CN112236452A - 检测和治疗阿尔茨海默氏病的基于抗体的方法 - Google Patents

检测和治疗阿尔茨海默氏病的基于抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了结合磷酸化和去磷酸化的tau的抗体和抗原结合片段以及用于检测和治疗阿尔茨海默氏病和其他tau蛋白病的方法。还包括确定人类受试者中阿尔茨海默氏病时期和监测抗tau疗法有效性的方法。

Description

检测和治疗阿尔茨海默氏病的基于抗体的方法
领域
本申请要求2018年3月28日提交的美国专利申请62/649,208、2018年4月30日提交的美国专利申请62/664,662和2018年7月25日提交的美国专利申请62/703,299的优先权，其每一个均通过引用整体并入本文。
本文公开了用于检测、监测、预防和/或治疗阿尔茨海默氏病和其他tau蛋白病的抗体、组合物、试剂盒和方法。
背景与概述
阿尔茨海默氏病(AD)是一种破坏高级脑结构，如涉及于记忆和认知中的那些脑结构相关的进行性神经变性病症。所述疾病导致认知功能缺陷和记忆、学习、语言衰退以及进行有意和有目的活动的能力衰退。AD也伴随相伴行为性、情绪性、人际性和社会性退化。这些认知和行为缺陷致使生活困难(Burns et al.,Alzheimer’s disease,The Lancet,vol.360,Jul.13,2002)。晚期AD患者常不能说话、理解语言和处理他们自己的基本个人护理，最终需要专职护理和监视，且常依赖于家庭成员和疗养院。AD是老年性痴呆的主要病因，且预测随着人口中的年长人士的比例增长，发病率会增加。预测患有AD的人士的总数在2000年与2050年之间会增加至少三倍，从而致使AD成为世界范围内的公共健康问题(Sloane et al.,The Public Health Impact of Alzheimer’s Disease,2000-2050:Potential Implication of Treatment Advances,Annu.Rev.Public Health,23:213-31,2002)。AD的临床检测、管理和治疗仍然远远不够。对于检测和治疗AD的有效的方法仍然存在未满足的需要。
通过分析脑切片以鉴定脑中神经元外斑块以及细胞内和细胞外神经原纤维缠结的存在，AD在组织学上已得到病理学上的表征。斑块主要由β淀粉样蛋白(Αβ)组成，而缠结包含病理性形式的tau，如tau构象异构体及其聚集体。尽管研究表明淀粉样蛋白和tau发病机理之间存在关联，但斑块和缠结与疾病过程之间的关系仍不清楚(Hardy et al.,Genetic dissection of Alzheimer’s disease and related dementias:amyloid andits relationship to tau,Nature Neuroscience,vol 1,No.5,1998；Oddo et al.,AβImmunotherapy Leads to Clearance of Early,but Not Late,HyperphosphorylatedTau Aggregates via the Proteasome,Neuron,43:321-332,2004；Rapoport et al.,2002；Roberson,et al.,Reducing Endogenous Tau Ameliorates Amyloidβ-InducedDeficits inan Alzheimer’s Disease Mouse Model,Science,316:750,2007；Shipton etal.,Tau Protein Is Required for Amyloidβ-Induced Impairment of HippocampalLong-TermPotentiation,J.Neuroscience,31(5):1688-1692,2011)。Αβ在AD病理学的主要作用初始是在称为“Αβ级联”的假设中提出，其中在Αβ沉积之后是tau磷酸化和缠结形成，然后是神经元死亡(Hardy和Allsop,Amyloid deposition as the central eventinthe aetiology of Alzheimer’s disease,TiPS,vol12,1991；Hardy和Selkoe,TheAmyloid Hypothesis of Alzheimer’s Disease:Progress and Problems on the Roadto Therapeutics,Science,vol 297,2002；对于综述，参见Walsh和Selkoe,Decipheringthe Molecular Basis of Memory Failure inAlzheimer’s Disease,Neuron,44:181-193,2004；也参见Seabrook et al.,Beyond Amyloid the Next Generation ofAlzheimer’s Disease Therapeutics,Molecular Intervention,7(5),2007)。
因此，AD的治疗方法通常集中于靶向Aβ和tau，并且关于这些靶标的许多研究今天仍在继续。在AD患者中进行临床试验的最先进的针对疾病的疗法包括被动免疫疗法，如用于Aβ去除的BAN2401、ADUCANUMAB、GANTENERUMAB和CRENEZUMAB；靶向tau蛋白的C2N 8E12、RO7105705和BIIB092；以及用于Aβ疗法的活性疫苗(例如CAD106、Lu AF20513、ABvac 40)或靶向疾病经修饰的tau的ACI-35和AADvac1。
最近的工作已经导致了许多直接或间接特别针对tau级联的治疗方法(对于综述文章，参见，例如Dickey和Petrucelli,Pharmacologic reductions of total taulevels；implications for the role of microtubule dynamics in regulating tauexpression,Molecular Neurodegeneration,1:6,2006；Schneider和Mandelkow,Tau-Based Treatment Strategies inNeurodegenerative Disease,Neurotherapeutics,5:443-457,2008；Zilka et al.,Chaperone-like Antibodies Targeting Misfolded TauProtein:New Vistas inthe Immunotherapy of Neurodegenerative Foldopathies,Journal of Alzheimer’s Disease,15:169-177,2008)，包括预防或逆转tau聚集的化合物(Wischik et al.,Selective inhibition of Alzheimer’s disease-like tauaggregation by phenothiazines,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:11213-11218,1996；Necula et al.,Cyanine Dye N744 Inhibits Tau Fibrillization by BlockingFilament Extension:Implications for the Treatment of TauopathicNeurodegenerative Diseases,Biochemistry,44:10227-10237,2005；Pickhardt et al.,Screening for Inhibitors of Tau Polymerization,Current Alzheimer Research,2:219-226,2005；Taniguchi et al.,Inhibition of Heparin-induced Tau FilamentFormation by Phenothiazines,Polyphenols,and Porphyrins,The Journal ofBiological Chemistry,280:9,7614-7623,2005；Larbig et al.,Screening forInhibitors of Tau ProteinAggregation into Alzheimer Paired Helical Filaments:ALigand Based Approach Results inSuccessful Scaffold Hopping,CurrentAlzheimer Research,4:315-323,2007)，抑制tau激酶或激活tau磷酸酶的小分子型药物(Iqbal和Grundke-Iqbal,Inhibition of Neurofibrillary Degeneration:A PromisingApproach to Alzheimer’s Disease and Other Tauopathies,Current Drug Targets,5:495-502,2004；Noble et al.,Inhibition of glycogen synthase kinase-3by lithiumcorrelates with reduced tauopathy and degeneration invivo,PNAS,102:19,6990-6995,2005；Iqbal和Grundke-Iqbal,Developing pharmacological therapies forAlzheimer disease,Cell.Mol.Life Sci.,64:2234-2244,2007)，微管稳定药物(Zhang etal.,Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizingmicrotubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathymodel,PNAS,102(1):227-231,2005)，促进错折叠的tau蛋白的蛋白水解降解的药物(Dickey et al.,Development of a High Throughput Drug Screening Assay for theDetection of Changes in Tau Levels-Proof of Concept with HSP90 inhibitors,Current Alzheimer Research,2:231-238,2005,Dickey et al.,Pharmacologicreductions of total tau levels；implications for the role of microtubuledynamics in regulating tau expression,Molecular Neurodegeneration,1:6,2006)，和免疫抑制药物(Zilka et al.,Chaperon-like Antibodies Targeting Misfolded TauProtein:New Vistas in the Immunotherapy of Neurodegenerative Foldopathies,Journal of Alzheimer’s Disease,15:169-177,2008)，以及免疫治疗策略，包括主动和被动免疫(Schneider和Mandelkow et al.,Tau-Based Treatment Strategies inNeurodegenerative Diseases,Neurotherapeutics,5:443-457,2008；Zilka et al.,Chaperon-like Antibodies Targeting Misfolded Tau Protein:New Vistas in theImmunotherapy of Neurodegenerative Foldopathies,Journal of Alzheimer’sDisease,15:169-177,2008,Tabira,T.Immunization Therapy for Alzheimer disease:AComprehensive Review of Active Immunization Strategies.Tohoku J.Exp.Med.,220:95-106(2010))。此外，研究人员集中于新的单克隆抗体(mAb)疗法以治疗AD。对于综述，参见，例如，Citron et al.,Alzheimer’s disease:strategies for diseasemodification,Nature Reviews,9:397,2010,和Asuni et al.,Immunotherapy TargetingPathological Tau Conformers In a Tangle Mouse Model Reduces Brain Pathologywith Associated Functional Improvements,The Journal of Neuroscience,27(34):9115-9129,2007。靶向疾病形式的tau的治疗性抗体代表用于治疗和/或诊断AD和其他tau蛋白病的一种有前途的方法(WO 2004/007547,US2008/0050383)。
尽管关于治疗AD和其他tau蛋白病的治疗策略的研究日益增多，但仍存在对诊断工具的未满足的需求，该诊断工具可以准确地检测并将患有痴呆症的患者中AD和其他tau蛋白病与其他脑病区分开来，以确保适当的靶向治疗决定，尤其是在疾病过程的早期阶段(Blennow和Hampel,CSF markers for incipient Alzheimer’s disease,LancetNeurol.,2:605-613,2003；Blennow,CSF markers for incipient Alzheimer’s disease,Lancet Neurol.,2:605-613,2005)。在过去的二十年中，人们为识别临床前AD的体内脑指示物和基于样品的生物标志物做出了巨大努力，但都没有太大的成功。研究主要集中在脑脊液(CSF)和血液上，但还没有发现能够准确检测和区分不同类型痴呆症的明确标志物。例如，已经对几种CSF和血液生物标志物进行了广泛的研究，而检测精度却没有足够的提高。这些包括以下的生物标志物：神经变性(t-tau、NFL、NSE、VLP-1)、APP代谢(Aβ42、Aβ40、Aβ38、sAPPα和sAPPβ)、缠结病理(p-tau)和神经胶质活化(YKL-40、MCP-1和GFAP)(Olsson etal.,CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer’s disease:asystematic review and meta-analysis,Lancet Neurol.,7:673-84,2016)。已经报道了三种CSF生物标志物用于前驱病状轻度认知障碍(MCI和AD痴呆：CSF Aβ1-42(Aβ1-42)，也表示为Aβ1-42：Aβ1-40比率，t-tau，和p-tau Thr181&Thr231蛋白(Cavedo et al.,The RoadAhead to Cure Alzheimer’s Disease:Development of Biological Markers andNeuroimaging Methods for Prevention Trials Across all Stages and TargetPopulations,J.Prev.Alzheimer’s Dis.,3:181-202,2014)。然而，准确检测患者中早期AD以及将AD与其他tau蛋白病或其他病因的痴呆区分开的方法仍然是一个挑战，尤其对于基于CSF的测定法。
研究表明，tau的不同磷酸化表位，包括苏氨酸181、苏氨酸181和231，苏氨酸231，苏氨酸231和235，丝氨酸199，丝氨酸396和404，可能与AD相关，尽管有一些相互矛盾的报道(Andreasen et al.,Cerebrospinal fluid levels of total-tau,phospho-tau and Abeta 42predicts development of Alzheimer's disease in patients with mildcognitive impairment,Acta Neurol.Scand.Suppl.,179:47-51,2003；Formichi et al.,Cerebrospinal fluid tau,A beta,and phosphorylated tau protein for thediagnosis of Alzheimer's disease,J.Cell Physiol.,208:39-46,2006；Blennow和Hampel,CSF markers for incipient Alzheimer's disease,Lancet Neurol.,2:605-613,2003)。例如，建议对CSF p-tau181进行重复的评估并不能提供有用的临床生物标志物，因为它对2年内的疾病进展不敏感(Bouwman et al.,Longtitudinal changes of CSFbiomarkers in memory clinic patients,Neurology,69:1006-1011,2007)。因此，CSFtau和Aβ生物标志物的预测能力及其随时间变化的动态仍存在争议。甚至检测CSF中的这些生物标志物的有限能力也进一步加重了诊断AD的挑战。例如，几项研究描述了AD患者CSF中Aβ42、t-tau和p-tau水平的纵向变化(Andersson et al.,Neurobiol Aging,29:1466-1473,2008；Blomberg et al.,Neurosci.Lett.,214:163-166,1996；Arai et al.,JAGS,45:1228-31,1997；Kanai et al.,Ann.Neurol.,44:17-26；Kanai et al.,Neurosci.Lett.,267:65-68,1999；Hampel et al.,Ann Neurol.,49:545-546,2001；Hoglund et al.,Dement.Geriatr.Cogn.Disord.,19:256-265,2005)，而其他人则报告这些CSF生物标志物不会随时间显著变化(Nishimura et al.,MethodsFind.Exp.Clin.Pharmacol.,20:227-235,1998；Andreasen et al.,Arch.Neurol.,56:673-680,1999；Sunderland et al.,Biol.Psychiatry,46:750-755,1999；Tapiola etal.,Neurosci.Lett.,280:119-122,2000；deLeon et al.,Neurobiol.Aging,27:394-401,2006；Mollenhauer et al.,J.Neural.Transm.,112:933-948,2005；Zetterberg et al.,Alzheimers Res.Ther.,5(2):9,2007；Mattsson et al.,J.Alzheimers Dis.,30(4):767-778,2012；Toledo et al.,Acta Neuropathol.125(5):659-70,2013)。CSF生物标志物似乎不能反映某些患者随着时间推移的疾病进展的原因尚不清楚。一种可能性是脑源性蛋白质在CSF隔室中被稀释(deLeon et al.,Longitudinal cerebrospinal fluid tau loadincreases in mild cognitive impairment,Neurosci Lett.,333:183-186,2004)。另一种可能的解释是，年龄较大的非痴呆症个体(65岁以上)趋向于具有比年龄较小的个体更高的p-tau水平，并因此，在年龄较大的非痴呆症个体中，生物标志物随疾病进展的升高被掩盖了(Bouwman et al.,CSF biomarker levels inearly and late onset Alzheimer’sdisease,Neurobiol Aging,30:1895-1901,2008)。这些因素和其他因素导致缺乏有效的基于CSF的测定法。
用于检测CSF生物标志物的可用测定法几乎完全集中于涉及经典ELISA形式的免疫测定法，其中有INNOTEST hTAU、INNOTEST磷酸-Tau(识别磷酸-苏氨酸181)和INNOTEST Aβ42。然而，这些测定法的特异性和敏感性通常不足以预测阿尔茨海默氏病，尤其是在其临床前阶段(
Figure BDA0002755663400000061
et al.,The Inflammatory Marker YKL-40Is Elevated inCerebrospinal Fluid from Patients with Alzheimer's but Not Parkinson'sDisease or Dementia with Lewy Bodies,10(8):e0135458,PlosOne,2015；Wang et al.,Analysis of Cerebrospinal Fluid and[11C]PIB PET Biomarkers for Alzheimer'sDisease with Updated Protocols,52(4):1403-13,JAD 2016)。
除了基于样品的诊断测定法外，近年来分子成像技术的进步还导致了针对正电子发射断层摄影术(PET)的潜在tau特异性示踪剂的研究。已开发出三类放射性示踪剂作为tau PET示踪剂：芳基喹啉衍生物THK5117和THK5351，吡啶并吲哚衍生物AV-1451(也称为T807和Flortaucipir)，和苯基/吡啶基丁二烯基苯并噻唑/苯并噻唑鎓衍生物PBB3(Saint-Aubert et al.,Tau PET imaging:present and future directions,Mol.Neurodegener.,12:19,2017)。由于tau PET示踪剂显示出靶向结合，主要识别酶MAO B或神经黑色素(Barrio et al.,The Irony of PET Tau Probe Specificity,J.Nucl.Med.,59(1):115-116,2018；Lemoine et al.,Comparative binding propertiesof the tau PET tracers THK5117,THK5351,PBB3,and T807 in postmortem Alzheimerbrains,Alzheimers Res.Ther.,9(1):96,2017；Ng et al.,Monoamine oxidase Binhibitor,selegiline,reduces 18F-THK5351 uptake inthe human brain,AlzheimersRes.Ther.,9(1):25,2017)，已经开发出第二代tau PET示踪剂：PI-2620、MK-6240、GTP1和RO6958948(www.alzforum.org)。但是，在一些新近开发的示踪剂中仍存在与多种组织靶标的非特异性结合，这表明仍有改进技术的空间(The 12th Human Amyloid Imaging,Miami,Florida,USA2018)。
多项神经病理学研究的结果表明，患者脑中tau病状的数量与AD的进展密切相关。tau病变的解剖定位模式可能对应于在阿尔茨海默氏病病程中受影响的认知结构域以及脑萎缩的模式和程度(Braak and Braak,Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes,Acta Neuropathol,82:239-59,1991；Murray et al.,Neuropathologically defined subtypes of Alzheimer's disease with distinctclinical characteristics:a retrospective study,Lancet Neurol.,(9):785-96,2011；Nelson et al.,Correlation of Alzheimer disease neuropathologic changeswith cognitive status:a review of the literature,J.Neuropathol.Exp.Neurol.,71:362-81,2012)。类似地，一些独立的影像学研究显示tau PET信号的分布可能与认知能力衰退有关(Ossenkoppele et al.,Tau PET patterns mirror clinical andneuroanatomical variability in Alzheimer's disease,Brain,139:1551-67,2016；Bejanin et al.,Tau pathology and neurodegeneration contribute to cognitiveimpairment in Alzheimer's disease,Brain,140(12):3286-3300,2017；Mattsson etal.,AV-1451and CSF T-tau and P-tau as biomarkers inAlzheimer's disease,EMBOMol.Med.,9:1212-1223,2017；Mattsson et al.,Comparing 18F-AV-1451with CSF t-tauand p-tau for diagnosis of Alzheimer disease,Neurology,5:e388-e395,2018)。因此，开发用于脑中tau的PET成像的改良试剂和方法可帮助提高诊断准确性并随时间推移监控AD患者。尽管CSF tau生物标志物主要用作疾病状态生物标志物，但tau PET成像也可用于监测AD进展，例如从前驱阶段向痴呆的转变(Mattsson et al.,Comparing 18F-AV-1451with CSF t-tau and p-tau for diagnosis of Alzheimer disease,Neurology,5:e388-e395,2018)。但是考虑到脑成像剂的侵入性和放射性性质，对AD具有改进的准确性和特异性的基于非侵入性CSF的测定法将是有益的。
然而，当前可用的生物标志物在临床使用中显示出一些限制。研究表明，患病病例和对照病例之间的总tau、p-tau和Aβ42的CSF水平明显重叠(Hulstaert et al.,Improveddiscrimination of AD patients using beta-amyloid(1–42)and tau levels in CSF,Neurology,52:1555-1562,1999；Hu et al.,Levels of nonphosphorylated andphosphorylated tau in cerebrospinal fluid Alzheimer's disease patients:anultrasensitive bienzyme-substrate-recycle enzyme-linked immunosorbent assay,Am.J.Pathol.,160:1269-1278,2002)。在tau PET成像中，开发新的tau定向放射性示踪剂的关键挑战是克服非特异性结合(Barrio et al.,The Irony of PET Tau ProbeSpecificity,J.Nucl.Med.,59:115-116,2018；Lemoine et al.Comparative bindingproperties of the tau PET tracers THK5117,THK5351,PBB3,and T807 in postmortemAlzheimer brains,Alzheimers Res.Ther.,9(1):96,2017；Ng et al.,Monoamineoxidase B inhibitor,selegiline,reduces 18F-THK5351 uptake inthe human brain,Alzheimers Res.Ther.,9(1):25.2017)。此外，最近的报道表明病理性tau构象因不同人tau蛋白病而不同，并且tau配体对各种tau病理实体具有不同的结合亲和力(Choi et al.,Development of tau PET Imaging Ligands and their Utility inPreclinical andClinical Studies,52(1):24-30,2018)。因此，另一个挑战是提高与各种tau病理性病变的结合效力，以将其用于多种人tau蛋白病的诊断。
靶向AD的更强有力的治疗的最新发展强调了在早期阶段准确检测AD并将其与患者中其他形式的痴呆症区别开来的需要。有效的生物标志物(如果可用)对于患者分层和疾病进展的纵向监测也将是有用的，因为斑块和缠结的相对量可能在疾病不同阶段的AD患者之间显示出明显的差异。基于生物标志物数据对患者进行分层也可能是一种识别更倾向于对治疗响应的患者亚群的方法。(Hampel et al.,Perspective on future role ofbiological markers in clinical therapy trials of Alzheimer's disease:a long-range point of view beyond 2020,Biochem.Pharmacol.,88(4):426-46,2014)。
因此，本文公开了提供改进的检测、监测、预防和/或治疗阿尔茨海默氏病和其他tau蛋白病的抗体、组合物、试剂盒和方法。
在各种实施方案中，本公开提供了能够结合tau的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以结合tau中的磷酸化的表位。在一些实施方案中，来自患有AD的患者的样品(例如血液或CSF)中的具有该磷酸化表位的tau种类以比患有另一种tau蛋白病的患者或健康受试者中更高的浓度存在。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在各种实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以结合tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)上的表位，其中表位被磷酸化。表位可以包含tau蛋白2N4R的残基188-227(SEQ ID NO:10)中的一个或多个。在一些实施方案中，表位可以包含tau蛋白2N4R的残基210-221(SEQ ID NO:11)中的一个或多个。在某些实施方案中，表位包含至少一个磷酸化的残基。在某些实施方案中，表位还包含tau蛋白2N4R的位置210处的磷酸化的丝氨酸、位置212处的苏氨酸、位置214处的丝氨酸，或位置220处的苏氨酸，或其任意组合。抗体或其抗原结合片段可以结合包含SRTPSLPpTPPTR(SEQ ID NO.12)或由其组成的表位。
在各种实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以结合tau上的表位，其包含tau蛋白2N4R的残基188-227(SEQ ID NO:10)中的一个或多个。在一些实施方案中，表位包含tau蛋白2N4R的残基210-221(SEQ ID NO:11)中的一个或多个。在某些实施方案中，表位包含至少一个磷酸化残基，其中该至少一个磷酸化残基可以是在tau蛋白2N4R(SEQ IDNO:9)的位置217处的磷酸苏氨酸。在一些实施方案中，表位还包含tau蛋白2N4R的位置210处的磷酸化的丝氨酸、位置212处的苏氨酸、位置214处的丝氨酸，或位置220处的苏氨酸，或其任意组合。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以结合包含SRTPSLPpTPPTR(SEQID NO.12)或由其组成的表位。
在各种实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以结合tau上的表位，其包含tau蛋白2N4R的残基151-188(SEQ ID NO:13)的一个或多个。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以结合包含tau蛋白2N4R的残基163-172(SEQ ID NO:14)中的一个或多个的表位。该表位可以包含KGQANATRIP(SEQ ID NO.14的序列)。在另一个实施方案中，抗体是DC2E7或其抗原结合片段，其中DC2E7是由保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏号PTA-124992下的杂交瘤产生的抗体。
在另一个实施方案中，本文公开了抗体DC2E2或其抗原结合片段，其中DC2E2是由保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏号PTA-124991下的杂交瘤产生的抗体。
在各种实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段与第二药剂缀合。在一些实施方案中，该药剂用于AD或另一种tau蛋白病的至少一种可检测标记或至少一种治疗剂。在某些实施方案中，所述药剂是放射性标记。
本文还公开了在受试者中治疗、延迟或预防AD或另一种tau蛋白病进展的方法。在一些实施方案中，该方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种根据先前公开的实施方案中的任一项的抗体。在一些实施方案中，该方法包括在施用或建议施用合适的AD治疗之前，使用一种或多种公开的抗体或抗原结合片段检测AD。在一些实施方案中，该方法包括使用本文公开的抗体或抗原结合片段向已经被诊断为患有AD的患者施用AD治疗。
在各种实施方案中，检测受试者中的tau蛋白病的方法包括：从受试者获得生物样品；使来自受试者的样品与有效量的能够与tau形成复合物的分子接触(例如，使用本文公开的能够结合tau以形成tau-抗体复合物的至少一种抗体或抗原结合片段)；使用本文所述的抗体或抗原结合片段检测tau-分子复合物的存在和/或量，其中tau-分子复合物的存在和/或量指示受试者中的tau蛋白病。在一些实施方案中，形成tau-分子复合物的分子是可以结合tau以形成tau-抗体复合物的第一抗体，并且其中使用第二抗tau抗体或抗原结合片段(其可以结合tau上与第一抗体不同的表位)检测tau-抗体复合物的存在。在某些实施方案中，第一或第二抗体或抗原结合片段连接(例如，共价或非共价包被在其上)至固体表面或颗粒。在一些实施方案中，将第一或第二抗体缀合至可检测的标记。公开的方法可以包含经典的ELISA、数字ELISA测定法或其他ELISA测定形式，例如，使用与磷酸化tau结合的本文公开的任何一种或多种抗体或片段，并且可以检测样品中磷酸化tau的存在和/或量，其中样品中磷酸化的tau的升高的水平表明受试者患有阿尔茨海默氏病，而不是另一种tau蛋白病。在某些实施方案中，生物样品是脑脊髓液。在某些实施方案中，生物样品是血清和/或血浆。
在各种实施方案中，区分受试者中阿尔茨海默氏病与另一种tau蛋白病或另一种原因的痴呆的方法包括：从受试者获得脑脊髓液或血液样品，使样品与本文公开的抗tau抗体或其抗原结合片段接触，并检测同一样品中与抗体或抗原结合片段复合的磷酸化的tau的存在和/或量，其中相对于来自健康对照受试者的样品中的水平，所述样品中磷酸化的tau的存在和/或升高的水平或其中高于阈值的磷酸化的tau的升高的水平表明该受试者患有阿尔茨海默氏病，而不是另一种tau蛋白病或另外的原因(即另一种形式)的痴呆或另一种神经退行性疾病。在一些实施方案中，抗tau抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，切LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，其能够与磷酸化的tau结合以形成磷酸化的tau抗体复合物。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在各种实施方案中，检测受试者中的阿尔茨海默氏病(AD)或轻度认知障碍(MCI)的方法包括：使来自受试者的生物样品与有效量的能够与tau形成复合物的分子接触(例如，使用至少一种本文公开的能够结合tau形成tau-抗体复合物的抗体或抗原结合片段)；检测tau-抗体复合物的存在和/或量；并将样品中与抗体结合的tau的存在/量与对照样品中的量或阈值进行比较，其中相对于对照样品或阈值与抗体复合的tau的存在和/或增加量指示受试者中AD或MCI。在一些实施方案中，MCI是患者中AD的前兆。在一些实施方案中，该方法将MCI和/或AD与其他神经学疾病区分开。在一些实施方案中，其他神经学疾病选自帕金森氏病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化和/或额颞痴呆。在一些实施方案中，生物样品包含脑脊髓液(CSF)。在一些实施方案中，生物样品包含血液。在一些实施方案中，生物样品包含血浆和/或血清级分。在一些实施方案中，阈值为约9.3pg/ml的tau或约5.3pg/ml的tau。在一些实施方案中，阈值在约100-600pg/ml之间。在一些实施方案中，阈值为约300pg/ml。
在各种实施方案中，在受试者中检测阿尔茨海默氏病(AD)或轻度认知障碍(MCI)的方法包括：获得生物样品；检测在生物样品中至少在位置苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或量；和比较在苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在/量与对照样品中的量或阈值，其中相对于对照样品或阈值，在苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或增加的量表明所述受试者中的AD或MCI。在各种实施方案中，MCI是患者中AD的前兆。在一些实施方案中，该方法将MCI和/或AD与其他神经学疾病区分开。在一些实施方案中，其他神经学疾病选自帕金森氏病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化和/或额颞痴呆。在一些实施方案中，生物样品包含脑脊髓液(CSF)。在一些实施方案中，生物样品包含血液。在一些实施方案中，生物样品包含血浆和/或血清级分。在一些实施方案中，阈值为约9.3pg/ml的tau。在一些实施方案中，阈值为约9.3pg/ml的tau或约5.3pg/ml的tau。在一些实施方案中，阈值在约100-600pg/ml之间。在一些实施方案中，阈值为约300pg/ml。
在各种实施方案中，区分受试者中阿尔茨海默氏病和/或轻度认知障碍与帕金森氏病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化，和/或额颞痴呆的方法包括：使来自受试者的生物样品与有效量的能够与tau形成复合物的分子(例如，使用本文公开的能够结合tau形成tau-抗体复合物的至少一种抗体或抗原结合片段)接触；检测在同一样品中与抗体或抗原结合片段复合的tau的存在和/或量；并将样品中与抗体结合的tau的存在/量与对照样品中的量或阈值进行比较，其中相对于对照样品或阈值，与抗体复合的tau的存在和/或增加量表明受试者中的阿尔茨海默氏病和/或轻度认知障碍(MCI)。在一些实施方案中，生物样品包含脑脊髓液(CSF)。在一些实施方案中，生物样品包含血液。在一些实施方案中，生物样品包含血浆和/或血清级分。在一些实施方案中，阈值为约9.3pg/ml的tau。在一些实施方案中，阈值在约100-600pg/ml之间。在一些实施方案中，阈值为约300pg/ml。
在各种实施方案中，区分受试者中阿尔茨海默氏病和/或轻度认知障碍与帕金森氏病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化，和/或额颞痴呆的方法包括：从受试者获得生物样品；检测在生物样品中至少在位置苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或量；比较在苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在/量与对照样品中的量或阈值，其中相对于所述对照样品或阈值，在苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或增加的量表明受试者中的阿尔茨海默氏病和/或轻度认知障碍。在一些实施方案中，生物样品包含脑脊髓液(CSF)。在一些实施方案中，生物样品包含血液。在一些实施方案中，生物样品包含血浆和/或血清级分。在一些实施方案中，阈值为约9.3pg/ml的tau。在一些实施方案中，阈值为约9.3pg/ml的tau或约5.3pg/ml。在一些实施方案中，阈值在约100-600pg/ml之间。在一些实施方案中，阈值为约300pg/ml。
在各种实施方案中，预测患有轻度认知障碍的患者将发展为阿尔茨海默氏病可能性的方法包括：使来自受试者的生物样品与有效量的能够与tau形成复合物的分子(例如，使用本文公开的能够结合tau形成tau-抗体复合物的至少一种抗体或抗原结合片段)接触；和检测在同一样品中与抗体或抗原结合片段复合的tau的存在和/或量；并将样品中与抗体结合的tau的存在/量与对照样品中的量或阈值进行比较，其中相对于对照样品或阈值，与抗体复合的tau的存在和/或增加的量表明患者将发展为阿尔茨海默氏病的增加的可能性。在一些实施方案中，生物样品包含脑脊髓液(CSF)。在一些实施方案中，生物样品包含血液。在一些实施方案中，生物样品包含血浆和/或血清级分。在一些实施方案中，阈值为约9.3pg/ml的tau。在一些实施方案中，阈值在约100-600pg/ml之间。在一些实施方案中，阈值为约300pg/ml。
在各种实施方案中，预测患有轻度认知障碍的患者将发展为阿尔茨海默氏病可能性的方法包括：从受试者获得生物样品；检测生物样品中至少在位置苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或量；比较在苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在/量与对照样品中的量或阈值，其中相对于对照样品或阈值，在苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或增加的量表明患者将发展为阿尔茨海默氏病的增加的可能性。在一些实施方案中，生物样品包含脑脊髓液(CSF)。在一些实施方案中，生物样品包含血液。在一些实施方案中，生物样品包含血浆和/或血清级分。在一些实施方案中，阈值为约9.3pg/ml的tau。在一些实施方案中，阈值在约100-600pg/ml之间。在一些实施方案中，阈值为约300pg/ml。
附图的简要说明
并入本说明书中并构成本说明书一部分的附图示出了本发明的几个非限制性实施方案，并且连同描述一起用于解释本公开的原理。
图1.使用ELISA确定的单克隆抗体DC2E2的同种型。
图2A-2D.在ELISA中使用tau缺失突变体和tau肽对抗体DC2E2进行表位定位。(图2A)用于评估tau蛋白上的DC2E2结合位点的tau缺失突变体和肽的示意图。(图2B)通过ELISA，DC2E2对人六种同等型的免疫反应性。(图2C)通过ELISA，使用tau缺失突变体确定DC2E2结合位点。(图2D)通过竞争性ELISA，使用tau衍生肽确定DC2E2结合位点。
图3.DC2E2对不同tau蛋白的免疫反应性。泳道1：从人类阿尔茨海默氏病脑组织中分离出来的十二烷基肌氨酸钠-不溶性tau；泳道2：tau151-391；泳道3：磷酸化的tau151-391；泳道4：tau 2N4R；泳道5：磷酸化的tau 2N4R。
图4.使用ELISA测定单克隆抗体DC2E7的同种型。
图5A-D.抗体DC2E2中可变区的核苷酸和氨基酸序列。图5A显示了编码轻链可变区的核苷酸序列。图5B显示了轻链可变区的氨基酸序列，CDR序列以粗体和下划线标出。图5C显示了编码重链可变区的核苷酸序列。图5D显示了重链可变区的氨基酸序列，CDR序列以粗体和下划线标出。根据IMGT编号系统鉴定互补决定区(CDR)。
图6A-D：抗体DC2E7中可变区的核苷酸和氨基酸序列。图6A显示了编码轻链可变区的核苷酸序列。图6B显示了轻链可变区的氨基酸序列，CDR序列以粗体和下划线标出。图6C显示了编码重链可变区的核苷酸序列。图6D显示了重链可变区的氨基酸序列，CDR序列以粗体和下划线标出。根据IMGT编号系统鉴定互补决定区(CDR)。
图7.DC2E7对不同tau蛋白的免疫反应性。泳道1：tau 2N4R；泳道2：在体外被磷酸化的2N4R；泳道3：胎儿tau；泳道4：从人类阿尔茨海默氏病脑组织中分离出来的十二烷基肌氨酸钠-不溶性tau。将识别所有形式的tau蛋白的pan tau单克隆抗体DC25用作对照。
图8.用于评估tau蛋白上的DC2E7结合位点的tau缺失突变体的示意图。
图9.使用tau缺失突变体通过免疫印迹确定tau蛋白上的DC2E7结合位点。
图10.在区域188-227中tau上潜在的磷酸化位点的示意图。
图11.使用tau点突变体通过免疫印迹测定tau蛋白上的DC2E7结合位点。Mab DC25用作对照，以测量点突变的磷酸化程度。
图12.使用tau衍生肽通过竞争ELISA测定tau蛋白上的DC2E7表位。
图13.抗体DC2E7和DC2E2在阿尔茨海默氏病(海马CA1)、FTD-匹克氏病(齿状回，海马)、CBD(尾状核)和PSP(壳核/尾状核)脑部切片中的结合。单克隆抗体AT8用作对照。工具条100μm。
图14.在Braak 1期、Braak 3期和Braak 6期脑部切片中抗体DC2E7和DC2E2的结合。工具条100μm。
图15.在来自阿尔茨海默氏病(海马CA1)、FTD-匹克氏病(齿状回，海马)中的匹克氏小体，以及CBD(尾状核)中的螺旋小体和星形细胞病理学的切片中抗体DC2E7和DC2E2的结合。工具条20μm。
图16.DC2E7数字ELISA测定法的示例性校准曲线。
图17A-B.使用来自健康个体的三个人类CSF进行峰值恢复实验。(图17A)人CSF中加标的DC2E7校准物的估计的浓度。(图17B)在人CSF中加标的DC2E7校准物的恢复％。
图18.对照和AD样品的DC2E7数字ELISA结果。
图19.AD和其他tau蛋白病样品的DC2E7数字ELISA结果。
图20：DC2E7与AD和其他人类tau蛋白病中的不溶性tau种类结合。
图21：使用pT217 tau和pT181 tau测定比较来自AD和FTD受试者的CSF样品。
图22：使用pT217 tau和pT181 tau测定比较来自AD和对照受试者的CSF样品。
图23A-B：使用pT217 tau测定比较来自对照、MCI和AD受试者的CSF样品(图23A)。使用pT217 tau测定比较来自对照组、AD、PD、MS、ALS和FTD受试者的CSF样品(图23B)。
图24：衍生自DC2E7的分离的scFV抗体片段的吸光度。
图25A-D：衍生自DC2E7的scFV抗体片段的氨基酸序列的比对。图25A显示了与DC2E7序列相比的scFV抗体轻链可变结构域。图25B显示了与DC2E7序列相比的scFV抗体重链可变结构域。图25C显示了scFV抗体片段的可变轻链结构域，其与DC2E7相比显示出更高的亲和力。图25D显示了scFV抗体片段的可变重链结构域，其与DC2E7相比显示出更高亲和力。与DC2E7序列相同的残基用点表示。根据IMGT编号系统鉴定CDR。
图26：DC2E7和DC149抗体对tau衍生肽2E7pep的亲和力的比较。
图27A-B：DC2E7和DC149的氨基酸序列的比对。图27A显示了与DC2E7轻链序列相比的DC149可变轻链结构域。图27B显示了与DC2E7重链序列相比的DC149可变重链结构域。与DC2E7序列相同的残基用点表示。根据IMGT编号系统鉴定CDR。
图28A-B：DC2E7和DC807的氨基酸序列的比对。图28A显示了与DC2E7轻链序列相比的DC807可变轻链结构域。图28B显示了与DC2E7重链序列相比的DC807可变重链结构域。与DC2E7序列相同的残基用点表示。根据IMGT编号系统鉴定CDR。
图29：来自阿尔茨海默氏病、其他tau蛋白病和对照个体的样品，使用磷酸化的tau校准物(左图)和2E7肽校准物(2E7pep)(右图)通过pT217 tau数字ELISA测定法测量的pT217 tau的分布。
发明详述
定义
为了更好地理解本公开，首先提供某些定义。
术语“亲和力”指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的合计强度。一般可以通过平衡解离常数(KD)(或其反平衡结合常数，KA)表示分子X对其配偶体Y的亲和力。可以通过本领域已知的常规方法，包括本文描述的那些来测量亲和力。参见例如，Pope M.E.,Soste M.V.,Eyford B.A.,Anderson N.L.,PearsonT.W.,(2009)J.Immunol.Methods.341(1-2):86-96及本文描述的方法。
术语“氨基酸”指天然发生的、修饰的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其以与天然发生的氨基酸以类似的方式起作用。天然发生的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及稍后修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸，和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然发生的氨基酸具有相同的基本化学结构，即结合氢的α-碳、羧基、氨基，和R基团的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是与天然发生的氨基酸保持相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但是以与天然发生的氨基酸相似的方式起作用的化合物。合适的氨基酸包括，但不限于肽中发现的20个常见天然发生的氨基酸以及通过有机合成或其他代谢途径制备的天然发生的和非天然发生的氨基酸的D-和L-异构体。此类非天然发生的氨基酸的实例包括，但不限于N-乙酰葡糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰葡糖氨基-L-苏氨酸，和O-磷酸酪氨酸。修饰的氨基酸包括，但不限于羟基脯氨酸、焦谷氨酸、γ-羧基谷氨酸、O-磷酸丝氨酸、吖啶羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基已酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、三-丁基甘氨酸、2,4-二氨基异丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘基丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、六氢哌啶羧酸和硫代脯氨酸。术语氨基酸还包括天然发生的氨基酸，其是某些生物中的代谢物但不由遗传密码编码用于掺入到蛋白质中。此类氨基酸包括，但不限于鸟氨酸、D-鸟氨酸，和D-精氨酸。
术语“抗体”是指无论是遗传工程改造的、天然的或完全或部分合成的或重组产生的免疫球蛋白。完整的抗体通常包含重链和轻链，每条链均包含形成抗原结合袋(pocket)的可变结构域和有助于效应子功能的恒定结构域。凭借其选择的重链，抗体可以是任何免疫球蛋白类别和亚类的成员，包括任何人类类别：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE或其衍生物或片段。同样，抗体的轻链可以衍生自任何种类，例如基于恒定结构域的氨基酸序列确定的人kappa(κ)或lambda(λ)轻链。
基本抗体结构单位通常包含四聚体。在各种实施方案中，四聚体包含两对相同的多肽链，各对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包括具有约100至110个或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。各链的羧基末端部分界定主要负责效应子功能的恒定区。人轻链分类为κ和λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区与恒定区是通过约12个或更多个氨基酸的“J”区加以接合，其中重链还包括约10个或更多氨基酸的“D”区。一般参见Fundamental Immunology Ch 7.(Paul,W.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))(出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。各轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，完整的抗体通常具有两个结合位点。除在双功能或双特异性抗体中之外，两个结合位点相同。所有链均表现出由三个高变区(也称为互补决定区或CDR)接合的相对保守的框架区(FR)的相同一般结构。来自各对的两个链的CDR通过框架区对准，从而使得能够结合特定表位。自N末端至C末端，轻链与重链两者均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。可以根据IMGT编号系统将氨基酸分配给每个结构域。替代性定义也为本领域普通技术人员所知。参见例如Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991)),或Clothia&LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Clothia et al.Nature 342:878-883(1989)。
“抗体片段”和“抗体部分”包含全长抗体的一部分，通常至少是其抗原结合部分/结构域或可变区。术语抗体片段是上述术语抗体的子集。抗体片段或抗原结合片段的实例包括：Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fv片段、双抗体、单链抗体分子、免疫毒素和由抗体片段形成的多特异性抗体。另外，抗体片段包含具有VH链结合病理性tau的特性的单链多肽，即能够与VL链装配在一起或与病理性tau结合的VL链的特性，即能够与VH链装配在一起形成功能性抗原结合袋从而提供与tau结合的特性。该术语还包含本身不能提供效应子功能(例如，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(“ADCC”)或补体依赖性细胞毒性(“CDC”))，但在与适当的抗体恒定结构域结合后可提供此功能的片段。
如本文所用，“能够结合tau”的抗体或其结合片段是指比其他抗原靶标优先结合tau的抗体或其结合片段。该术语可与“抗tau”抗体或“结合tau的抗体”互换。在一些实施方案中，能够结合tau的抗体或结合片段可以以与其他相比对该抗原的更高的亲和力来结合。在一些实施方案中，能够结合tau的抗体或结合片段可以以至少约10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-11、10-12或更大(或两者之间的任何值)的KD与该抗原结合，例如，通过表面等离子体共振或本领域技术人员已知的其他方法测量。
术语“嵌合的”抗体是指是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源(例如，人源化的嵌合抗体，类转换抗体)，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段的相应序列相同或同源，只要它们显示出所需的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))
在一个实施方案中，术语“嵌合抗体”是指通常通过重组DNA技术制备的包含来自一种来源或物种的可变区和至少一部分源于不同来源或物种的恒定区的单克隆抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体包含鼠可变区和人恒定区。此类鼠/人嵌合抗体可以通过表达包含编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA片段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA片段的免疫球蛋白基因来产生。其他形式的“嵌合抗体”可以是其中类别或亚类已经与原始抗体的类别或亚类相比被修饰或改变的那些形式。此类“嵌合”抗体也称为“类别转换抗体”。产生嵌合抗体的方法涉及本领域目前已知的常规重组DNA和基因转染技术。参见，例如，Morrison,S.L.,etal.,Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855；美国专利号5,202,238和5,204,244。
可以在测定中确定“竞争性结合”，其中所测试的免疫球蛋白/抗体/结合片段抑制参考抗体与共同抗原(诸如tau(例如tau SEQ ID No 12))的特异性结合。已知许多类型的竞争性结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹层竞争测定(参见Stahli et al.,Methods in Enzymology 9:242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland et al.,J.Immunol 137:3614(1986))；固相直接标记的测定、固相直接标记的夹层测定(参见Harlow and Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I125标记的固相直接标记RIA(参见Morel et al.,Mol.Immunol.25(1):7(1988)；固相生物素-亲合素EIA(Cheung etal.,Virology 176:546(1990))；和直接标记的RIA。(Moldenhauer et al.,Scand.J.Immunol.32:77(1990))。在一些实施方案中，此类测定涉及使用结合固体表面的纯化抗原或携带任何这些的细胞，未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白。通过测定在测试免疫球蛋白存在下结合固体表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。在一些实施方案中，测试免疫球蛋白过量存在。一般地，当竞争抗体过量存在时，其将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更多。
如本文所用，术语“缀合”指从第一个分子(例如，抗体)的功能基团与第二个分子(例如，可检测的标签或治疗剂或药物)的功能基团之间的化学反应形成的键或化学部分。此类键包括，但不限于共价键和非共价键，同时此类化学部分包括，但不限于酯类、碳酸酯、亚胺磷酸酯、腙、缩醛、原酸酯、肽键，和寡核苷酸键。
“延迟进展”和“预防进展”是向对易患或以其他方式有患特定疾病(诸如AD)风险的患者施用治疗剂。预防包括对有患AD风险的受试者进行预防性施用。一般人群中的任何人都有患AD的风险。一些个体具有患AD的增加的风险。一些个体有患AD的增加的遗传风险。延迟进展并预防进展可以消除或降低疾病风险或延迟疾病发作。可以通过与相似人群或个体中的标准疾病进展时间线进行比较来测量AD发作或进展的延迟。参见Ostrowitzki etal.,Alzherimers Res Ther.,9(1):95,2017。延迟进展的具体说明性和示例性实施方案描述如下。
术语“表位”是指抗原上免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段)可以特异性结合的位点。因此，tau上的表位是tau上免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段)可以特异性结合的位点。在一些实施方案中，特异性结合是指与非特异性相互作用可测量地不同的结合。特异性结合可以例如通过与对照分子的结合相比确定分子的结合来测定，其通常是不具有结合活性的相似结构的分子，或者通过与共有相似结合亲和力但未标记的对照分子进行竞争测定。
在这种情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性抑制，则表明特异性结合。该术语可以例如由具有至少约10-4M，或者至少约10-5M，或者至少约10-6M，或者至少约10-7M，或者至少约10-8M，或者至少约10-9M，或者至少约10-10M，或者至少约10-11M，或者至少约10-12M，或更大的靶标的Kd的分子来展示。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指分子与特定多肽或特定多肽上的表位结合而基本上不结合任何其他多肽或表位。
如本文所用术语，表位可以由通过蛋白质的三级折叠并置的连续氨基酸或非连续氨基酸形成。表位可以包括与抗体结合的核心区域周围的其他氨基酸段，例如，在核心表位肽的N和/或C末端的1、2、3、4、5、10、15、20或更多个氨基酸。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时失去。表位经常以独特的空间构象，其通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如丙氨酸扫描，X射线晶体学和二维核磁共振。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996)。示例性方法在本文中讨论并用于所公开的抗体。“构象性表位”是抗体或其tau结合片段以构象特异性方式结合的表位。至于基于蛋白质的表位，结合可以取决于携带表位的蛋白质的二级、三级或四级结构。换句话说，抗体以结构特异性方式或四级结构特异性方式结合。
如本文所讨论的，参考tau蛋白2N4R上的氨基酸残基，鉴定tau上的表位。本领域的技术人员可以容易地例如通过比对程序诸如
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来鉴定其他tau亚型和片段上的相应氨基酸残基。除非另有说明，否则提及tau上的特定氨基酸残基是指tau蛋白2N4R，且应理解为涵盖在其他tau同等型和片段上的相应位置。
可以通过木瓜蛋白酶消化抗体而产生“Fab”片段，每个具有单个抗原结合位点，还有一个残留的“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力(可结晶片段)。胃蛋白酶处理产生F(ab′)2片段，该片段具有两个抗原结合位点，并且仍然能够交联抗原。“Fv”是包含在Fab片段中的重链的可变区部分。这些片段中的任何一个也可以重组产生。抗体的Fc部分与抗体的效应子功能有关，包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性或吞噬作用。抗体的Fc区中的改变(例如，突变或糖基化改变)可用于调节其任何效应子功能以及增加其血清半衰期和其他药代动力学特性。
Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段通常与Fab片段的区别在于，在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基至少带有游离巯基。F(ab′)2抗体片段最初产生为Fab′片段对，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
如本文所用的术语“Fc”包括多肽，其包含抗体的恒定区，不包括第一个恒定区免疫蛋白结构域。因此Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，和IgE与IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域N-末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及Cγ1(Cγ1)与Cγ2(Cγ2)之间的铰链。尽管Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区一般限定包含在其羧基末端的残基C226或P230，其中编号根据EU编号系统。对于人IgG1，在一个实施方案中Fc区在本文中限定包含在其羧基末端的残基P232，其中编号根据EU编号系统(EdelmanG.M.et al.,(1969)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,63(1)；78-85)。例如，在抗体的产生或纯化过程中，或通过重组改造编码抗体的重链的核酸去除Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，完整抗体的组分可以包含所有K447残基被去除的抗体群、K447残基不被去除的抗体群，和具有含有和不含有K447残基的抗体混合物的抗体群。Fc可以指分离中的该区域或Fc多肽背景，例如抗体中的该区域。Fc可以是天然序列Fc或变体Fc。在Fc部分中替换氨基酸残基以改变抗体的效应功能是本领域中已知的(参见例如Winter et al.,美国专利号5,648,260和5,624,821)。在PCT申请WO 93/10151(由此通过参考并入)中描述的一个合适的Fc是从N末端铰链区延伸至人IgG1抗体的Fc区的天然C末端的单链多肽。另一有用的Fc多肽是美国专利号5,457,035和在Baum et al.,1994,EMBO J.13:3992-4001中描述的Fc突变蛋白。该突变蛋白的氨基酸序列与WO93/10151中呈现的天然Fc序列的氨基酸序列相同，除了氨基酸19已经从Leu改变为Ala，氨基酸20已经从Leu改变为Glu，并且氨基酸22已经从Gly改变为Ala。突变蛋白对Fc受体展示降低的亲和力。
“Fv”也是最小的抗体片段，其含有完整的抗原识别和抗原结合位点。该区域由紧密非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在该构型中，各可变结构域的三个高变区相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。总体上，六个高变区赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或包含仅三个对抗原特异的高变区的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，尽管以比完整结合位点低的亲和力。
如本文所用，例如由于天然发生的体细胞突变或有意引入位点定向突变，包含来自特定人种系免疫球蛋白序列的重或轻链可变“框架区”的人源化抗体与特定种系序列的重或轻链可变框架区相比，可以含有氨基酸差异。在各种实施方案中，所选人源化抗体在重或轻链可变框架区的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白基因的重或轻链可变框架区编码的氨基酸序列具有至少90％同一性，并且含有下述氨基酸残基，当与其他物种(例如，鼠种系序列)的种系免疫球蛋白氨基酸序列相比时，其将人源化抗体鉴定为来源于人。在某些情况中，人源化抗体可与种系免疫球蛋白基因编码的重或轻链可变框架区的氨基酸序列共享至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，来源于特定人种系序列的人源化抗体的重或轻链可变框架区将展示与人种系免疫球蛋白基因编码的重或轻链可变框架区的氨基酸序列不超过11个氨基酸，优选不超过5个，或甚至更优选不超过4、3、2或1个差异。
“框架区”或“FR”残基是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。它们将可变结构域中的高变区域括起来(bracket)。FR残基可根据标准编号系统，例如Kabat、Chothia或改进的Chotia编号方案来鉴定。在IMGT独特的编号系统中，保守的氨基酸始终具有相同的位置，例如半胱氨酸23(1st-CYS)、色氨酸41(CONSERVED-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104(2nd-CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。参见例如，LefrancM.P.,Immunology Today 18,509(1997)；Lefranc M.P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Guidicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.and Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)。在另一实施方案中，IMGT独特的编号提供了框架区(FR1-IMGT:位置1-26、FR2-IMGT:39-55、FR3-IMGT:66-104和FR4-IMGT:118-128)和互补决定区：CDR1-IMGT:27-38、CDR2-IMGT:56-65和CDR3-IMGT:105-117的标准化限定。IMGT独特的编号用于2D图解表示中，命名为IMGT Colliersde Perles。参见例如，Ruiz,M.and Lefranc,M.P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)；Kaas,Q.and Lefranc,M.P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)。其也可以用于表示3D结构。参见例如，IMGT/3Dstructure-DB Kaas,Q.,Ruiz,M.and Lefranc,M.P.,T cellreceptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)。
本文中术语“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”包括柔性多肽，其包含抗体或其tau结合片段的第一个和第二个恒定结构域之间的氨基酸。本文涉及的“铰链区”是长度为6-62个氨基酸的序列区，仅存在于IgA、IgD和IgG中，其涵盖桥接两个重链的半胱氨酸残基。
如本文所用的术语“人抗体”意图包括具有源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体，并且可以例如从人分离或重组产生。抗体的恒定区可为例如人IgG1类型抗体的恒定区。此类区域可为异型的并由例如Johnson,G.,and Wu,T.T.,Nucleic AcidsRes.28(2000)214-218和其中提及的数据库所描述。
术语“人源化抗体”指与亲本免疫球蛋白(例如，亲本小鼠免疫球蛋白残基)相比，框架区(FR)和/或互补决定区(CDR)已被修饰为包含人免疫球蛋白氨基酸残基的抗体。在一个实施方案中，将鼠类CDR移植到人抗体的框架区中，以制备“人源化抗体”。在另一实施方案中，将人框架“移植”或剪接至小鼠抗体中，保留小鼠抗体的CDR，并用人源框架替代其框架。移植和剪接可以通过多种重组DNA技术完成，包括PCR和诱变。本领域中存在多种人源化方法(例如，CDR移植、重塑、转基因动物、组合文库)。参见，例如，Riechmann,L.,et al.,Nature 332(1988)323-327；Neuberger,M.S.,et al.,Nature 314(1985)268-270；SastryL,Alting-Mess M,Huse WD,Short JM,Sorge JA,Hay BN,Janda KD,Benkoviv SJ,LernerRA(1989)Cloning of the immunological repertoire for generation of monoclonalcatalytic antibodies:construction of a heavy chain variable region-specificcDNA library.Proc Natl Acad Sci USA 86,5728-5732；和Huse WD,Sastry S,IversonSA,Kang AS,Alting-Mees M,Burton DR,Benkoviv SJ,Lerner RA(1989)Generation of alarge combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phagelambda.Science 246,1275-1281。在一些实施方案中，人源化抗体在保持其原始抗原结合特性的同时更具人样。Presta,L.G.Engineering of therapeutic antibodies tominimize immunogenicity and optimize function.Advanced Drug Delivery Reviews,Volume 58,Issues 5-6:640-656(2006)。在一些实施方案中，针对已知的人可变结构域序列的文库或人种系序列的文库筛选啮齿类动物抗体的可变结构域的序列。然后可以将最接近啮齿动物序列的人序列作为人源化抗体的人框架区(Sims et al.,J.Immunol.1993；151:2296et seq.；Chothia et al,Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.1987；196901-917)。在另一个实施方案中，人源化涉及使用源自轻链或重链特定亚组的所有人类抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.,PNAS USA,1992；89:4285et seq.；Presta et al.,J Immunol 1993；151:2623et seq.)。设计用于降低人患者中抗体分子的免疫原性的其他方法包括修饰的抗体(参见例如，美国专利号6,797,492和美国专利申请公开20020034765和20040253645)和已经通过T细胞表位分析和去除修饰的抗体(参见例如美国专利申请公开20030153043和美国专利号5,712,120)。在各种实施方案中，本文所述的人源化抗体的CDR对应于小鼠单克隆DC2E7抗体的CDR序列，即SEQID No.1-6。
当在本文中使用时，术语“高变区”是指对抗原结合最直接起作用的抗体的氨基残基。该术语与术语“互补决定区”(或“CDR”)同义。在一个实施方案中，根据IMGT，高变区通常在每个重链和轻链可变结构域上包含三个延伸中的氨基酸(例如，轻链可变结构域中的残基27-32(LCDR1)、49-51(LCDR2)和88-96(LCDR3)和重链可变结构域中的26-33(HCDR1)、51-58(HCDR2)和97-102(HCDR3))。
术语“不溶性tau”是指tau的聚集体(例如神经原纤维缠结、神经毡细丝(neuropilthread)、匹克氏小体、螺旋小体等)，可以例如通过其在脑或溶液中的特征性模式来鉴定。例如，可以通过离心均质化的脑样品来分离tau聚集体，并通过例如蛋白质印迹或ELISA测定法进行评估。参见例如Lasagna-Reeves et al.,FASEB J.26:1946-59(2012)。Tau聚集体可由tau单体、tau二聚体、三聚体或低聚物组成，例如粒状tau低聚物(GTO)和各种类型的纤维，包括配对螺旋纤维(PHF)和直纤维(SF)等。Cowan,C.M.and Mudher,A.,Are tauaggregates toxic or protective intauopathies？,Frontiers in Neurology,4:114(2013)
如本文所用，术语“分离的核酸”是指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其某些组合，凭借其来源，(1)与自然界中发现“分离的核酸”的多核苷酸的全部或部分无关，(2)与不可能在自然界中的多核苷酸可操作地连接，或(3)自然界中不作为较大序列的一部分存在。
“连接的”是指部分与肽、抗体、化合物或固体颗粒的连接。该术语包括其中部分与肽、抗体、化合物或固体颗粒偶联、复合或共价或非共价连接的情况。例如，本文公开的抗体或抗原结合片段可以被共价或非共价地包被在珠子或其他出售的颗粒上。该部分可以化学交联或表达或合成为与肽或抗体的融合体。
如本文所用，“能够形成tau-分子复合物的分子”是优选能够结合tau种类以形成复合物的任何药剂。该术语涵盖抗体，例如本文公开的抗tau抗体，以及抗原受体、Fc缀合的受体、受体片段、补体因子和能够与tau形成复合物的任何其他合适的结合部分。
如本文所用，术语“核酸”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是我们的双链单链。
“病理性tau”包括病理性tau构象异构体和结构，并涵盖以下所有：疾病修饰的tau(例如，过度磷酸化的tau，截短的tau等)、混乱的tau、紊乱的(misdisordered)tau、紊乱的可溶性tau、不溶的tau、tau低聚物和纤维、细胞外和细胞内tau聚集体，例如神经原纤维缠结、神经毡细丝、神经斑、鬼影缠结(ghost tangles)和轴突球体、匹克氏小体、螺旋小体、簇状星形胶质细胞、星形胶质斑或与AD或其他tau蛋白病相关的任何其他形式的tau。
如本文所用，“样品”或“生物样品”是指从受试者获得的用于测试目的的组织或体液的任何部分(例如，血液、CSF等)。样品可以直接从受试者中分离或在测试之前进一步处理(例如，通过稀释、固定、变性、分裂、分离、离心、免疫复合物解离等)。这些术语还包括用于诊断或监测目的的样品部分。样品也可以在测试期间或之后进一步处理(例如，通过免疫沉淀、纯化、分配等)。术语“样品”和“生物样品”在这些处理步骤之前，期间和/或之后同样适用于组织或体液。如本文所用，术语“对照样品”是指从健康患者或患有另一种被诊断为tau蛋白病的患者或在生物流体例如CSF中具有已知tau种类水平的患者获得的样品。
各种类型的tau(即tau蛋白种类)可存在于受试者中，例如脑组织或样品(例如CSF或血液)中。这些类型的tau的细节是已知的，并且已经描述于例如WO2004/007547A2和U.S.9,518,101中，其全部内容通过引用并入本文。除非另有说明，术语“tau”在没有其他同等型规格(例如tau 2N4R)的情况下使用时，涵盖所有形式的tau以及tau片段。
术语“药学上可接受的”意指生物学上或药理学上适合体内用于动物或人中，并优选意指通过联邦或州政府的管理机构批准或列于美国药典或其他通常认可的用于动物或更具体地人类中的药典里。
术语“磷酸化的tau”是指包含一个或多个磷酸化氨基酸的任何tau同等型。成年人脑tau的最长形式有80个丝氨酸或苏氨酸残基和5个酪氨酸残基；因此，几乎80％的分子具有被磷酸化的潜力。参见Goedert,M.et al,Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau:sequences and localization in neurofibrillary tanglesof Alzheimer’s disease.Neuron 3,519-526(1989)。术语磷酸化的tau也指磷酸化tau氨基酸的任何组合。Tau在调节微管动力学，轴突运输和神经突生长中起关键作用。可以通过位点特异性磷酸化和正常磷酸化事件的改变来调节的tau的所有这些功能(例如，过度磷酸化，异常磷酸化)可能导致神经退行性疾病，例如AD。Johnson GV et al.,Tauphosphorylation inneuronal cell function and dysfunction.J.CellSci.2004Nov15；117(Pt 24):5721-9。
在一些实施方案中，磷酸化的tau是指在氨基酸188和227之间具有一个或多个磷酸化残基的任何组合的tau蛋白(如在tau蛋白2N4R或在另一个tau片段或同等型中的等同残基中编号)。在另一个实施方案中，磷酸化的tau是指至少在苏氨酸217处磷酸化的tau(如在tau蛋白2N4R或在另一个tau片段或同种型中的等同残基中编号)。在一些实施方案中，如在实施例中检测到的磷酸化的tau蛋白一样，tau蛋白被磷酸化。
“生理学tau”是指在健康个体的脑中发现的天然的、未折叠的tau蛋白，其长度可以不同。此类tau蛋白通常是高度可溶的并且通常显示较少的聚集趋势。参见Wang et al.,Tau inphysiology and pathology,Nature Reviews,17:22-35,2016。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)旨在指其中已引入重组表达载体的细胞。应理解此类术语旨在不仅指具体的受试者细胞还指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可以在继代中发生，此类后代实际上可能与亲本细胞不相同，但仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所用，关于抗体的“特异性结合”是指该抗体以比其结合结构上不同的抗原或表位更大的亲和力结合其靶抗原或表位。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。优选地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成所需的结构用于抗原结合。对于scFv的综述，参见Pluckthun inThe Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。
如本文所用的术语“治疗”定义为向患有疾病、具有疾病症状或针对疾病的易感的受试者应用或施用治疗剂，目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、提高或影响疾病、疾病的一个或多个症状或针对疾病的易感性。此外，与在缺少治疗的症状相比，只要本公开内容的组合物单独或与另一治疗剂组合治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、提高或影响所治疗的阿尔茨海默氏病或另一tau蛋白病的至少一种症状，则应该认为结果是对潜在病征的治疗，不管是不是病征的所有症状均被治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、提高或影响。可以使用“有效量”的治疗剂来实现治疗，该治疗剂应理解为包括部分和完全治疗，例如，部分或完全治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、提高或影响疾病，一种或多种疾病症状或对疾病的易感性。可以经验确定“有效量”。同样地，“治疗有效量”是对于达到规定的治疗效果有效的浓度。
“Tau蛋白病”是指与病理性tau的形成有关的疾病。Tau蛋白病涵盖了所有神经系统疾病，并伴有患者脑中微管相关蛋白tau异常形式的出现。该术语包括但不限于以下疾病：阿尔茨海默氏病、Gerstmann-
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-Scheinker疾病、英国痴呆症、丹麦痴呆症、匹克氏病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、嗜银颗粒病、关岛帕金森-痴呆综合征、Tangle-only痴呆、具有球形神经胶质内含物的白质tau蛋白病、额颞痴呆(例如，FTDP-17)，与17号染色体慢性创伤性脑病相关的帕金森氏病和点头病。参见例如Goedert M,Clavaguera Fand Tolnay M.The propagation of prion-like protein inclusions inneurodegenerative diseases.Trends Neurol.Sci。
在一些实施方案中，患有额颞痴呆(FTD)的受试者可以患有非流利性/语法缺失原发性进行性失语症(nfPPA)、语义变异的原发进行性失语症(svPPA)、行为变异性额颞痴呆(bvFTD)或肌萎缩性侧索硬化/额颞痴呆(ALS/FTD)。在一个实施方案中，在至少一种测定法中，tau的那些异常形式中的一种或多种被本文所述的抗体或结合片段之一识别。在一些实施方案中，测定法是IHC。在其他实施方案中，测定法是ELISA。术语“另一种tau蛋白病”涵盖除AD之外的所有神经学疾病(例如，基于tau病因的痴呆)，并伴有病理性tau的出现，例如，上述列出的任何其他的tau蛋白病。相比之下，痴呆症也可能源于非基于tau的病因，这些疾病不在tau蛋白病术语的范围之内。
术语“可变结构域”是指以下事实：免疫球蛋白的某些部分在抗体之间的序列差异很大，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性通常不均匀地分布在抗体的可变结构域中。它集中在轻链和重链可变结构域中的三个称为高变区的区段中。可变结构域的高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，它们通常采用β-折叠结构，并通过三个高变区连接，这三个高变区通常形成连接β-折叠结构的环，在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区(HVR)通过FR紧密结合在一起，并且与另一条链中的高变区一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。相反，抗体的“恒定结构域”通常不直接参与抗体与抗原的结合，但有助于抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运已经与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指另外的DNA区段可以连入其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连入病毒基因组中。某些载体能够在它们导入其中的宿主细胞(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中时可以整合入宿主细胞的基因组中，并由此随宿主基因组进行复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般地，重组DNA技术中有用的表达载体经常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括表达载体的其他形式，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其发挥等效功能。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文另外明确指出。此外，就在详细描述和/或权利要求中使用术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”或其变体的程度而言，此类术语旨在于以类似于术语“包含”的方式包含在内。如本文所用，术语“约”和“大约”是指如本领域普通技术人员所确定的，在特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以指1至1.5个标准偏差或1至2个标准偏差。替代地，“约”可以意指高达并包括给定值的20％、10％、5％或1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或进程，该术语可以表示多达和包括一个数量级，多达和包括5倍，并且多达和包括2倍的值。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应假设术语“约”表示该特定值在可接受的误差范围内。而且，本文描述的所有范围包括端点以及之间的所有点。除非上下文另外明确指出，否则术语“或”将被理解为意指“和/或”。本文引用的所有参考文献通过引用整体并入。在所结合的参考文献中的任何内容与本文提供的材料矛盾或不一致的程度上，以本公开为准。
抗体
本文描述了可用于检测、监测、治疗和预防AD的新型抗tau抗体。在一些实施方案中，抗体能够结合磷酸化的tau。在一些实施方案中，抗体能够结合生物样品(例如，CSF或血液)中的磷酸化的tau，从而使其可用于非侵入性地将AD与其他tau蛋白病区别。在一些实施方案中，抗体可以与第二药剂(例如，本文公开的抗体或抗原结合片段以外的药剂，例如放射性示踪剂或治疗剂)缀合。在一些实施方案中，本文公开的一种或多种抗体或抗原结合片段彼此缀合。在一些实施方案中，抗体和/或缀合的抗体穿过血脑屏障以结合脑中的tau，使得它们可用于体内检测或治疗脑中的AD和其他tau蛋白病。
抗体CDR和可变结构域的序列，以及全长tau蛋白2N4R及其部分在下表1中示出。在各种实施方案中，本文公开的抗体和结合片段包含表中公开的一个或多个CDR和/或可变结构域序列，和/或结合表中公开的tau蛋白2N4R的一个或多个部分。
表1
Figure BDA0002755663400000301
Figure BDA0002755663400000311
Figure BDA0002755663400000321
Figure BDA0002755663400000331
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Figure BDA0002755663400000361
Figure BDA0002755663400000371
在各种实施方案中，能够结合tau的本文公开的抗体或其抗原结合片段包含以上表1中公开的一种或多种氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的抗体包含表1中公开的一种或多种序列的变体，同时保留了结合tau的能力(例如在位置217处的磷酸化的tau)。
例如，在一些实施方案中，能够结合tau的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQID NO:1的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1的在位置5和6的一个或多个处具有取代的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:2的位置1、4、5、6和8的一个或多个处具有取代的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，和/或其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:4的位置2处具有取代的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:5的位置3处具有取代的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:6的位置4和6的一个或多个处具有取代的氨基酸序列。
特定位置的取代可以通过氨基酸序列中从左到右(氨基到羧基末端)的计数来确定，例如，表1中列出的序列，始于肽序列的氨基末端(或在表格中左端)。
在各种实施方案中，HCDR1中在位置5处的所述取代是甘氨酸，HCDR1中在位置6处的所述取代是甘氨酸。在一些实施方案中，HCDR2中在位置1处的所述取代是缬氨酸，HCDR2中在位置4处的所述取代是丙氨酸，HCDR2中在位置5处的所述取代是甘氨酸，HCDR2中在位置6处的所述取代是丝氨酸，和/或HCDR2中在位置8处的所述取代是缬氨酸。在一些实施方案中，LCDR1中在位置2处的所述取代是天冬酰胺。在一些实施方案中，LCDR2中在位置3处的所述取代是甘氨酸。在一些实施方案中，LCDR3的在位置4处的所述取代是精氨酸，和/或LCDR3中在位置6处的所述取代是苏氨酸。
在各种实施方案中，HCDR1包含在位置5处具有取代的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含在位置8处具有取代的SEQ ID NO:2的氨基酸序列，和/或HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，和/或LCDR1包含在位置2处具有取代的SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和/或LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在各种实施方案中，HCDR1中在位置5处的取代是甘氨酸，和HCDR2中在位置8处的取代是缬氨酸，和LCDR1中在位置2处的取代是天冬酰胺。
在各种实施方案中，包含表1中公开的那些的变体序列的抗体或抗原结合片段包含选自图24-27B中所示的那些的任何抗体CDR(例如，所有六个CDR)和/或完整重链和/或轻链可变结构域序列(例如，特定抗体克隆的成对的重链和轻链可变结构域序列)。
在各种实施方案中，公开了能够结合tau的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。在不同的实施方案中，CDR和/或可变结构域序列选自表1中列出的那些。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在各种实施方案中，公开了能够结合tau的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:7的位置1、2、3、9、12、19、30、31、35、37、42、43、48、49、51、54、55、56、58、62、63、64、65、66、68、69、70、73、76、77、78、79、80、83、84、88、94、96、107、108和112的一个或多个处具有取代的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:8的位置3、7、11、14、17、19、20、21、24、25、28、39、42、49、52、56、69、71、75、92、94、99、105和106的一个或多个处具有取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重链可变区包含在SEQ ID NO:7的位置1、2、3、9、12、19、30、31、35、37、42、43、48、49、51、54、55、56、58、62、63、64、65、66、68、69、70、73、76、77、78、79、80、83、84、88、94、96、107、108和112的一个或多个处具有取代的氨基酸序列，其中在重链可变区中在位置1处的取代是甘氨酸，位置2处是丙氨酸，位置3处是精氨酸，位置9处是精氨酸，位置12处是丙氨酸，位置19处是精氨酸，位置30处是甘氨酸，位置31处是甘氨酸，位置35处是精氨酸，位置37是丙氨酸，位置42处是甘氨酸，位置43处是蛋氨酸，位置48处是异亮氨酸，位置49处是苏氨酸，位置51处是缬氨酸，位置54处是丙氨酸，位置55处是甘氨酸，位置56处是丝氨酸，位置58处是缬氨酸，位置62处是甘氨酸，位置63处是丙氨酸，位置64处选自丙氨酸和谷氨酸，位置65处是谷氨酸，位置66处是天冬氨酸，位置68处是亮氨酸，位置69处是丙氨酸，位置70处是苏氨酸，位置73处是天冬酰胺，位置76处是谷氨酸，位置77处是丝氨酸，位置78处是丙氨酸，位置79处是蛋氨酸，位置80处选自丝氨酸、亮氨酸和组氨酸，位置83处是苏氨酸，位置84处是丙氨酸，位置88处是脯氨酸，位置94处是半胱氨酸，位置95处是甘氨酸，位置107处是丙氨酸，位置108处是脯氨酸，和/或位置112处是脯氨酸。
在一些实施方案中，轻链可变区包含在SEQ ID NO:8的位置3、7、11、14、17、19、20、21、24、25、28、39、42、49、52、56、69、71、75、92、94、99、105和106的一个或多个处具有取代的氨基酸序列，其中在轻链可变区中在位置3处的取代是精氨酸，位置7处是脯氨酸，位置11处选自丝氨酸或亮氨酸，位置14处是脯氨酸，位置17处是缬氨酸，位置19处是丙氨酸，位置20处是丙氨酸，位置21处是缬氨酸，位置24处是谷氨酸，位置25处是苏氨酸，位置28处是天冬酰胺，位置39处是异亮氨酸，位置42处选自丝氨酸和天冬氨酸，位置49处是脯氨酸，位置52处是甘氨酸，位置56处是脯氨酸，位置69处是甘氨酸，位置71处是组氨酸，位置75处是缬氨酸，位置92处是精氨酸，位置94处是苏氨酸，位置99处是丝氨酸，位置105处是甘氨酸，和/或位置106处为缬氨酸。
在各种实施方案中，重链可变区包含在SEQ ID NO:7的位置1、3、30、37、48、58、63、68、76、77和80的一个或多个处具有取代的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含在SEQ IDNO:8的位置7、11、20、28、39和69的一个或多个处具有取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重链可变区中在位置2处的取代是丙氨酸和/或在位置35处的取代是精氨酸。
在一些实施方案中，重链可变区中在位置49处的取代是苏氨酸和/或在位置79处是甲硫氨酸，和/或轻链可变区中在位置19处的取代是丙氨酸。
在一些实施方案中，重链可变区中在位置43处的取代是甲硫氨酸，在位置65处是谷氨酸，和/或在位置80处是丝氨酸，和/或轻链可变区中在位置56处的取代是脯氨酸和在位置94处是苏氨酸。
在一些实施方案中，重链可变区中在位置12处的取代是丙氨酸，在位置64处是谷氨酸，并且在位置78处是丙氨酸，和/或轻链可变区中在位置21处的取代是缬氨酸。
在一些实施方案中，重链可变区中在位置107处的取代是丙氨酸，和/或轻链可变区中在位置42处的取代是天冬氨酸。
在一些实施方案中，重链可变区中在位置19处的取代是精氨酸，在位置51处是缬氨酸，在位置66处是天冬氨酸，并且在位置84处是丙氨酸，和/或在轻链可变区中在位置99处的取代是丝氨酸。
在一些实施方案中，重链可变区中在位置31处的取代是甘氨酸和/或在位置80处是丝氨酸。
在一些实施方案中，重链可变区中在位置73处的取代是天冬酰胺，和/或在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸。
在一些实施方案中，重链可变区中在位置37处的取代是丙氨酸，和/或轻链可变区中在位置42处的取代是丝氨酸。
在一些实施方案中，重链可变区中在位置80处的取代是亮氨酸，和/或轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸，而在位置105处是甘氨酸。
在一些实施方案中，在重链可变区中位置54处的取代是丙氨酸和/或在位置56处是丝氨酸。
在一些实施方案中，在重链可变区中在位置37处的取代是丙氨酸，在位置68处是亮氨酸，在位置83处是苏氨酸，在位置99处是半胱氨酸，轻链可变区中在位置25处的取代是苏氨酸，在位置49处是脯氨酸，和/或在位置52处是甘氨酸。
在一些实施方案中，在重链可变区中在位置19处的取代是精氨酸，在位置42处是甘氨酸，和/或在位置112处是脯氨酸。
在一些实施方案中，在重链可变区中在位置80处的取代是亮氨酸，在轻链可变区中在位置3处的取代是精氨酸和/或在位置17处是缬氨酸。
在一些实施方案中，在重链可变区中位置19处的取代是精氨酸，在位置37处是丙氨酸，在位置55处是甘氨酸，在位置70处是苏氨酸，在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸和/或在位置42处是丝氨酸。
在一些实施方案中，在重链可变区中在位置64处的取代是丙氨酸，在位置69出取代是丙氨酸，和/或在轻链可变区中在位置42处的取代是丝氨酸。
在一些实施方案中，在重链可变区中在位置9处的取代是精氨酸和/或在位置62处是甘氨酸，和/或在轻链可变区中在位置11处的取代是丝氨酸和/或在位置14处是脯氨酸。
在一些实施方案中，在重链可变区中在位置37处的取代是丙氨酸，和/或在轻链可变区中在位置75处的取代是缬氨酸。
在一些实施方案中，在重链可变区中在位置56处的取代是丝氨酸，在位置88处是脯氨酸，和/或在位置96处是甘氨酸，和/或在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸，在位置24处是谷氨酸，在位置42处是天冬氨酸，在位置71处是组氨酸，在位置92处是精氨酸，和/或在位置106处是缬氨酸。
在一些实施方案中，在重链可变区中在位置80处的取代是组氨酸和/或在位置108处是脯氨酸。
在一些实施方案中，能够结合tau的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含在SEQ ID NO:7的位置1、3、30、37、48、58、63、68、76、77和80的一个或多个处具有取代的氨基酸序列，和轻链可变区，该轻链可变区包含在SEQ ID NO:8的位置7、11、20、28、39和69的一个或多个处具有取代的氨基酸序列。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置1处的取代是甘氨酸，在位置3处是精氨酸，在位置30处是甘氨酸，在位置37处是丙氨酸，在位置48处是异亮氨酸，在位置58处是缬氨酸，在位置63处是丙氨酸，在位置68处是亮氨酸，在位置76处是谷氨酸，在位置77处是丝氨酸，和/或在位置80处是丝氨酸，并且在轻链可变区中在位置7处的取代是脯氨酸，在位置11处选自亮氨酸和丝氨酸，在位置20处是丙氨酸，在位置28处是天冬酰胺，在位置39处是异亮氨酸，和/或在位置69处是甘氨酸。
在各种实施方案中，在重链可变区中在位置68处的取代是亮氨酸，和/或在轻链可变区中在位置39处的取代是异亮氨酸。
在各种实施方案中，在重链可变区中在位置48处的取代是异亮氨酸。
在各种实施方案中，在重链可变区中在位置30处的取代是甘氨酸和/或在位置58处是缬氨酸，在轻链可变区中在位置7处的取代是脯氨酸和/或在位置69处是甘氨酸。
在各种实施方案中，在轻链可变区中在位置11处的取代是丝氨酸。
在各种实施方案中，在重链可变区中在位置77处的取代是丝氨酸，和/或在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸，在位置20处是丙氨酸，和/或在位置28处是天冬酰胺。
在各种实施方案中，在重链可变区中在位置37处的取代是丙氨酸，在位置63处是丙氨酸，和/或在位置80处是丝氨酸，和/或在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸。
在各种实施方案中，在重链可变区中在位置1处的取代是甘氨酸，在位置3处是精氨酸，在位置76处是谷氨酸，和/或在位置77处是丝氨酸。
在各种实施方案中，在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸。
在一些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一些实施方案中，能够结合tau的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在各种实施方案中，公开了能够结合tau的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:1的位置5和6的一个或多个处具有取代的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:2的位置1、4、5、6和8的一个或多个处具有取代的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:4的位置2处具有取代的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:5的位置3处具有取代的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:的氨基酸序列6，或在SEQ ID NO:6的位置4和6的一个或多个处具有取代的氨基酸序列。在各种实施方案中，HCDR1中在位置5处的所述取代是甘氨酸，HCDR1中在位置6处的所述取代是甘氨酸，HCDR2中在位置1处的所述取代是缬氨酸，HCDR2中在位置4处的所述取代是丙氨酸，HCDR2中在位置5处的所述取代是甘氨酸，HCDR2中在位置6处的所述取代是丝氨酸，HCDR2中在位置8处的所述取代是缬氨酸，LCDR1中在位置2处的所述取代是天冬酰胺，LCDR2中在位置3处的所述取代是甘氨酸，和/或LCDR3的在位置4处的所述取代是精氨酸，和/或LCDR3中在位置6处的所述取代是苏氨酸。
在各种实施方案中，能够结合tau的抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含在SEQID NO:1的位置5处具有取代的氨基酸序列，HCDR2包含在SEQ ID NO:2的位置8处具有取代的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，LCDR1包含在SEQ ID NO:4的位置2处具有取代的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和/或LCDR3包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列。
在各种实施方案中，能够结合tau的抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1中在位置5处的取代是甘氨酸，HCDR2中在位置8处的取代是缬氨酸，和/或LCDR1中在位置2处的取代是天冬酰胺。
在各种实施方案中，能够结合tau的抗体或其抗原结合片段，其包含：HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列，并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO 34的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，HCDR2包含的氨基酸序列SEQ ID NO:2，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在各种实施方案中，能够结合tau的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ IDNO:49的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:64的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:76的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:88的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列。
在各个实施方案中，本文还公开了抗体或抗原结合片段，其可与由序列定义的抗体或其抗原结合片段竞争结合，如本段所公开。在另一个实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以与由序列限定的抗体或其抗原结合片段和tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)上相同的表位结合，如本段所公开。
在各种实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以结合在tau上的表位上，该表位包含tau蛋白2N4R的残基188-227(SEQ ID NO:10)中的一个或多个。在一些实施方案中，表位包含tau蛋白2N4R的残基210-221(SEQ ID NO:11)中的一个或多个。在各种实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以结合在tau上的表位上，该表位包含tau蛋白2N4R的残基188-227(SEQ ID NO:10)。在一些实施方案中，表位包含tau蛋白2N4R的残基210-221(SEQ ID NO:11)。该表位可包含至少一个或多于一个的磷酸化残基，其可包括在tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)的位置217处的磷酸苏氨酸。在一些实施方案中，表位还包含tau蛋白2N4R的位置210处的磷酸化的丝氨酸、位置212处的苏氨酸、位置214处的丝氨酸，或位置220处的苏氨酸，或其任意组合。在某些实施方案中，表位包含SRTPSLPpTPPTR(SEQ IDNO:12的序列)或由其组成。在某些实施方案中，表位包括或由包含多于一个磷酸化残基的区域组成，例如SRpTPSLPpTPPTR(SEQ ID NO:31的序列)。在一些实施方案中，通过本领域技术人员已知的任何方法确定表位。在一些实施方案中，通过本领域技术人员已知的任何方法确定表位。在一些实施方案中，丙氨酸扫描或缺失/诱变研究用于确定表位。在一些实施方案中，质谱法用于确定表位。在某些实施方案中，表位由抗体-tau复合物的晶体结构确定，其中表位定义为tau上抗体结合口袋的5埃内的任何接触残基。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:7的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:29的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:30的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含在位置1、3、30、37、48、58、63、68、76、77和80的一个或多个处具有取代的SEQ ID NO:7的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含在位置7、11、20、28、39和69的一个或多个处具有取代的SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，在重链可变区中在位置68处的取代是亮氨酸，在轻链可变区中在位置39处的取代是异亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置48处的取代是异亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置30处的取代是甘氨酸且在位置58处是缬氨酸，在轻链可变区中在位置7处的取代是脯氨酸且在位置69处是甘氨酸。在各种实施方案中，在轻链可变区中在位置11处的取代是丝氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置77处的取代是丝氨酸，且在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸，在位置20处是丙氨酸，且在位置28处是天冬酰胺。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置37处的取代是丙氨酸，在位置63处是丙氨酸，且在位置80处是丝氨酸，且在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置1处的取代是甘氨酸，在位置3处是精氨酸，在位置76处是谷氨酸，且在位置77处是丝氨酸。在各种实施方案中，在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸。
在其他方面，本文公开了可以与包含重链可变区和轻链可变区的抗体竞争结合tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其包含在位置1、3、30、37、48、58、63、68、76、77和80的一个或多个处具有取代的SEQ ID NO:7的氨基酸序列，和/或轻链可变区，其包含在位置7、11、20、28、39和69的一个或多个处具有取代的SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，在重链可变区中在位置68处的取代是亮氨酸，在轻链可变区中在位置39处的取代是异亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置48处的取代是异亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置30处的取代是甘氨酸且在位置58处是缬氨酸，在轻链可变区中在位置7处的取代是脯氨酸且在位置69处是甘氨酸。在各种实施方案中，在轻链可变区中在位置11处的取代是丝氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置77处的取代是丝氨酸，且在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸，在位置20处是丙氨酸，且在位置28处是天冬酰胺。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置37处的取代是丙氨酸，在位置63处是丙氨酸，且在位置80处是丝氨酸，且在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置1处的取代是甘氨酸，在位置3处是精氨酸，在位置76处是谷氨酸，且在位置77处是丝氨酸。在各种实施方案中，在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸。
在各种实施方案中，通过流式细胞术或荧光显微镜、ELISA、HTRF和/或SPR测量竞争。在一个实施方案中，竞争ELISA用于测量竞争性结合。在另一个实施方案中，使用BIACORE测定法。在一些实施方案中，与公开的抗体竞争的抗体或抗原结合片段包含SEQ IDNO:7的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，与公开的抗体竞争的抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:29的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:30的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方案中，与公开的抗体竞争的抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其包含在位置1、3、30、37、48、58、63、68、76、77和80的一个或多个处具有取代的SEQ ID NO:7的氨基酸序列，和/或轻链可变区，其包含在位置7、11、20、28、39和69的一个或多个处具有取代的SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，与公开的抗体竞争的抗体或抗原结合片段包含在重链可变区中在位置68处的取代是亮氨酸，在轻链可变区中在位置39处的取代是异亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置48处的取代是异亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置30处的取代是甘氨酸且在位置58处是缬氨酸，在轻链可变区中在位置7处的取代是脯氨酸且在位置69处是甘氨酸。在各种实施方案中，在轻链可变区中在位置11处的取代是丝氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置77处的取代是丝氨酸，且在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸，在位置20处是丙氨酸，且在位置28处是天冬酰胺。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置37处的取代是丙氨酸，在位置63处是丙氨酸，且在位置80处是丝氨酸，且在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置1处的取代是甘氨酸，在位置3处是精氨酸，在位置76处是谷氨酸，且在位置77处是丝氨酸。在各种实施方案中，在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸。在一些实施方案中，可以与包含重链可变区和轻链可变区的抗体结合在tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)上相同的一个或多个氨基酸上的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在各种实施方案中，与公开的抗体竞争的抗体或抗原结合片段可以结合在tau上的表位上，该表位包含tau蛋白2N4R的残基188-227(SEQ ID NO:10)中的一个或多个。在某些实施方案中，表位包含tau蛋白2N4R的残基210-221(SEQ ID NO:11)中的一个或多个。在其他实施方案中，表位包含至少一个磷酸化的残基。在另一个实施方案中，至少一个磷酸化的残基包含在tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)的位置217处的磷酸苏氨酸，并且任选地还包含tau蛋白2N4R的位置210处的磷酸化的丝氨酸、位置212处的苏氨酸、位置214处的丝氨酸，或位置220处的苏氨酸，或其任意组合。在另一个实施方案中，表位包含SRTPSLPpTPPTR(SEQID NO.12的序列)或由其组成。在某些实施方案中，表位包含SRpTPSLPpTPPTR(SEQ ID NO:31的序列)或由其组成。
在各种实施方案中，可以结合于tau蛋白2N4R的区域或片段的抗体或其抗原结合片段，包含或由tau蛋白2N4R的残基188-227(SEQ ID NO:10)组成，其中该区域或片段被磷酸化。在各种实施方案中，该区域或片段包含或由tau蛋白2N4R的残基210-221(SEQ ID NO:11)组成。在各种实施方案中，该区域或片段在对应于tau蛋白2N4R残基217的位置处磷酸化，并且任选地还在对应于tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)的丝氨酸210，苏氨酸212，丝氨酸214和苏氨酸220的一个或多个位置处磷酸化。在各种实施方案中，tau蛋白2N4R的区域或片段包含或由SRTPSLPpTPPTR(SEQ ID NO.12的序列)组成。在某些实施方案中，表位包含或由SRpTPSLPpTPPTR(SEQ ID NO:31的序列)组成。
在各种实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段可以结合tau上的磷酸化表位，例如，如通过流式细胞术或荧光显微镜、ELISA、HTRF和/或SPR所测量的。在一个实施方案中，ELISA用于测量或检查与磷酸化和去磷酸化的tau的结合。在另一个实施方案中，使用BIACORE测定法。
在各种实施方案中，本文公开了可以结合tau上的表位的抗体或其抗原结合片段，该tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基151-188(SEQ ID NO:13)的一个或多个。在一些实施方案中，tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基163-172(SEQ ID NO:14)中的一个或多个。在各种实施方案中，本文公开了可以结合tau上的表位的抗体或其抗原结合片段，所述tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基151-188(SEQ ID NO:13)。在一些实施方案中，tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基163-172(SEQ ID NO:14)。在某些实施方案中，表位包含或由KGQANATRIP(SEQ ID NO.14的序列)组成。在某些实施方案中，表位上的一个或多个残基被磷酸化，例如tau蛋白2N4R的位置169处的磷酸化苏氨酸。
在各种实施方案中，本文公开了可以结合包含tau蛋白2N4R的残基151-188(SEQID NO:13)的tau的部分或片段的抗体或其抗原结合片段。在各种实施方案中，本文公开了抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以结合包含tau蛋白2N4R的残基163-172(SEQ ID NO:14)的tau的部分或片段。
在一些实施方案中，通过本领域技术人员已知的任何方法确定本文公开的抗体的表位。在一些实施方案中，丙氨酸扫描或缺失/诱变研究用于确定表位。在一些实施方案中，质谱法用于确定表位。在某些实施方案中，表位由抗体-tau复合物的晶体结构确定，其中表位定义为tau上抗体结合口袋的5埃内的任何接触残基。
在各种实施方案中，公开了能够结合tau的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQID NO:17的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，LCDR2包含SEQID NO:19的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在各种实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以与前述抗体或其抗原结合片段竞争结合一个或多个氨基酸tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)上的氨基酸。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以结合tau蛋白2N4R上相同的表位(SEQ ID NO:9)，所述表位与本段先前公开的抗体或其抗原结合片段结合。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以结合由本段先前公开的抗体或其抗原结合片段结合的tau蛋白2N4R的片段或区域(SEQID NO:9)。
在各种实施方案中，本文所述的任何抗体或抗原结合片段可包含重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区可以是IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种型，或其保留完整重链的至少一种效应子功能的衍生物或片段。重链恒定区可以是人IgG同种型。重链恒定区可以是人IgG1或人IgG4同种型。重链恒定区可以是人IgG1同种型。轻链恒定区可以是人κ轻链或λ轻链或其衍生物或片段，其保留完整轻链的至少一种效应子功能。轻链恒定区可以是人κ轻链。
在各种实施方案中，任何公开的抗体或抗原结合片段可以是啮齿动物抗体或其抗原结合片段，嵌合抗体或其抗原结合片段，CDR移植抗体或其抗原结合片段，或人源化抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，任何公开的抗体或抗原结合片段包含人或人衍生的重链和轻链可变区，包括人框架或具有一个或多个回复突变的人框架。参见例如美国专利号7,566,771中概述的回复突变策略，该公开的公开内容通过引用并入本文。在各种实施方案中，任何公开的抗体或抗原结合片段可以是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、scFv、(scFv)2、scFv-Fc或Fv片段。
在各种实施方案中，公开了抗体DC2E7或其功能性抗原结合片段，其中DC2E7是由以美国典型培养物保藏中心专利保藏号PTA-124992保藏的杂交瘤产生的抗体。在各种实施方案中，公开了抗体DC2E2或其功能性抗原结合片段，其中DC2E2是由保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏号PTA-124991中的杂交瘤产生的抗体。还公开了可以与tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)上的相同表位结合或者可以与抗体DC2E7或抗体DC2E2竞争结合tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)的抗体和抗原结合片段。
在各种实施方案中，任何公开的抗体或其抗原结合片段可以与第二药剂缀合。第二药剂可以是例如至少一种可检测的药剂，包括但不限于酶、放射性同位素、荧光团、核磁共振标志物或重金属。在一个实施方案中，至少一种可检测的标记是放射性同位素。在一些实施方案中，缀合至可检测的标记(例如，放射性标记)的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一些实施方案中，缀合至可检测的标记(例如，放射性标记)的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些实施方案中，在一些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列且轻链可变区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，缀合至可检测的标记的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)。在一些实施方案中，缀合至可检测的标记(例如，放射性标记)的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQID NO:43的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ IDNO:55的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ IDNO:67的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ IDNO:79的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ IDNO:91的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ IDNO:77的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列。
在一些实施方案中，缀合至可检测标记(例如，放射性标记)的抗体或抗原结合片段可竞争结合或结合与由序列定义的该抗体相同的表位。
与本公开一致的合适类型的可检测标记的实例包括但不限于酶、放射性同位素和放射性核素、胶态金属、荧光化合物、化学发光化合物、生物素基团、由二级报道子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)、和化学/电化学/生物发光化合物。酶包括但不限于过氧化酶(例如辣根过氧化物酶)、荧光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡萄糖-6磷酸脱氢酶。或者，标记是生物素、地高辛(digoxigenin)或5-溴-脱氧尿苷。荧光标记也可以与抗体及其抗原结合片段结合，所述标记包括若丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体、荧光素及其衍生物、荧光染料、若丹明及其衍生物、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、丹磺酰、伞形酮及其他。此类缀合物可以通过本领域技术人员已知的方法制备。它们可以直接与标记绑定；通过间隔子基团或连接基团，如聚醛、戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)或二乙三胺五乙酸(DPTA)；或在其他结合剂如本领域常规已知的结合剂的存在下。
其他可检测的标记可包括放射性标记，例如碘-123，碘-125，碘-126，碘-133，碘-131，溴-77，锝-99m，铟-113m，镓-67，镓-68，钌-95，钌-97，钌-103，钌-106，汞-203，钪-47，碲-121m，碲-128，铥-165，铥-167，铥-168，氟-18，钇-99和锆89。可以使用本领域技术人员已知的直接或间接地例如通过螯合剂(例如EDTA或DTPA)来标记具有放射性同种型的抗体的现有方法。
在各种实施方案中，任何公开的抗体或抗原结合片段可以与第二药剂缀合，其中第二药剂可以是用于阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病的至少一种治疗剂。在一些实施方案中，缀合于阿尔茨海默氏病的治疗剂的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含选自表1中所示的那些一个或多个序列(例如，全部六个CDR和/或重链和/或轻链可变结构域)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区且轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQID NO:44的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:68的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:78的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；或所述重链可变区包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:29和30。在一些实施方案中，缀合至治疗剂的抗体或抗原结合片段可竞争结合或结合与该抗体所定义的序列的相同表位。
在一些实施方案中，治疗剂可以是针对β淀粉样蛋白或tau，或乙酰胆碱酯酶的抑制剂的被动免疫疗法。在一些实施方案中，治疗剂可以选自以下中的一种或多种：CAD106、Gantenerumab、Crenezumab、IVIG、AADvac1、ACI-35、NIC5-15、CHF-5074、MK-8931，AZD3293、LY33 14814、Elenbecestat、Tideglusib、鼻内Humulin R、鼻内赖谷胰岛素(Intransal glulisine)、SB742457与多奈哌齐、Azeliragon、尼伐地平。参见Godyn etal.,Pharmacological Reports,68:127-138,2016。在一些实施方案中，治疗剂可以选自：Aducanumab、ALZT-OP1a+ALZT-OP1b、阿立哌唑、AVP-786、AZD3293(LY3314814)、Brexprprazole(OPC-34712)、CAD106、CNP520、Elenbecestat、胰岛素(Humulin)、Lumateperone、JNJ-54861911、哌醋甲酯、MK-4305(苏沃雷生)、Nabilone、尼伐地平、吡格列酮、RVT-101(intepirdine)、Sodium Oligo-mannurarate(GV-971)、TRx0237、TTp488(azeliragon)、AADvac1、ABBV-8E12、AD-SVF细胞、ANAVEX 2-73、阿托莫西汀、AVP-786、AZD0530(塞卡替尼)、BAC、BAN2401、苯磷硫胺、BI409306、苔藓虫素(Bryostatin)1、坎地沙坦、CB-AC-02、西洛他唑、CPC-201、CT1812、DAOIB、屈大麻酚、E2609、福莫特罗、hUCB-MSC、JNJ-54861991、左乙拉西坦、利拉鲁肽、LY3202626、NewGam10％IVIG、尼洛替尼、ORM-12741、Pimavanserin、Piromelatine、Posiphen、PQ912、普罗布考、雷沙吉兰、利鲁唑、RVT-101、S47445、沙格司亭、辛伐他汀+L-精氨酸+四氢生物蝶呤(SLAT)、STA-1、SUVN-502、T-817MA、替米沙坦、UB-311、伐昔洛韦、VX-745、Xanamema。参见Cummings et al.,Alzheimer’sdisease drug development pipeline:2017,Alzheimer’s&Dementia,3:367-384,2017。在一些实施方案中，抗tau疗法包含小分子或肽疫苗疗法或抗tau抗体治疗。参见美国专利号9,518,101，其通过引用整体并入本文。
在其他实施方案中，提供了具有式(A)-(L)-(C)的免疫缀合物，其中：(A)是本文公开的抗体或其抗原结合片段；(L)是一个可选的接头；(C)是第二药剂(例如，用于治疗AD或另一种tau蛋白病的可检测的标记或治疗剂)；其中接头(L)将(A)连接至(C)。在一些实施方案中，(C)是治疗剂、显像剂、可检测药剂或诊断剂。在一些实施方案中，这些缀合物在本文中是指抗体-药物-缀合物(ADC)。
如本文所用，任选的接头(L)可以存在或不存在。当存在时，(L)是用于将(A)连接至(C)的分子。在一些实施方案中，接头能够与抗体和第二药剂形成共价键。合适的接头是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于直链或支链碳接头，杂环碳接头或肽接头。当抗体和第二药剂是多肽时，接头可以通过其侧基(例如，通过与半胱氨酸的二硫键)与组成的氨基酸连接。然而，在另一个实施方案中，接头可以连接至末端氨基酸的α碳氨基和羧基。
在某些情况下，当免疫缀合物到达其靶位点时，期望从抗体中释放第二药剂。因此，在这些情况下，免疫缀合物可以包含在靶位点附近切割的连接。可以通过酶活性或靶细胞内或靶位点附近免疫缀合物所处的条件促进接头的切割以从抗体释放第二药剂。在其他实施方案中，接头单元不是可切割的并且药物不被释放或例如通过抗体降解释放。
许多不同的反应可用于将药物和/或接头共价附于抗体或其抗原结合片段上。这经常通过抗体分子的氨基酸残基，包括赖氨酸的胺基、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧基、半胱氨酸的巯基和芳香族氨基酸的多个部分的反应来完成。最常用的共价附着的非特异性方法之一是连接化合物的羧基(或氨基)与抗体的氨基(或羧基)的碳化二亚胺反应。此外，双功能药剂如二醛或亚氨酸酯已经用于连接化合物的氨基与抗体分子的氨基。还可以用于将药物附着到抗体上的是希夫碱反应。该方法涉及含有乙二醇或羟基的药物的高碘酸盐氧化，从而形成醛，然后使其与结合剂反应。附着通过希夫碱与结合剂的氨基的形成发生。异硫氰酸盐也可以用作偶联剂，用于将药物共价附着到结合剂上。
在一些实施方案中，接头可以被胞内环境(例如溶酶体或内含体或细胞膜小凹(caveolea)内)中存在的切割剂切割。接头可以是例如肽基接头，其可以被胞内肽酶或蛋白酶，包括但不限于溶酶体或内含体蛋白酶切割。参见例如Dubowchik and Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123。此类接头的其他实例描述于例如美国专利号6,214,345。在其他实施方案中，可切割的接头是pH敏感的，即对某些pH值下的水解敏感。通常，pH敏感的接头在酸性条件下是可水解的。例如，可以使用可在溶酶体中水解的酸不稳定接头(例如，腙、缩氨基脲、硫代缩氨基脲、顺式-乌头酰胺、原酸酯、乙缩醛、缩酮等)。(参见例如，美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik and Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123；Neville et al.,1989,Biol.Chem.264:14653-14661.)。在其他实施方案中，接头在还原条件下是可切割的(例如，二硫键接头)。多种二硫键接头为本领域所知，包括例如可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-硫代乙酸乙酰酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)-、SPDB和SMPT形成的那些。(参见，例如，Thorpe et al.,1987,Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak etal.,In lmmunoconjugates:Antibody Conjugates in Radiolmagery and Therapy ofCancer(C.W.Vogel ed.,Oxford U.Press,1987.参见美国专利号4,880,935)。在另一实施方案中，接头是丙二酸酯接头(Johnson et al.,1995,Anticancer Res.15:1387-93)、maleimidobenzoyl接头(Lau et al.,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)，或3'-N-酰胺类似物(Laur et al.,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。
在另一实施方案中，接头单元不是可切割的并且通过抗体降解释放药物。(参见美国公开号2005/0238649)。在一个实施方案中，接头对胞外环境基本上不敏感。如本文所用，在接头的背景下“对胞外环境基本上不敏感”表示当抗体-药物缀合化合物存在于胞外环境(例如，血浆)中时，抗体-药物缀合化合物样品中不多于约20％，约15％，约10％，约5％，约3％，或不多于约1％的接头被切割。例如可以通过抗体-药物缀合化合物与血浆温育预定时间期限(例如，2、4、8、16或24小时)，然后定量血浆中存在的游离药物的量来测定接头对胞外环境是否基本上不敏感。
在一些实施方案中，(L)还可包含间隔基团或连接基团，例如聚醛、戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)或二亚乙基三胺五乙酸(DPTA)。
在一些实施方案中，可以将一种以上的第二药剂直接或通过接头连接至本文公开的抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，第二药剂与抗体的比例平均可以从约1：1至约1：8的范围内。参见美国专利号7,498,298。ADC的负载(药物/抗体比)可以用不同的方式控制。参见WO2006/034488。
核酸、载体、宿主细胞
还公开了分离的核酸，其编码本文所述的任何抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白链的至少一个可变区。在某些实施方案中，分离的核酸编码前述抗体或抗原结合片段中任一个的抗体或抗原结合片段。其他实施方案提供了包含核酸的分离的载体。另一个实施方案包括包含任何核酸或载体的分离的宿主细胞。
编码本文描述的抗体或抗原结合片段的多核苷酸或核酸可以是例如DNA，cDNA，RNA或合成产生的DNA或RNA或重组产生的嵌合核酸分子，其单独或组合地包含任何那些多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是载体的一部分。此类载体可以包含其他基因，例如标记基因和/或控制元件，从而允许在合适的宿主细胞中并且在合适的条件下选择和/或表达载体。
在一些实施方案中，多核苷酸可操作地连接至一个或多个表达控制序列，从而允许在原核或真核细胞中表达。多核苷酸的表达可以包括将多核苷酸转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞例如哺乳动物细胞中表达的调节元件是本领域技术人员已知的。它们通常包含确保转录起始的调节序列和任选的确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。其他调节元件可包括转录以及翻译增强子，和/或天然相关或异源启动子区域。
在这个方面，本领域技术人员将了解至少编码轻链和/或重链的CDR和/或可变结构域的聚核苷酸可编码两条或仅一条免疫球蛋白链的可变结构域。同样，多核苷酸可受同一启动子控制或可被分别控制以进行表达。允许在原核宿主细胞中表达的可能调控元件包括例如大肠杆菌中的PL、lac、trp或tac启动子，且允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其它动物细胞中的CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、CMV增强子、SV40增强子或球蛋白内含子。
除负责启始转录的元件之外，此类调节元件还可在多核苷酸下游包含转录终止信号，如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。此外，视所用表达系统而定，能够将多肽引导至细胞区室或使其分泌至介质中的前导序列可添加至多核苷酸的编码序列中且在本领域中是已知的。当使用时，前导序列可以与翻译，起始和终止序列以及任选地能够将翻译的蛋白质或其一部分的分泌引导到周质空间或细胞外介质中的前导序列在适当的阶段组装。在一些实施方案中，异源序列可编码包括C末端或N末端鉴定肽的融合蛋白，所述鉴定肽赋予所需特征，例如使表达的重组产物稳定化或纯化简化。在这种情况下，合适的表达载体是本领域已知的，并且包括但不限于Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)和pSPORT1(GIBCO BRL)。
在一些实施方案中，表达控制序列可以是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，但也可使用原核宿主的控制序列。一旦将载体掺入合适的宿主中，就将宿主维持在适合于核苷酸序列高水平表达的条件下，并根据需要，随后可以进行收集和纯化免疫球蛋白轻链、重链、轻链/重链二聚体或完整抗体、结合片段或其它免疫球蛋白形式。参见例如Beychok,Cells of Immunoglobulin Synthesis,Academic Press,N.Y.,(1979)。
在各种实施方案中，可以使用质粒、粘粒、病毒和噬菌体，其包含编码本公开的抗体的免疫球蛋白链的可变结构域的多核苷酸；任选地与编码本发明抗体的其他免疫球蛋白链的可变结构域的另一多核苷酸组合。在一些实施方案中，载体是表达载体和/或基因转移或靶向载体。源于如反转录病毒、痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头状瘤病毒的病毒的表达载体可用于将本公开的多核苷酸或载体递送至靶细胞群体中。本领域技术人员已知的任何方法均可用于构建重组病毒载体。或者，由本发明提供的多核苷酸和载体可重构至脂质体中以递送至靶细胞。可以通过已知方法将含有本公开的多核苷酸的载体(例如，免疫球蛋白链编码序列的重和/或轻可变结构域)转移到宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。
在一些实施方案中，用本文所述的用多核苷酸或载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。宿主细胞中存在的多核苷酸或载体可以整合到宿主细胞的基因组中，或其可维持在染色体外。宿主细胞可为任何原核或真核细胞，如细菌、昆虫、真菌、植物、动物或人细胞。优选真菌细胞是例如酵母属(Saccharomyces)的那些真菌细胞，例如酿酒酵母。取决于重组产生程序中采用的宿主，由多核苷酸编码的抗体或其抗原结合片段可以被糖基化。符合本公开的某些抗体或其抗原结合片段也可以包括初始甲硫氨酸氨基酸残基。本文公开的多核苷酸可以使用本领域普通技术人员通常已知的任何技术来转化或转染宿主。此外，用于制备融合的，可操作地连接的基因并在例如哺乳动物细胞和细菌中表达它们的方法是本领域众所周知的。通常，将含有促进插入的多核苷酸的有效转录的启动子序列的表达载体与宿主一起使用。表达载体通常包含复制起点，启动子和终止子，以及能够提供转化细胞表型选择的特定基因。用于DNA序列的合适的源细胞和用于免疫球蛋白表达和分泌的宿主细胞可以从许多来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(“Catalogue of CellLines and Hybridomas,”Fifth edition(1985)Manassas,Va.,U.S.A.,以及其他可用版本，以引用方式并入本文)。此外，包含本发明细胞的转基因动物(例如哺乳动物)，可用于大规模生产本文公开的抗体或抗原结合片段。
在另一个实施方案中，公开了产生抗体DC2E7的杂交瘤。该杂交瘤已经以专利保藏号PTA-124992保藏在美国典型培养物保藏中心。
在另一个实施方案中，公开了产生抗体DC2E2的杂交瘤。该杂交瘤已经以专利保藏号PTA-124991保藏在美国典型培养物保藏中心。
组合物、配制剂和组合
在一些示例性实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以与一种或多种也可用于检测、预防和/或治疗AD或另一种tau蛋白病的另外的化合物共配制和/或共施用。
在一些实施方案中，配制本文所述的抗体或其抗原结合片段以用于检测来自人类受试者的生物样品(例如，CSF或血液)中的磷酸化的tau的测定。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段缀合至可检测的标记，例如酶、放射性同位素、荧光团、核磁共振标志物或重金属。在一些实施方案中，配制本文所述的两种或更多种(例如3、4、5种等)抗体或抗原结合片段，以适用于该测定。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含抗体克隆DC2E7或DC2E2和/或包含来自那些克隆的CDR或可变结构域的抗体或片段，其单独或缀合至合适的可检测的标记。在一些实施方案中，所述制剂进一步包含适用于诊断测定法(例如下文所述的经典和数字ELISA测定法)的另外的元素和试剂(例如，固体支持物或颗粒，例如磁珠)。
在一些实施方案中，本文所述的抗体和抗原结合片段被制备用于检测生物样品中的磷酸化的tau的方法中。例如，可以如以下实施例3中所述制备和配制抗体。在一些实施方案中，可以例如使用蛋白G亲和柱从无血清杂交瘤上清液中纯化抗体或抗原结合片段(例如DC2E7，DC149，DC807和/或DC2E2或其抗原结合片段或变体)。然后可以将纯化的上清液洗脱(例如用0.1M甘氨酸-HCl pH 2.7)，并用1M Tris-HCl pH 9.0中和。合并的级分可以在缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS))中透析(diazlied)。在一些实施方案中，可以例如通过超滤浓缩缓冲的抗体溶液。在一些实施方案中，通过使用式c(mg/ml)＝A280nm/1.43测量在280nm处的吸光度来确定抗体浓度。
当在数字ELISA中用作捕获抗体时，可以在合适的缓冲溶液中制备DC2E7或抗原结合片段。在一些实施方案中，DC2E7或抗原结合片段被固定化在固体支持物(例如，固体表面或ELISA捕获珠)上。在一些实施方案中，例如根据下面的实施例10所述，将DC2E7或抗原结合片段连接至固体表面。简要地，DC2E7可以偶联至珠上，例如，磁珠(Quanterix)。在一些实施方案中，DC2E7以约0.1-5.0mg/mL(例如约1.0mg/mL)的浓度偶联至珠上。在一些实施方案中，DC2E2或抗原结合片段用作检测抗体，并且可以缀合至可检测的标记。例如，抗体或抗原结合片段可以被生物素化以用于检测目的，例如，通过暴露于相对于抗体浓度的1-200倍(例如，约120倍)过量的生物素。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段可以与可检测标记共同配制和/或共同施用。在一些实施方案中，可检测标记是酶、放射性同位素、荧光团、核磁共振标志物或重金属。在一些实施方案中，可检测标记与抗体或抗原结合片段缔合(例如，共价或非共价)缔合。可以使用用于抗体施用的合适的添加剂和配制条件，例如本领域已知的用于配制用于肠胃外施用(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)或静脉内、肌内或皮下注射的抗体。
在一些实施方案中，将抗体或其抗原结合片段与也可用于预防和/或治疗AD或另一种tau蛋白病的另外的化合物组合配制。这些包括但不限于用于AD的主动和被动免疫疗法的化合物，例如β-淀粉样蛋白肽(例如，N-末端淀粉样蛋白β肽)和tau肽，其可以或可以不与其他化合物缀合，例如突变的白喉毒素，KLH或其他载体。其他选择包括针对β淀粉样蛋白的抗体，例如巴匹组单抗(bapineuzumab)、苏兰珠单抗(solaneuzumab)、更汀芦单抗(gantenerumab)、克瑞组单抗(crenezumab)、泊奈组单抗(ponezumab)和IVIG免疫球蛋白，靶向Abeta低聚物的其他免疫疗法，其他tau抗体，防止tau过度磷酸化的化合物以及靶向tau聚集体的其他主动和被动免疫疗法。
在与本文所述的抗体和tau结合片段的联合治疗中可能有帮助的其他药物包括淀粉样β聚集抑制剂(例如高牛磺酸(Tramiprosate))、γ-分泌酶抑制剂(例如，司马西特(semagacestat))和γ-分泌酶调节剂(tarenflurbil)。此外，本文公开的一种或多种新型抗体可以与两种或多种前述治疗剂组合使用或配制。在疾病的早期阶段，联合疗法可能是有利的。组合疗法在疾病的后期也很有利，如hAb和生长因子以及其他生物活性分子包括神经元可塑性和再生的组合。此类组合疗法可以有利地利用较低剂量的所施用的治疗剂，因而避免可能的毒性或与多种单一疗法相关的并发症。根据相关实施方案，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以用于与选自以下的至少一种组合药剂组合：乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如，多奈哌齐(donepezil)、利凡斯的明(rivastigmine)、加兰他敏(galantamine)、他克林(tacrine)、营养补充剂)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂(例如，美金刚(memantine))、DNA修复的抑制剂(例如，哌仑西平(pirenzepine)或其代谢物)、过渡金属螯合剂、生长因子、激素、非类固醇类抗炎药物(NSAID)、抗氧化剂、降脂剂、选择性磷酸二酯酶抑制剂、tau聚集体的抑制剂、蛋白激酶的抑制剂、抗线粒体功能异常药物的抑制剂、神经营养因子、热激蛋白的抑制剂、脂蛋白相关磷脂酶A2抑制剂及其任何药学上可接受的盐。在一个实施方案中，利用公开的抗体和/或其tau结合片段与利用胆碱酯酶抑制剂(ChEI)和/或美金刚的治疗组合。在一个实施方案中，组合治疗剂选自由以下组成的组：抗细胞凋亡化合物、金属螯合剂、DNA修复的抑制剂、3-氨基-1-丙磺酸(3APS)、1,3-丙二磺酸(1,3PDS)、分泌酶抑制剂、β分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、β-淀粉样蛋白肽、β-淀粉样蛋白抗体、神经递质、β-折叠开关(breaker)、抗炎分子，和胆碱酯酶抑制剂。在一个实施方案中，胆碱酯酶抑制剂是利凡斯的明、多奈哌齐、加兰他敏，或营养补充剂。在另一实施方案中，另外的治疗剂选自BACE抑制剂；毒蕈碱拮抗剂；胆碱酯酶抑制剂；γ-分泌酶抑制剂；γ分泌酶调节剂；HMG-CoA还原酶抑制剂；非类固醇类抗炎剂；N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂；抗淀粉样蛋白抗体；维生素E；烟碱乙酰胆碱受体激动剂；CB1受体反激动剂或CB1受体拮抗剂；抗生素；生长激素促分泌物；组胺H3拮抗剂；AMPA激动剂；PDE4抑制剂；GABAA反激动剂；淀粉样蛋白聚集的抑制剂；糖原合成酶激酶β抑制剂；α分泌酶活性的促进剂；PDE-10抑制剂和胆固醇吸收抑制剂。
可以与本文所述的抗体和抗原结合片段组合使用的其他化合物包括美国专利9,518,101中所述的治疗性抗体和肽，将其全文通过引用并入本文。在WO 2004/058258中描述的化合物也是有用的，将其全文通过引用并入本文(尤其参见第16和17页)，包括治疗药物靶标(第36-39页)，链烷磺酸(alkanesulfonic acid)和链烷醇硫酸(alkanolsulfuricacid)(第39-51页)，胆碱酯酶抑制剂(第51-56页)，NMDA受体拮抗剂(第56-58页)，雌激素(第58-59页)，非甾体类抗炎药(第60-61页)，抗氧化剂(第61-62页)，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)激动剂(第63-67页)，降胆固醇剂(第68-75页)；淀粉样蛋白抑制剂(第75-77页)，淀粉样蛋白形成抑制剂(第77-78页)，金属螯合剂(第78-79页)，抗精神病药和抗抑郁药(第80-82页)，营养补充剂(第83-89页)和增加脑中生物活性物质的可用性的化合物(参见第89-93页)和前药物(第93和94页)。可以组合使用的其他化合物包括在Cummings etal.,Alzheimer’s disease drug development pipeline:2017,Alzheimer’s&Dementia:Translational Research&Clinical Interventions 3(2017)367-384中描述的那些。
本文还提供了包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段和另一种成分(如载体)的组合物。还提供了包含本文所述的人源化抗体或其抗原结合片段和载体(例如适合于诊断或治疗用途的载体)的组合物/制剂。
在一个实施方案中，通过将具有所期望程度的纯度的抗体或抗原结合片段与任选载体(例如，药学上可接受的载体)、稀释剂、赋形剂或稳定剂混合来制备根据本公开使用的抗体的配制剂和组合物(以冻干配制剂或水溶液形式)，以用于存储和/或施用(Remington’s Pharmaceutical Sciences 21st edition,Mohr,M.Ed.(2006))。在一个实施方案中，可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度上对受试者是无毒的，并且包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；氯化苯甲烃铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸酯如甲基或丙基对羟苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和m-甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖，和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖，或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的平衡离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇(PEG)。低压冻干的抗体制剂的实例描述于WO 97/04801中，通过引用明确并入本文。
在一个实施方案中，可以将抗体及其抗原结合片段掺入适合向受试者施用的药物组合物中。在某些实施方案中，药物组合物包含本文所公开的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，“药学上可接受的载体”包括生理相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的其他实例包括水，盐水，磷酸盐缓冲盐水，右旋糖，甘油，乙醇等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，组合物将包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇，山梨糖醇或氯化钠。药学上可接受的载体可进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其可延长抗体或其抗原结合片段的保质期或有效性。
包含公开的抗体或抗原结合片段的本文所述的组合物可以以多种形式。这些包括例如，液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如，可注射的和可输注(infusible)的溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。在一些实施方案中，此类组合物还可以包含缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐溶液)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、螯合剂如EDTA或谷光苷肽、佐剂(例如，氢氧化铝)和/或防腐剂。或者，可以将本发明的组合物配制成冻干物。抗体及其抗原结合片段也可以被包封在脂质体内。
适用于诊断测定或内部施用的剂型通常每单位或容器含有约0.1毫克-约500毫克的抗体或其抗原结合片段。在这些组合物中，基于组合物的总重量，活性成分通常将以约0.5-99.999％的量存在。优选的剂型取决于预期的用途和/或施用方式。
在某些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段可以穿过血脑屏障或被配制为穿过血脑屏障。某些神经退行性疾病，包括AD和相关的tau蛋白病，与血脑屏障通透性的增加有关，因此抗体或其抗原结合片段可以很容易地引入脑。当血脑屏障保持完整时，存在几种本领域已知的用于穿过其的转运分子的方法，包括但不限于物理方法，基于脂质的方法以及基于受体和通道的方法。环绕血脑屏障的方法包括但不限于直接注射入脑中(参见例如，Papanastassiou et al.,Gene Therapy 9:398-406(2002)和在脑中植入递送装置(参见例如，Gill et al.,Nature Med.9:589-595(2003):和Gliadel Wafers,T.M.,Guildford Pharmaceutical)。在屏障中创建开口的方法包括，但不限于超声(参见例如，美国公开号2002/0038086)、渗透压(例如，通过施用高渗甘露醇(Neuwelt,E.A.,Implicationof the Blood-BrainBarrier and its Manipulation,Vols 1&2,Plenum Press,N.Y.(1989)))，通过例如缓激肽(bradykinin)或透化剂A-7透化(参见例如，美国专利号5,112,596、5,268,164、5,506,206和5,686,416)，和利用含有编码抗体或其抗原结合片段的基因的载体转染神经元，其跨越血脑屏障(参见例如，美国专利公开号2003/0083299)。基于脂的转运抗体或其抗原结合片段横跨血脑屏障的方法包括，但不限于在偶联其活性片段的脂质体中封装抗体或其抗原结合片段，所述脂质体结合血脑屏障的血管内皮上的受体(参见例如美国专利申请公开号20020025313)，和在低密度脂蛋白颗粒中(参见例如，美国专利申请公开号20040204354)或载脂蛋白E中(参见例如，美国专利申请公开号20040131692)包被抗体或其抗原结合片段。
在各种实施方案中，组合物可包含本文所述的任何一种或多种抗体或抗原结合片段以及载体和/或稀释剂。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含选自表1中所示的那些任意一个或多个序列(例如，全部六个CDR和/或重链和/或轻链可变结构域)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含如表1所示任意序列，例如，表1中列出一组六个CDR和或成对的重链和轻链可变结构域序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:29和30。在一些实施方案中，该组合物适合用于诊断测定，例如经典或数字ELISA。在一些实施方案中，该组合物是药物组合物，并且包含药学上可接受的载体。
在某些实施方案中，组合物包含如前所述的任何两种抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，组合物包含至少一种其他抗体或抗原结合片段，和/或至少一种其他药剂。在一个示例性实施方案中，一种抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；另一种抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一抗体或抗原结合片段包含选自表1中所示的那些中的任意一个或多个(例如，所有六个CDR和/或重链和/或轻链可变结构域)序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含表1中所示的任意序列，例如，表1中列出的一组六个CDR和/或成对的重链和轻链可变结构域序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含SEQ IDNO:29和30。在一些实施方案中，第二抗体或抗原结合片段包含选自表1所示的那些中的任意一个或多个(例如，所有六个CDR和/或重链和/或轻链可变结构域)序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含表1中所示的任意序列，例如表1中列出的一组六个CDR和/或成对的重链和轻链可变结构域序列。抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:29和30。
在一些实施方案中，该组合物适合用于诊断测定法，例如经典或数字ELISA。在一些实施方案中，该组合物是药物组合物，并且包含药学上可接受的载体。该药物组合物可以进一步包含至少一种用于治疗阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病的其他治疗剂。
治疗方法
本文所述的抗体和组合物可用于治疗和预防AD及其tau蛋白病的各种方法。在一些实施方案中，抗体和组合物可用于检测适合基于抗tau的治疗的患者，报告治疗选择或监测治疗随时间的进展。在其他实施方案中，本文公开的抗体和组合物可以通过向需要其的患者施用一种或多种抗体或组合物而用作AD和其他tau蛋白病的直接治疗或预防。
在预防性(preventative)(即预防性(prophylactic))应用中，本文公开的抗体和药物组合物(例如，抗体DC2E7或可与抗体DC2E7结合相同表位或包含CDR或可变结构域的抗体或抗原结合片段)可以是给予易患阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病或有其他风险的患者。在一些实施方案中，以足以消除或降低风险，减轻严重性或延缓疾病发作的量施用抗体或药物组合物，包括疾病的生化，组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病发展过程中出现的中间病理表型。在治疗性应用中，将组合物以足以治愈或至少部分减轻，阻止或逆转疾病症状的量施用于怀疑，诊断和/或已经患有此类疾病的患者(生物化学，组织学和/或行为)，包括其并发症和疾病发展过程中的中间病理表型。
在一些实施方案中，治疗阿尔茨海默氏病是指随着时间的流逝减少或预防行为，功能和认知的恶化。在一些实施方案中，可以通过本领域技术人员已知的一系列标准化测试的任何一种或多种来评估阿尔茨海默氏病的行为、功能和认知方面，所述标准化测试包括，但不限于神经心理测试、简易精神状态检查、简易认知检查、神经精神问卷、罗斯痴呆评定量表、西班牙语和英语神经心理评定量表(SENAS)、精神病行为评定、功能评定、画钟测试、Boston命令测试、加利福尼亚言语学习测试、认知症状核对表、持续表现测试、受控的语词联想测试、认知量表、注意力的d2测试、Delis-Kaplan执行功能系统、痴呆评级量表、数字警觉测试、图形流利度测试、手指敲击测试、哈氏分类测试、Halstead-Reitan神经心理学试验、Hooper视觉组织测试、Kaplan Baycrest神经认知评定、Kaufman短神经心理学评定、Luria-Nebraska神经心理学试验、记忆评定量表、快速神经学筛选测试、用于评定神经心理学状态的可重复试验、Stroop测试、符号数字模式测试、触觉性能测试、主题理解测试、伦敦塔、踪迹描绘测试A和B、言语(词语)流畅性测试，和威斯康星卡片分类测试。也使用本领域技术人员已知的用于抑郁、焦虑、失语、躁动和行为参数的附加测试。另外，在一些实施方案中，可以使用本文公开的任何涉及一种或多种公开的抗体或其抗原结合片段的检测方法来诊断或监测患者的治疗功效。
在一些实施方案中，可施用本文公开的抗体和药物组合物(例如，抗体DC2E7或可结合与抗体DC2E7相同的表位或包含来自抗体DC2E7的CDR或可变结构域的抗体或抗原结合片段)以治疗患者的AD或另一种tau蛋白病。在一些实施方案中，阿尔茨海默氏病治疗的功效由至少一种选自由以下组成的组的评估的改善，缺乏恶化或恶化率降低来确定：阿尔茨海默氏病评定量表-认知分量表(ADAS-cog)、临床痴呆评级-盒总和(CDR-sb)、阿尔茨海默氏病协同研究日常生活活动量表(ADCS-ADL)、神经精神问卷(NPI)，和简易精神状态评估(MMSE)、进行性恶化量表(PDS)、阿姆斯特丹仪器日常生活(IADL)、临床痴呆评定量表(CDR)、痴呆症残疾评估量表(DAD)和简易精神状态评估(MMSE)。在一些实施方案中，治疗导致ADAS-cog评分的恶化率降低。在其他实施方案中，治疗导致ADAS-cog评分的恶化率中值降低两至五个点。
在一些实施方案中，提供了一种延迟阿尔茨海默氏病进展的方法，其包括施用一种或多种公开的抗体，例如，抗体DC2E7或可结合与抗体DC2E7相同的表位或包含来自抗体DC2E7的CDR或可变结构域的抗体或抗原结合片段。在一个实施方案中，AD的“延迟”进展是指推迟，阻碍，减慢，延迟，稳定和/或延缓疾病的发展。取决于疾病的历史和/或被治疗的个体，该延迟可以持续不同的时间长度。对本领域技术人员显而易见的是，充分或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患该病。在一个实施方案中，与不使用该方法时相比，“延迟”AD或另一种tau蛋白病的进展的方法是在给定时间范围内降低疾病发展的可能性和/或在给定时间范围内降低疾病程度的方法。此类比较通常基于临床研究，使用统计学上显著数量的受试者。
在某些实施方案中，AD或另一种tau蛋白病可延迟数天，数月或数年。例如，该方法可以将AD或另一种tau蛋白病的延迟进展一个或多个星期，几个月或几年。
患者、受试者或个体包括哺乳动物，如人、牛、马、犬、猫、猪，和绵羊动物。受试者可以是人类，并且可以患有或可以不患有疾病或目前没有症状。就AD而言，几乎任何人只要寿命足够长，就有患AD的风险。因此，本方法可以预防性地施用于普通人群，而不需要对受试者患者的风险进行任何评估。在其他实施方案中，使用本文公开的检测方法评估受试者的AD。
在一个实施方案中，本文中的患者在治疗之前任选地进行诊断测试，其可以包括本文公开的诊断方法。在一个实施方案中，所公开的方法对于具有已知的AD遗传风险的个体是有用的。此类个体包括那些有亲戚经历过这种疾病的人，以及那些通过遗传或生化标志物分析确定其风险的人。患AD风险的遗传标志物包括APP基因中的突变，特别是在位置717以及位置670和671处的突变，分别称为Hardy和Swedish突变。参见Hardy(1997)TrendsNeurosci.20:154-9)。其他风险标志物是早老素基因，PS1，PS2和ApoE4突变，AD家族史，高胆固醇血症或动脉粥样硬化。当前患有AD的个体也可以通过行为特征来鉴定。在无症状的患者中，治疗可以在任何年龄(例如10、20、30岁)开始。在某些患者中，直到患者达到较高年龄，例如40、50、60或70或更高年龄，或两者之间的任何时间段，才有必要开始治疗和/或监测。治疗可能使得在一段时间内多次剂量成为必需。可以以各种方式监视治疗，包括通过使用本文公开的AD检测方法。
定期使用这些测试中的一项或多项可以向医生或其他医学专家建议有关阿尔茨海默氏病和相关tau蛋白病的进展或消退以及进一步治疗的必要性。测试的选择和治疗成功的判断是阿尔茨海默氏病领域医学专家的专长。在一项或多项测试中提高的分数表明该受试者的AD严重程度降低。
在各种实施方案中，公开了在受试者中治疗、延迟进展或预防另一种tau蛋白病的阿尔茨海默氏病的进展的方法，其包括向该受试者施用有效量的至少一种本文所述的抗体或抗原结合片段。该方法可以导致减少运动障碍，改善运动功能，减少认知障碍，改善认知功能或其组合。通过将抗体或抗原结合片段施用于有此需要的受试者，本文所述任何抗体的用途可用于治疗、延缓进展或预防阿尔茨海默氏病。
检测和监测AD和其他tau蛋白病进展的方法
本文的公开内容部分集中于发现tau上的某些表位残基，特别是tau上含有一个或多个磷酸化的残基的那些，可以在某些生物样品(例如血液或CSF)中检测到，并用于鉴定和区分AD、其他tau蛋白病和其他形式的痴呆。例如，有用的表位残基可包含tau蛋白2N4R的残基188-227(SEQ ID NO:10)中的一个或多个。在某些实施方案中，该表位包含tau蛋白2N4R的残基210-221(SEQ ID NO:11)中的一个或多个。在某些实施方案中，该表位包含至少一个磷酸化的残基，例如在tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)的位置217处的磷酸苏氨酸，并且任选地还包含tau蛋白2N4R的在位置210处的磷酸化的丝氨酸，位置212处的苏氨酸，位置214处的丝氨酸，或位置220处的苏氨酸，或其任意组合。在另一个实施方案中，表位包含或由SRTPSLPpTPTPTR(SEQ ID NO:12的序列)或其中具有一个或多个其他磷酸化位置的氨基酸残基段组成。在另一个实施方案中，该表位包含或由SRpTPSLPpTPPTR(SEQ ID NO:31的序列)组成。本公开部分基于令人惊讶的发现，即这些样品中的磷酸化tau种类的量可用于将AD与其他tau蛋白病以及患有其他形式的痴呆的受试者区分开，从而根据分析结果诊断，监测和/或指导AD或其他tau蛋白病或其他原因的痴呆治疗决策。不受理论的束缚，鉴于磷酸化的表位通常可以在脑中跨不同的tau蛋白病而被检测到的事实，这些磷酸化表位的水平(例如在位置217处)可用于区分某些样品中的AD，其他变态反应和其他形式的痴呆的发现是特别出乎意料的。
本文提供的公开还部分地集中于抗体(例如，包含表1中所示的一个或多个序列的任意抗体，例如，选自表中所示的所有六个CDR和/或重链和/或轻链可变结构域)能够与某些类型的生物样品(例如CSF或血液)中的这些特定的磷酸化的tau表位结合，并且对于基于样品中的结合水平鉴定和区分AD，其他tau蛋白病和其他形式的痴呆症特别有用。本公开部分基于令人惊讶的发现，即这些样品中由公开的抗体结合的磷酸化tau种类的量可用于将AD与其他tau蛋白病以及患有其他形式痴呆的受试者区分开，从而根据分析结果诊断，监测和/或指导AD或其他tau蛋白病或其他原因的痴呆治疗决策。
除AD外，本领域已知其他疾病，包括额颞痴呆(FTD)、皮质基底膜疾病(CBD)和进行性核上性麻痹(PSP)。Murray et al.,Clinicopathologic assessment and imaging oftauopathies in neurodegenerative dementias,Alzheimer’s Research&Therapy,6:1,2014。还已知许多其他原因的痴呆。不受理论的束缚，来自AD患者和具有本文公开的抗体或抗原结合片段结合的其他tau蛋白病患者的某些生物样品(例如CSF或血液)中的磷酸化的tau种类的增加的量，可能有助于它们的有用性在非侵入性检测和区分这些体液中AD与其他原因的痴呆或其他的tau蛋白病。
来自健康受试者和痴呆症患者的某些类型的样品(例如血液和/或CSF)中存在大量的tau种类。尽管有许多潜在的靶标，但可以与这些样品中的特定tau种类结合的抗体使得它们可以提供诊断能力(例如，与仅存在于患有AD和/或其他tau蛋白病的受试者的样品中或存在于那些处于较高和/或不同水平的受试者样品的tau种类结合的抗体)以前尚未被确定。不受理论的束缚，在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段提供了对本领域的改进，因为其具有以比来自患有另一种tau蛋白病，其他神经系统疾病的患者或健康受试者的可比较样品更高的水平结合存在于患有AD患者的某些类型的样品(例如血液或CSF)中的tau蛋白上的磷酸化表位的能力。在一些实施方案中，该差异可用于检测患有痴呆症的受试者是否患有AD、另一种tau蛋白病或另一种病因的痴呆，和/或监测AD治疗的病程。例如，可以检测抗体结合的tau的量的不同阈值或倍数差异(例如，与健康受试者的水平相比或与患有已知原因的痴呆症的受试者相比)，并将其与受试者中AD，另一种tau蛋白病或另一种病因的痴呆相关联。在一些实施方案中，该差异可用于检测患有痴呆症的受试者是否患有AD或另一种tau蛋白病。在一些实施方案中，该差异可用于检测患有痴呆症的受试者是否患有AD或一些其他病因的痴呆。在一些实施方案中，该差异可用于区分患有痴呆症的受试者是否患有AD或另一种tau蛋白病。在一些实施方案中，该差异可用于区分患有痴呆症的受试者是否患有AD或一些其他病因的痴呆。
在各种实施方案中，公开了一种检测受试者中的tau蛋白病的方法，其包括：从所述受试者获得生物样品；使来自受试者的样品与有效量的能够形成tau分子复合物的分子接触(例如，本文公开的至少一种受体，抗体或抗原结合片段，其能够结合tau形成tau-抗体复合物)；使用本文公开的抗体或抗原结合片段检测tau-分子复合物的存在和/或量；其中tau-分子复合物的存在和/或量指示受试者中的tau蛋白病。在各种实施方案中，检测受试者中的tau蛋白病的方法包括：使来自受试者的生物样品与有效量的本文公开的能够结合tau形成tau-抗体复合物的至少一种抗体或抗原结合片段接触，其中tau-抗体复合物的存在和/或量指示受试者中的tau蛋白病。在一些实施方案中，通过免疫磁还原生物测定法进行检测，例如使用来自MagQu Co.Ltd的生物测定装置。
在一些实施方案中，样品中检测到的tau是磷酸化的tau。在各种实施方案中，至少一种抗体或抗原结合片段可以结合tau上的表位，其包含tau蛋白2N4R的残基188-227(SEQID NO:10)中的一个或多个。在各种实施方案中，至少一种抗体或抗原结合片段可以结合tau上的表位，其包含tau蛋白2N4R的残基210-221(SEQ ID NO:11)中的一个或多个。在一些实施方案中，该方法中使用的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在某些实施方案中，该方法中使用的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的在位置2处有取代的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的在位置2和12的一个或多个处有取代的氨基酸序列，和/或HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，和/或LCDR1包含SEQ IDNO:4的在位置2处有取代的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和/或LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在各个实施方案中，HCDR1的在位置2处的取代是甘氨酸，HCDR2的在位置2处的取代是异亮氨酸，HCDR2的在位置12处的取代是缬氨酸，和/或LCDR1中位置2处的取代是天冬酰胺。
在各种实施方案中，抗体或抗原结合片段包含表1中所示的任意序列，例如表1中列出的一组六个CDR和/或成对的重链和轻链可变结构域序列。
在某些实施方案中，方法中使用的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在各种实施方案中，用于公开的方法的抗体或抗原结合片段可包含DC2E7或其抗原结合片段或本文公开的能够与tau结合的任意变体。在各种实施方案中，抗原或抗原结合片段进一步包含可检测的标记。
在一些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或SEQ ID NO:7的在位置1、2、3、9、12、19、30、31、35、37、42、43、48、49、51、54、55、56、58、62、63、64、65、66、68、69、70、73、76、77、78、79、80、83、84、88、94、96、107、108和112的一个或多个处具有取代的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或SEQ ID NO:8的在位置3、7、11、14、17、19、20、21、24、25、28、39、42、49、52、56、69、71、75、92、94、99、105和106的一个或多个处具有取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，在重链可变区中在位置1处的取代是甘氨酸，位置2处是丙氨酸，位置3处是精氨酸，位置9处是精氨酸，位置12处是丙氨酸，位置19处是精氨酸，位置30处是甘氨酸，位置31处是甘氨酸，位置35处是精氨酸，位置37是丙氨酸，位置42处是甘氨酸，位置43处是蛋氨酸，位置48处是异亮氨酸，位置49处是苏氨酸，位置51处是缬氨酸，位置54处是丙氨酸，位置55处是甘氨酸，位置56处是丝氨酸，位置58处是缬氨酸，位置62处是甘氨酸，位置63处是丙氨酸，位置64处选自丙氨酸和谷氨酸，位置65处是谷氨酸，位置66处是天冬氨酸，位置68处是亮氨酸，位置69处是丙氨酸，位置70处是苏氨酸，位置73处是天冬酰胺，位置76处是谷氨酸，位置77处是丝氨酸，位置78处是丙氨酸，位置79处是蛋氨酸，位置80处选自丝氨酸、亮氨酸和组氨酸，位置83处是苏氨酸，位置84处是丙氨酸，位置88处是脯氨酸，位置94处是半胱氨酸，位置95处是甘氨酸，位置107处是丙氨酸，位置108处是脯氨酸，和/或位置112处是脯氨酸，和/或在轻链可变区中在位置3处的取代是精氨酸，位置7处是脯氨酸，位置11处选自丝氨酸或亮氨酸，位置14处是脯氨酸，位置17处是缬氨酸，位置19处是丙氨酸，位置20处是丙氨酸，位置21处是缬氨酸，位置24处是谷氨酸，位置25处是苏氨酸，位置28处是天冬酰胺，位置39处是异亮氨酸，位置42处选自丝氨酸和天冬氨酸，位置49处是脯氨酸，位置52处是甘氨酸，位置56处是脯氨酸，位置69处是甘氨酸，位置71处是组氨酸，位置75处是缬氨酸，位置92处是精氨酸，位置94处是苏氨酸，位置99处是丝氨酸，位置105处是甘氨酸，和/或位置106处为缬氨酸。
在各种实施方案中，在重链可变区中在位置68处的取代是亮氨酸，在轻链可变区中在位置39处的取代是异亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置48处的取代是异亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置30处的取代是甘氨酸和在位置58处是缬氨酸，在轻链可变区中在位置7处的取代是脯氨酸和在位置69处是甘氨酸。在各种实施方案中，在轻链可变区中在位置11处的取代是丝氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置77处的取代是丝氨酸，和在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸，在位置20处是丙氨酸，和在位置28处是天冬酰胺。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置37处的取代是丙氨酸，在位置63处是丙氨酸，和在位置80处是丝氨酸，和在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置1处的取代是甘氨酸，在位置3处是精氨酸，在位置76处是谷氨酸，和在位置77处是丝氨酸。在各种实施方案中，在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸。
在各种实施方案中，抗体或抗原结合片段包含表1中所示的任意序列，例如表1中列出的一组六个CDR和/或成对的重链和轻链可变结构域序列。
在一些实施方案中，该方法包括使来自受试者的生物样品(例如血液或CSF)与至少一种捕获抗体和至少一种检测抗体接触。在一些实施方案中，使用一种以上的捕获抗体和/或一种以上的检测抗体。在一些实施方案中，捕获和检测抗体是相同的(例如，当检测样品中的tau低聚物时)。在一些实施方案中，本文公开了能够形成tau-抗体复合物的第一抗体或抗原结合片段(例如，检测抗体)，并且其中tau-抗体复合物的存在是使用第二抗tau抗体或抗原结合片段来检测(例如，检测抗体)。在一些实施方案中，第二抗体或抗原结合片段结合tau上与第一抗体不同的表位。
在一些实施方案中，第一抗体或抗原结合片段可以结合tau上的表位，所述tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基188-227(SEQ ID NO:10)中的一个或多个或tau蛋白2N4R的残基210-221(SEQ ID NO:11)中的一个或多个。该表位可以在tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)的217位置处包含至少一个磷酸化残基，并且任选地还可以包含tau蛋白2N4R的位置210处的磷酸化丝氨酸、位置212处的苏氨酸、位置214处的丝氨酸，或位置220处的苏氨酸，或其任意组合。在某些实施方案中，tau上的表位包含或由SRTPSLPpTPPTR(SEQ ID NO:12)组成。在某些实施方案中，tau上的表位包含或由SRpTPSLPpTPPTR(SEQ ID NO 31)组成。在一些实施方案中，第一抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一个实施方案中，第一抗体或抗原结合片段包含抗体DC2E7或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，第一抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在各种实施方案中，第二抗体或抗原结合片段可以结合在tau上的表位上，所述tau上的表位包含tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:13)的残基151-188的一个或多个。在一些实施方案中，该表位包含tau蛋白2N4R的残基163-172(SEQ ID NO:14)中的一个或多个。在某些实施方案中，表位上的一个或多个残基被磷酸化，例如tau蛋白2N4R的位置169处的磷酸化的苏氨酸。在一些实施方案中，第二抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在某些实施方案中，第二抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一个实施方案中，第二抗体或抗原结合片段包含抗体DC2E2或其抗原结合片段。
在其他实施方案中，将第一抗体和第二抗体颠倒，和/或使用一个以上的第一抗体和第二抗体(其可以是相同或不同的抗体)。
在一些相反的实施方案中，第一抗体或抗原结合片段可以结合于tau上的表位，所述tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基151-188(SEQ ID NO:13)的一个或多个。在一些实施方案中，所述表位包含tau蛋白2N4R的残基163-172(SEQ ID NO:14)中的一个或多个。在某些实施方案中，表位上的一个或多个残基被磷酸化，例如tau蛋白2N4R的位置169处的磷酸化的苏氨酸。在一些实施方案中，第一抗体或抗原结合片段包含表1中所示的任意序列，例如表1中列出的一组六个CDR和/或成对的重链和轻链可变结构域序列。
在一些实施方案中，第一抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一个实施方案中，第一抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，第一抗体或抗原结合片段包含抗体DC2E2或其抗原结合片段。
在一些相反的实施方案中，第二抗体或抗原结合片段可以结合在tau上的表位上，所述tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基188-227(SEQ ID NO:10)中的一个或多个或tau蛋白2N4R的残基210-221(SEQ ID NO:11)中的一个或多个。由第二抗体或抗原结合片段结合的表位可以在tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)的217位置处包含至少一个磷酸化残基。在一些实施方案中，该表位还包含tau蛋白2N4R的位置210处的磷酸化丝氨酸、位置212处的苏氨酸、位置214处的丝氨酸，或位置220处的苏氨酸，或其任意组合。在某些实施方案中，第二抗体可以结合tau上包含SRTPSLPpTPPTR(SEQ ID NO:12)的表位。在一些实施方案中，第二抗体或抗原结合片段包含表1中所示的任何序列，例如表1中列出的一组六个CDR和/或成对的重链和轻链可变结构域序列。
在一些实施方案中，第二抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，第二抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列。在一个实施方案中，第二抗体或抗原结合片段包含抗体DC2E7或其抗原结合片段。
在各种实施方案中，将第一或第二抗体或抗原结合片段连接和/或包被在固体表面或颗粒上。固体表面可以是微量滴定板的表面。微量滴定板或多孔板通常具有例如以2：3矩形矩阵排列的6、12、24、48、96、384或1536或更多个样品孔。每个孔通常容纳数十纳升至几毫升的液体。如果使用固体颗粒代替固体表面或除固体表面之外，它可以是珠子。该颗粒可以是磁珠。珠子可以是塑料的或合成的聚合物床(bed)，包括：聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚酰胺、聚氨酯、酚醛聚合物、硝化纤维素、天然衍生的聚合物、胶乳橡胶、多糖、多肽、复合材料、陶瓷、二氧化硅或二氧化硅基材料、碳、金属或金属化合物、金、银、钢、铝、铜、无机玻璃，或二氧化硅材料，或其组合。珠子可以具有球形、盘状、环形或立方体状形状。
在某些实施方案中，将第一和/或第二抗体缀合至可检测标记。标记可以包含酶、放射性同位素、生物素、核磁共振标志物、重金属或其组合。该方法可以进一步包括检测来自可检测标记的信号。在一个实施方案中，通过在结合到tau之后检测来自标记抗体的荧光信号或该信号的强度来实现检测标记。在一些实施方案中，可检测的标记是生物素，并且通过使样品与缀合至酶的链霉亲合素接触来检测，所述酶优选辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。
在某些实施方案中，本文公开的tau检测方法包含经典/常规ELISA测定法(即，模拟读出系统)。另外或可替代地，这些方法可以包含数字ELISA(即，数字读出系统，其能够以数字方式确定浓度，而不是通过测量直至单个免疫复合物的总模拟信号来确定浓度，尽管在某些浓度下，这些方法也可以是用于读取模拟信号)。参见Rissin,D.M.,et al.,Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins atsubfemtomolar concentrations.Nat.Biotechnol.,2010.28(6),555-559。例如，可以使用单分子阵列(simoa)，它是一种数字ELISA，其中在磁性微珠上形成夹心复合物后，将珠在底物溶液中转移到微孔阵列中，例如，飞升(femtoliter)大小的微孔。在一些实施方案中，这些孔每个仅容纳一个珠子。在一些实施方案中，在添加用于标记检测抗体的酶的荧光底物之后，然后施加油膜以将孔密封至小体积，例如将反应体积限制为50fL。在一些实施例中，即使在珠子上仅存在一个夹心复合物，该小体积也允许检测到可读信号。作为报告物，可以使用酶β-半乳糖苷酶和底物试卤灵-β-D-半乳糖苷，并且将具有可检测信号的孔与所有含有珠的孔一起计数。这些计数之间的比率可以提供平均每珠输出的酶(AEB)。当AEB低(<0.1)时，可以使用泊松统计来显示任一珠的表面上只有一个或更少的复合物。当AEB信号变高时，增加每个磁珠不止一个复合物的可能性，可以使用光强度计算的转换，即使信号>0.1，也允许可用的AEB。可以使用用于Simoa仪器的软件(例如从96孔微量滴定板或单独的样品瓶进行采样和校准的软件)来实现用于转换的算法。
其他免疫测定法是本领域已知的，并且可以与公开的抗体和标记的抗体一起使用以检测样品中的磷酸化的tau。例如，可以使用单分子计数(SMC)平台，例如，其中带有或不带有荧光标记的抗体在珠子或板上与tau形成夹心复合物，然后将复合物破坏，荧光标记(例如Alexa Fluor)检测抗体的分子被吸到毛细管中，并在它们通过激发荧光团的激光束时计数。如果荧光达到背景阈值以上，则可以对数字事件进行计数。在较高的浓度下，所有发射光子的总和可用作信号的读数，从而实现高动态范围。在一些实施方案中，检测是通过单分子计数，例如，使用来自Merck Millipore的单分子计数装置(由Singulex开发)。可以使用的另一种高灵敏度免疫测定包括将磁性纳米颗粒附着于本文公开的抗体，并且在与分析物结合后以浓度依赖的方式在交变磁场中检测纳米颗粒的振荡变化，例如检测免疫磁性还原(IMR)。在一些实施方案中，通过免疫磁减量生物测定法进行检测，例如使用来自MagQuCo.Ltd.的生物测定法。
在各种实施方案中，样品可以在与抗体或其抗原结合片段接触之前被稀释。在某些情况下，循环抗原可以被天然存在的针对那些也在血液中循环的抗原的抗体掩盖。HIV蛋白p24是一个众所周知的例子。另外，在文献中已经报道了天然存在的tau/抗tau抗体复合物。WuJ,Li L.Autoantibodies in Alzheimer’s disease:potential biomarkers,pathogenic roles,and therapeutic implications.Journal of BiomedicalResearch.2016；30(5):361-372。这些复合物的存在可能干扰本文公开的检测测定。因此，在各种实施方案中，在与本公开的抗体或抗原结合片段接触之前，可以对样品进行免疫复合物解离(ICD)(例如，使样品中天然存在的tau-抗体/tau-分子复合物解离，使得tau不再与天然存在的抗体/分子结合，并且因此，因此可以通过本公开的方法自由地检测)。在一些实施方案中，通过向样品施加热和/或酸或任何其他已知的实现ICD的方法来实现免疫复合物的解离。
在任何前述实施方案中，生物样品可包含脑脊髓液(CSF)。可以例如通过在医疗环境中进行腰穿从患者获得CSF。备选地，生物样品可以包含血浆和/或血清。
在各个实施方案中，本文公开的方法检测样品中磷酸化tau的存在和/或量，将样品中磷酸化tau的量与健康个体的对照样品中的水平进行比较，其中样品中磷酸化tau的水平高于对照表明tau蛋白病。在另一个实施方案中，检测到的tau蛋白病是阿尔茨海默氏病。在某些实施方案中，来自受试者的样品中的磷酸化tau的水平相对于来自健康对照和/或患有非AD的已知的tau蛋白病样品的患者的样品的增加表示该受试者患有阿尔茨海默氏病而不是另一种tau蛋白病或另一种病因的痴呆。
例如，与来自健康受试者的对照样品中的水平相比，在来自患有痴呆症的受试者的样品中，由抗体或抗原结合片段检测到的tau水平0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更多倍的增加(或两者之间的任意倍数增加)可能表明存在AD或另一种tau蛋白病。在一些实施方案中，倍数增加在约1-100倍或约2-3倍之间。在一些实施方案中，倍数增加在约1-50、1-25、1-10或1-5倍之间。在一些实施方案中，痴呆症受试者的样品中结合的tau水平大于健康受试者的对照样品中观察到的阈值(例如，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、9.3 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000pg/ml，或两者之间的任意值)可能表明存在AD或另一种tau蛋白病。在一些实施方案中，阈值为约9.3pg/ml的tau。在一些实施方案中，阈值为0.93和93pg/ml之间的任何值的tau。在一些实施方案中，阈值为约5.37pg/ml。在一些实施方案中，阈值为约305pg/ml。在一些实施方案中，阈值为约100-600pg/ml。在一些实施方案中，与来自患有非AD的已知的tau蛋白病(例如，FTD，CBD或PSP)的患者的对照样品，或来自患有另一种形式痴呆的患者的对照样品中的水平相比，在来自患有痴呆的受试者的样品中，由抗体或抗原结合片段检测到的tau水平0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多倍的增加(或两者之间的任意倍数增加)可能表明患有痴呆的受试者存在AD。在一些实施方案中，倍数增加为约1-100倍，或约1-50倍，或约1-25倍，或约1-5倍，或约2-3倍之间。在一些实施方案中，痴呆受试者的样品中结合的tau水平大于在患有非AD的已知的tau蛋白病(例如，FTD，CBD或PSP)的患者的对照样品，或来自患有另一种形式痴呆的患者的对照样品中观察到的阈值(例如，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、9.3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900、950或1000pg/ml，或两者之间的任意值)可能表明患有痴呆的受试者存在AD。在各种实施方案中，使用常规方法，例如通过测量荧光强度，通过蛋白质印迹，质谱，经典ELISA，数字ELISA或本领域技术人员已知的其他方法，定量通过抗体结合检测的tau水平。
在一些实施方案中，当使用磷酸化的tau蛋白，即包含一个或多个磷酸化位置的全长tau蛋白校准检测测定法时，阈值约为0.1-10pg/ml。在一些实施方案中，当使用具有以下序列的2E7合成肽(2E7pep)校准检测测定法时，阈值是约100-600pg/ml：GQKGQANATRIPAKGGGSGGGSGGGSSRTPSLPpTPPTREPK。
在各种实施方案中，公开了一种用于在受试者中区分阿尔茨海默氏病与另一种tau蛋白病或另一种病因的痴呆的方法，该方法包括：从所述受试者获得生物样品；使来自受试者的样品与有效量的能够形成tau-分子复合物的分子(例如，能够结合tau以形成tau-抗体复合物的本文公开的至少一种受体，或抗体，或抗原结合片段)接触；使用本文公开的抗体或抗原结合片段检测tau-分子复合物的存在和/或量；其中相对于来自健康对照受试者的样品中的水平和/或相对于来自患有非AD的已知的tau蛋白病(例如，FTD，CBD或PSP)的受试者的样品中的水平，其中在样品中结合所述分子的磷酸化tau的存在和/或升高的水平表明受试者患有阿尔茨海默氏病，而非另一种tau蛋白病或其他病因的痴呆。在各个实施方案中，患有额颞痴呆(FTD)的受试者可以患有非流利性/语法缺失原发性进行性失语症(nfPPA)、语义变异的原发进行性失语症(svPPA)、行为变异性额颞痴呆(bvFTD)或肌萎缩性侧索硬化/额颞痴呆(ALS/FTD)。
在各种实施方案中，公开了一种用于区分受试者中阿尔茨海默氏病与另一种tau蛋白病或另一种原因的痴呆的方法，包括：从受试者获得脑脊髓液或血液样品；使样品与本文公开的抗tau抗体或其抗原结合片段接触；和使用本文公开的抗体或抗原结合片段检测tau-抗体复合物的存在和/或量，其中相对于来自健康对照受试者的样品中的水平和/或相对于来自患有非AD的已知的tau蛋白病(例如，FTD，CBD或PSP)的受试者的样品中的水平，其中在样品中结合抗体的磷酸化tau的存在和/或升高的水平表明受试者患有阿尔茨海默氏病，而非另一种tau蛋白病或其他病因的痴呆。在一些实施方案中，该方法使用包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗原结合片段，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。其中抗体或抗原结合片段能够结合磷酸化的tau以形成磷酸化的tau-抗体复合物；并检测样品中与抗体或抗原结合片段复合的磷酸化tau的存在和/或量，其中相对于来自健康对照受试者的样品中的水平，样品中的磷酸化tau的存在和/或水平升高表示受试者患有阿尔茨海默氏病，而不是另一种tau蛋白病或可选病因的痴呆。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或结合片段包含抗体DC2E7或其抗原结合片段。
在各种实施方案中，用能够结合tau的第二抗体或其抗原结合片段检测抗体-tau复合物。在一些实施方案中，第二抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在某些实施方案中，第二抗体或抗原结合片段包括包含SEQID NO:21的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区。在各种实施方案中，第二抗体或抗原结合片段包含抗体DC2E2或其抗原结合片段。在一些实施方案中，检测和捕获抗体是颠倒的。
在各种实施方案中，公开了一种治疗方法，其包括向患有阿尔茨海默氏病的受试者施用阿尔茨海默氏病的治疗剂，其中根据前述方法中的任一种，已将该受试者鉴定为患有阿尔茨海默氏病。治疗可包括施用治疗AD的抗体，治疗性肽或小分子，例如本文所述的任何治疗。在各种实施方案中，治疗剂可包括在美国专利号9,518,101和/或WO 2016/079597中公开的一种或多种抗体或治疗性肽，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，治疗剂可以是抗体DC2E7或其抗原结合片段和/或DC2E2或其抗原结合片段。在一个实施方案中，治疗剂可以是与DC2E7和/或DC2E2结合相同表位的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本文还公开了与可检测的标记(例如，放射性标记)偶联的所公开的抗体和抗原结合片段的用途，其可以(例如，静脉内)施用于受试者以检测脑中磷酸化tau的模式，从而诊断AD或另一种tau蛋白病。
在各种实施方案中，公开了一种在人类受试者中检测阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病的方法，其包括向受试者施用缀合至可检测标记(例如放射性同位素)的本文公开的抗体或抗原结合片段，并检测来自患者的脑中放射性同位素或其他可检测标记的信号，其中信号的检测表明受试者患有阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病。在一些实施方案中，与被公开的抗体和抗原结合片段(与可检测标记物缀合)结合的tau种类的脑部分布可用于确定受试者是否患有AD或另一种tau蛋白病。例如，与其他tau蛋白病(例如FTD-Pick病(其中在齿状回中，tau物种类可能更显著，在某种程度上，海马体)、CBD(其中tau种类可能在尾状核中更显著)和PSP(其中tau种类可能在壳状核/尾状核中更显著))相比，AD中的抗体结合(其中海马CA1中的tau种类可能更显著)可能有所不同。在一些实施方案中，向受试者施用缀合至可检测标记的抗体和抗原结合片段(例如，通过静脉内施用)，然后使他们的脑成像(例如，通过PET)以在脑中产生与被标记的抗体和抗原结合片段结合的tau图。可以针对已知的AD和其他tau蛋白病的图来分析该图，以确定患者是否患有AD或另一种tau蛋白病。
在某些实施方案中，通过正电子发射断层摄影术进行检测。脑中信号的分布可能表明受试者患有阿尔茨海默氏病还是另一种tau蛋白病。参见Murray et al.,Clinicopathologic assessment and imaging of tauopathies in neurodegenerativedementias,Alzheimer’s Research&Therapy,6:1,2014。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体或结合片段包含抗体DC2E7或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述抗体或结合片段包含与抗体DC2E7或其抗原结合片段竞争结合或结合相同表位的抗体或抗原结合片段。
在各种实施方案中，缀合至放射性同位素的抗体或其抗原结合片段可如本文所述施用于受试者。可以通过正电子发射断层摄影术在脑中检测放射性信号。然后可以通过计算机分析来构建体内抗体缀合物浓度的三维图像。整个脑中的信号浓度可用于关联与AD或其他Tau蛋白病相关的不同模式，或确定患有痴呆的患者是否患有AD，另一种tau蛋白病或另一种病因的痴呆。本领域技术人员可以解释这些信号模式，以确定受试者是否患有AD或另一种tau蛋白病。参见Murray et al.,Clinicopathologic assessment and imaging oftauopathies in neurodegenerative dementias,Alzheimer’s Research&Therapy,6:1,2014。
在各种实施方案中，在做出治疗决定之前，首先对患有痴呆症状的人类受试者进行检测本文公开的检测阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病的任何一种或多种方法。在某些实施方案中，从表现出痴呆症状的人类受试者中提取样品(例如，CSF或血液)，并根据上述方法进行分析，和/或向人类受试者施用缀合有放射性同位素的抗体DC2E7，信号在受试者的脑中被检测，以确定受试者是否患有阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病。在一个实施方案中，可以将已经确定患有阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病的人类受试者施用治疗AD或另一种tau蛋白病的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含本文公开的抗体或抗原结合片段。在一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种在美国专利号9,518,101和/或WO 2016/079597中公开的抗体或治疗性肽。或者，如果确定受试者没有患AD或另一种tau蛋白病，则可以进行替代施用。
在各种实施方案中，公开了确定人类受试者中阿尔茨海默氏病的时期的方法，其包括：从受试者获得脑脊髓液或血液样品，使样品与有效量的能够形成tau-分子复合物的分子接触(例如，能够结合tau以形成tau-抗体复合物的本文公开的至少一种受体，抗体，或抗原结合片段)；使用本文公开的抗体或抗原结合片段检测tau-分子复合物的量；将与该分子复合的tau的量与已知AD时期或阈值的样品中的量进行比较，从而确定阿尔茨海默氏病的时期。在一些实施方案中，样品中更高的tau量指示AD的更晚期。在各种实施方案中，如上所述，评估水平和/或阈值。在一些实施方案中，通过与已知AD时期(例如Braak I-VI期)的样品中检测到的磷酸化的tau的量比较，来确定晚期阶段。Braak et al.,"Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes".ActaNeuropathologica,82(4):239–59(1991)。
在各种实施方案中，公开了确定人类受试者中阿尔茨海默氏病的时期的方法，其包括：从受试者获得脑脊髓液或血液样品，使样品与本文公开的抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体或抗原结合片段能够与磷酸化tau结合以形成磷酸化tau-抗体复合物，检测样品中与抗体或抗原结合片段复合的磷酸化tau的量，并将与抗体复合的tau的量与已知AD时期或阈值的样品中的量进行比较，从而确定阿尔茨海默氏病的时期。在一些实施方案中，样品中更高的tau量指示AD的更晚期。在各种实施方案中，如上所述，评估水平和/或阈值。在一些实施方案中，通过与已知AD时期(例如Braak I-VI期)的样品中检测到的磷酸化的tau的量比较，来确定晚期阶段。Braak et al.,"Neuropathological stageing ofAlzheimer-related changes".Acta Neuropathologica,82(4):239–59(1991)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或结合片段包含抗体DC2E7或其抗原结合片段。在一些实施方案中，将样品中确定的tau水平与来自已知AD时期患者的样品中水平和/或与来自健康个体的对照样品中水平进行比较，以确定测试受试者样品中的tau量是否升高。
在各种实施方案中，公开了一种确定抗tau疗法对阿尔茨海默氏病的有效性的方法，其包括：从人类受试者获得脑脊髓液或血液样品；使样品与本文公开的抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体或抗原结合片段能够与磷酸化的tau结合以形成磷酸化的tau-抗体复合物；检测样品中与抗体或抗原结合片段复合的磷酸化tau的存在和/或量，其中相对于健康对照受试者的样品中的水平或阈值，样品中磷酸化tau的升高的水平表明受试者更可能对阿尔茨海默氏病的抗tau疗法有响应。在各种实施方案中，如上所述确定tau的超过阈值的升高水平或倍数增加。
在一些实施方案中，用于确定抗tau疗法对阿尔茨海默氏病的有效性的抗tau抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQID NO:7的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或结合片段包含抗体DC2E7或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，将抗tau疗法施用于确定为更可能对疗法有响应的受试者。在一个实施方案中，抗tau疗法包括施用与tau结合并促进其从脑中清除或抑制tau病理学扩散的抗体。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列。抗tau疗法包含本文公开的任何一种，和/或美国专利号9,518,101和WO2016/079597中公开的任何一种。在各种实施方案中，抗tau疗法包含小分子或肽疫苗疗法或抗体疗法。参见美国专利号9,518,101和WO 2016/079597，其全部内容通过引用并入本文。
在各种实施方案中，公开了一种监测抗tau疗法对阿尔茨海默氏病有效性的方法，其包括：(a)在治疗之前从人类受试者获得脑脊髓液或血液样品；(b)使样品与本文公开的抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体或抗原结合片段能够与磷酸化的tau结合形成磷酸化的tau-抗体复合物；(c)检测与抗体或抗原结合片段复合的磷酸化tau的存在和/或量；(d)向该受试者施用抗tau疗法；(e)在施用抗tau疗法后重复步骤(a)-(c)，由此与治疗前样品中的水平相比，治疗后样品中磷酸化tau的水平降低表明有效的治疗。在一些实施方案中，抗tau抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，该方法还包括向受试者在此施用抗tau疗法，与治疗前获得的样品中的水平相比，治疗后获得的样品中具有较低水平的磷酸化的tau。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或结合片段包含抗体DC2E7或其抗原结合片段。在各种实施方案中，抗tau疗法包含小分子或肽疫苗或抗体疗法。参见WO 2016/079597和美国专利号9,518,101，其通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，抗tau疗法包括施用与tau结合并促进其从脑中清除的抗体。在某些实施方案中，抗tau疗法包括施用包含重链可变区和轻链可变区的抗tau抗体或抗原结合片段，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗tau疗法包含本文公开的任何一种，和/或美国专利号9,518,101和WO 2016/079597中公开的任何一种。
监测和/或确认AD的其他方法
许多附加措施可以用于例如通过行为评估来确定、确认和/或监测AD状态，以用于确认AD诊断或评估治疗和/或疾病进展的效果。在一些实施方案中，这些措施包括阿尔茨海默氏病活动量表-认知子量表13(ADAS-Cog 13)得分的平均变化和阿尔茨海默氏病合作性日常生活学习活动(ADCS-ADL)得分的平均变化。其他措施可包括MRI容量变化，临床痴呆评分((CDR-SB/CDR-GS)变化，神经精神行为变化：神经精神问卷(NPI)总分和领域得分，和/或认知变化：MMSE总分。在另一个实施方案中，所述措施可以包括以下任一项：死亡发生时间，机构化，丧失进行日常生活活动的能力，严重痴呆的时间，ADCS-ADL，ADAS-cog评分，MMSE评分，认知表现，血浆CSF生物标志物，ADAS总分，通过生活质量阿尔茨海默氏病量表评估的生活质量，行为测试得分以及美国FDA的临床痴呆症分级总和。
在各种实施方案中，在人类受试者中检测阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病的方法，包括：向受试者施用已与放射性同位素缀合的本文公开的抗体或抗原结合片段并在患者的脑中检测信号，其中在脑中检测到的信号模式表明该受试者患有阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病。信号的检测可以通过正电子发射断层摄影术完成。脑中信号的分布可用于指示受试者是否患有阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病。在一个实施方案中，与放射性同位素缀合的施用的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含抗体DC2E7或其抗原结合片段。
本文公开的用于治疗或诊断用途的抗体和抗原结合片段可以通过任何合适的施用途径施用，例如肠胃外、局部、皮内、静脉内、口服、皮下、腹膜内、鼻内或肌内途径。典型的施用途径可以是皮下施用，尽管其他途径同样有效。另一个典型的途径可以是肌肉注射。这种注射类型通常在手臂或腿部肌肉中进行。也可以使用静脉内注射以及腹膜内注射、动脉内、颅内或真皮内注射。本文公开的抗体或抗原结合片段可以以物质在生理上可接受的载体和/或稀释剂中的溶液或悬浮液(例如无菌液体如水、油、盐水、甘油或乙醇)的可注射剂量施用。本文公开的抗体或抗原结合片段也可以通过在颅骨上钻一个小孔进行施用来给药，其可以允许穿过血脑屏障。
试剂盒
在各种实施方案中，本文公开了试剂盒，其包含本文所述的一种或多种抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，试剂盒包括包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗原结合片段，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或结合片段包含抗体DC2E7或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，试剂盒包括包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗原结合片段，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其选自表1中的那些，例如表1中的那些的一组六个CDR。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域和轻链可变结构域，其选自表1中的那些，例如选自表1中的那些的成对的重链和轻链可变结构域序列。
在某些实施方案中，试剂盒包含抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，和轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含在位置2处有取代的SEQID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含在位置2和12中的一个或多个处有取代的SEQ ID NO:2的氨基酸序列，和/或HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，和/或其中LCDR1包含在位置2处有取代的SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和/或LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在各种实施方案中，HCDR1中位置2处的取代是甘氨酸，HCDR2中位置2处的取代是异亮氨酸，和/或HCDR2中位置12处的取代是缬氨酸，和/或LCDR1中位置2处的取代是天冬酰胺。在各种实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在各种实施方案中，重链可变区包含在位置1、3、30、37、48、58、63、68、76、77和80的一个或多个处具有取代的SEQ ID NO:7的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含在位置7、11、20、28、39和69的一个或多个处具有取代的SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置68处的取代是亮氨酸，在轻链可变区中在位置39处的取代是异亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置48处的取代是异亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置30处的取代是甘氨酸且在位置58处是缬氨酸，在轻链可变区中在位置7处的取代是脯氨酸且在位置69处是甘氨酸。在各种实施方案中，在轻链可变区中在位置11处的取代是丝氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置77处的取代是丝氨酸，且在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸，在位置20处是丙氨酸，且在位置28处是天冬酰胺。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置37处的取代是丙氨酸，在位置63处是丙氨酸，且在位置80处是丝氨酸，且在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸。在各种实施方案中，在重链可变区中在位置1处的取代是甘氨酸，在位置3处是精氨酸，在位置76处是谷氨酸，且在位置77处是丝氨酸。在各种实施方案中，在轻链可变区中在位置11处的取代是亮氨酸。
在各种实施方案中，试剂盒包含两个或更多个抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，试剂盒包含：
a.包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗原结合片段，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；和
b.另一抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在某些实施方案中，试剂盒包含两种或更多种抗体或抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，另一种抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列并且轻链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在某些实施方案中，试剂盒包含抗体或DC2E7或其抗原结合片段和/或抗体或DC2E2或其抗原结合片段。
在各种实施方案中，试剂盒包含两种或更多种抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，试剂盒包含：
a.抗体或抗原结合片段，其包含表1中所示的任意序列，例如表1中列出的一组六个CDR和/或成对的重链和轻链可变结构域序列；
b.另一抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在各种实施方案中，试剂盒包含两种或更多种抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，试剂盒包含：
a.抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
b.和另一抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:16的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQID NO:18的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，任何前述试剂盒可进一步包含用于使用一种或多种抗体或抗原结合片段根据本文公开的方法来检测来自受试者的样品中的磷酸化的tau，从而检测受试者中阿尔茨海默氏病的说明书。说明书可能要求样品是脑脊液或血液。试剂盒可进一步包含用于经典ELISA或数字ELISA的另外的组分。
实施例
在下面阐述的非限制性实施例中示出了前述的若干个实施方案。然而，从整体上考虑说明书，本公开的其他实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。说明书和实施例旨在被认为仅是示例性的。另外，本文中引用的所有参考文献应被认为通过引用整体并入。
实施例1
重组人Tau蛋白的制备
人全长tau 2N4R和tau缺失突变体：重组tau蛋白是从克隆τ40中生成的(Goedert等人，Multiple isoforms of human microtubule-associated proteintau:sequencesand localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer’s disease,Neuron 3,519-526(1989)，所述克隆τ40被亚克隆到表达质粒pET-17b(Novagen)中并在细菌中表达。每个tau缺失突变体是通过DNA测序验证的。所有tau缺失突变体和tau肽是根据最长人tau同等型2N4R编号的，所述同等型2N4R的长度为441个氨基酸，并且因此也被称为tau441(D'Souza,I.,和Schellenberg,G.D.(2005).Regulation of tau isoform expression anddementia.Biochimica et biophysica acta 1739,104-115)。tau蛋白的生产涉及以下步骤：a)tau在细菌中的表达；b)通过离子交换色谱纯化tau；c)通过凝胶过滤纯化tau；d)浓缩和储存分离的tau。
a)人全长tau(2N4R)和重组tau缺失突变体的细菌表达：将人tau(以上)表达质粒转化到大肠杆菌(E.coli)生产菌株BL21(DE3)中。如Sambrook和Russell(2001)的“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”中所述，培养并诱导含有合适表达质粒的细菌细胞。将用驱动tau蛋白或其片段表达的pET-17b质粒转化的BL21(DE3)细菌的单个菌落在37℃下于500mL带有100μg/ml氨苄青霉素的Luria肉汤培养基中以300rpm的速度培养，并通过添加异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)至0.4mM的终浓度来诱导。在37℃下进一步温育3小时后，通过在4℃下以3,000xg离心15分钟来收集细菌。
b)碱性和中性tau蛋白(六种tau同等型，tau同等型2N4R的点突变体：Ser198Ala、Ser199Ala、Ser202Ala、Thr205Ala、Ser208Ala、Ser210Ala、Thr212Ala、Ser214Ala、Thr217Ala、Ser231Ala、tau221-441、tau99-441、tau188-44、tau31-441、tau151-391、tau127-441、tau2N4RΔ(134-168)、tau2N4RΔ(49-243)的阳离子交换色谱纯化基本上如上所述进行(Krajciova等人，Preserving free thios of intrinsically disordered tauprotein without use of a reducing agent,Analytical Biochemistry,383:343-345,2008)。表达后，将细菌沉淀重悬于10ml裂解缓冲液(50mM 1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)pH6.9，50mM氯化钠(NaCl)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，5mM二硫苏糖醇(DTT)，0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，5％(v/v)甘油)中，在液氮中快速冷冻并保存于-80℃直至用于tau蛋白的纯化。对于tau蛋白纯化，将冷冻的细菌悬浮液迅速解冻并置于冰上。细菌细胞壁通过在冰上超声处理并通过以下条件进行破碎：使用Sonopuls HD 2200，将尖端TT-13(Bandelin，Germany)设置为50％占空比，50W功率输出，6次持续30s暂停30s。通过离心(21,000xg，在4℃下15分钟)澄清裂解物，并通过0.45μm膜滤器过滤上清液。使用
Figure BDA0002755663400000961
-FPLC工作站(AmershamBiosciences，Sweden)在6℃进行了重组tau蛋白的大规模纯化。将过滤的裂解物以3ml/min的流速加载到用裂解缓冲液平衡的5ml HiTrap SP HP柱(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上，并用60ml裂解缓冲液充分洗涤直至280nm处的基线变得稳定。将结合的tau蛋白用梯度(15ml内0-30％)缓冲液B(补充有1M NaCl的裂解缓冲液)洗脱。收集单独的1mL级分，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。为了除去与带正电荷的tau蛋白共纯化的核酸，通过使用具有较不陡峭的梯度(45ml中0-30％)的缓冲液B的5mlHiTrap SP HP柱(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)，将含有tau蛋白的级分合并并通过第二阳离子交换色谱步骤进行纯化。如先前所述(Csokova等人，Rapid purification oftruncated tau proteins:model approach to purification of functionally activefragments of disordered proteins,implication for neurodegenerative diseases,Protein Expression and Purification,35:366-372,2004)，对酸性tau蛋白(tau1-226，tau1-136，tau1-242)进行阴离子交换色谱纯化。表达后，将细菌沉淀重悬于10ml组氨酸裂解缓冲液(20mM组氨酸，pH 6.0，50mM NaCl，1mM EDTA，5mM DTT，0.1mM PMSF和5％(v/v)甘油)中。细菌细胞壁通过在冰上超声处理并通过以下条件进行破碎的：使用Sonopuls HD2200，将尖端TT-13(Bandelin，Germany)设置为50％占空比，50W功率输出，6次持续30s暂停30s。通过离心(21,000xg，在4℃下15分钟)使裂解物澄清。将细菌裂解液用1％硫酸链霉素(Medexport，Russia)沉淀，在冰上温育5分钟，通过离心(21,000xg，在4℃下15分钟)澄清，并通过0.45μm膜滤器过滤。将过滤的链霉素沉淀的裂解物以3ml/min的流速加载到5ml的HiTrap QSepharose HP柱(Amersham Biosciences，Sweden)上，并用30-50ml的组氨酸裂解缓冲液充分洗涤，直至A280基线变得稳定。用组氨酸裂解缓冲液中的两步盐梯度(40ml中的0.05-0.5M NaCl，然后20ml中的0.5-1M NaCl)对Tau蛋白进行洗脱。
c)在纯化的最终凝胶过滤步骤中(所有tau蛋白都相同)，将通过离子交换色谱获得的合并的tau蛋白级分以3ml/min注入凝胶过滤柱(HiLoad 26/60Superdex 200prepgrade column,GE Healthcare)上，所述合并的tau蛋白级分分别在用于碱性/中性或酸性tau蛋白的补充有100mM NaCl的PIPES或组氨酸裂解缓冲液中。将洗脱的tau蛋白合并。
d)对于凝胶过滤纯化后的tau蛋白浓度，将合并的级分用1.5体积的2.5％甘油稀释，然后再次加载至HiTrap SP HP柱(碱性和中性tau蛋白)或HiTrap Q HP柱(酸性tau蛋白)上。然后将浓缩的重组tau蛋白用1M NaCl逐步梯度从柱上洗脱下来。最后，将缓冲液更换为充满氩气的磷酸盐缓冲液(PBS，8.09mM磷酸二钠(Na2HPO4)，1.47mM磷酸二氢钾(KH2PO4)，136.89mM NaCl，2.7mM氯化钾(KCl))，使用5mL HiTrap脱盐柱(GE Healthcare)。使用二辛可宁酸(BCA)定量试剂盒(Pierce，USA)，以牛血清白蛋白(BSA)为标准，对纯化的样品进行蛋白质定量。将Tau蛋白等分为工作等分试样，在液氮中速冻，并于-70℃保存。
实施例2
生产针对人Tau1-242单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备，ELISA筛选单克隆抗体以及单克隆抗体DC2E2的初步表征
用在完全弗氏佐剂(SIGMA)中的50μg重组tau1-242-(如实施例1中所述制备)对六周龄的Balb/c小鼠进行皮下初次免疫(prime)，并在四周的间隔用不完全弗氏佐剂中的50μg相同抗原加强免疫3次。融合前三天，给小鼠静脉内注射PBS中50μg的相同抗原。根据Kontsekova等人,The effect of postfusion cell density on establishment ofhybridomas,Folia Biol.34,18-22(1988)的方法，将来自免疫小鼠的脾细胞与NS/0骨髓瘤细胞融合。将脾细胞与NS/0骨髓瘤细胞混合(比例为5:1)，并在1ml补充有10％二甲基亚砜的无血清Dulbecco's改良Eagle培养基(DMEM)中的50％聚乙二醇(PEG)1550(Serva)中融合1分钟。将融合的细胞重悬于含有20％马血清，L-谷氨酰胺(2mM)，次黄嘌呤(0.1mM)，氨基蝶呤(0.04mM)，胸苷(0.016mM)和庆大霉素(40U/ml)的DMEM中，在96孔板上以每孔2.5x 105个脾细胞的密度。
将细胞在37℃下温育10天，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选生长的杂交瘤，用于产生抗tau1-242特异性单克隆抗体。将微量滴定板于37℃在PBS中用tau1-242(5μg/ml，50μl/孔)包被过夜。将板用1％脱脂奶粉封闭以减少非特异性结合，用PBS-0.05％Tween20洗涤，并与50μl/孔的杂交瘤培养上清液在37℃温育1小时。用与辣根过氧化物酶(HRP，DAKO)缀合的绵羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)检测结合的单克隆抗体。用TMB one(Kem-En-TecDiagnostics)作为过氧化物酶底物发生反应，并用50μl的2M H2SO4终止反应。使用Powerwave HT(Bio-Tek)测量450nm处的吸光度。吸光度值为阴性对照(PBS)值的至少两倍的读数被认为是阳性的。根据Kontsekova等人,One-step method for establishing 8-azaguanine-resistant hybridomas suitable for preparation of triomas,J.Immunol.Methods,145,247-250(1991)中所述的规程，将阳性杂交瘤培养物进一步亚克隆到软琼脂中。
在由此产生和选择的阳性杂交瘤培养物中鉴定了单克隆抗体DC2E2(由美国典型培养物保藏中心保藏的小鼠杂交瘤细胞系生产，ATCC专利保藏号为PTA-124991。)。如下所述进一步表征DC2E2。使用小鼠Ig分型试剂盒(ISO-2，SIGMA)通过ELISA(图1)确定了抗体同种型为鼠IgG1。
实施例3
使用重组Tau缺失突变体，Tau衍生肽和质谱的DC2E2表位的定位
使用ELISA将人tau蛋白2N4R的缺失突变体用于DC2E2的表位定位(mapping)(图2A)。如实施例1中所述制备重组人tau同等型2N4R，1N4R，2N3R，0N4R，1N3R，0N3R和tau缺失突变体。将微量滴定板在37℃下用重组tau蛋白(PBS中50μg/ml，50μl/孔)包被过夜。用PBS-Tween20(0.1％v/v)封闭板以减少非特异性结合，并与50μl/孔的DC2E2杂交瘤培养物上清液一起在37℃下温育1小时。用绵羊抗小鼠Ig HRP缀合物(DAKO)检测结合的单克隆抗体。用TMB one溶液(Kem-En-Tec Diagnostics)作为过氧化物酶底物发生反应，并用50μl的2MH2SO4终止反应。使用Powerwave HT(Bio-Tek)在450nm处测量吸光度。吸光度值为阴性对照(PBS)值的至少两倍的读数被认为是阳性的。DC2E2识别以下的人tau蛋白：六种人tau同等型(图2B)，tau 1-242、tau 31-441、tau 99-441、tau 1-226、tau151-391、tau 127-441，但未能识别缺失突变体tau 1-136、tau 221-441和tau 2N4R(Δ134-168)(图2C)。总之，这些发现表明DC2E2识别tau上的结合位点或表位，所述结合位点或表位位于氨基酸151-188之间的tau的脯氨酸到达区域(reach region)中。
为了进一步定义表位，进行了竞争ELISA。对于竞争实验，如下所述，在蛋白G亲和柱上从无血清杂交瘤上清液中纯化DC2E2单克隆抗体(mAb)。将杂交瘤上清液调节至pH7.5，通过离心将溶液预先澄清，通过0.45μm的膜滤器过滤，并加载到5ml蛋白G琼脂糖柱上。用0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.7从柱中洗脱DC2E2 mAb。立即用1M Tris-HCl pH 9.0中和洗脱的级分。将合并的级分针对PBS透析，通过超滤浓缩，并保存在-70℃。通过使用式c(mg/ml)＝A280nm/1.43，在280nm处测量吸光度来确定抗体的浓度。
对于竞争ELISA，通过EZBiolabs合成肽(tau 141-170、161-190、181-210、171-200)，所述肽的纯度高于90％。将ELISA板(Nunc Medisorp，Thermo Scientific，Denmark)用50μl/孔的PBS溶液中的0.4μg/ml的重组纯化tau 1-242在4℃下包被过夜。将板用PBS/Tween 20(0.1％v/v)洗涤4次，并在25℃用PBS/Tween 20封闭2小时。将肽分别以5mM的终浓度溶解于PBS中。在带有锥形孔底部的聚丙烯板(Greiner#，#651201)中制备在PBS/Tween20中的肽连续稀释液(2.5倍)(浓度范围200μM、32μM、12,8μM、5,1μM、2μM、0,8μM和0,3μM)。每孔加入60μl的每种稀释液。在PBS/Tween 20中将纯化的DC2E2稀释至0.6μg/ml的浓度，并将60μl的该稀释的抗体与各肽的连续稀释液混合，得到120μl的混合物，其中具有0.36ng的抗体/含有处于200μM、32μM、12,8μM、5,1μM、2μM、0,8μM和0,3μM的浓度的各自的测试肽的60μl。将抗体/肽混合物在设置为250rpm的旋转平台上在25℃下温育1小时。将五十微升(50μl)抗体/肽混合物从聚丙烯板转移到tau1-242包被的和PBS/Tween 20封闭的板中(一式两份)，并在设置为250rpm的旋转平台上在25℃下温育1小时。将板用PBS/Tween 20洗涤4次，并在25℃下在旋转平台(设置为250rpm)上与50μl的在PBS/Tween 20中1:1000稀释的多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白/HRP(Dako#，#P0447)温育1小时。将板用PBS/Tween洗涤4次，并然后与50μl/孔的作为过氧化物酶底物的TMB one溶液(Kem-En-Tec Diagnostics)温育。通过加入50μl的2M H2SO4(Merck)终止反应。使用Powerwave HT(Bio-Tek)在450nm处测量吸光度。
用以下肽进行竞争ELISA：tau 141-170、161-190、171-200、181-210。(图2D)仅肽tau 161-190与tau 1-242竞争与DC2E2的结合(图2D)。但是，将肽转移到tau的C端(171-200，181-210)或tau的N端(141-170)会导致与tau1-242结合DC2E2的竞争活性丧失。这些结果表明表位位于氨基酸161-181之间。
使用LC/MALDI质谱法旨在更精确地定义表位。通过将蛋白水解消化的tau蛋白与固定化在磁珠上的DC2E2单克隆抗体结合，然后通过LC/MALDI质谱法鉴定洗脱的肽，来鉴定结合位点的序列。将Tau蛋白(tau2N4R和tau151-391)在37℃下用胰蛋白酶，Glu-C，胰凝乳蛋白酶的混合物消化过夜，或在108℃下用甲酸消化2小时。结合反应在PBS中的1％CHAPS中进行2小时。通过用PBS中的1％CHAPS洗涤3次，去除未结合的肽。通过用甲酸洗涤三次洗脱结合的肽并将其冻干。通过UHPLC(Dionex，Ultimate 3000nano-LC系统)分离肽，将级分与HCCA基质溶液混合，并分配到MTP Anchor Chip 384MALDI样品板(Bruker Daltonics)上。用在阳离子模式下操作的MALDI TOF/TOF(Ultraflextreme，Bruker Daltonics)仪器，分析分级的样品。使用Mascot搜索引擎(Matrix Science)针对tau蛋白数据库搜索收集的MS和MS/MS光谱。
数据库分析揭示了若干个肽序列，它们全部包含KGQANATRIP。该肽位于tau 2N4R上163-172的区域中(富含脯氨酸的区域)。
实施例4
DC2E2识别对于阿尔茨海默氏病中不溶性Tau，磷酸化Tau和未磷酸化Tau特异性的A68三联体(triplet)
在阿尔茨海默氏病中，tau是过度磷酸化的。因此，为了详细表征DC2E2的结合特性，检查了过度磷酸化的PHF-tau和体外磷酸化的tau。
使用肌氨酰(sarkosyl)方法(Greenberg和Davies,Apreparation of Alzheimer’s paried helical filaments that displays distint tau proteins bypolyacrylamide gel electrophoresis,PNAS,87:5827-31,1990)从人AD脑中分离出十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)不溶性tau复合物(PHF-Tau)。对于蛋白质提取，将冰冻的人AD脑组织(额叶皮层，从荷兰脑库获得的Braak VI期样品)在10体积的冷提取缓冲液(10mM TrispH 7.4，0.8M NaCl，1mM EGTA和10％蔗糖)中均质化，并将匀浆以20,000xg离心20分钟。为了制备十二烷基肌氨酸钠不溶性的tau，在上清液中补充N-十二烷酰基肌氨酸(lauroylsarcosine)(SIGMA)至终浓度为1％，并在摇动的同时在室温下温育1小时。在100,000xg离心1h后，弃去所得的上清液，并将包含肌氨酰不溶性tau级分的沉淀重悬于1/50体积的用于制备不溶性tau的上清液中。
对于tau 2N4R和tau151-391的体外磷酸化，使用了激酶提取物。将成年大鼠脑(1g/2,5ml)在激酶缓冲液(10mM TRIS-HCl,pH 7,4；5mM EGTA,2mM DTT；1mM PMSF；2mMMgCl2,亮抑酶肽(20μg/ml)，胃酶抑素(20μg/ml)，抑肽酶(20μg/ml))中均质化，并在4℃以100,000xg离心30分钟后，将上清液(激酶提取物)用于tau的磷酸化。磷酸化反应是在37℃在10mM TRIS-HCl,pH 7,4；5mM EGTA,2mM DTT；1mM PMSF；亮抑酶肽(20μg/ml)；胃酶抑素(20μg/ml)；抑肽酶(20μg/ml)；2mM ATP；2mM MgCl2和10μM冈田酸中进行的。将脑激酶提取物(5μl)添加到50μl tau溶液(1μM)中，并将反应液在37℃下温育24h。使用针对六种重组人tau同等型产生的兔抗血清，通过SDS-PAGE和免疫印迹法分析tau的磷酸化(Csokova等人Rapid purification of truncated tau proteins:model approach to purificationof functionally active fragments of disordered proteins,implication forneurodegenerative diseases,Protein Expression and Purification,35:366-372,2004)。
使用DC2E2通过免疫印迹法分析了磷酸化和未磷酸化的tau蛋白2N4R和tau151-391和十二烷基肌氨酸钠不溶性PHF-tau。用等体积的2x SDS(十二烷基硫酸钠)样品加载缓冲液(含β-巯基乙醇)(Laemmli，1970)稀释可溶性tau蛋白，并且每泳道加载250ng蛋白。对于不溶性PHF-tau，将沉淀溶解在1x SDS样品加载缓冲液中，以用于制备不溶性tau级分的可溶性级分的1/50体积。然后，将等体积的可溶性tau和肌氨酰不溶性tau级分用于免疫印迹，这相当于可溶性级分中15μg的总蛋白(参见Filipcik等人2010)。将样品在95℃加热5分钟，加载到5-20％梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶上，并在Tris-甘氨酸-SDS缓冲液系统中以25mA电泳40分钟。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(以150mA，10mM CAPS中，pH 12下1h)。转移后，将膜在磷酸盐缓冲盐水(PBS；136.89mM NaCl,2.7mM KCl,8.09mM Na2HPO4,1.47mM KH2PO4)中的5％脱脂奶粉中在室温下封闭1个小时，然后与DC2E2杂交瘤培养物上清液温育12小时，然后用大量PBS-T(1％Tween20)洗涤3次。将膜与HRP缀合的山羊抗小鼠Ig(DAKO，Denmark)温育(在室温下1小时)，并用PBS中的1％脱脂奶粉以1:3,000稀释，作为二抗。该温育后，用0.1％Tween 20的PBS溶液洗涤(三次)。用SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce，U.S.A)显影印迹，并使用LAS3000成像系统(FUJI Photo FilmCo.,Japan)检测蛋白质信号。使用AIDA(Advanced Image Data Analyzer,Raytest,Straubenhardt，Germany)软件定量化学发光信号强度。
DC2E2识别两种形式的tau蛋白：体内磷酸化的tau 2N4R，151-319以及野生型(未磷酸化)形式的tau 2N4R和tau151-391(图3)。
此外，值得注意的是，DC2E2识别A68三联体，这是AD神经原纤维变性中病理性tau(PHF-tau)的特征。这些结果表明，DC2E2可以识别和结合不同类型的tau蛋白，从AD脑分离的病理性tau，生理性tau(2N4R)，截短的tau151-391及其磷酸化形式。因此，DC2E2独立于表位磷酸化来识别表位。公开的DC2E2结合特性表明使用该抗体作为AD诊断工具的可能性。
实施例5
DC2E2可变区的测序
确定DC2E2轻链和重链可变区的核苷酸和氨基酸序列(图5)。通过使用从表达DC2E2单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系DC2E2(ATCC)提取的总RNA合成的cDNA的DNA测序，确定DC2E2可变区的核苷酸序列(图5A和5C)。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Germany)提取总RNA。根据制造商的方案(Applied Biosystems,USA)，使用“高容量cDNA逆转录”试剂盒进行第一链cDNA的合成。用于2x逆转录预混液(master-mix)的试剂组成如下(每20μL反应量)：2μL的10x RT缓冲液；0.8μL的25x dNTP Mix(100mM)；2μl的10x RT随机引物(50μM)；1μL的MultiScribeTM逆转录酶(50U/μL)；4.2μL的无核酸酶H2O。对于逆转录，将10μL的2x逆转录预混液与RNA样品(1μg/10μL)混合，并在以下条件下合成cDNA：25℃10分钟，37℃120分钟，85℃5分钟，最后冷却至4℃。编码轻链和重链可变区的基因是使用
Figure BDA0002755663400001031
高保真度DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific,USA)通过聚合酶链反应(PCR)扩增的。在筛选小鼠免疫球蛋白信号序列正向引物的文库后，分别选择了轻链和重链的正向引物(M13-L6 5’-TGTAAAACGACGGCCAGTΑTGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG-3’和M13-H15‘-TGTAAAACGACGGCCAGTATGAAATGCAGCTGGGTCATSTTCTTC-3‘)。使用信号序列正向引物的优势在于扩增抗体轻链和重链两者的完整V基因，而在将可变区的起点用于引物设计时不会引入偏倚。轻链和重链的反向引物(M13-KC 5’-CAGGAAACAGCTATGACCACTGGATGGTGGGAAGATGG-3’和M13-CG15’-CAGGAAACAGCTATGACCCAGTGGATAGACAGATGGGGG-3’)分别源自kappa和IgG1链恒定区。
对PCR产物进行测序，且所得DC2E2的轻链和重链的可变区的DNA序列分别示于图5A和5C中。在DC2E2轻链和重链蛋白质序列中以下划线标出了互补决定区(CDR)(分别为图5B和5D)。根据ImMunoGeneTics(IMGT)编号系统(例如，参见Lefranc M.P.The IMGT uniquenumbering for immunoglobulins,T-cell receptors,and Ig-like domains.TheImmunologist,7,132-1 36,1999(1999))鉴定CDR和框架区(FR)。
实施例6
生产针对人阿尔茨海默氏病中不溶性Tau种类的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备，ELISA筛选单克隆抗体以及单克隆抗体DC2E7的初步表征
来自AD脑的十二烷基肌氨酸钠不溶性tau(PHF-tau)被用作免疫Balb/c小鼠的免疫原。如实施例4中所述，使用肌氨酰方法(Greenberg和Davies,A preparation ofAlzheimer paired helical filaments that diplays distinct tau proteins bypolyacrylamide gel electrophoresis,PNAS,87:5827-31,1990)，从人AD脑(额叶皮层，Braak阶段VI，荷兰脑库)中分离出十二烷基肌氨酸钠不溶性tau复合物。
用在完全弗氏佐剂(SIGMA)中的大约20-30μg的从人阿尔茨海默氏病脑组织中分离出的不溶性tau蛋白对六周龄的Balb/c小鼠进行皮下初次免疫，并在四周的间隔用在不完全弗氏佐剂中的20-30μg相同抗原加强免疫五次。融合前三天，给小鼠静脉内注射20-30μg的相同抗原的PBS溶液。根据Kontsekova等人,The effect of postfusion cell densityon establishment of hybridomas,Folia Biol.34,18-22(1988)的方法，将来自免疫小鼠的脾细胞与NS/0骨髓瘤细胞融合。将脾细胞与NS/0骨髓瘤细胞混合(比例为5:1)，并在1ml补充有10％二甲基亚砜的无血清Dulbecco's改良Eagle培养基(DMEM)中的50％聚乙二醇(PEG)1550(Serva)中融合1分钟。将融合的细胞重悬于含有20％马血清，L-谷氨酰胺(2mM)，次黄嘌呤(0.1mM)，氨基蝶呤(0.04mM)，胸苷(0.016mM)和庆大霉素(40U/ml)的DMEM中，在96孔板上以每孔2.5x105个脾细胞的密度。
将细胞在37℃下温育10-14天，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选生长的杂交瘤，用于产生抗PHF-tau特异性单克隆抗体。将微量滴定板在37℃PBS中用PHF-tau(5μg/ml，50μl/孔)包被过夜。将板用1％脱脂奶粉封闭以减少非特异性结合，用PBS-0.05％Tween 20洗涤，并与50μl/孔的杂交瘤培养上清液在37℃温育1小时。用与辣根过氧化物酶(HRP，DAKO)缀合的绵羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)检测结合的单克隆抗体。用TMB one(Kem-En-TecDiagnostics)作为过氧化物酶底物发生反应，并用50μl的2M H2SO4终止反应。使用Powerwave HT(Bio-Tek)测量450nm处的吸光度。吸光度值为阴性对照(PBS)值的至少两倍的读数被认为是阳性的。根据Kontsekova等人,One-step method for establishing 8-azaguanine-resistant hybridomas suitable for preparation of triomas,J.Immunol.Methods,145,247-250,(1991)中所述的规程，将阳性杂交瘤培养物进一步亚克隆到软琼脂中。
在阳性杂交瘤培养物中鉴定了单克隆抗体DC2E7(由美国典型培养物保藏中心保藏的小鼠杂交瘤细胞系生产，ATCC专利保藏号为PTA-124992)。如下所述进一步表征DC2E7。使用小鼠Ig分型试剂盒(ISO-2，SIGMA)通过ELISA(图4)确定了抗体同种型为鼠IgG2a。
实施例7
DC2E7可变区的测序
确定DC2E7轻链和重链可变区的核苷酸和氨基酸序列(图6)。通过使用从表达DC2E7单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系DC2E7(ATCC)提取的总RNA合成的cDNA的DNA测序，确定DC2E7可变区的核苷酸序列(图6A和6C)。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Germany)提取总RNA。根据制造商的方案(Applied Biosystems,USA)，使用“高容量cDNA逆转录”试剂盒进行第一链cDNA的合成。用于2x逆转录预混液(master-mix)的试剂组成如下(每20μL反应量)：2μL的10x RT缓冲液；0.8μL的25x dNTP Mix(100mM)；2μl的10x RT随机引物(50μM)；1μL的MultiScribeTM逆转录酶(50U/μL)；4.2μL的无核酸酶H2O。对于逆转录，将10μL的2x逆转录预混液与RNA样品(1μg/10μL)混合，并在以下条件下合成cDNA：25℃10分钟，37℃120分钟，85℃5分钟，最后冷却至4℃。编码轻链和重链可变区的基因的扩增是使用
Figure BDA0002755663400001051
高保真度DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific,USA)通过聚合酶链反应(PCR)进行的。在筛选小鼠免疫球蛋白信号序列正向引物的文库后，选择正向引物(M13-L12 5’-TGTAAAACGACGGCCAGTATGAAGTTTCCTTCTCAACTTCTGCTC-3’和M13-H5 5’-TGTAAAACGACGGCCAGTATGGACTCCAGGCTCAAMAGTTTTCCTT-3’)。使用信号序列正向引物的优势在于扩增抗体轻链和重链两者的完整V基因，而在将可变区的起点用于引物设计时不会引入偏倚。轻链和重链的反向引物(M13-KC 5’-CAGGAAACAGCTATGACCACTGGATGGTGGGAAGATGG-3’和M13-CG2a 5’-CAGGAAACAGCTATGACCCAGTGGATAGACCGATGGGGC-3’)分别源自kappa和IgG2a链恒定区。
对PCR产物进行测序，且所得DC2E7的轻链和重链可变区的DNA序列分别示于图6A和6C中。在DC2E7轻链和重链蛋白质序列中以下划线标出了互补决定区(CDR)(分别为图6B和6D)。根据ImMunoGeneTics(IMGT)编号系统(例如，参见Lefranc M.P.The IMGT uniquenumbering for immunoglobulins,T-cell receptors,and Ig-like domains.TheImmunologist 7,132-1 36,1999(1999))鉴定CDR和框架区(FR)。
实施例8
单克隆抗体DC2E7对Tau蛋白的磷酸化形式具有特异性
重组全长tau 2N4R、磷酸化的2N4R、PHF-tau和胎儿tau用于通过免疫印迹进一步表征单克隆抗体DC2E7的结合活性。如实施例1中所述制备重组人tau同等型2N4R。如实施例4中所述制备PHF-tau。
使用1％高氯酸基本上如Ivanovova et al.,High-yield purification offetal tau preserving its structure and phosphorylation,J.Immunol.Methods,339:17-22,2008中所述进行胚胎大鼠tau的提取和纯化。经从1-7日龄的大鼠幼崽中获得的脑组织在冰冷的1％高氯酸中(每5ml高氯酸1.5g组织，Applichem)均质化，并在冰上静置20min。同时使用Amicon Ultra Centrifugal Filter装置(Millipore)将匀浆液以15,000xg旋转20min，浓缩澄清的上清液，同时将缓冲液更换为洗涤缓冲液(20mM Tris，pH 7.4，150mMNaCl，0.1％Tween 20)。将过滤后的提取物以0.2ml/min的流速加载到装有携带固定化pan-tau mAb DC25的琼脂糖的Poly-Prep柱C10/10(GE Healthcare)上。用10-15ml洗涤缓冲液洗去未结合的蛋白质，直到洗脱级分的吸光度(在280nm)变得稳定。用0.1M甘氨酸，pH 2.6洗脱与mAb DC25结合的胎儿tau。立即用50μl 1M Tris-HCl(pH 9)中和洗脱的0.5ml级分，并通过SDS-PAGE测定。使用Amicon Ultra Centrifugal Filter装置(Millipore)浓缩含胎儿tau的级分，同时将缓冲液交换为PBS。根据Chen等人(2005年)的方法，通过加入四倍体积的含10％三氯乙酸的冰冷丙酮沉淀通过亲和色谱纯化的胎儿tau。将混合物在-20℃下温育2小时，并在2℃下以15,000xg离心20min。弃去上清液，将沉淀物重悬于1ml冰冷的丙酮中，使其在冰上静置20min，然后如上再次离心。将所得的沉淀物在室温下干燥，并溶解在与沉淀前体积相等的一定体积的PBS中。
如实施例4中所述，通过使用DC2E7的免疫印迹分析了全长tau同等型2N4R，十二烷基肌氨酸钠不溶性PHF-tau和胎儿tau。在免疫印迹中，DC2E7抗体识别了PHF-tau和胎儿tau(图7)。两种类型的被测试的tau都被磷酸化，但是磷酸化水平不同。在重组人tau 2N4R上未观察到免疫反应性。另一方面，该抗体结合了人tau同等型2N4R的体外磷酸化形式。结果表明DC2E7识别被磷酸化的表位，因此该抗体对磷酸化的tau种类具有特异性。抗体识别的表位存在于磷酸化的PHF-tau、胎儿tau和体外磷酸化的tau中。因此，DC2E7能够将源自阿尔茨海默氏病脑组织的磷酸化的tau(PHF-tau)与生理性tau(2N4R)区分开来。
实施例9
使用重组Tau缺失突变体，Tau点突变体和Tau衍生肽对DC2E7磷酸化表位的定位
DC2E7的免疫反应性显示抗体识别磷酸化tau(胎儿tau、PHF-tau、体外磷酸化tau，见上述)上的表位。因此，为了确定表位，使用了tau蛋白的磷酸化缺失突变体(图8)。如实施例4中所述，使用激酶提取物完成tau缺失突变体的磷酸化。
人类tau蛋白2N4R的磷酸化缺失突变体(tau 1-296、tau 188-441、tau221-441、tau151-391、tau 122-227)用于免疫印迹中DC2E7的表位的定位(参见实施例4)。免疫印迹分析表明，DC2E7识别以下所有缺失突变体：tau1-296、tau188-441、tau151-391、tau122-227，tau蛋白221-441除外(图9)。这些结果表明DC2E7磷酸化表位位于脯氨酸到达区域，在氨基酸残基188-227之间。
用tau缺失突变体对DC2E7表位的上述定位表明Pro188-Ala227之间的表位。在tau的这一区域中，在PHF-tau上检测到11个磷酸化位点(Ser191、Tyr197、Ser198、Ser199、Ser202、Thr205、Ser205、Ser210，Thr212、Ser214、Thr217)(Hanger等，2009，图10)。在胎儿tau上也发现了其中四个(Ser198、Ser199、Ser202、Thr217)(Morishima-Kawashima等，1995，图10)。因为DC2E7还识别胎儿tau，所以第一个重点是胎儿tau中存在并确认的磷酸化位点(Ser198；Ser199；Ser202；Thr217)。
为了定义DC2E7的确切磷酸化位点，产生了具有单点突变的tau 2N4R的突变形式，其中丝氨酸和苏氨酸残基被丙氨酸替代。使用QuickChange定点诱变试剂盒(AgilentTechnologies,USA,CA)根据制造商的说明，将所需的点突变(Ser198Ala；Ser199Ala；Ser202Ala；Thr217Ala)插入人2N4R tau蛋白中。在一个50μl反应中，使用5-50μg包含野生型2N4R tau蛋白编码序列的质粒和每种引物125ng。循环参数如下：95℃30秒，然后PCR继续循环，重复16次：变性95℃30s，退火55℃60s，延伸68℃6min。用对甲基化DNA特异的DpnI消化整个反应，以消除亲本质粒。用1μl反应液转化50μl超感受态大肠杆菌XL-1Blue(由诱变试剂盒提供)，并铺在补充有氨苄青霉素的LB-琼脂平板上。从生长的菌落中分离质粒，并使用DNA测序对诱变进行验证。如实施例1所述，将具有所需突变的质粒用于产生重组蛋白。
如实施例1中所述纯化制备的tau突变体，其被来自大鼠脑的激酶提取物磷酸化，并在免疫印迹中用DC2E7染色。tau缺失突变体的磷酸化诱导了分子量的变化，因此所有蛋白质都被磷酸化，如用pan tau抗体DC25(表位347-353aa，AXON Neuroscience，SE)染色所示(图11)。磷酸化的tau点突变体的分析表明，DC2E7检测到了所有单个突变(Ser198Ala、Ser199Ala、Ser202Ala)除了Thr217Ala(图11)。这些结果表明，在位置217处的磷酸化苏氨酸产生了由抗体DC2E7识别的表位的关键部分。
然而，位于磷酸化位点Thr217附近的其他磷酸化位点可以是表位的一部分，或者可以参与表位的产生。因此，检测了磷酸化位点Thr205、Ser208、Ser210、Thr212、Ser214、Ser231对DC2E7识别的表位的可能的影响。制备的具有单点突变(Thr205Ala、Ser208Ala、Ser210Ala、Thr212Ala、Ser214Ala、Ser231A)的突变体tau蛋白被激酶提取物磷酸化，并用DC2E7进行免疫印迹测试(图11)。免疫印迹分析表明，该抗体识别出所有带有点突变的tau蛋白(图11)。因此，位于Thr217附近的磷酸化位点不影响由DC2E7识别的表位。
这些定位实验表明在DC2E7的表位内存在磷酸化苏氨酸217。为了检测DC2E7表位区域中的残基对抗体结合的影响，在竞争性ELISA中分析了带有不同磷酸化位点的不同长度的合成肽。肽(tau210-224/pT212/pT217、210-222/pT212/pT217、210-221/pT212/pT217、210-220/pT212/pT217、210-219/pT212/pT217、210-218/pT212/pT217、tau 201-230/pT212、tau193-222/pS208、193-222/pS214、tau 193-231/pS208/pS210/pT212/pS214/pT217、tau 193-231/pS202/pS205/pT212/pT220、tau 201-229)由EZBiolabs(USA)合成，纯度高于95％。除未磷酸化的肽tau 201-229(用作阴性对照)外，每个合成的肽均包含位于残基Thr217周围的磷酸化位点。作为阳性对照，使用了体外磷酸化的tau151-391。
接下来，通过竞争ELISA分析所有肽与体外磷酸化的tau151-391竞争结合DC2E7的能力。将ELISA板(Nunc Medisorp,Thermo Scientific,Denmark)在37℃下用50μl/孔的PHF-tau(用PBS稀释200x)包被过夜。将包被的板用PBS/Tween 20(0.05％v/v)洗涤5次，并在25℃用PBS/Tween 20封闭1h。将每种肽分别以终浓度1mM溶于PBS。在具有锥形孔底(Greiner)的聚丙烯微量滴定板中，制备PBS/Tween 20中肽的连续稀释液(2.5x)，其在200μM；80μM；32μM；12.8μM；5.12μM；2.048μM；0.8192μM；0.32768μM的浓度范围内。将单克隆抗体DC2E7在PBS中稀释至0.6μg/ml的浓度，并将60μl的该稀释的抗体添加到每个孔中以连续稀释肽，从而得到120μl/孔的混合物。将抗体/肽混合物在设定为230rpm的旋转平台上于25℃温育1小时。将50μl/孔的抗体/肽混合物从聚丙烯板转移到PHF-tau包被和PBS/Tween 20封闭的ELISA板中(一式两份)，并在25℃温育1小时。将板用PBS/Tween 20洗涤5次，并与50μl/孔的PBS/Tween 20中以1：1000稀释的多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白/HRP(Dako)在25℃下温育1h。洗涤后，将板与50μl/孔的补充有1.5μl/2ml的30％H2O2(Sigma)的0.1M乙酸钠pH＝6.0(Roth)中的1mg/2mLo-PDA(邻苯二胺，Sigma)在黑暗中25℃下温育20min。通过添加50μl/孔的2M H2SO4(Merck)终止反应，然后在492nm处读取平板(Powerwave HT，Bio-Tek)。
所有涵盖磷酸化苏氨酸217的分析肽都与磷酸化tau151-391竞争与DC2E7的结合(图12)。总之，DC2E7结合了一个tau表位，该表位包括磷酸化的苏氨酸217。没有其他磷酸化位点表现出影响抗体的免疫反应性。但是，值得注意的是，受试肽的C末端部分从224到220个氨基酸的缩短(210-220/pT212/pT217、210-219/pT212/pT217、210-218/pT212/pT217)导致尽管存在磷酸化苏氨酸217，但其竞争活性丢失。数据表明DC2E7结合人磷酸化tau上12个氨基酸的磷酸化表位，该磷酸化表位包含残基210-SRTPSLPTPPTR-221，其中至少苏氨酸217被磷酸化。
实施例10
单克隆抗体DC2E2和DC2E7识别人类阿尔茨海默氏病脑和Tau蛋白病的病理
该实施例表明，DC2E7和DC2E2识别阿尔茨海默氏病中的神经纤维病变。以下脑区域用于免疫组织化学研究：来自阿尔茨海默氏病(Braak 6期)、FTD(匹克氏病)和对照脑(Braak 1和3期)的海马和内嗅皮层，来自皮质基底变性(CBD)的尾状核和来自进行性核上性麻痹(PSP)的尾状核。脑组织石蜡块获自阿姆斯特丹脑库。
将包埋在石蜡中的脑块在切片机(Leica RM2255)上切成8μm厚的切片。将这些切片放在HistoBond载玻片上(Marienfeld,Germany)。对于免疫组织化学切片用甲酸(98％在4℃1min或80％1h)和加热(高压灭菌器，121℃，20min)预处理，然后与一抗(AT8 1:1000、DC2E7 1:10 000、DC2E2 1:200)温育过夜。将所有切片与抗小鼠生物素化的二抗在室温下温育1h，并与亲合素-生物素过氧化物酶-复合物温育1h。免疫反应用VIP(VectastainEliteABC试剂盒，Vector Laboratories，CA，USA)可视化，并用甲基绿(Vector Laboratories)复染。
免疫组织化学分析表明，DC2E7和DC2E2二者都以与单克隆抗体AT8类似的方式识别阿尔茨海默氏病和其他tau蛋白病中的tau病理(图13)，AT8被认为是组织病理学染色的黄金标准。DC2E7和DC2E2染色AD患者海马中神经纤维病理、FTD患者的齿状回的匹克氏小体、患有CBD或PSP患者的尾状核中的神经胶质tau病理。DC2E7和DC2E2不识别正常脑中符合Braak 1期标准的tau病理，在前驱期(Braak 3期)两种抗体鉴定了海马神经原纤维病理，在充分发展(full blown)的AD中，抗体可视化了以神经原纤维缠结、神经毡细丝、神经斑的形式的大量tau病理(图14)。通过使用更高的放大倍数，证明了抗体结合了AD中的神经原纤维缠结，FTD中的匹克氏小体以及PSP和CBD中的神经胶质tau病理(图15)。
实施例11
DC2E7 ELISA
制备DC2E7 ELISA的标准品
通过亲和色谱纯化体外磷酸化的tau151-391。制备了两个亲和柱：DC2E7和DC190(表位368-376，AXON Neuroscience，SE)。根据实施例3中所述的方法纯化抗体。根据制造商的建议，将抗体与CnBr活化的琼脂糖4B(GE Healthcare，#17-0430-01)偶联。在4℃下针对PBS(3×100倍过量)透析体外磷酸化反应(参见实施例4)。所有纯化步骤均在4℃下进行。用3×5ml WBNP0.1缓冲液(50mM Tris pH 7.4、150mM NaCl和0.1％NP40)洗涤DC2E7柱。用冰冷的WBNP1缓冲液(50mM Tris pH 7.4、150mM NaCl和1％NP40)将体外磷酸化反应稀释4倍，然后通过0.2μm过滤器过滤。将样品施加至DC2E7柱。样品进入树脂柱后，如下洗涤：用2x5mL WBNP1缓冲液，用2x 5mL WBNP0.1缓冲液，用1x 5mL的50mM Tris.HCl pH 7.4，150mMNaCl。用3x 2ml洗脱缓冲液(100mM甘氨酸/HCl，pH 2.8)洗脱结合的蛋白质。立即用1MTris.HCl(pH 9)将洗脱的蛋白质调节至pH 7-8，并用WBNP0.1缓冲液1：1稀释。将样品施加至DC190亲和柱上，并如DC2E7亲和纯化中所述进行纯化。将洗脱的蛋白质针对PBS进行透析，并通过分光光度法评估浓度。纯化的蛋白质命名为“DC2E7校准物”。
使用Simoa-HD1分析仪(Quanterix)以高灵敏度形式(数字ELISA)设置DC2E7ELISA。用于数字ELISA的试剂是根据Quanterix Homebrew Assay Development Guide制备的，其详细信息如下。DC2E7抗体用作捕获抗体，DC2E2抗体用作检测(detector)抗体。DC2E7以0.5mg/mL的浓度与磁珠(Quanterix)偶联。通过对DC2E2进行生物素化来制备检测抗体，从而使用了比抗体浓度高120倍的生物素EZ-LinkTMNHS-PEG4-生物素(ThermoScientific，#21329)。将DC2E7校准物在校准物稀释液(20mM磷酸钠pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，2％BSA和0.01％酪蛋白)中稀释，从100pg/mL开始，依次为50、25、12.5、6.25、3.13、1.56和0pg/ml连续两倍稀释。将制备的校准物浓度与样品稀释液(80mM磷酸钠pH7.4，548mM NaCl，10.8mM KCl，0.04％酪蛋白和0.4％Tween 20)以3：1的比例混合。如先前所述，还用样品稀释液稀释来自对照个体的CSF样品。使用具有10、5、2和0pg/ml的DC2E7校准物的CSF峰值(spike)进行CSF样品的峰值恢复。将稀释的校准物和样品吸取至96孔板中，插入Simoa HD1分析仪中，并且将稀释于珠子稀释液中的捕获抗体DC2E7珠子、稀释于检测稀释液中至1.2μg/ml的检测DC2E2、稀释于SBG稀释液中至200pM的SBG和底物RGP插入分析仪中(所有缓冲液、SBG和RGP均从Quanterix获得)。在Simoa 1.5软件中对测定进行编程，然后进行分析。分析后，通过Graphpad Prism和/或Simoa 1.5软件中包含的软件进行评估。校准曲线的示例如图16所示。峰值恢复实验的示例如图17所示。
实施例12
DC2E7数字ELISA显著区分阿尔茨海默氏病患者和对照个体
DC2E7数字ELISA用于分析来自阿尔茨海默氏病患者(n＝20)和健康个体(n＝20)的CSF样品(图18)。分析表明，DC2E7数字ELISA以非常高的显著性将阿尔茨海默氏病患者与对照个体区分开来。ROC曲线的面积非常接近1。在浓度>4.43pg/mL时，该测定法给出95％的敏感性和89.5％的特异性，并且在浓度>6.19pg/mL时，敏感性为95％且特异性为100％。
实施例13
DC2E7数字Elisa显著区分阿尔茨海默氏病患者和患有其他tau蛋白病的患者
DC2E7数字ELISA用于分析阿尔茨海默氏病患者(n＝6)和额颞痴呆(n＝16)的CSF样品(图19)。分析表明，DC2E7数字ELISA以非常高的显著性将阿尔茨海默氏病患者与患有其他tau蛋白病的患者区分开来。ROC曲线的面积为0.97。在浓度>3.89pg/ml时，该测定法给出93.8％的敏感性和100％的特异性。
实施例14
DC2E7识别阿尔茨海默氏病和人类tau蛋白病中的不溶性Tau种类
先前的结果表明DC2E7识别发生磷酸化的tau的表位。因此，分析了DC2E7对其他tau蛋白病中存在的磷酸化tau蛋白的免疫反应性。
如实施例4中所述，从人AD脑(Braak V期，额叶皮层，阿姆斯特丹脑库)、皮质基底变性(伦敦脑库，额叶皮层)和FTD(阿姆斯特丹脑库)中分离不溶性tau复合物(异常tau形式)。如实施例4中所述，使用DC2E7在免疫印迹中分析提取的不溶性tau蛋白。
从患有AD和上述tau蛋白病的患者的脑的免疫印迹分析表明，使用DC2E7可检测不溶性tau级分。结果表明，tau蛋白病中的病理性tau聚集体由类似于AD中PHF-tau的高度磷酸化tau组成(图20)。此外，DC2E7在CBD和FTD中与AD相似，识别出三个主要的PHF-tau样带，分别为60、64和68kDa(A68三联体)。
实施例15
pT217 Tau数字ELISA测定法以高敏感性和特异性区分AD患者与FTD和健康受试者
使用抗体DC2E7进行的pT217 tau数字测定法用于分析来自AD患者(n＝30)、FTD患者(nfPPA，n＝14；svPPA，n＝10；bvFTD，n＝10，PSP，n＝19；CBD，n＝15)和健康个体(n＝30)的CSF。该测定法与INNOTEST Phospho-Tau(181P)测定法进行了比较。
分析表明，pT217 tau数字ELISA测定法区分AD患者与FTD和健康受试者。与Innotest Phospho-Tau(181P)测定法(>52pg/ml,78.0％敏感性，100％特异性，图21)相比，该测定法能更好地将AD与FTD/对照分开(>5.37pg/ml，94.1％敏感性，91.7％特异性，图21)。相比p-tau 181测定法(>52pg/ml，AUC0.93，95％CI，0.85-0.97，92％敏感性，87.5％特异性)，该测定法在区分AD患者和健康受试者方面也稍好一些(>3.855pg/ml，AUC 0.96，95％CI，0.89-0.99，95％敏感性，89.7％特异性)(图22)。比较在AD组pT217和pT181测定之间的高度相关性(P<0.0001，Spearman相关系数r＝0.8226)与在健康对照(P<0.5，Spearman相关系数r＝0.4032)和FTD(P＝0.387，Spearman相关系数r＝0.232)中观察到的低相关性表明CSF中的pT217 tau种类可以提供CSF中的AD特异性生物标志物。当与pT217 tau本身相比时，使用INNOTEST Aβ42/pT217 tau比率没有观察到益处。
在AD组中，在pT217 tau和pT181 tau测定之间观察到高度相关性(P<0.0001，Spearman相关系数r＝0.8226)，在非痴呆对照中观察到低相关性(P<0.5，Spearman相关系数r＝0.4032)。
在FTD患者中，在pT217 tau和pT181 tau测定之间没有观察到相关性(P＝0.7517，Spearman相关系数r＝0.08929)；从而在同一FTD患者中在pT181和HTAU测定之间观察到强相关性(P＝0.0019，Spearman相关系数r＝0.7321)。
所有这些结果表明，CSF中的pT217 tau种类可以在CSF中提供AD特异性生物标志物。
实施例16
pT217 Tau数字ELISA测定法使用不同的校准物以高敏感性和特异性将AD患者与FTD和健康受试者区分开
pT217 tau数字ELISA测定可以区分患有轻度认知障碍(MCI)的受试者和健康受试者。对于患有MCI和AD的受试者，脑脊液(CSF)中的pT217 tau浓度相似(图23A)。患有MCI的三名受试者后来发展为AD。
pT217 tau测定用于检测患有其他神经学病症(包括多发性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞痴呆(FTD))的受试者的CSF样品。其中可能存在tau病理(图23B)。FTD患者代表了非常异质性的群体，其中一些患者患有进行性核上性麻痹(PSP)或皮质基底变性(CBD)，而其他患者则发展为原发性进行性失语症(PPA)的典型症状。pT217tau数字ELISA测定区分AD和其他神经学病症(临界值9.3pg/ml，特异性94％，敏感性100％)。
pT217 tau数字ELISA测定法可以以相似的敏感性敏感性和特异性区分AD患者与FTD患者和健康受试者，而与选择的校准物无关。使用体外磷酸化tau蛋白或合成肽的AD患者、FTD患者和健康受试者的CSF样品中pT217tau的分布显示出相似的敏感性和特异性。使用磷酸化的tau蛋白校准品，该测定法显示出94.1％的敏感性和91.7％的特异性(>5.37pg/ml)。使用2E7肽(2E7pep)，该测定法显示出93.9％的敏感性和90.0％的特异性(>305pg/ml)(图29)。2E7pep具有以下氨基酸序列：GQKGQANATRIPAKGGGSGGGSGGGSSRTPSLPpTPPTREPK。第一个下划线的序列代表DC2E2抗体的表位，第二个下划线的序列代表DC2E7抗体的表位(前3个氨基酸和最后一个氨基酸均源自tau蛋白，而序列(GGGS)3是连接DC2E2和DC2E7的表位的接头)。
实施例17
通过重组技术优化抗体DC2E7
通过核糖体展示和噬菌体展示技术优化了DC2E7抗体的亲和力。首先，通过从DC2E7杂交瘤细胞系扩增和克隆产生编码抗体DC2E7的scFv形式的cDNA。然后通过易错PCR对scFv DC2E7的基因进行突变，并通过核糖体展示(Hanes et al.,1998)和噬菌体展示技术(Harrison at al.,1996)针对2E7pep亲和力选择突变的scFv DC2E7片段文库。
经过四轮选择，将分离的scFv片段克隆到表达载体中，使得scFv与myc-tag融合并在大肠杆菌JM109中表达(Sanmark et.al.,2015)。使用肽竞争免疫测定法测试了含有突变的DC2E7 scFv的30个菌落的细菌裂解液。免疫测定法是在96孔微量滴定板中进行的，该微量滴定板用100μl/孔的PBS中的0.01μg/ml 2E7pep在4℃包被过夜。将板洗涤4次并在室温下在PBS-T中封闭30min。在室温下，在摇动平台上用100μl PBS-T中的10x稀释细菌裂解液(含有10,000x稀释的抗myc抗体)进行结合1小时。用PBS-T将孔洗涤四次，并在摇动平台上于室温下与每裂解物浓度为10μg/ml的2E7pep进行竞争2小时。然后，将板用PBS-T洗涤4次，并与在PBS-T中以1：10000稀释的链霉亲合素-HRP缀合物在室温下温育1小时。将板洗涤4xPBS-T，并使用TMB底物显影5min，然后使用1M H2SO4停止比色反应。使用微量滴定板吸光度读取器读取450nm处的吸光度。
由核糖体展示和噬菌体展示产生的scFv的吸光度显示在图24中。scFv K+代表未突变的DC217。与原始DC217 scFv相比，所有显示在与scFv K+对应的线上方的信号的scFv均具有更高的亲和力(标有星号)。
通过核糖体展示和噬菌体展示分离的scFv的重链和轻链氨基酸序列的比对(克隆名称末尾的“PD”表示它是通过噬菌体展示获得的)显示在图25中。显示了VL(图25A)和VH(图25B)序列。相对于DC2E7具有改善的结合的抗体显示于图25C(轻链)和图25D(重链)中。第一行代表原始的DC2E7抗体。与DC2E7中序列相同的残基用点表示。VL和VH中的氨基酸残基编号以及CDR的标记根据IMGT编号系统进行。
实施例18
抗体DC2E7、DC149和DC807的比较
以与实施例2中所述类似的方式产生抗体DC149，其具有以下区别：用在位置Thr212和Thr217处双重磷酸化的肽(即经由第一个半胱氨酸与KLH缀合的CSRpTPSLPpTPPTREPK(2N4R tau的210-224))免疫小鼠。如实施例2所述通过ELISA进行筛选，由此通过与包含SRTPSLPpTPPTREPK的肽(即，与DC2E7结合的在Thr217位置处被单磷酸化的相同肽)特异性结合来鉴定DC149并通过与双磷酸化肽特异性结合来鉴定DC807。DC149和DC807抗体不结合未磷酸化的肽或未磷酸化的tau蛋白，而DC807也不结合单磷酸化的肽。
使用与实施例10中所述类似的设置，在经典ELISA测定法中分析DC2E7和DC149、DC807，由此使用2E7pep校准物。所有三种抗体以非常相似的亲和力与至少在Thr217上磷酸化的tau肽结合(图26)。
通过克隆和质谱确定抗体DC217、DC149和DC807的氨基酸序列。DC2E7和DC149中重链和轻链序列的比对显示在图27A-B中。DC2E7和DC807中重链和轻链序列的比对显示在图28A-B中。与DC2E7序列相同的残基用点表示。VL和VH的互补决定区(CDR)用方框表示。VL和VH中的氨基酸残基编号以及CDR的标记根据IMGT编号系统进行。
参考文献：
Hanes et al.,(1998).Ribosome display efficiently selects and evolveshigh-affinity antibodies in vitro from immune libraries.PNAS,Vol.95,pp.14130–14135.doi.org/10.1073/pnas.95.24.14130.
Harrison et al.,(1996).Screening of phage antibodylibraries.vol.26783-109,pp.83-109.doi.org/10.1016/S0076-6879(96)67007-4.
Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.M.,Gottesmann,K.S.&Foeller,C.(1991)inSequences of Proteins of Immunological Interest(U.S.Department of Health andHuman Services,Bethesda,MD)Vol.I,pp.151and 464,5th Ed.
实施例19
pT217测定的独立验证
使用HD-1分析仪将先前讨论的pT217检测和定量的方案应用于SIMOA。发现该方案适用于人CSF样品中pT217的测量。分析了该测定法的敏感性、线性、平行度和回收率。通过将2E7 pep校准肽掺入CSF样品和PBS中来测量标准曲线。DC2E7用作捕获抗体，而DC2E2用作检测抗体。观察到的检出限为184.4pg/mL。评估了重复性：批内(对于标准曲线的线性范围内的值，<15％)，批间(对于标准曲线的线性范围内的值，<15％)和板内分析(Intra-plateassay)(对于标准曲线的线性范围内的值，<15％)。平行度和回收率确定为<15％。

Claims (176)

1.能够结合tau的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1的在位置5和6的一个或多个处具有取代的氨基酸序列，
HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2的在位置1、4、5、6和8的一个或多个处具有取代的氨基酸序列，
HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，
LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或SEQ ID NO:4的在位置2处具有取代的氨基酸序列，
LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或SEQ ID NO:5的在位置3处具有取代的氨基酸序列，和
LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或SEQ ID NO:6的在位置4和6的一个或多个处具有取代的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中
HCDR1中在位置5处的所述取代是甘氨酸，HCDR1中在位置6处的所述取代是甘氨酸，
HCDR2中在位置1处的所述取代是缬氨酸，HCDR2中在位置4处的所述取代是丙氨酸，HCDR2中在位置5处的所述取代是甘氨酸，HCDR2中在位置6处的所述取代是丝氨酸，HCDR2中在位置8处的所述取代是缬氨酸，
LCDR1中在位置2处的所述取代是天冬酰胺，
LCDR2中在位置3处的所述取代是甘氨酸，和/或
LCDR3的在位置4处的所述取代是精氨酸，和/或LCDR3中在位置6处的所述取代是苏氨酸。
3.权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其中
HCDR1包含SEQ ID NO:1的在位置5处具有取代的氨基酸序列，
HCDR2包含SEQ ID NO:2的在位置8处具有取代的氨基酸序列，
HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，
LCDR1包含SEQ ID NO:4的在位置2处具有取代的氨基酸序列，
LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和/或
LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
4.权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其中
HCDR1中在位置5处的所述取代是甘氨酸，
HCDR2中在位置8处的所述取代是缬氨酸，和/或
LCDR1中在位置2处的所述取代是天冬酰胺。
5.权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
6.权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
7.权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中
HCDR1包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
8.权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中
所述重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
9.权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中
所述重链可变区包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:46的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:62的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:64的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:68的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:74的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:76的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:78的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:82的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:84的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:86的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:88的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:90的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:94的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:96的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:98的氨基酸序列。
10.权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中
所述重链可变区包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:78的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:84的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:86的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:94的氨基酸序列。
11.能够结合tau的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
12.权利要求11所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
13.能够结合tau的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
14.权利要求11所述的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
15.抗体或其抗原结合片段，其可以与根据权利要求1-14中任一项的抗体竞争结合tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)。
16.抗体或其抗原结合片段，其可以结合被权利要求1-15中任一项的抗体结合的tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)上的相同表位。
17.抗体或其抗原结合片段，其可以结合tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)上的表位，其中所述表位被磷酸化。
18.权利要求17所述的抗体或抗原结合片段，其中tau上的所述表位包含tau蛋白2N4R的残基188-227(SEQ ID NO:10)的一个或多个。
19.权利要求17或18所述的抗体或抗原结合片段，其中tau上的所述表位包含tau蛋白2N4R的残基210-221(SEQ ID NO:11)的一个或多个。
20.权利要求17-19中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述一个或多个磷酸化的残基包含在tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)的位置217处的磷酸苏氨酸。
21.权利要求20所述的抗体或抗原结合片段，其中所述表位还包含tau蛋白2N4R的位置210处的磷酸化的丝氨酸、位置212处的苏氨酸、位置214处的丝氨酸或位置220处的苏氨酸，或其任意组合。
22.权利要求17-20中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述表位包含SRTPSLPpTPPTR(SEQ ID NO.12的序列)或由其组成。
23.权利要求17-20中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述表位包含SRpTPSLPpTPPTR(SEQ ID NO:31的序列)或由其组成。
24.权利要求17-23中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是根据权利要求1-12中任一项的抗体或与权利要求1-12中任一项的抗体竞争结合的抗体。
25.抗体或其抗原结合片段，其可以结合tau上的表位，所述tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基151-188(SEQ ID NO:13)的一个或多个。
26.权利要求25所述的抗体或抗原结合片段，其中所述tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基163-172(SEQ ID NO:14)的一个或多个。
27.权利要求25或26所述的抗体或抗原结合片段，其中所述tau上的表位包含KGQANATRIP(SEQ ID NO.14的序列)，并且任选地，其中所述表位上的一个或多个残基被磷酸化，并且任选地，其中所述磷酸化包含tau蛋白2N4R的位置169处的磷酸化的苏氨酸。
28.权利要求25-27中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述tau上的表位由KGQANATRIP(SEQ ID NO.14的序列)组成。
29.权利要求25-28中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是根据权利要求13-14中任一项的抗体或与根据权利要求13-14中任一项的抗体竞争结合的抗体。
30.权利要求1-29中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。
31.权利要求30所述的抗体或抗原结合片段，其包含人IgG同种型重链恒定区。
32.权利要求31所述的抗体或抗原结合片段，其中所述人IgG同种型是人IgG1同种型或人IgG4同种型。
33.权利要求1-32中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其进一步包含人κ轻链恒定区。
34.权利要求1-30中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段选自啮齿动物抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、CDR移植抗体或其抗原结合片段和人源化抗体或其抗原结合片段。
35.权利要求1-29中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、scFv、(scFv)2、scFv-Fc，或Fv片段。
36.权利要求1-12351中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与第二药剂缀合。
37.权利要求36所述的抗体或抗原结合片段，其中所述第二药剂是至少一种可检测的标记。
38.权利要求37所述的抗体或抗原结合片段，其中所述至少一种可检测的标记包含酶、放射性同位素、荧光团、生物素、核磁共振标志物，或重金属。
39.权利要求38所述的抗体或抗原结合片段，其中所述至少一种可检测的标记包含放射性同位素或生物素。
40.权利要求36所述的抗体或抗原结合片段，其中所述第二药剂包含至少一种用于阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病的治疗剂。
41.分离的核酸，其编码权利要求1-35中任一项的抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白链的至少一个可变区。
42.分离的载体，其包含权利要求41所述的核酸。
43.分离的宿主细胞，其包含权利要求41所述的核酸和/或权利要求42所述的载体。
44.产生能够结合tau的抗体或其片段的方法，其包括在足以产生所述抗体或其片段的条件下培养权利要求43所述的宿主细胞。
45.药物组合物，其包含根据权利要求1-40中任一项的一种或多种抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的载体和/或稀释液。
46.权利要求45所述的药物组合物，其包含根据权利要求1-40中任一项的两种或更多种抗体或抗原结合片段。
47.权利要求45或46所述的药物组合物，其进一步包含至少一种用于治疗阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病的另外的治疗剂。
48.在受试者中治疗、延迟或预防阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病进展的方法，其包括向所述受试者施用有效量的至少一种根据权利要求1-40中任一项的抗体或根据权利要求45-47中任一项的药物组合物。
49.权利要求1-40中任一项的抗体或抗原结合片段或权利要求45-47中任一项的药物组合物在制备通过向有此需要的受试者施用所述抗体或抗原结合片段用于治疗、延迟或预防阿尔茨海默氏病的药物的应用。
50.检测受试者中tau蛋白病的方法，其包括：
从所述受试者获得生物样品；
使所述样品与有效量的权利要求1-40中任一项的抗体或抗原结合片段接触，和
检测所述样品中所述抗体或抗原结合片段与tau的结合，
从而在所述受试者中检测tau蛋白病。
51.权利要求50所述的方法，其中权利要求1-40中任一项的所述抗体或抗原结合片段进一步包含可检测的标记。
52.权利要求50或51所述的方法，其中相对于对照样品或阈值，与所述抗体或抗原结合片段复合的tau的存在和/或增加的量指示所述受试者中的tau蛋白病，任选地其中所述tau蛋白病为阿尔茨海默氏病。
53.检测受试者中的tau蛋白病的方法，其包括：
从所述受试者获得生物样品；
使所述样品与有效量的权利要求1-40中任一项的抗体或抗原结合片段(“第一抗体”)接触，和
使所述生物样品与能够与tau形成复合物的分子接触，任选地其中所述分子是能够结合tau的第二抗体或抗原结合片段(“第二抗体”)，
检测所述样品中所述第一和/或第二抗体与tau的结合，
从而在所述受试者中检测tau蛋白病。
54.权利要求53所述的方法，其中所述第一和/或第二抗体进一步包含可检测的标记。
55.权利要求53或54所述的方法，其中所述第一抗体与tau结合以形成tau-抗体复合物，并且所述第二抗体与所述tau-抗体复合物结合，或
其中所述第二抗体与tau结合以形成tau-抗体复合物，并且所述第一抗体与tau抗体复合物结合，
并且其中相对于对照样品或阈值，tau-抗体复合物的存在和/或增加的量指示所述受试者中的tau蛋白病。
56.权利要求53-55中任一项所述的方法，其中所述第一抗体与所述第二抗体结合tau上不同的表位。
57.权利要求56所述的方法，其中所述第一抗体结合tau上的表位，所述tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基188-227(SEQ ID NO:10)的一个或多个。
58.权利要求57所述的方法，其中所述第一抗体结合tau上的表位，所述tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基210-221(SEQ ID NO:11)的一个或多个。
59.权利要求57或58所述的方法，其中所述tau上的表位在tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:9)的位置217处包含至少一个磷酸化的残基且任选地还包含tau蛋白2N4R的位置210处的磷酸化的丝氨酸，位置212处的苏氨酸，位置214处的丝氨酸，或位置220处的苏氨酸，或其任意组合。
60.权利要求59所述的方法，其中所述tau上的表位包含SRTPSLPpTPPTR(SEQ ID NO:12)。
61.权利要求59所述的方法，其中所述tau上的表位包含SRpTPSLPpTPPTR(SEQ ID NO:31)。
62.权利要求53-61中任一项所述的方法，其中所述第一抗体包含权利要求1-10或13-14中任一项的抗体或抗原结合片段。
63.权利要求53-62中任一项所述的方法，其中所述第一抗体包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。
64.权利要求53-62中任一项所述的方法，其中所述第一抗体包括包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；或
其中所述第一抗体包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。
65.权利要求53-62中任一项所述的方法，其中所述第一抗体包括包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LCDR3。
66.权利要求53-62中任一项所述的方法，其中所述第一抗体包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区。
67.权利要求53-62中任一项所述的方法，其中所述第一抗体包括包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链可变区；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:78的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:84的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:86的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:94的氨基酸序列。
68.权利要求53-62中任一项所述的方法，其中所述第一抗体包括包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区。
69.权利要求53-68中任一项所述的方法，其中所述第二抗体结合tau上的表位，所述tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基151-188(SEQ ID NO:13)的一个或多个。
70.权利要求69所述的方法，其中所述第二抗体结合tau上的表位，所述tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基163-172(SEQ ID NO:14)的一个或多个。
71.权利要求53-70中任一项所述的方法，其中所述第二抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，且HCDR3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
72.权利要求71所述的方法，其中所述第二抗体包括包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区。
73.权利要求53-72中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二抗体连接至固体表面或颗粒。
74.权利要求73所述的方法，其中所述颗粒是珠子。
75.权利要求74所述的方法，其中所述珠子是磁珠。
76.权利要求74所述的方法，其中所述珠子是塑料的或合成的聚合物珠子。
77.权利要求74所述的方法，其中所述珠子包含聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚酰胺、聚氨酯、酚醛聚合物、硝化纤维素、天然衍生的聚合物、胶乳橡胶、多糖、多肽、复合材料、陶瓷、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属或金属化合物、金、银、钢、铝、铜、无机玻璃，或二氧化硅材料，或其组合。
78.权利要求74-77中任一项所述的方法，其中所述珠子具有球形、盘状、环形或立方体样形状。
79.权利要求54所述的方法，其中所述可检测的标记包含酶、放射性同位素、荧光团、生物素、核磁共振标志物、重金属，或其组合。
80.权利要求79所述的方法，其进一步包括检测来自所述可检测的标记的信号。
81.权利要求80所述的方法，其中所述可检测的标记是生物素，并且通过使所述样品与缀合至酶的链霉亲合素接触来检测，所述酶优选辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。
82.权利要求50-81中任一项所述的方法，其中所述方法包含经典的ELISA。
83.权利要求50-81中任一项所述的方法，其中所述方法包含数字ELISA或单分子阵列。
84.权利要求50-83中任一项所述的方法，其中在所述样品与抗体或抗原结合片段接触之前将其稀释。
85.权利要求50-84中任一项所述的方法，其中所述样品在与抗体或抗原结合片段接触之前进行免疫复合物解离。
86.权利要求85所述的方法，其中免疫复合物解离包括对所述样品施加热和/或酸。
87.权利要求50-86中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含脑脊髓液(CSF)或血液。
88.权利要求87所述的方法，其中所述样品包含血液的血浆和/或血清级分。
89.权利要求50-88中任一项所述的方法，其中所述方法检测所述样品中磷酸化的tau的量，并且任选地，所述样品中检测的所述磷酸化的tau比对照样品中高1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多倍，和/或任选地，其中所述样品中检测的所述磷酸化的tau大于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10pg/ml的阈值。
90.权利要求89所述的方法，其中所述样品中检测的所述磷酸化的tau大于约100-600pg/ml的阈值。
91.权利要求90所述的方法，其中所述阈值为约110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580或590pg/ml。
92.权利要求91所述的方法，其中所述阈值为约300pg/ml。
93.权利要求91所述的方法，其中所述阈值为约305pg/ml。
94.权利要求91所述的方法，其中所述阈值为约295pg/ml。
95.权利要求50-94所述的方法，其包括将所述样品中所述磷酸化的tau的量与来自健康个体的对照样品中的水平进行比较，并且其中所述样品中磷酸化的tau的水平比所述对照增加表明tau蛋白病。
96.权利要求50-95中任一项所述的方法，其中所述检测的tau蛋白病为AD。
97.权利要求96所述的方法，其包括将所述样品中磷酸化的tau的量与阈值或来自患有已知非AD的tau蛋白病的患者的对照样品中的水平进行比较，其中所述样品中的磷酸化的tau的水平增加表明所述受试者患有阿尔茨海默氏病，而不是另一种tau蛋白病或另一种原因的痴呆。
98.区分受试者中阿尔茨海默氏病与另一种tau蛋白病或另一种原因的痴呆的方法，包括：
从所述受试者获得脑脊髓液或血液样品；
进行权利要求50-97中任一项的方法以确定所述样品中所述磷酸化的tau的量；和
将磷酸化的tau的水平与对照样品中的水平或阈值进行比较，
其中相对于所述对照样品中的水平或阈值，所述样品中磷酸化的tau的升高的水平表明所述受试者患有阿尔茨海默氏病而不是另一种tau蛋白病或另外的原因的痴呆。
99.权利要求98所述的方法，其中所述其他tau蛋白病或另外的原因的痴呆包含额颞痴呆(FTD)或另一种神经学病症，例如帕金森氏病(PD)、多发性硬化症(MS)，和/或肌萎缩侧索硬化(ALS)。
100.权利要求98或99所述的方法，其中所述对照样品来自健康个体或患有AD以外的已知tau蛋白病的患者。
101.权利要求98-100中任一项所述的方法，其中在所述样品中检测的的磷酸化的tau比所述对照样品中高1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多倍。
102.权利要求98-101中任一项所述的方法，其中所述样品中检测的所述磷酸化的tau大于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、9.3或10pg/ml的阈值或大于约100-600pg/ml的阈值。
103.权利要求102所述的方法，其中所述阈值为约110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580或590pg/ml。
104.权利要求103所述的方法，其中所述阈值为约300pg/ml。
105.权利要求103所述的方法，其中所述阈值为约305pg/ml。
106.权利要求103所述的方法，其中所述阈值为约295pg/ml。
107.治疗方法，包括向患有阿尔茨海默氏病的受试者施用阿尔茨海默氏病的治疗剂，其中根据权利要求50-106中任一项所述的方法，所述受试者已经被鉴定为患有阿尔茨海默氏病。
108.试剂盒，其包含根据权利要求1-40中任一项的一种或多种抗体或抗原结合片段，以及使用所述一种或多种抗体或抗原结合片段来鉴定患有阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病的受试者的说明。
109.权利要求108所述的试剂盒，其包含根据权利要求1-40中任一项的两种或更多种抗体或抗原结合片段。
110.在人类受试者中检测阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病的方法，其包括向所述受试者施用缀合至放射性同位素的权利要求1-35中任一项的抗体或抗原结合片段，并检测来自患者的脑中放射性同位素的信号，其中所述信号的检测表明所述受试者患有阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病。
111.权利要求110所述的方法，其中通过正电子发射断层摄影术进行检测。
112.权利要求110或111所述的方法，其中所述信号在脑中的分布模式表明所述受试者是否患有阿尔茨海默氏病或另一种tau蛋白病。
113.权利要求110-112中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段结合tau上的表位，所述tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基188-227(SEQ ID NO:10)的一个或多个。
114.权利要求110-113中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段结合tau上的表位，所述tau上的表位包含tau蛋白2N4R的残基210-221(SEQ ID NO:11)的一个或多个。
115.权利要求113或114所述的方法，其中所述tau上的表位包含tau蛋白2N4R(SEQ IDNO:9)的位置217处至少一个磷酸化的残基，并且任选地还包含tau蛋白2N4R的位置210处的磷酸化的丝氨酸、位置212处的苏氨酸、位置214处的丝氨酸，或位置220处的苏氨酸，或其任意组合。
116.权利要求115所述的方法，其中所述tau上的表位包含SRTPSLPpTPPTR(SEQ ID NO:12)。
117.权利要求115所述的方法，其中所述tau上的表位包含SRpTPSLPpTPPTR(SEQ IDNO:31)。
118.权利要求110-117中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含权利要求1-10或13-14中任一项的抗体或抗原结合片段。
119.权利要求110-118中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2，包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。
120.权利要求110-118中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HCDR2，包含SEQID NO:3的氨基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；或
HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；并且其中LCDR1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
121.权利要求110-118中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR2，包含SEQID NO:25的氨基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LCDR3。
122.权利要求110-118中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区。
123.权利要求110-118中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的轻链可变区。
124.权利要求110-118中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区。
125.确定人类受试者中阿尔茨海默氏病的时期的方法，包括：
从所述受试者获得脑脊髓液或血液样品；
进行权利要求50-97中任一项所述的方法以确定所述样品中磷酸化的tau的量；和
将磷酸化的tau的水平与来自已知AD时期的患者的样品中的水平或阈值水平进行比较，
从而鉴定阿尔茨海默氏病的时期。
126.权利要求125所述的方法，其中所述阈值水平为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10pg/ml，或约100-600pg/ml。
127.确定抗tau疗法对阿尔茨海默氏病的有效性的方法，包括：
从人类受试者获得脑脊髓液或血液样品；
进行权利要求50-97中任一项所述的方法以确定所述样品中磷酸化的tau的量；和
其中相对于来自健康对照受试者的样品中的水平和/或相对于阈值水平而言，所述样品中磷酸化的tau的升高的水平表明所述受试者更可能对阿尔茨海默氏病的抗tau疗法有响应。
128.权利要求127所述的方法，其中所述阈值水平为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10pg/ml，或约100-600pg/ml。
129.权利要求127或128所述的方法，其进一步包括向鉴定为更可能对所述疗法有响应的受试者施用抗tau疗法。
130.权利要求129所述的方法，其中所述抗tau疗法包含抗tau抗体、小分子或肽疫苗疗法。
131.权利要求130所述的方法，其中所述抗tau疗法包括施用与tau结合并促进其从脑中清除的抗体。
132.权利要求130所述的方法，其中所述抗tau疗法包括施用权利要求1-40中任一项的抗tau抗体或抗原结合片段。
133.监测用于阿尔茨海默氏病的抗tau疗法的有效性的方法，包括：
a)在治疗之前从人类受试者获得脑脊髓液或血液样品；
b)进行权利要求50-97中任一项所述的方法以确定所述样品中磷酸化的tau的量；
c)向所述受试者施用抗tau疗法；
d)在施用所述抗tau疗法后重复步骤a)-b)，由此与治疗前所述样品中的水平相比，治疗后所述样品中磷酸化的tau的水平降低表明有效的疗法。
134.权利要求133所述的方法，其进一步包括向与治疗前获得的所述样品中的水平相比，治疗后获得的样品中具有更低水平的磷酸化的tau的受试者继续施用所述抗tau疗法。
135.权利要求133或134所述的方法，其中所述抗tau疗法包含抗tau抗体、小分子或肽疫苗疗法。
136.权利要求135所述的方法，其中所述抗tau疗法包括施用与tau结合并促进其从脑中清除的抗体。
137.权利要求135所述的方法，其中所述抗tau疗法包括施用权利要求1-40中任一项的抗体或抗原结合片段。
138.产生抗体DC2E7的杂交瘤，其中所述杂交瘤以美国典型培养物保藏中心专利保藏号PTA-124992保藏。
139.产生抗体DC2E2的杂交瘤，其中所述杂交瘤以美国典型培养物保藏中心专利保藏号PTA-124991保藏。
140.检测受试者中阿尔茨海默氏病(AD)或轻度认知障碍(MCI)的方法，其包括：
使来自所述受试者的生物样品与有效量的能够结合tau以形成tau-抗体复合物的根据权利要求1-40中任一项的至少一种抗体或抗原结合片段接触；
检测所述tau-抗体复合物的存在和/或量；和
将所述样品中与所述抗体结合的tau的存在/量与对照样品中的量或阈值进行比较，
其中相对于所述对照样品或阈值，与所述抗体复合的tau的存在和/或增加的量表明所述受试者中的AD或MCI。
141.权利要求140所述的方法，其中所述MCI表明患者中AD的前兆。
142.权利要求140或141所述的方法，其中所述tau-抗体复合物的量将MCI和/或AD与其他神经学疾病区分开。
143.权利要求142所述的方法，其中所述其他神经学疾病选自帕金森氏病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化和/或额颞痴呆。
144.权利要求140-143中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含脑脊髓液(CSF)。
145.权利要求140-143中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含血液。
146.权利要求145所述的方法，其中所述样品包含血液的血浆和/或血清级分。
147.权利要求140-146中任一项所述的方法，其中与所述抗体复合的tau的增加的量是高于约9.3pg/ml的tau的阈值的量。
148.权利要求140-146中任一项所述的方法，其中与所述抗体复合的tau的增加的量是高于约0.9、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20pg/ml的tau，或约100-600pg/ml的tau的阈值的量。
149.权利要求140-146中任一项所述的方法，其中所述阈值是约110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580或590pg/ml。
150.权利要求149所述的方法，其中所述阈值为约300或305pg/ml。
151.权利要求149所述的方法，其中所述阈值为约295pg/ml。
152.检测受试者中阿尔茨海默氏病(AD)或轻度认知障碍(MCI)的方法，其包括：
从所述受试者获得生物样品；
检测在所述生物样品中至少在位置苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或量；和
将在苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在/量与对照样品中的量或阈值进行比较，
其中相对于所述对照样品或阈值，在苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或增加的量表明所述受试者中的AD或MCI。
153.权利要求152所述的方法，其中所述MCI是患者中AD的前兆。
154.权利要求152或153所述的方法，其中增加的量将MCI和/或AD与其他神经学疾病区分开。
155.权利要求154所述的方法，其中所述其他神经学疾病选自帕金森氏病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化和/或额颞痴呆。
156.权利要求152-155中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含脑脊髓液(CSF)。
157.权利要求152-155中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含血液。
158.权利要求157所述的方法，其中所述样品包含血液的血浆和/或血清级分。
159.权利要求152-158中任一项的方法，其中所述tau的增加的量是高于约9.3pg/ml的tau的阈值的量。
160.权利要求152-158中任一项所述的方法，其中所述tau的增加的量是高于约0.9、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20pg/ml的tau的阈值的量。
161.权利要求152-158中任一项所述的方法，其中所述tau的增加的量是高于约100-600pg/ml的阈值的量。
162.权利要求161所述的方法，其中所述阈值为约110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580或590pg/ml。
163.权利要求152-162中任一项所述的方法，其中使用抗体或抗原结合片段来检测至少在位置苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或量，所述抗体或抗原结合片段包含权利要求1-10或13-14中任一项的抗体或抗原结合片段。
164.区分受试者中阿尔茨海默氏病和/或轻度认知障碍与帕金森氏病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化，和/或额颞痴呆的方法，其包括：
使来自所述受试者的生物样品与有效量的能够结合tau以形成tau-抗体复合物的根据权利要求1-40中任一项的至少一种抗体或抗原结合片段接触；
检测所述tau-抗体复合物的存在和/或量；和
将所述样品中与所述抗体结合的tau的存在/量与对照样品中的量或阈值进行比较，
其中相对于所述对照样品或阈值，与所述抗体复合的tau的存在和/或增加的量表明所述受试者中的阿尔茨海默氏病和/或轻度认知障碍。
165.权利要求164所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含权利要求1-10或13-14中任一项的抗体或抗原结合片段。
166.区分受试者中阿尔茨海默氏病和/或轻度认知障碍与帕金森氏病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化，和/或额颞痴呆的方法，其包括：
从所述受试者获得生物样品；
检测在所述生物样品中至少在位置苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或量；和
将在苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在/量与对照样品中的量或阈值进行比较，
其中相对于所述对照样品或阈值，在苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或增加的量表明所述受试者中的AD或MCI。
167.权利要求166所述的方法，其中使用抗体或抗原结合片段检测所述生物样品中至少在位置苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或量，所述抗体或抗原结合片段包含权利要求1-10或13-14中任一项的抗体或抗原结合片段。
168.预测患有轻度认知障碍的患者将发展为阿尔茨海默氏病的可能性的方法，其包括：
使来自所述受试者的生物样品与有效量的能够结合tau以形成tau-抗体复合物的根据权利要求1-40中任一项的至少一种抗体或抗原结合片段接触；
检测所述tau-抗体复合物的存在和/或量；和
将所述样品中与所述抗体结合的tau的存在/量与对照样品中的量或阈值进行比较，
其中相对于所述对照样品或阈值，与所述抗体复合的tau的存在和/或增加的量表明所述患者将发展为阿尔茨海默氏病的增加的可能性。
169.预测患有轻度认知障碍的患者将发展为阿尔茨海默氏病的可能性的方法，其包括：
从所述受试者获得生物样品；
检测在所述生物样品中至少在位置苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或量；和
将在苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在/量与对照样品中的量或阈值进行比较，
其中相对于所述对照样品或阈值，在苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或增加的量表明所述患者将发展为阿尔茨海默氏病的增加的可能性。
170.权利要求169所述的方法，其中使用抗体或抗原结合片段检测所述生物样品中至少在位置苏氨酸217处磷酸化的tau蛋白2N4R的存在和/或量，所述抗体或抗原结合片段包含权利要求1-10或13-14中任一项的抗体或抗原结合片段。
171.能够结合tau的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且所述轻链可变区包含三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列。
172.权利要求171的抗体或抗原结合片段，其中
所述重链可变区包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列并且所述轻链可变区包含SEQ IDNO:108的氨基酸序列。
173.治疗受试者中阿尔茨海默氏病(AD)的方法，其包括：
使用权利要求50-97、110-124和140-163中任一项的方法检测受试者中的AD，和
向鉴定患有AD的所述受试者施用AD的治疗。
174.权利要求173所述的方法，其中所述治疗包含以下一个或多个：
a)抗tau抗体或其抗原结合片段，例如，根据权利要求1-40中任一项的抗体或抗原结合片段；
b)结合β淀粉样蛋白的抗体或其抗原结合片段；
c)针对β淀粉样蛋白和/或tau的基因疗法；和/或
c)肽疫苗疗法，例如，使用包含其氨基酸序列由KDNIKHVPGGGS组成的合成肽的疫苗。
175.根据权利要求50-97、110-124和/或140-163中任一项所述的方法治疗已被鉴定为患有阿尔茨海默氏病的患者的方法，包括向所述患者施用阿尔茨海默氏病的治疗。
176.权利要求175所述的方法，其中所述治疗包含以下一个或多个：
a)抗tau抗体或其抗原结合片段，例如，根据权利要求1-40中任一项的抗体或抗原结合片段；
b)结合β淀粉样蛋白的抗体或其抗原结合片段；
c)针对β淀粉样蛋白和/或tau的基因疗法；和/或
c)肽疫苗疗法，例如，使用包含其氨基酸序列由KDNIKHVPGGGS组成的合成肽的疫苗。
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