JP2004532410A - 細胞および組織の自動分析のためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

例えば、形態学を同定するため、またはバイオマーカーを局在化しそして定量するために、細胞含有サンプルを迅速に分析するシステムおよび方法が、開示される。１つの実施形態において、本方法は、コンピューターによって実行され、そして、使用者により規定された細胞内の領域の画像に対してバイオマーカーの画像を重ね合わせて、バイオマーカーが使用者により規定された範囲内にあるか否かを決定する。別の局面において、本発明は、画像の不規則さ、歪み、変化するトポロジーおよび１つ以上のエレメントの非存在にもかかわらず、生物学的サンプルのアレイの光学的分析を容易にするアルゴリズムを特徴とする。

Description

【背景技術】
【０００１】
（Ｉ．発明の背景）
組織マイクロアレイ技術は、組織サンプルの高スループットの分析の機会を提供する（Ｋｏｎｅｎ，Ｊら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：８４４−７（１９８８）；Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ，Ｏ．Ｐ．ら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０：６５７−６２（２００１）；Ｒｉｍｍ，Ｄ．Ｌ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．７：２４−３１（２００１））。例えば、組織マイクロアレイを使用してラージスケールの研究を迅速に実施する能力は、薬物標的／予後マーカー（例えば、エストロゲンレセプター（ＥＲ）およびＨＥＲ２／ｎｅｕ）および候補治療薬を同定し、そして確認するための重要な情報を提供し得る。
【０００２】
しかし、マイクロアレイにおける組織サンプルの自動定量分析は、組織切片の不均一性、染色の細胞下局在化およびバックグラウンドシグナルの存在を含む、様々な困難を提示する。例えば、分析される腫瘍または組織切片の型に依存して、目的の領域は、サンプルのほぼ全体か、または小さい割合だけを表示し得る。例えば、膵臓癌、または実質的な癒着応答を有する胸部の小葉癌は、全領域の高い割合を表す間質組織を示し得る。このアッセイの目標が、所定のマーカーの上皮細胞発現を決定することである場合、その領域のみを評価するプロトコルを使用しなければならない。このプロトコルは、目的の領域を選択し得るだけでなく、この領域を正規化し得るので、任意の所定の領域から読み取られた発現レベルは、他の領域の発現レベルと比較され得る。細胞下局在化は、より同様の困難を提示する。核染色または膜染色の比較は、例えば、全細胞質染色における比較とはかなり異なる。
【０００３】
特定の方法（共焦点顕微鏡および重畳／逆重畳顕微鏡を含む）は、単一の強力な領域内における細胞（または細胞下）レベルでのタンパク質の発現を定量するために使用されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６３：８９−１０６（２００１）；Ｓｈａｗ，Ｐ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６：６８７−９４（１９９４））。しかし、これらは、計算上、集約的かつ困難な技術であり、これは、複数の連続画像上で操作する。結果として、組織切片のような組織マイクロアレイの分析のための現在の標準は、従来の病理学者に基づく分析およびスケールに従う類別である。
【０００４】
大半のバイオマーカーは、パラメトリック（通常「ベル型」）の分布を示し、結果的に、連続スケール（例えば、０〜１０００）で最良に分析される。不幸にも、手動での観察が、名目的（例えば、１＋、２＋、３＋）でありがちである。なぜならば、第１に、ヒトの目は、染色強度の僅かな差を容易に区別し得ないからである。様々な方法が、名目上の手動での観察を連続スケールに変換するために開発されている。これらの中で最も先に挙げられるのが、Ｈスコアであり、ここで、陽性染色細胞のパーセント（０〜１００）が、染色強度（０〜３）によって乗算され、理論上の連続スケール（０〜３００）を作製する。しかし、染色強度の僅かな差異を検出できないこと（特に、スケールの下限および上限にて）、ならびに、スコアを四捨五入する傾向（例えば、１５０のスコアについて、３＋で５０％、対 １４１のスコアについて３＋で４７％）は、Ｈスコアの有効性を制限する。
【０００５】
組織（組織マイクロアレイを含む）を迅速に分析する自動化システムおよび方法（これは、組織および他の細胞含有サンプル内でのバイオマーカーの同定および同定されたバイオマーカーの局在化を可能にする）が、必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（２．発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、細胞含有サンプルを迅速に分析するためのシステムおよび方法を特徴として、細胞内の特定のバイオマーカーを局在化および定量する。１つの実施形態において、本方法は、コンピューターによって実行され、そして、使用者により規定された細胞内の領域の画像に対してバイオマーカーの画像を重ね合わせて、バイオマーカーが使用者により規定された範囲内にあるか否かを決定する。
【０００７】
別の局面において、本発明は、画像の不規則さ、歪み、変化するトポロジーおよび１つ以上のエレメントの非存在にもかかわらず、生物学的サンプルのアレイの光学的分析を容易にするアルゴリズムを特徴とする。
【０００８】
本明細書中に記載のシステムおよびプロセスに従う患者サンプルの分析は、診断的に（特定の疾患を有するか、特定の毒素に曝露されたか、または、特定の治療薬もしくは器官移植によく応答する患者を同定するため）、および予後的に（例えば、特定の疾患を発症する可能性があるか、特定の治療薬によく応答する可能性があるか、または、特定の器官移植を許容する可能性がある患者を同定するため）有用であり得る。疾患の新規かつより良いマーカーがポストゲノム時代において同定されているので、本明細書中に記載されたプロセス（これは、マーカーを定量するだけでなく、細胞内でのそれらの局在を決定する）は、適用性を増大する。
【０００９】
本明細書中で記載されるような、細胞含有調製物の自動分析は、バイオマーカーの予後的利点の迅速な評価を提供し得る。さらに、これらの自動化技術は、手動技術を使用しては代表的に示されない関連性を同定し得る。また、自動分析は、（特に、上端および下端での）染色強度の僅かな差異をより良く識別し得る。低レベルの発現を検出する能力、およびそれを発現していないものから区別する能力は、重要な予後情報を提供し得る。さらに、特定のマーカーの細胞下分布の分析は、以前は認識されなかった患者の生存への関連性を解明し得る。
【００１０】
本発明の他の特性、目的および利点は、以下の図面、詳細な説明および特許請求の範囲から理解される。
【００１１】
（４．詳細な説明）
（４．１概要）
一般に、細胞含有サンプル（組織および組織マイクロアレイを含む）の迅速な自動分析のために使用され得る多くの技術が、本明細書中に記載される。これらの技術は、互いに基づいており、そして、密接したプロセスとして記載されるが、各技術は、広範な適用性を有しており、そして、個々にか、または、以下に記載の技術以外と組合せて使用され得る。
【００１２】
１つの実施形態において、画像内のスポットの位置を同定するための技術が特徴とされる。この技術（「スポットファインダー（ｓｐｏｔｆｉｎｄｅｒ）」と呼ばれる）は、画像の不規則さ、歪み、変化するトポロジーおよび１つ以上のエレメントの非存在にもかかわらず、このような位置を柔軟に同定し得る。このプロセスは、ヒストスポット（ｈｉｓｔｏｓｐｏｔ）の位置を局在化すること、および組織マイクロアレイ画像内の欠如したヒストスポットを同定することについて記載されているが、この技術は、より広範な適用を有する。より詳細には、この技術は、エレメントを局在化し、そして、エレメントの任意の集合において欠如するエレメントを同定するために使用され得る。さらに、このプロセスは、実質的に任意の次元のアレイおよび任意のエレメントの集合を含むアレイにおいて使用され得る。試料は、サイズまたは形状で制限されず、規則正しく間隔を空けられなければならないわけではない。
【００１３】
別の実施形態において、単独でか、またはスポットファインダーと組合せて使用して、必要に応じて細胞内のバイオマーカーの局在化および定量し得る技術を、特徴とする。細胞調製物の画像は、代表的に二次元を特色とするが、細胞調製物は、深さを特徴とする。例えば、１つの細胞特性は、別の特性上に存在し得る。この重複は、画像分析ソフトウェアを潜在的に混乱させ得る。本明細書中に記載の技術（吹き替えＲＥＳＡ（Ｒａｐｉｄ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ））は、焦点外の画像エレメントを減算することによって、三次元画像を見積もり得る。従って、画像上のバックグラウンド特性の影響は削減され、より良い画像分析を可能にする。
【００１４】
本明細書中に記載の別の技術（吹き替えＰＬＡＣＥ（Ｐｉｘｅｌ Ｂａｓｅｄ Ｌｏｃａｌｅ Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ））は、異なる細胞の特徴付けの間を区別する。例えば、この技術は、個々の細胞内の細胞下分布の位置を決定し得る。この技術を実行するコンピューターは、例えば、ピクセルごとの基準で区画特異的染色から得られる画像の相対強度を測定する。次いで、このコンピューターは、画像内の個々のピクセル、このピクセルが、細胞内の特定の場所または使用者が規定した領域に対応する可能性を決定する。このような分析は、コンピューターが、細胞下区画に対してシグナルを、確立した程度の正確度（例えば、９５％）で割り当てることを可能にする。この技術は、細胞の規定された場所の画像と、特定のバイオマーカーに関連するシグナルとを共存させ得る。
【００１５】
これらの技術の使用は、自動化マイクロアレイ分析のスピードと正確さとの両方を増強し得る。図１は、蛍光タグ化マーカーでの染色後に撮影され、そして以下のような単一色の画像と合わされた、結腸癌腫の別個の単色画像を示す：ＤＡＰＩ（核を可視化するため、青）、抗サイトケラチン（非腫瘍エレメントから腫瘍を識別するため、緑）および抗α−カテニン（細胞膜を可視化するため、赤）（パネルＡ）。これらの細胞下区画間の有意な程度の重複に留意のこと。バイオマーカーβ−カテニンの単色画像が撮影され（パネルＢ、挿入図）、そして画像中の各ピクセルの強度は、パネルＡ中の種々の区画の相対的シグナル強度に従って再分配する（青＝核、赤＝膜、緑＝細胞質）。
【００１６】
この腫瘍におけるβ−カテニンの発現は、主に膜結合であるが、パネルＡ中の区画における有意な重複は、核に対して有意な量のシグナルを誤って割り当てる（マゼンダおよび青のピクセル、パネルＢ）。重複したシグナルの除去を助けるために、核細胞下区画の単色画像は、焦点外の画像から指数関数的に減算される。パネルＣは、抗サイトケラチンマスク由来のマスク（緑のピクセル）上に示された、ＤＡＰＩおよび抗α−カテニン（それぞれ、青および赤）の指数関数的に減算された合成画像を示す。チャネル間であまりに重複したピクセルは、抗サイトケラチン画像から生成されるマスクによって規定されるように、非腫瘍領域なので、打ち消される（＜５％）。パネルＤにおいて、バイオマーカーの指数関数的に減算された画像（β−カテニン、挿入図）からのシグナル強度は、次いで、パネルＣにおいて規定された区画に従って再分配される。これは、重要な予後の有意性を有し得る、膜区画へのバイオマーカーのより正確な割り当てを生じる。膜結合β−カテニンは、接着複合体の細胞骨格付着を促進することによってカドヘリン媒介性の接着を安定化一方、核結合β−カテニンは、転写因子として作用する（これは、細胞の増殖および侵襲において重要ないくつかの遺伝子をアップレギュレートし、そしてこの能力において癌遺伝子とみなさる）ので、β−カテニン単独の発現は、予後情報を提供しない。しかし、核におけるその局在は、発癌の重要な指示であり得る。
【００１７】
（１．スポット−ファインダー（ｓｐｏｔ−ｆｉｎｄｅｒ））
１つの実施形態において、図３に示されるように、コンピュータは、画像から任意の異常なサイズのスポットＢ１を除去する。異常な大きさのスポットとしては、例えば、融合したスポットおよび／または破片の画像が挙げられ得る。コンピュータは、このプロセスを自動的に実行するが、他の実施形態において、コンピュータは、このプロセスを容易にするためにユーザの入力の使用を可能にし得る。
【００１８】
次いで、コンピュータは、代表的なスポットの大きさおよび形状の不透明な仮想的マスクを作製または利用する。仮想的マスクを使用して、コンピュータは、画像Ｂ２をスキャンして、第一のマスクが最高の平均ピクセル強度を有する領域をカバーするＢ３を決定する。コンピュータは、スキャンの間、画像の合計強度をモニタリングし、そしてマスクは不透明なので、合計画像強度が最小化される場合にマスクの位置を同定する。コンピュータは、この領域を第一のスポットとして同定し、そしてゼロ強度を有するように、この領域内のピクセルＢ４を設定する。コンピュータはまた、ゼロ強度を有するように、この領域を取り囲む予め規定された領域内のさらなるピクセルを設定する。このことは、重複するスポット間を識別するために役立つ。
【００１９】
第一のスポットを同定した後、コンピュータは、最高の平均ピクセル強度を有する次の領域を見出すために、マスクを使用して、再びＢ２画像をスキャンする。次の領域が見出されると、コンピュータは、これを第二のスポットとして同定し、そしてゼロ強度を有するように、この領域中またはこの領域の周囲のピクセルを設定する。コンピュータは、スポットとして認定されるのに十分な強度を有する画像領域が見出され得なくなるまで、このプロセスを繰り返す。
【００２０】
次いで、コンピュータは、参照点Ｂ５（例えば、中心）を各スポットにおいて同定し、そして各スポットの参照点を上下左右の各々の最も近い隣のスポットの参照点に結ぶ線を引く。コンピュータがこれらの方向のいずれにおいても最も近い隣のスポットを同定できない（すなわち、スポットがアレイの端にある）場合、コンピュータは、スポットの中心から、画像の最も近い端へと線を引く。
【００２１】
（２．ＲＥＳＡおよびＰＬＡＣＥ）
目的の画像領域の位置が一旦決定されると、光学顕微鏡は、目的の細胞特徴を同定するために適切な波長で、高解像度の画像を入手し得る。これらの特徴としては、バイオマーカー（「シグナル」とも称される）、組織切片内の目的の細胞（「細胞マスク」と称される）または細胞マスク内のユーザが規定した位置（「場所」と称される）が挙げられる。シグナル、細胞マスクおよび場所は、「チャネル」と称される。
【００２２】
図４を参照して、プロセス５０は、細胞マスクチャネルからマスクを作成することによって画像中の目的の領域を決定する（工程Ｃ１）。次に、このプロセスは、場所およびシグナルチャネルにこのマスクを適用する（工程Ｃ２）。次いで、このプロセスは、例えば、偽逆重畳のプロセスにおいて、マスクした画像から焦点外の情報を除去する（工程Ｃ３）。次に、「ピクセル割り当て」段階において、このプロセスは、画像中の細胞下特徴を同定し、画像中のピクセルを場所に割り当てる（工程Ｃ４）。一旦ピクセルが割り当てられると、コンピュータは、この場所をシグナル画像上にマッピングし（工程Ｃ５）、そして各場所中のバイオマーカーの量を定量する。この段階は、「シグナル割り当て」と称される。これらの工程は、以下でより詳細に記載される。
【００２３】
（マスキング）
このプロセスの間に、ソフトウェアは、目的の染色された細胞（すなわち、細胞マスクチャネル）の画像中の目的の領域を同定する。このソフトウェアは、この場所およびシグナルチャネルをマスクして、目的の領域の外側の領域の不要な分析を回避する。
【００２４】
目的の領域を同定するために、コンピュータは、細胞マスクチャネルについての閾値強度を決定する。一旦決定されると、コンピュータは、二元リディストリビューション中のピクセル強度を再分配する。言い換えると、コンピュータは、閾値未満の各ピクセルの強度をゼロに設定し、そして残りのピクセルを最大強度を有するように設定する（例えば、８ビットの画像の最大強度は、２５５である）。最大強度に設定されたピクセル位置のセットは、マスクと称される。画像スタック中の他の画像に対する引き続く手順は、マスクに対応するピクセル位置に対して実行される。
【００２５】
閾値強度は、画像中のバックグラウンドの強度に関連し、これは、コンピュータが、最初にその強度に従って各ピクセルを保存することによって決定する（例えば、８ビットの各ピクセルは、０〜２５５の強度を有する）。いくつかの実施形態において、このバックグラウンドは、最大のビン（すなわち、最も一般的なピクセル強度）に対応する。他の実施形態において、このバックグラウンドは、第２の最大ビンに対応する。組織の自己蛍光および最大のビンが、蛍光組織化学染色の代わりに、蛍光組織の領域に対応するいくつかの場合において、これが生じる。いずれの場合においても、コンピュータは、バックグラウンド強度が、最大強度の特定の割合より低いこと（例えば、最大強度の半分未満）を推定する。
【００２６】
ビンの大きさは、ヒストグラムを得るために、強度に対してプロットされる。ヒストグラム中の最大ピークは、最大ビンに対応する。最大ビンがバックグラウンドに対応する実施形態において、コンピュータは、この最大ピーク強度をバックグラウンド強度として割り当てる。他の実施形態において、バックグラウンドが第２の最大ビンに対応する場合、このヒストグラムは、最大ピークよりも低い強度で第二のピークを有する。従って、第二のピークが最大ピークの大きさの少なくとも特定の割合（例えば、少なくとも５％）である場合、コンピュータは、この第二のピーク強度を、画像のバックグラウンド強度として割り当てる。
【００２７】
一旦確立されると、コンピュータは、バックグラウンド強度にさらなる因数を加算して、閾値強度を決定する。８ビットの画像について、この因数は、ユーザが規定した入力（通常０．５）によって乗算されたＤ（１／５）／１０と等しい。ここで、Ｄ（１／５）は、保存されたピクセルの五分位数分布であり、以下のように決定される：
Ｄ（１／５）＝〈Ｉ〉_上位２０−〈Ｉ〉_下位２０、
ここで、〈Ｉ〉_上位２０は、上位２０番内の百分位数の平均ピクセル強度であり、そして〈Ｉ〉_下位２０は、下位２０番内の百分位数の平均ピクセル強度である。
【００２８】
閾値強度以上の強度を有するピクセルは、マスクに割り当てられる。
【００２９】
次いで、このマスクは、ユーザにより規定されたパラメータおよび画像処理技術に従ってさらに調節される。例えば、このマスクは、このマスク領域がユーザにより規定された値に一致するか、またはマスク内の特定の（ユーザにより規定された）大きさの満たされた穴を有するように、拡張または破壊され得る。マスクを作製するためのユーザにより規定されたパラメータは、少数のサンプルヒストスポット（ｈｉｓｔｏｓｐｏｔ）画像を分析した後で、全アレイを実行する前に調整され得る。
【００３０】
マスクの作製後、コンピュータは、このマスクを画像スタック中の画像に適用し、これらの画像の各々における目的の領域を、マスクピクセル位置に対応するピクセル位置として同定する。
【００３１】
（バックグラウンド減少）
示されるように、プロセス５０は、画像からの焦点外の情報の影響Ｃ３を減少させる。例えば、このプロセス５０は、偽逆重畳技術を使用し得る。残りの画像のピクセルは、強度が減少されるが、画像情報は、組織の上部を介したより薄い仮想的スライスを示す。さらに、偽逆重畳は、画像のより高い染色強度とより低い染色強度との間の界面領域を、これらの領域間の対比を増大させることによって増強する。
【００３２】
コンピュータは、場所（細胞区画）およびシグナル（すなわち、細胞成分）チャネルに対する逆重畳を実行する。コンピュータは、最初に、これらのチャネルの画像をマスキングし、分析されるべきピクセルの数を減少させる。コンピュータは、各チャネルの２つの画像を分析する。第一の画像は、焦点が合った画像（すなわち、ヒストスポットの上部の画像）である。第二の画像は、僅かに焦点の外れた画像であり、これは、組織の下部の僅かに下に焦点面を配置することによって生成される（例えば、５ミクロンの厚さのヒストスポットについて、この画像の焦点面は、このヒストスポットの上部の約８ミクロン下に位置される）。
【００３３】
各ピクセル位置について、コンピュータは、対応する焦点の合った画像のピクセル強度（Ｉ_焦点内）から、焦点外の画像のピクセル強度の割合（Ｉ_焦点外）を減算する。コンピュータは、四分位数分布Ｄ（１／４）を使用して、焦点の合った画像の調整されたピクセル強度（Ｉ_{新ピクセル}）を以下のように決定する：
【００３４】
【数１】

ここで、Ｉ_最大は、最大のピクセル強度（例えば、８ビットの画像について２５５）であり、そしてψは、以下から計算される：
ψ＝α×Ｄ（１／４）^−β、
これは、画像のライブラリーの経験的評価から作成された。光学逆重畳を、可視的に判断し、そして各々についてのψを焦点内の画像についての四分位数分布に対してプロットした。経験的データの回帰分析により、フィッティングパラメータについての値を得た（すなわち、αは約８０であり、そしてβは約１．１９である）。この四分位数分布は、以下から決定される：
Ｄ（１／４）＝〈Ｉ〉_上位２５−〈Ｉ〉_下位２５、
ここで、〈Ｉ〉_上位２５は、上位２５番内の百分位数の平均ピクセル強度であり、そして〈Ｉ〉_下位２５は、下位２５番内の百分位数の平均ピクセル強度である。概念的には、低いＤ（１／４）（すなわち、ノイズに対する低いシグナル比）を有する画像中の低い強度のピクセルは、高いＤ（１／４）を有する画像からの低い強度のピクセルよりも、あまり激しく減算されない。
【００３５】
ψの値は、マスクされた領域内の偽逆重畳の後に残るシグナル強度の割合を決定し、そしてその値をこのチャネルについて予め規定された値と比較することによって、精緻化され得る。この割合が、例えば、予め規定した値よりも高い場合、偽逆重畳は停止される。そうでない場合には、コンピュータは、シグナル強度の予め規定された割合に達するまで、ψの値を繰り返し増大させる。この予め規定された値は、チャネルによって覆われるマスクの予測された割合である。
【００３６】
偽逆重畳後、得られた画像の各ピクセルは、ピクセル割り当てと称される、プロセスにおいて場所に割り当てられる。
【００３７】
（ピクセルベースの発現の場所割り当て区画化（Ｐｉｘｅｌ Ｂａｓｅｄ Ｌｏｃａｌｅ Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＰＬＡＣＥ））
ピクセル割り当て段階の間、コンピュータは、場所チャネル画像（すなわち、染色された場所の画像）の各々におけるピクセル位置の相対強度に基づく同定を割り当てる。例えば、この段階の間、コンピュータは、画像中の各ピクセル位置について、そのピクセル位置が核、膜または細胞質に属するか否かを決定する。コンピュータは、ユーザが規定した程度の確実度（例えば、９５％）以内に割り当て得ないピクセルへの割り当てを行わない。より高いレベルの確実度は、この分析からより多くのピクセルを排除する。
【００３８】
一般に、２つの場所画像中の各ピクセル位置について、コンピュータは、ピクセル強度を読み取り、そして各強度値を所定の閾値強度値と比較する。１つの場所のみの強度値が閾値よりも高い場合、コンピュータは、このピクセル位置をその場所に割り当てる。両方の強度値が、そのそれぞれの閾値よりも高い場合、コンピュータは、各場所からの強度値を比較し、そしてより高い強度値を有する場所の同一性を、そのピクセル位置に割り当てる。両方のピクセル強度がその閾値よりも低い場合、コンピュータは、そのピクセルを第三の場所に割り当てる。
【００３９】
画像中のピクセル位置について上述のことを繰り返した後、コンピュータは、各場所の面積を計算し、そしてその結果を所定の（予想された）対象部分と比較する。計算された対象部分（例えば、核の場所のピクセルの数／マスクされたピクセルの数）が、所定の対象部分よりも大きい場合、コンピュータは、この場所から、最も低い強度を有するピクセルを除去する。コンピュータは、対象部分が、ほぼ所定の対象部分に減少するまで、最も低い強度のピクセルを除去し続ける。
【００４０】
以下は、このプロセスが如何に作用するかの例である。膜の場所および核の場所の画像は、実行される割り当て分析について、９５％の信頼区間で選択される。ピクセル位置は、排除によって細胞質の場所に割り当てられる。
【００４１】
コンピュータは、膜および核の場所の画像中の各ピクセル位置においてピクセル強度を読み取り、そしてそれらを閾値と比較する。いずれの強度値も閾値よりも低い場合、ピクセル位置は、細胞質の場所に割り当てられる。核強度のみまたは膜強度のみが閾値よりも高い場合、コンピュータは、このピクセル位置を、閾値を上回る場所に割り当てる。両方の強度が閾値よりも高い場合、コンピュータは、一方に対すて強度値の比率を比較し、そして以下のような割り当てを行う：
核強度／膜強度＞１→ピクセル位置＝核の場所
核強度／膜強度＜１→ピクセル位置＝膜の場所
核強度／膜強度＝１→ピクセル位置＝割り当てない。
【００４２】
従って、核強度が膜強度よりも高い場合、コンピュータは、このピクセル位置を核の場所に割り当てる。膜強度が核強度よりも高い場合、コンピュータは、このピクセル位置を膜の場所に割り当てる。膜強度が核強度と等しい場合、このピクセル位置は割り当てられない。これを、ピクセル位置について繰り返す。
【００４３】
一旦全てのピクセル位置が分析されると、コンピュータは、膜の場所に誤って割り当てられた（すなわち、核から膜にこぼれた）核強度の量を決定し、その逆も決定する。膜チャネルに誤って割り当てられた核強度の量が、総核強度の５％より高い場合、コンピュータは、核強度に因数ｗで重み付けし、そして重み付けされた核強度の膜強度に対する比を再計算する。この比は互いに比較され、そしてピクセル位置は、以下のように再割り当てされる：
ｗ×核強度／膜強度＞１→ピクセル位置＝核の場所
ｗ×核強度／膜強度＜１→ピクセル位置＝膜の場所
ｗ×核強度／膜強度＝１→ピクセル位置＝割り当てない。
【００４４】
コンピュータは、再び、誤って割り当てられた各場所の量を決定する。これがなお５％より高い場合、コンピュータは、ｗの値を増大させ、そして上記の工程を繰り返す。これは、誤って割り当てられた核の場所の量が５％未満になるまで続く。コンピュータは、類似の技術を使用して、膜から核へのこぼれを最小化する。
【００４５】
コンピュータはまた、細胞質（排除）の場所の面積を計算し、そしてそれを所定の値と比較する。割り当てプロセスを繰り返すことによって、コンピュータは、生物学に基づいて決定されるように、５％未満の細胞質から核または細胞質から膜が存在することを確実にする。
【００４６】
次いで、コンピュータは、「シグナル割り当て」プロセスの間に、各場所中のシグナルの量を評価する。
【００４７】
ピクセル割り当て後、コンピュータは、各場所中のシグナルを合計する。コンピュータは、シグナル画像（すなわち、細胞成分を選択的に標識する染色の画像）のピクセル強度を読み取り、そして同じ細胞下の区画に割り当てられたピクセル位置についてのシグナル強度を一緒に加算する。コンピュータは、その場所に割り当てられた各ピクセル位置のシグナル強度の直接的加算によってその場所のピクセル強度の合計を計算する。コンピュータはまた、シグナル強度および各ピクセル位置についての場所強度の比率を一緒に加算することによって、ピクセル強度比の合計を計算する。
【００４８】
ピクセル強度の合計およびピクセル強度比の合計は、次いで、１以上のパラメータを計算する際に使用される。例えば、コンピュータは、各区画内に入るシグナルの相対的な割合（例えば、総シグナルの３０％は膜であり、２０％は細胞質であり、そして５０％は核である）を決定する。別の例において、コンピュータは、特定の区画の大きさと比較した、存在するシグナルの量（例えば、膜チャネルに割り当てられたピクセルの数によって分割された、膜チャネルに割り当てられたピクセルのシグナル強度）を表示する。ユーザは、コンピュータに目的の他のパラメータを評価させるように選択し得る。例えば、どの程度の画像領域がマスクによって覆われているか、どの程度のマスクが各場所によって覆われているか、など。
【００４９】
偽逆重畳アルゴリズム（これは、無関係のピクセル強度の大部分を制限する）を、強度面積測定値（これは、特定の細胞下の場所の面積をさらに規定する）と一緒に実行することによって、コンピュータは、細胞下の位置でのピクセル位置の非常に正確な割り当てを行うことができる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、コンピュータは、カメラのダイナミックレンジをよりよく利用するために、さらなる工程を実行する。これは、その相対強度に基づいて、検出器のダイナミックレンジを超えて画像中のピクセル強度を再分配することによって達成される。
【００５１】
再分配の１形態は、正規化再分配であり、これによって、より低い閾値（すなわち、マスキングの間に決定されたバックグラウンドのピクセル強度）は、画像中の全てのピクセルから減算され、そして得られた負の値を有する任意のピクセルは、ゼロに設定される。正規化再分配は、シグナルチャネルのために使用される。なぜなら、この再分配は、１つのサンプルから次のサンプルへと尺度を保存し、サンプル間の直接的比較が行われるのを可能にするからである。これは、シグナル画像をマスキングした後のいずれかに実行される。
【００５２】
二重対数再分配は、画像の上限閾値の５０％（すなわち、画像中のピクセルの５０％のみがより高い強度を有する値）より上の画像中の全てのピクセルを、最大強度値に設定する（例えば、８ビットの画像について２５５）。下限閾値未満の強度値を有する全てのピクセルは、０に設定され、そして上限閾値と下限閾値との間の強度値を有する全てのピクセルは、以下の式に従って再割り当てされる：
【００５３】
【数２】

ここで、Ｉ_新は、新しいピクセル強度をいい、Ｉ_旧は、古いピクセル強度をいい、ＬＴおよびＵＴは、それぞれ、最大閾値より低いか最大閾値の５０％であり、そしてＩ_最大は、最大の強度値である。二重対数再分配は、場所チャネルのマスキングの後か、または偽逆重畳の後のいずれかで、これらのチャネルのために使用される。概念的には、これは、５０百分位数を超える強度を有する場所画像中のピクセルが、割り当て段階の間にその場所に割り当てられることを確実にする。５０番目の百分位数より低いがそれに近い強度を有するピクセルは、より厳しく重み付けされ、そして５０番目の百分位数より十分低い強度を有するピクセルよりも、その場所に割り当てられる可能性が高い。
【００５４】
他のユーザにより規定される再分配（例えば、線形再分配または他の方程式による再分配）が、上記の例に加えて使用され得る。
【００５５】
上記のアルゴリズムは、組織マイクロアレイの分析に関連するが、これらは、このようなアレイを研究することだけに限定されない。スポットファインダーアルゴリズムは、収集を含む任意のエレメントを同定するために使用され得、そしてＲＥＳＡアルゴリズムおよびＰＬＡＣＥアルゴリズムは、任意の画像化可能な細胞含有サンプル（組織生検を含む）および細胞含有液体サンプル（血液、尿、髄液、唾液、リンパ、胸膜液、腹膜液および心膜液を含む）内のバイオマーカーを局在化および定量するために使用され得る。
【００５６】
また、任意の光学画像化デバイスまたは非光学画像化デバイス（例えば、垂直光学顕微鏡または倒立光学顕微鏡、走査型共焦点顕微鏡、カメラ、操作型電子顕微鏡またはトンネル電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡および画像化赤外線検出器など）が使用され得る。
【００５７】
上記の実施形態において、コンピュータは、システムの他の構成エレメントを制御し、そして画像を分析してヒストスポットまたは組織マイクロアレイについての所望の情報を引き出すために、ハードウェア、ソフトウェアまたはこれら両方の組み合わせを備え得る。上記の分析は、標準的なプログラミング技術を使用するコンピュータプログラムにおいて実行される。このようなプログラムは、プロセッサ、データ保存システム（メモリおよび／または保存エレメントを備える）、少なくとも１つの入力デバイス、少なくとも１つの出力デバイス（例えば、ディスプレイまたはプリンタ）をそれぞれ備える、プログラム可能なコンピュータで実行するために設計される。プログラムコードは、入力データ（例えば、一緒に綴じられた画像または画像スタック）に適用されて、本明細書に記載される関数を実行し、そして情報（例えば、シグナルの局在化）（これは、１以上の出力デバイスに適用される）を生成する。各コンピュータプログラムは、高レベルの手続型プログラム言語またはオブジェクト指向プログラム言語、あるいはアセンブリ言語または機械言語で実施され得る。このようなコンピュータプログラムの各々は、コンピュータによって読み出された場合に、コンピュータ中のプロセッサに本明細書中に記載される分析を実行させ得る、コンピュータ読み出し可能保存媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭまたは磁気ディスク）に保存され得る。
【００５８】
以下は、本明細書に記載される方法に従って組織マイクロアレイの調製および分析の特定の実施形態の詳細な記載を提供するが、類似の工程が、任意の細胞含有サンプルに関して実行され得る。図５を参照して、組織マイクロアレイ１００は、代表的には薄い（例えば、約５ミクロン）のパラフィンブロック１３０中に通常の間隔で包埋され、一連の行および列を形成するヒストコア（ｈｉｓｔｏｃｏｒｅ）から調製された、ヒストスポット１２０の複数のサンプルを含む。ヒストスポット（ヒストコアの薄い切片）１２０は、実質的にディスク状の形状であり、そして代表的には、パラフィンブロック１３０と同じ厚さ（すなわち、約５ミクロン）であり、約０．６ミリメートルの直径を有する。代表的には、ヒストスポットの中心は、１ミリメートルの約１０分のいくつか離れて間隔を空けられる。パラフィンブロック１３０およびヒストスポット１２０は、顕微鏡スライド１１０上に取り付けられ得る。組織マイクロアレイ１００は、任意の数のヒストスポット、代表的には数百から数千程度のヒストスポットを備え得る。
【００５９】
図６を参照して、光学顕微鏡ステーションが、組織の適切な画像を獲得するために使用され得る。顕微鏡ステーション２００は、組織の画像化のための倒立光学顕微鏡２０１、および画像を分析するためのコンピュータ２９０を備える。光学顕微鏡２０１は、光源２２０を収容するマウント２１０、サンプルステージ２４０、対物レンズ２５０およびＣＣＤカメラ２７０を備える。コンピュータ２９０中のフレームグラッバーは、ＣＣＤカメラ２７０を介して画像を獲得する。
【００６０】
光学顕微鏡２０１はまた、フィルタホイール２３０および２６０を備え、これらは、一連のダイクロイックフィルタを収容する。ホイール２３０中のフィルタは、標準的な顕微鏡または蛍光顕微鏡についての適切な照明スペクトルの選択を可能にする。ホイール２６０中のフィルタは、蛍光顕微鏡におけるスペクトルシグネチャーの単離のために、伝えられた光をフィルタにかける。サンプルステージ２４０は、組織マイクロアレイ１００を支持するか、または適切に位置付ける。サンプルステージ２４０は、ｘ方向、ｙ方向およびｚ方向（軸が示される）に直線的に移動され得る。サンプルステージ２４０は、自動化された移動を可能にするために、モーターを備える。コンピュータ２９０は、モーターのサーボ制御によって、サンプルステージ２４０の移動を制御する。
【００６１】
組織マイクロアレイ１００は、以下のように画像化され得る：ユーザは、このマイクロアレイをサンプルステージ２４０上に配置する。ユーザは、第一（すなわち、左上）のヒストスポットがカメラの視野の中心になり、そしてＣＣＤカメラ２７０の焦点に合うように、サンプルステージ２４０を調節する。対物レンズ２５０は、適切な解像度に調整されるべきであり、例えば、０．６ミリメートルのヒストスポットは、１０倍の倍率で観察され得る。一般に、種々の手段（染色された組織の可視光散乱、組織自己蛍光または蛍光タグに由来するシグナルを含む）を介して評価されるように、ヒストスポットは、周りのパラフィンよりも高い光強度の領域に対応する。コンピュータ２９０は、コンピュータソフトウェア（Ｓｏｆｔｗｏｒｘ２．５、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、Ｉｓｓａｑｕａｈ、ＷＡ）および画像化プラットホーム（例えば、Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎ）を使用して、低解像度の画像（例えば、１６ビンの解像度を有する６４ピクセル×６４ピクセル）を獲得し得る。コンピュータ２９０は、サンプルステージ２４０を、視野とほぼ等しい量に自動的に変換する。次いで、コンピュータは、第二の低解像度の画像を獲得する。このプロセスは、コンピュータが組織マイクロアレイ全体の画像を獲得するまで繰り返される。次いで、市販のソフトウェアを使用して、コンピュータは、パッチワークのように一連の画像をつなぎ合わせることによって、組織マイクロアレイ全体の複合画像を生成する。
【００６２】
本発明に従って検出され得る生物学的マーカーとしては、任意の核酸、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物または細胞の他の成分が挙げられるが、これらに限定されない。特定のマーカーは、特定の細胞に特徴的であるが、他のマーカーは、特定の疾患または状態に関連することが同定されている。公知の予後マーカーの例としては、酵素的マーカー（例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼＩＩ、ニューロン特異的エノラーゼ、プロトンＡＴＰａｓｅ−２および酸性ホスファターゼ）が挙げられる。ホルモンマーカーまたはホルモンレセプターマーカーとしては、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、副腎皮質刺激ホルモン、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、アンドロゲンレセプター、ｇＣ１ｑ−Ｒ／ｐ３３補体レセプター、ＩＬ−２レセプター、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター、ＰＴＨレセプター、甲状腺ホルモンレセプターおよびインスリンレセプターが挙げられる。
【００６３】
リンパ球のマーカーとしては、以下が挙げられる：α−１−アンチキモトリプシン、α−１−アンチトリプシン、Ｂ細胞マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｂリンパ球抗原３６ｋＤ、ＢＭ１（骨髄マーカー）、ＢＭ２（骨髄マーカー）、ガレクチン−３、グランザイムＢ、ＨＬＡクラスＩ抗原、ＨＬＡクラスＩＩ（ＤＰ）抗原、ＨＬＡクラスＩＩ（ＤＱ）抗原、ＨＬＡクラスＩＩ（ＤＲ）抗原、ヒト好中球デフェンシン、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、κ軽鎖、κ軽鎖、λ軽鎖、リンパ球／組織球抗原、マクロファージマーカー、ムラミダーゼ（リゾチーム）、ｐ８０未分化（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ）リンパ腫キナーゼ、プラズマ細胞マーカー、分泌性白血球プロテアーゼインヒビター、Ｔ細胞抗原レセプター（ＪＯＶＩ１）、Ｔ細胞抗原マーカー（ＪＯＶＩ３）、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、非クラスター化Ｂ細胞マーカー。
【００６４】
腫瘍マーカーとしては、以下が挙げられる：αフェトプロテイン、アポリポプロテインＤ、ＢＡＧ−１（ＲＡＰ４６タンパク質）、ＣＡ１９−９（シアリルルイスＡ（ｓｉａｌｙｌ ｌｅｗｉｓａ）、ＣＡ５０（癌腫関連ムチン抗原）、ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）、ＣＡ２４２（腫瘍関連ムチン抗原）、クロモグラニンＡ、クラスタリン（アポリポプロテインＪ）、上皮膜抗原、上皮関連抗原、上皮特異的抗原、大柄な（ｇｒｏｓｓ）嚢胞性疾患液性タンパク質−１５、肝細胞特異的抗原、ヘレグリン、ヒト消化管ムチン、ヒト乳脂肪小球、ＭＡＧＥ−１、マトリクスメタロプロテイナーゼ、メランＡ、黒色腫マーカー（ＨＭＢ４５）、メソセリン、メタロチオネイン、ミクロフタルミア症転写因子（ＭＩＴＦ）、Ｍｕｃ−１コア糖タンパク質、Ｍｕｃ−１糖タンパク質、Ｍｕｃ−２糖タンパク質、Ｍｕｃ−５ＡＣ糖タンパク質、Ｍｕｃ−６糖タンパク質、ミエロペルオキシダーゼ、Ｍｙｆ−３（横紋筋肉腫マーカー）、Ｍｙｆ−４（横紋筋肉腫マーカー）、ＭｙｏＤ１（横紋筋肉腫マーカー）、ミオグロビン、ｎｍ２３タンパク質、胎盤アルカリホスファターゼ、プレアルブミン、前立腺特異的抗原、前立腺酸ホスファターゼ、前立腺インヒビンペプチド、ＰＴＥＮ、腎臓細胞癌腫マーカー、小腸ムチンの抗原、テトラネクチン、甲状腺転写因子−１、マトリクスメタロプロテアーゼ１の組織インヒビター、マトリクスメタロプロテイナーゼ２の組織的インヒビター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１、ビリン、フォンビルブラント因子。
【００６５】
細胞周期関連マーカーとしては、以下が挙げられる：アポトーシスプロテアーゼ活性化因子−１、ｂｃｌ−ｗ、ｂｃｌ−ｘ、ブロモデオキシウリジン、ＣＡＫ（ｃｄｋ活性化キナーゼ）、細胞内アポトーシス感受性タンパク質（ＣＡＳ）、カスパーゼ２、カスパーゼ８、ＣＰＰ３２（カスパーゼ３）、ＣＰＰ３２（カスパーゼ３）、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリンＡ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、サイクリンＤ３、サイクリンＥ、サイクリンＧ、ＤＮＡ断片化因子（Ｎ末端）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質、Ｆａｓリガンド、Ｆｅｎ−１、ＩＰＯ−３８、Ｍｃｌ−１、ミニクロモソーム維持タンパク質、ミスマッチ修復タンパク質（ＭＳＨ２）、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ、増殖細胞核抗原、ｐ１６タンパク質、ｐ２７タンパク質、ｐ３４ｃｄｃ２、ｐ５７タンパク質（Ｋｉｐ２）、ｐ１０５タンパク質、Ｓｔａｔ １α、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩα、トポイソメラーゼＩＩＩα、トポイソメラーゼＩＩβ。
【００６６】
神経組織マーカーおよび腫瘍マーカーとしては、以下が挙げられる：αＢクリスタリン、α−インターネキシン、αシヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）、アミロイド前駆体タンパク質、βアミロイド、カルビンジン、コリンアセチルトランスフェラーゼ、興奮性アミノ酸トランスポーター１、ＧＡＰ４３、グリア線維酸性タンパク質、グルタミン酸レセプター２、ミエリン塩基性タンパク質、神経成長因子レセプター（ｇｐ７５）、神経芽細胞腫マーカー、ニューロフィラメント６８ｋＤ、ニューロフィラメント１６０ｋＤ、ニューロフィラメント２００ｋＤ、ニューロン特異的エノラーゼ、ニコチン性アセチルコリンレセプターα４、ニコチン性アセチルコリンレセプターβ２、ペリフェリン、タンパク質遺伝子産物９、Ｓ−１００タンパク質、セロトニン、ＳＮＡＰ−２５、シナプシンＩ、シナプトフィジン、タウ、トリプトファン水酸化酵素、チロシン水酸化酵素、ユビキチン。
【００６７】
クラスター分化マーカーとしては、以下が挙げられる：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｒ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤｗ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤｗ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤｗ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１２８ａ、ＣＤｗ１２８ｂ、ＣＤ１３０、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１４９、ＣＤｗ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、およびＴＣＲ−ζ。
【００６８】
他の細胞マーカーとしては、以下が挙げられる：セントロメアタンパク質−Ｆ（ＣＥＮＰ−Ｆ）、ジャイアンチン（ｇｉａｎｔｉｎ）、インボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）、ラミンＡおよびラミンＣ［ＸＢ１０］、ＬＡＰ−７０、ムチン、核膜孔複合体タンパク質、ｐ１８０ラメラ体タンパク質、ｒａｎ、ｒ、カテプシンＤ、Ｐｓ２タンパク質、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ、Ｐ５３、Ｓ１００、上皮マーカー抗原（ＥＭＡ）、ＴｄＴ、ＭＢ２、ＭＢ３、ＰＣＮＡ、ならびにＫｉ６７。
【００６９】
細胞含有サンプルを、特定の生物マーカーまたは種々の型の細胞もしくは亜細胞画分と直接反応する、色素もしくは染色液、または組織化学物質を使用して染色し得る。全ての染色が適合するわけではない。従って、使用される染色型およびそれらの適用順序は、十分に考慮されるべきであるが、これは当業者によって容易に決定され得る。このような組織化学物質は、透過顕微鏡によって検出可能な発色団か、または蛍光顕微鏡によって検出可能な発蛍光団であり得る。一般に、細胞含有サンプルは、少なくとも１つの組織化学物質を含む溶液でインキュベートされ得、このサンプルは標的の化学物質の基と直接反応するか、または結合する。いくつかの組織化学物質は、染色を可能にするために、媒染剤または金属と共インキュベートされなければならない。細胞含有サンプルは、目的の成分を染色する少なくとも１つの組織化学物質、および対比染色として作用し、かつ目的の成分の外部領域に結合する別の組織化学物質の混合物でインキュベートされ得る。あるいは、複数のプローブの混合物が染色において使用され得、そして特定のプローブの位置を識別する方法を提供し得る。
【００７０】
以下の非限定的なリストが、組織学的染色または対比染色に使用され得る例示的な発色団、およびそれらの標的細胞、亜細胞画分、または細胞成分を提供する：エオシン（塩基性細胞成分、細胞質）、ヘマトキシリン（核酸）、オレンジＧ（赤血球、膵臓および下垂体細胞）、ライトグリーンＳＦ（コラーゲン）、ロマノフスキー−ギムザ（細胞全体の形態）、メイ−グリュンヴァルト色素（血液細胞）、ブルーカウンターステイン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、エチルグリーン（ＣＡＳ）（アミロイド）、フォイルゲン−ナフトールイエローＳ（ＤＮＡ）、ギムザ（種々の細胞画分を異なって染色する）、メチルグリーン（アミロイド）、ピロニン（ｐｉｙｒｏｎｉｎｅ）（核酸）、ナフトールイエロー（赤血球）、ニューラルレッド（核）、パパニコラウ染色（代表的には、ヘマトキシリン、エオシンＹ、オレンジＧおよびビスマルクブラウン混合物（全体的な細胞形態）、レッドカウンターステインＢ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、レッドカウンターステインＣ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、シリウスレッド（アミロイド）、フォイルゲン試薬（パラローザニリン）（ＤＮＡ）、ガロシアニンクロムミョウバン（ＤＮＡ）、ガロシアニンクロムミョウバンおよびナフトールイエローＳ（ＤＮＡ）、メチルグリーンピロニンＹ（ＤＮＡ）、チオニン−フォイルゲン試薬（ＤＮＡ）、アクリジンオレンジ（ＤＮＡ）、メチレンブルー（ＲＮＡおよびＤＮＡ）、トルイジンブルー（ＲＮＡおよびＤＮＡ）、アルシアンブルー（炭水化物）、ルテニウムレッド（炭水化物）、スーダンブラック（脂質）、スーダンＩＶ（脂質）、オイルレッド−Ｏ（脂質）、ヴァン・ギーソン三色色素（酸性フクシンおよびピクリン酸の混合物）（筋肉細胞）、マッソン三色色素（ヘマトキシリン、酸性フクシンおよびライトグリーンの混合物）（コラーゲン、細胞質、仁（ｎｕｃｌｅｉｏｌｉ）を別々に染色する）、アルデヒドフクシン（エラスチン繊維）ならびにヴァイゲルト染色（細網線維および膠原線維を区別する）。このような染色の包括的なリスト、これら染色の説明、および一般的な使用は、Ｒ．Ｄ．Ｌｉｌｌｉｅ「Ｃｏｎｎ’ｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｉｎｓ」、第８編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９６９）において提供される。前述の適切な媒染剤および組成物は、当業者に周知である。
【００７１】
以下の非限定的なリストは、例示的な蛍光組織化学染色、およびそれらの標的細胞、亜細胞画分、または適用可能な細胞成分を提供する：４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（核酸）、エオシン（塩基性細胞成分、細胞質）、ヘキスト３３２５８およびヘキスト３３３４２（２つのビスベンズイミド）（核酸）、ヨウ化プロピジウム（核酸）、スペクトラムオレンジ（核酸）、スペクトラムグリーン（核酸）、キアナクリン（ｑｕｉａｎａｃｒｉｎｅ）（核酸）、フルオレセインファロイジン（アクチン繊維）、クロモマイシンＡ３（核酸）、アクリフラビンフォイルゲン反応（核酸）、オーラミンＯ−フォイルゲン反応（核酸）、臭化エチジウム（核酸）、ニッスル染色（ニューロン）、高親和性ＤＮＡ発蛍光団（例えば、ＰＯＰＯ、ＢＯＢＯ、ＹＯＹＯ、およびＴＯＴＯ、ならびにその他）およびＤＮＡ結合性タンパク質（例えば、ヒストン）と融合された緑色蛍光タンパク質、ＡＣＭＡ、キアナクリン、ならびにアクリジンオレンジ。
【００７２】
広範な種々の、独自の蛍光性のオルガネラ特異的プロープは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）より利用可能であり、これらとしては、ミトコンドリア特異的プローブ（ＭｉｔｏＦｌｕｏｒ色素およびＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ色素）、小胞体（ＥＲ）およびゴルジ体のプローブ（ＥＲ−Ｔｒａｃｋｅｒおよび種々のセラミド結合体）、ならびにリソソームプローブ（Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ色素）が挙げられる。これらのプローブ、ならびに多くの一般の蛍光性組織化学物質は、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」第８版（２００１）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから利用可能）から利用可能であり、そしてそこに広範に記載されている。
【００７３】
各々の細胞含有サンプルは、目的の細胞成分である酵素に対して適切な基質、および酵素活性の部位で有色沈殿物を生成する適切な試薬と共に、共インキュベートされる。このような酵素組織化学染色は、特定の標的酵素に特異的である。酵素組織化学染色での染色を使用して、亜細胞成分または特定の型の細胞を規定し得る。あるいは、酵素組織化学染色を診断上で使用して、細胞内の酵素活性量を定量し得る。種々の広範な酵素基質および検出アッセイは、当該分野で公知であり、そして記載されており、そしていくつかの選択される方法が以下に例示される。
【００７４】
酸性ホスファターゼはいくつかの方法により検出され得る。酸性ホスファターゼについてのＧｏｍｏｒｉの方法において、細胞調製物をグリセロリン酸と共にインキュベートし、そしてニトロ化を導く。酵素がホスフェートを遊離させて、これがリードと結合してリードホスフェートの無色沈殿物を生じる。次いで、この組織を硫酸アンモニウムの溶液に浸し、これは、リード硫化物の黒色沈殿物を形成するリードホスフェートと反応する。あるいは、細胞をパラロサニリン塩酸、亜硝酸ナトリウム、ナフトール（ｎａｐｔｈｏｌ）ＡＳＢ１ホスフェート（基質）およびベロナール酢酸緩衝液を含む溶液でインキュベートし得る。この方法は、酸性ホスファターゼ活性の領域に赤色沈殿物を形成する。酸性ホスファターゼの特徴的な含有量に起因して、リソソームは、このアッセイの使用により他の細胞質顆粒およびオルガネラと区別され得る。
【００７５】
デヒドロゲナーゼは、細胞を、デヒドロゲナーゼの種に対する適切な基質、およびテトラゾールと共にインキュベートすることによって位置付けられ得る。この酵素は、基質から水素イオンをテトラゾールに移動させて、テトラゾールをホルマザンの暗色沈殿物に還元する。例えば、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、呼吸鎖の複合体Ｉの成分であり、そしてミトコンドリアに大部分が配置される。
【００７６】
周知の染色技術が開発された他の酵素、およびそれら酵素の本来の細胞内位置または活性としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＴＰａｓｅ（筋肉線維）、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ミトコンドリア）、チトクロムｃオキシダーゼ（ミトコンドリア）、ホスホリラーゼ（ミトコンドリア）、ホスホフルクトキナーゼ（ミトコンドリア）、アセチルコリンエステラーゼ（神経細胞）、ラクターゼ（小腸）、ロイシンアミノペプチダーゼ（肝細胞）、ミオデニレート（ｍｙｏｄｅｎｙｌａｔｅ）デアミナーゼ（筋細胞）、ＮＡＤＨジアフォラーゼ（赤血球）、およびスクラーゼ（小腸）。
【００７７】
免疫組織化学は、最も感度良くかつ特異的な組織化学的技術の１つである。各々の組織スポットは、特異的な結合プローブを含む、標識された結合組成物と結合され得る。種々の標識（例えば、フルオロフォア）、または光もしくは蛍光を吸収する生成物を生成する酵素が使用され得る。単独の結合事象に関係して強力なシグナルを提供する、広範な種々の標識が公知である。染色に使用される複数のプローブは、１つ以上の識別可能な蛍光標識で標識され得る。これらの色の差異は、特定のプローブの位置を識別する方法を提供する。フルオロフォアとタンパク質（例えば、抗体）の結合体を調製する方法は、文献に広範に記載されており、そして本明細書で例示を必要としない。
【００７８】
少なくとも１２０，０００個の市販の抗体が存在するが、以下は、細胞成分に特異的に結合することが公知であり、そして研究のために、そして限定される場合において種々の疾患の診断のために使用される免疫組織化学的染色における成分として現在使用される、いくつかの例示的な１次抗体を列挙する。抗エストロゲンレセプター抗体（乳癌）、抗プロゲステロンレセプター抗体（乳癌）、抗ｐ５３抗体（複数の癌）、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体（複数の癌）、抗ＥＧＦＲ抗体（上皮増殖因子、複数の癌）、抗カテプシンＤ抗体（乳癌および他の癌）、抗Ｂｃｌ−２抗体（アポトーシス細胞）、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体（卵巣癌および他の癌）、抗ＣＡ１５−３抗体（乳癌）、抗ＣＡ１９−９抗体（結腸癌）、抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体、抗Ｐ−糖タンパク質抗体（ＭＤＲ、多種薬剤耐性）、抗ＣＥＡ抗体（癌胎児性抗原）、抗レチノブラストーマタンパク質（Ｒｂ）抗体、抗ｒａｓ腫瘍性タンパク質（ｏｎｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ｐ２１）抗体、抗ルイスＸ（またはＣＤ１５とも呼ばれる）抗体、抗Ｋｉ−６７抗体（細胞増殖）、抗ＰＣＮＡ抗体（複数の癌）、抗ＣＤ３抗体（Ｔ細胞）、抗ＣＤ４抗体（ヘルパーＴ細胞）、抗ＣＤ５抗体（Ｔ細胞）、抗ＣＤ７抗体（胸腺、未成熟Ｔ細胞、ＮＫキラー細胞）、抗ＣＤ８抗体（サプレッサーＴ細胞）、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体（ＡＬＬ）、抗ＣＤ１０（またはＣＡＬＬＡとも呼ばれる）抗体（一般に急性リンパ芽球性白血病）、抗ＣＤ１１ｃ抗体、単球、顆粒球、ＡＭＬ）、抗ＣＤ１３抗体（骨髄性単球細胞、ＡＭＬ）、抗ＣＤ１４抗体（成熟単球、顆粒球）、抗ＣＤ１５抗体（ホジキン病）、抗ＣＤ１９抗体（Ｂ細胞）、抗ＣＤ２０抗体（Ｂ細胞）、抗ＣＤ２２抗体（Ｂ細胞）、抗ＣＤ２３抗体（活性化Ｂ細胞、ＣＬＬ）、抗ＣＤ３０抗体（活性化Ｔ細胞および活性化Ｂ細胞、ホジキン病）、抗ＣＤ３１抗体（脈管新生マーカー）、抗ＣＤ３３抗体（骨髄性細胞、ＡＭＬ）、抗ＣＤ３４細胞（上皮性幹細胞、間質腫瘍）、抗ＣＤ３５抗体（樹状細胞）、抗ＣＤ３８抗体（プラズマ細胞、活性化Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、および骨髄性細胞）、抗ＣＤ４１抗体（血小板、巨核球）、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体（白血球共通抗原）、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（ヘルパーＴ細胞、インデューサーＴ細胞）、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（Ｂ細胞）、抗ＣＤ３９、ＣＤ１００抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体（アポトーシス）、抗ＣＤ９９抗体（ユーイング肉腫マーカー、ＭＩＣ２遺伝子産物）、抗ＣＤ１０６抗体（ＶＣＡＭ−１；活性化内皮細胞）、抗ユビキチン抗体（アルツハイマー病）、抗ＣＤ７１（トランスフェリンレセプター）抗体、抗ｃ−ｍｙｃ（腫瘍性タンパク質およびハプテン）抗体、抗サイトケラチン（トランスフェリンレセプター）抗体、抗ビメンチン（内皮細胞）抗体（Ｂ細胞およびＴ細胞）、抗ＨＰＶタンパク質（ヒトパピローマウイルス）抗体、抗κ軽鎖抗体（Ｂ細胞）、抗λ軽鎖抗体（Ｂ細胞）、抗メラノソーム（ＨＭＢ４５）抗体（黒色腫）、抗前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）抗体（前立腺癌）、抗Ｓ−１００抗体（黒色腫細胞、軟骨（ｓａｌｖａｒｙ）細胞、グリア細胞）、抗タウ抗原抗体（アルツハイマー病）、抗フィブリン抗体（上皮細胞）、抗ケラチン抗体、抗サイトケラチン抗体（腫瘍）、抗α−カテニン（細胞膜）、ならびに抗Ｔｎ抗原抗体（結腸癌、腺癌、および膵臓癌）。
【００７９】
１次抗体と結合体化され得るフルオロフォアとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＶＥＣＴＯＲ Ｒｅｄ、ＥＬＦ．ＴＭ．（酵素標識フルオレセイン）、Ｃｙ０、Ｃｙ０．５、Ｃｙ１、Ｃｙ１．５、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ、カルセイン、カルセイン−ＡＭ、ＣＲＹＰＴＯＦＬＵＯＲ．ＴＭ．’Ｓ、オレンジ（４２ｋＤａ）、タンジェリン（３５ｋＤａ）、ゴールド（３１ｋＤａ）、レッド（４２ｋＤａ）、クリムゾン（４０ｋＤａ）、ＢＨＭＰ、ＢＨＤＭＡＰ、Ｂｒ−オレゴン、ルシファーイエロー、アレクサ色素ファミリー、Ｎ−［６−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾル−４−イル）アミノ］カプロイル］（ＮＢＤ）、ＢＯＤＩＰＹ．ＴＭ．、ホウ素ジピロメテン二フッ化物、オレゴングリーン、ＭＩＴＯＴＲＡＣＫＥＲ．ＴＭ．Ｒｅｄ、ＤｉＯＣ．ｓｕｂ．７（３）、ＤｉＩＣ．ｓｕｂ．１８、フィコエリスリン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、フィコビリプロテイン（Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ）ＢＰＥ（２４０ｋＤａ）ＲＰＥ（２４０ｋＤａ）ＣＰＣ（２６４ｋＤａ）ＡＰＣ（１０４ｋＤａ）、スペクトラムブルー、スペクトラムアクア、スペクトラムグリーン、スペクトラムゴールド、スペクトラムオレンジ、スペクトラムレッド、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ、赤外線（ＩＲ）色素、サイクリックＧＤＰ−リボース（ｃＧＤＰＲ）、カルコフルオロホワイト、リサミン、アンベリフェロン（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、チロシン、およびトリプトファン。広範な種々の他の蛍光プローブが、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」第８版（２００１）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから利用可能）ならびに多くの他の製造業者から利用可能であり、そして／またはそれらに広範に記載される。
【００８０】
シグナルのさらなる増幅は、抗抗体が標的の抗体プローブの定常領域に結合する場合、特に、その抗体が異なる種由来である場合、特異的な結合メンバーの組み合せ（例えば、抗体と抗抗体）を使用することによって、達成され得る。あるいは、リガンド−レセプター対の特異的な結合（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン）が、１次抗体がその対の一方のメンバーと結合体化されて、そしてその他のメンバーが検出可能なプローブで標識される場合、使用され得る。従って、当業者は、第１のメンバーが細胞成分と結合して、第２の結合を提供するよう役割を果たす場合、第２の結合メンバーは標識を含んでも含まなくてもよい場合、結合メンバーのサンドイッチを効果的に構築し、このことはさらに、三次的な結合メンバーが標識を提供する場合、三次結合を提供し得る。
【００８１】
二次抗体、アビジン、ストレプトアビジン、またはビオチンは、それぞれ独立して検出可能な部分で標識されて、この検出可能な部分は、実質的に不溶性発色反応生成物、蛍光性色素（染料）、発光性色素または非蛍光性色素を有する基質の発色反応に関する酵素であり得る。これらの選択肢のそれぞれに関する例を以下に列挙する。
【００８２】
原理的に、酵素は、（ｉ）１次抗体と結合体化され得るか、または１次抗体と間接的に（例えば、結合体化されたアビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、２次抗体を介して）結合し得、そして（ｉｉ）不溶性産物（沈殿物）を提供する可溶性基質を使用する、任意の酵素が使用され得る。
【００８３】
使用される酵素は、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、および／またはグルコースオキシダーゼであり得；そして基質は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはグルコースオキシダーゼのそれぞれの基質であり得る。
【００８４】
アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）の基質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＰ−ブルー基質（青色沈殿物、Ｚｙｍｅｄカタログ）；ＡＰ−オレンジ基質（オレンジ、沈殿物、Ｚｙｍｅｄ）、ＡＰ−レッド基質（赤色、赤色沈殿物、Ｚｙｍｅｄ）、５−ブロモ，４−クロロ，３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ基質、ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ沈殿物）、５−ブロモ，４−クロロ，３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム／ヨードニトロテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＩＮＴ基質、黄褐色沈殿物、Ｂｉｏｍｅｄａ）、５−ブロモ，４−クロロ，３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質、青色／紫色）、５−ブロモ，４−クロロ，３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム／ヨードニトロテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ／ＩＮＴ、茶色沈殿物、ＤＡＫＯ、ファーストレッド（赤色）、Ｍａｇｅｎｔａ−ｐｈｏｓ（マゼンタ）、ナフトールＡＳ−ＢＩ−ホスフェート（ＮＡＢＰ）／ファーストレッドＴＲ（赤色）、ナフトールＡＳ−ＢＩ−ホスフェート（ＮＡＢＰ）／Ｎｅｗ Ｆｕｃｈｓｉｎ（赤色）、ナフトールＡＳ−ＭＸ−ホスフェート（ＮＡＭＰ）／Ｎｅｗ Ｆｕｃｈｓｉｎ（赤色）、Ｎｅｗ Ｆｕｃｈｓｉｎ ＡＰ基質（赤色）、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ、黄色、水溶性）、ＶＥＣＴＯＲＴＭ Ｂｌａｃｋ（黒色）、ＶＥＣＴＯＲ．ＴＭ．Ｂｌｕｅ（青色）、ＶＥＣＴＯＲ．ＴＭ．Ｒｅｄ（赤色）、Ｖｅｇａ Ｒｅｄ（ラズベリー赤色）。
【００８５】
西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ、時々ＰＯと略される）の基質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズ−チアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ、緑色、水溶性）、アミノエチルカルバゾール、３−アミノ，９−エチルカルバゾールＡＥＣ（３Ａ９ＥＣ、赤色）、α−ナフトールピロニン（赤色）、４−クロロ−１−ナフトール（４Ｃ１Ｎ、青色、暗青色）、３，３’−ジアミノベンジジン四水素化物、（ＤＡＢ、茶色）、オルト−ジアニシジン（緑色）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ、茶色、水溶性）、ＴＡＣＳ Ｂｌｕｅ（青色）、ＴＡＣＳ Ｒｅｄ（赤色）、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、緑色または緑／青色）、ＴＲＵＥ ＢＬＵＥ．ＴＭ．（青色）、ＶＥＣＴＯＲ．ＴＭ．ＶＩＰ（紫色）、ＶＥＣＴＯＲ．ＴＭ．ＳＧ（くすんだ青灰色）、およびＺｙｍｅｄ ＢｌｕｅＨＲＰ基質（鮮やかな青色）。
【００８６】
グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）の基質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、紫色沈殿物）、四ニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ、黒色沈殿物）、２−（４−ヨードフェニル）−５−（４−ニトロフェニル）−３−フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ、赤色またはオレンジ色沈殿物）、テトラゾリウムブルー（青色）、ニトロテトラゾリウムバイオレット（青紫色）、および３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、紫色）。全てのテトラゾリウム基質は、グルコースを補基質として必要とする。そのグルコースは酸化され、そしてテトラゾリウム塩は還元され、そして有色沈殿物を生成する不溶性ホルマザンを形成する。
【００８７】
β−ガラクトシダーゼ基質としては、以下が挙げられるが、これに限定されない：５−ブロモ−４−クロロ，３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ、青色沈殿物）。列挙された各々の基質に関連する沈殿物は、特有の検出可能なスペクトルサイン（成分）を有する。
【００８８】
この酵素はまた、基質の発光反応を触媒すること（例えば、ルシフェラーゼおよびアクオリンであるが、これらに限定されない）に向けられ得、この基質は、発光し得るか、または発光生成物を有する第２の基質（例えば、ルシフェリンおよびＡＴＰ、またはコエレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）およびＣａ．ｓｕｐ．＋＋であるが、これらに限定されない）の第２反応を導き得る、不溶性反応性生物を実質的に有する。
【００８９】
以下の参考文献は、本明細書中で援用され、そしてさらなる例を提供する：Ｊ．Ｍ．Ｅｌｉａｓ（１９９０）Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．ＡＳＣＰ Ｐｒｅｓｓ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ），Ｃｈｉｃａｇｏ；Ｊ．Ｆ．ＭｃＧｉｎｔｙ，Ｆ．Ｅ．Ｂｌｏｏｍ（１９８３）Ｄｏｕｂｌｅ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ ｏｐｉｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｃａｌ ｂａｓａｌ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２７８：１４５−１５３；およびＴ．Ｊｏｗｅｔｔ（１９９７）Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ １９９７年１２月 ４５（１２）：１６２９−１６４１。
【００９０】
細胞調製物は、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に供され得る。一般に、核酸配列プローブは、合成されて、そして蛍光性プローブまたはリガンド：レセプター対（例えば、ビオチン／アビジン）の１メンバー（検出可能な部分で標識される）のいずれかで標識される。例示的なプローブおよび部分は、前述の節に記載される。この配列プローブは、細胞中の標的ヌクレオチド配列に相補的である。標的ヌクレオチド配列を含む、各々の細胞または各々の細胞成分は、標識されたプローブに結合し得る。分析に使用されるプローブは、ＤＮＡのオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、またはＲＮＡのオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのいずれかであり得、そして天然に存在するヌクレオチド以外にも、それらのアナログ（例えば、ジオキシゲニンｄＣＴＰ、ビオチンｄｃＴＰ ７−アザグアノシン、アジドチミジン、イノシンまたはウリジン）を含み得る。他の有用なプローブとしては、ペプチドプローブおよびそのアナログ、分枝の遺伝子ＤＮＡ、ペプチド模倣物、ペプチド核酸、および／または抗体が挙げられる。プローブは、標的核酸配列とプローブとの間に安定かつ特異的な結合が生じるような、目的の標的核酸配列に対して十分な相補性を有する。安定なハイブリダイゼーションのために必要とされる相同性の程度は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーで変動する。ＩＳＨ、ハイブリダイゼーションおよびプローブの選択についての従来の方法論は、Ｌｅｉｔｃｈら、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ，Ｏｘｆｏｒｄ ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ ｖ．２７（１９９４）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載される。
【００９１】
本発明はさらに、以下の実施例によって例示され、これらは何らかの目的に限定するように構築されるべきではない。掲載される全ての参考文献の内容は、本明細書によって明確に参考として援用される。
【実施例】
【００９２】
（実施例１．エストロゲンレセプター（ＥＲ）およびＨＥＲ２／ｎｅｕの生存分析および核会合β−カテニンの分析に関する組織マイクロアレイの構築）
組織マイクロアレイの設計：結節陽性の侵襲性乳癌腫の３４５症例由来のパラフィン包埋されたホルマリン固定化切片を識別した。インサイチュで、病変および正常上皮から離れた侵襲性癌腫の領域を同定して、そして３つの０．６ｃｍパンチの「生検」中心を別々の領域から取り出した。各々の中心を、別々のレシピエントブロックに整列させて、そして厚さ５ミクロンの切片を薄切して先に示したように処置した（Ｋｏｎｅｎｅｎ，Ｊ．ら、Ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，（１９８７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：８４４−７）。同様に、結腸癌腫の３１０症例を入手して、そして先に記載されるように整列させた（Ｃｈｕｎｇ，Ｇ．Ｇ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（印刷中））。
【００９３】
免疫組織化学：予め薄切したパラフィンコーティングされた組織マイクロアレイスライドをパラフィン除去し、そして圧力をかけて加熱して（ｐｒｅｓｓｕｅ−ｃｏｏｋｉｎｇ）、抗原賦活化させた（Ｋａｔｏｈ，Ａ．Ｋ．ら、（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｆ２：２９１−８）。スライドを、３つの標的抗原のうちの１つに対する抗体（モノクローナル抗Ｅ．Ｒ．（マウス、Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）、ポリクローナル抗ＨＥＲ／ｎｅｕ（ウサギ、Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．）、モノクローナル（マウスクローン１４、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）抗β−カテニン、またはポリクローナルウサギ抗βカテニン）を用いて染色した。１次抗体を４℃で一晩インキュベートした。次いで、デキストランポリマーの骨格で修飾された西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化された、対応するヤギ抗マウス２次抗体または抗ウサギ２次抗体（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ，ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．）を、１時間適用した。標的抗原を、視覚分析のために、可視光クロマジェン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）（ジアミノベンジジン、ＤＡＫＯ）か、または蛍光性クロマジェン（Ｃｙ−５−チラミド（ｔｙｒａｍｉｄｅ）、ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）のいずれかを用いて可視化した。自動化された分析のために設計されたスライドを、核の可視化のためにＤＡＰＩで対比染色し、そして腫瘍細胞とストローマ細胞を区別するために、ポリクローナルウサギ抗サイトケラチン（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）またはウサギ抗α−カテニンのいずれかを、ならびに細胞膜を視覚化するために使用した。多くの場合において、抗サイトケラチンで染色されたヒストスポットの、指数関数的に減算された画像は、腫瘍細胞においてサイトケラチンの膜下の融合に起因して、細胞膜に受容可能なマーカーを提供する。これらの抗体は、Ｃｙ３またはＡｌｅｘａ ４８８のいずれかで結合体化されたヤギ抗マウス２次抗体または抗ウサギ２次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して可視化される。目視検査のために設定されたスライドを、ヘマトキシリンで酸性化した水酸化アンモニウムで対比染色した。Ｅ．Ｒ．、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびβ−カテニンのレベルについてのマイクロアレイの手動検査は、これまでに記載されている（Ｓｎｅａｄ，Ｄ．Ｒ．ら、（１９９３）Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２３：２３３−８）。
【００９４】
画像分析：マイクロアレイの画像を、自動化Ｘ，Ｙ，Ｚステージ移動を備えるＴＥ２００倒立蛍光顕微鏡上の１０×Ｎｉｋｏｎ Ｓｕｐｅｒ−Ｆｌｕｏｒレンズを通して、付属の水冷式Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃシリーズ３００カメラを備える、Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎのプラットフォームおよびソフトウェア（ＳｏｆｔＷｏｒｘ ２．５）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡ）を使用して獲得した。マイクロアレイの複数（約１５００枚）の低解像度画像（６４×６４ピクセル）を一緒に使用して、マイクロアレイの低い強度の画像を構築（ｓｔｉｃｈ）した。各々の位置を決定するために、本明細書中で記載されるソフトウェアアルゴリズムによって、これらの画像を分析した。続いて、モノクロの高解像度（１０２４×１０２４ピクセル）の画像を、各々、平面焦点およびその８ミクロン下の両方で獲得した。各々の蛍光色素についてのイメージ対を獲得した。簡潔に以下に述べると、以下のように、さらなるアルゴリズムを使用して、画像を分析した。遍在的に発現される上皮特異的抗原（サイトケラチンまたはα−カテニンのいずれか）に由来するマスクを使用して、目的の領域（腫瘍）を同定した。蛍光性に標識される膜および核の区画の画像を、設定された量の画像強度が残るまで指数関数的に減算した。次いで画像を組み合わせると、その結果、ある区画から次の区画までのシグナルの最小限の重複部分が存在した。有意な程度の重複部分が存在するピクセルを、さらなる分析から無効にした。標的抗原の指数関数的に減算された画像のピクセル強度を、３つの区画（核、膜または核でも膜でもない（細胞質））のうちの１つに割り当てた。標的の強度を以下のように分析した。Ｅ．Ｒ．については、核に局在するシグナルのみを使用し、ＨＥＲ２／ｎｅｕについては膜に局在するシグナルのみを分析した。β−カテニンの総量のシグナルについては、核 対 膜のシグナル比、および核 対 総量のシグナル比を分析した。
【００９５】
データ分析：乳癌からの染色スコアは、２つのスコア付け可能なヒストスポットからの、平均化した結果（ＥＲについて）または最大化された結果（ＨＥＲ２／ｎｅｕについて）を示す。その後の研究は、単独のヒストスポットの分析が結果を判定するのに統計的有意力を提供することを示し、その結果、結腸癌のアレイからの染色スコアはただ１つのヒストスポットの結果を示す。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの分析を使用して、そして統計的有意性を評価するためにＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘの対数階級スコアを使用して、総合的な生存分析を評価した。一変量のＣｏｘ比例危険モデル（Ｃｏｘｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｈａｚａｒｄ ｍｏｄｅｌ）を使用して、相対的な危険性を評価した。分析を、Ｓｔａｔｖｉｅｗ ５．０．１（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して実施した。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１（Ａ〜Ｄ）は、蛍光タグ化マーカーで染色し、そして、以下のとおりの単一のカラー画像に合わせられた後に撮られた、結腸癌の別々の単色画像を示す：ＤＡＰＩ（核を可視化するため、青）、抗サイトケラチン（非腫瘍エレメントと腫瘍エレメントを区別するため、緑）、および抗α−カテニン（細胞膜を可視化するために、赤）
【図２】図２（Ａ〜Ｄ）は、エストロゲンレセプターレベルの自動化スコアリングおよび病理学者によるスコアリングの回帰比較を示す。
【図３】図３は、アレイ内のスポットの相対位置を同定する方法およびその説明のフローチャートである。
【図４】図４は、位置内のシグナル（例えば、バイオマーカー）を局在化するためのプロセスのフローチャートである。
【図５】図５は、組織マイクロアレイを示す。
【図６】図６は、光学顕微鏡ステーションを示す。

Claims (38)

1. 細胞内でバイオマーカーを局在化する、コンピューターにより実行される方法であって、以下：
   第１の規定された領域に対応する該細胞の第１の画像の部分を同定する工程；
   少なくとも１つのバイオマーカーに対応する該細胞の第２の画像の部分を同定する工程；
   該第１の画像の該部分内に位置する該第２の画像の部分を決定し、該バイオマーカーが該規定された領域内に局在化するか否かを同定する工程
   を包含する、方法。
2. 前記第１の画像の前記部分および前記第２の画像の前記部分が、ピクセルを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の画像の前記部分が、前記細胞の該第１の規定された領域に関連する強度を有する、ピクセルを含む請求項１に記載の方法。
4. 前記細胞の前記第１の規定された領域に関連する前記強度を決定する工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
5. 前記第２の画像の前記部分が、前記少なくとも１つのバイオマーカーに対応する強度を有するピクセルを含む、請求項２に記載の方法。
6. 前記少なくとも１つのバイオマーカーに関連する前記強度を決定する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
7. 前記第１の画像中の焦点外エレメントの表示を削減する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
8. 表示を削減する工程が、異なる焦点の深さを特徴とする第３の画像の画像ピクセル強度に基づいて、前記第１の画像の画像ピクセル強度を操作する工程を包含する、請求項７に記載の方法。
9. 前記規定された領域が、細胞核、細胞質、核膜、細胞膜、ミトコンドリア、小胞体、ペルオキソームおよびリソソームからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
10. 前記細胞成分が、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質または炭水化物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
11. 細胞含有サンプルを分析する方法であって、以下：
    該細胞内の第１の規定された領域に選択的な第１の染色および、少なくとも１つのバイオマーカーに選択的な第２の染色を有する該細胞の第１の画像、を得る工程；
    該第１の画像中の複数のピクセル位置で、該第１の染色についての強度値を決定する工程；
    該強度値に基づいて、該細胞内の該第１の規定された領域に対応する該第１の画像中のピクセル位置を決定し、そして、これらのピクセル位置を該第１の規定された領域に割り当てる工程；
    第２の画像を得て、該第２の画像中の複数のピクセル位置で、該第２の染色についての強度値を決定する工程；ならびに、
    該第１の画像および該第２の画像を比較して、該第１の細胞区画内にある該第２の画像中のピクセル位置を同定する工程、
    を包含する、方法。
12. 前記規定された領域が、細胞核、細胞質、核膜、細胞膜、ミトコンドリア、小胞体、ペルオキソームおよびリソソームからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記細胞成分が、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質または炭水化物からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
14. 請求項１１に記載の方法であって、前記細胞が、該細胞内の第２の規定された領域に選択的な第３の染色に接触され、該方法はさらに、以下：
    該細胞中の該第３の染色の分布についての第３の画像において、該第３の画像中の複数のピクセル位置の各ピクセル位置について強度値を決定する工程；
    該強度値に基づいて、該第３の画像中のピクセル位置が、該細胞の該第２の規定された領域に対応することを決定し、そして、これらのピクセル位置を、該第２の規定された領域に割り当てる工程；ならびに、
    該第２の画像中の該ピクセル位置のいずれが、該第２の規定された領域内にあるかを決定する工程、
    を包含する、方法。
15. 前記第１の規定された領域または前記第２の規定された領域に割り当てられないピクセル位置を、第３の規定された領域に割り当て、そして、該第２の画像中の該ピクセル位置のいずれが該第３の規定された領域内にあるかを同定する工程、をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
16. 前記第１の規定された領域、前記第２の規定された領域および前記第３の規定された領域が、以下：
    核、細胞質、核膜、細胞膜、ミトコンドリア、小胞体、ペルオキソームおよびリソソーム、
    からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 請求項１４に記載の方法であって、前記細胞が、該細胞中の規定された領域に選択的な第４の染色と接触され、そして、該第４の染色の分布の少なくとも１つのピクセル化された画像が取得され、該方法はさらに、以下：
    該第４の染色分布の画像中の複数のピクセルの各々について、第３の強度値を読み取る工程；
    該第３の強度値からの閾値強度値を決定する工程；
    該閾値強度と、該複数のピクセルの各々についての該第３の強度とを比較する工程；ならびに
    ピクセル位置を、該閾値強度値に基づくマスクに割り当てる工程、
    を包含する、方法。
18. 前記第１の染色分布の画像中の前記複数のピクセルにおける前記ピクセル位置が、前記マスクセット中の該ピクセル位置である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記マスクに割り当てられた前記ピクセル位置が、前記閾値強度値と等しいか、またはそれより大きい第３の強度値を有するピクセルの位置を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記第４の染色分布の前記画像中の前記複数のピクセルの各々について、前記第３の強度値を保存する工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記閾値強度値が、最大ビンの強度値から決定される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記閾値強度値が、第２の最大ビンの強度値から選択される、請求項２０に記載の方法。
23. 各ピクセル位置について、前記第１の強度値と前記第２の強度値を比較し、そして、該第２の強度値が、該第１の強度値より大きい場合、該ピクセル位置に前記第２の規定された領域を割り当てる工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
24. 前記第２の染色分布の前記画像中のピクセルのアレイにおける各ピクセル位置について、シグナル強度値を読み取り、全シグナル強度を決定するために該シグナル強度を合計する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
25. 前記第２の染色分布の前記画像中の前記ピクセルのアレイが、前記細胞中の前記第１の規定された領域中である、請求項１７に記載の方法。
26. 前記第２の染色分布の前記画像中の前記ピクセルのアレイにおける各ピクセル位置についてシグナル強度値を読み取り、該シグナル値を合計する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
27. 前記第２の染色分布の前記画像中の前記ピクセルのアレイが、前記第２の規定された領域である、請求項１７に記載の方法。
28. 前記第２の染色分布の前記画像中の前記ピクセルのアレイにおける各ピクセル位置についてシグナル強度値を読み取り、全強度を決定するために該シグナル強度値を合計する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
29. 前記第２の染色分布の前記画像中の前記アレイのピクセルが、前記第３の規定された領域である、請求項１７に記載の方法。
30. 細胞含有サンプルを分析する方法であって、以下：
    細胞の第１の画像中の複数のピクセル位置の各々についての値を入手する工程；
    細胞の第２の画像中の該複数のピクセル位置の各々についての値を入手する工程；および
    該第２の画像中の各ピクセル位置についての強度値の割合を、該第１の画像中の同じピクセル位置の強度値から減算して、調整した強度値を得る工程
    を包含する、方法。
31. 前記第１の画像が、第１の焦点面で獲得され、そして、前記第２の画像が、第２の焦点面で獲得される、請求項３０に記載の方法。
32. 減算された前記第２の画像中の各ピクセル位置についての前記強度値の割合が、強度分布関数から決定される、請求項３０に記載の方法。
33. 複数のスポットを分析する方法であって、以下：
    該スポットを位置付ける工程；
    該位置付けられたスポットについて参照点を規定する工程；
    該位置付けられたスポットの該参照点を、対応する線分を有する最も隣接する１セットのスポットの参照点につなげる工程；および
    互いにスポットをつなげるために使用された線分間の共通部分の点を同定する工程
    を包含する、方法。
34. 参照点および共通部分の点に参照番号を割り当てる工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
35. 前記参照番号およびスポット位置を表にする工程をさらに包含する、請求項３４に記載の方法。
36. 各スポット内の前記参照点が、該スポットの中心である、請求項３３に記載の方法。
37. 前記スポットが、組織マイクロアレイ中のヒストスポットである、請求項３３に記載の方法。
38. 複数の参照点の各々を、対応する線分を使用して、最も近い端につなげる工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。

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