃｉｋら、２０１０を参照のこと）、９５℃で５分
間加熱した。次いで、６μｌの各々を５〜２０％グラジエントＳＤＳポリアクリルアミド
ゲルに充填し、Ｔｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳ緩衝液系において、２５ｍＡで４０分間、電
気泳動した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた（１０ｍＭ ＣＡＰＳ，ｐＨ１２にお
いて１５０ｍＡで１時間）。その移動の後、その膜をＰＢＳ中の５％脱脂粉乳において室
温で１時間ブロッキングし、次いで、１次（タウ特異的）モノクローナル抗体（各抗体の
より詳細な記載については下記を参照のこと）とともに１時間インキュベートした後、大
量のＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳで１：４０００希釈されたＨＲＰ結合体化ヤ
ギ抗マウスＩｇ（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を二次抗体として使用した。インキュベー
ション（室温において１時間）の後、ＰＢＳ中の０．２％Ｉｇｅｐａｌで洗浄した（３回
）。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ
Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いてそのブロットの像を得て、
ＬＡＳ３０００イメージングシステム（ＦＵＪＩ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍ Ｃｏ．，Ｊａ
ｐａｎ）を使用してシグナルを検出した。シグナル強度を、ＡＩＤＡソフトウェア（Ａｄ
ｖａｎｃｅｄ Ｉｍａｇｅ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｒａｙｔｅｓｔ，Ｓｔｒａｕ
ｂｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して定量した。胎仔タウ（０．６μｇ／レー
ン）を、定量解析のための内標準として使用した。
モノクローナル抗体ＡＴ８およびＡＴ２７０は、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｂｅｌｇ
ｉｕｍ）から購入し、その両方を免疫ブロット解析のために使用した。ＡＴ８は、免疫組
織化学的検査にも使用した。ＡＴ８は、タウの微小管結合親和性の大部分に寄与する、タ
ウのプロリンリッチドメインに位置するリン酸化セリン２０２およびトレオニン２０５を
認識する。ＡＴ２７０は、プロリンリッチドメインに位置するリン酸化トレオニン１８１
を認識する。両方の抗体が、可溶性タウおよび不溶性タウに結合する。本研究において使
用されたリン酸化特異的モノクローナル抗体ＤＣ２０９（ｐＴ２３１を認識する）、ＤＣ
２１７（ｐＴ２１７を認識する）は、Ａｘｏｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＧｍｂＨ（
Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）によって調製された。Ｐａｎ−タウ抗体ＤＣ２５（Ａｘ
ｏｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＧｍｂＨ）は、すべての形態の可溶性および不溶性タ
ウにおける、タウタンパク質のＣ末端における第４の微小管結合リピートリピートにおけ
るエピトープ（３４７−３５３）を認識する。ＤＣ２５抗体は、そのリン酸化レベルとは
無関係なタウタンパク質を認識する。
（ｂ）神経行動学的評価：最後のワクチン投与の１０日後にラットの神経行動学的反応を
、ＮｅｕｒｏＳｃａｌｅ（ヒト切断型タウタンパク質を発現するトランスジェニックラッ
トに対して当初はデザインされた一連の行動試験である）（Ｋｏｒｅｎｏｖａら、２００
９）を用いて評価した。そのＮｅｕｒｏＳｃａｌｅは、感覚運動の課題（梁歩行試験）、
神経筋の課題（握力牽引力試験（ｐｒｅｈｅｎｓｉｌｅ ｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）
）および神経学的課題（踏み直り反射、立ち直り反射、姿勢反射、耳介反射、驚愕反射お
よび後肢逃避伸展反射）から構成され、基本的な観測的評価によって強化される。
全般的な観察は、姿勢および肢の機能の評価を含み；神経学的検査は、基本的な反射応
答を含んだ（すべてが、１点のスケールで点数をつけられた（正常反応は０点；遅延した
または不完全な反応は１点））。後肢逃避伸展反射の評価は、３点のスケールで点数をつ
けた（正常反応は０〜１点；障害は２〜３点）。
梁歩行試験の場合、３種類の横断セグメントを使用した（３×３ｃｍ、４×２ｃｍおよ
び直径３．５ｃｍの丸い梁）。最高点は１０点だった（潜時に対する５点＋１つの梁のタ
イプにおける後肢のスリップに対する５点）。梁歩行試験から得られるスコアが低いほど
、試験された動物の感覚運動協調性の能力が良い。達成し得る点数の合計は、３０点だっ
た。
握力牽引力試験の場合、ラットに、パッド入りの表面の７６ｃｍ上に吊るされた水平方
向のスチールワイヤ（直径３ｍｍ）を前肢で掴ませた。ワイヤから落ちるまでの潜時を測
定した。与えることのできる最高点は、５点だった（それは、神経筋の機能性の重篤な障
害および筋力低下を反映する）。落ちるまでの潜時が長いほど、この課題から得られるス
コアが低く、そのスコアは、試験された動物の前肢の筋力および敏捷性を反映する。
個々の試験において得られたスコアからＮｅｕｒｏＳｃａｌｅスコアを計算した。観測
的評価、神経学的検査、３種類の梁歩行試験および握力牽引力試験の寄与を加えることに
よって、４９点という最高総スコアが可能だった。神経行動学的障害が重篤になるほど、
ＮｅｕｒｏＳｃａｌｅスコアは高くなる。
（ｃ）免疫組織化学的検査：脳サンプルを回収するために、深麻酔下において２分間、ラ
ットにＰＢＳを経心的に灌流した。灌流後、そのラットの脳を取り出し、矢状方向に２つ
の同じサイズの半球に切断した。右半球の脳幹および小脳を生化学的解析のために回収し
た。左半球を、４℃において４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した後、凍結保護を提
供するために２５％スクロースで４８時間処理した。次いで、その材料を冷２−メチルブ
タン（−４２℃）中で３０秒間凍結し、クライオミクロトームにおいて薄片に切断した。
矢状切片（４０μｍ）を−１８℃においてクライオスタットで切断した。浮遊切片を免疫
組織化学的研究のために使用した。
処置ラットおよびコントロールラットの凍結脳切片において免疫組織化学的染色を行っ
た。Ｋｏｓｏｎら、２００８は、ＳＨＲ７２トランスジェニックラットの脳におけるＮＦ
Ｔの数が、それらの動物の死去の時間と相関することを示した（すなわち、ＮＦＴが多い
ほど、動物の死去は早い）。ラット脳における神経原線維の変化を解析するために、その
脳の矢状切片を調製した。浮遊組織切片を、室温（２５℃）において３０秒間、冷（＋４
℃）８０％ギ酸で処理した。脳切片を、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１％Ｈ
２Ｏ２を含むＰＢＳ中で室温において２０分間インキュベートした後、ブロッキング溶液
（０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ウマ血清を含むＰＢＳ）中で３０分間インキ
ュベーションし、その後、精製されたＡＴ８抗体（ブロッキング緩衝液において０．２μ
ｇ／ｍｌ）またはハイブリドーマ培養上清ＤＣ２１７（ブロッキング緩衝液において１：
１００）とともに４℃において一晩インキュベーションした。両方の抗体が、トランスジ
ェニックラットの脳幹において類似の免疫染色パターンを示した。洗浄後、それらの切片
を、標準的なアビジンビオチンペルオキシダーゼ法（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて免疫染色した。反
応産物を、アビジン−ビオチン系および色素原としてＶｅｃｔｏｒ ＶＩＰ（Ｖｅｃｔｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して可視化した。次いで、切片をＯｌｙｍｐｕｓ
ＢＸ５１顕微鏡で検鏡した。
（ｄ）抗体応答：研究の開始前（すなわち、最初の注射の前）および最後の注射の２週間
後にトランスジェニックラットから採血した。投与された免疫原／ワクチンに対する抗体
応答を、段階希釈された血漿サンプルを使用するＥＬＩＳＡによって測定した。ペプチド
免疫原、組換えタウタンパク質タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒおよび組換
え完全長タウアイソフォーム２Ｎ４Ｒを、３７℃において一晩、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍ
ｌの濃度で９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ，Ｊａｐａｎ）上に別個にコーティングした
。ＰＢＳ中の１％脱脂粉乳でブロッキングした後、そのプレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０で洗浄し、５０μｌ／ウェルの血漿段階希釈物（ブロッキング緩衝液におい
て１：２００〜１：１２８，０００）とともに３７℃において１時間インキュベートした
。インキュベーションおよび洗浄の後、ペルオキシダーゼ結合体化二次抗体（ウサギ抗ラ
ットＩｇ，ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を１：１０００希釈し、３７℃において１時間、
ウェルに適用した（５０μｌ／ウェル）。その反応物を、ペルオキシダーゼ基質溶液（０
．１Ｍリン酸緩衝液）中のｏ−フェニレンジアミンを用いて発色させ、５０μｌの２Ｍ
Ｈ２ＳＯ４で停止させた。４９２ｎｍにおける吸光度を、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＭＣＣ／
３４０ ＥＬＩＳＡリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した。ネガティブ
コントロールの吸光度の値の少なくとも２倍の値を有する読取値を、ポジティブと考えた
。
上記の実施例５に記載されたようにＳＰＲを使用して親和性測定を行った。簡潔には、
ランニング緩衝液として０．００５％のＰ２０を含むリン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４（ＰＢ
Ｓ−Ｐ）中、２５℃において実験を行った。３０００ＲＵ（応答単位）のポリクローナル
抗マウス抗体（Ｎｏ．Ｚ０４２０；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，
Ｄｅｎｍａｒｋ）を、５μｇ／ｍｌ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５における
２００μｇ／ｍｌの０．５×ＰＢＳ原液の４０倍希釈によって調製される）の濃度におい
て１級アミンを介して、２つのフローセル（その一方を測定の基準として使用した）にお
いて同時に結合させた。各解析サイクルにおいて、ほぼ飽和に等しい約８５０ＲＵの固定
化レベルに達するように、１０００倍希釈された血清を分析フローセルに捕捉した。ＫＡ
測定のために、ならびに動態速度定数の測定のために、タウ免疫原性ペプチドまたはタウ
タンパク質の１００ｎＭ溶液を１００μｌ／分の流速でセンサーチップの上に注入した。
ＰＢＳ−Ｐ注射を、二重参照手順（Ｍｙｓｚｋａ Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃ １９９９）にお
けるバックグラウンドシグナル減算のために使用した。動態データをＢＩＡ評価ソフトウ
ェア４．１（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）によって１：１反応モデルに当てはめた。動態速度
定数を全体的に近似させ、最大レスポンスを局所的に当てはめ、バルクレスポンスを０に
設定した。
実施例２０：４つの治療用エピトープ配列の少なくとも１つを含むタウペプチドワクチ
ンは、ヒトアルツハイマー病をモデル化するトランスジェニックラットにおいて有益であ
る
ａ．配列番号１タウ２５１−ＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱ
ＩＩＮＫ−２８０。トランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）を、Ａｄｊｕ−ｐｈｏｓア
ジュバントとともに製剤化されたタウペプチド配列番号１で免疫した。
可溶性型からサルコシル不溶性病理型へのタウの変換は、タウ病理の発生における重要
な工程として理解され、いくつかの因子（例えば、タウの濃度、タウの切断およびタウリ
ン酸化の程度）に依存するとみられる（Ａｌｏｎｓｏら、２００１；Ｋｏｓｏｎら、２０
０８；Ｋｏｖａｃｅｃｈ ａｎｄ Ｎｏｖａｋ ２０１０）。タウペプチド配列番号１で
免疫されたラットの群およびコントロール群から回収されたサルコシル不溶性脳画分中の
不溶性タウの免疫ブロット定量的解析の結果を、図２６Ｃに示す。そのワクチン接種によ
って、アジュバント単独を投与されたコントロールラットよりも、タウ２５１−２８０（
配列番号１）で免疫されたラットにおいて不溶性タウの量が減少した（図２６Ｃ）。この
減少は、全レベルの不溶性タウ（残基３４７−３５３を認識するＤＣ２５ｐａｎ−タウ抗
体によって評価されるとき）、ならびに図２６Ｂおよび２６Ｃに記載されている、サルコ
シル不溶性画分中に存在すると知られている他のすべての試験されたＡＤ関連タウエピト
ープ（ＡＤの代用マーカー）の両方について観察された。実際に、タウペプチド配列番号
１による免疫は、不溶性タウの統計学的に有意な（ｐ＜０．００１）減少を誘導し、これ
は、ｐａｎ−タウモノクローナル抗体ＤＣ２５を使用して、全不溶性タウレベルにおいて
観察された（７１％）（図２６Ｂ、Ｃ）。ＤＣ２１７（ｐＴｈｒ２１７）、ＡＴ２７０（
ｐＴｈｒ１８１）を用いた解析から、コントロールラットと比べて免疫されたラットにお
いて不溶性タウのＴｈｒ２１７（４２％）およびｐＴｈｒ１８１（５８％）においてリン
酸化のレベルが低下する傾向が明らかになった。より弱い処置効果（１１％）が、不溶性
タウタンパク質ホスホエピトープｐＴｈｒ２３１において観察された（図２６Ｂ）。これ
らの結果から、上記ワクチンが、タウ凝集の阻害に関与する機序および／またはタウ−タ
ウ相互作用を起こしやすいタウタンパク質のレベルの低下に関わる機序を活性化させたと
示唆される。
タウペプチド免疫原配列番号１で処置されたラットは、コントロールラットと比べて、
梁歩行試験において統計学的に有意に減少した逃避潜時を示した（＊ｐ＝０．０４５）（
図２７Ａ）。同様に、後肢のスリップ回数は、コントロールと比べてワクチン接種群にお
いて減少した；しかしながら、この差は、わずかに統計学的に有意なだけだった（ｐ＝０
．０５９，図２７Ｂ）。ＮｅｕｒｏＳｃａｌｅスコア（上記の実施例１９に記載された）
を、梁歩行試験、握力牽引力試験および神経学的検査（基本的な反射、後肢逃避伸展反射
）において得られた値から計算した。上記免疫は、コントロール群と比べて、ペプチド配
列番号１で処置されたラットのＮｅｕｒｏＳｃａｌｅスコアを改善したが、この改善は、
統計学的に有意でなかった（ｐ＝０．０６５，図２７Ｃ）。全ＮｅｕｒｏＳｃａｌｅスコ
アから、未処置ラットと比べて処置ラットの神経行動学的改善が確かめられた。すべての
統計データは、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーＵ検定を用いて得られた。
神経行動学的パラメータは、脳幹における不溶性タウのレベルと相関した。低レベルの
不溶性タウを有する処置ラットは、コントロールと比べて、より短い逃避潜時およびより
少ない後肢のスリップを示した。これらの知見は、高度に不溶性のミスフォールドされた
タウの減少によって、免疫されたラットにおいて機能的改善がもたらされること（これは
、治療的な価値があり得る）を示唆している。タウペプチド配列番号１を用いた免疫療法
は、処置ラットの神経行動学的パラメータの改善をもたらした。この効果に続いて、免疫
されたラットの脳における不溶性タウレベルが減少した。これらの知見は、不溶性タウレ
ベルの低下が治療的利点を有することを示唆している。
タウペプチド配列番号１を用いた免疫療法の有効性を免疫組織化学的レベルでさらに試
験した（図２８）。処置されたラットおよびｍｏｃｋで処置された（アジュバント／ＰＢ
Ｓだけを投与された）コントロールトランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳幹において
、神経原線維変化（ＮＦＴ）を、抗タウ抗体ＡＴ８、ＤＣ２１７（病理学的タウ上のリン
酸化エピトープを認識する）を使用して解析した。半定量的方法を用いてＮＦＴの数を測
定した。３つの定量的レベルを割り当てた：１）神経原線維変化が無いまたはほとんど無
い（脳幹において最大３つ）；２）中程度（主に脳幹の網様体における多くのＮＦＴ）；
および３）重篤（脳幹の全領域における多くのＮＦＴ）。「広範」は、神経原線維の神経
変性の中程度から重篤な段階を意味する。免疫組織化学的解析は、トランスジェニック動
物のワクチン処置群における神経原線維変化の量の５０％減少を示した。
生化学的に測定された不溶性タウレベルの減少は、免疫組織化学的解析の結果と相関し
た。配列番号１による免疫からのデータは、ＤＣ８Ｅ８エピトープＮｏ．１を含むこのペ
プチドの処置能力を示している。
ｂ．配列番号２タウ２５６−ＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫ
ＬＤＬＳ−２８５。トランスジェニックラット（ＳＨＲ７２）を、キャリアＫＬＨに結合
体化されたタウペプチド配列番号２で免疫した（上に記載されたように）。
免疫ブロット解析は、上記ワクチンが、アジュバント単独を投与されたコントロールラ
ットと比べて、免疫されたラットにおける不溶性タウの量を減少させることを明らかにし
た。図２９は、不溶性／凝集タウに存在するモニターされたすべてのエピトープの減少を
示している。ｐａｎ−タウＤＣ２５免疫反応性の定量的解析は、アジュバントだけを投与
されたコントロールラットと比べて、免疫されたラットにおける不溶性タウの４１％減少
を明らかにした（統計学的に有意、ｐ＜０．００１）（図２６Ｂ）。同様に、不溶性タウ
上のリン酸化されたＡＤ特異的エピトープを認識する他の抗体の免疫反応性も低下した（
図２６Ｂおよび図２９）。さらに、その処置は、別のタウホスホエピトープ（これは、２
つのホスホ残基Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５によって作り出され、ＡＤの病理のマーカー
として公知である）のレベルにも影響を与えた。そのワクチンは、非処置動物と比較して
、免疫されたトランスジェニックラットにおいて、このエピトープの８０％減少を誘導し
た。同様に、リン酸化されたタウエピトープＴｈｒ２１７、Ｔｈｒ２３１およびＴｈｒ１
８１のレベルは、それぞれ７２％（ｐ＜０．００１）、６４％および７４％（ｐ＜０．０
１）低下した。これらの結果は、そのワクチンが、タウ凝集の阻害に関与する機序および
／または病理学的タウ−タウ相互作用を起こしやすいタウ種を減少させる機序を誘導した
ことを示唆している。
上記ラットを行動解析に供し、図３０は、梁歩行試験（図３０Ａ）、後肢スリップ試験
（図３０Ｂ）およびｎｅｕｒｏｓｃａｌｅ解析（図３０Ｃ，＊ｐ，０．０５）において得
られた結果を示している。タウペプチド配列番号２で処置されたラットの群では、梁歩行
逃避潜時（ｂｅａｍ ｗａｌｋｉｎｇ ｅｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙ）の正の傾向が観
察された（ｐ＝０．０９６）。その免疫は、横断梁試験において後肢のスリップ回数を減
少させた；しかしながら、コントロール群と比較して、差は統計学的に有意でなかった（
ｐ＝０．２５）。握力牽引力試験および神経学的検査とともに運動障害試験をＮｅｕｒｏ
ｓｃａｌｅスコアに要約した。図３０は、コントロール群と比べて、タウペプチド配列番
号２で処置されたラットのＮｅｕｒｏｓｃａｌｅスコアの統計学的に有意な改善を示して
いる（＊ｐ＝０．０３６）。概して、タウペプチド配列番号２による免疫は、全体的な運
動能力を改善した。神経行動学的レベルの改善は、コントロールと比べて、免疫された動
物における不溶性タウ（ＡＤ鋳型タウ）の量の減少と相関した。これらの知見は、より低
い不溶性タウレベルが、治療的な利点を有し得ることを示唆している。
タウペプチド配列番号２による免疫療法の有効性を免疫組織化学的レベルにおいてさら
に試験した（図３１）。この目的のために、リン酸化された可溶性タウと不溶性タウの両
方を認識する２つの異なる抗タウ抗体を使用した（ＡＴ８、ＤＣ２１７）。これらのラッ
ト（ＳＨＲ７２）における神経原線維病理は、主に、脳幹および脊髄、ならびに部分的に
小脳に局在する（データ示さず）。半定量的方法を用いてＮＦＴの数を測定した。３つの
定量的レベルを割り当てた：１）神経原線維変化が無いまたはほとんど無い（脳幹におい
て最大３つ）；２）中程度（主に脳幹の網様体における多くのＮＦＴ）；および３）重篤
（脳幹の全領域における多くのＮＦＴ）。「広範」は、神経原線維の神経変性の中程度か
ら重篤な段階を意味する。ペプチド配列番号２による免疫療法は、脳幹に広範なＮＦＴを
有するトランスジェニックラットの数をほぼ６０％減少させた（図３１）。
これらの結果は、タウペプチド配列番号２によるワクチン接種が、いくつかの望ましい
ワクチンの結果：１）生化学的レベルでの、免疫されたトランスジェニックラットの脳に
おける不溶性タウの減少；２）行動レベルでの、免疫されたトランスジェニック（ｔｒａ
ｎｇｅｎｉｃ）ラットにおける感覚運動障害の軽減；および３）免疫組織化学的レベルで
の、神経原線維病変の数の減少を示すことを証明する。
リン酸化Ｓｅｒ２６２を有する配列番号２タウ２５６−ＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱ
ＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳ−２８５。２６２位にリン酸化セリンを含む配列番号
２をＫＬＨに結合体化した。
ＤＣ２５抗体による、ラット脳サルコシル不溶性タウ画分の免疫ブロットは、そのワク
チンが、アジュバントだけを投与されたコントロールトランスジェニックラットと比べて
、免疫された動物において不溶性タウの総量を統計学的に有意に４６％減少させることを
明らかにした（ｐ＜０．０１）（図３２および図２６Ｂ、ＤＣ２５ベースの測定（「３４
７−３５３」データ）。同様に、ＤＣ２０９（ｐＴｈｒ２３１）、ＤＣ２１７（ｐＴｈｒ
２１７）、ＡＴ８（ｐＳｅｒ２０２、ｐＴｈｒ２０５）およびＡＴ２７０（ｐＴ１８１）
のシグナルの定量は、コントロールと比べて、免疫された動物群においてより低いレベル
の不溶性リン酸化タウを示した（図２６Ｂ）。しかしながら、ｐＴｈｒ２１７（ｐ＜０．
００１；７３％）、ｐＴｈｒ２３１（８４％）、ｐＳｅｒ２０２／ｐＴｈｒ２０５（８２
％）およびｐＴｈｒ１８１（ｐ＜０．０１；８２％）におけるリン酸化された不溶性タウ
のレベルの低下は、不溶性タウ全体において観察された低下よりも顕著だった。ＡＤタウ
のミスフォールディングカスケードに関わるホスホエピトープのレベルのこれらの変化は
、処置の効果の有用な指標である。ＡＤに関連するタウエピトープの減少は、そのワクチ
ンが、タウ凝集の阻害に関与する機序および／または内在性タウと病理学的な相互作用を
起こしやすいタウのレベルを低下させる機序を活性化したことを示す。
免疫組織化学的プロファイル（図３３）は、ホスホペプチド配列番号２による免疫療法
が、脳幹に広範なＮＦＴを有するトランスジェニックラットの数を減少させたことを示す
。コントロール非免疫群と比べて広範なＮＦＴを有するトランスジェニックラットの数の
７８％の減少が、免疫された群において観察された。その免疫は、免疫された動物におい
て脳タウ病理の発生を停止した。生化学的レベルにおいても解析されたＡＤに関連するエ
ピトープに対して類似の効果が得られ、不溶性タウが減少した（図２６Ｂおよび３２）。
これらの結果は、タウホスホペプチド配列番号２／ｐＳｅｒ２６２によるワクチン接種
が、１）生化学的レベルでの、免疫されたトランスジェニックラットの脳における不溶性
タウの減少；および２）免疫組織化学的レベルでの、神経原線維病変の数に対する正の処
置効果を誘発したことを証明する。
ｄ．配列番号３タウ２５９−ＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬ
ＳＮＶＱ−２８８。トランスジェニックラット（ＳＨＲ７２系統）を、ミョウバンアジュ
バント（ＡｄｊｕＰｈｏｓ）とともに製剤化されたタウペプチド配列番号３で免疫した。
図３４は、免疫療法が、アジュバントだけを投与されたコントロールラットと比べて、
免疫されたラットにおいて不溶性タウを減少させることを証明している。不溶性タウレベ
ルの低下は、解析されたすべてのタウエピトープについて（すなわち、３４７−３５３／
ＤＣ２５抗体、ｐＴ２１７／ＤＣ２１７抗体、ｐＴ２３１／ＤＣ２０９抗体、ｐＳ２０２
／ｐＴ２０５／ＡＴ８抗体およびｐＴ１８１／ＡＴ２７０抗体について）検出された。不
溶性タウ全体のレベルは、ｐａｎ−タウ抗体ＤＣ２５を用いた免疫検出によって明らかに
されたとき、４０％減少した。同様に、ワクチンは、図２６Ｂおよび図３４に示されるよ
うに、ｐＴ２１７においてリン酸化されたタウタンパク質の３０％減少を誘導した。処置
は、非免疫ラットと比べて、免疫されたラットにおいて、Ｔｈｒ２３１（６３％）、Ｔｈ
ｒ１８１（７４％）およびＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５（６１％）においてリン酸化され
た不溶性タウ型のレベルに対してより高い効果を有した（図２６Ｂおよび図３４）。これ
らの知見は、不溶性タウの減少が、病理をもたらすタウタンパク質のレベルをさらに変化
させ得ること、およびゆえに、治療的有意性を有し得ることを示す。ＡＤに関連するタウ
エピトープの減少は、上記ワクチンが、タウ凝集の阻害に関与する機序および／または内
在性タウとの病理学的な相互作用を起こしやすいタウのレベルを低下させる機序を活性化
したことを示す。
図３５Ａ〜Ｃは、神経行動学的評価によって得られた結果を示している。ペプチド配列
番号３で処置されたラットの群において、梁歩行逃避潜時の正の傾向が観察された；しか
しながら、ペプチド処置ラットと非処置／コントロールラットとの間に統計学的に有意な
差はなかった（図３５Ａ；ｐ＝０．２１）。同様に、処置は、非処置ラットと比べて、免
疫されたラットの群において後肢のスリップ回数を減少させたが、この効果は、統計学的
に有意でなかった（図３５Ｂ，ｐ＝０．１５）。総Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅスコアによって
、非処置ラットと比べてタウペプチド配列番号３で処置されたラットにおいて神経行動学
的改善が確かめられた（両方の場合においてｐ＝０．１１）。しかしながら、Ｎｅｕｒｏ
ｓｃａｌｅスコアの差は、統計学的に有意でなかった（ｐ＝０．１９）。タウペプチド配
列番号３による免疫療法は、梁歩行試験ならびに後肢スリップ試験において、コントロー
ルラットと比べて処置ラットのより良好な感覚運動協調性をもたらした；これらの結果は
、Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅスコアによって確かめられた。
さらに、免疫組織化学的プロファイルは、ホスホペプチド配列番号３による免疫療法が
、ワクチン処置動物の脳幹においてＮＦＴを５８％減少させることを明らかにした（図３
６）。これらの結果は、ＤＣ８Ｅ８エピトープＮｏ．１を含む配列番号３による免疫が、
ＮＦＴに構築された病理的ポリマーのタウを有意に減少させたことを示している。さらに
、この正の処置効果は、不溶性の病理学的タウの統計学的に有意な減少によって表される
、生化学的レベルでも示された。
ｅ．配列番号４タウ２７５−ＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶ
ＰＧＧＧ−３０４。タウペプチド配列番号４を、ＫＬＨに結合体化し、ミョウバンアジュ
バント（ＡｄｊｕＰｈｏｓ）とともに免疫のために使用した。
図３７および図２６Ｂは、配列番号４による免疫療法が、アジュバントだけを投与され
たコントロールラットと比べて、免疫されたラットにおける不溶性タウの量を減少させる
ことを示している。そのデータは、不溶性タウのレベルの低下が、解析されたすべてのタ
ウエピトープについて検出されたことを示す。不溶性タウ全体のレベルは、ｐａｎ−タウ
抗体ＤＣ２５との免疫反応性によって明らかにされたとき、６３％減少した。同様に、そ
のワクチンは、図２６Ｂに示されるように、ｐＴｈｒ２１７（９２％）、Ｔｈｒ２３１（
９５％）、Ｔｈｒ１８１（８７％）およびＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５（９５％）におい
てリン酸化されたタウタンパク質の減少を誘導した。不溶性タウのレベルがタウ病理の進
行と相関することは以前に示されている（Ｚｉｌｋａら、２００６）。本結果は、配列番
号９９の中に含まれる治療用タウエピトープに対する免疫療法が、不溶性タウのレベルを
低下させ得ることおよびタウ病理の進行を遅くすることを示している。
複合スコアであるＮｅｕｒｏｓｃａｌｅでの神経学的検査と組み合わされた標準的な運
動試験のセットによって、複合運動障害を測定した。この免疫療法の効果を測定する目的
で、６．５ヶ月齢において、タウペプチド配列番号４で処置されたトランスジェニックラ
ットＳＨＲ７２を行動試験に供した。タウペプチド免疫原配列番号４で処置されたラット
は、梁歩行試験において、アジュバントだけを投与されたトランスジェニックラット（コ
ントロール）と比べて逃避潜時の短縮を示した（図３８Ａ）。同様に、後肢のスリップ回
数の正の結果が、トランスジェニック処置コントロールと比較してワクチン接種群におい
て観察された（図３８Ｂ）。梁歩行試験、握力牽引力試験および神経学的検査（基本的な
反射、後肢逃避伸展反射）において得られたデータから、総Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅスコア
を計算した。その免疫は、コントロール処置群と比べて、ペプチド配列番号４で処置され
たラットのＮｅｕｒｏｓｃａｌｅスコアを改善した（図３８Ｃ）。総Ｎｅｕｒｏｓｃａｌ
ｅスコアは、非処置トランスジェニックラットと比べて、処置されたトランスジェニック
ラットの神経行動学的改善を確証させた。
タウペプチド配列番号４による免疫療法の有効性を、免疫組織化学的レベルにおいてさ
らに試験した（図３９）。神経原線維変化（ＮＦＴ）を、ワクチンで処置されたおよびア
ジュバントで処置された（コントロール）ＳＨＲ７２ラットの脳幹における病理学的タウ
上のリン酸化エピトープを認識する抗タウ抗体ＡＴ８およびＤＣ２１７を使用して解析し
た。アジュバントのみを投与された動物由来の脳組織は、脳幹の全領域に、主に脳幹の網
様体に、ＡＴ８陽性およびＤＣ２１７陽性のＮＦＴを含んだ。免疫組織化学的解析は、ワ
クチンで処置されたトランスジェニックラットＳＨＲ７２における神経原線維病理の６６
％減少を示した（図３９）。
トランスジェニックラット系統ＳＨＲ７２の脳幹における不溶性タウレベルの変化は、
処置効果の高感度の指標である。総不溶性タウレベルならびにリン酸化タウレベル（病理
学的な単量体、二量体、オリゴマーおよびポリマー）は両方とも、タウペプチド配列番号
４での処置によって、脳幹において効果的に減少した（６３〜９５％減少；図２６Ｂ）。
測定された不溶性タウレベルの低下は、免疫組織化学的解析から得られた結果と生化学的
に相関した。この解析は、ワクチンを注射されたトランスジェニックラットの脳幹におけ
る神経原線維病理の６０％超の減少を示した（図３８）。配列番号４による免疫からのデ
ータは、ＤＣ８Ｅ８エピトープＮｏ．２を含むこのペプチドの処置の能力を示す。
ｆ．２１７位にリン酸化トレオニンを有する配列番号５タウ２０１−ＧＳＰＧＴＰＧＳ
ＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲ−２３０。トレオニン２１７の位置にお
いてリン酸化されたタウペプチド配列番号５を、ミョウバンアジュバント（ＡｄｊｕＰｈ
ｏｓ）を使用してＳＨＲ７２トランスジェニックラットに投与した。
免疫ブロット解析は、ホスホペプチド配列番号５による免疫が、アジュバントだけを投
与されたコントロールＴｇラットと比べて、総不溶性タウ（ＤＣ２５抗体で検出される）
の量に影響しないことを示した（図４０および図２６Ｂ）。しかしながら、抗体ＤＣ２０
９およびＡＴ２７０を用いた解析は、不溶性タウ画分中のホスホ−タウｐＴｈｒ２３１お
よびｐＴｈｒ１８１のレベルの約３０％減少を明らかにした（図２６Ｂ）。他方で、処置
は、コントロールトランスジェニックラットと比べて、トレオニン２１７においてリン酸
化された不溶性タウ（１１％増加）およびホスホ部位（ｐｈｏｓｐｈｏｓｉｔｅｓ）Ｓｅ
ｒ２０２／Ｔｈｒ２０５を有するタウ（３１％増加）の中程度の増加を誘導した。この知
見は、評価されているＡＤに関連するマーカーに対する、ホスホペプチド配列番号５によ
る免疫のあいまいなまたは中立のワクチン効果を示唆し得る（そのペプチドは、治療用エ
ピトープとして上（実施例１から１１）で同定されたタウ凝集エピトープ＃１から＃４の
いずれも含まない）。
リン酸化されたタウペプチド配列番号５で処置されたラットの神経行動学的解析は、コ
ントロール群と比べて、梁歩行試験での処置群における神経行動学的機能（図４１Ａ，ｐ
＝０．１９）または後肢のスリップ回数（図４１Ｂ）に有意な改善がないことを示した。
総ＮｅｕｒｏＳｃａｌｅスコア（図４１Ｃ）は、ｍｏｃｋで免疫されたラットと比べて、
処置ラットの神経行動学的改善を確証させなかった（ｐ＝０．２８）。
タウホスホペプチド配列番号５による免疫療法は、免疫組織化学的検査によってコント
ロールトランスジェニックラットと比べたとき、脳幹に広範なＮＦＴを有するトランスジ
ェニックラット（ＳＨＲ７２）の数を減少させなかった（図４２）。
これらの結果は、タウペプチド配列番号５ ｐＴ２１７（すべての治療用エピトープ（
配列番号９８〜１０１）を欠く）によるワクチン接種が、神経行動学的機能を統計学的に
有意に改善しないこと、および免疫組織化学的レベルにおいて神経原線維病変の数をわず
かおよそ１１％しか減少させないことを示している。ＤＣ２５抗体によって評価したとき
、不溶性タウの減少に関しては、生化学的レベルに対する効果は観察されなかった。
ｇ．３９６位および４０４位にリン酸化セリン残基を有する配列番号６タウ３７９−Ｒ
ＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬ−４０８。３９６位およ
び４０４の位置においてリン酸化されたタウペプチドを、ミョウバンアジュバント（Ａｄ
ｊｕＰｈｏｓ）を使用してＳＨＲ７２に投与した。配列番号６／ｐＳ３９６／ｐＳ４０４
は、配列番号９８〜１０１によって表される治療用エピトープのいずれも欠くが、ＡＤ脳
タウタンパク質において大きな比率を占めるホスホエピトープを含む（Ｇｒｅｅｎｂｅｒ
ｇら、１９９２；Ｏｔｖｏｓら、１９９４）。
ペプチド配列番号１〜４を用いて観察されたサルコシル不溶性タウの量の減少とは対照
的に、リン酸化されたペプチド配列番号６による免疫は、アジュバントだけを投与された
コントロールラットと比べて、免疫されたラットにおいて不溶性タウの量を増加させた。
免疫ブロット解析は、不溶性ホスホ−タウレベルの全体的な増加の傾向を明らかにした（
図４３および図２６Ｂ）。免疫は、ｐａｎ−タウｍＡｂ ＤＣ２５によって明らかにされ
たように、不溶性タウ画分中の総タウレベルを増加させた。タウエピトープｐＴ２１７（
３３％増加）、Ｔｈｒ２３１（４４％増加）およびＴｈｒ１８１（７％増加）においても
増加が観察された。しかしながら、ＡＤに関連するエピトープｐＳ２０２／ｐＴ２０５は
、例外だった（図２６Ｂ）。このホスホエピトープを有するタウタンパク質のレベルは、
コントロールラットと比べて１９％減少した。複数の疾患に関連する病理学的不溶性タウ
タンパク質のレベルの上昇は、上記ラットに対するこのワクチンの望ましくない負の効果
を示唆する。
タウペプチド配列番号６／ｐＳ３９６／ｐＳ４０４で処置されたラットおよびコントロ
ールの神経行動学的反応を評価した（図４４Ａ、ＢおよびＣ）。免疫療法は、梁歩行逃避
潜時（ｐ＝０．８２）または後肢のスリップ回数（ｐ＝０．７５）において、処置ラット
とコントロールラットとの間に統計学的有意差を示さなかった。これらの結果を、Ｎｅｕ
ｒｏｓｃａｌｅスコアによって確かめたところ（ｐ＝０．９６）、免疫されたラットとコ
ントロールラットとの間に全体的な神経行動学的能力に統計学的有意差は観察されなかっ
た。したがって、ペプチド配列番号６／ｐＳ３９６／ｐＳ４０４による処置は、梁歩行試
験逃避潜時、後肢のスリップ回数（ｎｕｍｂｅｒ ｏｒ ｈｉｎｄ−ｌｉｍｂ ｓｌｉｐ
ｓ）、または試験されたラットの全体的な運動能力に対して統計学的に有意な影響を有し
なかった。
図４５は、ＡＴ８を用いた免疫組織化学によって評価したときの、広範なタウ病理を有
するトランスジェニックラットのパーセンテージを示している。タウペプチド配列番号６
／ｐＳ３９６／ｐＳ４０４による免疫療法は、コントロール群と比べて濃縮体の量を９％
増加させた。したがって、免疫組織化学的レベルでの配列番号６／ｐＳ３９６／ｐＳ４０
４の負の効果が、生化学的レベルおよび神経行動学的レベルにおいて確かめられた。
これらの結果は、タウホスホペプチド配列番号６／ｐＳ３９６／ｐＳ４０４（配列番号
９８〜１０１に表されている治療用タウエピトープのいずれも有しない）によるワクチン
接種が、１）免疫されたラットの脳における不溶性タウに対して治療効果が無いこと；２
）行動レベルにおいて効果が無いこと；および３）濃縮体の量の減少が無く、むしろ９％
増加することを示すことを証明する。ゆえに、ＡＤ特異的であると報告されている（Ｇｒ
ｅｅｎｂｅｒｇら、１９９２；Ｏｔｖｏｓら、１９９４）このホスホエピトープは、治療
効果を誘導しなかった。
ｈ．２０２位にリン酸化セリン残基および２０５位にリン酸化トレオニン残基を有する
配列番号７タウ１８１−ＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲ
Ｓ−２１０。得られたタウペプチド配列番号７／ｐＳ２０２／ｐＴ２０５は、配列番号９
８〜１０１に表されている治療用エピトープのいずれも有しない。そのホスホペプチドを
ＫＬＨに結合体化し、フロイントアジュバント中においてトランスジェニックラット（Ｓ
ＨＲ７２系統）に投与した。
免疫ブロットによる脳幹におけるタウ免疫反応性の定量的解析は、いかなる治療効果も
示さなかった（図４６）。総タウのレベル（ＤＣ２５エピトープ、６％増加）、ならびに
疾患に関連するタウエピトープｐＴ２１７（３％増加）、Ｔｈｒ２３１（１１％増加）お
よびＴｈｒ１８１（７％増加）上でリン酸化されたタウタンパク質のレベルは、コントロ
ールと比べて、免疫されたラットにおいてわずかに増加した（図４６および２６Ｂ）。免
疫は、Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５においてリン酸化された不溶性タウタンパク質のより
大きな増加を誘導した（４１％増加）。
リン酸化されたペプチド配列番号７による免疫療法は、ラットの感覚運動機能に有意に
影響しなかった（図４７）。免疫されたラットは、コントロールと比べて、神経行動学的
パラメータの明らかな改善を示した。しかしながら、処置ラットとコントロールとの間で
、梁歩行逃避潜時（ｐ＝０．４７、図４７Ａ）ならびに後肢のスリップ回数（ｐ＝０．５
４、図４７Ｂ）およびＮｅｕｒｏＳｃａｌｅスコア（ｐ＝０．３、図４７Ｃ）に統計学的
有意差が観察されなかったので、それらの群は、統計学的に異ならなかった。
ペプチド配列番号７は、いずれのＤＣ８Ｅ８エピトープも含まないリン酸化タウエピト
ープを有する。処置されたＳＨＲ７２ラットの脳幹の検査は、タウペプチド配列番号７に
よる免疫療法が、神経原線維変化の量を減少させることができないことを明らかにした（
図４８）。ワクチン接種された動物由来およびコントロール動物由来の脳組織は、脳幹の
全領域、主に、網様体に、ほぼ同一の数のＡＴ８およびＤＣ２１７陽性のＮＦＴを含んだ
。ＤＣ８Ｅ８エピトープを有しない配列番号７を含むワクチンは、処置動物においていか
なる有益な効果も示さなかった。
これらの結果は、タウホスホペプチド配列番号７／ｐＳ２０２／ｐＴ２０５によるワク
チン接種が、１）生化学的レベルでは、免疫されたラットの脳における不溶性タウのレベ
ルを変化させないこと；および２）行動レベルでは効果をもたらないことを証明する。こ
のホスホペプチドは、ｐＳ２０２／ｐＴｈｒ２０５によって表されるホスホ部位が、病理
学的タウタンパク質を排除する免疫反応および／またはラットの神経行動学的状態に正に
影響する免疫反応を誘発するのに十分でないというさらなる証拠を提供する。対照的に、
治療用タウエピトープ（配列番号９８〜１０１）は、この効果を達成する。
ｉ．配列番号８タウ３００−ＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫ−３１７。より短
いタウペプチド（４つのタウ「治療用エピトープ」のうちの１つが存在し得る完全なタウ
６−ｍｅｒもリン酸化エピトープも有しないので、コントロールとして使用された）によ
る免疫療法を、脳における病理学的不溶性タウおよび神経原線維の沈着物のレベルに影響
する能力を測定するために、行った。ｐａｎ−タウｍＡｂ ＤＣ２５によって検出される
総不溶性タウのレベルは、アジュバントだけを投与されたコントロールと比べて、免疫さ
れたラットにおいて有意に上昇した（８２％）（図４９および図２６Ｂ）。同様に、免疫
療法は、Ｔ２３１においてリン酸化された不溶性タウのレベルの増加（６０％）およびＴ
１８１の位置においてリン酸化された不溶性タウのより小さい増加（１０％）を誘導した
。異なる抗体セットであるＤＣ２１７（ｐＴ２１７）およびＡＴ８（ｐＳ２０２／ｐＴ２
０５）を用いた定量的解析は、不溶性タウにおけるこれらのエピトープに対していかなる
効果も明らかにしなかった（図２６Ｂ）。
動物を行動解析に供した（図５０Ａ、Ｂ、Ｃ）。ペプチド配列番号８で処置されたラッ
トは、コントロールと比べて、梁歩行試験における逃避潜時に統計学的有意差を示さなか
った（ｐ＝０．６）。後肢のスリップ回数の差も、コントロールと比べて統計学的に有意
でなかった（ｐ＝０．４９）。同様に、ＮｅｕｒｏＳｃａｌｅスコアに統計学的有意差は
なかった（ｐ＝０．９）。したがって、ペプチド配列番号８の投与は、ラットの運動能力
に統計学的に有意に影響しなかった。
これらの結果は、タウペプチド配列番号８（上記治療用エピトープ（配列番号９８〜１
０１の中）のすべてを有しない）によるワクチン接種が、１）生化学的レベルにおいて、
免疫されたラットの脳における不溶性タウに変化をもたらさなかったこと；および２）神
経行動学的レベルにおいて効果をもたらさなかったことを証明する。
処置動物およびｍｏｃｋコントロール動物（アジュバントのみを投与された）の脳幹に
おけるＮＦＴの量に対するペプチドワクチンの効果を、免疫組織化学的検査（ｉｍｕｎｏ
ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって評価した。その結果は、タウペプチド配列番号
８による免疫療法が、神経原線維変化の量を減少させないことを示した（図５１）。処置
動物およびｍｏｃｋコントロール動物は、ＡＴ８およびＤＣ２１７染色によって明らかに
されるとき、脳幹の全領域、主に、脳幹の網様体においてほぼ同一の数の神経変性の変化
をもたらした。
配列番号８（いかなる完全な治療用エピトープ（配列番号９８〜１０１）も含まない）
によるワクチン接種は、処置動物においていかなる有益な効果も示さなかった。したがっ
て、ペプチド配列番号５〜８による免疫の結果は、少なくとも１つの完全な治療用エピト
ープ（配列番号９８〜１０１の中に位置する）の存在が、ワクチンの所望の正の効果（タ
ウ病理の減少および少なくとも１つの神経行動学的パラメータの改善）のために必要であ
ることを示す。
ｊ．配列番号１０８タウ２９４−ＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ−３０５。ミョウバンアジ
ュバントとともに製剤化され、動物１匹あたり１００μｇの用量で投与される、キャリア
ＫＬＨに結合体化されたタウペプチド配列番号１０８でＳＨＲ７２ラットを免疫した。
トランスジェニックラットＳＨＲ７２にタウペプチド配列番号１０８をワクチン接種す
ることにより、不溶性の病理学的タウが統計学的に有意に減少した（ｐ＜０．００１）。
ＳＨＲ７２におけるアルツハイマー病の病理は、病理学的不溶性タウ型（病理学的タウの
単量体、二量体、オリゴマーおよびポリマーによって表される）によって引き起こされる
ので、１２−ｍｅｒの受動ワクチン配列番号１０８による処置の不溶性タウレベルに対す
る影響を解析した。それぞれの免疫原で免疫したトランスジェニック動物およびアジュバ
ントだけで免疫したコントロール群の脳幹を、サルコシル不溶性の病理学的タウの抽出の
ために使用した（上に記載されたように）。タウペプチド配列番号１０８で免疫されたト
ランスジェニックラットの群およびコントロール群からの定量的免疫ブロット解析の結果
を図５２および２６Ｂに示す。ワクチン接種は、アジュバントだけを投与されたコントロ
ールトランスジェニックラットと比べて、免疫された動物において病理学的不溶性タウを
統計学的に有意に減少させた（図５２）。この減少は、解析されたすべてのＡＤに関連す
るタウエピトープにおいて観察された。タウペプチド配列番号１０８による免疫は、ｐａ
ｎ−タウモノクローナル抗体ＤＣ２５を用いた測定によって明らかにされた、不溶性の病
理学的タウの有意な減少を誘導した（ｐ＜０．００１；７０％）（図５２）。さらに、ホ
スホ依存性ｍＡｂ ＤＣ２１７（ｐＴｈｒ２１７）およびＡＴ８（ｐＳｅｒ２０２／ｐＴ
ｈｒ２０５）を用いた解析は、コントロールと比べて、免疫されたラットの不溶性タウに
おけるＴｈｒ２１７（ｐ＜０．００１；９６％）およびＳｅｒ２０２／ｐＴｈｒ２０５（
ｐ＜０．０５；９８％）においてリン酸化された病理学的タウ種のレベルの有意な低下を
明らかにした（図５２）。統計学的に有意な低下は、ｐＴｈｒ２３１（ｐ＜０．０５；９
７％）およびｐＴｈｒ１８１（ｐ＜０．０５；９４％）を有する不溶性の病理学的タウの
レベルにおいても観察された。これらの結果は、このワクチンによって誘導される免疫応
答が、初期の形態の病理学的タウ（単量体、二量体、オリゴマーによって代表される）お
よび後期の形態の病理学的タウポリマー（ＰＨＦによって代表される）の統計学的に有意
な減少をもたらすことを示している。
タウペプチド配列番号１０８によるトランスジェニックラットＳＨＲ７２のワクチン接
種は、神経行動学的パラメータを統計学的に有意に改善した（ｐ＜０．０５）。複合スコ
アであるＮｅｕｒｏｓｃａｌｅでの神経学的検査と組み合わされた標準的な運動試験のセ
ットによって、運動障害を測定した。免疫療法の効果を測定する目的で、６．５ヶ月齢に
おいて、タウペプチド配列番号１０８で処置されたトランスジェニックラットＳＨＲ７２
を行動試験に供した。タウペプチド免疫原配列番号１０８で処置されたラットは、梁歩行
試験において、アジュバントだけを投与されたトランスジェニックラット（コントロール
）と比べて逃避潜時の有意な短縮を示した（＊ｐ＝０．０４）（図５３）。同様に、後肢
のスリップ回数の正の傾向が、トランスジェニック処置コントロールと比較してワクチン
接種群において観察され、この差は有意だった（＊ｐ＝０．０４５、図５３）。梁歩行試
験、握力牽引力試験および神経学的検査（基本的な反射、後肢逃避伸展反射）において得
られたデータから、総Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅスコアを計算した。その免疫は、コントロー
ル処置群と比べて、ペプチド配列番号１０８で処置されたラットのＮｅｕｒｏｓｃａｌｅ
スコアを有意に改善した（＊ｐ＝０．０４７）（図５３Ｃ）。総Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅス
コアは、非処置トランスジェニックラットと比べて、処置されたトランスジェニックラッ
トの神経行動学的改善を確証させた。すべての統計データは、ノンパラメトリックなマン
・ホイットニーＵ検定を用いて得られた。
神経行動学的パラメータは、処置されたトランスジェニック動物の脳幹における不溶性
の病理学的タウレベルと相関した。ワクチンペプチド配列番号１０８で処置された動物は
、コントロール処置動物と比較して、より短い逃避潜時およびより少ない後肢のスリップ
回数に関連する、低レベルの不溶性の病理学的タウを示した。これらの知見は、不溶性の
病理学的タウの減少が、１２−ｍｅｒペプチド（配列番号１０８）ワクチンで免疫された
トランスジェニック動物の群において、神経行動学的障害の統計学的に有意な改善をもた
らすことを示し、その治療的な価値を示す。
タウペプチド配列番号１０８によるトランスジェニックラットＳＨＲ７２のワクチン接
種は、神経原線維変化（ＮＦＴ）の量を６０％減少させた。脳幹における神経原線維のタ
ウ病理（神経原線維変化，ＮＦＴ）の免疫組織化学的解析は、ワクチンで処置されたＳＨ
Ｒ７２ラットにおいて達成されたＮＦＴの減少を示した（図５４）。脳幹に広範なＮＦＴ
を有する免疫されたトランスジェニックラットの数は、アジュバントで処置された動物と
比べて、６０％超減少した。その免疫は、配列番号１０８ペプチドワクチンで免疫された
トランスジェニック動物の脳におけるタウ病理（病理学的タウポリマー，ＰＨＦ）を減少
させた。
上記の結果は、タウペプチド配列番号１０８による免疫療法が、ＳＨＲ７２ラットにお
いてタウ病理を効果的に減少させたことを示している。ワクチン接種が、免疫された動物
の脳における不溶性の病理学的タウのレベルを統計学的に有意に減少させ、ならびに神経
原線維変化の量（ＰＨＦ）を減少させた。病理学的タウタンパク質の量の減少は、処置さ
れたトランスジェニックラットの神経行動学的パラメータの統計学的に有意な改善をもた
らした。したがって、タウペプチド配列番号１０８の投与は、ＡＤを処置するための能力
を有する。
実施例２１：ＡＤ治療ペプチドによる免疫療法は、免疫原性であり、トランスジェニッ
クラットにおいて疾患タウ特異的抗体の産生を誘導する
ａ．タウペプチドワクチンを５回投与した後、処置ラットにおけるそのペプチドの免疫
原性の解析を行った。免疫されたラット由来の血清を抗体価の測定のために使用した。ア
ジュバントだけで免疫されたラット由来の血清をコントロールとして使用した。特異的な
抗タウ抗体の力価を、実施例１９に記載されたようにＥＬＩＳＡによって測定した。各血
清の段階希釈物を、予めマイクロタイターウェルプレート上にコーティングしておいたＡ
ＤタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒおよび組換え完全長タウ２Ｎ４Ｒに対し
て試験した。アッセイされた免疫原は、特異的な抗タウ抗体の産生を誘導した。
例えば、２７５−ＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧ−
３０４（配列番号４）による免疫の後、抗タウ特異的抗体が産生された。タウペプチド配
列番号４によって誘導された抗体は、タウ２Ｎ４Ｒよりも誤無秩序タウΔ（１−１５０；
３９２−４４１）／４Ｒに対しておよそ３倍高い結合活性を示した（図５５；１：３，２
００希釈）。これらの結果はさらに、このワクチンが、アルツハイマー病における病理学
的タウタンパク質を認識するおよび排除する／中和する治療的可能性を有する抗体を誘導
したことを示唆する。
また、タウペプチド配列番号１０８によるトランスジェニックラットＳＨＲ７２のワク
チン接種は、生理学的タウにまさって病理学的タウタンパク質に優先的に結合する抗体の
形成を誘導した。ワクチンを５回投与した後、ワクチン接種された各ラットにおいて免疫
原性の解析を行った。最後の追加免疫の投与の２週間後に動物から採血し、回収された血
清を幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の測定のために使用した。特異的な抗タウ抗体の力価を、
実施例１９に記載されたようにＥＬＩＳＡによって測定した。各血清の段階希釈物（１：
１００から１：５１，２００）を、固相として使用される病理学的タウΔ（１−１５０；
３９２−４４１）／４Ｒおよび生理学的タウ２Ｎ４Ｒに対して試験した。力価は、最大光
学濃度（吸光度）の半分をもたらす血清の希釈度の逆数と定義された。幾何平均抗体価を
計算するために、１００より小さい力価の読取値を、１０という値として割り当てた。図
５６に示されるように、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対する
抗体価（ＧＭＴ１２８００）は、完全長タウ２Ｎ４Ｒに対する抗体価（ＧＭＴ４２００）
よりも３倍高かった。抗体価は、実施例１９に記載された同じ方法を使用して、非結合体
化ペプチド配列番号１０８に対しても測定された。図５６は、タウペプチド配列番号１０
８に対して最も高い抗体価（ＧＭＴ２０８００）がもたらされたことを示している。アジ
ュバントのみで免疫されたトランスジェニックラットでは抗体応答は観察されなかった（
ＧＭＴ１０；データ示さず）。ＤＣ８Ｅ８エピトープＮｏ．２（配列番号９９の中）を有
するペプチド配列番号１０８のワクチン接種は、病理学的タウタンパク質を優先的に認識
するがゆえに病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１／４Ｒ）と生理学的タウ２Ｎ
４Ｒとを区別する抗体を誘導した。さらに、結果は、配列番号１０８が、免疫原性であり
、ゆえに、アルツハイマー病における病理学的タウタンパク質を排除する治療的可能性を
有することを示した。
さらに、タウペプチド配列番号１０８によるトランスジェニックラットＳＨＲ７２のワ
クチン接種が、病理学的タウに特異的なＩｇＧ抗体アイソタイプの形成を優先的に誘導し
た。ペプチド配列番号１０８に応答して産生される抗体の特異的なアイソタイプを判定す
るために、免疫群およびコントロール群のラット由来の血清を、１：１００から１：１２
，８００まで段階希釈し、病理学的なタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対
するＥＬＩＳＡ（実施例１９に記載されたように）によって２つ組で試験した。ラットＩ
ｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＭアイソタイプを検出するため
に、抗ラットサブクラス特異的ＨＲＰ結合体化二次抗体を、ＰＢＳにおいて１：５，００
０希釈した（Ｐｉｅｒｃｅ，抗ＩｇＧ１−ＰＡ１−８４７０８、抗ＩｇＧ２ａ−ＰＡ１−
８４７０９、抗ＩｇＧ２ｂ−ＰＡ１−８４７１０、抗ＩｇＧ２ｃ−ＰＡ１−８４７１１お
よび抗ＩｇＭ−ＰＡ１−８４７１２）。図５７は、代表的な１：８００希釈に対する結果
を示している。データは、ＫＬＨに結合体化されたペプチド配列番号１０８が、広範囲の
抗タウ抗体アイソタイプを誘導したことを証明する。そのワクチンは、高レベルの抗体ア
イソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃ）（これらは高親和性
抗体であると考えられている）を産生させた。対照的に、アイソタイププロファイルは、
非常に低いレベルのＩｇＭ抗体を示した。これらは、抗原に対して低い親和性を有すると
考えられる。病理学的タウに対して優先的な親和性を有する高力価のＩｇＧ抗体の存在は
、ワクチンによって誘導される免疫応答が病理学的タウ種に特異的であることを示唆した
。ｍｏｃｋで免疫された（アジュバント単独を投与された）ラットから得られたコントロ
ール血清は、陰性だった。
これらのデータを、免疫応答の偏り（Ｔｈ１／Ｔｈ２表現型）の測定のためにさらに使
用した。免疫によって誘導されるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａアイソタイプのレベルは、Ｔ
ｈ２サイトカインと比べてＴｈ１サイトカインの免疫応答への寄与を間接的に示唆する。
一般に、ＩｇＧ１抗体の産生は、Ｔｈ２サイトカインによって誘導され、ＩｇＧ２ａ抗体
の産生は、Ｔｈ１サイトカインによって誘導される。ゆえに、ＩｇＧ１アイソタイプとＩ
ｇＧ２ａアイソタイプとの比を、ＩｇＧ１に対するＯＤ値をＩｇＧ２ａに対するＯＤ値で
除算することによって計算した。これらのデータは、免疫応答がＴｈ１表現型にわずか転
じたこと示唆する（上記比＝０．６２５）。
ｂ．表面プラズモン共鳴を使用した結合事象のリアルタイムモニタリングによって、タ
ウペプチド２７５−ＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧ−
３０４（配列番号４）で免疫されたラットのプールされた血清由来の抗体の会合（ｋＯＮ
）および解離（ｋＯＦＦ）の動態速度の測定が可能だった。その解析は、タウΔ（１−１
５０；３９２−４４１）／４Ｒの認識と生理学的タウアイソフォーム２Ｎ４Ｒの認識との
違いを示した（図５８）。免疫によって誘導された抗体は、対応する完全長アイソフォー
ム２Ｎ４Ｒに対する親和性と比べて、切断型ＡＤタウに対して３倍高い親和性でこのタウ
タンパク質に結合するタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対して優先的な親
和性を示した。この結合の差は、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対する
およそ５倍大きいｋＯＮ速度に部分的に起因すると判定された（データ示さず）。
ｃ．治療用タウペプチドで免疫されたラットにおいて誘導された抗体の特異性をさらに
測定するために、ヒトＡＤ脳由来の海馬の凍結切片の免疫組織化学的染色のために抗血清
を使用することができる。例えば、配列番号４による免疫の後に誘導された抗体をこのア
ッセイによって評価した。ヒトＡＤ脳由来の海馬を、４℃において２日間、４％パラホル
ムアルデヒドで固定した後、凍結保護を提供するために２５％スクロースで７２時間処理
した。次いで、その材料を冷２−メチルブタン（−４２℃）中で３０秒間凍結し、クライ
オミクロトームにおいて薄片に切断した。冠状切片（４０μｍ）をクライオスタットにお
いて−１８℃で切断した。免疫組織化学的研究のために浮遊切片を使用した。浮遊組織切
片を室温（２５℃）において冷（＋４℃）９９％ギ酸で１分間処理した。脳切片を室温に
おいて、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１％Ｈ２Ｏ２を含む０．０１ＭのＰＢ
Ｓ，ｐＨ７．４中で２０分間インキュベートした後、ブロッキング溶液（０．３％Ｔｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００、１％ウマ血清を含む０．０１Ｍ ＰＢＳ）中で３０分間インキュベ
ーションし、その後、ペプチド配列番号４を含むワクチンで免疫されたトランスジェニッ
クラット由来の血清（１：１０００希釈されたもの）とともに４℃において一晩インキュ
ベーションした。洗浄した後、切片を、標準的なアビジンビオチンペルオキシダーゼ法（
ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ
，ＣＡ）を使用して免疫染色した。反応産物を、アビジン−ビオチンおよび色素原として
Ｖｅｃｔｏｒ ＶＩＰ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して可視化し
た。次いで、切片をＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡で検鏡した。免疫組織化学的染色は
、ペプチド配列番号４による免疫によって誘導された抗体が、アルツハイマー病脳の海馬
において、病理学的タウ構造、すなわち、神経原線維病変を特異的に認識することを示し
た（図５９Ａ、Ｂ）。アジュバントだけを投与されたコントロールラット由来の血清をネ
ガティブコントロールとして使用したところ、それは、いかなる神経細胞の病理も認識し
なかった（データ示さず）。
タウペプチド配列番号１０８によるトランスジェニックラットＳＨＲ７２のワクチン接
種は、ヒトアルツハイマー病脳組織由来の切片において病理学的タウタンパク質を認識す
る抗体を誘導した。治療用タウペプチド配列番号１０８で免疫されたラットにおいて誘導
された抗体の特異性をさらに判定するために、それらの血清を、ヒトＡＤ脳（Ｂｒａａｋ
ステージＶＩ）の凍結切片を使用する嗅内皮質の免疫組織化学的染色のために使用した。
浮遊組織切片を、免疫されたトランスジェニックラット由来の血清（１：１０００希釈さ
れたもの）とともに４℃においてインキュベートした。配列番号１０８でワクチン接種さ
れた動物由来の個々の血清を別々に使用したが、アジュバントのみでワクチン接種された
動物由来の血清は、プールした。標準的なアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ法（ＡＢ
Ｃ Ｅｌｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃ
Ａ）を使用して免疫染色した後、切片をＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡で検鏡した。免
疫組織化学的染色は、ペプチド配列番号１０８での免疫によって誘導された抗体が、アル
ツハイマー病脳の嗅内皮質において病理学的タウ構造、すなわち、神経原線維病変を特異
的に認識することを示した。図６０（Ａ〜Ｅ）は、ワクチン接種された５匹のトランスジ
ェニックラットＳＨＲ７２から回収されたラット血清による代表的な免疫染色を示してい
る。配列番号１０８でワクチン接種された動物の血清は、神経原線維病理を非常に強くデ
コレートした（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）ことから、その抗体が病理学的タウタンパク質を効
率的に標的化することが確かめられた。アジュバントだけを投与されたコントロールラッ
ト由来の血清をネガティブコントロールとして使用した。それらは、いかなる神経原線維
病理も認識しなかった（図６０Ｆ）。
配列番号１０８ワクチンによって誘導された抗体は、ＳＨＲ７２の脳およびヒトＡＤ脳
から抽出された病理学的タウタンパク質を認識する。タウペプチド配列番号１０８で免疫
されたラット由来の血清の特異性を、免疫ブロット法を使用して、可溶性および不溶性の
病理学的タウの病理学的形態についてさらに調べた（実施例１９に記載されたように）。
その病理の後期におけるＳＨＲ７２ラットの脳幹を可溶性不溶性の病理学的タウタンパク
質の抽出のために使用した。ヒトＡＤ脳（ＢｒａａｋステージＶＩ；Ｎｅｔｈｅｒｌａｎ
ｄｓ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手したもの）の側頭皮質を
ヒト病理学的ＡＤタウの抽出のために使用した。可溶性および不溶性の病理学的タウタン
パク質を、実施例８に記載された方法と同じ方法を使用して調製した。可溶性タウ画分の
場合、１レーンあたり１５μｇの総タンパク質を充填した。不溶性タウ画分の場合、ペレ
ットを、不溶性タウ画分の調製のために使用された可溶性画分の１／５０体積の１×ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルローディング緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０
）に溶解し、等体積をＳＤＳ−ＰＡＧＥに充填した。免疫された動物由来のプールされた
血清をＰＢＳにおいて１：１０００希釈し、１次抗体として使用した。１次抗体とのイン
キュベーションの後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化されたポリクローナルウサ
ギ抗ラット免疫グロブリン（１：３０００；Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒ
ｋ）とインキュベーションした。ウエスタンブロットシグナルを、ＬＡＳ３０００ ＣＣ
Ｄイメージングシステム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｊａｐａｎ）を用いてデジタル化した。こ
の免疫ブロット解析の結果を図６１に示す。
結果（図６１）は、ＤＣ８Ｅ８エピトープ２（配列番号９９）を有するペプチドに対し
て産生された抗体が、ＳＨＲ７２およびＡＤ脳組織から抽出された病理学的タウタンパク
質を認識することを示している。誘導された抗体は、単量体型の病理学的タウ（レーンＮ
ｏ．１、２およびＮｏ．３）、ならびにＡＤに特徴的なＡ６８タウトリプレットを含むオ
リゴマー型の病理学的タウ（レーンＮｏ．２およびＮｏ．３）を認識した。これらの知見
は、アルツハイマー病のこのラットモデルを使用する免疫療法に対して重要な影響を有す
る。ワクチンによって産生された高親和性抗体は、すべての形態の病理学的タウタンパク
質を標的化する。それらは、単量体型の病理学的タウタンパク質を標的化するので、病理
学的タウ−タウ相互作用（オリゴマー化）を妨げ、ワクチン接種されたラットにおいて不
溶性タウレベルを低下させ、その結果として、神経行動学的パラメータを改善する。産生
された抗体は、オリゴマー型の病理学的タウにも結合し、ｍＡｂ ＤＣ８Ｅ８について実
施例１０に記載されたように、それらを分解、例えば、ミクログリアによる分解に標的化
する。
実施例２２：ＡＤ治療用ペプチドによる免疫療法は、マウスにおいて疾患タウ特異的抗
体の産生を誘導する
配列番号１００または１０１のいずれかの中に上記治療用エピトープのうちの１つを有
する、ペプチド配列番号１０９、配列番号１１０（配列番号８８は配列番号１１０＋結合
体化のためのさらなるＮ末端Ｃｙｓに対応する）、配列番号１１１および配列番号１１２
は、免疫されたマウスにおいて抗体の産生を誘導した。得られた抗体は、生理学的タウ２
Ｎ４Ｒよりも病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対して統計学的に
有意に高い結合活性を示す。
実際には、１つもしくは複数の治療用ＤＣ８Ｅ８エピトープを有するペプチド（例えば
、７−ｍｅｒ：配列番号１００および配列番号１０１の中に）の免疫原性の可能性をさら
に判定するために、ＤＣ８Ｅ８治療用エピトープの１つを有する１２および３０アミノ酸
長のペプチド（配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１および配列番号１１２
）をデザインした。タウペプチド配列番号１０９（３０アミノ酸）および配列番号１１１
（１２アミノ酸）は、配列番号１００における治療用エピトープをそれらの中に含む。タ
ウペプチド配列番号１１０（３０アミノ酸）および配列番号１１２（１２アミノ酸）は、
配列番号１０１における治療用エピトープをそれらの中に含む。実施例１８〜１９に記載
されたようにＮ末端のＣｙｓ残基を介してペプチドをＫＬＨに結合体化した。免疫のため
のワクチンを、１００μｌのＰＢＳ中に１００μｇの結合体化されたペプチドを含むペプ
チド−ＫＬＨ結合体を用いて調製し、最終投与体積の２００μｌにおいてフロイントアジ
ュバントと１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で乳化した。１処置群あたり５匹のＢａｌｂ／ｃマ
ウスを使用した。最初の免疫を、フロイント完全アジュバントとともに製剤化されたＰＢ
Ｓ中のペプチド結合体を使用して行った。２週間間隔での次の２回の免疫を、フロイント
不完全アジュバントとともに製剤化されたＰＢＳ中のペプチド結合体を使用して行った。
コントロールとして、アジュバントのみを含むワクチンを使用した。最後の免疫の１０日
後に血清を回収し、実施例１９に記載されたようにＥＬＩＳＡによって抗体応答を測定し
た。個々のマウス由来の血清を１：１００から１：１２，８００まで段階希釈し、２つ組
で試験した。血清の特異性を判定するために、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４
４１／４Ｒ）および生理学的タウ２Ｎ４Ｒを固相として使用した。図６２から６５は、１
：８００希釈の血清に対する結果の要約を示している。ＥＬＩＳＡの結果を、ノンパラメ
トリックなマン・ホイットニー検定を使用して統計学的に評価した。
試験されたすべてのペプチドが、免疫されたマウスにおいてタウ特異的抗体を産生させ
た。タウペプチド配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１および配列番号１１
２によるワクチン接種によって誘導された抗体は、生理学的タウ２Ｎ４Ｒよりも病理学的
タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対して統計学的に有意に高い結合活性を
示した（図６２〜６５）。さらに、ペプチドを３０アミノ酸（配列番号１０９、配列番号
１１０）から１２アミノ酸（配列番号１１１および配列番号１１２）まで短縮することに
より、病理学的タウを優先的に認識する特異的抗体の有意に多い産生がもたらされた（配
列番号１０９，ｐ＝０．０１１５；配列番号１１０，ｐ＝０．００２９；配列番号１１１
，ｐ＝０．０００７；配列番号１１２，ｐ＜０．００１）。全体的にみて、これらの結果
は、ペプチド配列番号１０９および配列番号１１１（配列番号１００の中に治療用エピト
ープを有する）ならびにペプチド配列番号１１０および配列番号１１２（配列番号１０１
の中に治療用エピトープを有する）が免疫原性であり、アルツハイマー病に罹患している
患者の脳に存在する病理学的タウタンパク質を標的化する治療活性を有することを示した
。
実施例２３：少なくとも１つのＤＣ８Ｅ８エピトープへの結合について病理学的タウと
競合することができるデザイナーペプチド（デザイナー治療用エピトープ）の同定
エピトープ＃１（ＫＨＱＰＧＧＧの中、配列番号９８）と＃２（ＫＨＶＰＧＧＧの中、
配列番号９９）と＃３（ＨＨＫＰＧＧＧの中、配列番号１００）と＃４（ＴＨＶＰＧＧＧ
の中、配列番号１０１）との間で保存されたアミノ酸残基に基づいて、２つのさらなるペ
プチド（１１−ｍｅｒ）をデザインした。それらのデザインにおいて、これらのエピトー
プへのＤＣ８Ｅ８の結合に寄与する５残基：配列ＨｘＰＧＧＧ（配列番号１６４）の中の
ヒスチジン、プロリンおよび３つのグリシン残基を固定して維持した。ペプチドは、ＥＺ
Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）によって８５％より高い純度で合成された。２つのデザイナー
治療用エピトープは、ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５０）およびＳＶＦＱＨＬ
ＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）である。
これらのペプチドを競合ＥＬＩＳＡによって病理学的タウと競合する能力について解析
した。ＥＬＩＳＡプレート（ＩＷＡＫＩ高結合プレート，＃３８０１−０９６，Ｂｅｒｔ
ｏｎｉ ＧｍｂＨ，Ａｕｓｔｒｉａ）を、１００μｌ／ウェルの、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍ
ｌの精製された組換えタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）４Ｒで、４℃において一晩
コーティングした。コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０
（０．０５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０が補充されたリン酸緩衝食塩水）で４回洗浄し、２
５℃において２時間、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０でブロッキングした。各ペプチドを別々に
５ｍＭの最終濃度でＰＢＳに溶解した。ポリプロピレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，＃６
５１２０１）においてＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０中のペプチドの２倍段階希釈物を調製した
（濃度範囲８０μＭ、４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭおよび２．５μＭ）。１０
０μｌの各ペプチド希釈物を１００μｌの２μｇ／ｍｌの精製されたＤＣ８Ｅ８モノクロ
ーナル抗体と混合した（精製は、実施例５に記載されたように行った）。次いで、得られ
た２００μｌの混合物は、１μｇ／ｍｌのＤＣ８Ｅ８抗体、ならびに４０μＭ、２０μＭ
、１０μＭ、５μＭ、２．５μＭおよび１．２５μＭのペプチドを含んだ。ポジティブコ
ントロールとしてタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）４Ｒを含めた。抗体／ペプチド
混合物を、２５０ｒｐｍに設定された回転プラットフォーム上において２５℃で１時間イ
ンキュベートした。次いで、１００マイクロリットルの抗体／ペプチド混合物を、調製さ
れたＥＬＩＳＡプレートに移し、２５０ｒｐｍに設定された回転プラットフォーム上にお
いて２５℃で１時間インキュベートした。そのＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ
２０で４回洗浄した。次いで、そのＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で１
：４０００希釈された１００μｌのポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブリン／ＨＲＰ
（Ｄａｋｏ，＃Ｐ０４４７）とともにインキュベートし、２５０ｒｐｍに設定された回転
プラットフォーム上において２５℃で１時間インキュベートした。そのＥＬＩＳＡプレー
トをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。次いで、そのＥＬＩＳＡプレートを、１．
５μｌ／２ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２（ＳＩＧＭＡ，Ｈ−０９０４）が補充された０．１Ｍ
酢酸Ｎａ ｐＨ＝６．０（Ｒｏｔｈ，＃６７７９）中の１００μｌの１．５ｍｇ／２ｍｌ
のｏ−ＰＤＡ（ｏ−フェニレンジアミン，ＳＩＧＭＡ，Ｐ１５２６）とともに２５℃で１
０分間、暗所においてインキュベートした。１００μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４（Ｍｅｒｃｋ
，１．００７３１．１０００）を加えることによって反応を停止した。発色されたシグナ
ルを、４９０ｎｍにおいて読むことによって測定した（例えば、Ｖｉｃｔｏｒ Ｍｕｌｔ
ｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ）を使用して）。
２つのデザイナーペプチド、すなわち、ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５０）
およびＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）の両方ともが、ＤＣ８Ｅ８への結合
についてタウΔ（１−１５０；３９２−４４）４Ｒと競合することができた（図６６）。
デザイナー治療用エピトープ１と呼ばれるペプチドＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ（配列番号
２５０）は、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）４Ｒと比べてＤＣ８Ｅ８に対して最
もよく似た親和性を示した。デザイナー治療用エピトープ２と呼ばれるペプチドＳＶＦＱ
ＨＬＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）のＤＣ８Ｅ８に対する親和性は、この抗体に対する
疾患タウ（タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）４Ｒの親和性よりも１桁超高かった。
実施例２４：デザイナー治療用エピトープ１および２の免疫原性および免疫応答の特異
性についてのインビボ試験
デザイナー治療用エピトープ１（ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ，配列番号２５０）および
デザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ，配列番号２５１）を、Ｃ末
端Ｃｙｓ残基を介してＫＬＨに結合体化し（実施例１８に記載されたように）、Ｂａｌｂ
／ｃマウスを免疫するために使用した。各デザイナー治療用エピトープに対して３匹のマ
ウスを使用した。免疫は、以下のとおり行った。免疫用のワクチンを、１００μｌのＰＢ
Ｓ中に１００μｇの結合体化ペプチドを含むデザイナー治療用エピトープ−ＫＬＨ結合体
を用いて調製し、最終投与体積の２００μｌにおいてフロイントアジュバントと１：１（
ｖｏｌ／ｖｏｌ）で乳化した。最初の免疫を、フロイント完全アジュバントとともに製剤
化されたＰＢＳ中のデザイナー治療用エピトープ−ＫＬＨ結合体を使用して行った。４週
間間隔での次の４回の免疫を、フロイント不完全アジュバントとともに製剤化されたＰＢ
Ｓ中のデザイナー治療用エピトープ−ＫＬＨ結合体を使用して行った。コントロール免疫
のために、デザイナー治療用エピトープ−結合体の代わりにＰＢＳを使用した。最後の免
疫の１４日後に血清を調製した。
１．抗体は病理学的タウを区別する。血清の特異性を判定するために、２つのタウタン
パク質を使用した：組換え病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）４Ｒおよび生
理学的タウ２Ｎ４Ｒ。各マウス由来の血清を、１：１００から１：１２，８００まで段階
希釈し、３つ組で試験した。１：４，０００希釈されたポリクローナルヤギ抗マウス免疫
グロブリン／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ，＃Ｐ０４４７）を使用して、抗体価を測定した。図６７
は、１：３２００希釈に対する代表的な結果を示している。
両方のデザイナー治療用エピトープが、免疫されたマウスにおいて高い免疫応答をもた
らした。さらに、試験された両方のデザイナー治療用エピトープが、生理学的タウ２Ｎ４
Ｒと比べてより高い親和性で病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）４Ｒを認識
する抗体を誘導した（図６７）。この区別は、免疫されたすべての動物由来の血清につい
て統計学的に有意である。全体的にみて、ＤＣ８Ｅ８を用いて観察された活性を用いて得
られた結果と組み合わせて、これらの結果は、デザイナー治療用エピトープ１および２の
両方が免疫原性であり、アルツハイマー病患者の脳における病理学的タウタンパク質を標
的化する治療的可能性を有する抗体応答を誘導することを示している。
２．抗体アイソタイプ：これらのデザイナー治療用エピトープ１および２に応答して産
生される抗体の特定のアイソタイプを判定するために、同じ群のマウス由来の血清をプー
ルし、１：１００から１：１２，８００まで段階希釈し、抗体アイソタイプＥＬＩＳＡに
よって３つ組で試験した。マウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇ
Ｇ３アイソタイプを検出するために、抗マウスサブクラス特異的ＨＲＰ結合体化二次抗体
を使用した（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した抗体，抗ＩｇＧ１
−＃ＬＳ−Ｃ５９１０７、抗ＩｇＧ２ａ−＃ＬＳ−Ｃ５９１１２、抗ＩｇＧ２ｂ−＃ＬＳ
−Ｃ５９１１７、抗ＩｇＧ３−＃ＬＳ−Ｃ５９１２５および抗ＩｇＭ−＃ＬＳ−Ｃ５５８
７５）。コントロールマウスから得られた抗血清は、陰性だった。図６８は、１：８００
希釈に対する代表的な結果を示している。プールされた血清を用いて得られたデータは、
試験された両方のデザイナー治療用エピトープによる免疫が広範囲の抗タウ抗体アイソタ
イプを誘導することおよびアイソタイププロファイルがすべての試験において非常によく
似ていることを証明した。両方のデザイナー治療用エピトープが、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２
ｂおよびＩｇＧ３応答と比較して、主にＩｇＧ１抗体を産生させた（図６８）。
３．デザイナー治療用エピトープは、病理学的タウと生理学的タウとを統計学的に非常
に有意に区別する抗体応答を誘導する。デザイナー治療用エピトープに対して産生された
抗体の親和性の解析を、実施例５および１９に記載されたように、ＣＭ５センサーチップ
を使用したＢＩＡＣＯＲＥ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ）における
表面プラズモン共鳴によって行った。各解析サイクルにおいて、ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳ
Ｃ（配列番号２５０）であるデザイナー治療用エピトープ１（１００倍希釈されたもの）
またはＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）であるデザイナー治療用エピトープ
２（１００倍希釈されたもの）に対するマウス抗血清（３匹のマウス由来のプールされた
抗血清）を、ほぼ飽和に等しい約９５０ＲＵの固定化レベルに達するように、分析フロー
セルに捕捉した。基準として、タウに結合しない無関係の抗体Ｒａｂ５０（Ｍａｃｉｋｏ
ｖａら、１９９２）を基準フローセルに捕捉した。ＫＡ測定のために、ならびに動態速度
定数ｋＯＮおよびｋＯＦＦの測定のために、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４
１）４Ｒまたは生理学的タウ２Ｎ４Ｒの１００ｎＭ溶液を１００μｌ／分の流速でセンサ
ーチップの上に注入した。
デザイナー治療用エピトープ１および２によるワクチン接種によって誘導された抗体は
、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）４Ｒと生理学的タウ２Ｎ４Ｒとを区別
した（図６９Ａおよび６９Ｂ）。表面プラズモン共鳴によって測定された、デザイナー治
療用エピトープ１（ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５０）に対する抗血清中に存
在する抗体の親和性は、生理学的タウと比べて、病理学的タウに対してほぼ５０倍高い親
和性を示した（これは、非常に統計学的に有意である（ｐ＜０．００１））。表面プラズ
モン共鳴によって測定された、デザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳ
Ｃ（配列番号２５１）に対する抗血清中に存在する抗体の親和性は、生理学的タウと比べ
て、病理学的タウに対してほぼ１５倍高い親和性を示した（これは、非常に統計学的に有
意である（ｐ＜０．０１））。
４．デザイナー治療用エピトープは、ヒトＡＤ脳における病理学的タウ種を認識する抗
体応答を誘導する。デザイナー治療用エピトープで免疫されたマウスにおいて産生される
抗体の特異性を判定するために、ヒトＡＤ脳の凍結切片において免疫組織化学的染色を行
った。
ヒトＡＤ脳組織サンプル（嗅内皮質，ＡＤ Ｂｒａａｋ ＶＩ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ
ｓ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋによって提供されたもの）を、４℃において２日間、ＰＢＳ中
の４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで、凍結保護し（２５％スクロース）、冷２
−メチルブタン（−４２℃）中で凍結し、クライオトームにおいて薄片に切断した。浮遊
組織切片（４０μｍ）を、室温（２５℃）において１分間、冷（４℃）９９％ギ酸で処理
した。その切片を、標準的なアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ法（ＡＢＣ Ｅｌｉｔ
ｅ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用し
て免疫染色した。デザイナー治療用エピトープ１（配列番号２５０）およびデザイナー治
療用エピトープ２（配列番号２５１）に対するマウス抗血清（各々、３匹の免疫マウスか
らプールされたもの）を、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の、５％ウシ血清アルブミン、０
．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で１：２０００希釈した。次いで、切片をＯｌｙｍｐ
ｕｓ ＢＸ５１顕微鏡で検鏡した。
免疫組織化学的染色は、両方のデザイナー治療用エピトープＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ
（配列番号２５０）およびＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）に対して産生さ
れたマウス免疫血清（ｉｍｍｕｎｏｓｅｒａ）が、アルツハイマー病脳の嗅内皮質におけ
る病理学的タウ構造、すなわち、神経原線維変化および糸屑状構造物を特異的に認識する
ことを示した（図７０Ａ〜Ｄ）。デザイナー治療用エピトープ１およびデザイナー治療用
エピトープ２に対する抗血清は、コントロールヒト脳における正常タウを認識しなかった
（図７０Ｅ、Ｆ）。
５．デザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５１）は
、アルツハイマー病のトランスジェニックラットモデルの脳における病理学的タウ種を認
識する抗体応答を誘導する。デザイナー治療用エピトープで免疫されたマウスにおいて産
生される抗体の特異性を判定するために、トランスジェニックラットＳＨＲ７２の脳のパ
ラフィン包埋切片において免疫組織化学的染色を行った。
ＳＨＲ７２系統のトランスジェニックラット（７ヶ月齢）に、深麻酔下において１分間
、ＰＢＳを経心的に灌流した後、１００ｍｌの４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）
を灌流した。灌流後、頭部を切断し、すみやかに脳を取り出した。使い捨てメス刃を使用
して、脳を矢状方向に２つの同じサイズの半球に切断した。その脳組織を４％パラホルム
アルデヒド中で後固定し、パラフィンに包埋し、ミクロトームにおいて切片に切断した。
８μｍパラフィン包埋組織切片において免疫組織化学的検査および組織病理学的検査を行
った。組織切片を、室温（２５℃）において、抗原アンマスキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２０分間前処理し、冷（＋４℃）９０％ギ
酸（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で１分間前処理した。ブロッキングの後、切
片を、ブロッキング溶液（５０ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中の５％ウシ血清アルブミン、０
．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）で１：１０００希釈されたデザイナー治療用エピトープ
２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５１）に対して産生された血清とともに一晩
インキュベートした。洗浄した後、切片を室温において１時間、ビオチン化二次抗体（Ｖ
ｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）とともにインキュベートし、次いで、室温（２５℃）において、アビジン−ビオ
チンペルオキシダーゼ−複合体溶液と６０分間反応させた（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌ
ｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。免疫反応を、ペ
ルオキシダーゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ ＶＩＰ，Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｃａ，ＵＳＡ）を用いて可視化した。切片をＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ７１顕微鏡で
検鏡した。
トランスジェニックラット脳（ＳＨＲ７２）において、デザイナー治療用エピトープ２
（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５１）に対して産生された血清は、神経原線維
変化を認識した（図７０Ｇ）。同齢のコントロールラット脳において、その抗体は、神経
細胞を染色しなかった（図７０Ｈ）。
デザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号２５１）に対し
て産生された血清は、オリゴマーのプレ濃縮体段階のタウ（図７０Ｉ）、ならびに細胞内
の神経原線維変化（図７０Ｊ）を認識した。
６．デザイナー治療用エピトープ１および２によって誘導された抗体は、ヒトＡＤ脳に
おける可溶性および不溶性の病理学的タウを認識する：サルコシル可溶性および不溶性の
病理学的タウをヒトアルツハイマー病の側頭皮質（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂｒａｉｎ
Ｂａｎｋから入手したもの）から単離し、実施例８に記載されたように免疫ブロット法
によって解析した。
可溶性および不溶性の病理学的タウタンパク質画分を含む膜を、ＰＢＳＴ中の５％脱脂
粉乳で１：１希釈されたＤＣ８Ｅ８ハイブリドーマ上清またはデザイナー治療用エピトー
プ１（配列番号２５０、ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ）に対して産生されたプールされたマ
ウス抗血清またはデザイナー治療用エピトープ２（ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ、配列番号
２５１）に対して産生されたプールされたマウス抗血清とともにインキュベートした（こ
こで、両方のプールされた抗血清が、ＰＢＳＴ中の５％脱脂粉乳において１：１００希釈
された）。膜を洗浄し、次いで、１：４０００希釈されたペルオキシダーゼ結合体化ヤギ
抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とともにインキュベートした。ＬＡＳ３０
００イメージングシステム（ＦＵＪＩ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を
使用して検出されるＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉ
ｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて、そのブロ
ットの像を得た。シグナル強度を、ＡＩＤＡソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍａｇ
ｅ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｒａｙｔｅｓｔ，Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）を使用して定量した。
この免疫ブロット解析の結果を図７１に示す。これらの結果は、デザイナー治療用エピ
トープ１（すなわち、ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ）（配列番号２５０）と２（すなわちＳ
ＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ）（配列番号２５１）の両方に対して産生された抗体が、ＤＣ８
Ｅ８と同じ病理学的タウタンパク質を認識することを示している。ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧ
ＳＣ（配列番号２５０）抗血清、ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ（配列番号２５１）抗血清お
よびＤＣ８Ｅ８抗体のすべてが、ＡＤ脳組織から単離されたサルコシル可溶性および不溶
性タウ画分中に存在する病理学的タウタンパク質を特異的に認識した（図７１）。
７．デザイナー治療用エピトープ１および２によって誘導された抗体は、タウトランス
ジェニックラットの脳における可溶性および不溶性の病理学的タウを認識する。サルコシ
ル可溶性および不溶性の病理学的タウを、実施例８に記載されたように、タウトランスジ
ェニックラット脳（実施例７に記載されたＳＨＲ７２系統）の脳から単離した。
免疫ブロット解析（実施例８に記載された）の結果を図７２に示す。これらの結果は、
デザイナー治療用エピトープ１（すなわち、ＧＷＳＩＨＳＰＧＧＧＳＣ）（配列番号２５
０）および２（すなわち、ＳＶＦＱＨＬＰＧＧＧＳＣ）（配列番号２５１）によって誘導
された抗体が、ＤＣ８Ｅ８と同じ病理学的タウタンパク質を認識することを示している（
図７２）。単量体およびオリゴマーの病理学的タウタンパク質を標的化することによって
、病理学的タウ凝集体の生成が妨げられ、タウ病理が減少し、ヒトにおける治療効果およ
びＡＤの処置がもたらされる。
実施例２５：ＡＤをモデル化するトランスジェニックラットにおけるデザイナー治療用
エピトープのインビボ有効性
デザイナー治療用エピトープによる免疫療法は、処置されたラットの神経行動学的パラ
メータの改善を示した。トランスジェニックラットＳＨＲ７２における免疫療法のために
、デザイナー治療用エピトープ２（配列番号２５１）を選択した。Ａｄｊｕ−ｐｈｏｓア
ジュバントと組み合わされた、ＫＬＨに結合体化されたデザイナー治療用エピトープ２（
配列番号２５１）を含むワクチン用量を、ラットの皮下に免疫した。実施例１８に記載さ
れたようにワクチンを調製した。１用量は、１００μｇの結合体化されたデザイナー治療
用エピトープ２を含んだ。複合スコアであるＮｅｕｒｏｓｃａｌｅでの神経学的検査と組
み合わされた標準的な運動試験のセットによって、複合運動障害を測定した。免疫療法の
効果を測定する目的で、６．５ヶ月齢において、デザイナー治療用エピトープ２（配列番
号２５１）を含むワクチンで処置されたトランスジェニックラットＳＨＲ７２を行動試験
に供した。
デザイナー治療用エピトープ２（配列番号２５１）で処置されたラットは、梁歩行試験
において、アジュバントだけを投与されたトランスジェニックコントロールラットよりも
２７％の逃避潜時の短縮を示した（図７３Ａ）。後肢のスリップ回数は、トランスジェニ
ックコントロールと比較して、ワクチン接種群において統計学的に有意に４４％減少した
（ｐ＜０．０５）（図７３Ｂ）。梁歩行試験、握力牽引力試験および神経学的検査（基本
的な反射、後肢逃避伸展反射）において得られた値から、Ｎｅｕｒｏｓｃａｌｅスコアを
計算した。その免疫は、コントロール群と比べて、ペプチド配列番号２５１で処置された
ラットのＮｅｕｒｏｓｃａｌｅスコアを有意に２６％改善した（図７３Ｃ）。総Ｎｅｕｒ
ｏｓｃａｌｅスコアは、非処置トランスジェニックラットと比べて、処置されたトランス
ジェニックラットの神経行動学的改善を確証させた。すべての統計データは、ノンパラメ
トリックなマン・ホイットニーＵ検定を用いて得られた。
デザイナー治療用エピトープ２による免疫療法は、処置されたアルツハイマートランス
ジェニックラットの脳における病理学的タウの統計学的に有意な減少を示した（ｐ＜０．
０５）。不溶性の病理学的タウのレベルに対する、デザイナー治療用エピトープ２（配列
番号２５１）による免疫の効果を確かめるために、本発明者らは、ラット脳サンプルの免
疫ブロット解析を使用した。デザイナー治療用エピトープ２（配列番号２５１）で免疫さ
れたトランスジェニック動物およびアジュバントだけで免疫されたトランスジェニック動
物のコントロール群の脳組織（脳幹）を、実施例８に記載されたように、サルコシル不溶
性タウ画分の調製のために使用した。実施例１９に記載されたように、免疫ブロット解析
を行った。Ｔ検定によって統計解析を行った。リン酸化依存的モノクローナル抗体ＡＴ８
、ＤＣ２０９、ＤＣ２１７およびｐａｎ−タウモノクローナル抗体ＤＣ２５を、この研究
において使用した。
デザイナー治療用エピトープ２（配列番号２５１）で免疫されたたトランスジェニック
ラットの群およびコントロール群の不溶性タウレベルの免疫ブロットの定量的解析の結果
を図７４に示す。免疫療法は、アジュバントだけを投与されたコントロールトランスジェ
ニックラットと比べて、免疫された動物において不溶性タウの量を統計学的に有意に減少
させた。不溶性タウの減少は、解析されたすべてのタウエピトープにおいて観察された。
３４７−３５３エピトープおよびホスホ−タウエピトープにおける減少は、統計学的に有
意だった（Ｐ＜０．０５）。観察された減少は、以下のとおりだった：３４７−３５３タ
ウエピトープにおいて、４６％（Ｐ＜０．０５）、ｐＴ２１７タウエピトープにおいて、
５７％（Ｐ＜０．０５）、ｐ２３１−タウエピトープにおいて、５５％（Ｐ＜０．０５）
、ｐＳ２０２／ｐＴ２０５タウエピトープにおいて、４７％（Ｐ＜０．０５）。
これらの結果は、そのワクチンが、病理学的タウを減少させる病理学的タウ特異的抗体
を誘導したことを示している。処置されたアルツハイマー病ラットモデルの脳における病
理学的タウレベルの低下は、神経行動学的パラメータと相関した。低レベルの不溶性タウ
を有する処置された動物は、コントロール動物と比較して、より短い逃避潜時および統計
学的に有意に減少した後肢のスリップ回数を示した（ｐ＜０．０５）。これらの知見は、
デザイナー治療用エピトープによる免疫が、処置された動物において不溶性の病理学的タ
ウの減少および神経行動学的改善をもたらすことを示し、これは、ヒトアルツハイマー病
および関連タウオパチーを処置するためのそのワクチンの治療的可能性を強調する。
実施例２６：ＤＣ８Ｅ８最小エピトープ（治療用コアユニット用）のさらなる特徴付け
ＤＣ８Ｅ８の最小エピトープをさらに特徴付けるために、ヒトタウタンパク質２Ｎ４Ｒ
の微小管結合リピート領域（ＭＴＢＲ１、ＭＴＢＲ２、ＭＴＢＲ３、ＭＴＢＲ４）に由来
する、種々の長さ（４２−ｍｅｒ、１９−ｍｅｒ、１２−ｍｅｒ、７−ｍｅｒ、６−ｍｅ
ｒおよび５−ｍｅｒ）を有するタウペプチドのパネルをデザインした（図７５Ａ、Ｂ）。
ペプチドは、ＥＺＢｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）によって９５％より高い純度で合成された。
すべてのペプチドを、ＤＣ８Ｅ８への結合について病理学的タウΔ（１−１５０；３９２
−４４１）／４Ｒと競合する能力について競合ＥＬＩＳＡによって解析した。ＥＬＩＳＡ
プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，＃８２１５８１００１）を５０μｌ／ウェルの、ＰＢＳ中
の５μｇ／ｍｌの精製された組換えタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒ）で、
３７℃において一晩コーティングした。コーティングされたプレートを、ＰＢＳ／Ｔｗｅ
ｅｎ２０（０．０５％ｖ／ｖ）で５回洗浄し、２５℃において１時間、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅ
ｎ２０（０．０５％ｖ／ｖ）でブロッキングした。各ペプチドを別々に１ｍＭの最終濃度
でＰＢＳに溶解した。コニカルウェル底を有するポリプロピレンマイクロタイタープレー
ト（Ｇｒｅｉｎｅｒ，＃６５１２０１）においてＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０中のペプチドの
段階希釈物（２．５×）を、２００μＭ；８０μＭ；３２μＭ；１２．８μＭ；５．１２
μＭ；２．０４８μＭ；０．８１９２μＭ；０．３２７６８μＭの濃度範囲内で調製した
。確認用モノクローナル抗体ＤＣ８Ｅ８を、ＰＢＳにおいて０．６μｇ／ｍｌの濃度に希
釈し、６０μｌのこの希釈された抗体を、１２０μｌ／ウェルの混合物をもたらすペプチ
ドの段階希釈となるように各ウェルに加えた。その抗体／ペプチド混合物を、２３０ｒｐ
ｍに設定された回転プラットフォーム上で２５℃において１時間インキュベートした。５
０μｌ／ウェルの抗体／ペプチド混合物を、ポリプロピレンプレートから、タウΔ（１−
１５０；３９２−４４１）／４ＲでコーティングされＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０でブロッキ
ングされたＥＬＩＳＡプレートに移し（２つ組で）、２５℃において１時間インキュベー
トした。そのプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、５０μｌ／ウェルの、Ｐ
ＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で１：１０００希釈されたポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブ
リン／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ，＃Ｐ０４４７）とともに２５℃において１時間インキュベート
した。洗浄した後、次にプレートを、５０μｌ／ウェルの、１．５μｌ／２ｍｌの３０％
Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ，Ｈ−０９０４）が補充された０．１Ｍ酢酸Ｎａ ｐＨ＝６．０（
Ｒｏｔｈ，＃６７７９）中の１ｍｇ／２ｍｌのｏ−ＰＤＡ（ｏ−フェニレンジアミン，Ｓ
ｉｇｍａ，Ｐ１５２６）とともに暗所において２５℃で２０分間インキュベートした。５
０μｌ／ウェルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４（Ｍｅｒｃｋ，１．００７３１．１０００）を加える
ことによって反応を停止した後、プレートを４９２ｎｍにおいて読んだ（例えば、Ｐｏｗ
ｅｒｗａｖｅ ＨＴ，Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）。
図７６は、以下のペプチドを用いて行われた競合ＥＬＩＳＡの結果を示している：ＴＥ
ＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫ（配列番号２７０）、ＫＨＱＰＧＧＧ（配列番号２７１）、ＨＱＰ
ＧＧＧ（配列番号２７２）、ＨＱＰＧＧ（配列番号２７３）、ＱＰＧＧＧ（配列番号２７
４）、ＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶ
ＰＧＧＧＳ（配列番号２７５）、ＫＨＶＰＧＧＧ（配列番号２７６）、ＨＶＰＧＧＧ（配
列番号２７７）、ＨＶＰＧＧ（配列番号２７８）、ＶＰＧＧＧ（配列番号２７９）、ＤＮ
ＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶ（配列番号２８０）、ＨＨＫＰＧＧＧ（配列番号２
８１）、ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２８２）およびＴＨＶＰＧＧＧ（配列番号２８３）。タ
ウ治療用エピトープを含む解析されたすべてのペプチドが、病理学的タウΔ（１−１５０
；３９２−４４１／４Ｒ）と競合した。図７６に示されるように、６−ｍｅｒペプチド（
配列番号２７２、配列番号２７７および配列番号２８２）でさえ、ＤＣ８Ｅ８への結合に
ついてタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと競合することができた。しかしな
がら、ヒスチジンの除去（５−ｍｅｒペプチド配列番号２７４、２７９）または最後のグ
リシンの除去（５−ｍｅｒペプチド配列番号２７３、２７８）によって、ＤＣ８Ｅ８への
結合についてタウΔ（１−１５０；３９２−４４１／４Ｒ）との競合活性が失われた（そ
れらの５−ｍｅｒペプチドは、下線が引かれた除去されたアミノ酸ＨｉｓおよびＧｌｙを
有する配列番号２７２および配列番号２７７に由来した。上記を参照のこと）。これらの
結果は、それらの５−ｍｅｒペプチドが、病理学的タウ上にＤＣ８Ｅ８によって認識され
る治療的な３Ｄ構造をもたらさなかったことを示唆する。他方で、６つのアミノ酸残基を
含むペプチドは、競合ＥＬＩＳＡによって測定される生物学的活性に関与する治療的な３
Ｄ構造を作り出し、ＤＣ８Ｅ８の最小エピトープ（治療用コアユニット）を形成する。そ
れらのデザインにおいて、保存されている５つのアミノ酸残基が、ＤＣ８Ｅ８認識にとっ
て重要である（配列ＨｘＰＧＧＧにおけるヒスチジン、プロリンおよび３つのグリシン残
基）。
結論：上記データは、ヒトタウ上の最小ＤＣ８Ｅ８エピトープが、残基ＨＱＰＧＧＧ（
ＭＴＢＲ１の中に位置する）、ＨＶＰＧＧＧ（ＭＴＢＲ２の中）、ＨＫＰＧＧＧ（ＭＴＢ
Ｒ３の中）およびＨＶＰＧＧＧ（ＭＴＢＲ４の中）を含む６アミノ酸からなることを示唆
する。したがって、ＤＣ８Ｅ８結合部位（＝エピトープ）は、２Ｎ４Ｒタウにおいて４回
および２Ｎ３Ｒタウにおいて３回、登場する。これは、その６−ｍｅｒ配列の中で必須の
アミノ酸が、ヒスチジンおよび３つすべてのグリシンであることを示唆する。
実施例２７：ＤＣ８Ｅ８最小エピトープを有するペプチドの免疫原性の測定
ａ）ＤＣ８Ｅ８の最小エピトープを有するペプチドは、免疫原性である：個々のタウペ
プチドの免疫原性の潜在能力を測定する目的で、ペプチドを、そのＮ末端のＣｙｓ残基を
介してＫＬＨに結合体化した。
この目的のために、ＫＬＨタンパク質の表面上にペプチドの配向結合を得る目的で、Ｎ
末端に位置する余分なシステイン残基を有するシステイン付加ペプチドとしてタウペプチ
ドを合成した。ペプチドを、二機能性架橋剤Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スク
シンイミドエステル（ＧＭＢＳ）を介してＫＬＨキャリアに結合させた。結合体化反応物
を調製するために、２０ｍｇのＫＬＨ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、１０分間静かに混合
することによって結合体化緩衝液（０．９Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢ
Ｓ）に溶解して、１０ｍｇ／ｍｌの濃度にした。マレイミド活性化ＫＬＨを調製するため
に、２ｍｇの活性な二機能性架橋剤ＧＭＢＳを５０μｌの無水ジメチルホルムアミドに溶
解し、２ｍｌのＫＬＨ溶液と室温において１時間混合した。続いて、結合体化緩衝液にお
いて平衡化された５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔ
ｈｃａｒｅ）において、未反応のＧＭＢＳを除去した。ペプチドとマレイミド活性化ＫＬ
Ｈとの１：１比（ｗ／ｗ、２０ｍｇのペプチド）で室温（２５℃）において２時間、結合
体化を行った。得られた結合体を１００倍過剰のＰＢＳに対して透析し、４回の透析緩衝
液の交換により、未結合体化ペプチドを除去した。透析の後、結合体を２℃、２１，００
０×ｇで１５分間遠心した。その結合体を等分し、使用するまで−２０℃で保管した。
免疫のためのワクチンを、１００μｌのＰＢＳ中に１００μｇの結合体化ペプチドを含
むペプチド−ＫＬＨ結合体を用いて調製し、最終投与体積の２００μｌにおいてフロイン
トアジュバントと１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で乳化した。１処置群あたり５匹のＣ５７／
ＢＬマウスを使用した。最初の免疫を、フロイント完全アジュバントとともに製剤化され
たＰＢＳ中のペプチド結合体を使用して行った。１週間間隔での次の２回の免疫を、フロ
イント不完全アジュバントとともに製剤化されたＰＢＳ中のペプチド結合体を使用して行
った。最後の追加免疫の投与の１週間後に動物から採血し、回収された血清を抗体価の測
定のために使用した。特異的な抗タウ抗体の力価を、実施例１９に記載されたようにＥＬ
ＩＳＡによって測定した。各血清の段階希釈物（１：１００から１：１０２４００）を、
固相として使用される病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒおよび生理
学的タウ２Ｎ４Ｒに対して試験した。図７７Ａ〜Ｃは、１：８００希釈の血清に対する結
果の要約を示している。ＥＬＩＳＡの結果を、ノンパラメトリックなマン・ホイットニー
検定を使用して統計学的に評価した。力価は、最大ＯＤの２分の１をもたらす血清の希釈
度の逆数と定義され、それを図７８に要約した。
タウペプチドＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫ（配列番号２７０）、ＫＨＱＰＧＧＧ（配列番
号２７１）、ＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩ
ＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号２７５）、ＫＨＶＰＧＧＧ（配列番号２７６）、ＨＶＰＧＧ
Ｇ（配列番号２７７）、ＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶ（配列番号２８０）、
ＨＨＫＰＧＧＧ（配列番号２８１）およびＴＨＶＰＧＧＧ（配列番号２８３）でマウスを
免疫することにより、免疫されたマウスにおいて、高レベルのタウ特異的抗体が誘導され
た。さらに、誘導された抗体は、生理学的タウ２Ｎ４Ｒよりも病理学的タウΔ（１−１５
０；３９２−４４１）／４Ｒに対してより高い親和性を示した（図７７Ａ〜Ｃ）。この区
別は、免疫されたすべての動物由来の血清について統計学的に有意だった（配列番号２７
０，ｐ＜０．００７９；配列番号２７１，ｐ＜０．００５２；配列番号２７５，ｐ＜０．
００７９；配列番号２７６，ｐ＜０．００７９；配列番号２７７，ｐ＜０．０３７９；配
列番号２８０，ｐ＜０．０１５９；配列番号２８１，ｐ＜０．０３７９および配列番号２
８３，ｐ＜０．０２８６）。概して、病理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／
４Ｒに対する幾何平均抗体価は、生理学的タウ２Ｎ４Ｒに対するそれよりも３〜５倍高か
った（図７８）。図７８に示されるように、病理学的タウに対する最も高い抗体価は、タ
ウペプチド配列番号２７５（ＧＭＴ５１２００）、配列番号２８０（ＧＭＴ５１２００）
、配列番号２７０（ＧＭＴ２２２８６）および配列番号２７６（ＧＭＴ２２２８６）によ
って誘導された。治療的な３Ｄ構造を欠くとみられる５−ｍｅｒペプチド（配列番号２７
３、２７４、２７８、２７９）は、免疫された動物においてタウ特異的抗体を誘導するこ
とができなかった。全体的に見て、これらの結果は、最小の治療用エピトープ（治療用コ
アユニット）を有するペプチド（配列番号２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２
７７、２８０、２８１および２８３）が免疫原性であり、アルツハイマー病患者の脳にお
ける病理学的タウタンパク質を標的化する治療的な潜在能力を有する抗体を誘導すること
を示した。上述のエピトープマッピング実験は、ペプチド配列番号２８２が治療的な３Ｄ
構造を作り出す（例えば、最小ＤＣ８Ｅ８エピトープを少なくとも部分的に模倣する）が
、それにもかかわらず、免疫されたマウスにおいて特異的抗体応答を誘導しない（病理学
的タウに対するＧＭＴは１７４だった。図７８）ことを示した。
ｂ）アイソタイププロファイル：Ｃ５７／ＢＬマウスにタウペプチド配列番号２７０、
２７１、２７５、２７６、２７７、２８０、２８１および２８３をワクチン接種すること
により、病理学的タウに特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ抗体アイソタイプの形成が優
先的に誘導された。ペプチドに応答して産生された抗体の特異的アイソタイプを判定する
ために、マウス由来の血清をプールし、１：１００から１：１２，８００まで希釈し、病
理学的タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対するＥＬＩＳＡによって２つ組
で試験した（実施例１９に記載されたように）。マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２
ｃ、ＩｇＧ３およびＩｇＭアイソタイプを検出するために、抗マウスサブクラスに特異的
なＨＲＰ結合体化二次抗体を、ＰＢＳにおいて１：５，０００希釈した（抗体はＬｉｆｅ
ｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）。図７９は、代表的な１：８００希釈
に対する結果を示している。そのデータは、ＫＬＨに結合体化されたペプチドが、広範囲
の抗タウ抗体アイソタイプを誘導したことを示唆している。概して、ペプチドのワクチン
接種によって、高親和性抗体であると考えられている抗体アイソタイプ（ＩｇＧ１、Ｉｇ
Ｇ２ｂ）が最も高いレベルで産生された。病理学的タウに対して優先的な親和性を有する
高力価のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ抗体の存在は、ワクチンによって誘導された免疫応答
が病理学的タウ種に対するものであることを示唆した。ｍｏｃｋで免疫されたマウス（ア
ジュバントだけを投与された）から得られたコントロール血清は、陰性だった（データ示
さず）。
ｃ）治療用エピトープを有するペプチドは、病理学的タウと生理学的タウとを区別する
抗体を誘導する：表面プラズモン共鳴を使用した結合事象のリアルタイムモニタリングに
よって、個々のタウペプチドＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫ（配列番号２７０）、ＫＨＱＰＧ
ＧＧ（配列番号２７１）、ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２７２）、ＨＱＰＧＧ（配列番号２７
３）、ＱＰＧＧＧ（配列番号２７４）、ＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳ
ＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳ（配列番号２７５）、ＫＨＶＰＧＧＧ（配列
番号２７６）、ＨＶＰＧＧＧ（配列番号２７７）、ＨＶＰＧＧ（配列番号２７８）、ＶＰ
ＧＧＧ（配列番号２７９）、ＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶ（配列番号２８０
）、ＨＨＫＰＧＧＧ（配列番号２８１）、ＨＫＰＧＧＧ（配列番号２８２）およびＴＨＶ
ＰＧＧＧ（配列番号２８３）で免疫されたマウスＣ５７／ＢＬのプールされた血清由来の
抗体の会合（ｋＯＮ）および解離（ｋＯＦＦ）の動態速度の測定が可能だった。実施例５
および１９に記載されたようにＣＭ５センサーチップを使用するＢＩＡＣＯＲＥ３０００
（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ）における表面プラズモン共鳴によって解析を
行った。その解析は、上記ペプチドによる免疫によって誘導された抗体がタウΔ（１−１
５０；３９２−４４１）／４Ｒおよび生理学的タウアイソフォーム２Ｎ４Ｒの認識を区別
することができることを示した（図８０）。最小の治療用エピトープを有する、ペプチド
配列番号２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２７７、２８０、２８１および２８
３による免疫によって誘導された抗体は、対応する生理学的タウ２Ｎ４Ｒに対する親和性
と比べて、タウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒに対して優先的な親和性を示し
た。この区別は、ペプチド：配列番号２７０（ｐ＝０．０３９２）、配列番号２７１（ｐ
＝０．０３６３）、配列番号２７２（ｐ＝０．００２２）、配列番号２７６（ｐ＝０．０
０１３）、配列番号２７７（ｐ＝０．００２３）、配列番号２８０（ｐ＝０．０１０４）
、配列番号２８１（ｐ＝０．０１２３）および配列番号２８３（ｐ＝０．００１１）から
の血清に対して統計学的に有意だった。得られた結果は、図７７Ａ〜Ｃおよび図７８に要
約されている以前の免疫原性実験と一致する。
ｄ）ペプチドによって誘導された抗体は、ウエスタンブロットによって病理学的形態の
タウを認識する：マウスＣ５７／ＢＬを個々のタウペプチドで免疫することによって誘導
された抗体を、免疫ブロット法（実施例１９に記載されたように）を使用して病理学的形
態のタウに対して調べた。神経原線維病理の後期におけるＳＨＲ７２ラットの脳幹を、不
溶性の病理学的タウタンパク質の抽出のために使用した。ヒトＡＤ脳の側頭皮質（Ｂｒａ
ａｋステージＶＩ；Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ，Ｎｅｔｈｅｒｌａ
ｎｄｓから入手したもの）を、ヒト病理学的ＡＤタウの抽出のために使用した。サルコシ
ル法（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ １９９０）に従って、抽出されたタ
ウタンパク質を調製した。免疫された動物由来のプールされた血清を、ＰＢＳで１：１０
００希釈し、１次抗体として使用した。１次抗体とのインキュベーションの後、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼに結合体化されたポリクローナルウサギ抗ラット免疫グロブリン（１
：３０００；Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とインキュベーションした
。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗体を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅ
ｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒ
ｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して化学発光によって可視化した
。そのシグナルを、ＬＡＳ３０００ ＣＣＤイメージングシステム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，
Ｊａｐａｎ）を用いてデジタル化した。要約された結果を図８１に提供する。ＤＣ８Ｅ８
エピトープの治療的な３Ｄ構造をおそらく作り出すペプチド（配列番号２７０、２７１、
２７２、２７５、２７６、２７７、２８０、２８１および２８３）のワクチン接種によっ
て誘発された抗体は、ＳＨＲ７２およびＡＤ脳組織から抽出されたすべての病理学的形態
のタウタンパク質（ＡＤに特徴的なＡ６８タウトリプレットを含む）を認識した。それに
もかかわらず、治療的な３Ｄ構造を作り出すとみられるペプチド配列番号２８２（ＤＣ８
Ｅ８への結合についてタウΔ（１−１５０；３９２−４４１）／４Ｒと競合する）は、こ
の免疫されたマウスにおいて特異的抗体応答を誘導せず、ゆえに、反応性は陰性だった。
同様に、タウ特異的抗体応答を誘導することができなかった５−ｍｅｒペプチドも、この
解析において陰性だった。
ｅ）ペプチドによって誘導された抗体は、ヒトアルツハイマー病脳組織由来の切片にお
いて病理学的タウタンパク質を認識する：マウスＣ５７／ＢＬを個々のペプチドでワクチ
ン接種するによって誘発されたタウ特異的抗体を、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ ｂｒａｉｎ
ｂａｎｋから入手したヒト脳組織（パラフィンブロック）において試験した。そのブロ
ックをミクロトームにおいて切断した。アルツハイマー病脳（ＢｒａａｋステージＶ）由
来の海馬−ＣＡ１区域のパラフィン切片（８μｍ）を、室温（２５℃）において冷（＋４
℃）９９％ギ酸で１分間処理した。その組織切片をブロッキング溶液（５０ｎＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ中の、５％ＢＳＡ、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中でインキュベート
し、次いで、ブロッキング溶液で１：１０００希釈された血清とともに一晩インキュベー
トした。続いて、それらの切片を、ビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉ
ｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに室温におい
て１時間インキュベートし、次いで、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体と両方
とも２５℃においてさらに１時間反応させた（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢ
Ｃ Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。免疫反応を、ペルオキシダー
ゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ ＶＩＰ，Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａ
，ＵＳＡ）を用いて可視化し、メチルグリーン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）で対比染色した。それらの切片をＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ７１顕微鏡で検鏡した。免疫
組織化学的染色（図８２Ａ〜Ｃ、図８３）は、ペプチド配列番号２７０、２７１、２７５
、２７６、２８０、２８１および２８３による免疫によって誘導された抗体が、アルツハ
イマー病脳組織の海馬における病理学的タウ構造、すなわち、神経原線維変化を特異的に
認識したことを示唆している。上述のペプチドをワクチン接種された動物の血清は、神経
原線維病理を強くデコレートしたことから、それらの抗体が、病理学的タウタンパク質を
標的化したことが確かめられた。ペプチド配列番号２７２および２７７のワクチン接種に
よって誘導された抗体は、脳組織において病理学的タウ構造のより弱い強度の染色を示す
。より低いレベルのタウ特異的抗体応答を誘導したペプチドまたはタウ特異的抗体応答を
誘導しなかったペプチド（配列番号２７３、２７４、２７８、２７９および２８２）は、
この解析において陰性だった。アジュバントだけを投与されたマウス由来の血清を、ネガ
ティブコントロールとして使用した。それらは、神経原線維の病理を認識しなかった（図
８２Ｃ）。
本明細書に引用されたすべての参考文献（特許、特許出願、論文、教科書などを含む）
およびそれらの中で引用された参考文献は、それらがすでに引用されていない範囲まで、
それらの全体が参照により本明細書に援用される。さらに、先のパラグラフにおいてより
省略された形態で引用された以下の参考文献もまた、そのような参考文献において引用さ
れた参考文献を含んで、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
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Claims (30)

  1. ＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）、ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４）、およびＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２４）からなる群から選択される最小エピトープのうちの１つまたは複数におけるタウに結合することができる、単離された抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 前記抗体が、
    ａ）モノクローナル抗体；
    ｂ）ポリクローナル抗体；
    ｃ）組換え抗体；
    ｄ）キメラ抗体；および
    ｅ）ヒト化抗体
    から選択される、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 前記抗体が、１つまたは複数の標識剤で検出可能に標識される、請求項１に記載の抗体。
  4. 少なくとも１つの標識剤が、酵素、放射性同位体、フルオロフォア、核磁気共鳴マーカーおよび重金属から選択される、請求項３に記載の抗体。
  5. 前記抗体に結合された少なくとも１つの薬物をさらに含む、請求項１に記載の抗体。
  6. 前記抗体が、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）によって検出可能である剤で標識される、請求項３に記載の抗体。
  7. 前記抗体が、最小エピトープＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４）におけるタウに結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  8. 請求項１に記載の少なくとも１つの抗体と希釈剤またはキャリアとを含む組成物。
  9. 請求項２に記載の少なくとも１つの抗体と希釈剤またはキャリアとを含む組成物。
  10. 請求項５に記載の少なくとも１つの抗体と希釈剤またはキャリアとを含む組成物。
  11. 請求項７に記載の少なくとも１つの抗体と希釈剤またはキャリアとを含む組成物。
  12. 前記抗体が１つまたは複数の標識剤で検出可能に標識される、請求項７に記載の抗体。
  13. 前記抗体が、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）によって検出可能である標識剤で標識される、請求項１２に記載の抗体。
  14. 前記抗体が、エピトープＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）におけるタウに結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  15. 前記抗体が、エピトープＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２４）におけるタウに結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  16. 検出可能な標識、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイドまたは他の病原菌に由来するトキソイド、血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン分子またはそのフラグメント、チログロブリン、オボグロブリン、ユニバーサルＴ細胞エピトープ、サイトカイン、ケモカイン、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＲＡＮＴＥＳ、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属キレート剤、成長因子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤、脂質低下剤、選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナーゼの阻害剤、熱ショックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫試薬、抗アミロイド凝集阻害剤、およびセクレターゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物または剤をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
  17. 検出可能な標識、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイドまたは他の病原菌に由来するトキソイド、血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン分子またはそのフラグメント、チログロブリン、オボグロブリン、ユニバーサルＴ細胞エピトープ、サイトカイン、ケモカイン、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＲＡＮＴＥＳ、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属キレート剤、成長因子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤、脂質低下剤、選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナーゼの阻害剤、熱ショックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫試薬、抗アミロイド凝集阻害剤、およびセクレターゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物または剤をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
  18. 検出可能な標識、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイドまたは他の病原菌に由来するトキソイド、血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン分子またはそのフラグメント、チログロブリン、オボグロブリン、ユニバーサルＴ細胞エピトープ、サイトカイン、ケモカイン、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＲＡＮＴＥＳ、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属キレート剤、成長因子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤、脂質低下剤、選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナーゼの阻害剤、熱ショックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫試薬、抗アミロイド凝集阻害剤、およびセクレターゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物または剤をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
  19. 検出可能な標識、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイドまたは他の病原菌に由来するトキソイド、血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン分子またはそのフラグメント、チログロブリン、オボグロブリン、ユニバーサルＴ細胞エピトープ、サイトカイン、ケモカイン、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＲＡＮＴＥＳ、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属キレート剤、成長因子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤、脂質低下剤、選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナーゼの阻害剤、熱ショックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫試薬、抗アミロイド凝集阻害剤、およびセクレターゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物または剤をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
  20. 請求項１に記載の少なくとも１つの抗体を含む、被験体におけるアルツハイマー病または他のタウオパチーに関連する少なくとも１つの症状を回復させるための組成物。
  21. 前記少なくとも１つの症状が、進行性の記憶障害、認知低下、言語の低下、行動変化、心理学的症状、気分の撹乱、情動、食欲、覚醒睡眠サイクル、錯乱、激越、抑うつ、損なわれた運動機能、失行、ミオクローヌス、歩行障害、筋力低下、錐体外路の特徴、運動緩徐、硬直、静止時振戦、基本的な日常生活動作の損なわれた成績、および失見当識から選択される、請求項２０に記載の組成物。
  22. エピトープＨＱＰＧＧＧ（配列番号２２３）、ＨＶＰＧＧＧ（配列番号１５４）、およびＨＫＰＧＧＧ（配列番号２２４）の３つすべてにおけるタウに結合することができる、単離された抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  23. 前記抗体が、
    ａ）モノクローナル抗体；
    ｂ）ポリクローナル抗体；
    ｃ）組換え抗体；
    ｄ）キメラ抗体；および
    ｅ）ヒト化抗体
    から選択される、請求項２２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  24. 前記抗体が、１つまたは複数の標識剤で検出可能に標識される、請求項２２に記載の抗体。
  25. 少なくとも１つの標識剤が、酵素、放射性同位体、フルオロフォア、核磁気共鳴マーカーおよび重金属から選択される、請求項２４に記載の抗体。
  26. 前記抗体に結合された少なくとも１つの薬物をさらに含む、請求項２２に記載の抗体。
  27. 請求項２２に記載の少なくとも１つの抗体と希釈剤またはキャリアとを含む組成物。
  28. 検出可能な標識、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイドまたは他の病原菌に由来するトキソイド、血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン分子またはそのフラグメント、チログロブリン、オボグロブリン、ユニバーサルＴ細胞エピトープ、サイトカイン、ケモカイン、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＲＡＮＴＥＳ、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト、遷移金属キレート剤、成長因子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酸化防止剤、脂質低下剤、選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤、タウ凝集の阻害剤、タンパク質キナーゼの阻害剤、熱ショックタンパク質の阻害剤、抗アミロイド受動および能動免疫試薬、抗アミロイド凝集阻害剤、およびセクレターゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物または剤をさらに含む、請求項２７に記載の組成物。
  29. 請求項２２に記載の少なくとも１つの抗体を含む、被験体におけるアルツハイマー病または他のタウオパチーに関連する少なくとも１つの症状を回復させるための組成物。
  30. 前記少なくとも１つの症状が、進行性の記憶障害、認知低下、言語の低下、行動変化、心理学的症状、気分の撹乱、情動、食欲、覚醒睡眠サイクル、錯乱、激越、抑うつ、損なわれた運動機能、失行、ミオクローヌス、歩行障害、筋力低下、錐体外路の特徴、運動緩徐、硬直、静止時振戦、基本的な日常生活動作の損なわれた成績、および失見当識から選択される、請求項２９に記載の組成物。
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