JP6404425B2 - 光画像計測装置 - Google Patents

Description

本発明は、光の干渉を用いて測定対象を観察する光画像計測装置に関する。

近年、光の干渉を用いて測定対象の表面構造や内部構造の画像を取得する光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ：Optical Coherence Tomography）が注目を集めている。ＯＣＴは眼底検査用途で既に実用化されており、近年では再生医療における移植組織の検査などの目的で、培養細胞のイメージングへの適用も検討されている。

ＯＣＴでは、例えば特許文献１に記載されているように、光源からの光を測定対象に照射する信号光と、測定対象に照射せずに参照光ミラーで反射させる参照光とに２分岐し、測定対象から反射された信号光を参照光と合波させ干渉させることにより信号を得る。

ＯＣＴは測定位置の光軸方向への走査方法（以下、ｚスキャンと称する）により、大きくタイムドメインＯＣＴとフーリエドメインＯＣＴとに分けられる。タイムドメインＯＣＴにおいては、光源として低コヒーレンス光源を使用し、測定時に参照光ミラーを走査することによりｚスキャンを行う。これにより信号光に含まれる参照光と光路長が一致する成分のみが干渉し、得られた干渉信号に対して包絡線検波を行うことにより、所望の信号が復調される。一方、フーリエドメインＯＣＴはさらに波長走査型ＯＣＴとスペクトルドメインＯＣＴとに分けられる。波長走査型ＯＣＴでは、出射光の波長を走査することが可能な波長走査型光源を使用し、測定時に波長を走査することによりｚスキャンがなされ、検出された干渉光強度の波長依存性（干渉スペクトル）をフーリエ変換することにより所望の信号が得られる。スペクトルドメインＯＣＴにおいては、光源に広帯域光源を用い、生成された干渉光を分光器により分光し、波長成分ごとの干渉光強度（干渉スペクトル）を検出することがｚスキャンを行うことに対応している。得られた干渉スペクトルをフーリエ変換することにより所望の信号が得られる。

US 2012/0300217 A1

ＯＣＴで生体組織や細胞などを測定する場合、一般的に測定対象内部からの反射光は測定対象表面からの反射光あるいはカバーガラスや細胞の培養容器などの測定対象保持部と測定対象の界面からの反射光に比べて非常に小さい。例として図１のように培養液で満たされた培養容器内の細胞を測定する場合について述べる。典型的な培養容器（ポリスチレン製）の屈折率は１．５９、細胞の屈折率は１．３７程度であり、これらの値より培養容器と細胞の界面の反射率を見積もると約０．５５％となる。それに対して例えば細胞と培養液の界面の反射率は、培養液の屈折率を１．３３程度とすると０．０２２％程度となり、細胞からの反射光が培養容器と細胞の界面からの反射光よりも１桁以上小さくなることが分かる。異なる細胞同士の界面や、細胞内部の反射率はこれよりもさらに小さいと考えられる。

このように、測定対象表面や測定対象と測定対象保持部の界面からの反射光が測定対象内部からの反射光よりも非常に大きいため、ＯＣＴで測定対象内部を撮像する際にクロストークとなり画像を劣化させることが問題となる。測定対象と測定対象保持部の界面からの反射光による画像の劣化の具体例を図２に示した。図２は、ＯＣＴによって得られる図１に示したｚ＝０μｍとｚ＝５μｍにおけるｘｙ像（光軸に垂直な方向の断層画像）の模式図である。ｚ＝５μｍにおけるｘｙ像にｚ＝０μｍにおけるｘｙ像が残像として写っている。このように、測定対象と測定対象保持部の界面からの反射光の影響は測定対象内部のｘｙ像に測定対象と測定対象保持部の界面の構造が残像として写る形で表れる。

当該残像を除去するための手段として、測定対象内部のｘｙ像から輝度調整を行ったｚ＝０μｍのｘｙ像を減算する方法が考えられる。当該方法は、ｚ方向の測定位置の変更あるいは走査を参照光ミラーの移動や波長の掃引によって行う従来のＯＣＴにおいては機能すると考えられる。しかしながら、これら従来のＯＣＴは低ＮＡ（典型的にはＮＡ０．１以下）の対物レンズを使用するため、ｘｙ分解能が２０μｍ〜３０μｍ程度であり、培養細胞のような大きさ１０μｍ程度の小さな構造物をイメージングすることはできない。

そこで本発明者らは、高い空間分解能を得るために、光源としてコヒーレンス長の長いレーザー光源を適用し、高ＮＡの対物レンズを用いてレーザー光（信号光）を測定対象に集光して照射し、対物レンズを走査することにより集光位置を走査して測定対象の断層像を取得する構成を検討した。本構成のＯＣＴ装置を用いる場合、測定対象内部を測定する際のｚ＝０μｍにおける信号光はデフォーカスしているため、測定対象内部のｘｙ像に残像として写るのはデフォーカスしたｚ＝０μｍのｘｙ像である。したがって、測定対象内部のｘｙ像から輝度調整を行ったｚ＝０μｍのｘｙ像を減算する方法では、上記のデフォーカスを考慮していないため、ｚ＝０μｍからの反射光による残像を正確に除去することはできないという問題があった。

本発明による光画像計測装置は、レーザー光を出射する光源と、光源から出射されたレーザー光を信号光と参照光に分岐する光分岐部と、信号光を容器内の測定対象に集光して照射する第１の対物レンズと、信号光の集光位置を走査する集光位置走査部と、参照光を集光する第２の対物レンズと、第２の対物レンズを通った参照光を反射して第２の対物レンズに戻す反射ミラーと、第２の対物レンズと反射ミラーの間に配置された平板と、測定対象によって反射もしくは散乱された信号光と反射ミラーによって反射されて第２の対物レンズを通った参照光とを合波し、互いに位相関係が異なる３つ以上の干渉光を生成する干渉光学系と、干渉光を検出する光検出器とを備える。ここで、第２の対物レンズは第１の対物レンズと同一の対物レンズであり、平板は容器の信号光が透過する部分と同じ材質及び同じ厚さを有する。

また、集光位置走査部により走査される信号光の各集光位置において光検出器から得られた信号をもとに画像を生成する画像生成部と、画像生成部で生成された２つの画像の間で減算処理を行う画像処理部を備える。

本発明による光画像計測方法は、１本のレーザー光を信号光と参照光に分岐し、信号光を測定対象に集光して照射し、測定対象から反射もしくは散乱された信号光と参照光を干渉させて互いに位相関係が異なる３つ以上の干渉光を生成し、干渉光の検出信号をもとに測定対象の断層像を取得する光画像計測方法であって、参照光を平面波とした状態で、信号光の集光位置を光軸に垂直な方向に走査して得た検出信号をもとに第１の画像を取得する工程と、参照光にデフォーカス収差を付与した状態で、信号光の集光位置を光軸に垂直な方向に走査して得た検出信号をもとに第２の画像を取得する工程と、第１の画像と第２の画像の間で少なくとも減算処理を施すことにより第３の画像を生成する工程と、を有する。

第３の画像を生成する工程は、第１の画像から輝度調整を行った第２の画像を減算することによりなされるものとすることができる。
デフォーカス収差は、一つの観点からすると、第１の画像に現れたクロストーク成分が第３の画像で除去あるいは低減される大きさとすることができる。

また、本発明による光画像計測装置は、レーザー光を出射する光源と、光源から出射されたレーザー光を信号光と参照光に分岐する光分岐部と、信号光を測定対象に集光して照射する対物レンズと、信号光の集光位置を走査する集光位置走査部と、参照光のデフォーカス収差を調整するデフォーカス収差調整部と、測定対象によって反射もしくは散乱された信号光を参照光と合波し、互いに位相関係が異なる３つ以上の干渉光を生成する干渉光学系と、干渉光を検出する光検出器と、光検出器の出力信号を元に画像を生成する画像生成部と、画像生成部で生成された画像に対して画像処理を施す画像処理部と、を有し、画像処理部は、参照光にデフォーカス収差を付与しない状態で画像生成部で生成した第１の画像と参照光にデフォーカス収差を付与した状態で画像生成部で生成した第２の画像の間で少なくとも減算処理を施すことにより、第３の画像を生成する。

第３の画像は、画像処理部において第１の画像から輝度調整を行った第２の画像を減算することにより生成されるものとすることができる。

ここで、参照光をデフォーカス収差調整部を通らない第１の参照光とデフォーカス収差調整部を通る第２の参照光に分岐する光分岐部を有し、干渉光学系として第１の干渉光学系と第２の干渉光学系を有し、第１の干渉光学系は測定対象によって反射もしくは散乱された信号光と第１の参照光との干渉光を生成し、第２の干渉光学系は測定対象によって反射もしくは散乱された信号光と第２の参照光との干渉光を生成し、第１の干渉光学系の干渉光を検出する光検出器の出力信号を元に画像生成部で生成された画像を上記第１の画像とし、第２の干渉光学系の干渉光を検出する光検出器の出力信号を元に画像生成部で生成された画像を上記第２の画像とすることができる。

本発明によれば、測定対象の表面などの特定の反射面で生じる強い反射光の影響を抑制し、その特定の反射面近傍の構造を鮮明に可視化可能な光画像計測装置を提供することが出来る。
上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。

ＯＣＴ装置の測定対象の例を示す模式図。 従来のＯＣＴ装置で得られる画像の例を示す模式図。 本発明の光画像計測装置の構成例を示す摸式図。 光画像計測装置の動作手順の例を示す図。 本発明の光画像計測装置の構成例を示す摸式図。 本発明の光画像計測装置の動作手順の例を示す図。 本発明による光画像計測装置の別の実施例を示す模式図。 画像表示部の模式図。

以下に本発明の態様を例示する。
（１）一例として、光源から出射されたレーザー光を信号光と参照光とに分岐し、信号光を対物レンズにより測定対象に集光して照射させ、信号光の集光位置を集光位置走査部により走査し、参照光はデフォーカス収差調整部によってデフォーカスを調整され、干渉光学系によって測定対象から反射もしくは散乱された信号光を参照光と合波して互いに位相関係が異なる３つ以上の干渉光を生成して検出する。画像生成部ではこれら検出信号を元に画像データを生成し、画像処理部で生成された画像に対して画像処理を施す。画像処理部では、デフォーカス収差調整部で参照光にデフォーカス収差を付与しない状態で取得した第一の画像と、参照光にデフォーカス収差を付与した状態で得られた第二の画像を元に、測定対象の表面などの反射率の強い特定の反射面からのクロストーク成分を除去した第三の画像を生成する。ここで、デフォーカス収差調整部により参照光に付与されるデフォーカス収差は、信号光に含まれる反射率の強い特定の反射面からの反射光成分が有するデフォーカス収差と等しい。強い反射の生じる反射面とは、測定領域のその他の部位に比べて大きな反射率を有する反射面であり、当該反射面からの反射光がその周辺部分の構造の鮮明な可視化を妨げると考えられ、ユーザーがその反射面からの反射光の影響を取り除くことを選択しうる反射面である。具体的には、測定対象の表面、何らかの容器越しに信号光を照射する場合には当該容器の表面、あるいはホルマリン溶液などの液中にある測定対象の場合にはその液面などが考えられる。
これにより、測定対象表面などの特定の反射面からの強い反射光の影響を抑制することが可能となり、前記特定の反射面近傍の構造を鮮明に可視化することができる。

（２）一例として、信号光を測定対象に集光する対物レンズの開口数を０．４以上とした。
これにより、広帯域光源あるいは波長走査型光源を用いることなく、従来のＯＣＴ装置と同等かそれ以上の光軸方向の空間分解能を達成可能である。

（３）一例として、干渉光学系において干渉光を４つ生成し、これら４つの干渉光は信号光と参照光の干渉位相が互いに略９０度の整数倍だけ異なり、信号光と参照光の干渉位相が互いに略１８０度異なる干渉光の対を電流差動型の光検出器によって検出することとした。
これにより、電流差動型の検出器を用いているため、参照光の強度を大きくしても検出器が飽和しにくくなり、電流差動型の検出器を用いない場合よりも信号のＳＮ比を大きくすることができる。

（４）一例として、デフォーカス収差調整部として、信号光の集光に用いる対物レンズと同一の対物レンズと、反射ミラーと、対物レンズと反射ミラーの相対距離を変化させるアクチュエータと、を用いることとした。
これにより、信号光に含まれる反射率の強い特定の反射面からの反射光成分が有するデフォーカス収差と等しいデフォーカス収差を、容易に参照光に付与することができる。

（５）一例として、光源から出射されたレーザー光を信号光と第一の参照光と第二の参照光に分岐し、信号光を対物レンズにより測定対象に集光して照射させ、信号光の集光位置を集光位置走査部により走査し、第二の参照光はデフォーカス収差調整部によってデフォーカスを調整され、測定対象から反射もしくは散乱された信号光を第一の信号光と第二の信号光に分割し、第一の干渉光学系によって第一の信号光と第一の参照光を合波して互いに位相関係が異なる３つ以上の干渉光を生成して検出し、第二の干渉光学系によって第二の信号光と第二の参照光を合波して互いに位相関係が異なる３つ以上の干渉光を生成して検出する。画像生成部ではこれら検出信号を元に画像データを生成し、画像処理部で生成された画像に対して画像処理を施す。画像処理部では、第一の干渉光学系からの信号を元に生成された第一の画像と、第二の干渉光学系からの信号を元に生成された第二の画像を元に、測定対象の表面などの反射率の強い特定の反射面からのクロストーク成分を除去した第三の画像を生成する。ここで、デフォーカス収差調整部により第二の参照光に付与されるデフォーカス収差は、信号光に含まれる反射率の強い特定の反射面からの反射光成分が有するデフォーカス収差と等しい。
これにより、一度の測定で参照光にデフォーカス収差を付与しない条件での画像（第一の画像）と、参照光にデフォーカス収差を付与した条件での画像（第二の画像）を取得することが出来るため、より短い測定時間で、測定対象表面などの特定の反射面からの強い反射光の影響を抑制することが可能となり、前記特定の反射面近傍の構造を鮮明に可視化することができる。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。

〔実施例１〕
図３（ａ）は、本発明による光画像計測装置の構成例を示す模式図である。
光源３０１から出射された１本のレーザー光はコリメートレンズ３０２によって平行光に変換され、光学軸方向を調整可能なλ／２板３０３によって偏光を回転させられた後、偏光ビームスプリッタ３０４からなる光分岐部によって信号光と参照光に２分岐される。信号光は光学軸方向が水平方向に対して約２２．５度に設定されたλ／４板３０５を透過して偏光状態をｓ偏光から円偏光に変換された後、開口数が０．４以上の対物レンズ３０６によって培養容器３０８内の培養細胞３０９に集光して照射される。ここで、対物レンズ３０６は培養容器３０８の底面を通過後に球面収差がほぼゼロとなるように設計されているものとする。対物レンズ３０６は対物レンズアクチュエータ３０７によって走査され、これにより対物レンズ３０６による信号光の集光位置（測定位置）の走査がなされる。測定対象から反射又は散乱された信号光は対物レンズ３０６を再び通過し、λ／４板３０５によって偏光状態を円偏光からｐ偏光に変換され、偏光ビームスプリッタ３０４へ入射する。一方、参照光はλ／４板３１０によって偏光状態をｐ偏光から円偏光に変換された後、参照光の光路中に配置されたデフォーカス収差調整部３１５へ入射する。

デフォーカス収差調整部３１５は、対物レンズ３０６と同一の対物レンズ３１１、対物レンズアクチュエータ３１２、培養容器３０８と同じ材質でその厚みが信号光透過部分すなわち培養容器３０８の底面と同一である平板３１３、及び反射ミラー３１４によって構成されており、対物レンズアクチュエータ３１２によって対物レンズ３１１と反射ミラーの相対位置を変化させることにより参照光のデフォーカス収差を調整することが可能である。ここで、平板３１３は参照光の球面収差を信号光と等しくするために挿入されている。従って培養容器３０８が材質や底面の厚さが異なる別の培養容器に変更される場合には、平板３１３もそれに対応して変更される。平板３１３の変更を容易に実施するために、事前に複数の種類の平板３１３を搭載し、ユーザーが選択した培養容器３０８に対応して平板３１３を切り替え可能な機構を設けることが望ましい。あるいは、平板３１３の代わりに液晶素子を挿入し、印加する電圧を調整することにより、参照光の球面収差を信号光と等しくすることとしても良い。デフォーカス収差調整部３１５へ入射した参照光は対物レンズ３１１によって集光され、平板３１３を透過した後に反射ミラー３１４によって反射され、再び平板３１３と対物レンズ３１１を透過した後、λ／４板３１０によって偏光状態を円偏光からｓ偏光へ変換されて偏光ビームスプリッタ３０４へ入射する。

信号光と参照光は偏光ビームスプリッタ３０４によって合波され、合成光が生成される。合成光はハーフビームスプリッタ３１６、λ／２板３１７、λ／４板３１８、集光レンズ３１９，３２０、ウォラストンプリズム３２１，３２２から成る干渉光学系３２３へ導かれる。干渉光学系３２３へ入射した合成光は、ハーフビームスプリッタ３１６によって透過光と反射光に２分岐される。透過光は光学軸が水平方向に対して約２２．５度に設定されたλ／２板３１７を透過した後、集光レンズ３１９によって集光され、ウォラストンプリズム３２１によって偏光分離されることにより互いに位相関係が１８０度異なる第一の干渉光と第二の干渉光が生成される。第一の干渉光と第二の干渉光は電流差動型の光検出器３２４によって検出され、それらの強度の差に比例した差動出力信号３２６が出力される。

一方、反射光は光学軸が水平方向に対して約４５度に設定されたλ／４板３１８を透過した後、集光レンズ３２０によって集光され、ウォラストンプリズム３２２によって偏光分離されることにより互いに位相関係が約１８０度異なる第三の干渉光と第四の干渉光が生成される。ここで、第三の干渉光は第一の干渉光に対して位相が約９０度異なる。第三の干渉光と第四の干渉光は電流差動型の光検出器３２５によって検出され、それらの強度の差に比例した差動出力信号３２７が出力される。このようにして生成された差動出力信号３２６，３２７は画像生成部３２８に入力され、画像データ３２９が生成される。画像処理部３３０は画像データ３２９を元に、新たな画像データ３３１を生成し、画像表示部３３２に表示させる。

図４は、本実施例のＯＣＴ装置の動作手順の例を示す図である。まず始めに測定対象のｘｚ像すなわち光軸を含む断層像を取得し（Ｓ１１）、その結果を元にその影響を除去すべき強い反射光が発生している反射面位置（ｚ₀）をユーザーが選択する（Ｓ１２）。本実施例における当該反射面位置（ｚ₀）は、培養容器３０８と培養細胞３０９の界面位置であるとする。なお、簡便には２次元のｘｚ像に代えて光軸方向（ｚ軸方向）の１次元像を取得し、その１次元像から強い反射光が発生している反射面位置（ｚ₀）を選択してもよい。

次に、ｘｙ測定を行うｚ位置（ｚ＝ｚ_m）をユーザーに選択させ（Ｓ１３）、当該ｚ位置においてｘｙ像を繰り返し取得して平均化されたｘｙ像を生成し、これを第一の画像とする（Ｓ１４）。ｘｙ像の取得にあたっては、対物レンズアクチュエータ３０７を駆動して対物レンズ３０６による信号光の集光位置を光軸に垂直な面内で２次元走査する。参照光は平面波とする。すなわち、デフォーカス収差調整部３１５の対物レンズアクチュエータ３１２を駆動して、対物レンズ３１１による参照光の集光位置が反射ミラー３１４の表面となるように対物レンズ３１１と反射ミラー３１４の相対距離を調整する。このとき、第一の画像にはｚ＝ｚ₀からの強い反射光の影響により、デフォーカスしたｚ＝ｚ₀位置の構造が残像（クロストーク）として写っている。

その後、デフォーカス収差調整部３１５を調整して、参照光に対してｚ＝ｚ₀からの反射光が有するデフォーカス収差と等しいデフォーカス収差を付与し、その条件下でｘｙ像を繰り返し取得して平均化されたｘｙ像を生成し、これを第二の画像とする（Ｓ１５）。このとき、デフォーカス収差は図３（ｂ）に示すように、対物レンズアクチュエータ３１２によって参照光の集光位置を反射ミラー３１４からｚ₀−ｚ_mだけ変位させることにより付与される。ここで、第二の画像は、デフォーカスした測定対象のｚ＝ｚ₀におけるｘｙ像であり、輝度調整を行うことにより第一の画像に残像として写っている画像とほぼ等しくなる。画像処理部３３０は、第一の画像から輝度を調整した第二の画像を減算することにより、残像を除去した第三の画像を生成し（Ｓ１６）、画像表示部３３２に表示させる（Ｓ１７）。

こうして、ｚ＝ｚ₀からの反射光によるクロストーク成分が除去された測定対象のｚ＝ｚ_mにおける断層像が表示される。換言すると、ステップ１５における第二の画像取得時にデフォーカス収差調整部３１５によって参照光に付与したデフォーカス収差は、ステップ１４において取得した第一の画像に現れたクロストーク成分が第三の画像で除去あるいは低減される大きさであるということができる。

以下で本実施例の動作原理及び効果について数式を用いて説明する。干渉光学系３２３へ入射する時点での合成光のジョーンズベクトルを
［式１］

と表す。ここでＥ_sigは、信号光が集光される光軸方向の位置ｚ、測定対象のｚ＝ｚ₀からカウントしてｊ番目（ｚ＝ｚ₀を０番目とする）の反射点の光軸方向位置ｚ_j、ｊ番目の反射点からの反射光の電場振幅Ａ_sig,j及び位相θ_sig,jを用いて以下のように表わすことができる。

［式２］

ここで、Ｗ（ｚ−ｚ_j）ｒ²はデフォーカス収差を表わしており、ＷはＷ＝２π・ＮＡ²・ｚ／（λ・ｄ²）で与えられる。ｒは光軸中心からの距離、ｄはレンズ開口の半径、λはレーザー光の波長である。

式２において、ｚ＝ｚ₀からの反射光の振幅Ａ_sig,0の二乗はそれ以外の反射点からの反射光の振幅の二乗に比べると１桁以上大きいものとする。一方、Ｅ_refは以下の様に表わされる。
［式３］

ここで、Ａ_refとθ_refはそれぞれ参照光の電場振幅と位相、Δｚ_refは参照光のデフォーカス量（対物レンズ３１１による参照光の集光位置と反射ミラー３１４の間の光軸方向の距離）である。ＷΔｚ_refｒ²はデフォーカス収差調整部３１５により参照光に付与されるデフォーカス収差を表わしている。

ハーフビームスプリッタ３１６を透過し、さらにλ／２板３１７を透過した後の合成光のジョーンズベクトルは次のようになる。
［式４］

ウォラストンプリズム３２１によって式４で示される合成光はｐ偏光成分とｓ偏光成分に偏光分離された後、電流差動型の光検出器３２４によって差動検出され、以下の式で表わされる差動出力信号３２６が生成される。

［式５］

ここでρは光束断面の座標ベクトル、Ｄは検出領域を表し、∫_Dｄρは光束内全域での積分演算を意味する。簡単のため検出器の変換効率は１とした。

一方、ハーフビームスプリッタ３１６で反射され、さらにλ／４板３１８を透過した後の合成光のジョーンズベクトルは次のようになる。
［式６］

ウォラストンプリズム３２２によって、式６で示される合成光はｐ偏光成分とｓ偏光成分に偏光分離された後、電流差動型の光検出器３２５によって差動検出され、以下の式で表わされる差動出力信号３２７が生成される。
［式７］

さらに、式５、式７に式２、式３を代入して積分を実行すると以下の式が得られる。
［式８］

［式９］

ここで、θ_j＝θ_sig,j−θ_ref、ｋ_eff＝π・ＮＡ²／λである。また、Ｉ，Ｑ及びＡ_sig,j，θ_jは信号光のｘｙ方向（光軸に垂直な面内方向）の集光位置（ｘ，ｙ）の関数であることを明示するため、Ｉ＝Ｉ（ｘ，ｙ），Ｑ＝Ｑ（ｘ，ｙ），Ａ_sig,j＝Ａ_sig,j（ｘ，ｙ），θ_j＝θ_j（ｘ，ｙ）と書き直した。

画像生成部３２８は、これらの信号に対して以下の演算を施すことにより画像データ３２９を生成する。
［式１０］

以下では、ｍ番目の反射点のｚ位置におけるｘｙ像を取得する場合について考えることとし、位置ｚ_mに信号光が集光されている（ｚ＝ｚ_m）ものとして説明する。参照光にデフォーカス収差を与えない場合、すなわちΔｚ_ref＝０の場合には式８、式９は近似的に以下の様に書き表される。

ここで、ｚ＝ｚ₀からの反射光以外の反射光成分の寄与は十分小さい、すなわちｊ＞０に対しては
［式１３］

であるとして式を簡略化した。このときの画像データは次のようになる。
［式１４］

式１４における第一項がｚ＝ｚ₀からの反射光のクロストークを含まない理想的なｘｙ像の画像データを表わしており、第二項と第三項がｚ＝ｚ₀からの反射光のクロストークによる残像の画像データに相当する。第三項は信号光や参照光の位相（θ_m−θ₀）に依存しているため、外乱によるランダムな位相変動により測定毎にランダムな値を取ると考えられる。従って、十分な回数平均化処理を施すことにより、第三項の寄与は大幅に小さくなる。外乱による位相変動が小さい場合には、ピエゾ素子などにより参照光の位相を変調することにより同様の効果が得られる。従って、繰り返し測定を行い平均化して得られる第一の画像データは近似的に以下の様に表わされる。

［式１５］

一方、参照光にΔｚ_ref＝ｚ_m−ｚ₀に相当するデフォーカス収差を与える場合、式８、式９は近似的に以下の様に書き表される。
［式１６］

［式１７］

このときの画像データは
［式１８］

と表わされる。式１８はｚ_m−ｚ₀だけデフォーカスした信号光を走査することにより取得した、ｚ＝ｚ₀におけるｘｙ像の画像データである。検出器ノイズなどの影響を第一の画像と等しくするために、式１８で表わされる画像に関しても繰り返し測定を行い平均化を施し、第二の画像データAveragedData2（Δｚ_ref＝ｚ_m−ｚ₀；ｘ，ｙ）を取得する。第一の画像と第二の画像は、画像処理部３３０によって以下の画像処理を施され、第三の画像データが生成される。

［式１９］

ここで、ｇは以下の式で与えられる既知の量である。
［式２０］

式１９で表わされる第三の画像は、ｚ＝ｚ₀からの反射光のクロストークが除去された画像、すなわちｚ＝ｚ₀の構造の残像が除去された画像である。

すなわち、本実施例においては参照光を平面波としてデフォーカス収差を付与しない状態で取得したｘｙ像から、参照光にデフォーカス収差を付与した状態で取得した画像を所定の倍率で輝度を調整して減算することにより、ｚ＝ｚ₀からの反射光によるクロストークを抑制することができる。これにより、ｚ＝ｚ₀近傍の構造を従来のＯＣＴ装置よりも鮮明に可視化することができる。

ここで、本発明の光画像計測装置の空間分解能について述べる。光軸方向の空間分解能は対物レンズをｚ方向に走査した際に得られる単一反射面に対応するピークの半値全幅として定義する。単一の反射面のみが存在する場合の式１０に対応する信号は以下の式により表わされる。

［式２１］

上記の式より、単一反射面からの信号の半値全幅、すなわち光軸方向の空間分解能は近似的に以下の様に表わされる。
［式２２］

ここで、λはレーザー光の波長、ＮＡは対物レンズ３０６の開口数である。

一般的にＯＣＴ装置で利用される光の波長はヘモグロビンにも水にも吸収されにくい６００ｎｍから１３００ｎｍ程度である。例えば対物レンズの開口数を０．４とすると、波長６００ｎｍ〜１３００ｎｍでの光軸方向の空間分解能は約３．３μｍ〜約７．２μｍ、平面分解能（λ／ＮＡ程度）は約１．５μｍ〜約３．６μｍとなり、従来のＯＣＴ装置と同等かそれ以上の高い光軸方向の分解能を達成できる。

本実施例においては、信号光と参照光の干渉位相が互いに略１８０度異なる干渉光の対を電流差動型の光検出器によって検出しているため、参照光の強度を大きくしても検出器が飽和しにくくなり、電流差動型の検出器を用いない場合よりも信号のＳＮ比を大きくすることができる。

さらに、本実施例においてはデフォーカス収差調整部３１５に対物レンズ３０６と同一の対物レンズ３１１を用いているため、強い反射率を持つ特定の反射面からの反射光が有するデフォーカス収差と等しいデフォーカス収差を、容易に参照光に付与することができる。

なお、本実施例では干渉光学系３２３で位相が互いに９０度ずつ異なる４つの干渉光を生成して検出しているが、干渉光が３つ以上であれば干渉光がいくつであっても本実施例と同様の効果を得ることができる。例えば、位相が互いに６０度ずつ異なる３つの干渉光を生成してもよい。

また、本実施例においては、ｚ＝ｚ₀からの反射光の影響をより抑制するために第一の画像と第二の画像それぞれに対して平均化処理を施したが、当該平均化処理は本発明の効果を得るために必須の条件ではない。すなわち、平均化によって得られるクロストークの抑制効果と、本発明によるクロストーク抑制効果は独立である。

〔実施例２〕
図５は、本発明による光画像計測装置の別の実施例を示す模式図である。なお、図３に示した部品と同じものには同一の符号を付し、その説明を一部省略する。本実施例は、参照光を平面波として参照光にデフォーカス収差を付与しない状態で取得した画像と、参照光にデフォーカス収差を付与した状態で取得した画像が、一度の測定で得られる点において実施例１と異なる。

光源３０１から出射されたレーザー光は偏光ビームスプリッタによって信号光と参照光に分岐される。信号光は実施例１と同様の光路を辿り、再び偏光ビームスプリッタ３０４へ入射する。信号光は偏光ビームスプリッタ３０４を透過し、光学軸方向が水平方向に対して約２２．５度に設定されたλ／２板５０１によって偏光を約４５度回転された後、偏光ビームスプリッタ５０２によってｐ偏光成分とｓ偏光成分に分岐され、第一の信号光と第二の信号光が生成される。参照光は反射ミラー５０３によって反射され、光学軸方向が水平方向に対して約２２．５度に設定されたλ／２板５０４によって偏光を約４５度回転された後、偏光ビームスプリッタ５０５によってｓ偏光成分とｐ偏光成分に分岐され、それぞれ第一の参照光と第二の参照光となる。第一の参照光は偏光ビームスプリッタ５０５を反射した後、偏光ビームスプリッタ５０２に入射する。第二の参照光は、偏光ビームスプリッタ５０５を透過し、光学軸方向が水平方向に対して約２２．５度に設定されたλ／４板５０６によって偏光状態をｐ偏光から円偏光に変換され、反射ミラー５０７を反射した後再びλ／４板５０６へ入射して偏光状態を円偏光からｓ偏光に変換されて偏光ビームスプリッタ５０５へ入射する。さらに第二の参照光は偏光ビームスプリッタ５０５を反射して光学軸方向が水平方向に対して約２２．５度に設定されたλ／４板５０８によって偏光状態をｓ偏光から円偏光に変換され、デフォーカス収差調整部３１５によってデフォーカス収差を付与された後、再びλ／４板５０８に入射して偏光状態を円偏光からｐ偏光に変換され、偏光ビームスプリッタ５０５を透過して偏光ビームスプリッタ５０２に入射する。

第一の信号光と第一の参照光は偏光ビームスプリッタ５０２によって合波され、第一の合成光が生成される。第二の信号光と第二の参照光は偏光ビームスプリッタ５０２によって合波され、第二の合成光が生成される。第一の合成光はハーフビームスプリッタ３１６ａ、λ／２板３１７ａ、λ／４板３１８ａ、集光レンズ３１９ａ，３２０ａ、ウォラストンプリズム３２１ａ，３２２ａから成る第一の干渉光学系３２３ａへ導かれる。第二の合成光はハーフビームスプリッタ３１６ｂ、λ／２板３１７ｂ、λ／４板３１８ｂ、集光レンズ３１９ｂ，３２０ｂ、ウォラストンプリズム３２１ｂ，３２２ｂから成る第二の干渉光学系３２３ｂへ導かれる。第一の干渉光学系３２３ａ及び第二の干渉光学系３２３ｂの機能は実施例１における干渉光学系３２３と同じであるため、ここでは説明を省略する。

第一の干渉光学系３２３ａで生成された干渉光を検出することにより生成された差動出力信号３２６ａ，３２７ａは画像生成部３２８に入力され、実施例１における式１４で表わされる画像に相当する画像データが生成される。一方、第二の干渉光学系３２３ｂで生成された干渉光を検出することにより生成された差動出力信号３２６ｂ，３２７ｂは画像生成部３２８に入力され、実施例１における式１８で表わされる画像に相当する画像データが生成される。

すなわち、本実施例においては、一度の測定で参照光にデフォーカス収差を付与しない状態での画像と、参照光にデフォーカス収差を付与した状態での画像を取得することができるため、実施例１に比べてより短い測定時間でｚ＝ｚ₀からの反射光とのクロストークを抑制した第三の画像を得ることができる。

〔実施例３〕
図６は、本発明の光画像計測装置における、別の動作手順の例を示した図である。装置構成は図３に示された実施例１と同様であるためその説明を省略する。本実施例は複数のｚ位置からの反射光によるクロストークを抑制する点において実施例１と異なる。ここでは、測定対象に強い反射の生じる部位、すなわちユーザーがその部位からの反射光の影響を取り除くことを選択しうる反射面がｎ個ある場合について考え、そのｎ個の反射面は表面から数えてＳ₁，…，Ｓ_n番目の反射面であるとする。

まず始めに、ｘｚ像を取得し（Ｓ２１）、クロストークを除去する対象の反射面位置（ｚ＝ｚ_S1，ｚ_S2，…，ｚ_Sn）をユーザーに指定させる（Ｓ２２）。次に、ｘｙ測定を行うｚ位置（ｚ＝ｚ_m）をユーザーに選択させ（Ｓ２３）、当該ｚ位置においてｘｙ像を繰り返し取得して平均化されたｘｙ像を生成し、これを第一の画像とする（Ｓ２４）。その後、参照光に対して、クロストークを除去する対象の反射面位置からの反射光（ｚ＝ｚ_S1，ｚ_S2，…，ｚ_Snからの反射光）が有するデフォーカス収差と等しいデフォーカス収差を付与し、その条件下でｘｙ像を繰り返し取得して平均化されたｘｙ像を生成し、これを第二の画像群とする（Ｓ２５）。画像処理部３３０は、第一の画像から輝度を調整した第二の画像群を減算することにより、残像を除去した第三の画像を生成し（Ｓ２６）、画像表示部３３２に表示させる（Ｓ２７）。

以下に本実施例の動作原理及び効果について数式を用いて説明する。前記特定の反射面からの反射光の振幅の二乗はそれ以外の反射面からの反射光の振幅の二乗に比べると１桁以上大きいものとする。また、以下ではｍ番目の反射面におけるｘｙ像を取得する場合について考えることとし、位置ｚ_mに信号光が集光されている（ｚ＝ｚ_m）ものとして説明する。参照光にデフォーカス収差を与えない場合、すなわちΔｚ_ref＝０の場合の差動出力信号３２６，３２７は近似的に以下の式により表される。

このときの式２３、式２４で表される検出信号を元に生成された画像データを複数回取得し、平均化することにより得られる第一の画像データは近似的に以下の式で与えられる。
［式２５］

ここで、信号光や参照光の位相に依存している項の寄与は平均化により小さくなることを用いて式を簡略化している。一方、Ｓ_p番目の反射面からの反射光が有するデフォーカス収差を参照光に付与した場合、すなわちΔｚ_ref＝ｚ_m−ｚ_Spの場合の検出信号は近似的に、
［式２６］

［式２７］

となる。従って、このときの平均化された画像データは
［式２８］

と表される。

式２５で与えられる第一の画像データと、式２８で表わされる第二の画像データ群（Ｓ_p＝Ｓ₁，Ｓ₂，…，Ｓ_n）を用いて、第三の画像データは以下の式により計算される。
［式２９］

［式３０］

式２９で表わされる第三の画像は、複数個の反射面からのクロストーク成分が抑制された画像である。

すなわち、本実施例においては参照光にデフォーカス収差を付与しない状態で取得した画像（第一の画像）から、所定の倍率で輝度を調整した参照光に所定のデフォーカス収差を付与した状態で取得した複数個の画像（第二の画像群）を減算することにより、一つの特定の反射面からの反射光だけではなくユーザーが選択した複数個の反射面からの反射光によるクロストークが除去された画像を得ることができる。これにより、強い反射が生じる特定の反射面近傍の領域をより鮮明に可視化することができる。

〔実施例４〕
図７は、本発明による光画像計測装置の別の実施例を示す模式図である。なお、図３に示した部品と同じものには同一の符号を付し、その説明を一部省略する。本実施例においては、測定対象として、それを保持するための培養容器のような測定対象保持部が不要な場合、あるいは測定対象保持部を設けることが困難な場合を想定している。従って、本実施例での信号光は実施例１のように培養容器を介して測定対象へ照射されるものではなく、測定対象３０９へ直接照射される。これに対応するために、本実施例ではデフォーカス収差調整部３１５から平板３１３が取り除かれており、この点において実施例１とは構成が異なる。さらに、本実施例においては画像処理部３３０における画像処理方法が実施例１とは異なる。

画像処理方法以外の動作方法は実施例１と同一であるため、ここでは画像処理部３３０における画像処理方法についてのみ説明する。式１５で表わされる第一の画像データAveragedData1（Δｚ_ref＝０；ｘ，ｙ）と、式１８で表わされる第二の画像データAveragedData2（Δｚ_ref＝ｚ_m−ｚ₀；ｘ，ｙ）を取得するまでの動作は実施例１と同様である。画像処理部３３０は第一，第二の画像データに対して以下の演算を施すことにより第三の画像データを生成する。

［式３１］

ここで、Ｇはユーザーが自由に設定することができる任意の定数であり、初期値は式２０で与えられるｇに設定されているものとする。

第三の画像データに基づく第三の画像は画像表示部３３２に表示される。図８（ａ）はこのときの画像表示部３３２の模式図である。画像表示部３３２には第三の画像とそのときのＧの値が表示されており、ユーザーはこの画面上でキーボードやマウスなどを用いてＧの値を自由に設定することが可能となっている。出力される第三の画像はＧの値に依存しており、理論的にはＧ＝ｇが最適値であるが、光学系の調整ずれなどに起因する理想状態からの乖離によりＧ＝ｇが最適値とならない場合がある。本実施例においては、ユーザーは出力された第三の画像を観察してＧ＝ｇがｚ＝ｚ₀からの反射光のクロストークを除去する上で最適値ではないと判断した場合に、Ｇの値をユーザーが最適であると判断する任意の値に変更する。変更後のＧの値は画像処理部３３０に送られ、再び第三の画像データが生成されて画像表示部３３２に表示される。図８（ｂ）にこのときの画像表示部３３２の模式図を示した。このように、本実施例においては、式３１におけるＧの値をユーザーが自由に設定可能であるため、光学系の調整ずれなどによりＧ＝ｇが最適値でない場合にも、より高い精度でｚ＝ｚ₀からの反射光のクロストークが除去された画像が得られる可能性を向上させることが出来る。

なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

３０１：光源
３０２：コリメートレンズ
３０３，３１７：λ／２板
３０４：偏光ビームスプリッタ
３０５，３１０，３１８：λ／４板
３０６：対物レンズ
３０７：対物レンズアクチュエータ
３０８：培養容器
３０９：培養細胞
３１５：デフォーカス収差調整部
３２３：干渉光学系
３１６：ハーフビームスプリッタ
３１９，３２０：集光レンズ
３２１，３２２：ウォラストンプリズム
３２４，３２５：電流差動型の光検出器
３２８：画像生成部
３３０：画像処理部
３３２：画像表示部

Claims (11)

1. １本のレーザー光を信号光と参照光に分岐し、前記信号光を測定対象に集光して照射し、前記測定対象から反射もしくは散乱された信号光と前記参照光を干渉させて互いに位相関係が異なる３つ以上の干渉光を生成し、前記干渉光の検出信号をもとに測定対象の断層像を取得する光画像計測方法であって、
   前記参照光を平面波とした状態で、前記信号光の集光位置を光軸に垂直な方向に走査して得た検出信号をもとに第１の画像を取得する工程と、
   前記参照光にデフォーカス収差を付与した状態で、前記信号光の集光位置を光軸に垂直な方向に走査して得た検出信号をもとに第２の画像を取得する工程と、
   前記第１の画像と前記第２の画像の間で少なくとも減算処理を施すことにより第３の画像を生成する工程と、
   を有することを特徴とする光画像計測方法。
2. 請求項１に記載の光画像計測方法において、
   前記第３の画像を生成する工程は、前記第１の画像から輝度調整を行った前記第２の画像を減算することによりなされることを特徴とする光画像計測方法。
3. 請求項１に記載の光画像計測方法において、
   前記デフォーカス収差は、前記第１の画像に現れたクロストーク成分が前記第３の画像で除去あるいは低減される大きさであることを特徴とする光画像計測方法。
4. 請求項１に記載の光画像計測方法において、
   前記デフォーカス収差は、前記参照光の光路中に配置した対物レンズと反射ミラーの相対距離を変化させることにより付与されることを特徴とする光画像計測方法。
5. レーザー光を出射する光源と、
   前記光源から出射されたレーザー光を信号光と参照光に分岐する光分岐部と、
   前記信号光を測定対象に集光して照射する対物レンズと、
   前記信号光の集光位置を走査する集光位置走査部と、
   前記参照光のデフォーカス収差を調整するデフォーカス収差調整部と、
   前記測定対象によって反射もしくは散乱された信号光を前記参照光と合波し、互いに位相関係が異なる３つ以上の干渉光を生成する干渉光学系と、
   前記干渉光を検出する光検出器と、
   前記光検出器の出力信号を元に画像を生成する画像生成部と、
   前記画像生成部で生成された画像に対して画像処理を施す画像処理部と、を有し、
   前記画像処理部は、前記参照光にデフォーカス収差を付与しない状態で前記画像生成部で生成した第１の画像と前記参照光にデフォーカス収差を付与した状態で前記画像生成部で生成した第２の画像の間で少なくとも減算処理を施すことにより、第３の画像を生成する
   ことを特徴とする光画像計測装置。
6. 請求項５に記載の光画像計測装置において、前記第３の画像は前記画像処理部において前記第１の画像から輝度調整を行った前記第２の画像を減算することにより生成されることを特徴とする光画像計測装置。
7. 請求項５に記載の光画像計測装置において、
   前記デフォーカス収差調整部は、前記信号光の集光に用いる前記対物レンズと同一の第２の対物レンズと、反射ミラーと、前記第２の対物レンズと前記反射ミラーの相対距離を変化させるアクチュエータを備えることを特徴とする光画像計測装置。
8. 請求項７に記載の光画像計測装置において、
   前記デフォーカス収差調整部は、前記第２の対物レンズと前記反射ミラーの間に平板を備え、前記平板は測定対象を入れる容器の前記信号光が透過する部分と同じ材質及び同じ厚さを有することを特徴とする光画像計測装置。
9. 請求項５に記載の光画像計測装置において、
   前記参照光を前記デフォーカス収差調整部を通らない第１の参照光と前記デフォーカス収差調整部を通る第２の参照光に分岐する光分岐部を有し、
   前記干渉光学系として第１の干渉光学系と第２の干渉光学系を有し、
   前記第１の干渉光学系は前記測定対象によって反射もしくは散乱された信号光と前記第１の参照光との干渉光を生成し、前記第２の干渉光学系は前記測定対象によって反射もしくは散乱された信号光と前記第２の参照光との干渉光を生成し、
   前記第１の干渉光学系の干渉光を検出する光検出器の出力信号を元に前記画像生成部で生成された画像を前記第１の画像とし、前記第２の干渉光学系の干渉光を検出する光検出器の出力信号を元に前記画像生成部で生成された画像を前記第２の画像とする
   ことを特徴とする光画像計測装置。
10. 請求項５に記載の光画像計測装置において、前記対物レンズは０．４以上の開口数を有することを特徴とする光画像計測装置。
11. 請求項５に記載の光画像計測装置において、
    前記干渉光学系において生成される干渉光は４つであり、
    前記信号光と前記参照光の干渉位相が互いに略９０度の整数倍だけ異なり、
    前記信号光と前記参照光の干渉位相が互いに略１８０度異なる干渉光の対が電流差動型の光検出器によって検出される、
    ことを特徴とする光画像計測装置。

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